JPH11180878A - 発毛誘導剤および発毛方法 - Google Patents
発毛誘導剤および発毛方法Info
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- JPH11180878A JPH11180878A JP9364545A JP36454597A JPH11180878A JP H11180878 A JPH11180878 A JP H11180878A JP 9364545 A JP9364545 A JP 9364545A JP 36454597 A JP36454597 A JP 36454597A JP H11180878 A JPH11180878 A JP H11180878A
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/18—Materials or treatment for tissue regeneration for hair reconstruction
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ドナーおよび採取部位の肉体的苦痛を最小限
にとどめ、移植に必要な毛乳頭細胞を確保し、皮膚に適
切な発毛を誘導する。 【解決手段】 毛乳頭細胞スフェロイドを含有する発毛
誘導剤。皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド。毛乳頭細
胞培養用培地、培養容器およびスフェロイド培養器を含
有する皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド作成用キット
および毛乳頭細胞を培養しスフェロイドを形成させ、そ
のスフェロイドを皮膚に移植することを特徴とする、該
部位に発毛を惹起させる方法。 【効果】 採取部位の肉体的苦痛を最小限にとどめ、多
面積の皮膚における発毛処置が可能になる。また、自家
移植が容易になり、免疫学的拒絶反応の危険性を回避
し、ウイルスをはじめとする病原性微生物の感染の危険
性を回避できる。
にとどめ、移植に必要な毛乳頭細胞を確保し、皮膚に適
切な発毛を誘導する。 【解決手段】 毛乳頭細胞スフェロイドを含有する発毛
誘導剤。皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド。毛乳頭細
胞培養用培地、培養容器およびスフェロイド培養器を含
有する皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド作成用キット
および毛乳頭細胞を培養しスフェロイドを形成させ、そ
のスフェロイドを皮膚に移植することを特徴とする、該
部位に発毛を惹起させる方法。 【効果】 採取部位の肉体的苦痛を最小限にとどめ、多
面積の皮膚における発毛処置が可能になる。また、自家
移植が容易になり、免疫学的拒絶反応の危険性を回避
し、ウイルスをはじめとする病原性微生物の感染の危険
性を回避できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、皮膚への発毛誘導
剤の移植に関する。詳しくは、頭部皮膚および薄毛また
は脱毛部位に発毛を促す毛乳頭細胞スフェロイドを移植
することによる該部位の発毛誘導に関する。
剤の移植に関する。詳しくは、頭部皮膚および薄毛また
は脱毛部位に発毛を促す毛乳頭細胞スフェロイドを移植
することによる該部位の発毛誘導に関する。
【０００２】
【従来の技術】毛髪移植は、広く実施されている処理で
ある。典型的には、多くの個別移植片を埋植するもので
ある。通常、外科的手術で毛根、毛包等を切除し毛髪移
植片を準備する。この移植片は、頭皮にあらかじめ処理
された直径０．２〜１．４ｍｍの穿孔部位に移植される
（特開平８−２２４２５３）。
ある。典型的には、多くの個別移植片を埋植するもので
ある。通常、外科的手術で毛根、毛包等を切除し毛髪移
植片を準備する。この移植片は、頭皮にあらかじめ処理
された直径０．２〜１．４ｍｍの穿孔部位に移植される
（特開平８−２２４２５３）。
