KR102254911B1

KR102254911B1 - 천공을 통한 모유두세포 이식방법

Info

Publication number: KR102254911B1
Application number: KR1020200100977A
Authority: KR
Inventors: 강다윗; 윤정인; 노정원
Original assignee: 한모바이오 주식회사; 한모바이오메디테크 주식회사; 강다윗
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2021-05-24
Also published as: WO2022035023A1

Abstract

본 발명은 모유두세포의 이식방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 대량증식된 모유두세포를 FUE(Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용한 천공을 통하여 피이식자의 두피에 이식하는 방법에 관한 발명으로, 본 발명에 의하여 대량으로 이식된 모유두세포는 육모에 중요한 역할을 할 수 있는 점에서, 모유두세포를 이식하는 최적의 방법에 관한 본 발명은 의료분야, 미용분야 등 다양한 산업분야에서 활용이 가능하다.

Description

천공을 통한 모유두세포 이식방법{Method for transplanting dermal papilla cells through perforation}

본 발명은 천공을 통한 모유두세포의 이식방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 대량증식된 모유두세포를 FUE(Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용한 천공을 통하여 피이식자의 두피에 이식하는 방법에 관한 발명이다.

탈모증(alopecia)은 질병, 영양부족, 노화, 호르몬 불균형 등에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 많은 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고, 근본적인 탈모에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않으나, 일반적으로 모발은 일정한 모주기(hair cycle)를 거치게 되며, 모유두(dermal papilla)의 자극을 받은 모모세포(keratinocyte)가 활발히 분열·증식하여 모발이 자라는 성장기(anagen), 모구(hair bulb)에 혈액공급이 끊기고 모유두가 모낭으로부터 분리되는 퇴행기(catagen) 및 세포 증식이 멈춰 모발이 성장하지 않는 휴지기(telogen)를 거쳐 다시 성장기로 들어가거나 모발이 두피로부터 빠지는 탈락기(exogen)로 가게 된다. 사람의 모발은 각각 독립된 성장주기를 가져 일부는 탈락기로, 일부는 성장기로 들어가며 전체적으로 동일 수준의 모발수를 유지하게 되는데, 이러한 균형이 탈락기로 기울어 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없어지는 상태를 탈모증(alopecia)이라 한다.

이러한 탈모를 치료하기 위한 연구도 오랜기간 동안 진행되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 오직 두 개의 약물들 (피나스테라이드(finasteride) 및 미녹시딜(minoxidil))만이 탈모 치료를 위해 FDA(Food and Drug Administration) (U.S.A)에서 인가되었다.

인체의 모발은 약 10만∼15만 개 정도이며 모낭(hair follicle)에서 형성된다. 모낭에는 유두가 있는데, 이 부위에는 작은 혈관이 분포되어 모발의 성장에 필요한 영양분을 공급하고 유두 위의 옆으로는 모발에 윤기를 주는 기름을 공급해주는 지루샘이 있다. 모낭은 여러 다른 상피세포들(epithelial cells) 및 모유두세포들로 이루어진다. 모유두세포는 모낭의 기저부에 위치한 중간엽-유래 섬유아세포(mesenchymally-derived fibroblasts)이며 육모에 중요한 역할을 한다. 특히, 미녹시딜(minoxidil)은 모유두세포의 증식 및 항-세포사멸 효과를 가지는 것으로 보고되었다.

본 발명자는 육모에 중요한 역할을 하는 모유두세포를 대량증식하여 피이식자에게 이식하는 방법에 관하여 꾸준히 연구해 온 결과, 모유두세포 최적의 이식방법에 관한 본 발명을 완성하게 되었다.

