CN111417717A - 真皮乳头和毛囊等同物的体外制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从源自真皮乳头和/或源自结缔组织鞘的成纤维细胞体外制备真皮乳头等同物的方法;用于通过在如此获得的所述真皮乳头上培养增殖性上皮细胞来体外制备毛囊等同物的方法;通过上述方法生产的体外真皮乳头和毛囊等同物以及这些等同物用于治疗脱发的用途和用于评价化妆品、药品或皮肤护理产品的效果的用途。
Description
本发明涉及一种用于从源自真皮乳头(dermal papilla)和/或源自结缔组织鞘的成纤维细胞体外制备真皮乳头等同物的方法。
本发明还涉及一种用于通过在如此获得的所述真皮乳头上培养增殖性上皮细胞来体外制备毛囊等同物的方法。
本发明类似地涉及通过上述方法生产的体外真皮乳头和毛囊等同物,并且涉及其用于治疗脱发的用途和用于评价化妆品、药品或皮肤护理产品的效果的用途。
单根毛发在其生命期内经历三个具有极不相等的持续时间的发育期:
-毛发生长期是单根毛发的活跃期,在此期间毛发生存和规则生长。它持续从4年至7年。围绕着单根毛发根球的乳头的芽细胞(germ cell)不断地产生使单根毛发能够生存和生长的物质。接下来,芽细胞的增殖在毛囊的底部停止。然后结束单根毛发的活跃期;另一个短得多的时期开始。
-退化期:在仅仅15天的时间内,单根毛发的毛球消失了(因为它由于芽细胞的中断而不再获得营养),并且以加快的速度转化。乳头消失,也就是说空心球变成实心;它角质化,变硬,并且变成角质组织。然后单根毛发死亡;毛囊紧绷以排出死亡的单根毛发。
-静止期是持续大约三个月的时期,在此期间死亡的单根毛发等待脱落。为了脱落,单根毛发必须被新的单根毛发推出,新的单根毛发进而在同一个毛囊中生长,并且会将旧毛发排出。
然后,毛囊从位于“隆突”的干细胞(称为芽细胞)开始再生。
“隆突”由外上皮鞘的细胞亚群(称为芽细胞)形成,位于毛囊中间部分,更准确地说位于竖毛肌插入区中。这些细胞代表毛囊永久部分的最底部分。
在“隆突”水平,角质形成细胞在生物化学和超微结构上相对未分化。
这种“隆突”处于在晚期静止期期间与上升的真皮乳头相互作用,并在毛发生长期启动新毛囊的战略位置。因此,这些芽细胞是单根毛发再生的必需细胞。单株静止期毛发的芽细胞(生发细胞或多能细胞或干细胞)参与毛囊从休眠期离开并因此参与单根毛发的重新生长。
毛球是梨形的,并且由以下构成:
-作为真皮起源发育的乳头,位于毛囊的基部。它是高度血管化的部位,通过其生长因子和细胞外基质蛋白的储存参与单根毛发生长的营养和调节。该信息将被传输到在基质中产生的基质细胞,以允许其分化(Rees JL Genetics of hair and skin color[头发和皮肤颜色的遗传学])。
-基质是遮盖真皮乳头的区域,由一团稍分化的基质细胞构成。它是强烈的有丝分裂活动的部位。基质细胞,位于毛球中并且在真皮乳头周围形成小细胞团(cell clump),主要由角质形成细胞的前体细胞构成,该前体细胞构成发芽层并且迅速增殖以便分化形成毛干,因此基质细胞在毛发周期中起着重要作用。从生长期开始直到所述时期结束时,这些基质细胞将增殖直到退化期,并然后在静止期消失。(Ebling FJ.The biology of hair.[头发的生物学]Dermatol.Clin.[临床皮肤病学]1987年7月;5(3):467-81.Review[综述];Saitoh M,Uzuka M,Sakamoto M.Human hair cycle[人毛发循环].J.Invest.Dermatol.[皮肤病学研究杂志]1970年1月;54(1):65-81)。细胞分化将允许外上皮鞘(ORS)、内上皮鞘(IRS)、和之后毛干的各种细胞类型的形成。这种基质还是控制着单根毛发形状的基质。对于直发,基质围绕对称轴均匀分布,而对于卷发,在一侧基质会更大(Melissopoulos A.和Levacher C.Les annexscutanées[皮肤外皮].La peau:structure et physiologie[皮肤:结构和生理学],由Lavoisier出版;1998.第57-99页)。基质还包含负责毛发色素沉着的毛囊黑色素细胞。这些基质细胞的增殖和分化由真皮乳头控制(Botchkarev VA,Kishimoto J.Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hairfollicle cycling.[毛囊周期中上皮-间质相互作用的分子控制]J Invest DermatolSymp Proc.[调查性皮肤病研讨会论文集]2003年6月;8(1):46-55.Review[综述]);
-外上皮鞘和内上皮鞘,由毛球的上层基质产生,还被称为角质化区域。上皮外鞘构成毛囊的外包膜:它是表皮的内陷。它尤其容纳干细胞,毛囊将由这些干细胞循环再生。内上皮鞘将外上皮鞘与毛干分开。该鞘由在角质化同心层中组织化的三种类型的细胞组成,该角质化同心层伴随单根毛发的生长。亨利氏层(Henlé's layer)、赫胥黎氏层(Huxley's layer)、以及由扁平细胞形成的指向毛发基质的角质层是不同的;
-毛干,部分可见的是毛发。毛干的结构从外到内由三个不同的层组成。角质层、皮质、和髓质全部构成了所有的角质化细胞。
脱发受多种因素影响:遗传、激素和环境,受饮食和体育锻炼影响。毛发具有重要的美学和身份作用。
因此,在人的一生中,拥有健康、强韧的毛发和浓密的头发是大多数女性和男性的渴望。
已知许多用于治疗脱发的技术,例如细胞疗法、激光疗法、或其他无需手术的植入物。后者立即见效,并且比手术的侵入性小得多。
为了获得植入物,通过培养毛球中存在的各种细胞类型来获得人毛囊。
多年以来,本领域技术人员已经从构成毛球的各个隔室在2D或3D中体外培养了毛囊细胞。
C.Higgins已显示,在体外2D培养中,真皮乳头细胞在首次培养和扩增后就失去了诱导能力。Higgins描述的在2D和3D培养中获得的球状体不具有体内真皮乳头的功能特征:特别地,这些球状体对碱性磷酸酶、多能蛋白聚糖(Versican)和SFRP2(分泌型卷曲相关蛋白2)的活性较低,如以下实例6中所示。