【０００３】このような実際の器官移植法に平行して、
治療的移植目的ではない、毛機能研究モデル開発目的に
おいて、機能を持つ組織あるいは細胞に特化して、移植
片についての研究がなされている。近年、当該技術分野
で、毛髪の成長は周期的であり、成長期、退行期、休止
期によって毛周期が形成されていることが言われてい
る。発毛に重要と考えられているのは、新たな毛包が形
成されるステージである休止期から成長期にあるとされ
ており、このステージにおいて重要な働きをする毛組織
は、毛乳頭であると考えられている。毛乳頭細胞は、毛
母細胞などの周りの上皮系の細胞へ信号を送り、毛髪お
よび毛包全体を形成させる重要な役割を担っていると考
えられている。これらに関連する他の研究成果として
は、例えばJahodaら(Nature 311, 560-562(1984)) は、
下半分が除去された毛包底にラット髭培養毛乳頭細胞を
移植すると、この移植毛乳頭細胞の周囲に真皮性マトリ
ックスを有する毛球が形成されることを明らかにしてい
る。Reynoldsら(Development 115, 587-593(1992))は、
ラットの毛乳頭細胞が、フットパッド表皮に新たに毛包
を誘導することを示している。また、ヒトにおいては、
ヒト毛乳頭細胞のスフェロイドをラットのフットパッド
に挿入し、そのフットパッド片をヌードマウスの腎臓と
その皮膜との間に移植させることにより、ヒト毛乳頭細
胞からの毛包誘導を生じることが示されている（特開平
９−１４０３７７）。
治療的移植目的ではない、毛機能研究モデル開発目的に
おいて、機能を持つ組織あるいは細胞に特化して、移植
片についての研究がなされている。近年、当該技術分野
で、毛髪の成長は周期的であり、成長期、退行期、休止
期によって毛周期が形成されていることが言われてい
る。発毛に重要と考えられているのは、新たな毛包が形
成されるステージである休止期から成長期にあるとされ
ており、このステージにおいて重要な働きをする毛組織
は、毛乳頭であると考えられている。毛乳頭細胞は、毛
母細胞などの周りの上皮系の細胞へ信号を送り、毛髪お
よび毛包全体を形成させる重要な役割を担っていると考
えられている。これらに関連する他の研究成果として
は、例えばJahodaら(Nature 311, 560-562(1984)) は、
下半分が除去された毛包底にラット髭培養毛乳頭細胞を
移植すると、この移植毛乳頭細胞の周囲に真皮性マトリ
ックスを有する毛球が形成されることを明らかにしてい
る。Reynoldsら(Development 115, 587-593(1992))は、
ラットの毛乳頭細胞が、フットパッド表皮に新たに毛包
を誘導することを示している。また、ヒトにおいては、
ヒト毛乳頭細胞のスフェロイドをラットのフットパッド
に挿入し、そのフットパッド片をヌードマウスの腎臓と
その皮膜との間に移植させることにより、ヒト毛乳頭細
胞からの毛包誘導を生じることが示されている（特開平
９−１４０３７７）。
【０００４】外科的手術で頭部皮膚に移植を行い、当該
部位を多毛化させるためには、ドナー部位より多量の移
植片を採取する必要があり、大面積にわたり移植片の外
科的手術が必要である。この多量採取により被移植片採
取部位の異常が起こりやすい。
部位を多毛化させるためには、ドナー部位より多量の移
植片を採取する必要があり、大面積にわたり移植片の外
科的手術が必要である。この多量採取により被移植片採
取部位の異常が起こりやすい。
【０００５】さらに、ヒトへ移植片を移植する場合、免
疫学的拒絶反応の危険性、ウイルスをはじめとする病原
性微生物の感染の危険性の問題がある。これらの問題を
回避するため、または最小限にとどめるために自家移植
が適することがよく知られている。
疫学的拒絶反応の危険性、ウイルスをはじめとする病原
性微生物の感染の危険性の問題がある。これらの問題を
回避するため、または最小限にとどめるために自家移植
が適することがよく知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ドナー
および採取部位の肉体的苦痛を最小限にとどめ、移植に