국내공개특허공보 10-2020-0025210 국내공개특허공보 10-2019-0127553

본 발명은 대량증식된 모유두세포를 FUE(Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용한 천공을 통하여 피이식자의 두피에 이식하는 최적화된 방법을 통하여 탈모를 치료하는 방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명은 (A) 대량증식된 모유두세포를 준비하는 단계; (B) 모유두세포를 syringe에 수집하는 단계; (C) 모유두세포를 피이식자의 두피에 이식하는 단계;를 포함하는 모유두세포의 이식방법으로, (C) 모유두세포를 피이식자의 두피에 이식하는 단계는 피이식자의 두피에 FUE(Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용하여 천공을 만든 후 syringe에 충진된 모유두세포를 이식하는 것을 특징으로 하는 모유두세포의 이식방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, (A) 대량증식된 모유두세포를 준비하는 단계에서 모유두세포는 spheroid 또는 single cell일 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, spheroid는 (a1) flask에 cell을 seeding한 후 배양기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 세포를 증식시키는 단계; (a2) flask에 들어있던 배지를 제거하고, PBS로 세척하는 단계; (a3) 0.25% Trypsin/EDTA 처리 후 배양기에서 5분간 incubation한 다음, 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 원심분리 하는 단계; (a4) 하부에 가라앉은 pellet을 tapping 한 후 Expansion Media 2를 넣고 세포수를 확인하여, 하나의 drop 당 1000 내지 3000 cell이 포함되도록 세포현탄액을 Expansion Media 2로 희석하는 단계; (a5) square dish 바닥에 PBS 40mL을 분주하고, square dish 덮개에 12채널 Multichannel Pipette으로 5 내지 30ul의 drop을 형성하는 단계; (a6) drop이 형성된 Square dish 모서리를 대각선으로 잡은 후 뒤집어서 hanging drop 형태를 만들고, 배양기에서 1 내지 7일 배양 후 형성된 spheroid를 수집하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, (a5) 단계의 drop은 16 내지 25ul 인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, (C) 모유두세포를 피이식자의 두피에 이식하는 단계는 (c1) FUE (Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용하여 내경이 0.8 내지 1mm 인 천공을 만드는 단계;를 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 천공은 깊이가 5 내지 7 mm인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, (c2) 5.0 * 10⁶개의 spheroid cell을 syringe에 충진하여 천공에 주사하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 syringe는 needle gauge의 내경이 (B)단계에서 수집된 모유두세포의 직경보다 큰 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 syringe는 needle gauge가 24G인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 의하여 제공되는 방법에 의하여 대량으로 이식된 모유두세포는 육모에 중요한 역할을 할 수 있는 점에서 본 발명은 의료분야, 미용분야 등 다양한 산업분야에서 활용이 가능하다.

도 1은 모구로부터 모유두세포를 분리하는 방법에 따른 세포수득률의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 모유두세포 분리방법과 배지조성에 따른 대량증식결과의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 case 별 계대배양에 따른 세포수득률 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 case 별 계대배양에 따른 모유두세포와 관련된 growth factor 분비량의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 chopping의 단계에 따른 모구 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 chopping의 단계에 따른 세포증식의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 drop 용량별 cell 수에 따른 Spheroid 형태를 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 면적당 seeding 된 세포수에 따른 증식 속도 및 수득률을 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 단순주사에 의한 모유두세포 이식 후 두피사진을 기간별로 나타낸 것이다.
도 10은 FUE (Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용한 천공을 통하여 모유두세포를 이식한 후 일정 기간별로 촬영한 두피사진을 나타낸 것이다.
도 11은 syringe needle gauge에 따른 spheroid 형태 및 크기를 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명에 의한 일 실시예에서는, (A) 대량증식된 모유두세포를 준비하는 단계; (B) 모유두세포를 syringe에 수집하는 단계; (C) 모유두세포를 피이식자의 두피에 이식하는 단계;를 포함하는 모유두세포의 이식방법으로, (C) 모유두세포를 피이식자의 두피에 이식하는 단계는 피이식자의 두피에 FUE(Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용하여 천공을 만든 후 syringe에 충진된 모유두세포를 이식하는 것을 특징으로 하는 모유두세포의 이식방법을 제공한다.

FUE (Follcular Unit Extractor)는 비절개 모발이식시에 모낭을 채취할 때 사용하는 장비로 내경 0.8 내지 1mm 크기의 소형 펀치를 두피조직에 접촉시킨 후 선형으로 회전시켜 모낭이 포함된 두피조직을 포셉 등을 이용하여 천공된 모낭을 발췌할 수 있다. 발췌된 모낭은 두피의 탈모가 일어난 부위에 이식할 수 있으며, 메스 등을 이용하여 절개하지 않기 때문에 흉터나 통증과 같은 후유증이 없고 일생 생활로 바로 복귀 가능한 장점이 있다.

