JP2005269923A - ヒト上皮細胞培養用培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 組織培養用のMCDB153基礎培地において、L−アスパラギン酸又はその塩を1.5〜4倍、L−イソロイシン又はその塩を22〜26倍、L−グルタミン又はその塩を1.5〜3倍、L−グルタミン酸又はその塩を1.1〜2倍、L−チロシン又はその塩を3〜6倍、L−トリプトファン又はその塩を5〜7倍、L−バリン又はその塩を0.4〜0.7倍、L−ヒスチジン又はその塩を2〜4倍、L−プロリン又はその塩を0.4〜0.7倍、L−フェニルアラニン又はその塩を4〜7倍、L−メチオニン又はその塩を4〜6倍、L−リジン又はその塩を1.1〜2倍になるようにアミノ酸構成比率を改変し、総アミノ酸量中のL−グルタミン又はその塩の含有量を65重量%以上にしたことを特徴とするヒト上皮細胞培養用基礎培地。
【選択図】 なし
Description
皮膚は第三の臓器とも言われ生体最外層に位置し、重層化した表皮細胞からなる表皮層と線維芽細胞を多く含む結合組織からなる真皮層及び皮下組織から構成されており、生体内の保護と外部からの異物の侵入を防止する上で重要な役割を担っている。従って、皮膚に火傷や切り傷などの損傷等が発生した生体は、体液の漏出や細菌感染等の危険にさらされることとなり、特に重度の熱傷や火傷等により皮膚損傷が深く広範囲に及ぶ場合には皮膚呼吸の低下などで生体内に異常をきたし、場合によっては人命を失うことになる。
H.グリーン,日経サイエンス,84-92(1992.1) 上田実,医学の歩み,180,508-509(1997) 朝比奈泉,週間医学界新聞,第2485号(2002.5.13) 許南浩,日本再生医療学会誌,Vol.2 No.3,47-52(2003.8) 黒柳能光,日本再生医療学会誌,Vol.2 No.3,39-45(2003.8) Cell, 6:331-344(1975) Cell, 19:245-254 (1980) The Journal of Investigative Dermatology, 81:33s-40s(1983) Mayo Clin Proc., Vol 61, 771-777(1986) Journal of Tissue Culture Methods, Vol.9(2), p.83(1985)
また本発明は、上記ヒト上皮細胞培養用基礎培地成分、及びヒト上皮細胞の増殖に必要な成長促進物質を含有するヒト上皮細胞培養用培地を提供するものである。
さらに、本発明は、このヒト上皮細胞培養用培地中でヒト上皮細胞を培養することを特徴とする培養ヒト上皮の製造法を提供するものである。
(1)最適なアミノ酸構成比率に改変した本発明基礎培地の成分組成を以下に例示する。
実施例1で調製された基礎液体培地1を用いて、次の通りにヒト上皮細胞増殖培地を調製した。すなわち、以下の成長促進物質及び抗生物質を添加配合して増殖培地を調製した。以下、用いた基礎培地に対応させて、これ等を「増殖液体培地1」と言う。
実施例1及び2に従って、本発明培地及びMCDB153培地を調製して凍結ヒト表皮角化細胞増殖能の比較試験を実施した。
液体窒素に凍結保存している凍結ヒト表皮角化細胞を急速融解して、1000回転で約5分間遠心分離して得られた細胞を用いてコラーゲン・タイプIをコーティングした100mmコラーゲンコートディッシュ(旭テクノグラス(株)製、コード番号:4010−010)に5×105細胞/10.0mLとなるように播種し、増殖液体培地1を用いて1代目の培養を開始した。同様に、MCDB153培地を用いて1代目の培養を開始した。該培養は37℃、飽和水蒸気下5%炭酸ガス気相下で行い、培養開始後20から24時間後及び以後1日おきに培地交換を行った。ヒト表皮角化細胞は5日間位でディッシュ面一杯にまで良好に増殖したので、次いで継代処理を行い、2代目の継代培養を行った。
継代培養は、植込細胞数が5×105細胞/10.0mLになるように植え込む以外は、上記の凍結融解後の培養と同様にして実施した。
細胞数の計数には、改良ノイバウエル血球計算盤により顕微鏡観察による計数を実施した。また、細胞の写真は位相差顕微鏡によるデジタル写真撮影装置を使用して撮影した画像である。