必要な毛乳頭細胞を確保し、皮膚に適切な発毛を誘導す
ること、および、免疫学的拒絶反応の危険性、ウイルス
をはじめとする病原性微生物の感染の危険性の問題を回
避、または最小限にとどめて頭部皮膚に適切な発毛を誘
導することを検討した。
および採取部位の肉体的苦痛を最小限にとどめ、移植に
必要な毛乳頭細胞を確保し、皮膚に適切な発毛を誘導す
ること、および、免疫学的拒絶反応の危険性、ウイルス
をはじめとする病原性微生物の感染の危険性の問題を回
避、または最小限にとどめて頭部皮膚に適切な発毛を誘
導することを検討した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、毛乳頭細
胞を拡大培養し、該細胞をスフェロイド化することによ
り生体の毛乳頭構造と近似させ、移植することにより、
ドナーおよび採取部位に負担を強いることなく多面積の
移植を可能にし、発毛を誘導できることを見出し本発明
を完成した。
胞を拡大培養し、該細胞をスフェロイド化することによ
り生体の毛乳頭構造と近似させ、移植することにより、
ドナーおよび採取部位に負担を強いることなく多面積の
移植を可能にし、発毛を誘導できることを見出し本発明
を完成した。
【０００８】本発明は、毛乳頭細胞スフェロイドを含有
する発毛誘導剤に関する。また、皮膚移植用毛乳頭細胞
スフェロイドに関する。さらに、毛乳頭細胞培養用培
地、培養容器およびスフェロイド培養器を含有する皮膚
移植用毛乳頭細胞スフェロイド作製用キットに関する。
さらに、毛乳頭細胞を培養しスフェロイドを形成させ、
そのスフェロイドを皮膚に移植することを特徴とする、
該部位に発毛を惹起させる方法に関する。すなわち、本
発明は、移植に必要な毛乳頭細胞を確保し、その細胞を
３次元再構築させ移植することによる発毛誘導に関す
る。
する発毛誘導剤に関する。また、皮膚移植用毛乳頭細胞
スフェロイドに関する。さらに、毛乳頭細胞培養用培
地、培養容器およびスフェロイド培養器を含有する皮膚
移植用毛乳頭細胞スフェロイド作製用キットに関する。
さらに、毛乳頭細胞を培養しスフェロイドを形成させ、
そのスフェロイドを皮膚に移植することを特徴とする、
該部位に発毛を惹起させる方法に関する。すなわち、本
発明は、移植に必要な毛乳頭細胞を確保し、その細胞を
３次元再構築させ移植することによる発毛誘導に関す
る。
【０００９】本発明で用いられる毛乳頭細胞は、動物、
好ましくはヒトの皮膚から得ることができる。特に好ま
しいのは、自家または同種細胞である。皮膚はどこの皮
膚でもよいが、特に、頭皮の側頭部又は後頭部が好まし
い。外科的手術により、数個の毛根部を切除する。毛根
部を例えば、ゲンタマイシン等の抗生物質を含むリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄した後、顕微鏡下、
物理的手段たとえばピンセットで、毛球部を単離する。
この毛球部下部から毛乳頭を露出させて毛乳頭を単離す
る。
好ましくはヒトの皮膚から得ることができる。特に好ま
しいのは、自家または同種細胞である。皮膚はどこの皮
膚でもよいが、特に、頭皮の側頭部又は後頭部が好まし
い。外科的手術により、数個の毛根部を切除する。毛根
部を例えば、ゲンタマイシン等の抗生物質を含むリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄した後、顕微鏡下、
物理的手段たとえばピンセットで、毛球部を単離する。
この毛球部下部から毛乳頭を露出させて毛乳頭を単離す
る。
【００１０】こうして得られた毛乳頭の培養は、毛乳頭
を鋭い刃物等で細かくした後、動物細胞の培養に用いら
れる栄養培地中、培養皿を用いて静置培養を行う。
を鋭い刃物等で細かくした後、動物細胞の培養に用いら
れる栄養培地中、培養皿を用いて静置培養を行う。
【００１１】毛乳頭細胞の培養に用いる培地は、通常動
物細胞培養に供するものであればよい。代表的な培地と
しては、牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地
（ＤＭＥＭ培地）、チャンの培地（Chang's medium）、