본 발명에 의한 다른 실시예에서, (A) 대량증식된 모유두세포를 준비하는 단계에서 모유두세포는 spheroid 또는 single cell일 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, spheroid는 (a1) flask에 cell을 seeding한 후 배양기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 세포를 증식시키는 단계; (a2) flask에 들어있던 배지를 제거하고, PBS로 세척하는 단계; (a3) 0.25% Trypsin/EDTA 처리 후 배양기에서 5분간 incubation한 다음, 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 원심분리 하는 단계; (a4) 하부에 가라앉은 pellet을 tapping 한 후 Expansion Media 2를 넣고 세포수를 확인하여, 하나의 drop 당 1000 내지 3000 cell이 포함되도록 세포현탄액을 Expansion Media 2로 희석하는 단계; (a5) square dish 바닥에 PBS 40mL을 분주하고, square dish 덮개에 12채널 Multichannel Pipette으로 5 내지 30ul의 drop을 형성하는 단계; (a6) drop이 형성된 Square dish 모서리를 대각선으로 잡은 후 뒤집어서 hanging drop 형태를 만들고, 배양기에서 1 내지 7일 배양 후 형성된 spheroid를 수집하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, (a5) 단계의 drop은 16 내지 25ul 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, (C) 모유두세포를 피이식자의 두피에 이식하는 단계는 (c1) FUE (Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용하여 내경이 0.8 내지 1mm 인 천공을 만드는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 천공은 깊이가 5 내지 7 mm인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, (c2) 5.0 * 10⁶개의 spheroid cell을 syringe에 충진하여 천공에 주사하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, syringe는 needle gauge의 내경이 (B)단계에서 수집된 모유두세포의 직경보다 큰 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, syringe는 needle gauge가 24G인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 두피조직으로부터 모구의 분리

멸균된 90 mm petri dish에 MEM alpha 배지를 피험자로부터 채취한 두피 조직(표피에서 진피층까지)이 잠기도록 채운 후, 90 mm petri dish 덮개에 MEM alpha 배지를 이용하여 여러 개의 drop을 형성시키고, 미세수술용 가위와 포셉(forcep)을 이용하여 진피층의 모구를 하나씩 분리하여 준비한 drop으로 옮겼다. 이 후, drop으로 이동된 모구를 실체현미경으로 관찰하며 26G syringe와 미세수술용 포셉을 이용하여 모구 말단에 부착되어 있는 fatty tissue 및 모간(hair shaft) 등을 제거하여 두피조직으로부터 모구를 분리하였다.

실시예 2. 모구로부터 모유두세포의 분리

모구로부터 모유두세포를 분리하는 최적의 방법을 선택하기위하여 하기와 같은 비교실험을 하였다.

먼저, 분리 방법 1은 35 mm cell culture dish에 1 ml 의 Dissection media를 넣고 모구 약 50개를 넣은 후 정밀미세가위로 chopping한 후 tube에 모으고 2200 rpm에서 5 분간 원심분리하는 방법이다.

다음으로, 분리 방법 2는 모구 약 50개가 들어있는 35 mm cell culture dish에 0.025% Collagenase type I 시약을 넣은 후 37 ℃, shaking incubator에서 2시간 30분 간 incubation 하고 tube에 모아 2200 rpm에서 5 분간 원심분리하는 방법이다.

상기 분리 방법 1과 2의 결과를 비교하기 위하여, 각각의 Pellet을 tapping 하고 하기 표 1의 조성을 가지는 Attachment media 2 ml로 pipetting을 충분히 한 후 35 mm cell culture dish에 seeding 하고, 37℃, 5% CO₂ 대량증식기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 culture dish가 세포로 가득 찰 때까지 증식시켰다.

