JP2021500897A - 毛乳頭及び毛包同等物をインビトロで調製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
− 成長期は、個々の毛髪の活性期であり、その間、毛髪は生存し、規則的に成長する。これは、4〜7年続く。個々の毛髪の毛根の毛球の毛乳頭を包囲する胚細胞は、個々の毛髪の生存及び成長を可能とする材料を継続的に産生する。次に、胚細胞の増大は、毛包の基部において停止する。次いで、個々の毛髪の活性期が終了し;別の期が開始し、それはかなり短期である。
− 退行期:わずか15日後、個々の毛髪の毛球は消失し(それというのも、胚細胞の遮断のためそれはもはや栄養供給されないため)、加速速度において変形する。毛乳頭は消失し、すなわち、中空の毛球が中実になり;これは角化し、硬化し、角質化する。次いで、個々の毛髪は死滅し;毛包は、個々の死滅毛髪を放出するように縮む。
− 休止期は、約3ヵ月続く期であり、その間、個々の死滅毛髪は抜け落ちを待つ。抜け落ちのため、個々の毛髪は、次いで同一の毛包中で成長し、古い毛髪を放出する新たな個々の毛髪により押し出されなければならない。
− 皮膚由来の出芽物であり、毛包の基部に位置する毛乳頭。これは成長因子及び細胞外毛母体タンパク質のその貯蔵を介する個々の毛髪の栄養摂取及びその成長の調節に関与する血管の多い部位である。この情報は毛母体中で産生される毛母細胞に伝達され、その分化が可能となる((非特許文献1))。
− 毛乳頭を包み込む区域であり、それほど分化していない毛母細胞の集塊から構成される毛母体。これは、強力な有糸分裂活性の部位である。毛球中に位置し、毛乳頭周囲の小細胞集塊を形成する毛母細胞は、主として、胚芽層を構成し、急激に増殖して分化して毛幹を形成するケラチノサイトの前駆体から構成され、したがって、毛周期における不可欠な役割を担う。成長期の開始から前記期の終了まで、それらの毛母細胞は退行期まで増殖し、次いで休止期において消失する。((非特許文献2)、(非特許文献3))。細胞分化は、外上皮鞘(outer epithelial sheath)(ORS)の、内上皮鞘(inner epithelial sheath)(IRS)の、及び次いで毛幹の種々の細胞タイプの形成を可能とする。個々の毛髪の形状を調整するのも、この毛母体である。毛母体は、直毛についてはほぼ対称軸で均一に分布する一方、縮毛については片側で大きく分布する((非特許文献4))。毛母体は、毛髪の色素沈着を担う毛包メラノサイトも含む。これらの毛母細胞の増殖及び分化は、毛乳頭により制御される((非特許文献5));
− 角化区域としても公知の毛球の上方毛母体により産生される外及び内上皮鞘。外上皮鞘は毛包の外殻を構成し:これは表皮の陥入である。これは特に、毛包が周期的に再生される幹細胞を包む。内上皮鞘は、外上皮鞘を毛幹から離隔する。この鞘は、個々の毛髪の成長を伴う同心円状の角化層において組織化される3つの細胞タイプから構成される。ヘンレ層、ハックスレー層及び扁平細胞から形成され、毛母体に方向付けされる毛小皮が区別される;
− 部分的に可視的である毛幹、すなわち毛髪。毛幹の構造は、外側から内側まで3つの区別される層から構成される。毛小皮、毛皮質及び毛髄質が存在し、全て、角化細胞の全てを構成する。
本発明の目的のため、用語「毛乳頭に由来する線維芽細胞」は、毛包の基部に位置する皮膚由来の出芽物上の成長期の毛包の顕微解剖から採取される線維芽細胞を意味する。
用語「増殖性上皮細胞」は、毛包中に存在し、個々の毛髪中に存在する全ての細胞タイプを生じさせ得る上皮細胞を意味する。増殖性上皮細胞は、好ましくは、毛母細胞及び/又は胚細胞から選択される。
本発明は、毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法であって、毛乳頭に及び/又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を、血清不含栄養培養培地Bを含む担体上で、前記担体から前記線維芽細胞が剥離し、一緒に群化して少なくとも1つのスフェロイドを形成することを可能とするために十分な期間培養する少なくとも1つのステップを含み;使用される前記担体の表面は細胞接着を許容せず;前記培養担体は、2D又は3D丸底マイクロプレート培養担体から選択される方法に関する。
a.頭皮試料から成長期毛包を単離すること;
b.毛乳頭の及び/又は結合組織鞘の線維芽細胞を、毛乳頭の及び/又は結合組織鞘の顕微解剖により回収すること;
