JP5253749B2 - 表皮シートの作製方法および初代培養時における培養容器への上皮幹細胞の接着性付与方法 - Google Patents
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Description
本発明は、安全性が高く、かつ、簡易な上皮幹細胞の分化誘導方法に関する。
近年、培養表皮や培養真皮などの培養上皮組織を再生医療に用いる研究開発が盛んに行われており、既にこれらが医薬品として供給されている国もある。培養上皮組織を得るための上皮幹細胞の培養方法は数多く存在するが、表皮幹細胞の培養方法を例に挙げると、代表的な方法としてＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法（非特許文献１）とＢｏｙｃｅ＆Ｈａｍ法（非特許文献２）がよく知られている。
Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法の特徴は、表皮幹細胞のみの選択的培養を行うために、マウスの間葉系線維芽細胞（３Ｔ３）を支持体（ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒ）として用いる点にある。また、この方法によれば、表皮幹細胞が分化することで、機能的にほぼ完全な表皮シート（細胞シート）を得ることができる。
一方、Ｂｏｙｃｅ＆Ｈａｍ法の特徴は、無血清培地を用いる点にある。しかしながら、この方法では表皮幹細胞は分化しないので、表皮シートを得るためには、ウシ由来の血清成分を添加するなどして表皮幹細胞の分化誘導を行う必要がある。
Rheinwald JG, Green H, Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes, Cell, 1975:6;331-343. Boyce ST, Ham RG, Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture, J. Invest. Dermatol., 1983:81;33s-40s.
Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法の特徴は、表皮幹細胞のみの選択的培養を行うために、マウスの間葉系線維芽細胞（３Ｔ３）を支持体（ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒ）として用いる点にある。また、この方法によれば、表皮幹細胞が分化することで、機能的にほぼ完全な表皮シート（細胞シート）を得ることができる。
一方、Ｂｏｙｃｅ＆Ｈａｍ法の特徴は、無血清培地を用いる点にある。しかしながら、この方法では表皮幹細胞は分化しないので、表皮シートを得るためには、ウシ由来の血清成分を添加するなどして表皮幹細胞の分化誘導を行う必要がある。
Rheinwald JG, Green H, Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes, Cell, 1975:6;331-343. Boyce ST, Ham RG, Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture, J. Invest. Dermatol., 1983:81;33s-40s.
上記の通り、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法とＢｏｙｃｅ＆Ｈａｍ法のいずれの方法を用いた場合でも、人体から採取した表皮幹細胞から表皮シートを得るためには、動物成分が必要となる。安全性の高い表皮シートを安定に供給するためには、動物成分を不要とし、完全アニマルフリー化を図ることが望ましい。Ｂｏｙｃｅ＆Ｈａｍ法の変法として、動物成分を用いることなく表皮幹細胞の分化誘導を行うことができれば、この目的を達成することができるが、未だそのような方法についての報告はない。
そこで本発明は、高い安全性のもとに簡易に表皮幹細胞をはじめとする上皮幹細胞の分化誘導を行うための方法を提供することを目的とする。
そこで本発明は、高い安全性のもとに簡易に表皮幹細胞をはじめとする上皮幹細胞の分化誘導を行うための方法を提供することを目的とする。
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、多血小板血漿（ＰＲＰ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ：血小板を多く含む血漿）を添加した無血清培地中で表皮幹細胞を培養することで、表皮幹細胞の分化誘導を行うことができることを知見した。
上記の知見に基づいてなされた本発明の表皮シートの作製方法は、請求項１記載の通り、多血小板血漿を添加した無血清培地中で表皮幹細胞を初代培養した後、多血小板血漿を添加しない無血清培地に培地交換して継代培養し、コンフルエントになったら多血小板血漿を添加した無血清培地に再び培地交換して表皮幹細胞を分化誘導することを特徴とする（但し表皮幹細胞の初代培養から分化誘導に至るまで支持体（Ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒ）は用いない）。
本発明によれば、高い安全性のもとに簡易に表皮幹細胞をはじめとする上皮幹細胞の分化誘導を行うための方法を提供することができる。従って、この方法によって表皮幹細胞の分化誘導を行うことで、動物成分を用いることなく熱傷などの治療に有用な表皮シートを得ることができる。