구분	Attachment Media (부착 단계)
Component	MEM alpha
	-
	20% Fetal bovine serum
	Penicillin-Streptomycin
	Amphotericin B

상기 비교실험 결과, 0.025% Collagenase type I 시약을 넣은 분리방법 2와 비교하여, 모구 자체에 다른 처리를 하지 않고 chopping만 진행한 분리방법 1에서 세포의 크기가 더 작고 일정하며 세포수득률도 높게 나오는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

실시예 3. 계대배양 단계

Passage 0 에서 Passage 1 로 계대배양하는 단계는 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 35 mm cell culture dish에서 수집된 세포수에 따라 계대배양 할 culture dish를 결정한 후, 35 mm cell culture dish에 들어있던 배지를 버리고, PBS로 1회 세척하였다. 다음으로, 0.25% Trypsin/EDTA을 처리하고 37℃, 5% CO₂ 대량증식기에서 5분간 incubation 하였다. 이 후, inactivation을 위해 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 50ml centrifuge tube에 모은 후 2200 rpm에서 5 분간 원심분리 후, 상층액은 버리고 아래에 가라앉은 pellet을 충분히 tapping 한 후 표 2에 나타낸 적당량의 Expansion Media 1 또는 2를 넣고 세포수를 확인하였다.

구분	Expansion Media 1 (대량증식 단계)	Expansion Media 2 (대량증식 단계)
Component	MEM alpha	MEM alpha
	-	Basic FGF
	10% Fetal bovine serum	10% Fetal bovine serum
	Penicillin-Streptomycin	Penicillin-Streptomycin
	Amphotericin B	Amphotericin B

계수된 세포수에 따라 1,500개/cm²가 되도록 다음 단계의 culture dish에 seeding 한 후, 37℃, 5% CO₂ 대량증식기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 culture dish가 세포로 가득 찰 때까지 증식시켰다.

이 후, passage 1 내지 passage 4 로 계대배양하는 단계는 상기와 동일한 순서로 이루어지며, 계수되는 세포수에 따라 culture dish의 크기를 맞추어 passage 4까지 계대배양하였고, 중간 passage 단계에서 동결하였다가 해동할 경우에는 3,000개/cm²가 되도록 culture dish에 seeding하였다.

실시예 4. 모유두세포 분리 및 대량증식 조건에 따른 결과 도출

실시예 4-1. 세포 분리방법과 배지조성에 따른 차이

모유두세포 분리방법과 배지 조성에 따른 대량증식결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 case 1은 chopping에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 1 배지에서 대량증식한 결과이고, case 2는 chopping에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 2 배지에서 대량증식한 결과이며, case 3은 0.025% Collagenase type I 시약 처리에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 1 배지에서 대량증식한 결과이고, case 4 는 0.025% Collagenase type I 시약 처리에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 1 배지에서 대량증식한 결과를 나타낸 것이다. 각 case 별로 세포의 morphology를 확인해 본 결과 chopping에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 2를 사용한 경우인 case 2에서 세포의 형태가 잘 유지되며 모유두세포의 대량증식 증식률이 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, case 별로 계대 대량증식에 따른 세포 크기변화를 하기 표 3에 나타내었다.

(um)	P1	P2	P3	P4	P5	P6
case1	18.99	19	19.28	17.78	17.58	17.66
case2	13.2	13	13.7	13.88	15.14	15.2
case3	17.1	17	17.6	18.75	18.94	19.22
case4	15.3	15	15.5	16.6	17.03	18.06

상기 표 3에 따르면, case 2의 세포 크기가 가장 작고 고르게 유지되었고, case 1을 제외한 나머지 군에서는 계대배양수가 늘어남에 따라 세포크기도 커지는 경향을 나타내었다. 나아가, case 2의 경우에는 P1 내지 P4까지는 큰 변화 없이 세포크기가 유지되는 것으로 보아 세포의 수득률 또한 높을 것으로 예상을 해 볼 수 있었고, 이를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 따르면, 세포의 수득률 역시 전체 계대에 걸쳐 case 2가 가장 높은 것을 확인 할 수 있었고, 특히 P3에서 가장 많은 양의 세포가 수집된 것으로 확인되었다.