c.20容量%のウシ胎児血清(FCS)、50〜90mg/lの非必須アミノ酸、並びに任意選択的に50〜200μg/mlの抗生物質及び/又は抗真菌薬が補給されたDMEM Glutamaxからなる栄養培養培地A中で前記毛乳頭線維芽細胞の及び/又は前記結合組織鞘線維芽細胞の増幅を実施すること
も含む。
本発明はまた、インビトロ毛包同等物を調製するための、本発明によるインビトロ毛乳頭同等物の、及び増殖性上皮細胞の使用に関する。
少なくとも1つの本発明による毛乳頭同等物中に播種される増殖性上皮細胞を、37℃及び5%のCO2において、合成培地、例えば、Philpott(1993)により記載される培地中で培養する。
本発明による毛包同等物をインビトロで調製する方法は、少なくとも1つの本発明による毛乳頭同等物の存在下で増殖性上皮細胞を培養するステップ前に、有効量のROCK阻害剤の存在下で増殖性上皮細胞を増幅させる予備ステップを含み得る。
インビトロ毛乳頭及び毛包同等物がそれぞれ、インビボの毛乳頭の、及び毛包の特徴のほとんどを有することを考慮すると、それらを任意選択的に、代用皮膚と組み合わせたインプラントとして使用することができる。
本発明による毛乳頭及び毛包同等物により、特に体毛又は頭髪についての成長キネティクスを確立すること、したがって、インビボ状況で生存し、可能な限り完全な多数の毛髪を要求する任意の試験、例えば、毛周期の、及びこの周期に影響し得る因子の試験(毛髪成長を促進する活性剤の試験まで及ぶ)、抜け毛の撲滅を可能とする活性剤の、又は体毛成長を減速させる活性剤の試験を実施することが可能となる。
実験プロトコル
i.毛乳頭線維芽細胞の顕微解剖
毛乳頭に由来する線維芽細胞を、以下の方法によりサンプリングした:フェイスリフトから切除された成長期毛包を、2%の抗生物質及び非必須アミノ酸が補給された最小培養培地を含有するペトリ皿中に配置する(図1)。
・線維芽細胞増殖のための栄養培養培地A:
線維芽細胞増幅のための栄養培養培地Aは以下の組成を有する:
毛乳頭同等物を調製するための栄養培養培地Bは、以下の組成を有する:
毛包の毛球領域中に位置する毛乳頭を、顕微鏡下で特定する。
単層培養物中の線維芽細胞の増幅後、線維芽細胞をトリプシン処理し、次いで細胞培養のために処理されていないペトリ皿(Falcon(登録商標)細菌ペトリ皿、Corning、参照番号:351007)中に、高密度(例えば、1cm2当たり23800個の細胞)において上記の血清不含栄養培養培地B中で堆積させる。
− 2D担体(Falcon(登録商標)細菌ペトリ皿、Corning)をCorning社により名称Costar(登録商標)のもと販売されている丸底96ウェル3Dマイクロプレート担体に代え;
− 線維芽細胞播種密度23800個の細胞/cm2を9375個の細胞/cm2に代えて、
得られた本発明による毛乳頭同等物も調製した。
実験プロトコル
i.毛母細胞の顕微解剖
毛包を頭皮の手術残渣から抽出する。前記残渣を最初に5mm2片に切断し、次いで外科用メスを真皮及び皮下組織間で使用して分割する。
培養条件は、3つの主要な構成要素を有する:
・基礎培地:
特に示されない限り、本実施例において使用される培地及び緩衝液の全ては、Bell et al.1979,(P.N.A.S.USA,76,1274−1278)、Asselineau and Prunieras,1984,(British J.of Derm.,111,219−222)又はAsselineau et al.,1987,(Models in dermato.,vol.III,Ed.Lowe & Maibach,1−7)に記載されている。
・接着表面:毛母細胞は、マイトマイシン処理により細胞周期を停止させたネズミ3T3線維芽細胞のフィーダー層の存在下でGreenベース培地中で接着及び増殖する。
顕微解剖後、毛母細胞集塊を、事前にフィーダー層が、好ましくは、40000個の放射線照射3T3細胞/cm2が播種され、完全培養培地、例えば、G7F培地+10μMのY27632により被覆された直径60mmのペトリ皿中に堆積させ;70%のコンフルエンスにおける毛母細胞の培養物を得る。
インビトロ毛包同等物を生成するため、細胞をサブコンフルエント段階において酵素処理により回収する。次いで、細胞を、事前に毛乳頭同等物を6000個の細胞/cm2の密度において含有する細胞培養のために処理されていない細菌ペトリ皿(Falcon(登録商標)細菌ペトリ皿、Corning参照番号:351007)中に、実施例1に記載の血清不含栄養培養培地B中で播種する。
1)材料及び方法:
毛乳頭同等物の調製を、国際公開第2009/118283号パンフレットの実施例2に記載の調製プロトコルにより実施した。
− 500mlのDMEM Glutamax(Invitrogen番号31966)
