FR3072972A1 - Procede de preparation in vitro d’equivalents de papille dermique et de follicule pileux - Google Patents

Procede de preparation in vitro d’equivalents de papille dermique et de follicule pileux Download PDF

Info

Publication number
FR3072972A1
FR3072972A1 FR1760242A FR1760242A FR3072972A1 FR 3072972 A1 FR3072972 A1 FR 3072972A1 FR 1760242 A FR1760242 A FR 1760242A FR 1760242 A FR1760242 A FR 1760242A FR 3072972 A1 FR3072972 A1 FR 3072972A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
equivalent
cells
hair
vitro
dermal papilla
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR1760242A
Other languages
English (en)
Other versions
FR3072972B1 (fr
Inventor
Khalid Bakkar
Theebah Sellathurai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LOreal SA
Original Assignee
LOreal SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to FR1760242A priority Critical patent/FR3072972B1/fr
Application filed by LOreal SA filed Critical LOreal SA
Priority to CN201880077456.4A priority patent/CN111417717A/zh
Priority to PCT/EP2018/079758 priority patent/WO2019086485A1/fr
Priority to JP2020523695A priority patent/JP7005754B2/ja
Priority to US16/760,109 priority patent/US20200255801A1/en
Priority to BR112020008348-8A priority patent/BR112020008348A2/pt
Priority to KR1020207015309A priority patent/KR102390235B1/ko
Priority to EP18803336.9A priority patent/EP3704226A1/fr
Publication of FR3072972A1 publication Critical patent/FR3072972A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR3072972B1 publication Critical patent/FR3072972B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0627—Hair cells
    • C12N5/0628—Hair stem cells; Hair progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/31—Pituitary sex hormones, e.g. follicle-stimulating hormone [FSH], luteinising hormone [LH]; Chorionic gonadotropins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/094—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells keratinocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C12N2503/06—Screening or testing on artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation in vitro d'un équivalent de papille dermique à partir de fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive ; un procédé de préparation in vitro d'un équivalent de follicule pileux par mise en culture de cellules épithéliales prolifératives sur lesdites papilles dermiques ainsi obtenues ; les équivalents in vitro de papilles dermiques et follicules pileux produits par les procédés précités, leurs utilisations pour le traitement de l'alopécie et pour l'évaluation de l'effet de produits cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques.