其他团队,如韩国的Park,则使用富含氨基酸和维生素的培养基来形成DPLT(真皮乳头状组织)。特别地,在以下文件WO 2009/014272和US 2008/0145929中分别描述了由源自脐带的间充质干细胞和源自真皮乳头的成纤维细胞制备的体外真皮乳头等同物。然而,使用WO 2009/014272中描述的源自脐带的生物学样品的间充质干细胞,以及使用US 2008/0145929中描述的针对细胞培养处理的不阻止细胞粘附的2D培养支持物,不能获得具有体内真皮乳头的基本特征的体外真皮乳头等同物,特别是从形态和/或功能的观点,并且这些基本特征尤其是阳性的碱性磷酸酶的酶活性。
此外,上述模型均不包含增殖性上皮细胞,如基质细胞或芽细胞,其存在和数量对于毛囊结构的形成是必不可少的。
WO 2017/055358公开了在ROCK抑制剂的存在下基质细胞使微毛囊再生的能力。然而,这些基质细胞被接种在失去增殖能力的成纤维细胞(3T3成纤维细胞,已经过照射或用丝裂霉素处理过的人成纤维细胞)上,而不是真皮乳头上。因此,这需要功能和形态上的差异,如下图10所示。
因此,需要分别具有体内真皮乳头或毛囊(优选地人毛囊,尤其是能够再生的人毛囊)的大部分功能和形态特征的体外真皮乳头和毛囊等同物。
令人惊讶的是,本申请人已经证明,首先,在圆底微孔板类型的特定2D或3D培养支持物(这些支持物不允许细胞粘附)上的无血清培养基中培养源自真皮乳头和/或结缔组织鞘的成纤维细胞,使得可以获得具有体内真皮乳头的大多数功能和形态特征的体外真皮乳头等同物。
其次,将增殖性上皮细胞(如基质细胞和/或芽细胞)接种在获得的所述体外真皮乳头等同物上,使得可以获得具有体内人毛囊(尤其是能够再生的毛囊)的大部分功能和形态特征的体外毛囊等同物。
因此,证明这种真皮乳头和毛囊等同物对于研究毛囊的形态发生、化妆品和/或药物活性剂的活性的预测测试以及毛发减少状态的预防性或治疗性治疗和脱发的治疗特别有利。
因此,根据本发明的第一个主题,本发明涉及一种用于体外制备真皮乳头等同物的方法,该方法包括以下中的至少一个步骤:在包含无血清营养培养基B的支持物上培养成纤维细胞,持续足以使所述成纤维细胞从所述支持物脱离并聚在一起形成至少一个球状体,这些成纤维细胞源自真皮乳头和/或源自结缔组织鞘的时间段;使用的所述支持物的表面不允许细胞粘附;所述培养支持物选自2D或3D圆底微孔板培养支持物。
本发明的第二个主题涉及可以根据上述方法获得的体外真皮乳头等同物。
本发明的第三个主题涉及根据本发明的真皮乳头等同物和增殖性上皮细胞(如基质细胞和/或芽细胞)用于制备体外毛囊等同物的用途。
根据本发明的另一个主题,本发明涉及一种用于体外制备毛囊等同物的方法,该方法包括以下中的至少一个步骤:在至少一种根据本发明的真皮乳头等同物的存在下培养增殖性上皮细胞,持续足以使所述增殖性上皮细胞分化为对标志物K85和K35呈阳性的角质形成细胞的时间段。
本发明还涉及可以根据上述方法获得的体外毛囊等同物。
本发明还涉及根据本发明的毛囊等同物在多毛性减弱状态的预防性或治疗性治疗和脱发的治疗中的用途。
根据本发明的另一个主题,本发明涉及根据本发明的毛囊等同物用于体外测试活性剂对毛发特性的影响,特别是用于鉴定调节体毛和/或头发生长的化合物的用途。
本发明还涉及使用根据本发明的毛囊等同物来筛选调节体毛和/或头发生长的化合物的方法。
具体实施方式
成纤维细胞
为了本发明的目的,术语“源自真皮乳头的成纤维细胞”是指从位于毛囊基部的真皮来源的芽上生长期毛囊的显微解剖取得的成纤维细胞。
同样,术语“源自结缔组织鞘的成纤维细胞”是指从真皮乳头下方毛囊基部的生长期毛囊的显微解剖取得的成纤维细胞。
源自真皮乳头或结缔组织鞘的成纤维细胞优选地取自外科手术废料或活检样品,例如整容手术废料或头皮样品,因为仅拔出单根毛发无法回收这些细胞。
特别地,在本发明的背景中使用的成纤维细胞不是先前被终止增殖的成纤维细胞,优选地通过事先对其进行辐照(例如用γ射线)或预先用丝裂霉素处理而被终止增殖的成纤维细胞。优选地,根据本发明的成纤维细胞不是3T3成纤维细胞。
增殖性上皮细胞
术语“增殖性上皮细胞”是指存在于毛囊中并且能够产生存在于单根毛发中的所有细胞类型的上皮细胞。增殖性上皮细胞优选地选自基质细胞和/或芽细胞。
术语“基质细胞”是指位于毛球中并在真皮乳头周围形成小细胞团的细胞(Ebling F.J.The biology of hair.[头发的生物学]Dermatol.Clin.[临床皮肤病学]1987年7月;5(3):467-81.Review[综述];Saitoh M,Uzuka M,Sakamoto M.Human hair cycle[人毛发循环].J.Invest.Dermatol.[皮肤病学研究杂志]1970年1月;54(1):65-81)。这些细胞的样品可以被采集,并且它们可以被扩增并存储在组织库中以用于随后使用的目的。
为了保持基质组织的完整性,可以根据以下方法对这些细胞进行采样:将毛囊放在有盖培养皿(Petri dish)中,该培养皿中含有补充了2%的抗生素和非必需氨基酸的最低必需培养基(minimum culture medium)。
毛球区域在真皮乳头顶部被切割,并且因此将毛球上皮与真皮乳头和结缔组织鞘分开。
为了本发明的目的,术语“芽细胞”是指存在于“隆突”中的干细胞。优选地,在静止期对芽细胞进行采样。
为了本发明的目的,术语“静止期”是指在静止期中含有单根毛发的毛囊。
可以根据以下方法对芽细胞进行采样:将静止期毛囊放在有盖培养皿中,该培养皿中含有补充了2%的抗生素和非必需氨基酸的最低必需培养基。
从结缔组织鞘中提取芽细胞的区域(称为隆突),随后置于含有3T3i成纤维细胞饲养层的有盖培养皿中。
这种显微解剖技术从而可以保持细胞的数量和完整性,因为它们不会彼此分离。
用于制备真皮乳头等同物的方法