다음으로, case 별로 계대배양에 따른 모유두세포와 관련된 Growth factor 분비량을 도 4에 나타내었다. 도 4에 따르면, 인체 모유두세포를 자극하여 상피 소낭 세포의 증식을 촉진시키는 HGF, 혈관확장에 관여하여 모발 성장을 유도하는 VEGF, 모낭조직의 성장을 촉진하는 FGF (KGF) 등 모유두세포의 성장인자로 알려져 있는 다양한 Growth factor의 분비량을 측정해 본 결과 전반적으로 case 2의 P3에서 가장 많은 양의 growth factor가 분비되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4-2. chopping 범위에 따른 차이

상기 실험결과를 토대로, 최적의 chopping 범위를 결정하기 위한 실험을 진행하였다. 먼저, 두피 조직으로부터 펀칭되어져 나온 모구를 PBS 또는 basal media가 채워진 petri dish에 수집하고, 35 mm cell culture dish에 1 ml의 Dissection media와 모구를 넣고 정밀미세가위로 모구를 chopping한 후, chopping의 정도에 따른 모구 크기 변화를 현미경으로 관찰하였다. chopping 단계에 따른 모구의 크기를 측정한 결과 chopping 전은 750μm 내지 900μm, chopping 1단계에서는 490μm 내지 630μm, 2단계에서는 300μm 내지 410μm, 3단계에서는 180μm 내지 260μm, 4단계에서는 15μm 내지 120μm 크기의 모구를 확인할 수 있었다(도 5).

이 후, chopping된 모구를 tube에 모으고 2200 rpm에서 5 분간 원심분리 한 후, 상층액은 버리고 pellet을 수집하여 35 mm cell culture dish에 1ml 의 Attachment media를 넣고 37℃, 5% CO₂ 대량증식기에서 세포의 증식을 확인하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 따르면, chopping 범위에 따라 총 4단계로 나눠 세포의 증식 및 부착 형태를 확인해 본 결과 chopping의 정도에 따라 세포의 부착 형태가 상이한 것을 확인할 수 있었다. 도 6의 좌측은 chopping 후 부착한지 3일째 된 사진이고, 우측은 chopping 후 부착한지 5일째 된 세포 사진이다. 배양 3일째 관찰한 결과 chopping의 단계가 낮은 경우 cell culture dish의 바닥면에 세포들이 고르게 부착되지 못하고 뭉쳐 자라는 현상이 일어났다. 반면 chopping의 단계가 높아질수록 cell culture dish 바닥면에 세포들이 일정한 간격으로 고르게 부착되어 자랐으며 양끝이 뾰족한 방추 형태로 증식되었다. 나아가, 배양 5일째에 관찰한 결과 chopping의 단계가 낮은 상태의 경우 뭉쳐 자란 곳과 뭉치지 않은 곳에서의 세포 증식이 현저하게 차이가 났으며 세포가 군데군데 퍼져 자라는 경향을 보였으나, chopping의 단계가 높아질수록 cell culture dish 바닥면 전체에 고르게 세포가 가득차 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, chopping의 단계에 따른 세포수득률에서도 차이를 나타내었는 바, 이를 하기 표 4에 나타내었다.

T25 cell culture dish 기준	세포 수득률
Chopping 1 단계	1.0E+05
Chopping 2 단계	1.3E+05
Chopping 3 단계	2.5E+05
Chopping 4 단계	2.8E+05

상기 표 4에 따르면, chopping의 정도에 따라 세포의 부착 형태뿐만 아니라 수득률에서도 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. chopping 정도에 따라 세포가 cell culture dish에 부착되는 형태가 달라지며 세포 사이의 간격 및 증식되는 모양에 따라 수득률에 크게 영향을 미치는 것으로 보인다. 대략적으로 1~2단계 chopping 정도에서는 콜로니(colony)를 형성하여 증식되고, 그로인해 세포가 퍼져 자라는 경향이 있어 1.0E+05 ~ 1.3E+05 수준의 세포수득율을 보이며, 3단계 chopping 정도에서는 세포의 뭉침은 1~2단계 chopping 보다는 덜 하지만 약간의 뭉침으로 인해 초기 부착시 세포의 퍼짐이 관찰되고, 4단계 chopping 에서는 세포들이 초기부터 single 상태로 잘 부착하여 세포의 퍼짐이나 뭉침들은 전혀 관찰되지 않았으며 배양일수가 늘어남에 따라 cell culture dish 바닥 전체에 고르게 부착하여 증식되는 것을 관찰 할 수 있었고, 이로 인해 chopping 1단계와 비교 했을 때 수득율이 약 2배 정도 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 15μm 이하로 chopping을 실시한 경우에는 모구 내부의 모유두세포가 손상되어 세포수득률이 현저히 낮아지는 문제가 있었고, 120μm 이상으로 chopping을 실시한 경우에는 상기 실험에서 확인한 바와 같이 세포의 뭉침현상이 발생하여 세포가 culture dish 바닥 전체에 고르게 분포되지 아니하는 결과 세포증식이 현저히 저하되는 문제가 있었는데, 이는 고르게 분포되는 세포들에 비하여 뭉쳐진 세포들은 영양분 흡수율이 저하되고, 세포밀도 상승에 기인한 외부스트레스 증가의 결과로 보인다.