− 5mlの非必須アミノ酸(NEAA)(Gibco番号11140−035)
− 100mMにおける50μlのアスコルビン酸(Sigma番号A8960)、すなわち、最終2.9mg/l
− 5mlのインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム(ITS)(Fisher Scientific番号10524233)
− 400mg/lのBSA
培養担体:平底6ウェルULA(超低接着)3Dプレート。
細胞密度:6660個の細胞/cm2。
細胞:毛乳頭から得られた線維芽細胞(継代P6)。
結論:不規則な縁部を有する異なるサイズの極めて不均一な細胞集合体が観察される。
1)材料及び方法:
毛包同等物の調製を、国際公開第2009/118283号パンフレットの実施例3に記載の調製プロトコルにより実施した。
− 毛乳頭同等物のためのDMEM(+)(DMEM+2%のBSA+ITS+ビタミンC)
− 次いで、DP/MHN/ORS混合培養のためのKSFM
培養担体:平底6ウェルULA(超低接着)プレート。
細胞密度:
− 毛乳頭の調製のため:毛乳頭から得られた線維芽細胞:500000個のDP/F75、すなわち、6660個のDP/cm2;
− 毛包の調製のため:250000個のORS/6ウェル、すなわち、26300個のORS/cm2+25000MHN/6ウェル、すなわち、2630個のMHN/cm2。
細胞:
− 毛乳頭から得られた線維芽細胞(継代P6)。
− メラノサイトM597(継代P4)
− ORS IBからのケラチノサイト(継代P3)
結論:細胞集合体(嚢胞)が、毛包に向かう進化なしで観察される。
1)材料及び方法:
毛乳頭同等物の調製を、実施例1に記載の調製プロトコルにより実施し、Falcon(登録商標)細菌ペトリ皿培養担体、Corning、参照番号351007を細胞培養のための(すなわち、細胞接着を許容する)ペトリ皿培養担体に代えた。
結論:細胞接着を許容する培養担体を使用すると毛乳頭の形成は観察されない。
1)材料及び方法:
本発明外の比較例:
− 3D培養担体:U字底96ウェルULAプレート
− 培養培地:DMEM培地+10%のFCS
− 細胞密度:9375個の細胞/cm2
本発明による毛乳頭同等物:
− 3D培養担体:U字底96ウェルULAプレート
− 培養培地:ウィリアムス培地(血清不含)
− 細胞密度:9375個の細胞/cm2
− 本発明による毛乳頭同等物について、毛乳頭の酵素活性の誘導性のマーカーとして公知のマーカーALPL(アルカリホスファターゼ)、VCAN(バーシカン)及びSFRP2(分泌型フリズルド関連タンパク質2)について過剰発現が観察される。
− 本発明外の比較例について、毛乳頭の酵素活性の誘導性のマーカーとして公知のマーカーALPL(アルカリホスファターゼ)、VCAN(バーシカン)及びSFRP2(分泌型フリズルド関連タンパク質2)について過小発現が観察される。
1)材料及び方法:
毛乳頭から及び増殖性上皮細胞(毛母細胞)から得られた線維芽細胞を含むスフェロイドを製造する第1のステップを、DMEM培地+10%の血清中でU字底96ウェルULAプレート中で実施した。
結論:毛包の形成はコラーゲンゲル中で観察されず;嚢胞は先端構造形成なしで観察される。
Claims (21)
- 毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法であって、毛乳頭に及び/又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を、血清不含栄養培養培地Bを含む担体上で、前記担体から前記線維芽細胞が剥離し、一緒に群化して少なくとも1つのスフェロイドを形成することを可能とするために十分な一定期間培養する少なくとも1つのステップを含み;使用される前記担体の表面は細胞接着を許容せず;前記培養担体は、2D又は3D丸底マイクロプレート培養担体から選択される方法。
- 前記線維芽細胞を、前記2D培養担体上に、少なくとも14000個の細胞/cm2の密度において、好ましくは、14000個の細胞/cm2〜47600個の細胞/cm2、いっそうより良好には、23500個の細胞/cm2〜24500個の細胞/cm2の密度において播種する、請求項1に記載の方法。
