WO2021025122A1 - 毛乳頭細胞の培養方法 - Google Patents

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WO2021025122A1
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dermal papilla
cells
papilla cells
fragment
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詩保 山下
頼子 中桐
関口　清俊
知性 下野
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花王株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing dermal papilla cells.
  • Dermal papilla is a cell derived from the mesenchymal lineage at the base of the hair follicle, and plays a role of inducing differentiation into the hair follicle by sending a differentiation signal to the hair follicle epithelial stem cell.
  • hair follicle cells are cells that are indispensable together with hair follicle epithelial stem cells for hair follicle regeneration, and if hair follicle cells can be collected from a small number of hair follicles and cultured in large quantities, hair regeneration treatment or Can contribute to hair regeneration research.
  • Non-Patent Document 1 culturing hair follicle-based cells while maintaining the ability to induce hair follicles.
  • Patent Document 2 culturing on feeder cells
  • Non-Patent Document 1 culturing in the form of spheroids
  • Patent Document 1 International Publication No. 2010/021245
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 5164439
  • Non-Patent Document 1 ACS Appl Master Interfaces, 2016, 8: 5906-5916
  • the present invention relates to the following inventions.
  • 2) A method for maintaining or promoting hair follicle-inducing ability of dermal papilla cells which comprises a step of culturing dermal papilla cells in the presence of at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof.
  • An agent for maintaining or promoting hair follicle-inducing ability of dermal papilla cells which comprises at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof as an active ingredient.
  • Photomicrograph of cultured dermal papilla cells stained with alkaline phosphatase activity The graph which shows the change of the expression of various genes of cultured dermal papilla cells.
  • Photomicrograph showing proliferation of cultured pluripotent stem cell-derived dermal papilla cells The graph which shows the change of the expression of various genes of a dermal papilla cell derived from a cultured pluripotent stem cell.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently culturing dermal papilla cells while maintaining the ability to induce hair follicles.
  • the present inventor examined various culture conditions of dermal papilla cells, and found that by culturing dermal papilla cells under the condition in which emirin or a fragment thereof is present, it is possible to proliferate while maintaining the ability to induce hair follicles.
  • dermal papilla cells can be easily proliferated without reducing the ability to induce hair follicles. This facilitates in vitro experiments using cultured dermal papilla cells capable of inducing hair follicles, and also isolates and cultivates dermal papilla cells collected from the patient's own hair, and returns the hair to the patient himself. Is easy to reproduce.
  • the "hair papilla cell” is a mesenchymal cell located at the bottom of the hair follicle and plays a role of sending an activation signal to the hair follicle epithelial stem cell for self-renewal of the hair follicle.
  • the dermal papilla cells are localized in the dermal papilla and are clearly distinguished from the mesenchymal stem cells localized in the bone marrow, fat, synovial membrane, dental pulp and the like.
  • dermal papilla cells used in the present invention dermal papilla cells derived from the skin of mammals such as humans, mice, rats, rabbits, guinea pigs, goats, pigs and cows can be used, but dermal papilla cells derived from human skin are preferable. is there.
  • skin as long as the dermal papilla maintains a normal physiological function, skin belonging to body hair or the like can be selected as long as it is not limited to hair, but is preferably the scalp.
  • the human scalp for example, one collected by surgery or the like can be used, and dermal papilla cells are collected from a growing hair follicle isolated under a microscope.
  • the dermal papilla cells to be cultured can be prepared from the collected skin using a known method (for example, Tissue Eng. 2007, 13: 975-82.). That is, growing hair follicles were isolated from the collected scalp tissue under a stereomicroscope, and the isolated hair papilla cells were placed on a culture dish and placed in DMEM medium containing 10% bovine serum and FGF-2. Hair papilla cells can be isolated by culturing in a CO 2 incubator under the conditions of 37 ° C., 5% CO 2 and 100% humidity for several days.
  • the dermal papilla cells used in the present invention are induced to differentiate from pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryonic germ stem cells (EG cells), and iPS cells. It may be a dermal papilla cell derived from the produced pluripotent stem cell.
  • pluripotent stem cells human-derived pluripotent stem cells are preferable, and human iPS cells are more preferable.
  • skin-derived pluripotent progenitor cells (SKPs) produced by inducing differentiation of pluripotent stem cells by a known method (for example, Japanese Patent No. 6304818) are used as hair. It can be used as papillary cells.
  • dermal papilla cells are cultured in the presence of at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof.
  • "Emilin” refers to elastin microfibril interface-located protein, which is a glycoprotein having a molecular weight of 115 kDa that constitutes the extracellular matrix.
  • Emilin-1, Emilin-2, and Emilin-3 have been found to form the Emilin protein family. Of these, the function of Emilin-1 has been clarified, and it has been reported that it exists at the interface between elastin and fine fibers in the skin and is involved in the elasticity of the skin by regulating elastin deposition (Japanese teeth). Journal of the Periodontal Society 2004 46: 175-184).
  • Emirin includes a gC 1 q domain is an integrin binding site on the C-terminal side, the N-terminal side there is a cysteine-rich EMI domain, are involved in multimerization. Emilin forms a homotrimer and exerts its function.
  • the origin of the emiline of the present invention is not particularly limited, and emiline derived from various organisms, preferably mammals, can be used. Mammals include, but are not limited to, humans, mice, rats, cows, pigs and the like. Of these, it is particularly preferable to use human-derived Emilin. It may also be a recombinant.
  • human emiline-1 is preferable, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the emiline fragment examples include a partial peptide of emiline, and examples thereof include a C-terminal fragment. It is preferably a partial peptide of Emilin-1. gC 1 q domain is an integrin binding site located from the C-terminal side of Emirin 120 to 160 of the amino acid region (J Biol Chem 2003,278:. 6160-6167 .). Therefore, it can be said that the Emilin fragment of the present invention is preferably a partial peptide of Emilin having integrin-binding activity. It can be confirmed by the ELISA method or the like that the emiline fragment has an integrin-binding activity.
  • suitable emiline fragments include, specifically, a C-terminal fragment of emirin- 1 , a fragment of emirin- 1 containing a gC1q domain, and more preferably emirin-1 consisting of 120 to 200 amino acids.
  • C-terminal fragment of Emilin- 1 containing the gC 1 q domain more particularly the C-terminal fragment of Emilin -1 containing the gC 1 q domain consisting of 120-160 amino acids. ..
  • the emiline or emiline fragment of the present invention may be a protein or peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the protein or peptide, and having integrin-binding activity.
  • a protein or peptide for example, one or several amino acids in the portion other than the gC 1 q domains in the protein or peptide are deleted, include proteins or peptides consisting of a substituted or added in the amino acid sequence.
  • the number may be, for example, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, or 2 to 4. May be good.
  • the method for producing the emiline fragment is also not particularly limited, and examples thereof include a method in which the full-length emiline is digested with a proteolytic enzyme to separate and purify the target fragment, and a method in which the emiline fragment is produced as a recombinant protein.
  • Recombinant emiline and recombinant emiline fragment can be produced by appropriately using a known gene recombination technique. That is, known proteins are obtained by obtaining DNAs encoding full-length proteins or partial proteins, inserting them into expression vectors, introducing them into appropriate host cells and expressing them, and forming trimeric proteins. It can be produced by purification by the method.