실시예 5. 모유두세포 이식 준비단계

세포 형태에 따른 세포이식 효과를 평가하기 위하여 spheroid 및 single cell을 다음과 같이 각각 준비하였다.

실시예 5-1. spheroid (Aggregation cell) 준비 단계

먼저, T225 flask 면적당(cm²) 대략 1300 내지 1500 개의 cell을 seeding 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 T225 flask가 세포로 가득 찰 때까지 증식시킨 다음, T225 flask에 들어있던 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척하였다. 이 후, 0.25% Trypsin/EDTA을 처리하고 37℃, 5% CO₂배양기에서 5분간 incubation한 다음, Inactivation을 위해 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 50ml centrifuge tube에 모은 후 2200 rpm에서 5분간 원심분리를 하였다. 상층액은 버리고 하부에 가라앉은 pellet을 충분히 tapping 한 후 적당량의 Expansion Media 2를 넣고 세포수를 확인한 후, 하나의 drop 당 1000 내지 3000cell이 포함되도록 필요한 만큼의 세포현탄액을 Expansion Media 2로 희석하였다. 다음, 온도와 습도를 유지하기 위해 Square dish 바닥에 PBS 40mL을 분주하고, Square dish 덮개에 12채널 Multichannel Pipette으로 5 내지 30ul의 drop을 형성하였다. drop이 형성된 Square dish 모서리를 대각선으로 잡은 후 뒤집어서 최적의 hanging drop 형태를 만들고, 37℃, 5% CO₂배양기에서 1~7일 배양 후 형성된 spheroid를 수집하였다.

실시예 5-2. spheroid 형성을 위한 drop 용량 결정

바람직한 spheroid 형태를 위한 drop 용량 결정 실험결과를 하기 표 5 및 도 7에 나타내었다.

	Case1 (drop 용량 5 내지 15ul)	Case2 (drop 용량 16내지 25ul)	Case3 (drop 용량 26내지 30ul)
1차	172.76	206.91	260.05
2차	200.62	201.69	242.29
3차	201.42	216.88	254.4
spheroid 평균 지름 (um)	191.6±16.32	208.5±7.71	252.25±9.07

도 7에 나타낸 바와 같이, drop 용량을 5 내지 15ul로 제한한 case 1의 경우 cell이 aggregation 되지 않고 넓게 분산되거나 여러 개의 spheroid가 형성되는 양상을 나타내었고, 일정하지 않은 크기의 spheroid 형성으로 표준편차가 매우 큰 것을 확인할 수 있었다. 반면, drop 용량을 16 내지 25ul로 제한한 case 2와 26 내지 30ul로 제한한 case 3는 3일 이내에 일정한 크기의 spheroid가 형성되었다. 다만, case 3의 drop 용량이 컨트롤하기 어려운 점에서, hanging drop 형태로 제조시 drop 형태가 일정하지 않고 흘러내리거나 찌그러진 모양으로 형성되는 문제를 확인할 수 있었다. 그 결과 case 3의 spheroid 크기는 case 2와 동일한 양의 cell임에도 불구하고 약 250um 정도로 case 2 보다 큰 형태로 형성된 것을 확인할 수 있었다. 이로써 case 2에서 형성된 Spheroid가 가장 잘 aggregation 되었으며 hanging drop 제조시 컨트롤도 용이하여 적절한 용량과 cell 수인 것을 확인하였다.

실시예 5-3. seeding 세포밀도 결정

효율적인 seeding 세포밀도를 결정하기 위하여 각 case 별로 면적당 세포 수를 다르게 seeding하여 세포증식 속도 및 세포수득률 비교실험을 진행하였고, 그 결과를 하기 표 6 및 도 8에 나타내었다.