- 前記線維芽細胞を、前記3D培養担体上に、少なくとも3000個の細胞/cm2の、好ましくは、少なくとも9000個の細胞/cm2の密度において、いっそうより良好には、9000個の細胞/cm2〜20000個の細胞/cm2の密度において播種する、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養培養培地Bは、500〜1500mg/lのアミノ酸、2〜18mg/lのビタミン、1500〜4500mg/lのグルコース、8750〜10000mg/lの無機塩、2〜20μg/mlのインスリン、2〜60ng/mlのヒドロコルチゾン、並びに任意選択的に50〜200μg/mlの抗生物質及び/又は抗真菌薬を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維芽細胞を、少なくとも3日間、好ましくは、少なくとも4日間、いっそうより良好には、4〜21日間培養する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の表面は、中性であり、疎水性である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維芽細胞を培養するステップの前に、以下の予備ステップ
a.頭皮試料から成長期毛包を単離すること;
b.毛乳頭の及び/又は結合組織鞘の線維芽細胞を、前記毛乳頭の及び/又は前記結合組織鞘の顕微解剖により回収すること;
c.20容量%のウシ胎児血清(FCS)、50〜90mg/lの非必須アミノ酸、並びに任意選択的に50〜200μg/mlの抗生物質及び/又は抗真菌薬が補給されたDMEM Glutamaxからなる栄養培養培地A中で前記毛乳頭線維芽細胞の及び/又は前記結合組織鞘線維芽細胞の増幅を実施すること
も含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法により得ることができるインビトロ毛乳頭同等物。
- 陽性アルカリホスファターゼ活性を有することを特徴とする、請求項8に記載のインビトロ毛乳頭同等物。
- インビトロ毛包同等物を調製するための、請求項8又は9に記載のインビトロ毛乳頭同等物の、及び増殖性上皮細胞の使用。
- 毛包同等物をインビトロで調製する方法であって、少なくとも1つの請求項8又は9に記載の毛乳頭同等物の存在下で増殖性上皮細胞を、マーカーK85及びK35について陽性であるケラチノサイトへの前記増殖性上皮細胞の分化を可能とするために十分な期間培養する少なくとも1つのステップを含む方法。
- 前記増殖性上皮細胞を、少なくとも2000個の細胞/cm2、好ましくは、少なくとも6000個の細胞/cm2の密度において、いっそうより良好には、6000〜10000個の細胞/cm2の密度において播種する、請求項11に記載の方法。
- 前記増殖性上皮細胞を、少なくとも3日間、好ましくは、少なくとも5日間、いっそうより良好には、5〜20日間培養する、請求項11又は12に記載の方法。
- 有効量のROCK阻害剤の存在下で前記増殖性上皮細胞を増殖させる予備ステップも含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法により得ることができるインビトロ毛包同等物。
- 陽性アルカリホスファターゼ活性を有する毛乳頭同等物と、マーカーK85及びK35について陽性であるケラチノサイトとから構成されることを特徴とする、請求項15に記載のインビトロ毛包同等物。
- 100〜250μmの範囲の直径、及び500〜2500μmの範囲の長さを有する中実管状構造を有することを特徴とする、請求項15又は16に記載のインビトロ毛包同等物。
- 毛量低減状態の予防的治療又は治療処置のための、請求項15〜17のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物。
- 脱毛症の治療のための、請求項15〜17のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物。
- 体毛及び/又は頭髪の成長を変調する化合物を同定するための、請求項15〜17のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物の使用。
- 体毛及び/又は頭髪の成長を変調する少なくとも1つの化合物をスクリーニングする方法であって、前記試験化合物を請求項15〜17のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物と接触させるステップ(a)、次いで前記インビトロ毛包同等物の少なくとも1つのパラメータに対する前記化合物の効果を分析するステップ(b)及び前記パラメータを改変する前記化合物を選択するステップ(c)を含む方法。
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