本发明涉及一种用于体外制备真皮乳头等同物的方法,该方法包括以下中的至少一个步骤:在包含无血清营养培养基B的支持物上培养成纤维细胞,持续足以使所述成纤维细胞从所述支持物脱离并聚在一起形成至少一个球状体的时间段,这些成纤维细胞源自真皮乳头和/或源自结缔组织鞘;使用的所述支持物的表面不允许细胞粘附;所述培养支持物选自2D或3D圆底微孔板培养支持物。
术语“球状体”是指呈球体形式的3D微组织,在该组织中细胞将被组织化并合成细胞外基质。认为在执行根据本发明的方法后看到至少一个球状体出现时,获得所述真皮乳头等同物。
为了本发明的目的,术语“无血清”是指包含相对于培养基总体积,按体积计低于5%的血清、按体积计低于4%的血清、按体积计低于3%的血清、按体积计低于2%的血清、按体积计低于1%的血清、优选地按体积计0%的血清的培养基。
术语“血清”是指包含在血清中的血清蛋白,特别是选自以下的至少一种血清蛋白:白蛋白、球蛋白(如α-1-球蛋白、α-2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白)及其混合物。
在所述培养源自真皮乳头和/或结缔组织鞘的成纤维细胞的步骤中,在至少1天时观察到簇的形成,然后所述簇在至少2天时形成聚集体。最后,在至少3天时观察到球状体的出现。
为了本发明的目的,术语“簇”是指细胞的2D集合。为了本发明的目的,术语“聚集体”或“早期球状体”是指不规则形状的3D细胞团,所述细胞团未组织化并且尚未合成细胞外基质。
在一个优选的实施例中,所述营养培养基B包含500至1500mg/l的氨基酸、2至18mg/l的维生素、1500至4500mg/l的葡萄糖、8750至10000mg/l的无机盐、2至20μg/ml的胰岛素、2至60ng/ml的氢化可的松,以及任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
有利地,所述营养培养基B包含600至1250mg/l的氨基酸、5至15mg/l的维生素、1750至2250mg/l的葡萄糖、9000至9750mg/l的无机盐、5至15μg/ml的胰岛素、5至50ng/ml的氢化可的松,以及任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
甚至更好,所述营养培养基B包含700至1150mg/l的氨基酸、5至15mg/l的维生素、1750至2250mg/l的葡萄糖、9000至9750mg/l的无机盐、5至15μg/ml的胰岛素、5至50ng/ml的氢化可的松、以及任选地100至180μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
存在于所述培养基B中的氨基酸优选地选自甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺水合物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二水合物钠盐、L-缬氨酸及其混合物。
存在于所述培养基B中的维生素优选地选自抗坏血酸、生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、麦角钙化醇、叶酸、甲萘醌硫酸氢钠、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、乙酸视黄酯、维生素B12、α-生育酚磷酸二钠盐、肌醇及其混合物。
存在于所述培养基B中的无机盐优选地选自无水氯化钙(CaCl2)、五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、无水硫酸镁(MgSO4)、一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)、七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)及其混合物。
可能提到的存在于所述培养基B中的抗生素的实例包括青霉素、链霉素及其混合物。
可能尤其提到的存在于所述培养基B中的抗真菌剂的一个实例是两性霉素B。
所使用的所述无血清营养培养基B优选地包含低于15μg/ml的生长因子,优选地低于12μg/ml的生长因子。特别地,存在于所述营养培养基B中的生长因子选自胰岛素和/或氢化可的松。
在一个特别优选的实施例中,所述营养培养基B包含按体积计80%至99%的Williams培养基E、250至350mg/l的谷氨酰胺、2至20μg/ml的胰岛素、2至60ng/ml的氢化可的松,以及任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。甚至更好,所述营养培养基B包含按体积计95%-98%的Williams培养基E、280-320mg/l的谷氨酰胺、5至15μg/ml的胰岛素、5至50ng/ml的氢化可的松、以及任选地100至180μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
Williams培养基E特别不含谷氨酰胺。
成纤维细胞优选地培养至少三天,甚至更好培养4天与21天之间。
成纤维细胞优选地以高密度接种,特别是以至少3000个细胞/cm2,优选地至少9000个细胞/cm2,甚至更好以至少14000个细胞/cm2的密度,甚至更优选地以在14000个细胞/cm2与47600个细胞/cm2之间的密度接种。
在一个优选的实施例中,以在23500个细胞/cm2与24500个细胞/cm2之间的密度接种成纤维细胞,甚至更好以23800个细胞/cm2的密度接种。
不允许细胞(特别是成纤维细胞)粘附的支持物选自2D和3D圆底微孔板培养支持物。
有利地,在本发明的背景中使用的2D和3D支持物没有涂布胶原蛋白。
在2D培养中,可能支持物尤其提到的是未针对细胞培养处理的细菌用有盖培养皿,特别是由塑料制成,不允许细胞粘附的培养皿。
所述支持物的表面优选地是中性的。为了本发明的目的,术语“中性表面”是指不带电的表面。
所述支持物的表面可以是疏水性的或亲水性的,优选地是疏水性的。
