JP2006506063A - 毛髪誘導細胞の培養 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は更に、男性型はげ頭症の処置(例えば化粧法)のための、本明細書に記載の方法を用いて得られる例えばDP細胞及び/又はDS細胞等の培養毛髪誘導細胞の使用を提供する。
調整培地(CM)の調製
CM試験用の増殖細胞がコンフルエント段階に近づいた時、新鮮培地を供給した。5日後、培地を除き、0.22μmフィルターでろ過し、細胞及び残骸を除いた。当該CMは、新鮮培地と1:1(体積:体積)の割合で混合し、培養した真皮乳頭細胞を供給するために用いた。CMは標準的条件下で増殖したヒトのケラチノサイトから生成させた。
以下の外胚葉性起源の細胞種を試験した:2種のヒト乳癌細胞株;MCF−7(American Type Culture Collection; ATCC)及びMDA−MB−231(ATCC)及び胎児性腫瘍細胞株であるN−テラ−2(P. Andrews, Sheffield, UK)、ヒト乳房上皮細胞(Cascade Biologics, Oregon, USA)及びヒトメラノサイト(Cambrex, New Jersey, USA)。以下の中胚葉起源の細胞種を試験した:ヒト真皮繊維芽細胞(HDF、新鮮な摘出ヒト組織から単離し、標準的条件下で増殖した)、骨格筋芽細胞(Cambrex)、前立腺上皮細胞(Cambrex)。試験に使用できる他の細胞種は:腎上皮細胞、内皮細胞及び免疫系細胞(中胚葉起源);及び肝細胞及び膀胱上皮組織(外胚葉起源)。特に断らなければ、細胞種は供給者によって推奨される条件下で培養する。
ヒトDPは、毛髪リンパ小節からDPを顕微解剖した後、培地中に入れた。標準培地で5日後、培地を試験CMと交換した。培養液を2〜3日毎に交換し、培養をコンフルエントになるまで継代した。培養を当該方法で数継代維持した。図2及び3に示す細胞は、3継代での写真である。
皮膚再構成試験(Lichti, et al., 1993, J, Invest. Dermatol. 101: 124S-129S; and Weinberg et al., 1993, J Invest. Dertmatol. 100: 229-236)を培養毛髪誘導(例えばDP)細胞による毛髪誘導を試験するために使用した。麻酔したマススの背中に円形の十分に深い傷を作り、移植チェンバー(graft chamber)をその傷中に設置した。培養真皮乳頭細胞又は真皮繊維芽細胞(負のコントロールとして)と混合した齧歯動物のケラチノサイトを、移植チェンバーを通して注射した。1週間後、チェンバーを外し、外傷に包帯をした。移植細胞は十分に厚い皮膚を形成し、毛髪誘導真皮乳頭細胞が存在している場合には新しい毛髪リンパ小節も形成された。DP細胞によって誘導された新しい毛髪が移植から4週間以内に現れた。
真皮乳頭細胞は、最初に単離された時に特徴的な形態を有する。当該細胞は小さく、丸く又は多角形で、かつ無規律な群集中で増殖する(図1)。いくつかの初期の群集の中には、分割していない大きな平坦な細胞が存在する。標準的培地中での培養で時間超過すると、大きな平坦な細胞の割合が増加する。当該細胞は毛髪リンパ小節形成を誘導する能力が低い。従って、理想的な培養条件下で観察された形態は、毛髪誘導能の最初の兆候として見ることができる。
Claims (28)
- 調整細胞によって調整された培地を含む培養液中で毛髪誘導細胞を培養する工程を含む毛髪誘導細胞の培養方法であって、当該調整細胞が非表皮性組織に由来する、前記方法。
- 前記組織が非外胚葉性である、請求項1記載の方法。
- 前記組織が中胚葉起源である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記調整細胞が前立腺上皮細胞である、請求項3記載の方法。
- 前記調整細胞がヒト真皮繊維芽細胞である、請求項3記載の方法。
- 前記組織が内胚葉起源である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記毛髪誘導細胞の毛髪誘導能が維持されている、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 前記培養液が前記調整培地から本質的に成る、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 前記培養液が前記非表皮性組織由来の調整細胞を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 前記毛髪誘導細胞が真皮乳頭(DP)細胞及び/又は真皮鞘(DS)細胞である、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 前記調整培地が細胞株(例えば樹立された細胞株)を使用して得られる、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記細胞株が、移植に関連する危険因子について選別され、かつ試験されているドナーに由来するものである、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
- 前記培養液が組み換え遺伝子及び/又はその組み換え産物を含まない、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記培養液がウイルス性ベクターを含まない、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 前記調整培地が使用前に凍結されている、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
- 前記調整培地が、10μg/mlを超える、例えば100μg/mlを超える又は1mg/mlを超える総蛋白含量を有する無血清成分を含む、請求項1〜15のいずれか1記載の方法。
- 前記調整培地が使用前に(例えば限外濾過によって)濃縮されている、請求項1〜15のいずれか1項記載の方法。
- 3以上の継代、例えば7以上の継代のための培養液中で前記毛髪誘導細胞を継代培養する工程を更に含む、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
- 培養もしくは継代培養された毛髪誘導細胞を採取又は単離する工程を更に含む、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
- 前記毛髪誘導細胞が非表皮性組織に対して同種異系である、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
- 前記毛髪誘導細胞が非表皮性組織に対して自系である、請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
- 哺乳動物種の真皮乳頭(DP)細胞及び/又は真皮鞘(DS)細胞の長期間培養方法であって、当該方法が、非表皮性組織(例えば中胚葉組織及び/又は内胚葉組織のような非外胚葉組織)に由来する1以上の哺乳動物細胞によって調整される培地から本質的に成る又は当該培地が補充されている細胞培養液中でDP及び/又はDS細胞を培養かつ継代培養し、それによってDP及び/又はDS細胞を増殖すると同時にそれらの毛髪誘導能を維持する工程を含む、前記方法。
- 移植のための真皮乳頭(DP)及び/又は真皮鞘(DS)細胞を提供しかつ維持するための方法であって、当該方法が、DP及び/又はDS細胞を対象から得、そして請求項1〜22のいずれか1項記載の条件下で当該DP及び/又はDS細胞を培養する工程を含む、前記方法。
- 請求項1〜23のいずれか1記載の方法を用いて取得し得る培養毛髪誘導細胞、例えばDP細胞及び/又はDS細胞。
- 男性型はげ頭症の治療(例えば化粧法)のための請求項23記載の培養毛髪誘導細胞、例えばDP細胞及び/又はDS細胞の使用。
- In vitroでの皮膚等価物の製造における、請求項23記載の培養毛髪誘導細胞、例えばDP細胞及び/又はDS細胞の使用。
- 毛髪誘導細胞、及び非表皮性組織(例えば中胚葉組織及び/又は内胚葉組織のような非外胚葉組織)に由来する細胞を調整することによって調整された培地を含む培養液を含む組成物。
- 毛髪誘導細胞の培養のための培養液であって、当該培養液が、非表皮性組織(例えば前立上皮細胞及び/又は内胚葉由来細胞のような中胚葉由来の細胞)によって調整された培地を含み、かつ前記毛髪誘導細胞の毛髪誘導能を維持することができる、前記培養液。
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