パピラ細胞培養培地（東洋紡社製）が挙げられる。
物細胞培養に供するものであればよい。代表的な培地と
しては、牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地
（ＤＭＥＭ培地）、チャンの培地（Chang's medium）、
パピラ細胞培養培地（東洋紡社製）が挙げられる。
【００１２】必要に応じて、培地には添加剤を加えるこ
とができる。細胞増殖因子、ホルモン、微量元素などを
加え培養することが出来る。これらの具体的なものとし
てトランスフェリン、インスリン、トリヨードタイロニ
ン、グルカゴン、繊維芽細胞増殖因子、ハイドロコーチ
ゾン、テストステロン、牛脳下垂体抽出液、表皮細胞抽
出液、表皮細胞培養上清、プロジェステロン、セレンな
どが挙げられる。
とができる。細胞増殖因子、ホルモン、微量元素などを
加え培養することが出来る。これらの具体的なものとし
てトランスフェリン、インスリン、トリヨードタイロニ
ン、グルカゴン、繊維芽細胞増殖因子、ハイドロコーチ
ゾン、テストステロン、牛脳下垂体抽出液、表皮細胞抽
出液、表皮細胞培養上清、プロジェステロン、セレンな
どが挙げられる。
【００１３】本発明で用いられる培養容器は、通常動物
細胞培養に供するものであればよい。好ましくは、光学
的に透明なポリスチレン製で細胞の付着や成長に必要な
表面処理がなされている細胞培養フラスコあるいは培養
皿がよい。また、コラーゲン、フィブロネクチン等の細
胞外マトリックスでコート処理されているものがよい。
特に好ましい培養容器としては、コラーゲンタイプＩが
コートされた培養容器で、市販品としては、セルタイト
Ｃ−１（住友ベークライト製）等が挙げられる。
細胞培養に供するものであればよい。好ましくは、光学
的に透明なポリスチレン製で細胞の付着や成長に必要な
表面処理がなされている細胞培養フラスコあるいは培養
皿がよい。また、コラーゲン、フィブロネクチン等の細
胞外マトリックスでコート処理されているものがよい。
特に好ましい培養容器としては、コラーゲンタイプＩが
コートされた培養容器で、市販品としては、セルタイト
Ｃ−１（住友ベークライト製）等が挙げられる。
【００１４】本発明の毛乳頭細胞スフェロイドは球状の
細胞集合体であり、通常の単層培養細胞とは異なり、生
体と類似した構造、機能を保持している。本発明の毛乳
頭細胞スフェロイドは毛乳頭細胞から得られる。毛乳頭
からアウトグロースしてきた毛乳頭細胞を継代培養し、
細胞を増殖させて得た毛乳頭細胞を培養皿から剥離さ
せ、細胞懸濁液を得る。その細胞懸濁液をスフェロイド
培養器に１０2 〜１０6 個／穴の割合、好ましくは１０
3 〜１０5 個／穴で播種し、培養を２〜１０日間、好ま
しくは３〜５日間培養することにより、球状の細胞集合
体であるスフェロイドが得られる。培養温度は、３７℃
が好ましい。２〜１０％好ましくは５〜１０％の二酸化
炭素存在下で培養する。本発明のスフェロイドの大きさ
は、直径、５０μｍ〜５００μｍ、好ましくは１００μ
ｍ〜３００μｍである。
細胞集合体であり、通常の単層培養細胞とは異なり、生
体と類似した構造、機能を保持している。本発明の毛乳
頭細胞スフェロイドは毛乳頭細胞から得られる。毛乳頭
からアウトグロースしてきた毛乳頭細胞を継代培養し、
細胞を増殖させて得た毛乳頭細胞を培養皿から剥離さ
せ、細胞懸濁液を得る。その細胞懸濁液をスフェロイド
培養器に１０2 〜１０6 個／穴の割合、好ましくは１０
3 〜１０5 個／穴で播種し、培養を２〜１０日間、好ま
しくは３〜５日間培養することにより、球状の細胞集合
体であるスフェロイドが得られる。培養温度は、３７℃
が好ましい。２〜１０％好ましくは５〜１０％の二酸化
炭素存在下で培養する。本発明のスフェロイドの大きさ
は、直径、５０μｍ〜５００μｍ、好ましくは１００μ
ｍ〜３００μｍである。
【００１５】本発明で用いられるスフェロイド培養器
は、スフェロイドを均質に作製することの出来るスフェ
ロイド培養器であればよい。代表的なスフェロイド培養
器としては、スフェロイド培養用９６穴プレート（住友