当所述表面是亲水性的时,其被一种物质覆盖以防止细胞粘附;特别地,这种物质可以选自与所述支持物的表面共价结合的水凝胶。
在一个特别优选的实施例中,所述支持物的表面是中性的和疏水性的。
优选地,该3D培养支持物不是平底微孔板。
在第一个实施例中,将源自真皮乳头和/或鞘的所述成纤维细胞以至少14000个细胞/cm2的密度,优选地以在14000个细胞/cm2与47600个细胞/cm2之间的密度,甚至更好以在23500个细胞/cm2与24500个细胞/cm2之间的密度接种在不允许细胞粘附的2D培养支持物上。
在第二个优选的实施例中,将源自真皮乳头和/或鞘的所述成纤维细胞以至少3000个细胞/cm2的密度,优选地以9000个细胞/cm2的密度,甚至更好以在9000个细胞/cm2与20000个细胞/cm2之间的密度接种在不允许细胞粘附的3D微孔板培养支持物上。
根据本发明的用于体外制备真皮乳头等同物的方法还可以包括在营养培养基A中扩增所述源自真皮乳头的成纤维细胞和/或源自结缔组织鞘的成纤维细胞的预备步骤;所述营养培养基A至少包含血清,特别是胎牛血清。
优选地,用于该扩增步骤的培养支持物是经处理以允许细胞粘附的支持物。这些支持物是常规用于细胞培养的那些,因此是本领域技术人员熟知的。
优选地,所述扩增步骤中使用的所述营养培养基A包含500至2000mg/l的氨基酸、15至35mg/l的维生素、2500至4500mg/l的葡萄糖、7500至9500mg/l的无机盐、按体积计5%至30%的胎牛血清,以及任选的50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
优选地,所述扩增步骤中使用的所述营养培养基A包含750至1800mg/l的氨基酸、20至30mg/l的维生素、3000至4000mg/l的葡萄糖、8000至9000mg/l的无机盐、按体积计10%至25%的胎牛血清、以及任选地100至180μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
在所述扩增步骤中使用的所述培养基A中存在的氨基酸优选地选自甘氨酸、L-丙氨酰-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐水合物、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和L-脯氨酸及其混合物。
所述扩增步骤中使用的所述培养基A中存在的维生素优选地选自氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇及其混合物。
所述扩增步骤中使用的所述培养基A中存在的有机盐优选地选自氯化钙(CaCl2)、硫酸镁(MgSO4)、硝酸铁(Fe(NO3)·9H2O)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·4H2O)及其混合物。
可能提到的存在于所述培养基A中的抗生素的实例包括青霉素、链霉素及其混合物。
可能尤其提到的存在于所述培养基A中的抗真菌剂的一个实例是两性霉素B。
在一个特别优选的实施例中,所述扩增步骤中使用的所述营养培养基A包含按体积计70%至80%的DMEM Glutamax培养基、5%至25%的胎牛血清、50至90mg/l的非必需氨基酸、以及任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。甚至更好,所述营养培养基A包含按体积计78%的DMEM Glutamax培养基、20%的胎牛血清、60至80mg/l的非必需氨基酸、以及任选地100至180μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
所述扩增步骤中使用的所述培养基A中存在的非必需氨基酸选自L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸及其混合物。
在一个特别优选的实施例中,根据本发明的用于制备体外真皮乳头等同物的方法还包括在培养所述成纤维细胞的步骤之前的以下预备步骤:
a.从头皮样品中分离出生长期毛囊;
b.通过该真皮乳头和/或该结缔组织鞘的显微解剖来回收该真皮乳头和/或该结缔组织鞘的成纤维细胞;
c.在由DMEM Glutamax构成的,补充了20%体积的胎牛血清(FCS)、50至90mg/l的非必需氨基酸和任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂的营养培养基A中,进行所述真皮乳头成纤维细胞和/或所述结缔组织鞘成纤维细胞的扩增。
本发明还涉及可通过如上所述的根据本发明的方法获得的体外真皮乳头等同物。
优选地,根据本发明的真皮乳头等同物的特征在于:它具有阳性碱性磷酸酶活性,并且任选地具有选自BMP2(骨形态发生蛋白2)、SFRP2(分泌型卷曲相关蛋白2)、CORIN、SOX2、VCAN(多能蛋白聚糖)和/或PLC(基底膜聚糖(Perlecan))的蛋白质的阳性表达。
根据本发明的真皮乳头等同物优选地特征在于:它由以下的步骤得到的细胞构成:在包含无血清营养培养基B的支持物上培养成纤维细胞,持续足以使所述成纤维细胞从所述支持物脱离并聚在一起形成至少一个球状体的时间段,这些成纤维细胞源自真皮乳头和/或源自结缔组织鞘;所述支持物不允许细胞粘附;所述培养支持物选自2D或3D圆底微孔板培养支持物。
根据本发明的真皮乳头等同物特别地是直径范围为100μm至250μm的球体。优选地,根据本发明的真皮乳头等同物是直径约200μm的球体。
碱性磷酸酶的酶活性可以通过,例如,使用罗氏实验室(Roche laboratory)出售的NBT/BCIP碱性磷酸酶试剂盒(2017年10月30日,参考号11 681 451 001)进行测定,其中BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐,甲苯胺盐)碱性磷酸酶底物将首先脱磷酸化,然后氧化给出蓝色产物。