  • the above-mentioned Emilin or a fragment thereof may contain a sequence used for their construction, separation, or purification, for example, a tag sequence, a linker sequence, or the like. That is, as one embodiment of the emiline or fragment thereof of the present invention, an amino acid such as a tag sequence is added to the end of the emirin or emirin fragment, for example, a 6 ⁇ His tag sequence is added to the N-terminal. Included.
  • the culture conditions for the dermal papilla cells of the present invention are not particularly limited as long as the dermal papilla cells are proliferative, except that they are carried out in the presence of at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof.
  • dermal papilla cells may be cultured on a culture substrate containing at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof, and at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof may be used as a medium. May be added to cultivate dermal papilla cells.
  • a culture medium having a coating agent containing at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof For example, plates, meshes, dishes, etc.
  • examples thereof are selected from the group consisting of emiline and fragments thereof by coating with a coating agent containing at least one selected from the group consisting of emiline and fragments thereof.
  • examples thereof include a culture medium to which at least one of these is adsorbed.
  • At least one selected from the group consisting of emiline and its fragments is added to the medium, at least one selected from the group consisting of emirin and its fragments is added to the medium prior to seeding of dermal papilla cells.
  • at least one selected from the group consisting of emiline and fragments thereof may be added to the medium together with the dermal papilla cells.
  • the culture substrate, coating agent, and medium containing at least one selected from the group consisting of Emilin and its fragments may contain scaffolding materials or cell adhesion molecules other than Emilin or its fragments.
  • Examples of the scaffolding material or cell adhesion molecule other than emiline or a fragment thereof include extracellular matrix components such as collagen, elastin, laminin, proteoglycan, and glycosaminoglycan, and among them, according to the hair root portion. It is preferable to select laminin, collagen type I or collagen type IV, which are extracellular matrix components.
  • the content of the emirin or a fragment thereof in the culture medium containing at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof is preferably 0.05 per 1 cm 2 of the area in which the culture medium contacts the culture. It may be about 50 ⁇ g, more preferably 0.1 to 10 ⁇ g, and more preferably 0.2 to 3 ⁇ g.
  • the culture substrate is coated with a coating agent containing preferably 0.05 to 50 ⁇ g, more preferably 0.1 to 10 ⁇ g, more preferably 0.2 to 3 ⁇ g of emiline or a fragment thereof per 1 cm 2 of the coating area. It may be treated and Emilin or a fragment thereof may be adsorbed on the culture substrate.
  • the content of emiline or a fragment thereof in a medium supplemented with at least one selected from the group consisting of emiline and fragments thereof is preferably 0.1 to 100 ⁇ g, more preferably 0, as the final concentration per 1 mL of the medium. . Adjust to 2 to 20 ⁇ g.
  • the material and shape of the incubator are not particularly limited as long as the cells can be cultured.
  • plastic, glass, or the like can be used as the material, and in addition to the dish, a well having a bottom surface having a round bottom type or a mortar type can also be used.
  • tissue culture dish for example, a cell culture surface-treated dish manufactured by Corning Inc. (product number: 43165)
  • a tissue culture dish manufactured by IWAKI product number: 3000-035
  • the culture medium can be used as it is or modified by adding an additive to a commercially available nutrient medium used for culturing animal cells.
  • a commercially available nutrient medium used for culturing animal cells.
  • known media for example, MEM medium (Minimum Essential Medium), BME medium (Basic Medium Eagle), IMDM medium (Iscover's Modified Dulvecco's Medium), D-MEM medium (Dulve's Medium), D-MEM medium (Dulve's Medium).
  • the additive may be a serum-containing medium, a serum-free medium, or a medium containing a serum substitute.
  • the serum substitute include albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements (for example, zinc, selenium, etc.), nutritional factors (EGF (epidermal growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), etc.).
  • Examples include B-27 TM supplements, N2 supplements, knockout epidermal replacement, and 2-mercaptoethanol.
  • components usually used in the medium such as vitamins, buffers, inorganic salts, antibiotics (for example, penicillin, kanamycin, streptomycin) can be mentioned.
  • the seeding density of cells at the start of culturing is not particularly limited, but for example, 0.15 ⁇ 10 4 to 10 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , preferably 0.5 ⁇ 10 4 to 2.0, relative to the incubator. ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the culture conditions are not particularly limited, but the culture temperature is, for example, 30 to 40 ° C, preferably 36 ° C to 38 ° C, and the CO 2 concentration is, for example, 3 to 10%, preferably 4 to 4. It is 6%.
  • the oxygen concentration is, for example, 1 to 25%, preferably 2 to 20%. Culturing is preferably carried out until the density of cell colonies reaches about 80% of that of the incubator.
  • the cultured dermal papilla cells maintain their ability to induce hair follicles.
  • Confirmation of having hair follicle-inducing ability encodes alkaline phosphatase (ALP) activity, for which a relationship between hair follicle-inducing ability and its activity has been reported, a protein for exerting hair follicle-inducing ability, and the protein concerned.
  • ALP alkaline phosphatase
  • protein expression can be confirmed by a method using an antigen-antibody reaction or the like, and gene expression can be confirmed by a method using a Northern blot method, a polymerase chain reaction (PCR), or the like.
  • alkaline phosphatase ALP
  • Wingless related MMTV integration site 5A WNT5A; involved in fetal hair follicle development
  • BMP4 Bone morphogenetic protein 4
  • LEF1 Lymphoid enhancer binding factor 1
  • ELF1 Lymphoid enhancer binding factor 1
  • LEF1 Lymphoid enhancer binding factor 1
  • Etc. and Dickkopf-1
  • DKK-1 Dickkopf-1
  • the ability of the dermal papilla cells to induce hair follicles can be maintained or promoted. It becomes. Therefore, Emilin or a fragment thereof can be a maintenance or promoter of hair follicle-inducing ability, which is used by being added to a medium during culturing of dermal papilla cells.
  • ⁇ 1> A method for culturing dermal papilla cells, in which dermal papilla cells are cultured in the presence of at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof.
  • ⁇ 2> Performed on a culture substrate containing at least one selected from the group consisting of Emilin and its fragments, or by adding at least one selected from the group consisting of Emilin and its fragments to the medium.
  • Culturing is carried out in an incubator coated with a scaffold material or cell adhesion molecule other than Emilin or a fragment thereof, by adding at least one selected from the group consisting of Emilin and its fragments.
  • ⁇ 4> The content of emiline or a fragment thereof in the medium is adjusted so that the final concentration per 1 mL of the medium is 0.1 to 100 ⁇ g, preferably 0.2 to 20 ⁇ g, ⁇ 1> to ⁇ 3>. Either way.
  • ⁇ 5> The content of the emirin or a fragment thereof in the culture medium containing at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof is 0. per 1 cm 2 of the area in which the culture medium contacts the culture.
  • the method of ⁇ 2> which is 05 to 50 ⁇ g, preferably 0.1 to 10 ⁇ g, and more preferably 0.2 to 3 ⁇ g.
  • a method for maintaining or promoting hair follicle-inducing ability of dermal papilla cells which comprises a step of culturing dermal papilla cells in the presence of at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof.
