JPH07274950A - 毛乳頭細胞の長期継代培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 機能を維持した毛乳頭細胞の長期の安定した
継代培養を可能とする。 【構成】 毛乳頭細胞を足裏表皮細胞および／またはそ
の培養上清とともに培養する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、毛乳頭細胞の長期継
代培養法に関するものである。さらに詳しくは、この発
明は、毛包の分化誘導因子や成長因子の単離、解析を容
易にすることや、移植材料としての毛乳頭細胞を短期間
に多量に提供することを通して毛髪の分化、増殖の人為
的制御に有用な、新しい毛乳頭細胞の長期継代培養法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】従来より、毛髪は皮膚の変化
したもので、毛包上皮とそれらを裏打ちする毛乳頭細胞
との相互作用の結果、毛母細胞が分化、増殖することに
より毛幹（いわゆる毛の本体）が伸長することが知られ
ている。これまでにも、毛髪の増殖、成長については様
々な観点より検討が進められてきているが、たとえばOl
iverは毛包（毛髪基部の皮膚に埋まっている部分）を半
分に切った切り口に毛乳頭細胞を詰めることにより毛包
が再生することを示し、毛乳頭細胞が毛包の分化、増殖
に重要な役割を担っていると推察している（J. Embryo
l. Exp. Morph.,１８：４３−、’６７）。つまり、毛
乳頭細胞は、毛包の分化誘導因子や成長因子を分泌して
いると推定される。

【０００３】しかしながら、これらの因子は毛髪の分
化、増殖の人為的制御には大変に重要であると考えられ
るものの、その実体についてはいまだに明らかにされて
いない。このような状況においては、これらの因子を探
索し、解析するため、あるいは生体移植の材料とするた
めには多量の毛乳頭細胞が必要である。しかしながら、
毛包に存在する毛乳頭細胞は少数であるため培養に頼ら
なければいけないが、これまで毛乳頭細胞の継代培養は
なかなかうまくゆかず、細胞の増殖が遅く継代数も７代
ほどに限られていた。また、継代数の多い培養毛乳頭細
胞は半分に切った毛包に詰めても毛包が再生しないこと
から（Jahoda et al., Nature,３１１：５６０−、’８
４）、すでに本来の毛乳頭細胞の機能を失っているもの
と考えられる。

【０００４】そこで、この発明は、以上の通りの従来技
術の限界を克服し、毛包の分化誘導因子や成長因子の解
明、そして毛髪の成長や生体移植材料としての開発にと
って欠くことのできない手段として、毛乳頭細胞の長期
の安定した継代培養が可能であって、しかも毛乳頭細胞
の機能を失うことのない、新しい、毛乳頭細胞の長期継
代培養法を提供することを目的としている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、毛乳頭細胞を足裏表皮細胞およ
び／またはその培養上清とともに培養することを特徴と
する毛乳頭細胞の長期継代培養法を提供する。

【０００６】

【作用】すなわち、この発明は、毛乳頭細胞を足裏表皮
細胞とともに培養すると細胞の増殖が著しく改善すると
の新しい知見に基づいて完成されたものである。そし
て、この効果は、足裏表皮細胞の培養上清（コンディシ
ョンドメディウム）でもみられるものである。また、こ
のコンディションドメディウムを用いることにより、足
裏表皮細胞の混入のない純粋な毛乳頭細胞を４０代以上
安定して継代培養することが可能となる。さらに、３０
代培養した毛乳頭細胞を半分に切った毛包に詰めると毛
包が再生したことから、この方法によって毛乳頭細胞を
本来の機能を維持したまま長期間培養することが可能と
なる。