标志物BMP2、SFRP2、CORIN、SOX2、VCAN和PLC的蛋白质表达可以通过,例如,免疫荧光技术来测量,而且该技术是本领域技术人员熟知的。
用于制备毛囊等同物的方法
本发明还涉及根据本发明的体外真皮乳头等同物和增殖性上皮细胞用于制备体外毛囊等同物的用途。
本发明还涉及一种用于体外制备毛囊等同物的方法,该方法包括以下中的至少一个步骤:在至少一种根据本发明的真皮乳头等同物的存在下培养增殖性上皮细胞,持续足以使所述增殖性上皮细胞分化为对标志物K85和K35呈阳性的角质形成细胞的时间段。
所述增殖性上皮细胞优选地选自如前面所定义的基质细胞和芽细胞及其混合物。
在一个特别优选的实施例中,在本发明的背景中使用的增殖性上皮细胞是基质细胞。
在至少一种体外真皮乳头等同物的存在下培养增殖性上皮细胞的步骤
将接种到至少一种根据本发明的真皮乳头等同物上的增殖性上皮细胞在37℃和5%CO2下在成分明确的培养基(如Philpott(1993)描述的培养基)中培养。
特别地,在与用于制备根据本发明的真皮乳头等同物的培养基相同的营养培养基中,特别是在无血清营养培养基B中,培养增殖性上皮细胞。
在一个特别优选的实施例中,所述真皮乳头等同物通过如上文“用于制备真皮乳头等同物的方法”部分中所述的用于制备真皮乳头等同物的方法获得。
在至少一种根据本发明的真皮乳头等同物的存在下培养所述增殖性上皮细胞的步骤优选地在如前面所定义的2D或3D支持物上进行,所述支持物的表面不允许细胞粘附。
所述增殖性上皮细胞优选地以高密度接种。优选地,以至少2000个细胞/cm2的密度,优选地至少6000个细胞/cm2的密度,甚至更好以在6000与10000个细胞/cm2之间的密度,将这些增殖性上皮细胞进行接种。
优选地,将所述增殖性上皮细胞培养一个时间段,所述时间段足以允许形成至少一个管状结构,也称为滤泡类器官(follicular organoid)。
为了本发明的目的,术语“管状结构”或“滤泡类器官”是指在将至少一种根据本发明的真皮乳头等同物与选自基质细胞和/或芽细胞的增殖性上皮细胞组合进行培养后观察到的出芽。
所述增殖性上皮细胞在真皮乳头等同物的存在下培养至少3天,优选地至少5天,甚至更好在5天与20天之间,优选地在5天与15天之间。
在一个特定的实施例中,根据本发明的用于制备毛囊等同物的方法包括以下步骤:向营养培养基B中添加选自WNT家族蛋白(特别是WNT3A蛋白)、BMP家族蛋白(特别是BMP2和BMP4蛋白)及其混合物的生长因子。从增殖性上皮细胞的接种开始的第1天与第5天之间进行所述生长因子的添加。
本发明还涉及可以根据上述方法获得的体外毛囊等同物。
更特别地,体外毛囊等同物的特征在于它由具有阳性碱性磷酸酶活性的真皮乳头等同物和对标志物K85和K35以及任选的Ki67呈阳性的角质形成细胞组成。
根据上述“用于制备真皮乳头等同物的方法”部分中提到的方法测量碱性磷酸酶活性。
根据免疫荧光方法对毛发特异性角蛋白K85和K35以及作为细胞增殖标志物的Ki67蛋白进行标记。
毛囊等同物特别地具有直径在100μm与250μm之间,长度至少500μm、优选地长度范围在500μm与2500μm之间、并且甚至更好在1500μm与2500μm之间的实心管状结构。
预备扩增步骤
根据本发明的用于体外制备毛囊等同物的方法在至少一种根据本发明的真皮乳头等同物存在的情况下培养增殖性上皮细胞的步骤之前,可以包括在有效量的ROCK抑制剂的存在下扩增增殖性上皮细胞的预备步骤。
增殖性上皮细胞(如基质细胞和芽细胞)通过毛囊的显微解剖提取,并且根据Rheinwald和Green的技术(Cell[细胞],第6卷,331-344,1975)通过在由成纤维细胞组成的饲养支持物上,在本领域技术人员已知的合适的培养基中,在生长因子(特别是氨基酸、血清、霍乱毒素、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、和pH缓冲溶液)的存在下进行培养来扩增。特别地,这样的培养基可以尤其包含至少一种针对角质形成细胞的促有丝分裂生长因子(例如表皮生长因子(EGF)和/或角质形成细胞生长因子(KGF),特别是KGF)、胰岛素、氢化可的松,以及任选地抗生素(例如,庆大霉素,二性霉素B),向该培养基中添加ROCK抑制剂。
所述ROCK抑制剂可以选自:Y27632、利帕司啶(Ripasudil)、法舒地尔(Fasudil)、噻唑维韦恩(Thiazovivin)及其混合物。
有利地,所述培养基还可以包含血清或垂体提取物,例如牛科动物来源的,肾上腺素、转铁蛋白和/或非必需氨基酸。
用于该培养的成纤维细胞将更优选地是3T3成纤维细胞。3T3成纤维细胞是本领域技术人员所熟知的。这是自1962年来已知的成纤维细胞细胞系。“3T3”表示“3天转移,3x105个细胞接种”。
增殖性上皮细胞培养优选地在成纤维细胞(优选地3T3成纤维细胞)上培养,细胞的增殖事先停止,优选地通过先前辐照细胞(例如用γ射线辐照)或先前已用丝裂霉素处理。丝裂霉素(特别是丝裂霉素C)阻断这些细胞的增殖,然而不阻止它们产生可用于角质形成细胞增殖的营养物质。
根据本发明,ROCK抑制剂(特别是Y27632)的有效量在1μM与100μM之间,优选地在5μM与25μM之间,并且优选地是10μM。
根据本发明,在ROCK抑制剂(特别是Y27632)的存在下将上皮细胞培养至少2天,并优选地至少3天。
优选地,将细胞以在1000与4000个细胞/cm2之间的细胞密度,优选地以3000个细胞/cm2的密度进行培养。
用途
考虑到体外真皮乳头和毛囊等同物分别具有体内真皮乳头和毛囊的大多数特征,它们可以用作植入物,任选地与皮肤替代物组合。
因此,根据本发明的体外真皮乳头和毛囊等同物也有用于制备植入物和/或皮肤替代物的应用,用于治疗皮肤障碍,如烧伤、愈合缺陷或白发症。
治疗效果被定义为无论是全部还是部分恢复到正常的多毛性状态。
为了本发明的目的,如果受试者具有脱发的先决条件(例如家族性倾向),则建议进行预防性治疗。
毛发数量减少的情况可能是由脱发、遗传性脱发、疤痕、烧伤、或意外伤害引起的。
因此,本发明还有一个主题是根据本发明的用于多毛性减弱状态的预防性或治疗性治疗的毛囊等同物。