  • An agent for maintaining or promoting hair follicle-inducing ability of dermal papilla cells which comprises at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof as an active ingredient.
  • ⁇ 13> Use of at least one selected from the group consisting of emirin and fragments thereof for maintaining or promoting the ability of hair dermal papilla cells to induce hair follicles.
  • ⁇ 15> In the above ⁇ 11> to ⁇ 14>, Emilin is Emilin-1.
  • the fragment of Emilin contains the gC1q domain.
  • the fragment of Emilin is the C-terminal fragment of Emilin-1.
  • the fragment of Emilin is a C-terminal fragment of Emilin-1 consisting of 120 to 200 amino acids.
  • PCR was performed using the cDNA reverse-transcribed from Human Fetal Heart Total RNA (Clontech) with SuperScript TM III First-Strand Synthesis System (trade name, Invitrogen) using the following three types of primer sets.
  • the cDNA encoding the human EMILIN-1 fragment was amplified.
  • PCR was performed using the following primer sets using the cDNA encoding the human EMILIN-1 second fragment and the third fragment as a template, and the cDNA encoding the fragment in which the second fragment and the third fragment were linked was amplified. did.
  • the expression vector pSecTag2A (Invitrogen) for mammalian cells was cleaved with restriction enzymes NheI and HindIII, and each cDNA encoding the human EMILIN-1 fragment subjected to the above enzyme digestion was inserted into the site to obtain a human full-length EMILIN-1.
  • An expression vector was prepared.
  • PCR was performed using the expression vector of human full-length EMILIN-1 as a template, and the C-terminal fragment of human EMILIN-1 (Ala 845- Ala 995 polypeptide chain [human EMILIN excluding the secretory signal].
  • PCR was performed using the following primers using the expression vector for mammalian cells, pSecTag2A (Invitrogen), and the Ig ⁇ secretion signal (Met-Glu-Thr-Asp-Thr-Leu-Leu-Leu-Leu-) of the pSecTag2A expression vector.
  • the cDNA encoding the Trp-Val-Leu-Leu-Leu-Trp-Val-Pro-Gly-Ser-Thr-Gly-Asp (SEQ ID NO: 10) and 6 ⁇ His tag was amplified.
  • PCR was performed using the cDNA encoding the Ig ⁇ secretion signal prepared above and the cDNA encoding the C-terminal fragment of human EMILIN-1 as templates using the following primers, and the human recombinant EMILIN-1 C-terminal fragment (EM1-C) was performed.
  • E1-C human recombinant EMILIN-1 C-terminal fragment
  • the amplified cDNA was excised with restriction enzymes NheI and HindIII and inserted into the site of the expression vector pSecTag2A (Invitrogen) for mammalian cells to prepare an expression vector for EM1-C.
  • the expression of EM1-C was carried out by introducing the prepared expression vector into human kidney-derived 293F cells (purchased from Invitrogen). 600 mL of 293F cells (1.0 ⁇ 10 6 cells / mL) were transfected with 600 ⁇ g of the expression vector using 780 ⁇ L of transfection reagent 293fectin (trade name, Invitrogen) and 42 mL of Opti-MEM (trade name, Invitrogen). After culturing for 48 hours, the culture solution was collected. The culture broth was centrifuged at 1000 ⁇ g for 15 minutes, and the supernatant was further centrifuged at 15,000 ⁇ g for 30 minutes to remove cells and insoluble matter.
  • the suspension was transferred to an econocolumn, the compacte His-tag Purification Resin was collected, washed with 5 mM imidazole / TBS (-) (Tris buffered saline containing no Ca and Mg), and then 250 mM imidazole / TBS. It was eluted with (-). The eluted fractions were combined and transferred to a centrifugal ultrafiltration filter (NMWL: 30K, Millipore) for centrifugal concentration. The concentrated fraction was transferred to a dialysis cassette (MWCO: 20K, Thermo Fisher Scientific) and dialyzed against PBS ( ⁇ ) (phosphate buffered saline containing no Ca, Mg).
  • NMWL 30K, Millipore
  • the dialyzed purified protein solution was collected, sterilized by a 0.22 ⁇ m disc filter, and quantified by the BCA method.
  • the purified EM1-C (containing a 6 ⁇ His tag on the N-terminal side) was stained with silver after SDS-PAGE to confirm its purity.
  • Example 1 Culture of normal human hair papilla cells 1.
  • Cell culture Normal human hair papilla cells (TOYOBO: CA602t05a) were seeded on a collagen type I coated dish 100 mm (IWAKI: 4020-010) and cultured using a hair papilla cell proliferation medium (TOYOBO: TMTPGM-250).
  • 80% to 90% confluent hair papilla cells were exfoliated using Accutase (Incubative Cell Technologies: AT104), and 2 mL of collagen type I coated dish 35 mm (IWAKI: 4000-010) or 100 nM EM1-C was added per well. Then, the cells were sown on a 6-well plate (Falcon: 353046) coated by allowing to stand at 37 ° C.
  • the cells were cultured in a papillary cell growth medium at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 3 days.
  • the amplification conditions were a denaturation reaction for 95 and 15 seconds, an annealing reaction at 60 ° C. for 1 minute, and an extension reaction in a 20 ⁇ L reaction system.
  • the value of each gene expression calculated by the ⁇ Ct method was corrected by the expression level of RPLP0, and each gene expression level was shown as a relative value with the expression level in hair papilla cells cultured on collagen-1 as 1.0. It was.
  • Figure 2 shows the results of gene expression in dermal papilla cells examined by the quantitative PCR method.
  • Alkaline phosphatase (ALP) expression which has been suggested to be associated with hair follicle-inducing ability, in dermal papilla cells cultured on EM1-C-coated plates than in dermal papilla cells cultured on collagen-type I-coated plates. was confirmed to increase.
  • Wingless retarded MMTV integration site 5A WNT5A
  • BMP4 Bone morphogenetic protein 4
  • LRP4 Low-density lipoprotein receptor-related protein 4
  • DKK-1 Dickkopf-1
  • Example 2 Culture of pluripotent stem cell-derived dermal papilla cells on Emilin-1 ⁇ Preparation of pluripotent stem cell-derived dermal papilla cells> 1.
  • SSPs skin-derived pluripotent progenitor cells
  • Human-derived iPS cells (clone name: 1231A3) were used as pluripotent stem cells. The cells were maintained and cultured according to the culture method recommended by the obtaining institution. That is, using StemFit (registered trademark) (AK02N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a medium for human iPS cells, in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 , Sci.
  • StemFit registered trademark
  • NCS neural crest stem
  • NCS cells prepared in (2) were cultured in DMEM / F12 medium (manufactured by Life Technologies, catalog number: 10565-018) containing (Cayman, catalog number: 13122, 3 ⁇ M) for 3 to 5 days. Differentiation from NCS cells to SKPs was induced. Since it is not passaged when the differentiation of NCS cells into SKPs is induced, P-LM111E8 coated during iPS cell culture exists as it is as a scaffolding molecule.
  • the cells differentiated into SKPs were subcultured using a cultured cell separation / dispersion solution (trade name: Accutase, manufactured by BD Biosciences, Catalog No .: 561527) without P-LM111E8 scaffolding, and then B-27 (trade name: Accutase, manufactured by BD Biosciences).