本発明の上皮幹細胞の分化誘導方法は、多血小板血漿を添加した無血清培地中で上皮幹細胞を培養することを特徴とするものである。本発明において分化誘導の対象とすることができる上皮幹細胞の代表例としては表皮幹細胞を挙げることができる。しかしながら、本発明においては、胃粘膜上皮幹細胞、気管上皮幹細胞、毛根から採取した幹細胞といったあらゆる上皮幹細胞をその対象とすることができる。本発明において用いる多血小板血漿は、遠心分離操作などの自体公知の操作によって血液中の血小板を濃縮したものであればどのようなものであってもよい。多血小板血漿は、培養対象となる上皮幹細胞に対して自家のものが望ましいが、対象者の血族両親や兄弟などの同種のものであってもよい。無血清培地への多血小板血漿の添加量は０．１〜５％とすることが望ましい。添加量は少なすぎると効果が現れにくい一方、必要以上に添加しても効果の向上は望めない。
無血清培地への多血小板血漿の添加は、上皮幹細胞の分化誘導を行う際（即ち上皮幹細胞が表皮幹細胞の場合には表皮シートを形成させる際）に用いる無血清培地に対して行いさえすれば、初代培養開始当初からその時点に至るまでの継代培養に用いる無血清培地には添加する必要は必ずしもない（添加しないことで対象者などからの採血量の削減を図ることができる）。しかしながら、多血小板血漿には、上皮幹細胞に対する分化誘導作用があることに加え、初代培養時における培養容器への上皮幹細胞の接着性付与作用があることを本発明者は見出している。従って、培養容器での初代培養時の培地として多血小板血漿を添加した無血清培地を用いることで、動物由来の接着因子などで表面処理した培養容器を用いることなく、安全かつ低コストに初代培養を行うことができる。
なお、本発明において多血小板血漿を添加する無血清培地は、上皮幹細胞を培養することができる無血清培地であればどのようなものであってもよく、例えば、血清を含まず、アミノ酸類、ビタミン類、無機塩類、糖類などを含むものが挙げられる（具体的にはイーグルＭＥＭ培地やダルベッコ変法イーグル培地などが例示される）。無血清培地には、ハイドロコーチゾン、インシュリン（ヒト型組換え体が望ましい）、上皮細胞増殖因子（ヒト型組換え体が望ましい）、トランスフィリン（ヒト由来が望ましい）などを添加してもよい。また、上皮幹細胞の初代培養から継代培養を経て分化誘導を行うまでの一連の培養方法は、上皮幹細胞の培養方法として知られている一般的な方法（例えば培養条件として５〜１０％ＣＯ２、３７℃、１００％湿度）を採用すればよい。
以下、本発明を、実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
実施例１：表皮幹細胞の培養と分化誘導による表皮シートの作製（その１）
（１）採皮とその処理
上腕部をポビドンヨード液（イソジン消毒液）で消毒した後、１平方センチメートル程度の全層皮膚を採皮した（局所麻酔下での標準的な手技による）。採取皮膚を生理食塩液で２回リンスし、８０％エタノール溶液に１分間浸漬した後、生理食塩液でさらに２回リンスした。こうして得られた皮膚を３００μｇ／ｍＬゲンタシン含有生理食塩液中で３０分間３７℃で保存した。
次に以下の操作をクリーンベンチ内で行った。上記の除菌済みの皮膚を剪刀を用いて約１〜２ｍｍ角に細切し、等張性リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で一度洗浄後、ポビドンヨード液に２分間浸漬した。その後、細切皮膚をポビドンヨード液から取り出してＰＢＳで３〜４回洗浄し、３０ｍＬ程度の０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ中にこの除菌済みの細切皮膚を浮遊させ、４℃で１８時間保存した。
上記の酵素消化された皮膚を３０ｍＬ程度の２％自家多血小板血漿（抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを添加した全血を９００×Ｇで遠心分離することで調製）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ培地）に移し、遊離細胞を得るために室温で約１時間撹拌し、Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ（７０μｍ，ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を用いて皮膚残渣を瀘去した。こうして得られた遊離細胞浮遊液を１２００回転、５分間、４℃で遠心分離し、上清を廃棄して表皮幹細胞の沈渣を得た。
（１）採皮とその処理
上腕部をポビドンヨード液（イソジン消毒液）で消毒した後、１平方センチメートル程度の全層皮膚を採皮した（局所麻酔下での標準的な手技による）。採取皮膚を生理食塩液で２回リンスし、８０％エタノール溶液に１分間浸漬した後、生理食塩液でさらに２回リンスした。こうして得られた皮膚を３００μｇ／ｍＬゲンタシン含有生理食塩液中で３０分間３７℃で保存した。
次に以下の操作をクリーンベンチ内で行った。上記の除菌済みの皮膚を剪刀を用いて約１〜２ｍｍ角に細切し、等張性リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で一度洗浄後、ポビドンヨード液に２分間浸漬した。その後、細切皮膚をポビドンヨード液から取り出してＰＢＳで３〜４回洗浄し、３０ｍＬ程度の０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ中にこの除菌済みの細切皮膚を浮遊させ、４℃で１８時間保存した。
上記の酵素消化された皮膚を３０ｍＬ程度の２％自家多血小板血漿（抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを添加した全血を９００×Ｇで遠心分離することで調製）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ培地）に移し、遊離細胞を得るために室温で約１時間撹拌し、Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ（７０μｍ，ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を用いて皮膚残渣を瀘去した。こうして得られた遊離細胞浮遊液を１２００回転、５分間、４℃で遠心分離し、上清を廃棄して表皮幹細胞の沈渣を得た。