ベークライト社製）が挙げられる。
は、スフェロイドを均質に作製することの出来るスフェ
ロイド培養器であればよい。代表的なスフェロイド培養
器としては、スフェロイド培養用９６穴プレート（住友
ベークライト社製）が挙げられる。
【００１６】本発明の発毛誘導剤は、毛乳頭細胞スフェ
ロイドを含む。発毛誘導剤の形態は、毛乳頭スフェロイ
ド自体でもよいし、溶液にスフェロイドを懸濁した形態
でもよい。懸濁する溶液は、生理食塩水、ＰＢＳ等が挙
げられる。このとき、ゼラチン、抗生剤、繊維芽細胞増
殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等を含ん
でいてもよい。
ロイドを含む。発毛誘導剤の形態は、毛乳頭スフェロイ
ド自体でもよいし、溶液にスフェロイドを懸濁した形態
でもよい。懸濁する溶液は、生理食塩水、ＰＢＳ等が挙
げられる。このとき、ゼラチン、抗生剤、繊維芽細胞増
殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等を含ん
でいてもよい。
【００１７】本発明の発毛誘導剤は、皮膚表皮層剥離面
やレーザーを用い頭皮に穿孔した孔あるいはトランスヘ
アーミクロドリルで穿孔した孔に移植される。発毛誘導
剤が毛乳頭細胞スフェロイド自体のときは、マイクロピ
ンセット等を用いて移植できる。また、発毛誘導剤が溶
液のときは、注射針を用いて皮内注射し移植できる。
やレーザーを用い頭皮に穿孔した孔あるいはトランスヘ
アーミクロドリルで穿孔した孔に移植される。発毛誘導
剤が毛乳頭細胞スフェロイド自体のときは、マイクロピ
ンセット等を用いて移植できる。また、発毛誘導剤が溶
液のときは、注射針を用いて皮内注射し移植できる。
【００１８】本発明の発毛誘導剤は、移植必要部位１cm
2 あたり、１０〜１００個移植する。好ましくは２５〜
８０個移植する。
2 あたり、１０〜１００個移植する。好ましくは２５〜
８０個移植する。
【００１９】本発明の毛乳頭細胞スフェロイド作製用キ
ットは、毛乳頭細胞培養用培地、培養容器およびスフェ
ロイド培養器を含有する。培養容器は細胞培養フラスコ
あるいは培養皿がよい。複数の、好ましくは２〜５の培
養容器がキットに含まれる。また、必要に応じて複数の
スフェロイド培養器を含有する。すべて滅菌済であるの
が好ましい。また、すぐ使用出来るように、培地は小分
けされているのが好ましい。
ットは、毛乳頭細胞培養用培地、培養容器およびスフェ
ロイド培養器を含有する。培養容器は細胞培養フラスコ
あるいは培養皿がよい。複数の、好ましくは２〜５の培
養容器がキットに含まれる。また、必要に応じて複数の
スフェロイド培養器を含有する。すべて滅菌済であるの
が好ましい。また、すぐ使用出来るように、培地は小分
けされているのが好ましい。
【００２０】
【実施例】以下、実施例及び実験例により本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるもの
ではない。
的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるもの
ではない。
【００２１】実施例１ 発毛誘導剤（皮膚移植用毛乳頭
細胞スフェロイド）の作製 実体顕微鏡下でヒト頭部毛包より毛乳頭を分離し、コラ
ーゲンでコート処理した３５ｍｍプラスチックシャーレ
（コースター社製）を用い、１０％牛血清含有ＤＭＥＭ
培地にて毛乳頭細胞の分離培養を行った。細胞がコンフ
レントに達したところで継代し、７〜８継代目のものに
ついて、同培地にて細胞を回収し、毛乳頭細胞懸濁液を
得た。毛乳頭細胞懸濁液をスフェロイド培養用９６穴プ
レート（住友ベークライト社製）に細胞が０．５〜２×
１０4 個／穴になるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ2 下
で３〜５日培養し、皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド
を得た。このスフェロイドを小試験管に集め、生理食塩
水で５回洗浄操作を行い発毛誘導剤を得た。