其另一主题是根据本发明的用于脱发治疗的毛囊等同物。
此外,本发明还涉及用于多毛性减弱状态或脱发的预防性或治疗性治疗的真皮乳头等同物。
用于筛选新活性剂的方法
根据本发明的真皮乳头和毛囊等同物使得尤其能够建立体毛或头发的生长动力学,并因此进行任何需要在活体内并且尽可能在体内背景下尽可能完整的多种毛发的研究(例如毛发周期和能够影响该周期的因素的研究),包括对促进毛发生长的活性剂的研究,对使得能够对抗脱发的活性剂的研究或对其他可减缓体毛生长的活性剂的研究。
因此,本发明还涉及根据本发明的体外毛囊等同物用于鉴定调节体毛和/或头发生长的化合物的用途。
此外,本发明还涉及用于筛选至少一种调节体毛和/或头发生长的化合物的方法,该方法包括步骤(a):使所述测试化合物与根据本发明的体外毛囊等同物接触,然后步骤(b):分析所述化合物对体外毛囊等同物的至少一个参数的影响,以及步骤(c):选择改变所述参数的化合物。
优选地,为了进行步骤(a),将调节性测试化合物局部施加,例如配制成常规局部制剂或以其他方式引入培养基中。
特别地,可以通过对与毛囊的质量和/或毛囊的稳态有关的标志物的表达、产生、和/或活性(例如表皮和/或真皮标志物,如结构蛋白)的分析来进行步骤(b)。作为结构蛋白的实例,可以提及毛发角蛋白。
为此,在筛选过程的步骤(b)中将对产品对毛干生长的影响进行分析。
分析产品效果的步骤(b)优选地将在与测试产品接触的毛囊等同物上测量的至少一个参数与在相同条件下培养但未接受测试产品的对照毛囊等同物上测量的那些参数进行比较。
选择改变毛囊等同物参数的产品的步骤(c)将根据预先确定的标准进行。
该参数的改变可以是对表达、产品和/或所述标记的活性和/或毛干的生长的刺激、降低或全部或部分的抑制。
用于选择所述产品的标准将例如是该产品对所测量的参数具有刺激或抑制作用。
根据本发明的毛囊等同物也可以在筛选用于鉴定新颖活性剂的化妆品、药物、或皮肤护理化合物的自动化方法中使用。
此外,本发明还涉及用于筛选至少一种调节体毛和/或头发生长的化合物的方法,该方法包括步骤(a):使所述测试化合物与根据本发明的体外真皮乳头等同物接触,然后步骤(b):分析所述化合物对体外真皮乳头等同物的至少一个参数的影响,以及步骤(c):选择改变所述参数的化合物。
附图说明
图1:在本发明的背景中使用的基质细胞和成纤维细胞的定位。
图2:芽细胞的定位。
图3:源自真皮乳头的成纤维细胞在营养培养基A中的扩增。
图4:在无血清营养培养基B中培养扩增的成纤维细胞后真皮乳头等同物的产生。
图5:将基质细胞接种在真皮乳头等同物上后T+1天。
图6:管状结构的形成导致毛囊等同物的形成(从将基质细胞接种到真皮乳头等同物上开始的T+4天)。
图7:毛囊等同物的生长(从将基质细胞接种到真皮乳头等同物上开始的T+10天)。
图8:根据本发明的真皮乳头等同物的强阳性碱性磷酸酶活性。
图9:毛囊显示出标志物K35、K85和Ki67的阳性标记。
图10:作为比较的WO 2017/055358:从接种基质细胞开始的T+10天。
图11:本发明以外的比较:根据WO 2009/118283的实例2中所述的方法获得的真皮乳头(放大倍数×10,D6)
图12:在2D培养支持物上根据实例1获得的根据本发明的真皮乳头等同物(放大倍数×10,D6)。
图13:本发明以外的比较:根据WO 2009/118283(D3)的实例3中描述的方法获得的包囊形式的毛囊
图14:本发明以外的比较:在用于细胞培养的2D培养支持物(即允许细胞粘附的支持物)上培养从真皮乳头获得的成纤维细胞。
图15:根据实例1在3D圆底微孔板培养支持物(D2)上获得的根据本发明的真皮乳头等同物。
图16:本发明以外的比较:在胶原蛋白凝胶上3D培养获得的毛囊。
在说明书和随后的实例中,除非另有说明,否则以“在.....与.....之间”形式书写的值的范围包括所述的下限和上限。
为了本发明的目的,术语“至少一个”应理解为,除非另有说明,意思是“一个或多个”。
以下给出的实例作为本发明的非限制性说明呈现。
实例1-根据本发明的真皮乳头等同物的制备
实验方案
i.真皮乳头成纤维细胞的显微解剖
根据以下方法对源自真皮乳头的成纤维细胞进行采样:将从整容手术解剖的生长期毛囊放置在有盖培养皿中,该培养皿中含有补充了2%的抗生素和非必需氨基酸的最低必需培养基。(图1)。
ii.培养条件:
·用于成纤维细胞扩增的营养培养基A:
用于成纤维细胞扩增的营养培养基A具有以下组成:
用于制备培养基A的商业培养基的详细信息
DMEM Glutamax培养基(Gibco编号31966047)
非必需氨基酸Gibco编号11140-035
化合物 | 浓度(mg/l) |
甘氨酸 | 750.0 |
L-丙氨酸 | 890.0 |
L-天冬酰胺 | 1320.0 |
L-天冬氨酸 | 1330.0 |
L-谷氨酸 | 1470.0 |
L-脯氨酸 | 1150.0 |
L-丝氨酸 | 1050.0 |
抗生素/抗真菌剂Gibco编号15240-062
化合物 | 浓度(mg/l) |
青霉素 | 10000U/ml |
链霉素 | 10000μg/ml |
两性霉素b | 25μg/ml |
·用于制备真皮乳头等同物的营养培养基B
用于制备真皮乳头等同物的营养培养基B具有以下组成:
用于制备培养基B的商业培养基的详细信息
Williams E培养基(不含谷氨酰胺)(Gibco编号A12176-01)
抗生素/抗真菌剂Gibco编号15240-062(参见上文)
真皮乳头成纤维细胞的培养扩增
在显微镜下精确定位位于毛囊球区的真皮乳头。
使用手术刀和针将真皮乳头解剖,然后将其置于如上所述含有营养培养基A的培养皿中。(图3)。
真皮乳头等同物的培养制备
在单层培养中扩增成纤维细胞后,将成纤维细胞用胰蛋白酶消化,然后以高密度(例如每cm223800个细胞)沉积在未针对细胞培养处理的有盖培养皿(细菌用有盖培养皿,康宁公司,参考号:351007)中,置于如上所述的无血清营养培养基B中。