  • the obtained SKPs were used as dermal papilla cells in the following experiments.
  • pluripotent stem cell-derived dermal papilla cells on Emilin-1 1.
  • pluripotent stem cell-derived SKPs were used as hair papilla cells, and an uncoated dish (IWAKI: 3000-035) or 0.5 ⁇ g / cm 2 EM1-C was allowed to stand at 37 ° C for 1 hour. Seed on the same coated dish, respectively, and B27 incubation (manufactured by Life Technologies, catalog number: 17504-044, 2% by mass), EGF (manufactured by R & D Systems, catalog number: 336-EG-200, 20 ng / mL).
  • BFGF Wang, Catalog No .: 064-04541, 40 ng / mL
  • Penicillin / Streptomycin (Life Technologies, Catalog No .: 15140-122, 50 U, 50 ⁇ g / mL) in D-MEM / F12 medium ( The cells were cultured for 3 days in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 using Life Technologies, Inc., Catalog No .: 10565-018).
  • FIG. 3 shows a micrograph showing the state of the dermal papilla cells obtained by culturing in this way.
  • the dermal papilla cells derived from pluripotent stem cells were also considered to have good cell growth by culturing on Emilin-1.
  • the amplification conditions were 95 ° C., 15 seconds of denaturation reaction, 60 ° C., 1 minute annealing, and extension reaction in a 20 ⁇ L reaction system.
  • the value of each gene expression calculated by the ⁇ Ct method was corrected by the expression level of RPLP0, and each gene expression level was shown as a relative value with the expression level in dermal papilla cells cultured on collagen type I as 1.0. It was.
  • Figure 4 shows the results of gene expression in pluripotent stem cell-derived dermal papilla cells examined by the quantitative PCR method.
  • pluripotent stem cell-derived dermal papilla cells prepared using the P-LM111E8 fragment were cultured on EM1-C, an increase in ALP expression, which was suggested to be associated with hair follicle-inducing ability, was confirmed.
  • increased expression of BMP4, which is involved in hair follicle development during the fetal period, and LEF1, which suppresses the expression of E-cadhelin during hair follicle primordium development was also confirmed.
  • LRP4 which is a dermal papilla cell marker

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Abstract

毛乳頭細胞を、毛包誘導能を維持させながら効率よく培養する方法を提供する。　毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する、毛乳頭細胞の培養方法。

Description

毛乳頭細胞の培養方法
　本発明は毛乳頭細胞の培養方法に関する。
　毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ）は、毛包の基部にある間葉系由来の細胞で、毛包上皮系幹細胞に分化シグナルを送ることにより毛包へ分化誘導する役割を担っている。
　すなわち、毛乳頭細胞は、毛包再生には毛包上皮系幹細胞と共に欠くことのできない細胞であり、少数の毛包から毛乳頭細胞を採取して大量に培養することができれば、毛髪再生治療や毛の再生研究に貢献できる。
　しかしながら、毛乳頭細胞が有する毛包誘導能は、培養継代数を重ねると共に失われてしまう。このため、毛包誘導能を維持したまま毛乳頭細胞を培養する技術が従来から求められており、例えば、ＢＭＰ－２／ＢＭＰ－４系材料及びＷＮＴ系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養すること（特許文献１）、フィーダー細胞上で培養すること（特許文献２）、スフェロイド状に培養すること（非特許文献１）等が報告されている。
　　（特許文献１）国際公開第２０１０／０２１２４５号
　　（特許文献２）特許第５１６４４３９号公報
　　（非特許文献１）ACS Appl Master Interfaces, 2016, 8: 5906-5916
　本発明は、以下の発明に係るものである。
　１）毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する、毛乳頭細胞の培養方法。
　２）毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する工程を含む、毛乳頭細胞の毛包誘導能の維持又は促進方法。
　３）エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進剤。
　４）毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進剤を製造するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
　５）毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
　６）毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進に使用するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種。
培養毛乳頭細胞をアルカリフォスファターゼ活性染色した顕微鏡写真。 培養毛乳頭細胞の各種遺伝子発現の変化を示すグラフ。 培養多能性幹細胞由来毛乳頭細胞の増殖を示す顕微鏡写真。 培養多能性幹細胞由来毛乳頭細胞の各種遺伝子発現の変化を示すグラフ。
発明の詳細な説明
　本発明は、毛乳頭細胞を、毛包誘導能を維持させながら効率よく培養する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、毛乳頭細胞の培養条件を種々検討したところ、エミリン又はそのフラグメントが存在する条件下で毛乳頭細胞を培養することにより、毛包誘導能を維持させながら増殖できることを見出した。
　本発明により、毛包誘導能を低下させずに、毛乳頭細胞が容易に増殖可能となる。これにより、毛包誘導能を持つ培養毛乳頭細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験が容易となり、また、患者自身の毛から採取した毛乳頭細胞を単離・培養し、再び患者自身に戻すような毛の再生が容易となる。
　本発明において、「毛乳頭細胞」とは、毛包最底部に位置する間葉系細胞であり、毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送る役割を担っている。なお、毛乳頭細胞は毛乳頭に局在し、骨髄、脂肪、関節滑膜、歯髄等に局在する間葉系幹細胞とは明確に区別される。　
　本発明で用いる毛乳頭細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ等の哺乳動物の皮膚由来の毛乳頭細胞を使用できるが、好ましくはヒト皮膚由来の毛乳頭細胞である。皮膚は、毛乳頭が正常な生理機能を保持されている限り、頭髪に限らず体毛等に属する皮膚を選択できるが、好ましくは頭皮である。ヒト頭皮は、例えば外科手術等によって採取されたものを使用することができ、顕微鏡下で単離した成長期毛包より毛乳頭細胞が採取される。
　培養に供する毛乳頭細胞は、採取した皮膚から公知の手法（例えば、Tissue Eng. 2007 ,13:975-82.）を用いて調製することができる。すなわち、採取した頭皮組織から実体顕微鏡下で成長期毛包を単離し、さらに単離した毛乳頭細胞を培養用ディッシュ上に静置し、１０％ウシ血清及びＦＧＦ－２を含むＤＭＥＭ培地で、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％条件下で数日間培養することにより毛乳頭細胞を単離できる。
　また、本発明で用いる毛乳頭細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して作製された多能性幹細胞由来の毛乳頭細胞であってもよい。多能性幹細胞としてはヒト由来の多能性幹細胞が好ましく、ヒトｉＰＳ細胞がより好ましい。多能性幹細胞由来の毛乳頭細胞としては、多能性幹細胞を公知の方法（例えば、特許第６３０４８１８号公報）により分化誘導して作製された皮膚由来多能性前駆細胞（ＳＫＰｓ）等を毛乳頭細胞として使用することができる。