細胞スフェロイド）の作製 実体顕微鏡下でヒト頭部毛包より毛乳頭を分離し、コラ
ーゲンでコート処理した３５ｍｍプラスチックシャーレ
（コースター社製）を用い、１０％牛血清含有ＤＭＥＭ
培地にて毛乳頭細胞の分離培養を行った。細胞がコンフ
レントに達したところで継代し、７〜８継代目のものに
ついて、同培地にて細胞を回収し、毛乳頭細胞懸濁液を
得た。毛乳頭細胞懸濁液をスフェロイド培養用９６穴プ
レート（住友ベークライト社製）に細胞が０．５〜２×
１０4 個／穴になるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ2 下
で３〜５日培養し、皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド
を得た。このスフェロイドを小試験管に集め、生理食塩
水で５回洗浄操作を行い発毛誘導剤を得た。
【００２２】実施例２ 実施例１で得られた皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド
をＰＢＳに懸濁し、注射剤として供することのできる液
状の発毛誘導剤を得た。
をＰＢＳに懸濁し、注射剤として供することのできる液
状の発毛誘導剤を得た。
【００２３】実施例３ 皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロ
イドのマウスへの移植 移植する動物は８週齢のヌードマウス（雄）を日本クレ
アから購入し用いた。まず、ヌードマウス背部を髭剃り
用シェーバーで剃毛したのち、イソジン（明治製菓株式
会社製）を用いて消毒を施した。次に、１８Ｇの注射針
（テルモ社製）を用いてヌードマウス背部皮膚の真皮部
に到る穿孔を行った。その後、各孔に実施例１で作製し
た皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイドをマイクロピンセ
ット及び先端の平坦なブローチを用いて埋め込んだ。そ
の後、各孔は、皮膚上皮部の接着を促すためにも、皮膚
表面に少量の接着液（アロンアルファ）をつけること
で、一時的に切創部を閉塞させた。その上をバンドエイ
ド及び包帯で覆い、２週間放置し、傷口が治癒したとこ
ろで、これら覆いを除去して飼育した。発毛は、経日的
に肉眼観察した。６０〜７０日後にヌードマウスの移植
背部に発毛が観察された。
イドのマウスへの移植 移植する動物は８週齢のヌードマウス（雄）を日本クレ
アから購入し用いた。まず、ヌードマウス背部を髭剃り
用シェーバーで剃毛したのち、イソジン（明治製菓株式
会社製）を用いて消毒を施した。次に、１８Ｇの注射針
（テルモ社製）を用いてヌードマウス背部皮膚の真皮部
に到る穿孔を行った。その後、各孔に実施例１で作製し
た皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイドをマイクロピンセ
ット及び先端の平坦なブローチを用いて埋め込んだ。そ
の後、各孔は、皮膚上皮部の接着を促すためにも、皮膚
表面に少量の接着液（アロンアルファ）をつけること
で、一時的に切創部を閉塞させた。その上をバンドエイ
ド及び包帯で覆い、２週間放置し、傷口が治癒したとこ
ろで、これら覆いを除去して飼育した。発毛は、経日的
に肉眼観察した。６０〜７０日後にヌードマウスの移植
背部に発毛が観察された。
【００２４】実施例４ ヒト疑似皮膚である培養人工皮膚三次元モデルへの皮膚
移植用毛乳頭細胞のスフェロイドの移植 １．生きた人工皮膚組織の作製 コラーゲンゲル作製方法は、ベルらの方法（Bell,E., e
t al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76,1274-,1979）に準
じて行った。オルガノジェネシス社から購入したヒト繊
維芽細胞を１０％牛血清含有ＤＭＥＭ培地にて培養し、
サブコンフレントに達した後、同培地にて細胞を回収
し、繊維芽細胞懸濁液を得た。４℃において、９容量の
コラーゲン溶液（オルガノジェネシス社製）に１容量の
１０倍濃度のＥＭＥＭ培地（ギブコ社製）を加え、重曹
をｐＨが中性付近になるまで攪拌しながら加えた。さら