Description

Procédé de préparation in vitro d’équivalents de papille dermique et de follicule pileux
La présente invention concerne un procédé de préparation in vitro d’un équivalent de papille dermique à partir de fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive.
La présente invention concerne également un procédé de préparation in vitro d’un équivalent de follicule pileux par mise en culture de cellules épithéliales prolifératives sur lesdites papilles dermiques ainsi obtenues.
Elle concerne, de même, les équivalents in vitro de papilles dermiques et follicules pileux produits par les procédés précités, leurs utilisations pour le traitement de l’alopécie et pour l’évaluation de l’effet de produits cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques.
Durant sa vie, le cheveu connaît trois phases de développement de durées très inégales :
La phase anagène est la phase active du cheveu, celle pendant laquelle il vit et pousse régulièrement. Elle dure de 4 à 7 ans. Les cellules germinales qui entourent la papille du bulbe de la racine du cheveu fabriquent continuellement la matière permettant au cheveu de vivre et de pousser. Ensuite, la multiplication des cellules germinales s’arrête au fond du follicule. La phase active du cheveu est alors terminée ; une autre commence, qui est beaucoup plus courte.
La phase catagène : En 15 jours à peine, le bulbe du cheveu disparait (car il n’est plus alimenté à cause de l’interruption des cellules germinatives) et se transforme à une vitesse accélérée. La papille disparaît, c'est-à-dire que le bulbe creux devient plein ; il se kératinise, se durcit et devient corné. Le cheveu est alors mort ; le follicule se resserre pour expulser le cheveu mort.
La phase télogène est la phase qui dure trois mois environ et pendant laquelle le cheveu mort est en attente de tomber. Afin de tomber, le cheveu doit être poussé dehors par le nouveau cheveu qui pousse à son tour dans le même follicule et qui va expulser l’ancien.
La régénération du follicule pileux se fait alors à partir des cellules-souches, appelées cellules germinales situées dans le “ bulge ”.
Le “ bulge ” est formé par une sous-population cellulaire de la gaine épithéliale externe, appelée cellules germinales, localisée au niveau de la portion moyenne du follicule pileux, et plus exactement au niveau de la zone d’insertion du muscle arrecteur du poil. Ces cellules représentent la partie la plus inférieure de la portion permanente du follicule.
Au niveau du “ bulge ”, les kératinocytes sont relativement indifférenciés, biochimiquement et ultrastructurellement.
Ce “ bulge ” est en position stratégique pour interagir durant la phase télogène tardive, avec l’ascendante papille dermique et initier un nouveau follicule en anagène. Les cellules germinales sont donc des cellules essentielles pour le renouvellement du cheveu. Les cellules germinales (cellules germinatives ou cellules pluripotente ou cellules souches) du cheveu télogène sont impliquées dans la sortie de la phase de dormance du follicule pileux et donc la repousse du cheveu.
Le bulbe pilaire est en forme de poire et il est composé :
De la papille qui est un bourgeonnement d’origine dermique, située à la base du follicule. C’est un site très vascularisé qui participe à la nutrition et à la régulation de la croissance du cheveu par sa réserve en facteurs de croissance et protéines de la matrice extracellulaire. Ces informations seront transmises aux cellules matricielles, élaborées dans la matrice, pour permettre leur différenciation (Rees JL. Genetics of hair and skin color).
De la matrice qui est une zone coiffant la papille dermique, constituée d’un amas de cellules matricielles peu différenciées. C’est le siège d’une intense activité mitotique. Les cellules de la matrice, qui sont localisées dans le bulbe pileux et qui forment un petit amas cellulaire autour de la papille dermique, sont majoritairement constituées de précurseurs de kératinocytes qui constituent une assise germinative et qui prolifèrent rapidement pour se différencier en formant la tige pilaire, jouant ainsi un rôle essentiel dans le cycle pilaire. Du début de la phase anagène jusqu’à la fin de celle-ci, ces cellules matricielles vont proliférer jusqu’à la phase catagène puis disparaître en phase télogène. (Ebling FJ, The biology of hair.Dermatol Clin. 1987 Jul;5(3):467-81. Review; Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M, Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970 Jan;54(l):6581). La différenciation cellulaire va permettre la formation des différents types cellulaires de la gaine épithéliale externe (ORS), interne (1RS) puis de la tige pilaire. C’est aussi cette matrice qui conditionne la forme du cheveu. La matrice se répartit de façon homogène autour d’un axe de symétrie pour le cheveu droit alors qu’elle sera plus importante d’un côté pour le cheveu frisé (Melissopoulos A et Levacher C. Les annexes cutanées. Dans : La peau : structure et physiologie, édition Lavoisier ; 1998. P.57-99). La matrice comprend également des mélanocytes folliculaires qui sont responsables de la pigmentation du cheveu. La prolifération et la différenciation de ces cellules de la matrice sont contrôlées par la papille dermique (Botchkarev VA, Kishimoto J. Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Invest Dermatol Symp Proc. 2003 Jun;8(l):46-55. Review).
Des gaines épithéliales externe et interne qui sont produites par la matrice supérieure du bulbe pileux aussi appelé zone de kératinisation. La gaine épithéliale externe constitue l’enveloppe externe du follicule : il s’agit d’une invagination de l’épiderme. Celle-ci héberge notamment des cellules souches à partir desquelles le follicule pileux sera cycliquement régénéré. La gaine épithéliale interne sépare la gaine épithéliale externe de la tige pilaire. Cette gaine est constituée de trois types cellulaires organisés en couche concentriques kératinisées qui accompagnent la croissance du cheveu. On distingue la couche de Henlé, la couche de Huxley et la cuticule qui est formée de cellules aplaties dirigé vers la matrice pilaire.
De la tige pilaire qui est en partie visible, c’est le cheveu. La structure de la tige pilaire se compose de trois couches distinctes de l’extérieur vers l’intérieur. On retrouve la cuticule, le cortex et la médulla, toutes composées de cellules kératinisées.
L’alopécie est conditionnée par divers facteurs : génétiques, hormonaux et environnementaux, par le régime alimentaire et l’activité physique. Les cheveux tiennent un rôle esthétique et identitaire essentiel.
Ainsi des cheveux sains, vigoureux et une chevelure dense tout au long de la vie est recherché par la plupart des femmes et des hommes.
De nombreuses techniques sont connues pour le traitement de l’alopécie telles que la thérapie cellulaire, le traitement au laser ou encore les implants sans chirurgie. Cette dernière apporte un résultat immédiat et se trouve être beaucoup moins invasive que la chirurgie.
Afin d’obtenir des implants, les follicules pileux humains sont obtenus par la culture de différents types cellulaires présents au niveau du bulbe pilaire.
Depuis plusieurs années, l’homme du métier a mis en culture in vitro des cellules du follicule pileux issues des différents compartiments qui composent le bulbe. Cependant, en culture in vitro 2D, les cellules, en particulier les cellules de la papille dermique perdent leur capacité d’induction dès les premières mises en culture et amplification.
C. Higgins a montré que les cellules de la papille dermique, cultivées in vitro, mais en culture 3D sous forme de sphéroïdes, regagnaient leur capacité d’induction qu’elles avaient perdue en culture 2D. La capacité des cellules de la papille dermique à former des agrégats in vitro semble corréler avec leur potentiel d’induction de la morphogénèse du follicule pileux.
D’autres équipes comme Park en Corée utilisent un milieu riche en acides aminés et vitamines pour former des DPLTs (dermalpapilla like tissue). En particulier, sont décrits respectivement dans les documents suivants WO2009/014272 et US2008/0145929 des équivalents in vitro de papilles dermiques préparés à partir de cellules souches mésenchymateuses issues de cordon ombilical et de fibroblastes issus de papilles dermiques. Cependant, l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses provenant d’un échantillon biologique de cordon ombilical décrite dans le document WO2009/014272 et l’utilisation d’un support classique traité pour la culture cellulaire n’empêchant pas l’adhésion des cellules décrite dans le document US2008/0145929, ne permettent pas d’obtenir des équivalents in vitro de papilles dermiques présentant les caractéristiques essentielles d’une papille dermique vivo, en particulier d’un point de vue morphologique et/ou fonctionnel et notamment une activité enzymatique phosphatase alcaline positive.
Par ailleurs, aucun des modèles précités ne contient de cellules épithéliales prolifératives comme les cellules de la matrice ou les cellules germinales, dont la présence et la quantité sont essentielles à la formation d’une structure folliculaire.
Le document WO2017/055358 divulgue la capacité des cellules de la matrice à régénérer un microfollicule pileux en présence d’inhibiteur de ROCK. Néanmoins ces cellules de la matrice sont ensemencées sur des fibroblastes 3T3 qui ont perdu leur capacité à proliférer impliquant ainsi des différences fonctionnelles et morphologiques comme le montre la figure 10 ci-après.
Il existe donc un besoin de pouvoir disposer d’un équivalent in vitro de follicule pileux présentant la plupart des caractéristiques fonctionnelles et morphologiques d’un follicule pileux vivo, de préférence un follicule pileux humain et notamment susceptible de se régénérer.