　本発明において、毛乳頭細胞の培養は、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下に行われる。
　「エミリン（Ｅｍｉｌｉｎ）」とは、細胞外マトリックスを構成する、分子量１１５ｋＤａの糖タンパク質であるｅｌａｓｔｉｎ　ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ－ｌｏｃａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎを指す。現在までに、エミリン－１、エミリン－２、エミリン－３が見出され、エミリンタンパク質ファミリーを形成している。
　このうち、エミリン－１については、その機能が明らかにされ、皮膚においてエラスチンと微細繊維の界面に存在し、エラスチン沈着を調節することで皮膚の弾性に関与することが報告されている（日本歯周病学会会誌 2004 46:175-184）。
　エミリンは、Ｃ末端側にインテグリン結合部位であるｇＣ１ｑドメインと、Ｎ末端側にはシステインリッチなＥＭＩドメインが存在し、多量体形成に関わっている。エミリンはホモ３量体を形成し、機能を発揮する。
　本発明のエミリンとしては、その由来は特に限定されず、各種生物、好ましくは哺乳動物由来のエミリンを用いることができる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。なかでもヒト由来のエミリンを用いることが特に好ましい。また組換体であってもよい。
　ヒトエミリンの遺伝子やアミノ酸配列の情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得可能であり、ヒトエミリン－１はＮＰ＿００８９７７．１、ヒトエミリン－２はＮＰ＿１１４４３７．２、ヒトエミリン－３はＮＰ＿４４３０７８．１として登録されている。このうち、好ましくはヒトエミリン－１であり、そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
　エミリンフラグメントとしては、エミリンの部分ペプチドが挙げられ、例えばＣ末端フラグメント等が例示できる。好ましくはエミリン－１の部分ペプチドである。ｇＣ１ｑドメインはエミリンのＣ末端側から１２０～１６０個のアミノ酸領域に位置するインテグリン結合部位である（J Biol Chem. 2003,278 :6160-6167.）。よって、本発明のエミリンフラグメントは、好適にはインテグリン結合活性を有するエミリンの部分ペプチドであると云える。エミリンフラグメントがインテグリン結合活性を有していることは、ＥＬＩＳＡ法等により確認することができる。
　本発明において、好適なエミリンフラグメントとしては、具体的には、エミリン－１のＣ末端フラグメント、ｇＣ１ｑドメインを含むエミリン－１のフラグメント、より好ましくは１２０～２００個のアミノ酸からなるエミリン－１のＣ末端フラグメント、詳細にはｇＣ１ｑドメインを含むエミリン－１のＣ末端フラグメント、より詳細には１２０～１６０個のアミノ酸からなるｇＣ１ｑドメインを含むエミリン－１のＣ末端フラグメントが挙げられる。
　本発明のエミリン又はエミリンフラグメントは、当該タンパク質又はペプチドにおいて１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つインテグリン結合活性を有するタンパク質又はペプチドであってもよい。斯かるタンパク質又はペプチドとしては、例えば当該タンパク質又はペプチドにおけるｇＣ１ｑドメイン以外の部分の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドが挙げられる。
　ここで、数個とは、例えば、２～１０個であってもよいし、２～８個であってもよいし、２～６個であってもよいし、２～４個であってもよい。
　エミリンは、例えば、エミリン高発現細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造することができる。エミリンフラグメントの製造方法も特に限定されず、例えば、全長エミリンをタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。組換えエミリン、組換えエミリンフラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。すなわち、全長タンパク質または部分タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、これを適切な宿主細胞に導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。
　また、上述したエミリン又はそのフラグメントは、それらの構築、分離、又は精製に用いられる配列、例えばタグ配列、リンカー配列等、を含んでいてもよい。すなわち、本発明のエミリン又はそのフラグメントには、一態様として、エミリン又はエミリンフラグメントの末端にタグ配列などのアミノ酸が付加されたもの、例えばＮ末端に６×Ｈｉｓタグ配列が付加されたもの等が包含される。
　本発明の毛乳頭細胞の培養条件は、毛乳頭細胞が増殖可能なものであればよく、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下に行われること以外特に制限されない。例えば、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で毛乳頭細胞を培養してもよく、またエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を培地に添加して毛乳頭細胞を培養してもよい。
　エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材の例としては、該エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有するコーティング剤を有する培養基材（例えばプレート、メッシュ、ディッシュ等）が挙げられ、その例としては、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含むコーティング剤によりコートすることでエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種が吸着している培養基材が挙げられる。
　また、培地にエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を添加する場合、毛乳頭細胞の播種に先立って培地にエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を添加してもよく、あるいは毛乳頭細胞と一緒に培地にエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を添加してもよい。
　なお、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材やコーティング剤、培地には、エミリン又はそのフラグメント以外の足場材又は細胞接着分子が含まれていてもよい。エミリン又はそのフラグメント以外の足場材又は細胞接着分子としては、例えば、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン等の細胞外マトリクス構成成分を挙げることができるが、このうち、毛根部に準じた細胞外マトリクス構成成分である、ラミニン、コラーゲンタイプＩ又はコラーゲンタイプＩＶを選択することが好適である。
　エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材における該エミリン又はそのフラグメントの含有量は、該培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ２あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇ、より好ましくは０．２～３μｇであればよい。例えば、コーティングする面積１ｃｍ２あたり、エミリン又はそのフラグメントを好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇ、より好ましくは０．２～３μｇ含むコーティング剤により、該培養基材をコーティング処理し、エミリン又はそのフラグメントを該培養基材に吸着させればよい。
　また、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を添加した培地におけるエミリン又はそのフラグメントの含有量を、培地１ｍＬあたりの最終濃度として、好ましくは０．１～１００μｇ、より好ましくは０．２～２０μｇになるように調整するとよい。
　培養器としては、細胞を培養可能なものであれば、材質や形状は特に限定されるものではない。例えば、材質はプラスチックやガラス等を用いることが可能であり、ディッシュの他、丸底型又はすり鉢型等の形状の底面を有するウエルを用いることもできる。
　具体的には、例えば、組織培養ディッシュ（例えば、コーニング社製の細胞培養表面処理済ディッシュ（製品番号：４３０１６５）やＩＷＡＫＩ社製の組織培養用ディッシュ（製品番号：３０００－０３５）が挙げられる。
　培養液（培地）は、動物細胞の培養に用いられる市販の栄養培地をそのまま、或いは添加剤を添加して改変して用いることができる。既知の培地としては、例えば、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ培地（Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ハム培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２）、ＲＰＭＩ培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、毛乳頭細胞増殖培地及びこれらの混合培地等を挙げることができる。
　添加剤としては、血清含有培地であっても、無血清培地であっても、血清代替物を含有する培地であってもよい。該血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン等）、栄養因子（ＥＧＦ（上皮成長因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）等）、Ｂ－２７（商標）サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２－メルカプトエタノールが挙げられる。さらには、必要に応じてビタミン、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えば、ペニシリン、カナマイシン、ストレプトマイシン）等、培地に通常用いられる成分が挙げられる。