に１０％量の牛血清を加えた後、上記繊維芽細胞懸濁液
を、最終細胞濃度が２．５×１０4 個／ｍｌになるよう
ゆっくり加え、よく攪拌した。かかる混合溶液を６穴プ
レートに入ったトランスウェル（コースター社製）の内
側に３ｍｌずつ加え、室温にて１５分間静置し、ゲル化
させた。かかるコラーゲンゲルに１０％牛血清含有ＤＭ
ＥＭ培地を静かに添加し、３７℃、１０％ＣＯ2 下で５
〜７日間培養し、繊維芽細胞の作用によってコラーゲン
ゲルを収縮させた後、人工皮膚の支持体に供した。次
に、表皮角化細胞の播種、培養はベルらの方法（Parent
eau,N.L., et al., J.Cellular Biochem.,45,245-,199
1）に従い行った。すなわち、オルガノジェネシス社か
ら購入したヒト表皮角化細胞をＣａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡ
Ｍ Ｆ１２＝３：１を基礎とするEpidemalization 用培
地（東洋紡社製）に懸濁し、コラーゲンゲルの上に同細
胞懸濁液を、細胞が０．５〜１×１０5 個／ｃｍ2 にな
るように添加した。次いで、同培地を静かに添加し、３
７℃、１０％ＣＯ2 下で３〜５日間培養し、表皮角化細
胞を充分伸展させた。次に、Ｃａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ
Ｆ１２＝１：１を基礎とするMaintenance 用培地（東
洋紡社製) を、真皮層が培養液下で、かつ表皮角化細胞
が空気中に出るよう添加し、３７℃、１０％ＣＯ2 下で
７〜１０日間培養し、生きた人工皮膚組織を作製した。
移植用毛乳頭細胞のスフェロイドの移植 １．生きた人工皮膚組織の作製 コラーゲンゲル作製方法は、ベルらの方法（Bell,E., e
t al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76,1274-,1979）に準
じて行った。オルガノジェネシス社から購入したヒト繊
維芽細胞を１０％牛血清含有ＤＭＥＭ培地にて培養し、
サブコンフレントに達した後、同培地にて細胞を回収
し、繊維芽細胞懸濁液を得た。４℃において、９容量の
コラーゲン溶液（オルガノジェネシス社製）に１容量の
１０倍濃度のＥＭＥＭ培地（ギブコ社製）を加え、重曹
をｐＨが中性付近になるまで攪拌しながら加えた。さら
に１０％量の牛血清を加えた後、上記繊維芽細胞懸濁液
を、最終細胞濃度が２．５×１０4 個／ｍｌになるよう
ゆっくり加え、よく攪拌した。かかる混合溶液を６穴プ
レートに入ったトランスウェル（コースター社製）の内
側に３ｍｌずつ加え、室温にて１５分間静置し、ゲル化
させた。かかるコラーゲンゲルに１０％牛血清含有ＤＭ
ＥＭ培地を静かに添加し、３７℃、１０％ＣＯ2 下で５
〜７日間培養し、繊維芽細胞の作用によってコラーゲン
ゲルを収縮させた後、人工皮膚の支持体に供した。次
に、表皮角化細胞の播種、培養はベルらの方法（Parent
eau,N.L., et al., J.Cellular Biochem.,45,245-,199
1）に従い行った。すなわち、オルガノジェネシス社か
ら購入したヒト表皮角化細胞をＣａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡ
Ｍ Ｆ１２＝３：１を基礎とするEpidemalization 用培
地（東洋紡社製）に懸濁し、コラーゲンゲルの上に同細
胞懸濁液を、細胞が０．５〜１×１０5 個／ｃｍ2 にな
るように添加した。次いで、同培地を静かに添加し、３
７℃、１０％ＣＯ2 下で３〜５日間培養し、表皮角化細
胞を充分伸展させた。次に、Ｃａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ
Ｆ１２＝１：１を基礎とするMaintenance 用培地（東
洋紡社製) を、真皮層が培養液下で、かつ表皮角化細胞
が空気中に出るよう添加し、３７℃、１０％ＣＯ2 下で
７〜１０日間培養し、生きた人工皮膚組織を作製した。
【００２５】２．毛乳頭細胞スフェロイドの人工皮膚へ