（２）表皮幹細胞の初代培養
（１）で得られた表皮幹細胞の沈渣を２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地に懸濁し、３×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２程度の細胞密度でディッシュに播種し、１０％ＣＯ２、３７℃、１００％湿度下で初代培養を行った。図１（ａ）に培養開始から７２時間経過後のディッシュ内の様子を、（ｂ）にＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法に従って初代培養を開始してから７２時間経過後のディッシュ内の様子を示す（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ染色による）。図１から明らかなように、２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地を用いることで、播種した表皮幹細胞はコロニーを作りながらディッシュの底面に接着して効率よく増殖し、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法よりも優れた初代培養時の細胞接着性が得られた。次に、初代培養開始から３日以内に、ＥｐｉＬｉｆｅ（倉敷紡績製の無血清培地の商品名）に、ハイドロコーチゾン０．５μｇ／ｍＬ、ヒト型組換えインシュリン１０μｇ／ｍＬ、ヒト型組換え上皮細胞増殖因子０．１ｎｇ／ｍＬ、ヒト由来トランスフィリン５μｇ／ｍＬを添加した培地（以下「培地Ａ」と略称する）に培地交換を行い、以後、２日に１度の割合で同じ培地交換を行って表皮幹細胞を培養した。
（１）で得られた表皮幹細胞の沈渣を２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地に懸濁し、３×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２程度の細胞密度でディッシュに播種し、１０％ＣＯ２、３７℃、１００％湿度下で初代培養を行った。図１（ａ）に培養開始から７２時間経過後のディッシュ内の様子を、（ｂ）にＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法に従って初代培養を開始してから７２時間経過後のディッシュ内の様子を示す（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ染色による）。図１から明らかなように、２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地を用いることで、播種した表皮幹細胞はコロニーを作りながらディッシュの底面に接着して効率よく増殖し、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法よりも優れた初代培養時の細胞接着性が得られた。次に、初代培養開始から３日以内に、ＥｐｉＬｉｆｅ（倉敷紡績製の無血清培地の商品名）に、ハイドロコーチゾン０．５μｇ／ｍＬ、ヒト型組換えインシュリン１０μｇ／ｍＬ、ヒト型組換え上皮細胞増殖因子０．１ｎｇ／ｍＬ、ヒト由来トランスフィリン５μｇ／ｍＬを添加した培地（以下「培地Ａ」と略称する）に培地交換を行い、以後、２日に１度の割合で同じ培地交換を行って表皮幹細胞を培養した。
（３）表皮幹細胞の継代培養
初代培養開始から６〜７日目に継代操作を次のようにして行った。ディッシュ内の培養表皮幹細胞を０．０２％ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ディッシュ内に０．０３％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳを添加し、３７℃で約５分間静置して細胞を剥離させた。その後、愛護的にピペッティングを行い、１ｍＬ程度の自家血清中に得られた遊離細胞を移して遠心分離を行った。得られた表皮幹細胞の沈渣を培地Ａを用いて細胞密度を２５００ｃｅｌｌ／ｃｍ２以上に調整した後、ディッシュに継代した。１日後に培地Ａに培地交換を行い、以後、２日に１度の割合で同じ培地交換を行って表皮幹細胞がコンフルエントになるまで培養した。
初代培養開始から６〜７日目に継代操作を次のようにして行った。ディッシュ内の培養表皮幹細胞を０．０２％ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ディッシュ内に０．０３％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳを添加し、３７℃で約５分間静置して細胞を剥離させた。その後、愛護的にピペッティングを行い、１ｍＬ程度の自家血清中に得られた遊離細胞を移して遠心分離を行った。得られた表皮幹細胞の沈渣を培地Ａを用いて細胞密度を２５００ｃｅｌｌ／ｃｍ２以上に調整した後、ディッシュに継代した。１日後に培地Ａに培地交換を行い、以後、２日に１度の割合で同じ培地交換を行って表皮幹細胞がコンフルエントになるまで培養した。
（４）表皮幹細胞の分化誘導（表皮シートの作製）