　培養開始時の細胞の播種密度は、特に限定されないが、例えば、培養器に対して０．１５×１０４～１０×１０４cells／ｃｍ２、好ましくは０．５×１０４～２．０×１０４cells／ｃｍ２である。
　培養条件は、特に限定されるものではないが、培養温度は、例えば３０～４０℃、好ましくは３６℃～３８℃であり、また、ＣＯ２濃度は、例えば３～１０％、好ましくは４～６％である。また、酸素濃度は例えば１～２５％、好ましくは２～２０％である。培養は、細胞のコロニーの密度が培養器に対して８０％前後に達するまで行うことが好ましい。
　斯くして、培養された毛乳頭細胞は、毛包誘導能を維持している。毛包誘導能を有することの確認は、毛包誘導能とその活性の関連性が報告されているアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性や、毛包誘導能を発揮するためのタンパク質や当該タンパク質をコードする遺伝子の発現の有無や、顕微鏡観察による細胞形態などを評価することによって行うことができる。例えば、タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって確認することができ、遺伝子の発現はノーザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを利用した方法等によって確認することができる。
　なお、毛包誘導能が高まるとその発現が増加する分子として、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ＭＭＴＶ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　５Ａ（ＷＮＴ５Ａ；胎仔期の毛包発生に関与）、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４（ＢＭＰ４；胎仔期の毛包発生に関与）、Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　１（ＬＥＦ１；毛包原基発生時におけるＥ－ｃａｄｈｅｌｉｎの発現抑制に関与）、Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４（ＬＲＰ４；毛乳頭細胞マーカー）等が挙げられ、毛包誘導能が高まるとその発現が低下する分子としてＤｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ－１；脱毛症患者で高発現）が報告されている（文献；J Cell Sci. 2012 125: 4114-4125）。
　斯様に、本発明の毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する方法によれば、毛乳頭細胞の毛包誘導能の維持又は促進が可能となる。したがって、エミリン又はそのフラグメントは、毛乳頭細胞の培養の際に培地に添加等して使用される、毛包誘導能の維持又は促進剤となり得る。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する、毛乳頭細胞の培養方法。
＜２＞エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で行われる、或いはエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を培地に添加することにより行われる、＜１＞の方法。
＜３＞培養がエミリン又はそのフラグメント以外の足場材又は細胞接着分子を用いてコーティングされた培養器中で、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を添加して行われる、＜２＞の方法。
＜４＞エミリン又はそのフラグメントの培地中の含有量が培地１ｍＬあたりの最終濃度として、０．１～１００μｇ、好ましくは０．２～２０μｇになるように調整される、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材における該エミリン又はそのフラグメントの含有量が、該培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ2あたり、０．０５～５０μｇ、好ましくは０．１～１０μｇ、より好ましくは０．２～３μｇである、＜２＞の方法。
＜６＞エミリンがエミリン－１である、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞エミリンのフラグメントがｇＣ１ｑドメインを含むものである、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜８＞エミリンのフラグメントがエミリン－１のＣ末端フラグメントである、＜７＞の方法。
＜９＞エミリンのフラグメントが１２０～２００個のアミノ酸からなるエミリン－１のＣ末端フラグメントである、＜７＞の方法。
＜１０＞毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する工程を含む、毛乳頭細胞の毛包誘導能の維持又は促進方法。
＜１１＞エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進剤。
＜１２＞毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進剤を製造するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜１３＞毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜１４＞毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進に使用するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種。
＜１５＞上記＜１１＞～＜１４＞において、エミリンがエミリン－１である。
＜１６＞上記＜１１＞～＜１４＞において、エミリンのフラグメントがｇＣ１ｑドメインを含むものである。
＜１７＞上記＜１６＞において、エミリンのフラグメントがエミリン－１のＣ末端フラグメントである。
＜１８＞上記＜１６＞において、エミリンのフラグメントが１２０～２００個のアミノ酸からなるエミリン－１のＣ末端フラグメントである。
参考例１　ヒト組換えＥＭＩＬＩＮ－１　Ｃ末端フラグメントの作製
　エミリンフラグメントとして、ヒト組換えＥＭＩＬＩＮ－１　Ｃ末端フラグメント（以下、「ＥＭ１－Ｃ」と記す）を以下に示す方法により作製した。
　最初に、Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　Ｈｅａｒｔ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（クロンテック社）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、インビトロジェン社）で逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、以下の３種類のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ヒトＥＭＩＬＩＮ－１フラグメントをコードするｃＤＮＡを増幅した。
（ｉ）ヒトＥＭＩＬＩＮ－１第１フラグメント増幅用プライマー
　　5’-atatatgctagccactgtggagcgccccgccatg-3’（forward、配列番号２）
　　5’-tccctgccccgcggctcctc-3’（reverse、配列番号３）
（ｉｉ）　ヒトＥＭＩＬＩＮ－１第２フラグメント増幅用プライマー
　　5’-atgtcgtggccggctcagtgacagtg-3’（forward、配列番号４）
　　5’-cctcctgctgcagcctgttaatctcagaaatgatacggtc-3’（reverse、配列番号５）
（ｉｉｉ）　ヒトＥＭＩＬＩＮ－１第３フラグメント増幅用プライマー
　　5’-gaccgtatcatttctgagattaacaggctgcagcaggagg-3’（forward、配列番号６）
　　5’-atatataagcttctaatgatgatgatgatgatgcgcgtgttcaagctctgggtcccc-3’（reverse、配列番号７）
　次に、ヒトＥＭＩＬＩＮ－１第２フラグメントと第３フラグメントをコードするｃＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、第２フラグメントと第３フラグメントを連結したフラグメントをコードするｃＤＮＡを増幅した。
（ｉｖ）第２と第３フラグメントを連結したフラグメントをコードするｃＤＮＡ増幅用プライマー
　　5’-atgtcgtggccggctcagtgacagtg-3’（forward、配列番号４と同じ）
　　5’-atatataagcttctaatgatgatgatgatgatgcgcgtgttcaagctctgggtcccc-3’（reverse、配列番号７と同じ）
　ヒトＥＭＩＬＩＮ－１第１フラグメントをコードするｃＤＮＡは制限酵素ＮｈｅＩとＳａｃＩＩで、第２と第３フラグメントを連結したフラグメントをコードするｃＤＮＡは制限酵素ＳａｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで、酵素消化した。
　哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン社）を制限酵素ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、当該部位に上記の酵素消化を行ったヒトＥＭＩＬＩＮ－１フラグメントをコードする各ｃＤＮＡを挿入し、ヒト全長ＥＭＩＬＩＮ－１の発現ベクターを作製した。
　次に、ヒト全長ＥＭＩＬＩＮ－１の発現ベクターを鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、ヒトＥＭＩＬＩＮ－１のＣ末端フラグメント（Ａｌａ８４５－Ａｌａ９９５ポリペプチド鎖［分泌シグナルを除いたヒトＥＭＩＬＩＮ－１アミノ酸配列Ｎ末端残基Ａｌａを１位とする］）をコードするｃＤＮＡを増幅した。
（ｖ）ヒトＥＭＩＬＩＮ－１のＣ末端フラグメント増幅用プライマー
　　5’-ccaggttccactggtgaccatcatcatcatcatcatgaggagggacaagcacaggccggc-3’（forward、配列番号８）