図1に増殖能の比較を、図2に培養後細胞の位相差顕微鏡写真を示す。その結果、本発明培地によるヒト表皮角化細胞の増殖率は、MCDB153培地の場合に比べて顕著に優れていることが判る。
異なるロットでも本発明培地は、細胞核の巨大化やスピンドル細胞などのない、細胞核の小さなヒト表皮角化細胞を活発に増殖していることが判る。
実施例1及び実施例2に従って、本発明培地及びMCDB153培地を調製して初代ヒト表皮角化細胞の増殖能の比較試験を実施した。
インフォームドコンセントの得られた患者からの手術時で得られた余剰正常皮膚を用いて初代培養を行った。ハサミで皮膚片から脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコPBS(−)(日水製薬(株)製、コード番号:05913、PBSと表記する)10mLにて2回洗浄した。70%エタノールに1分間浸し滅菌し、PBSを10mLにて洗浄後、メスを用いて幅3mm長さ10mm程度の短冊状に切り、ディスパーゼ液5mL(ディスパーゼII(合同酒精(株)製)を250単位/mLとなる様にダルベッコ変法MEM培地(DMEM)で溶解しろ過滅菌した溶液)に浸し、4℃で一晩(18−24時間)静置し酵素処理した。翌日、ピンセットを用いて表皮を真皮から剥離し、表皮をDMEM 5mLにて洗浄、続いて、PBS 5mLにて洗浄後、0.25%トリプシン溶液5mLの溶液中に浸し、37℃で10分間の酵素処理を行った。表皮をトリプシン中和液5mL入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、50mLの滅菌チューブに移した。ディッシュに残存している細胞をPBS 10mLにて回収し、表皮角化細胞浮遊液を調製した。細胞数を数え、1000回転で5分間遠心し細胞を沈殿させた。上清を吸引し、沈殿物の細胞を増殖液体培地1にて懸濁し、100mmコラーゲンコートディッシュ(旭テクノグラス(株)製、I型コラーゲンコートディッシュ、コード番号:4010-010)当たり3×106細胞/10.0mL培養液の割合で播種した。同様に、MCDB153培地にも懸濁し播種した。該培養は37℃、飽和水蒸気下5%炭酸ガス気相下で行い、培養開始後20から24時間後及び以後1日おきに培地交換を行った。ヒト表皮角化細胞は7日間位でディッシュ面一杯にまで良好に増殖したので、次いで継代処理を行い、2代目の継代培養を行った。
本発明培地を用いた場合、ヒト表皮角化細胞は、5日間でディッシュ一杯にまで良好に増殖した。更に、同様にして継代処理と継代培養とを繰り返すことにより、ヒト表皮角化細胞を良好に増殖させることが出来た。
図3に増殖能の比較を、図4に培養後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。その結果、本発明培地によるヒト表皮角化細胞の増殖率は、MCDB153培地の場合に比べて顕著に優れていることが判る。
本発明培地は、細胞核の巨大化やスピンドル細胞などのない、細胞核の小さなヒト表皮角化細胞を活発に増殖していることが判る。
実施例1及び実施例2に従って、MCDB153培地、橋本らの報告する改良培地(特許文献2)、及び本発明培地を調製して、実施例4と同様にして、初代ヒト表皮角化細胞の増殖能の比較試験を実施した。
図5に増殖能の比較を、図6に培養後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。その結果、本発明培地によるヒト表皮角化細胞の増殖率は、MCDB153培地及び特許文献2の培地(図6中、MCDB153 Type-II培地)の場合に比べて、顕著に優れていることが判る。
本発明培地は、細胞核の巨大化やスピンドル細胞などのない、細胞核の小さなヒト表皮角化細胞を活発に増殖していることが判る。
実施例1及び実施例2に従って、本発明培地である増殖液体培地1を調製して初代ヒト角膜上皮細胞の増殖能の試験を実施した。