【０００７】以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発
明について説明する。

【０００８】

【実施例】

−細胞培養− １）ラット足裏表皮細胞の単離 ラット足裏より皮膚を切り取りディスパーゼ処理（Disp
ase,１０００Ｕ／ｍｌ，４℃、一昼夜）して、表皮と真
皮を分離する。得られた表皮をトリプシン処理（Trypsi
n,０．２５％、３７℃、１０分間）したのち、先曲がり
ピンセットの背中を用いて細胞を表皮片より掻き取る。
ナイロンメッシュを通して細胞塊を除く。 ２）足裏表皮細胞と毛乳頭との共培養(co-culture) １）で得られた足裏表皮細胞（３．６×１０⁵ 細胞）と
ラット頬髭毛包より単離した毛乳頭８個を、Ｄ−ＭＥＭ
培地＋１０％牛胎児血清の入った３５ｍｍプラスチック
シャーレに同時に播種し、５％ＣＯ₂ ，３７℃のインキ
ュベーター内で培養する。 ３）足裏表皮細胞のコンディションドメディウムの調製 １）で得られた足裏表皮細胞を４×１０⁴ 細胞／ｃｍ²
の密度で１０ｃｍプラスチックシャーレに播種し、Ｄ−
ＭＥＭ培地＋１０％牛胎児血清で培養する。播種後５日
目と８日目に培地交換を行い、その際得られた培養上清
を０．２２μｍメンブランフィルターで濾過滅菌してそ
れぞれＣＭ５、ＣＭ８とする。 ４）ラット頬髭毛乳頭細胞の培養 実体顕微鏡下でラット頬髭毛包より毛乳頭を単離し、３
５ｍｍプラスチックシャーレに８個ずつ入れる。これを
Ｄ−ＭＥＭ培地＋１０％牛胎児血清のみ、あるいは、上
述のＣＭ５またはＣＭ８をそれぞれ培地と１：１で混合
したもの３種類の培養液で培養する。３〜４日おきに培
地交換を行う。毛乳頭から遊走してきた細胞がシャーレ
いっぱい(confluent) に達したところで継代し、以後、
３〜４日おきの培地交換と１週間おきの継代を繰り返
す。 −細胞機能検査− １）腎臓皮膜下移植 ラットの頬髭毛包を単離し、下半分を切断除去する。残
った上半分の毛包から毛幹を取り除き、切り口の毛幹を
抜いたあとの隙間に４）の培養毛乳頭細胞をペレット状
にして詰め込む。また、陽性対照として切り口の隙間に
毛包から単離した毛乳頭を詰め込んだものを用意する。
これらをラットの腎臓皮膜下に移植する。８週間後に開
腹し腎臓を摘出して観察するとともに免疫組織化学的に
調べる。 −免疫組織化学− １）培養細胞の抗体染色 培養毛乳頭細胞をＳＵＭＩＬＯＮセルデスク上に培養
し、セルデスクごとアセトン固定したのち我々の作製し
た１３ｘｘ抗体と反応させ、パーオキシダーゼ標識２次
抗体とジアミノベンジジン（３，３′−Diaminobenzidi
ne）で発色させる。 ２）腎臓皮膜下移植した毛包の抗体染色 開腹後回収した毛包を５μｍの凍結切片とし、１３ｘｘ
抗体、パーオキシダーゼ標識２次抗体と反応させジアミ
ノベンジジンで発色させる。 −結果− 単離した毛乳頭をプラスチックシャーレに入れて初代培
養すると、シャーレに接着した毛乳頭から細胞が遊走を
始める。図１に例示した通り、この毛乳頭細胞の遊走も
遊走した細胞の増殖速度も、足裏表皮細胞と共培養した
場合の方が明らかに良かった。つぎに、足裏表皮細胞の
効果が細胞間の相互作用によるのか細胞から分泌された
液性因子によるのかを知るために、図２の足裏表皮細胞
のコンディションドメディウムを加えて初代培養を行っ
た。その結果、図３に例示した通り、なにも加えていな
いコントロールに比べＣＭ５、ＣＭ８のどちらのコンデ
ィションドメディウムを加えたものも毛乳頭細胞の遊
走、増殖ともに優れていた。このことから、足裏表皮に
由来する何らかの液性因子が、毛乳頭細胞の遊走および
増殖を活性化するものと思われる。