成纤维细胞在有盖培养皿中迁移并聚在一起形成簇,然后细胞聚集,并且最后从支持物上脱离,从而在培养5天后形成真皮乳头球状体或等同物。(图4和12)。
所获得的真皮乳头为球形,直径为约200μm。
使用NBT/BCIP碱性磷酸酶试剂盒(罗氏参考号:11681451)进行碱性磷酸酶酶活性的标记,其中BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸,甲苯胺盐)碱性磷酸酶底物将首先脱磷酸化,然后氧化给出蓝色产物。
鲜明的深紫色显示强阳性碱性磷酸酶活性。(图8)。
还制备了根据与实例1相同的方法获得的根据本发明的真皮乳头等同物,如下进行:
-将成纤维细胞接种密度23800个细胞/cm2用9375个细胞/cm2代替。
所获得的真皮乳头也是球形的,直径为约200μm(见图15),并且具有高度阳性的碱性磷酸酶的酶活性。
结论:如此获得的根据本发明的真皮乳头确实具有体内真皮乳头的形态和功能特
征。
实例2-根据本发明的毛囊等同物的制备
实验方案
i.基质细胞的显微解剖
从头皮的手术残余物中提取毛囊。首先将所述残余物切割成5mm2的部分,并然后使用解剖刀在真皮与皮下组织之间切片。
使用眼科手术钳将毛囊提取出来,并然后用解剖刀在乳头上方切片。然后回收毛球。在这个阶段,毛球包括两个隔室:真皮隔室(真皮乳头和结缔组织鞘)和形成细胞块的基质细胞。(图1)。
使用灌注针将上皮部分与真皮部分分开。
ii.培养条件
培养条件具有三个主要的部分:
·基础培养基:
除非另有说明,否则在实例中使用的所有培养基和缓冲液均在Bell等人1979,(P.N.A.S.USA[美国国家科学院院刊],76,1274-1278),Asselineau和Prunieras,1984,(BritishJ.ofDerm.[英国皮肤病学杂志],111,219-222)或Asselineau等人,1987,(Modelsindermato.[皮肤病学模型],第III卷,Lowe&Maibach编,1-7)中进行了描述。
DMEM培养基+10%FCS+7F(被称为G7F培养基)具有以下组分:
·培养基补充物:10μM的Y27632。
·粘附表面:在基于Green的培养基中,通过丝裂霉素处理在细胞周期中捕获的鼠科动物3T3成纤维细胞的饲养层的存在下基质细胞粘附和增殖。
基质细胞的培养扩增
显微解剖后,将基质细胞团沉积在直径60mm的有盖培养皿中,预先接种饲养层,优选接种40000个经辐射的3T3细胞/cm2,并用完全培养基(例如G7F培养基+10μMY27632)覆盖;获得基质细胞70%汇合时的培养物。
毛囊等同物的培养制备
为了产生体外毛囊等同物,通过酶处理在亚汇合阶段回收细胞。然后将细胞接种到未针对细胞培养处理的细菌用有盖培养皿(细菌有盖培养皿,康宁公司,参考号:351007)中的如实例1所述的无血清营养培养基B中,该培养皿中预先含有真皮乳头等同物,密度为6000个细胞/cm2。
基质细胞仅在真皮乳头球状体的水平上粘附并增殖。(图5和6)。
共培养6天后,观察到毛囊等同物出现,特别具有以下形态特征:直径约2500微米的实心管状结构。(图6和7)。
毛发特异性角蛋白K85和K35以及细胞增殖标志物(如Ki67)的标记通过荧光免疫标记进行。(图9)。
结论:如此获得的根据本发明的毛囊确实具有体内毛囊的形态和功能特征。
实例3:本发明以外的比较:根据WO2009/118283的实例2中所述的方法获得的真皮乳头
1)材料和方法:
真皮乳头等同物的制备根据WO2009/118283的实例2中所述的制备方案进行。
DMEM(+)培养基的制备:
-500ml的DMEM Glutamax(Invitrogen编号31966)
-5ml的非必需氨基酸(NEAA)(Gibco编号11140-035)
-50μl的抗坏血酸100mM(Sigma编号A8960),即最终2.9mg/l
-5ml的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)(Fisher Scientific编号10524233)
-400mg/l BSA
培养支持物:平底6孔ULA(超低附着)3D板。
细胞密度:6660个细胞/cm2。
细胞:从真皮乳头获得的成纤维细胞(第P6代)。
2)结果:(见图11)
结论:观察到具有不规则边缘的不同大小的非常异质的细胞聚集体。
实例4:本发明以外的比较:根据WO2009/118283的实例3中所述的方法获得的真皮乳头
1)材料和方法:
根据WO2009/118283的实例3中所述的制备方案进行毛囊等同物的制备。
培养基:
-用于乳头等同物的DMEM(+)(DMEM+2%BSA+ITS+Vit C)
-然后用于DP/MHN/ORS混合培养的KSFM
培养支持物:平底6孔ULA(超低附着)板。
细胞密度:
-对于真皮乳头的制备:从真皮乳头获得的成纤维细胞:500000DP/F75,即6660DP/cm2;
-对于毛囊的制备:250000ORS/6孔,即26300ORS/cm2+25000MHN/6孔,即2630MHN/cm2。
细胞:
-从真皮乳头获得的成纤维细胞(第P6代)。
-黑色素细胞M597(第P4代)
-来自ORSIB的角质形成细胞(第P3代)
2)结果(见图13)
结论:没有观察到细胞聚集体(包囊)向毛囊进化。
实例5:本发明以外的比较:在用于细胞培养的2D培养支持物(即允许细胞粘附的支持物)上培养从真皮乳头获得的成纤维细胞。
1)材料和方法:
2)结果:(见图14)
结论:使用允许细胞粘附的培养支持物,未观察到真皮乳头的形成。
实例6:本发明以外的比较:如Higgins等人(“Modelling the hair follicledermal papilla using spheroid cell cultures[使用球状细胞培养物对毛囊真皮乳头建模]”)所述在含有血清的培养基中获得的真皮乳头
1)材料和方法:
本发明以外的比较:
-3D培养支持物:U型底96孔ULA板
-培养基:DMEM培养基+10%FCS
-细胞密度:9375个细胞/cm2
根据本发明的真皮乳头等同物:
-3D培养支持物:U型底96孔ULA板