De façon surprenante, la demanderesse a mis en évidence d’une part que la culture de fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive dans un milieu et support de culture 2D définis permet d’obtenir un équivalent in vitro de papille dermique présentant la plupart des caractéristiques fonctionnelles et morphologiques d’une papille dermique vivo \ d’autre part que l’ensemencement de cellules épithéliales prolifératives telles que les cellules de la matrice et/ou les cellules germinales sur lesdits équivalents in vitro de papilles dermiques obtenus permet d’obtenir un équivalent in vitro de follicule pileux présentant la plupart des caractéristiques fonctionnelles et morphologiques d’un follicule vivo humain, et notamment susceptible de se régénérer.
Par conséquent, de tels équivalents de papilles dermique et de follicule pileux s’avèrent être particulièrement intéressants pour l’étude de la morphogénèse d’un follicule pileux, pour les tests prédictifs de l’activité d’actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques ainsi que pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d’un état de pilosité réduite, et le traitement de l’alopécie.
Ainsi, selon un premier de ses objets, la présente invention concerne un procédé de préparation in vitro d’un équivalent de papille dermique comprenant au moins une étape de mise en culture de fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive sur un support comprenant un milieu de culture nutritif B exempt de sérum pendant une période de temps suffisante pour permettre auxdits fibroblastes de se détacher dudit support et de se regrouper pour former au moins un sphéroïde ; la surface dudit support utilisé ne permettant pas l’adhésion des cellules.
Un second obj et de la présente invention se rapporte à un équivalent in vitro de papille dermique susceptible d’être obtenu selon le procédé précité.
Un troisième objet de la présente invention se rapporte à l’utilisation d’un équivalent de papille dermique selon l’invention et de cellules épithéliales prolifératives telles que les cellules de la matrice et/ou les cellules germinales pour la préparation d’un équivalent in vitro de follicule pileux.
Selon un autre de ses objets l’invention concerne un procédé de préparation in vitro d’un équivalent de follicule pileux comprenant au moins une étape de culture de cellules épithéliales prolifératives en présence d’au moins un équivalent de papille dermique selon l’invention pendant une période de temps suffisante pour permettre une différenciation desdites cellules épithéliales prolifératives en kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 et K35.
La présente invention se rapporte encore à un équivalent in vitro de follicule pileux susceptible d’être obtenu selon le procédé précité.
La présente invention concerne également les utilisations thérapeutiques de l’équivalent de follicule pileux selon l’invention dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d’un état de pilosité réduite, et le traitement de l’alopécie.
Selon un autre de ses objets l’invention concerne l’utilisation de l’équivalent de follicule pileux selon l’invention pour le test in vitro d’effets d’actifs sur les propriétés pileuses, et en particulier pour l’identification de composé modulateur de la pousse des poils et/ou des cheveux.
La présente invention se rapporte aussi à un procédé de criblage de composés modulateurs de la pousse des poils et/ou des cheveux mettant en œuvre l’équivalent de follicule pileux selon l’invention.
Description détaillée de l’invention
Fibroblastes
Au sens de la présente invention, on entend par « fibroblastes issus de la papille dermique » des fibroblastes prélevés à partir d’une microdissection d’un follicule pileux en phase anagène au niveau du bourgeonnement d’origine dermique situé à la base du follicule pileux.
Egalement, on entend par « fibroblastes issus de la gaine conjonctive » des fibroblastes prélevés à partir d’une microdissection d’un follicule pileux en phase anagène à la base du follicule pileux sous la papille dermique.
Les fibroblastes issus de la papille dermique ou de la gaine conjonctive sont de préférence prélevés à partir de déchets opératoires ou biopsies comme par exemple des déchets de lifting ou un prélèvement de scalp car un simple arrachage du cheveu ne permet pas de récupérer ces cellules.
En particulier, les fibroblastes utilisés dans le cadre de la présente invention ne sont pas des fibroblastes dont la prolifération a été préalablement stoppée, préférentiellement en les ayant préalablement irradiés (par exemple, aux rayons gamma) ou préalablement traités à la mitomycine. De préférence, les fibroblastes selon l’invention ne sont pas des fibroblastes 3T3.
Cellules épithéliales prolifératives
On entend par « cellules épithéliales prolifératives » des cellules épithéliales présentent au niveau du follicule pileux et capables de donner naissance à tous les types cellulaires présents dans un cheveu. Les cellules épithéliales prolifératives sont de préférence choisies parmi les cellules de la matrice et/ou les cellules germinales.
On entend par « cellules de la matrice », les cellules localisées dans le bulbe pileux et qui forment un petit amas cellulaire autour de la papille dermique (Ebling FJ, The biology of hair.Dermatol Clin. 1987 Jul;5(3):467-81. Review; Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M, Human hair cycle. JInvestDermatol. 1970 Jan;54(l):65-81). Ces cellules pourront être échantillonnées, amplifiées et conservées en banques de tissus en vue d’une utilisation ultérieure.
Pour préserver l’intégrité du tissu matriciel, ces cellules pourront être prélevées selon le procédé qui suit : des follicules pileux sont placés dans une boite de Pétri contenant un milieu de culture minimum additionné de 2% d’antibiotique et des acides aminés non essentiels.
Fa région bulbaire est coupée au sommet de la papille dermique ainsi l’épithélium du bulbe est séparé de la papille dermique et de la gaine conjonctive.
Au sens de l’invention, on entend par « cellules germinales », les cellules souches présentes au niveau du « bulge ». De préférence, les cellules germinales sont prélevées en phase télogène.
Au sens de l’invention on entend par « télogène » le follicule qui contenait le cheveu en phase télogène.
Les cellules germinales pourront être prélevées selon le procédé qui suit : des follicules pileux en phase télogène sont placés dans une boite de Pétri contenant un milieu de culture minimum additionné de 2% d’antibiotique et des acides aminés non essentiels.
La région des cellules germinales, appelée le bulge, est extraite de la gaine conjonctive et ensuite placée dans une boite de Pétri contenant une couche nourricière de fibroblastes 3T3i. Cette technique de microdissection permet ainsi de préserver la quantité et l’intégrité des cellules, car elles ne sont pas séparées les unes des autres.
Procédé de préparation d’un équivalent de papille dermique
La présente invention concerne un procédé de préparation in vitro d’un équivalent de papille dermique comprenant au moins une étape de mise en culture de fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive sur un support comprenant un milieu de culture nutritif B exempt de sérum pendant une période de temps suffisante pour permettre auxdits fibroblastes de se détacher dudit support et de se regrouper pour former au moins un sphéroïde ; la surface dudit support utilisé ne permettant pas l’adhésion des cellules.
On entend par « sphéroïde » un microtissu 3D sous la forme d’une sphère dans lequel les cellules vont s’organiser et synthétiser de la matrice extracellulaire. On considère que Ton obtient ledit équivalent de papille dermique lorsque Ton voit apparaître après mise en œuvre du procédé selon l’invention au moins un sphéroïde.
Lors de ladite étape de mise en culture des fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive, on observe la formation de clusters à au moins 1 jour, puis lesdits clusters forment des agrégats à au moins 2 jours. On observe enfin l’apparition de sphéroïdes à au moins 3 jours.
On entend par « clusters » au sens de la présente invention un regroupement de cellules en 2D. Au sens de la présente invention on entend par « agrégats » ou « sphéroïde précoce » un amas de cellules en 3D de forme irrégulière, non organisé et ne synthétisant pas encore de matrice extracellulaire.
Dans un mode de réalisation préféré ledit milieu de culture nutritif B comprend de 500 à 1500 mg/L d’acides aminés, de 2 à 18 mg/L de vitamines, de 1500 à 4500 mg/L de glucose, de 8750 à 10000 mg/L de sels inorganiques, de 2 à 20 pg/ml d’insuline, de 2 à 20 ng/ml d’hydrocortisone, et éventuellement de 0,2% à 2% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotiques.
Avantageusement, ledit milieu de culture nutritif B comprend de 900 à 1250 mg/L d’acides aminés, de 5 à 15 mg/L de vitamines, de 1750 à 2250 mg/L de glucose, de 9000 à 9750 mg/L de sels inorganiques, de 5 à 15 pg/ml d’insuline, de 5 à 15 ng/ml d’hydrocortisone, et éventuellement de 0,5% à 1,5% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotique.
Encore mieux, ledit milieu de culture nutritif B comprend de 950 à 1150 mg/L d’acides aminés, de 5 à 15 mg/L de vitamines, de 1750 à 2250 mg/L de glucose, de 9000 à 9750 mg/L de sels inorganiques, de 5 à 15 pg/ml d’insuline, de 5 à 15 ng/ml d’hydrocortisone, et éventuellement de 0,5% à 1,5% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotique.
Les acides aminés présents dans ledit milieu B sont de préférence choisis parmi la glycine, Lglutamine, L-alanine, L-arginine, L-asparagine-H2O, L-acide aspartique, L-cystéine, L-cystine 2HC1, L-acide glutamique, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, chlorhydrate de L-lysine, Lméthionine, L-phénylalanine, L-proline, L-sérine, L-thréonine, L-tryptophane, sel disodique dihydraté de L-tyrosine, L-valine, et leurs mélanges.
Les vitamines présentes dans ledit milieu B sont de préférence choisies parmi l’acide ascorbique, biotine, chlorure de choline, D-calcium pantothénate, ergocalciferol, acide folique, menadione sodium bisulfate, niacinamide, chlorhydrate de pyridoxal, riboflavine, chlorhydrate dethiamine, rétinyl acétate, vitamine B12, alpha tocopherol phosphate disodique, i-inositol, et leurs mélanges.