表皮幹細胞がコンフルエントになったことを確認した後、２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地に培地交換を行い、３日間以上、表皮幹細胞を培養した。その結果、表皮幹細胞が分化することで重層化が進み、表面が水泡状となった強くて腰のある表皮シートが形成された。なお、２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地に培地交換を行うことなく、培地Ａを用いて引き続き表皮幹細胞を培養しても、表皮幹細胞は分化せず、表皮シートは形成されなかった。図２（ａ）に以上のようにして分化誘導を行った後のディッシュ内の様子を、（ｂ）にＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法に従って培養した後のディッシュ内の様子を示す（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ染色による）。また、図３（ａ）に以上のようにして分化誘導を行った後の細胞の位相差顕微鏡写真を、（ｂ）にＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法に従って培養した後の細胞の位相差顕微鏡写真を、（ｃ）に培地Ａを用いて引き続き培養した後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
表皮幹細胞がコンフルエントになったことを確認した後、２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地に培地交換を行い、３日間以上、表皮幹細胞を培養した。その結果、表皮幹細胞が分化することで重層化が進み、表面が水泡状となった強くて腰のある表皮シートが形成された。なお、２％自家多血小板血漿含有ＤＭＥ培地に培地交換を行うことなく、培地Ａを用いて引き続き表皮幹細胞を培養しても、表皮幹細胞は分化せず、表皮シートは形成されなかった。図２（ａ）に以上のようにして分化誘導を行った後のディッシュ内の様子を、（ｂ）にＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法に従って培養した後のディッシュ内の様子を示す（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ染色による）。また、図３（ａ）に以上のようにして分化誘導を行った後の細胞の位相差顕微鏡写真を、（ｂ）にＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法に従って培養した後の細胞の位相差顕微鏡写真を、（ｃ）に培地Ａを用いて引き続き培養した後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
参考例１：表皮シートを用いた移植
移植当日、１０ｍＬ程度の４００Ｕ／ｍＬディスパーゼ含有ＤＭＥ培地に培地交換を行い、３７℃で３０〜６０分間静置し、得られた表皮シートがディッシュの底面辺縁から十分に剥離することを確認した後（鑷子でつまむことで容易に確認できる）、トレックスガーゼをキャリアとして表皮シートをディッシュから剥離し、ＰＢＳで数回洗浄後、熱傷創面に移植した。
移植当日、１０ｍＬ程度の４００Ｕ／ｍＬディスパーゼ含有ＤＭＥ培地に培地交換を行い、３７℃で３０〜６０分間静置し、得られた表皮シートがディッシュの底面辺縁から十分に剥離することを確認した後（鑷子でつまむことで容易に確認できる）、トレックスガーゼをキャリアとして表皮シートをディッシュから剥離し、ＰＢＳで数回洗浄後、熱傷創面に移植した。
実施例２：表皮幹細胞の培養と分化誘導による表皮シートの作製（その２）
自家多血小板血漿のかわりに同種多血小板血漿（兄弟のもの）を用いたこと以外は実施例１と同様にして表皮幹細胞の培養と分化誘導を行って表皮シートを得た。図４に初代培養時における同種多血小板血漿の無血清培地への添加量と培養効率との関係を示す（従来法はＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法を意味する）。図４から明らかなように、自家多血小板血漿のかわりに同種多血小板血漿を無血清培地に添加して初代培養を行った場合でも、優れた効率で表皮幹細胞を培養できることがわかった。
自家多血小板血漿のかわりに同種多血小板血漿（兄弟のもの）を用いたこと以外は実施例１と同様にして表皮幹細胞の培養と分化誘導を行って表皮シートを得た。図４に初代培養時における同種多血小板血漿の無血清培地への添加量と培養効率との関係を示す（従来法はＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法を意味する）。図４から明らかなように、自家多血小板血漿のかわりに同種多血小板血漿を無血清培地に添加して初代培養を行った場合でも、優れた効率で表皮幹細胞を培養できることがわかった。
実施例３：胃粘膜上皮幹細胞の培養と分化誘導
表皮幹細胞のかわりに胃粘膜上皮幹細胞を対象としたこと以外は実施例１と同様の操作を行うことで、胃粘膜上皮幹細胞の培養と分化誘導を行うことができた。
表皮幹細胞のかわりに胃粘膜上皮幹細胞を対象としたこと以外は実施例１と同様の操作を行うことで、胃粘膜上皮幹細胞の培養と分化誘導を行うことができた。
本発明は、高い安全性のもとに簡易に表皮幹細胞をはじめとする上皮幹細胞の分化誘導を行うための方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
Claims (1)
- 多血小板血漿を添加した無血清培地中で表皮幹細胞を初代培養した後、多血小板血漿を添加しない無血清培地に培地交換して継代培養し、コンフルエントになったら多血小板血漿を添加した無血清培地に再び培地交換して表皮幹細胞を分化誘導することを特徴とする表皮シートの作製方法（但し表皮幹細胞の初代培養から分化誘導に至るまで支持体（Ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒ）は用いない）。
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| JP2007071252A JP5253749B2 (ja) | 2007-03-19 | 2007-03-19 | 表皮シートの作製方法および初代培養時における培養容器への上皮幹細胞の接着性付与方法 |
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