【０００９】また、毛乳頭細胞がシャーレいっぱいに達
したところで継代し、そのさい細胞数を数えて集団倍加
時間(Population Doubling Time)を計算したところ、図
４に示した通り、コンディションドメディウムを加えて
培養したものでは継代１０代目以降ほぼ安定して増殖し
たのに対し、なにも加えないで培養した毛乳頭細胞は徐
々に増殖速度が鈍り、継代５代目でほとんど細胞数の増
加がみられなくなった。コンディションドメディウムを
加えて培養している毛乳頭細胞は現在までに４０代以上
継代しているが、正常細胞の指標の一つである接触阻止
(contact inhibition)がみられる。図５に示した通り、
細胞の形態は培養初期のものとは若干異なるが、およそ
１０代目以降安定し、ＣＭ５とＣＭ８とではやや異なっ
た形態を示した。

【００１０】足裏表皮細胞のコンディションドメディウ
ムによる毛乳頭細胞の遊走および増殖の活性化は再現性
があり、継代後の細胞形態の変化もそれぞれのコンディ
ションドメディウムに特異的であった。コンディション
ドメディウムにより長期継代培養した毛乳頭細胞が本来
の毛乳頭細胞の機能を保持しているかどうかを調べるた
めに、図６に示したように、毛包の腎臓皮膜下移植法に
よる細胞機能検査を行った。その結果、図７に例示した
が、３０代継代された培養毛乳頭細胞を詰めた毛包でも
陽性対照と同様に毛包が再生し毛幹の伸長がみられた。
毛包の各組織を染め分けるモノクローナル抗体（Ｋ１３
ｘｘシリーズ）で染色したところ、図８に例示した通
り、再生した毛包は正常な毛包と同等の組織分化がみら
れた。

【００１１】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、これまでは毛
乳頭細胞を効率よく遊走、増殖させることができず、毛
乳頭細胞の長期継代培養が不可能で、毛乳頭細胞を本来
の機能（毛包再生能）を維持したまま継代培養すること
が困難であったが、この発明によって、足裏表皮細胞と
共培養することあるいは足裏表皮細胞のコンディション
ドメディウムを加えることにより、毛乳頭細胞を効率よ
く継代培養する方法が確立され、しかも、この培養法に
より、毛乳頭細胞を本来の機能（毛包再生能）を維持し
たまま継代培養することが可能となる。

【００１２】このため、この発明の毛乳頭細胞を細胞機
能を維持したまま長期培養する技術によって、毛乳頭細
胞が分泌していると考えられる毛包の分化誘導因子や成
長因子の単離、解析が容易となり、移植材料としての毛
乳頭細胞を短期間に多量に提供することを通して毛髪の
分化、増殖の人為的制御に大変に有用となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】毛乳頭と足裏表皮細胞との初代共培養を例示し
た培養８日後の状態図である。

【図２】足裏表皮細胞のコンディションドメディウムの
調製法を示したプロセス図である。

【図３】（ａ）（ｂ）（ｃ）は、各々、コンディション
ドメディウム無添加、ＣＭ５、ＣＭ８添加の初代培養を
例示した培養状態図である。

【図４】継代培養の結果を示した継代数と集団倍加時間
（ＰＤＴ）との相関図である。

【図５】（ａ）（ｂ）は、各々、ＣＭ５およびＣＭ８添
加の場合の、継代による細胞形態の変化を示した状態図
である。

【図６】腎臓皮膜下移植法を示した概要図である。

【図７】毛包の再生状態を示した図である。

【図８】再生した毛包の抗体染色図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 毛乳頭細胞を足裏表皮細胞および／また
   はその培養上清とともに培養することを特徴とする毛乳
   頭細胞の長期継代培養法。