Les sels inorganiques présents dans ledit milieu B sont de préférence choisis parmi le chlorure de calcium anhydre (CaC12), sulfate de cuivre pentahydraté (CuSO4-5H2O), sulfate ferreux heptahydraté (FeSO4-7H2O), sulfate de magnésium anhydre (MgSO4), sulfate de manganèse monohydraté (MnSO4-H20), chlorure de potassium (KC1), bicarbonate de sodium (NaHCO3), chlorure de sodium (NaCl), dihydrogénophosphate de sodium anhydre (NaH2PO4), sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO4-7H2O), et leurs mélanges.
A titre d’exemples d’antibiotiques présents dans ledit milieu B on peut citer la pénicilline, la streptomycine, et leurs mélanges.
A titre d’exemples d’antimycotiques présents dans ledit milieu B on peut citer notamment l’amphotéricine B.
Ledit milieu de culture nutritif B exempt de sérum utilisé comprend de préférence moins de 15 pg/ml de facteurs de croissance, de préférence moins de 12 pg/ml de facteurs de croissance. En particulier, les facteurs de croissance présents dans ledit milieu nutritif B sont choisis parmi l’insuline et/ou l’hydrocortisone.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit milieu de culture nutritif B comprend de 80% à 99% en volume de milieu de Williams E, de 250 à 350 mg/L de glutamine, de 2 à 20 pg/ml d’insuline, de 2 à 20 ng/ml d’hydrocortisone, et éventuellement de 0,2% à 2% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotique. Encore mieux, ledit milieu de culture nutritif B comprend de 95% à 98% en volume de milieu de Williams E, de 280 à 320 mg/L de glutamine, de 5 à 15 pg/ml d’insuline, de 5 à 15 ng/ml d’hydrocortisone, et éventuellement de 0,5% à 1,5% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotique.
Le milieu de Williams E est en particulier exempt de glutamine.
Les fibroblastes sont de préférence cultivés pendant au moins 3 jours, encore mieux entre 4 et 21 jours.
Les fibroblastes sont de préférence ensemencés à forte densité. En particulier, en un nombre d’au moins 6000 cellules/cm2, de préférence d’au moins 14000 cellules/cm2, de préférence d’au moins 23800 cellules/cm2 et encore mieux en un nombre compris entre 23800 cellules/cm2 et 47600 cellules/cm2. Dans un mode de réalisation préféré, les fibroblastes sont de préférence ensemencés en un nombre de 23800 cellules/cm2.
Le support utilisé est un support de culture en 2D et peut être par exemple une boîte de pétri bactériologique en plastique, non traitée pour la culture cellulaire.
La surface du support selon l’invention ne permet pas l’adhésion des cellules et notamment des fibroblastes tels que définis précédemment.
La surface dudit support est de préférence neutre. On entend par « surface neutre » au sens de la présente invention, une surface non chargée.
La surface dudit support peut être hydrophobe ou hydrophile, de préférence hydrophobe.
Lorsque ladite surface est hydrophile, celle-ci est recouverte d’une substance telle qu’elle empêche toute adhésion cellulaire, en particulier, une telle substance peut être choisie parmi les hydrogels liés de manière covalente à la surface dudit support.
Dans un mode particulièrement préféré la surface dudit support est neutre et hydrophobe. On pourra utiliser notamment une boite de pétri bactériologique Falcon® commercialisé par la société Coming (référence : 351007).
Le procédé de préparation in vitro d’un équivalent de papille dermique selon l’invention peut comprendre en outre une étape préliminaire d’amplification desdits fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de fibroblastes issus de la gaine conjonctive dans un milieu de culture nutritif A ; ledit milieu de culture nutritif A comprenant au moins du sérum, en particulier du sérum de veau fœtal.
De préférence, le support de culture utilisé pour cette étape d’amplification est un support traité pour permettre l’adhésion des cellules. Ces supports sont ceux classiquement utilisés pour la culture cellulaire et sont donc bien connus de l’homme du métier.
De préférence, ledit milieu de culture nutritif A utilisé à ladite étape d’amplification comprend de 500 à 2000 mg/L d’acides aminés, de 15 à 35 mg/L de vitamines, de 2500 à 4500 mg/L de glucose, de 7500 à 9500 mg/L de sels inorganiques, de 5% à 30% en volume de sérum de veau fœtal, et éventuellement de 0,2% à 2% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotiques.
Préférentiellement, ledit milieu de culture nutritif A utilisé à ladite étape d’amplification comprend de 750 à 1250 mg/L d’acides aminés, de 20 à 30 mg/L de vitamines, de 3000 à 4000 mg/L de glucose, de 8000 à 9000 mg/L de sels inorganiques, de 10% à 25% en volume de sérum de veau fœtal, et éventuellement de 0,5% à 1,5% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotique.
Les acides aminés présents dans ledit milieu de culture A utilisé à ladite étape d’amplification sont de préférence choisis parmi la glycine, L-alanyl-glutamine, chlorhydrate de L-arginine, Lcystine 2HC1, L-histidine hydrochloride-H2O, L-isoleucine, L-leucine, chlorhydrate de Llysine, L-méthionine, L-phénylalanine, L-serine, L-thréonine, L-tryptophane, L-tyrosine, Lvaline, L-alanine, L-asparagine, L-acide aspartique, L-acide glutamique, L-proline, et leurs mélanges.
Les vitamines présentes dans ledit milieu de culture A utilisé à ladite étape d’amplification sont de préférence choisies parmi la chlorure de choline, D-calcium pantothenate, l’acide folique, niacinamide, chlorhydrate de pyridoxine, riboflavine, chlorhydrate de thiamine, i-inositol et leurs mélanges.
Les sels inorganiques présents dans ledit milieu de culture A utilisé à ladite étape d’amplification sont de préférence choisis parmi le chlorure de calcium (CaCl2), le sulfate de magnésium (MgSO4), le nitrate de fer (Fe(NC>3), 9H2O), le chlorure de potassium (KC1), le bicarbonate de sodium (NaHCCh), le chlorure de sodium (NaCl), le dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4, 4H2O), et leurs mélanges.
A titre d’exemples d’antibiotiques présents dans ledit milieu A on peut citer la pénicilline, la streptomycine, et leurs mélanges.
A titre d’exemples d’antimycotiques présents dans ledit milieu A on peut citer notamment l’amphotéricine B.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré ledit milieu de culture nutritif A utilisé à ladite étape d’amplification comprend de 70% à 80% en volume de milieu DMEM Glutamax, de 5% à 25% de sérum de veau fœtal, de 0,5% à 1,5% d’acides aminés non essentiels, et éventuellement de 0,5% à 1,5% d’antibiotiques et/ou d’antimycotiques. Encore mieux, ledit milieu de culture nutritif A comprend 78% en volume de milieu DMEM Glutamax, 20% de sérum de veau fœtal, 1% d’acides aminés non essentiels, et éventuellement 1% d’antibiotiques et/ou d’antimycotiques.
Les acides aminés non essentiels présents dans ledit milieu de culture A utilisé à ladite étape d’amplification sont choisis parmi la L-alanine, L-asparagine, L-acide aspartique, L-acide glutamique, L-proline, L-sérine, et leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé de préparation d’un équivalent in vitro de papille dermique selon l’invention comprend en outre préalablement à l’étape de mise en culture desdits fibroblastes, les étapes préliminaires suivantes :
a. isoler un follicule pileux en phase anagène à partir d’un prélèvement de scalp ;
b. récupérer les fibroblastes de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive à l’aide d’une microdissection de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive ;
c. effectuer une amplification desdits fibroblastes de la papille dermique et/ou de fibroblastes de la gaine conjonctive dans un milieu de culture nutritif A constitué de DMEM Glutamax, de 20% en volume de sérum fœtal de veau (SVF), 1% en volume d’acides aminés non essentiels, et éventuellement 1% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotique.
La présente invention concerne également un équivalent in vitro de papille dermique susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention tel que décrit ci-dessus.
De préférence, l’équivalent de papille dermique selon l’invention est caractérisé en ce qu’il présente une activité phosphatase alcaline positive, et éventuellement une expression positive des protéines choisies parmi BMP2 (Bone morphogenetic protein 2), SFRP2 (secretedfrizzled relatedprotein 2), CORIN, SOX2 et/ou PLC (Perlecan).
L’équivalent de papille dermique selon l’invention est de préférence caractérisé en ce qu’il est constitué de cellules issues d’une étape de mise en culture de fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive sur un support comprenant un milieu de culture nutritif B exempt de sérum pendant une période de temps suffisante pour permettre auxdits fibroblastes de se détacher dudit support et de se regrouper pour former au moins un sphéroïde ; ledit support ne permettant pas l’adhésion des cellules.
L’équivalent de papille dermique selon l’invention est en particulier une sphère de diamètre allant de lOOpm à 250pm. De préférence, l’équivalent de papille dermique selon l’invention est une sphère d’environ 200pm de diamètre.
L’activité enzymatique de la phosphatase alcaline peut par exemple être mesurée par le kit phosphatase alcaline NBT/BCIP commercialisé par le Laboratoire Roche (réf : 11 681 451 001 au 30 octobre 2017) où le BCIP (sel de 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate toluidine), substrat de la phosphatase alcaline, sera d’abord déphosphorylé puis oxydé pour donner un produit coloré bleu.
L’expression protéique des marqueurs BMP2, SFRP2, CORIN, SOX2 et PLC peut par exemple être mesurée à l’aide de la technique d’immunofluorescence, technique par ailleurs bien connue de l’homme du métier.
Procédé de préparation d’un équivalent de follicule pileux
La présente invention concerne en outre rutilisation d’un équivalent in vitro de papille dermique selon l’invention et de cellules épithéliales prolifératives pour la préparation d’un équivalent in vitro de follicule pileux.
La présente invention concerne également un procédé de préparation in vitro d’un équivalent de follicule pileux comprenant au moins une étape de culture de cellules épithéliales prolifératives en présence d’au moins un équivalent de papille dermique selon l’invention pendant une période de temps suffisante pour permettre une différenciation desdites cellules épithéliales prolifératives en kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 et K35.