-培养基:Williams培养基(不含血清)
-细胞密度:9375个细胞/cm2
为了测量碱性磷酸酶、多能蛋白聚糖和SFRP2分泌型卷曲相关蛋白2(这些是真皮乳头酶活性的标志物)的RNA表达,使用了探针ALPL-Hs01029144_m1、VCAN-Hs00171642_m1和SFRP2-Hs00293258_m1。
结论:
-对于根据本发明的真皮乳头等同物,观察到标志物ALPL(碱性磷酸酶)、VCAN(多能蛋白聚糖)和SFRP2(分泌型卷曲相关蛋白2)的过表达,它们被称为诱导真皮乳头的酶活性的标志物。
-在本发明之外进行比较,观察到标志物ALPL(碱性磷酸酶)、VCAN(多能蛋白聚糖)和SFRP2(分泌的卷曲相关蛋白2)的表达不足,它们被称为诱导真皮乳头的酶活性的标志物。
实例7:本发明以外的比较:在胶原蛋白凝胶上3D培养获得的毛囊
1)材料和方法:
制造包含获得自真皮乳头和增殖性上皮细胞(基质细胞)的成纤维细胞的球状体的第一步是在U型底96孔ULA板中的DMEM培养基+10%血清中进行的。
然后进行第二步,包括将球状体整合到胶原蛋白凝胶(网格)中,在D14上进行观察。
2)结果:(见图16)
结论:在胶原蛋白凝胶中未观察到毛囊的形成;没有观察到包囊的顶端结构形成。
Claims (21)
1.一种用于体外制备真皮乳头等同物的方法,该方法包括以下中的至少一个步骤:在包含无血清营养培养基B的支持物上培养成纤维细胞,持续足以使所述成纤维细胞从所述支持物脱离并聚在一起形成至少一个球状体的时间段,这些成纤维细胞源自真皮乳头和/或源自结缔组织鞘;使用的所述支持物的表面不允许细胞粘附;所述培养支持物选自2D或3D圆底微孔板培养支持物。
2.如权利要求1所述的方法,其中以至少14000个细胞/cm2的密度,优选地以在14000个细胞/cm2与47600个细胞/cm2之间的密度,甚至更好以在23500个细胞/cm2与24500个细胞/cm2之间的密度,将所述成纤维细胞接种在所述2D培养支持物上。
3.如权利要求1所述的方法,其中以至少3000个细胞/cm2的密度,优选地至少9000个细胞/cm2的密度,甚至更好以在9000个细胞/cm2与20000个细胞/cm2之间的密度,将所述成纤维细胞接种在所述3D培养支持物上。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述营养培养基B包含500至1500mg/l的氨基酸、2至18mg/l的维生素、1500至4500mg/l的葡萄糖、8750至10000mg/l的无机盐、2至20μg/ml的胰岛素、2至60ng/ml的氢化可的松、以及任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中将所述成纤维细胞培养至少3天,优选地至少4天,甚至更好4天与21天之间。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述支持物的表面是中性的和疏水性的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法,该方法在培养所述成纤维细胞的步骤之前还包括以下预备步骤:
a.从头皮样品中分离出生长期毛囊;
b.通过该真皮乳头和/或该结缔组织鞘的显微解剖来回收该真皮乳头和/或该结缔组织鞘的成纤维细胞;
c.在由DMEM Glutamax构成的,补充了20%体积的胎牛血清(FCS)、50至90mg/l的非必需氨基酸和任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂的营养培养基A中,进行所述真皮乳头成纤维细胞和/或所述结缔组织鞘成纤维细胞的扩增。
8.一种体外真皮乳头等同物,其可通过如权利要求1至7中任一项所述的方法获得。
9.如权利要求8所述的体外真皮乳头等同物,其特征在于它具有阳性碱性磷酸酶活性。
10.增殖性上皮细胞和如权利要求8和9中任一项所述的体外真皮乳头等同物用于制备体外毛囊等同物的用途。
11.一种用于体外制备毛囊等同物的方法,该方法包括以下中的至少一个步骤:在至少一种如权利要求8或9中所定义的真皮乳头等同物的存在下培养增殖性上皮细胞,持续足以使所述增殖性上皮细胞分化为对标志物K85和K35呈阳性的角质形成细胞的时间段。
12.如权利要求11所述的方法,其中以至少2000个细胞/cm2的密度,优选地至少6000个细胞/cm2的密度,并且甚至更好在6000个细胞/cm2与10000个细胞/cm2之间的密度,将这些增殖性上皮细胞进行接种。
13.如权利要求11或12中所述的方法,其中将这些增殖性上皮细胞培养至少3天,优选地至少5天,甚至更好5天与20天之间。
14.如权利要求11至13中任一项所述的方法,该方法还包括在有效量的ROCK抑制剂的存在下扩增所述增殖性上皮细胞的预备步骤。
15.一种体外毛囊等同物,其可通过如权利要求11至14中任一项所述的方法获得。
16.如权利要求15所述的体外毛囊等同物,其特征在于它由具有阳性碱性磷酸酶活性的真皮乳头等同物和对标志物K85和K35呈阳性的角质形成细胞构成。
17.如权利要求15或16所述的体外毛囊等同物,其特征在于它具有实心管状结构,其直径范围为100至250μm,并且长度范围为500至2500μm。
18.如权利要求15至17中一项所述的体外毛囊等同物,用于多毛性减弱状态的预防性或治疗性治疗。
19.如权利要求15至17中一项所述的体外毛囊等同物,用于脱发的治疗。
20.如权利要求15至17中一项所述的体外毛囊等同物用于鉴定调节体毛和/或头发生长的化合物的用途。
21.一种用于筛选至少一种调节体毛和/或头发生长的化合物的方法,该方法包括步骤(a):使所述测试化合物与如权利要求15至17中任一项所述的体外毛囊等同物接触,然后步骤(b):分析所述化合物对该体外毛囊等同物的至少一个参数的影响,以及步骤(c):选择改变所述参数的所述化合物。
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