　　5’-atatataagcttctacgcgtgttcaagctctgggtccccatagag-3’（reverse、配列番号９）
　また、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン社）を鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ発現ベクターのＩｇκ分泌シグナル（Met-Glu-Thr-Asp-Thr-Leu-Leu-Leu-Trp-Val-Leu-Leu-Leu-Trp-Val-Pro-Gly-Ser-Thr-Gly-Asp（配列番号１０））及び６×ＨｉｓタグをコードするｃＤＮＡを増幅した。
（ｖｉ）Ｉｇκ分泌シグナル増幅用プライマー
　　5’-CGGTAGGCGTGTACGGTGGG-3’（forward、配列番号１１）
　　5’-atgatgatgatgatgatggtcaccagtggaacctggaaccc-3’（reverse、配列番号１２）
　上記で作製したＩｇκ分泌シグナルをコードするｃＤＮＡとヒトＥＭＩＬＩＮ－１のＣ末端フラグメントをコードするｃＤＮＡを鋳型として以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、ヒト組換えＥＭＩＬＩＮ－１　Ｃ末端フラグメント（ＥＭ１－Ｃ）（Ｎ末端側にＩｇΚ分泌シグナルと６×Ｈｉｓタグを含む）をコードするｃＤＮＡを増幅した。
（ｖｉｉ）ＥＭ１－ＣをコードするｃＤＮＡ増幅用プライマー
　　5’-CGGTAGGCGTGTACGGTGGG-3’（forward、配列番号１１と同じ）
　　5’-atatataagcttctacgcgtgttcaagctctgggtccccatagag-3’（reverse、配列番号９と同じ）
　増幅したｃＤＮＡを制限酵素ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン社）の当該部位に挿入して、ＥＭ１－Ｃの発現ベクターを作製した。
　ＥＭ１－Ｃの発現は、作製した発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社より購入）に導入して行った。６００ｍＬの２９３Ｆ細胞（１．０×１０６個／ｍＬ）にトランスフェクション試薬２９３ｆｅｃｔｉｎ（商品名、インビトロジェン社）７８０μＬ及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商品名、インビトロジェン社）４２ｍＬを用いて発現ベクター６００μｇをトランスフェクトし、４８時間培養を行ったのち、培養液を回収した。培養液は１０００×ｇで１５分間遠心し、その上清をさらに１５，０００×ｇで３０分間遠心して細胞や不溶物を除去した。培養上清をプラスチック製三角フラスコ（コーニング社）に移して、１ｍＬのｃＯｍｐｌｅｔｅ　Ｈｉｓ－ｔａｇ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｉｎ（商品名、Ｒｏｃｈｅ社）、プロテアーゼ阻害剤Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商品名、Ｒｏｃｈｅ社、終濃度２０００倍希釈）、イミダゾール（終濃度５ｍＭ）、アジ化ナトリウム（終濃度０．０５％）を添加し、４℃で一晩旋回させながらインキュベートしてバッチ法で目的蛋白質を吸着させた。懸濁液をエコノカラムに移して、ｃＯｍｐｌｅｔｅ　Ｈｉｓ－ｔａｇ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｉｎを回収し、５ｍＭイミダゾ－ル／ＴＢＳ（－）（Ｃａ、Ｍｇを含まないトリス緩衝生理的食塩水）で洗浄したのち２５０ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ（－）で溶出した。溶出されたフラクションを合わせて、遠心式限外ろ過フィルター（ＮＭＷＬ：３０Ｋ、ミリポア社）に移し、遠心濃縮した。濃縮したフラクションを透析カセット（ＭＷＣＯ：２０Ｋ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に移して、ＰＢＳ（－）（Ｃａ、Ｍｇを含まないリン酸緩衝生理的食塩水）に対し透析を行った。透析した精製タンパク質溶液を回収して、０．２２μｍディスクフィルターでフィルター滅菌し、ＢＣＡ法で定量した。精製したＥＭ１－Ｃ（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）はＳＤＳ－ＰＡＧＥ後に銀染色を行って純度を確認した。
実施例１　正常ヒト頭髪毛乳頭細胞の培養
１．細胞培養
　正常ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＴＯＹＯＢＯ：ＣＡ６０２ｔ０５ａ）をコラーゲンタイプＩコートディッシュ１００ｍｍ（ＩＷＡＫＩ：４０２０－０１０）上に播種し、毛乳頭細胞増殖培地（ＴＯＹＯＢＯ：ＴＭＴＰＧＭ－２５０）を用いて培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ＡＴ１０４）を用いて８０％～９０％コンフルエントの毛乳頭細胞を剥離し、コラーゲンタイプＩコート　ディッシュ３５ｍｍ（ＩＷＡＫＩ：４０００－０１０）もしくは１００ｎＭのＥＭ１－Ｃを１ウェル当たり２ｍＬ添加し３７℃で１時間静置してコーティングした６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ：３５３０４６）上にそれぞれ０．６７×１０４／ｃｍ２もしくは１．０×１０４／ｃｍ２となるように播種し、毛乳頭細胞増殖培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで３日間培養した。
２．毛包誘導能の確認（アルカリフォスファターゼ染色）
　培養した毛乳頭細胞をアルカリフォスファターゼ染色した。アルカリフォスファターゼ染色は、Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit(Vector laboratories：SK-5300)を用い、添付のプロトコールに従って行った。
　細胞をアルカリフォスファターゼ染色した結果を図１に示した。ＥＭ１－Ｃをコーティングしたプレート上で培養した毛乳頭細胞は、コラーゲンタイプＩをコーティングしたプレート上で培養した毛乳頭細胞よりもアルカリフォスファターゼ活性染色で強く染色された。
　以上の結果から、エミリン－１は毛乳頭細胞の毛包誘導能を上昇させていると考えられた。
３．毛乳頭細胞の遺伝子発現
　培養した毛乳頭細胞の遺伝子発現状況を定量的ＰＣＲ法により調べた。各サンプルからＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：７４１０４）を用い、ＲＮＡを抽出した。各Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度を測定し、一定量のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはＨｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：４３８７４０６）を用いた。定量的ＰＣＲ法による遺伝子発現は、得られたｃＤＮＡサンプル１μＬとＴａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：４４４８８９２）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出定量した。増幅条件は２０μＬの反応系で９５、１５秒の変性反応、６０°Ｃ、１分のアニーリング、伸長反応にて行った。各遺伝子発現量はΔＣｔ法にて算出した値を、ＲＰＬＰ０の発現量により補正し、それぞれの遺伝子発現量はコラーゲン－１上で培養した毛乳頭細胞における発現量を１．０として相対値で示した。
　定量的ＰＣＲ法により調べた毛乳頭細胞の遺伝子発現の結果を図２に示した。ＥＭ１－Ｃをコーティングしたプレート上で培養した毛乳頭細胞は、コラーゲンタイプＩをコーティングしたプレート上で培養した毛乳頭細胞よりも毛包誘導能との関連が示唆されているＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）発現の増加が確認された。また、胎仔期の毛包発生に関与しているＷｉｎｇｌｅｓｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ＭＭＴＶ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）やＢｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４（ＢＭＰ４）、毛包原基発生時におけるＥ－ｃａｄｈｅｌｉｎの発現を抑制するＬｙｍｐｈｏｉｄ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　１（ＬＥＦ１）の発現増加も確認された。毛乳頭細胞マーカーであるＬｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４（ＬＲＰ４）の発現の増加が確認され、脱毛症患者で発現が高いＤｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ－１）は発現の低下が確認された。さらに、ＥＭ１－Ｃ上で毛乳頭細胞を培養すると、エミリン－１遺伝子の発現増加が確認された。
　以上の結果から、エミリン－１は毛乳頭細胞の毛包誘導能を上昇させる可能性があると考えられた。
実施例２　多能性幹細胞由来毛乳頭細胞のエミリン－１上での培養
＜多能性幹細胞由来毛乳頭細胞の調製＞
１．皮膚由来多能性前駆細胞（ＳＫＰｓ）の作製
（１）ｉＰＳ細胞の培養
　多能性幹細胞として、ヒト由来のｉＰＳ細胞（クローン名：１２３１Ａ３）を用いた。細胞は入手機関が推奨する培養方法に従って維持培養した。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞用培地としてＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（ＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ2のインキュベーターで、Sci. Rep, 4, 2014, 3594; DOI:10.1038/srep03594に記載の方法に従って、細胞を培養した。その時に足場用の分子として、ヒトパールカンのドメインＩ（Ｇｌｙ25－Ｐｒｏ196）（以下、Ｐｌｎ－Ｄ１ともいう）フラグメントがヒトラミニンα１鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部に融合したラミニン１１１Ｅ８フラグメント（以下、パールカン修飾ＬＭ１１１Ｅ８、Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８ともいう）〔ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／０２９８５５、特願２０２０－１３２５４７及び特願２０１９－１４４８９９に記載の方法に従って調製〕をＤＰＢＳに溶解し、事前に０．５μｇ／コーティング面積ｃｍ2の濃度でコーティングしたディッシュを用いて培養を行った。