Les cellules épithéliales prolifératives sont de préférence choisies parmi les cellules de la matrice, les cellules germinales telles que définies précédemment, et leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les cellules épithéliales prolifératives utilisées dans le cadre de la présente invention sont les cellules de la matrice.
Etape de culture des cellules épithéliales prolifératives en présence d’au moins un équivalent in vitro de papille dermique
Les cellules épithéliales prolifératives ensemencées sur au moins un équivalent de papille dermique selon l’invention sont cultivées à 37°C et à 5% de CO2, dans un milieu défini, comme celui décrit par Philpott (1993).
En particulier, les cellules épithéliales prolifératives sont cultivées dans le même milieu de culture nutritif que celui utilisé pour la préparation des équivalents de papille dermique selon l’invention, en particulier le milieu de culture nutritif B exempt de sérum.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit équivalent de papille dermique est obtenu par le procédé de préparation d’équivalent de papille dermique tel que précité au paragraphe « Procédé de préparation d’un équivalent de papille dermique ».
L’étape de culture desdites cellules épithéliales prolifératives en présence d’au moins un équivalent de papille dermique selon l’invention est réalisée de préférence sur le support tel que défini précédemment dont la surface ne permet pas l’adhésion de cellules.
Les cellules épithéliales prolifératives sont de préférence ensemencées à forte densité. De préférence, les cellules épithéliales prolifératives sont ensemencées en un nombre d’au moins 2000 cellules/cm2, de préférence d’au moins 6000 cellules/cm2, et encore mieux en un nombre compris entre 6000 et 10000 cellules/cm2.
De préférence, lesdites cellules épithéliales prolifératives sont cultivées pendant une période de temps suffisante pour permettre la formation d’au moins une structure tubulaire.
Au sens de l’invention on entend par « structure tubulaire », le bourgeonnement observé après culture d’au moins un équivalent de papille dermique selon l’invention associé à des cellules épithéliales prolifératives choisies parmi les cellules de la matrice et/ou les cellules germinales.
Lesdites cellules épithéliales prolifératives sont cultivées en présence d’un équivalent de papille dermique pendant au moins 3 jours, de préférence pendant au moins 5 jours, encore mieux entre 5 et 20 jours, préférentiellement entre 5 et 15 jours.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation de l’équivalent de follicule pileux selon l’invention comprend un étape d’ajout dans le milieu de culture nutritif B de facteurs de croissance choisi parmi les protéines de la famille WNT, en particulier la protéine WNT3 A, les protéines de la famille BMP, en particulier les protéines BMP2 et BMP4, et leurs mélanges. L’ajout desdits facteurs de croissance est réalisé entre le 1er jour et le 5ieme jour à compter de l’ensemencement des cellules épithéliales prolifératives.
La présente invention concerne également un équivalent in vitro de follicule pileux susceptible d’être obtenu selon le procédé précité.
Plus particulièrement, l’équivalent in vitro de follicule pileux est caractérisé en ce qu’il est constitué d’un équivalent de papille dermique présentant une activité phosphatase alcaline positive et de kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 et K35 et éventuellement Ki67. L’activité phosphatase alcaline est mesurée selon la méthode précitée au paragraphe « Procédé de préparation d’un équivalent de papille dermique ».
Les marquages des kératines spécifiques du cheveu K85, K35 et de la protéine Ki67 marqueur de la prolifération cellulaire sont réalisés selon la méthode d’immunoflurorescence.
L’équivalent de follicule pileux présente en particulier une structure tubulaire pleine de diamètre compris entre lOOpm et 250pm, et de longueur d’au moins 500pm, de préférence de longueur allant de 500pm à 2500 pm, encore mieux de 1500 pm à 2500 pm.
Etape préliminaire d’amplification
Le procédé de préparation in vitro d’un équivalent de follicule pileux selon l’invention peut comprendre préalablement à l’étape de culture de cellules épithéliales prolifératives en présence d’au moins un équivalent de papille dermique selon l’invention, une étape préliminaire d’amplification de cellules épithéliales prolifératives en présence d’une quantité efficace d’un inhibiteur de ROCK.
Les cellules épithéliales prolifératives telles que les cellules de la matrice et les cellules germinales sont extraites par microdissection du follicule pileux et sont amplifiées selon la technique de Rheinwald et Green (Cell, vol 6 , 331-344,1975) par culture sur un support nourricier constitué de fibroblastes dans un milieu adapté connu de l'homme du métier, en présence de facteurs de croissance, notamment d'acides aminés, sérum, toxine cholérique, insuline, tri-iodo-thyronine et solution tampon de pH. En particulier, un tel milieu de culture pourra notamment contenir au moins un facteur de croissance mitogénique pour les kératinocytes (par exemple epidermal growth factor (EGF) et/ou kératinocyte growth factor (KGF), en particulier du KGF), de l’insuline, de l’hydrocortisone et facultativement un antibiotique (ex : gentamycine, amphotericine B) auquel a été ajouté un inhibiteur de Rock, en particulier le Y27632.
Avantageusement, ledit milieu pourra comprendre en outre du sérum ou un extrait pituitaire, par exemple d’origine bovine, de l’épinephrine, de la transferrine et/ou des acides aminés non essentiels.
Les fibroblastes utilisés pour cette culture seront plus préférentiellement des fibroblastes 3T3. Les fibroblastes 3T3 sont bien connus de l’homme du métier. C’est une lignée cellulaire de fibroblastes connue depuis 1962. « 3T3 » signifie « 3-day transfer, inoculum 3xl05cells ».
La culture des cellules épithéliales prolifératives est préférentiellement une culture sur des fibroblastes (préférentiellement des fibroblastes 3T3) dont la prolifération a été préalablement stoppée, préférentiellement en les ayant préalablement irradiés (par exemple, aux rayons gamma) ou préalablement traités à la mitomycine. La mitomycine (en particulier, la mitomycine C) bloque la prolifération de ces cellules sans pour autant les empêcher de produire des substances nutritives utiles pour la prolifération des kératinocytes.
Selon l’invention la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK, Y27632, est comprise entre 1 et 100 μΜ et de préférence comprise entre 5 et 25 μΜ et de manière préférée de 10μΜ.
Selon l’invention les cellules épithéliales sont cultivées en présence de l’inhibiteur de ROCK, Y27632, pendant au moins 2 jours et de préférence pendant au moins 3 jours.
De manière préférée les cellules sont mises en culture en un nombre de cellules compris entre 1000 et 4000 cellules et de préférence en un nombre de 3000 cellules par cm2.
Utilisations
Etant donné que les équivalents in vitro de papille dermique et de follicule pileux présentent respectivement la plupart des caractéristiques d’une papille dermique et d’un follicule pileux in vivo, ils pourront être utilisés comme implants, associés ou non à des substituts cutanés.
Les équivalents in vitro de papille dermique et de follicule pileux selon l’invention trouveront donc également des applications pour la préparation d’implants et/ou de substituts cutanés pour traiter un désordre cutané tel qu’une brûlure, un défaut de cicatrisation ou la canitie.
Un effet thérapeutique est défini comme un retour à la normale de l’état de pilosité, que ce soit totalement ou partiellement.
Au sens de l’invention, le traitement prophylactique est recommandé si le sujet possède une condition préalable pour la perte de cheveux, comme une prédisposition familiale.
Les conditions d'une quantité réduite de cheveux peuvent être le résultat de l'alopécie, la calvitie héréditaire, des cicatrices, des brûlures ou de blessures accidentelles.
Ainsi, la présente invention a également pour objet un équivalent de follicule pileux selon l’invention pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d’un état de pilosité réduite.
Un autre de ses objets est un équivalent de follicule pileux selon l’invention pour le traitement de l’alopécie.
Par ailleurs, la présente invention concerne également un équivalent de papille dermique pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d’un état de pilosité réduite ou l’alopécie.
Procédé de criblage de nouveaux actifs
Les équivalents de papille dermique et follicule pileux selon l’invention permettent de réaliser notamment des cinétiques de pousse des poils ou cheveux et donc toute étude nécessitant de nombreux cheveux vivants et aussi complets que possibles dans un contexte in vivo tel que l’étude du cycle du cheveu et des facteurs capables d’influencer ce cycle allant jusqu’à l’étude d’actifs favorisant la croissance du cheveu, d’actifs permettant de lutter contre la chute des cheveux ou encore d’actifs ralentissant la pousse des poils.
Ainsi, la présente invention concerne en outre l’utilisation d’un équivalent in vitro de follicule pileux selon l’invention pour l’identification de composés modulateurs de la pousse des poils et/ou des cheveux.
Par ailleurs, la présente invention concerne également un procédé de criblage d’au moins un composé modulateur de la pousse des poils et/ou des cheveux comprenant une étape (a) de mise en contact dudit composé à tester avec un équivalent in vitro de follicule pileux selon l’invention puis une étape (b) d’analyse de l’effet dudit composé sur au moins un paramètre de l’équivalent in vitro de follicule pileux et une étape (c) de sélection du composé modifiant ledit paramètre.
De préférence, pour la mise en œuvre de l’étape (a), le composé modulateur à tester est appliqué de façon topique, par exemple, formulé dans des formulations topiques classiques ou bien introduit dans le milieu de culture.