	Case 1 (1000 cell/cm²)	Case 2 (2000 cell/cm²)	Case 3 (3000 cell/cm²)	Case 4 (4000 cell/cm²)	Case 5 (5000 cell/cm²)
Cell 수	2.75E+05	7.00E+05	8.25E+05	9.75E+05	1.38E+06

실시예 5-4. single cell 준비 단계

상기 spheroid 준비 단계에서 수집한 cell 중 일부를 T225 flask 면적당(cm²) 1000 내지 5000개가 되도록 seeding하고, spheroid가 형성되는 1 내지 7일 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 증식시킨 후, T225 flask에 들어있던 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척하였다. 이 후, 0.25% Trypsin/EDTA을 처리하고 37℃, 5% CO₂배양기에서 5분간 incubation한 다음, Inactivation을 위해 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 50ml centrifuge tube에 모은 후 2200 rpm에서 5분간 원심분리를 하였다. 상층액은 버리고 하부에 가라앉은 pellet을 충분히 tapping 한 후 적당량의 NS 배지를 넣고 세포수를 확인하고, 이식되는 모수에 따라 세포현탄액을 희석하였다.

실시예 6. 모유두세포 이식

실시예 6-1. 모유두세포 수집단계

먼저, 37℃, 5% CO₂배양기에서 3일 내지 7일 이내 형성된 spheroid의 크기와 형태를 확인하고, hanging drop이 형성되어있는 square dish를 뒤집은 후 scraper를 사용하여 아래 방향으로 긁어 한 곳으로 수집하여 petri-dish로 이동시켰다. 이 후, PBS를 분주하고 원형을 그리며 cell을 세척한 후 가운데로 모인 spheroid를 10mL pipette으로 수집하는 세척과정을 3회 반복한 다음 NS배지에 부유시킨 후 syringe에 수집하였다.

실시예 6-2. 모유두세포 이식단계

먼저, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 단순 주사방법에 의한 이식의 경우 피이식자의 두피에서 유분을 제거한 후, ① 이마의 M자 탈모가 형성된 두 부분을 선택하여 한 사이트 당 대략 4 * 4 cm = 16 cm² 의 면적에 5.0 * 10⁶개의 세포를 single cell 상태로 syringe에 충진하고 ② 5.0 * 10⁶개의 세포를 spheroid cell 로 만들어 aggregation된 상태로 syringe에 충진하여 두피에 바로 주사하였고, 주사 후 15일, 30일, 45일, 60일 경과 후 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 세포를 단순히 주사한 방법에서는 single cell과 spheroid cell 두 가지 세포 모두에서 뚜렷한 차이가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 펀칭(punching) 후 주사방법에 의한 이식의 경우 피이식자의 두피에서 유분을 제거한 후, 정수리에 탈모가 형성된 부분을 선택하여 모낭이 없는 두피에 FUE (Follcular Unit Extractor) 펀치를 이용하여 내경은 약 0.8 내지 1mm , 깊이는 대략 5 ~ 7 mm 의 천공을 각 사이트 당 60개씩 만든 다음, 한 사이트 당 대략 ① 3 * 3 * 3.14 / 2 cm = 14 cm²의 면적에 5.0 * 10⁶개의 세포를 single cell 상태로 syringe에 충진하고 ② 5.0 * 10⁶개의 세포를 spheroid cell 로 만들어 aggregation된 상태로 syringe에 충진하여 천공을 낸 부분에 바로 주사하였고(표 8), 주사 후 10일, 30일, 40일, 50일, 60일 경과 후 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 펀칭 후 세포를 주사한 방법에서는 single cell과 spheroid cell 두 가지 세포에서 모발이 올라오는 것을 확인할 수 있었다. 특히 모낭이 없는 부분에 천공을 내고 세포를 주사했기 때문에 기존에 모발이 나고 빠진 부위가 아니며 새롭게 올라온 모발로 확인된다. 또한 초기 이미 있던 모발의 경우 가늘고 힘이 없는 상태이지만 세포를 주사하고 60일 정도 후에 관찰했을 때 모발에 힘이 있고 굵어진 것으로 보아 세포가 분비하는 영양분에 의해 세포를 주사한 위치뿐만 아니라 주변의 모발에도 영향을 미치는 것으로 확인되었다.