（２）ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹（ＮＣＳ）細胞の調製
　Nature protocols, 2010, 5:688-701、又はCell reports, 2013, 3:1140-1152に記載の方法に基づいて、（１）で培養したｉＰＳ細胞をＮＣＳ細胞へと分化させた。該ｉＰＳ細胞を、ｎｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：６０５７－ＮＧ－１００／ＣＦ、５００ｎｇ／ｍＬ）及び／又はＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ社製、カタログ番号：１６１４、１０μＭ）を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（添加剤Ｃ（－））培地で５日間～２週間培養することにより、ＮＣＳ細胞への分化を誘導した。なお、ｉＰＳ細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導時には継代しないことから、ｉＰＳ細胞培養時にコーティングしたＰ－ＬＭ１１１Ｅ８がそのまま足場用分子として存在している。
（３）ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導
　Ｂ－２７（商標）サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１７５０４－０４４、２質量％）、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：３３６－ＥＧ－２００、２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社製、カタログ番号：０６４－０４５４１、４０ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２、５０Ｕ、５０μｇ／ｍＬ）、及びＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｙｍａｎ社製、カタログ番号：１３１２２、３μＭ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１０５６５－０１８）により、（２）で調製したＮＣＳ細胞を３～５日間培養して、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化を誘導した。なお、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導時には継代しないことから、ｉＰＳ細胞培養時にコーティングしたＰ－ＬＭ１１１Ｅ８が足場用分子としてそのまま存在している。次いで、ＳＫＰｓへ分化した細胞を培養細胞分離／分散溶液（商品名：Ａｃｃｕｔａｓｅ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号：５６１５２７）を用いて、Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８足場なしで継代培養し、次いでＢ－２７（商標）サプリメント（２質量％）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２、５０Ｕ、５０μｇ／ｍＬ）を含むＤ－ＭＥＭ／Ｆ１２培地でさらに培養した。得られたＳＫＰｓを毛乳頭細胞として以下の実験に用いた。
＜多能性幹細胞由来毛乳頭細胞のエミリン－１上での培養＞
１．細胞培養
　上記のように多能性幹細胞由来ＳＫＰｓを毛乳頭細胞として、コート無しディッシュ（ＩＷＡＫＩ：３０００－０３５）もしくは０．５μｇ／ｃｍ２のＥＭ１－Ｃを３７°Ｃで１時間静置してコーティングした同ディッシュ上にそれぞれ播種し、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１７５０４－０４４、２質量％）、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：３３６－ＥＧ－２００、２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社製、カタログ番号：０６４－０４５４１、４０ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２、５０Ｕ、５０μｇ／ｍＬ）を含むＤ－ＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１０５６５－０１８）を用いて３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで３日間培養した。
　このように培養して得られた毛乳頭細胞の様子を示す顕微鏡写真を図３に示す。多能性幹細胞由来の毛乳頭細胞についても、エミリン－１上で培養することにより、細胞の生育が良好であると考えられた。
２．多能性幹細胞由来毛乳頭細胞の遺伝子発現
　培養した多能性幹細胞由来毛乳頭細胞の遺伝子発現状況を定量的ＰＣＲ法により調べた。各サンプルからＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔを用い、ＲＮＡを抽出した。各Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度を測定し、一定量のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはＨｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔを用いた。定量的ＰＣＲ法による遺伝子発現は、得られたｃＤＮＡサンプル１μＬとＴａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅを用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍで検出定量した。増幅条件は２０μＬの反応系で９５°Ｃ、１５秒の変性反応、６０°Ｃ、１分のアニーリング、伸長反応にて行った。各遺伝子発現量はΔＣｔ法にて算出した値を、ＲＰＬＰ０の発現量により補正し、それぞれの遺伝子発現量はコラーゲンタイプＩ上で培養した毛乳頭細胞における発現量を１．０として相対値で示した。
　定量的ＰＣＲ法により調べた多能性幹細胞由来毛乳頭細胞の遺伝子発現の結果を図４に示した。Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８フラグメントを用いて作製した多能性幹細胞由来毛乳頭細胞をＥＭ１－Ｃ上で培養すると、毛包誘導能との関連が示唆されているＡＬＰ発現の増加が確認された。また、胎仔期の毛包発生に関与しているＢＭＰ４、毛包原基発生時におけるＥ－ｃａｄｈｅｌｉｎの発現を抑制するＬＥＦ１の発現増加も確認された。さらに、毛乳頭細胞マーカーであるＬＲＰ４の発現の増加も確認された。
　以上の結果から、エミリン－１は多能性幹細胞由来毛乳頭細胞の毛包誘導能を上昇させる可能性があると考えられた。

Claims (16)

  1. 　毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する、毛乳頭細胞の培養方法。
  2. 　培養がエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で行われる、或いはエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を培地に添加することにより行われる、請求項１記載の方法。
  3. 　エミリンがエミリン－１である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　エミリンのフラグメントがｇＣ１ｑドメインを含むものである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　エミリンのフラグメントがエミリン－１のＣ末端フラグメントである、請求項４記載の方法。
  6. 　毛乳頭細胞をエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養する工程を含む、毛乳頭細胞の毛包誘導能の維持又は促進方法。
  7. 　エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進剤。
  8. 　毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進剤を製造するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
  9. 　毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
  10. 　エミリンがエミリン－１である、請求項８又は９記載の使用。
  11. 　エミリンのフラグメントがｇＣ１ｑドメインを含むものである、請求項８～１０のいずれか１項記載の使用。
  12. 　エミリンのフラグメントがエミリン－１のＣ末端フラグメントである、請求項１１記載の使用。
  13. 　毛乳頭細胞の毛包誘導能維持又は促進に使用するための、エミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種。
  14. 　エミリンがエミリン－１である、請求項１３記載のエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種。
  15. 　エミリンのフラグメントがｇＣ１ｑドメインを含むものである、請求項１３又は１４記載のエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種。
  16. 　エミリンのフラグメントがエミリン－１のＣ末端フラグメントである、請求項１５記載のエミリン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種。
     
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