L’étape (b) pourra, en particulier, être réalisée par l’analyse de l’expression, de la production et/ou de l’activité de marqueurs liés à la qualité et/ou à l’homéostasie du follicule pileux comme par exemple des marqueurs épidermiques et/ou dermiques, tels que des protéines de structure. Comme exemple de protéines de structure peuvent être citées les kératines du cheveu.
Pour cela, on analysera à l’étape (b) du procédé de criblage l’effet du produit sur la pousse de la tige pilaire.
L’étape (b) d’analyse de l’effet du produit sera préférentiellement une comparaison d’au moins un paramètre mesuré sur l’équivalent de follicule pileux mis en contact avec le produit à tester à celui ou ceux mesuré(s) sur un équivalent de follicule pileux témoin cultivé dans les mêmes conditions mais qui n’a pas reçu le produit à tester.
L’étape (c) de sélection du produit modifiant le paramètre de l’équivalent de follicule pileux se fera en fonction d’un critère déterminé à l’avance.
La modification de ce paramètre pourra être une stimulation, une diminution ou une inhibition totale ou partielle de l’expression, de la production et/ou de l’activité desdits marqueurs et/ou de la pousse de la tige pilaire.
Le critère de sélection dudit produit sera par exemple que ce produit à un effet stimulateur ou inhibiteur du paramètre mesuré.
L’équivalent de follicule pileux selon l’invention peut aussi être utilisé dans des procédés automatisés de criblages de composés cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques pour identifier de nouveaux actifs.
En outre, l’invention se rapporte également à un procédé de criblage d’au moins un composé modulateur de la pousse des poils et/ou des cheveux comprenant une étape (a) de mise en contact dudit composé à tester avec un équivalent in vitro de papille dermique selon l’invention puis une étape (b) d’analyse de l’effet dudit composé sur au moins un paramètre de l’équivalent in vitro de papille dermique et une étape (c) de sélection du composé modifiant ledit paramètre.
Figures
Figure 1 : Localisation des cellules de la matrice et des fibroblastes utilisés dans le cadre de la présente invention.
Figure 2 : Localisation des cellules germinales.
Figure 3 : Amplification des fibroblastes issus de papille dermique dans le milieu de culture nutritif A.
Figure 4 : Obtention d’équivalent de papille dermique après culture des fibroblastes amplifiés dans le milieu de culture nutritif B exempt de sérum.
Figure 5 : T+l jour après ensemencement des cellules de la matrice sur les équivalents de papilles dermiques.
Figure 6 : Formation d’une structure tubulaire à l’origine de la formation d’un équivalent de follicule pileux (T+4 jours à compter de l’ensemencement des cellules de la matrice sur les équivalents de papilles dermiques).
Figure 7 : Croissance de l’équivalent de follicule pileux (T+10 jours à compter de l’ensemencement des cellules de la matrice sur les équivalents de papilles dermiques).
Figure 8 : Activité phosphatase alcaline fortement positive d’équivalent de papille dermique selon l’invention.
Figure 9 : Follicule pileux présentant un marquage positif pour les marqueurs K35, K85 et Ki67. Figure 10 : Comparatif WO2017/055358 : T + 7 jours à compter de l’ensemencement des cellules de la matrice.
Dans la description et dans les exemples suivants, sauf indication contraire, les plages de valeurs libellées sous la forme « entre ... et... » incluent les bornes inférieure et supérieure précisées. Au sens de la présente invention, « au moins un » doit se comprendre, sauf indication contraire, au sens de « un ou plusieurs ».
Fes exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de l’invention.
Exemple 1 - Préparation d’un équivalent de papille dermique
Protocole expérimental
i. Microdissection des fibroblastes de la papille dermique
Fes fibroblastes issus de la papille dermique ont été prélevés selon le procédé qui suit : des follicules pileux en phase anagène, disséqués à partir d’un lifting, sont placés dans une boite de Pétri contenant un milieu de culture minimum additionné de 2% d’antibiotique et des acides aminés non essentiels. (Figure 1).
ii. Conditions de culture • milieu de culture nutritif A pour amplification des fibroblastes :
Fe milieu de culture nutritif A pour amplification des fibroblastes a la composition suivante :
Concentrations finales
DMEM Glutamax (Gibco n° 31966047) 78% en volume
Sérum de veau foetal (SVF) 20% en volume
Acides aminés non essentiels 1% en volume
Antibiotiques / Antimycotiques 1% en volume
• milieu de culture nutritif B pour la préparation des équivalents de papille dermique Le milieu de culture nutritif B pour la préparation des équivalents de papille dermique a la composition suivante :
Concentrations finales
Williams E (sans glutamine) (Gibco n° A12176-01) 98% en volume
L-glutamine 2mM
Antibiotiques / Antimycotiques 1% en volume
Insuline 10pg/ml
Hydrocortisone lOng/ml
Culture-Amplification des fibroblastes de la papille dermique
La papille dermique située dans la région bulbaire du follicule, est repérée sous le microscope. A l’aide d’un scalpel et d’aiguilles, la papille dermique est microdisséquée puis placée dans une 10 boite de culture contenant le milieu de culture nutritif A tel que décrit ci-dessus. (Figure 3).
Culture-Préparation de l’équivalent de papille dermique
Après amplification des fibroblastes en culture monocouche, les fibroblastes sonttrypsinés puis déposés dans une boite de Pétri non traitée pour la culture cellulaire (boite de pétri bactériologique Falcon®, Corning, ref : 351007) à forte densité (par exemple 23800 cellules par cm2), dans le milieu de culture nutritif B exempt de sérum tel que décrit ci-dessus.
Les fibroblastes migrent dans la boite de Pétri et se regroupent pour former des clusters, puis des agrégats cellulaires, pour enfin se détacher du support afin de former des sphéroïdes ou équivalents de papilles dermiques après 5 jours de culture. (Figure 4).
Les papilles dermiques obtenues sont de forme sphérique d’environ 200pm de diamètre.
Un marquage de l’activité enzymatique à la phosphatase alcaline est réalisé à l’aide du kit phosphatase alcaline NBT/BCIP (Roche réf : 11 681 451 001) où le BCIP (sel de 5-Bromo-4chloro-3-indolyl phosphate toluidine), substrat de la phosphatase alcaline, sera d’abord déphosphorylé puis oxydé pour donner un produit coloré bleu.
Une coloration violet foncé intense montre une activité enzymatique à la phosphatase alcaline fortement positive. (Figure 8).
Exemple 2 - Préparation d’un équivalent de follicule pileux
Protocole expérimental
i. Microdissection des cellules de la matrice
Les follicules pileux sont extraits d’un résidu chirurgical de scalp. Ce dernier est d’abord coupé en portions de 5 mm2 puis sectionné à l’aide d’un scalpel entre le derme et l’hypoderme.
Les follicules sont extraits à l’aide de pinces de chirurgie ophtalmique et sont ensuite sectionnés juste au-dessus de la papille avec un scalpel. Le bulbe est alors récupéré. A cette étape, le bulbe comprend deux compartiments : Le compartiment dermique (papille dermique et gaine conjonctive) et les cellules de la matrice qui forment une masse cellulaire. (Figure 1). A l’aide d’aiguilles à perfusion, la partie épithéliale est séparée de la partie dermique.
ii. Conditions de culture
Les conditions de culture ont trois composantes principales :
• Le milieu de base :
Sauf indication contraire, l’ensemble des milieux et tampons utilisés dans les exemples sont décrits dans Bell et col. 1979, (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau etPrunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222) ou Asselineau et col., 1987, (Models in dermato., vol.III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7).
Le milieu DMEM + 10% FCS + 7F (appelé milieu G7F) a la composition suivante :
Concentrations finales
DMEM 500 ml
Sérum de veau foetal (FCS) 10%
L-Glutamine 2mM
Sodium pyruvate 1 mM
Penicicilline - Steptomycine Pénicilline 20 U/ml Streptomycine 20 pg/ml
Fungizone Pénicilline 10 U/ml Streptomycine 10 pg/ml Amphotericine-B 25 ng/ml
Epidermal growth factor (EGF) 10 ng/ml
Choiera toxine 10'10M
Hydrocortisone 0.4 pg/ml
Adénine hydrochloride 1.8 x 10’4M
Triiodothyonine (T3) 2x 10'5 * * * 9M
Transferrine humaine 5 pg/ml
Insuline bovine 5 pg/ml
• Les compléments de culture : 10 μΜ de Y27632.
• La surface d’adhésion : les cellules de la matrice adhèrent et prolifèrent dans le milieu de base Green en présence d’une couche nourricière de fibroblastes murins 3T3 arrêtés dans le cycle cellulaire par un traitement mitomycine.
Culture-Amplification des cellules de la matrice
Après microdissection, les amas de cellules de la matrice sont déposés dans des boîtes de Pétri 15 de 60mm de diamètre préalablement ensemencées d’un feeder layer, de préférence avec 40 000
3T3irradié/cm2 et recouverte du milieu de culture complet, par exemple le milieu G7F +10μΜ Y27632 ; on obtient une culture à 70% de confluence de cellules de la matrice.
Culture-Préparation de l’équivalent de follicule pileux
Afin de générer les équivalents in vitro de follicule pileux, les cellules sont récupérées au stade de sous confluence par un traitement enzymatique. Les cellules sont ensuite ensemencées dans des boites de Pétri non traitée pour la culture cellulaire (boite de pétri bactériologique Falcon®, Corning, ref : 351007), contenant préalablement les équivalents de papilles dermiques, à une densité de 6000 cellules / cm2, dans le milieu de culture nutritif B exempt de sérum tel que 10 décrit à l’Exemple 1.
Les cellules de la matrice adhérent uniquement au niveau des sphéroïdes de papilles dermiques et prolifèrent. (Figures 5 et 6).
Après 6 jours de co-culture, on voit apparaître des équivalents de follicule pileux, présentant en particulier les caractéristiques morphologiques suivantes : structure tubulaire pleine de 15 diamètre d’environ 2500 micromètres. (Figures 6 et 7).
Le marquage des kératines spécifiques du cheveu K85 et K35, ainsi qu’un marqueur de prolifération cellulaire, comme le Ki67, est réalisé par immunomarquage en fluorescence. (Figure 9).