실시예 6-3. syringe needle gauge 결정

5mL syringe로 수집한 세포를 needle gauge가 24G 내지 31G인 needle을 사용하여 상기 실시예 6-2의 이식 방법으로 수득율을 확인하기 위하여, 실시예 5-2 결과에 따라 208.5±7.71 크기의 spheroid를 수집하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 31G로 수집한 spheroid의 경우 퍼져있거나 찌그러진 형태로 표준편차가 매우 큰 것을 확인할 수 있었다. 또한 syringe needle을 spheroid가 통과하면서 여러개로 나눠지거나 needle 내부에 정체되는 현상이 발행하여 수득율이 현저하게 낮게 나타났다. 26G 또한 spheroid의 크기가 일정하지 않고 기존 spheroid 에서 떨어져 나온 spheroid를 여러 개 확인할 수 있었으며, 가장자리 형태 또한 불규칙적이고 찢어지거나 aggregation이 풀린 모습이 확인되었다. 반면 24G를 사용하여 수집한 spheroid는 수집하기 전의 모습을 유지하였으며 크기가 일정하고 수득율 또한 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 spheroid cell 직경보다 내경이 작은 gauge에서는 spheroid cell 이 syringe 외부로 나오는 과정에서 부스러지는 현상이 발생되며, 반면 24G에서는 cell의 변형 없이 syringe 외부로 나오는 것을 확인하였고, 24G보다 더 작은 수치의 Gauge를 사용할 경우 needle이 굵어져 피이식자의 심한 고통을 유발하게 되는 문제가 있었다. 이로써 24G를 사용하여 수집하는 것이 spheroid형태를 가장 우수하게 유지하고 수득율 또한 높으며 환자의 두피에 최소한의 흉터로 세포를 이식할 수 있는 최적의 gauge임을 확인하였다.

Claims

(A) 15 내지 120μm로 초핑(chopping)된 모구로부터 모유두세포를 분리하여 대량증식하는 단계;
(B) 대량증식된 모유두세포를 준비하는 단계;
(C) 모유두세포를 시린지(syringe)에 수집하는 단계;를 포함하는 이식용 모유두세포의 처리방법으로,
상기 (A) 단계는 모유두세포를 MEM alpha, Basic FGF, 10% Fetal bvine serum, Penicillin-Streptomycin 및 Amphotericin B를 포함하는 배지에서 계대배양을 3회 반복하여 대량증식하고,
상기 (B) 대량증식된 모유두세포를 준비하는 단계에서 모유두세포는 스페로이드 셀(spheroid cell)이고,
상기 스페로이드 셀(spheroid cell)은
(a1) 플라스크(flask)에 세포(cell)를 접종(seeding)한 후 배양기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 세포를 증식시키는 단계;
(a2) 플라스크(flask)에 들어있던 배지를 제거하고, PBS로 세척하는 단계;
(a3) Trypsin/EDTA 처리 후 배양기에서 배양(incubation)한 다음, FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 원심분리 하는 단계;
(a4) 하부에 가라앉은 펠릿(pellet)을 탭핑(tapping) 한 후 Expansion Media 2를 넣고, 하나의 드롭(drop) 당 1000 내지 3000 cell이 포함되도록 세포현탄액을 Expansion Media 2로 희석하는 단계;
(a5) square dish 바닥에 PBS를 분주하고, square dish 덮개에 16 내지 25ul의 드롭(drop)을 형성하는 단계;
(a6) 드롭(drop)이 형성된 Square dish 모서리를 대각선으로 잡은 후 뒤집어서 hanging drop 형태를 만들고, 배양기에서 1 내지 7일 배양 후 형성된 스페로이드 셀(spheroid cell)을 수집하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식용 모유두세포의 처리방법.
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제1항에 있어서, 상기 시린지(syringe)는 needle gauge의 내경이 (C)단계에서 수집된 모유두세포의 직경보다 큰 것을 특징으로 하는 이식용 모유두세포의 처리방법.
제8항에 있어서, 상기 시린지(syringe)는 needle gauge가 24G인 것을 특징으로 하는 이식용 모유두세포의 처리방법.