インフォームドコンセントの得られた患者からの手術時で得られた余剰正常角膜を用いて初代培養を行った。ハサミで角膜から角膜実質細胞をできる限り取り除き、ダルベッコPBS(−)(日水製薬(株)製、コード番号:05913、PBSと表記する)5mLにて2回洗浄した。70%エタノールに1分間浸し滅菌し、PBSを10mLにて洗浄後、メスを用いて幅3mm長さ10mm程度の短冊状に切り、ディスパーゼ液5mL(ディスパーゼII(合同酒精(株)製)を250単位/mLとなる様にダルベッコ変法MEM培地(DMEM)で溶解しろ過滅菌した溶液)に浸し、4℃で一晩(18−24時間)静置し酵素処理した。翌日、ピンセットを用いて角膜上皮細胞を角膜実質から剥離して、角膜上皮細胞をDMEM5mLにて洗浄、続いて、PBS5mLにて洗浄後、0.25%トリプシン溶液5mLの溶液中に浸し、37℃で10分間の酵素処理を行った。角膜上皮細胞をトリプシン溶液5mL入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて角膜上皮片をほぐし、15mLの滅菌チューブに移した。ディッシュに残存している細胞をPBS5mLにて回収し、角膜上皮細胞浮遊液を調製した。細胞数を数え、1000回転で5分間遠心し細胞を沈殿させた。上清を吸引し、沈殿物の細胞を増殖液体培地1にて懸濁し、35mmコラーゲンコートディッシュ(旭テクノグラス(株)製、I型コラーゲンコートディッシュ、コード番号:4000-010)当たり1×106細胞/3.0mL培養液の割合で播種した。該培養は37℃、飽和水蒸気下5%炭酸ガス気相下で行い、培養開始後20から24時間後及び以後1日おきに培地交換を行った。ヒト角膜上皮細胞は10日間位でデイッシュ面一杯にまで良好に増殖したので、次いで継代処理を行い、2代目の継代培養を行った。
継代培養は、細胞浮遊液を4分割して、3mLづつ、4枚の35mmコラーゲンコートディッシュに植え込んで継代培養をする。
ヒト角膜上皮細胞は、7日間でディッシュ一杯にまで良好に増殖した。更に、同様にして継代処理と継代培養とを繰り返すことにより、ヒト角膜上皮細胞を5代まで良好に増殖させることが出来た。
その結果、図7に示すように、本発明培地でヒト角膜上皮細胞を、良好に増殖できることが判る。
本発明培地は、培養翌日の一日目の培養で敷石状の付着細胞が確認され、培養5日目で敷石状の細胞で比較的均一な細胞が多く、上皮様で敷石状に増殖していることが判る。
本発明培地は、ヒト表皮角化細胞のみならず角膜上皮細胞まで増殖できる。このようにヒト上皮細胞の培養技術に応用できる画期的な技術である。
Claims (5)
- 組織培養用のMCDB153基礎培地において、L−アスパラギン酸又はその塩を1.5〜4倍、L−イソロイシン又はその塩を22〜26倍、L−グルタミン又はその塩を1.5〜3倍、L−グルタミン酸又はその塩を1.1〜2倍、L−チロシン又はその塩を3〜6倍、L−トリプトファン又はその塩を5〜7倍、L−バリン又はその塩を0.4〜0.7倍、L−ヒスチジン又はその塩を2〜4倍、L−プロリン又はその塩を0.4〜0.7倍、L−フェニルアラニン又はその塩を4〜7倍、L−メチオニン又はその塩を4〜6倍、L−リジン又はその塩を1.1〜2倍になるようにアミノ酸構成比率を改変し、総アミノ酸量中のL−グルタミン又はその塩の含有量を65重量%以上にしたことを特徴とするヒト上皮細胞培養用基礎培地。
- L−アスパラギン酸又はその塩を1.5〜3倍、L−イソロイシン又はその塩を23〜25倍、L−グルタミン又はその塩を1.5〜2倍、L−グルタミン酸又はその塩を1.1〜2倍、L−チロシン又はその塩を4〜5倍、L−トリプトファン又はその塩を5〜6.5倍、L−バリン又はその塩を0.4〜0.6倍、L−ヒスチジン又はその塩を2〜3倍、L−プロリン又はその塩を0.4〜0.6倍、L−フェニルアラニン又はその塩を5〜6倍、L−メチオニン又はその塩を4〜5倍、L−リジン又はその塩を1.1〜2倍になるようにアミノ酸構成比率を改変し、総アミノ酸量中のL−グルタミン又はその塩の含有量を65〜75重量%にしたものである請求項1記載の基礎培地。
- 請求項1又は2記載の基礎培地成分、及びヒト上皮細胞の増殖に必要な成長促進物質を含有するヒト上皮細胞培養用培地。
- 動物組織抽出物を含まないものである請求項3記載の培地。
- 請求項3又は4記載の培地中でヒト上皮細胞を培養することを特徴とする培養ヒト上皮の製造法。
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