Claims (20)

  1. REVENDICATIONS
    1. Procédé de préparation in vitro d’un équivalent de papille dermique comprenant au moins une étape de mise en culture de fîbroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive sur un support comprenant un milieu de culture nutritif B exempt de sérum pendant une période de temps suffisante pour permettre auxdits fibroblastes de se détacher dudit support et de se regrouper pour former au moins un sphéroïde la surface dudit support utilisé ne permettant pas l’adhésion des cellules.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit milieu de culture nutritif comprend de 500 à 1500 mg/L d’acides aminés, de 2 à 18 mg/L de vitamines, de 1500 à 4500 mg/L de glucose, de 8750 à 10000 mg/L de sels inorganiques, de 2 à20 pg/ml d’insuline, de 2 à 20 ng/ml d’hydrocortisone, et éventuellement de 0,2% à 2% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotiques.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel lesdits fîbroblastes sont cultivés pendant au moins 3 jours, de préférence pendant au moins 4 jours, encore mieux entré 4 et 21 jours.
  4. 4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel la surface dudit support est neutre et hydrophobe.
  5. 5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel lesdits fibroblastes sont ensemencés en un nombre d’au moins 6000 cellules/cm2, de préférence d’au moins 14000 cellules/cm2, et encore mieux en un nombre compris entré 23800 et 47600 cellules/cm2·. 6
  6. 6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 comprenant en outre préalablement à l’étape de mise en culture desdits fibroblastes les étapes préliminaires suivantes :
    a. isoler un follicule pileux en phase anagène à partir d’un prélèvement de scalp ;
    b. récupérer les fibroblastes de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive à l’aide d’une microdissection de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive ;
    c. effectuer une amplification desdits fibroblastes de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive dans un milieu de culture nutritif A constitué de DMEM Glutamax, de 20% en volume de sérum fœtal de veau (SVF), 1% en volume d’acides aminés non essentiels, et éventuellement 1% en volume d’antibiotiques et/ou d’antimycotique.
  7. 7. Equivalent in vitro de papille dermique susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6.
  8. 8. Equivalent in vitro de papille dermique selon la revendication 7 caractérisée en ce qu’il présente une activité phosphatase alcaline positive.
  9. 9. Utilisation d’un équivalent in vitro de papille dermique selon Tune quelconque des revendications 7 à 8 et de cellules épithéliales prolifératives pour la préparation d’un équivalent in vitro de follicule pileux.
  10. 10. Procédé de préparation in vitro d’un équivalent de follicule pileux comprenant au moins une étape de culture de cellules épithéliales prolifératives en présence d’au moins un équivalent de papille dermique tel que défini selon la revendication 7 ou 8 pendant une période de temps suffisante pour permettre une différenciation desdites cellules épithéliales prolifératives en kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 et K35.
  11. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel les cellules épithéliales prolifératives sont ensemencées en un nombre d’au moins 2000 cellules/cm2, de préférence d’au moins 6000 cellules/cm2, et encore mieux en un nombre compris entre 6000 et 10000 cellules/cm2.
  12. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, dans lequel les cellules épithéliales prolifératives sont cultivées pendant au moins 3 jours, de préférence pendant au moins 5 jours, encore mieux entre 5 et 20 jours.
  13. 13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 12 comprenant en outre une étape préliminaire d’amplification desdites cellules épithéliales prolifératives en présence d’une quantité efficace d’un inhibiteur de ROCK.
  14. 14. Equivalent in vitro de follicule pileux susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 13,
  15. 15. Equivalent in vitro de follicule pileux selon la revendication 14 caractérisé en ce qu’il est constitué d’un équivalent de papille dermique présentant une activité phosphatase alcaline positive et de kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 et K35 .
  16. 16. Equivalent in vitro de follicule pileux selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce qu’il présente une structure tubulaire pleine de diamètre allant de 100 à 250μπί, et de longueur allant de 500 à 2500pm.
  17. 17. Equivalent in vitro de follicule pileux selon l’une des revendications 14 à 16 pour son utilisation dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d’un état de pilosité réduite.
  18. 18. Equivalent in vitro de follicule pileux selon l’une des revendications 14 à 16 pour son utilisation dans le traitement de l’alopécie.
  19. 19. Utilisation d’un équivalent in vitro de follicule pileux selon l’une des revendications 14 à 16 pour ridentification de composés modulateurs de la pousse des poils et/ou des cheveux.
  20. 20. Procédé de criblage d’au moins un composé modulateur de la pousse des poils et/ou des cheveux comprenant une étape (a) de mise en contact dudit composé à tester avec un équivalent in vitro de follicule pileux selon Tune quelconque des revendications 14 à 16 puis une étape (b) d’analyse de l’effet dudit composé sur au moins un paramètre de l’équivalent in vitro de follicule pileux et une étape (c) de sélection dudit composé modifiant ledit paramètre.
FR1760242A 2017-10-30 2017-10-30 Procede de preparation in vitro d’equivalents de papille dermique et de follicule pileux Active FR3072972B1 (fr)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1760242A FR3072972B1 (fr) 2017-10-30 2017-10-30 Procede de preparation in vitro d’equivalents de papille dermique et de follicule pileux
PCT/EP2018/079758 WO2019086485A1 (fr) 2017-10-30 2018-10-30 Procédé de préparation in vitro d'équivalents de papille dermique et de follicule pileux
JP2020523695A JP7005754B2 (ja) 2017-10-30 2018-10-30 毛乳頭及び毛包同等物をインビトロで調製する方法
US16/760,109 US20200255801A1 (en) 2017-10-30 2018-10-30 Method for the in vitro preparation of dermal papilla and hair follicle equivalents
CN201880077456.4A CN111417717A (zh) 2017-10-30 2018-10-30 真皮乳头和毛囊等同物的体外制备方法
BR112020008348-8A BR112020008348A2 (pt) 2017-10-30 2018-10-30 processo para a preparação in vitro de um equivalente de papila dérmica, equivalente de papila dérmica in vitro, processo para a preparação in vitro de equivalente de folículo piloso, equivalente de folículo piloso in vitro, uso de equivalente de folículo piloso in vitro e processo para triagem de pelo menos um composto que modula o crescimento de pelo corporal e/ou cabelo
KR1020207015309A KR102390235B1 (ko) 2017-10-30 2018-10-30 진피 모유두 및 모낭 등가물의 시험관 내 제조 방법
EP18803336.9A EP3704226A1 (fr) 2017-10-30 2018-10-30 Procédé de préparation in vitro d'équivalents de papille dermique et de follicule pileux

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1760242A FR3072972B1 (fr) 2017-10-30 2017-10-30 Procede de preparation in vitro d’equivalents de papille dermique et de follicule pileux
FR1760242 2017-10-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR3072972A1 true FR3072972A1 (fr) 2019-05-03
FR3072972B1 FR3072972B1 (fr) 2023-03-10

Family

ID=61521590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR1760242A Active FR3072972B1 (fr) 2017-10-30 2017-10-30 Procede de preparation in vitro d’equivalents de papille dermique et de follicule pileux

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20200255801A1 (fr)
EP (1) EP3704226A1 (fr)
JP (1) JP7005754B2 (fr)
KR (1) KR102390235B1 (fr)
CN (1) CN111417717A (fr)
BR (1) BR112020008348A2 (fr)
FR (1) FR3072972B1 (fr)
WO (1) WO2019086485A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115282137B (zh) * 2022-07-04 2023-08-18 爱美客技术发展股份有限公司 一种外用擦剂护理组合物及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007109223A2 (fr) * 2006-03-17 2007-09-27 Intercytex Limited Co-culture de cellules
US20080145929A1 (en) * 2004-11-29 2008-06-19 Jung-Keug Park Method For the Preparation of a Dermal Papilla Tissue Having Hair Follicle Inductive Potency
WO2009118283A1 (fr) * 2008-03-28 2009-10-01 Technische Universität Berlin Procédés pour produire des microfollicules capillaires et des papilles de novo et leur utilisation pour des essais in vitro et des implantations in vivo
WO2017055358A1 (fr) * 2015-09-29 2017-04-06 L'oreal Utilisation de cellules matricielles pour la préparation d'un micro follicule pileux

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1563061T3 (da) 2002-11-14 2012-10-01 Aderans Res Inst Inc Dyrkning af hårinducerende celler
CN101755046B (zh) 2007-07-20 2012-08-08 东国大学校产学协力团 采用间充质干细胞制备真皮乳头组织的方法
WO2010021245A1 (fr) 2008-08-22 2010-02-25 学校法人慶應義塾 Procédé de culture d'une cellule de papille dermique de poil
US9982238B2 (en) * 2011-02-09 2018-05-29 Organ Technologies, Inc. Method for producing regenerative organ primordium provided with guide for transplantation, composition containing regenerative organ primordium provided with guide for transplantation produced thereby, and method for transplanting regenerative organ primordium provided with guide for transplantation
EP2679674B1 (fr) * 2011-02-24 2019-04-24 Organ Technologies, Inc. Procédé de préparation d'un germe de follicule pileux régénéré transplantable avec maîtrise de la couleur
KR20160019654A (ko) * 2014-08-12 2016-02-22 강원대학교산학협력단 섬유아세포 배양용 배지 조성물, 섬유아세포의 배양방법 및 이를 이용한 피부 재생용 조성물
DE102015110880A1 (de) * 2015-07-06 2017-01-12 Linde Material Handling Gmbh Verfahren zur Steuerung des Ladebetriebs eines Druckspeichers einer mobilen Arbeitsmaschine
DE102015119880B4 (de) 2015-11-17 2018-05-24 Technische Universität Berlin Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln und de novo Papillen sowie deren Verwendung für in vitro Tests und in vivo Implantate

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080145929A1 (en) * 2004-11-29 2008-06-19 Jung-Keug Park Method For the Preparation of a Dermal Papilla Tissue Having Hair Follicle Inductive Potency
WO2007109223A2 (fr) * 2006-03-17 2007-09-27 Intercytex Limited Co-culture de cellules
WO2009118283A1 (fr) * 2008-03-28 2009-10-01 Technische Universität Berlin Procédés pour produire des microfollicules capillaires et des papilles de novo et leur utilisation pour des essais in vitro et des implantations in vivo
WO2017055358A1 (fr) * 2015-09-29 2017-04-06 L'oreal Utilisation de cellules matricielles pour la préparation d'un micro follicule pileux

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAVLICKOVA B ET AL: "Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial mesenchymal interactions", BRITISH JOURNAL OF DERMATOLOGY, OXFORD : WILEY-BLACKWELL, UK, vol. 151, no. 4, 1 January 2004 (2004-01-01), pages 753 - 765, XP003008012, ISSN: 0007-0963, DOI: 10.1111/J.1365-2133.2004.06184.X *
HIGGINS ET AL: "Modelling the hair follicle dermal papilla using spheroid cell cultures", EXPERIMENTAL DERMATOLOGY ONLINE, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD, vol. 19, no. 6, 1 June 2010 (2010-06-01), pages 546 - 548, XP002585390, ISSN: 1600-0625, [retrieved on 20100420], DOI: 10.1111/J.1600-0625.2009.01007.X *
JIN-JIN WU ET AL: "Hair follicle reformation induced by dermal papilla cells from human scalp skin", ARCHIVES OF DERMATOLOGICAL RESEARCH ; FOUNDED IN 1869 AS ARCHIV FÜR DERMATOLOGIE UND SYPHILIS, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 298, no. 4, 8 August 2006 (2006-08-08), pages 183 - 190, XP019426281, ISSN: 1432-069X, DOI: 10.1007/S00403-006-0686-9 *
YONG MIAO ET AL: "Controllable Production of Transplantable Adult Human High-Passage Dermal Papilla Spheroids Using 3D Matrigel Culture", TISSUE ENGINEERING PART A, vol. 20, no. 17-18, 1 September 2014 (2014-09-01), pages 2329 - 2338, XP055468607, ISSN: 1937-3341, DOI: 10.1089/ten.tea.2013.0547 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP7005754B2 (ja) 2022-01-24
BR112020008348A2 (pt) 2020-11-03
EP3704226A1 (fr) 2020-09-09
FR3072972B1 (fr) 2023-03-10
JP2021500897A (ja) 2021-01-14
CN111417717A (zh) 2020-07-14
US20200255801A1 (en) 2020-08-13
WO2019086485A1 (fr) 2019-05-09
KR102390235B1 (ko) 2022-04-22
KR20200073281A (ko) 2020-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1878790B1 (fr) Equivalent d`épiderme capable de se pigmenter obtenu à partir de cellules de la matrice, procédé de préparation et utilisation
EP1412484B1 (fr) Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire et le genie tissulaire
US9764064B2 (en) Methods for producing hair microfollicles and de novo papillae and their use for in vitro tests and in vivo implantations
US7635589B2 (en) Method for the preparation of a dermal papilla tissue having hair follicle inductive potency
KR20110022713A (ko) 인간 만능줄기세포로부터 인간 피부 대체물을 제조하는 방법
KR20140115296A (ko) 모낭 외모낭초로부터 멜라닌세포를 유도하기 위한 방법 및 이식을 위한 제조
CA2593923C (fr) Utilisation d'une base nutritive complexe dans le domaine cosmetique, en particulier capillaire
FR3041656A1 (fr) Utilisation des cellules de la matrice pour la preparation d'un microfollicule pileux
FR3072972A1 (fr) Procede de preparation in vitro d’equivalents de papille dermique et de follicule pileux
US9655930B2 (en) Compositions and methods for producing reconstituted skin
JP2017113030A (ja) 再構成頭皮モデルおよび活性分子のスクリーニング方法
FR3060018A1 (fr) Procede servant a ameliorer les conditions de culture de cultures de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'equivalents de glandes sudoripares en trois dimensions
CA2977727A1 (fr) Equivalent de peau et utilisation
FR3061207A1 (fr) Utilisation des cellules germinales pour la preparation d’un microfollicule pileux
WO2021176176A1 (fr) Procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en fibroblastes de tissus conjonctifs sous-jacents d'un épithélium

Legal Events

Date Code Title Description
PLSC Publication of the preliminary search report

Effective date: 20190503

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 3

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 4

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 5

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 6

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 7