の移植 作製した人工皮膚モデルの表皮表面に１８Ｇの注射針
（テルモ社製）を用いて、穿孔を作製した。その孔に、
実施例１と同様に作製した毛乳頭細胞スフェロイドを１
個ずつ埋め込んだ。Epidemalization 用培地（東洋紡社
製）を用いて２日培養後、Maintenance 用培地( 東洋紡
社製) に換え培養をさらに７日間継続した。
の移植 作製した人工皮膚モデルの表皮表面に１８Ｇの注射針
（テルモ社製）を用いて、穿孔を作製した。その孔に、
実施例１と同様に作製した毛乳頭細胞スフェロイドを１
個ずつ埋め込んだ。Epidemalization 用培地（東洋紡社
製）を用いて２日培養後、Maintenance 用培地( 東洋紡
社製) に換え培養をさらに７日間継続した。
【００２６】３．皮膚付属器官様構造体の確認 以上のようにして得られた毛乳頭細胞を組み込んだ人工
皮膚をホルマリン固定し、切片作製後、ＨＥ染色を行っ
た。得られた組織切片像を図１および図２に示す。ここ
に示すように、作成された人工皮膚はヒト皮膚に非常に
よく似た形態を示しており、組み込まれた毛乳頭スフェ
ロイドは、毛包状の皮膚付属器官様構造体として、表皮
／真皮境界部の適当な位置に組み込まれていることが見
られた。さらに、組み込み後、培養を継続すると毛乳頭
細胞スフェロイドの上部の表皮層部に毛幹様の角化した
領域が見られ、組み込んだ毛乳頭スフェロイドによる発
毛惹起が確認された。
皮膚をホルマリン固定し、切片作製後、ＨＥ染色を行っ
た。得られた組織切片像を図１および図２に示す。ここ
に示すように、作成された人工皮膚はヒト皮膚に非常に
よく似た形態を示しており、組み込まれた毛乳頭スフェ
ロイドは、毛包状の皮膚付属器官様構造体として、表皮
／真皮境界部の適当な位置に組み込まれていることが見
られた。さらに、組み込み後、培養を継続すると毛乳頭
細胞スフェロイドの上部の表皮層部に毛幹様の角化した
領域が見られ、組み込んだ毛乳頭スフェロイドによる発
毛惹起が確認された。
【００２７】実施例５ 毛乳頭細胞スフェロイド作製用
キットの作成 実施例１で検討された培養方法に従い毛乳頭細胞スフェ
ロイド作製用キットを作成した。キット構成としては、
分離培養セット、継代培養セット、スフェロイド培養セ
ットの３群より構成した。各セットの構成は、分離培養
セットが、コラーゲンタイプＩをコートした培養皿、毛
乳頭培養培地よりなり、継代培養セットが、コラーゲン
タイプＩをコートした細胞培養用フラスコおよび毛乳頭
培養培地よりなり、スフェロイド培養セットが、スフェ
ロイド培養用９６穴プレート（住友ベークライト製）お
よび毛乳頭スフェロイド培養培地よりなるように設定し
た。各セット共通試薬として継代培養用試薬セット（Ｐ
ＢＳ、トリプシン−ＥＤＴＡ液、トリプシン中和液）を
構成させた。
キットの作成 実施例１で検討された培養方法に従い毛乳頭細胞スフェ
ロイド作製用キットを作成した。キット構成としては、
分離培養セット、継代培養セット、スフェロイド培養セ
ットの３群より構成した。各セットの構成は、分離培養
セットが、コラーゲンタイプＩをコートした培養皿、毛
乳頭培養培地よりなり、継代培養セットが、コラーゲン
タイプＩをコートした細胞培養用フラスコおよび毛乳頭
培養培地よりなり、スフェロイド培養セットが、スフェ
ロイド培養用９６穴プレート（住友ベークライト製）お
よび毛乳頭スフェロイド培養培地よりなるように設定し
た。各セット共通試薬として継代培養用試薬セット（Ｐ
ＢＳ、トリプシン−ＥＤＴＡ液、トリプシン中和液）を
構成させた。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、限定された被移植片採取
部位から、毛乳頭採取が行えるので、ドナーの苦痛を軽
減でき、採取部位の異常を来すことがない。また、移植
必要部位の大小にかかわらず、被移植部位の毛髪発毛に
必要な数の毛乳頭スフェロイドを容易に製造し、移植し
発毛させることができる。すなわち、採取部位の苦痛を
最小限にとどめて、多面積の皮膚における発毛処置が可
能となる。さらに、本発明の方法により、自家移植が容
易になり、免疫学的拒絶反応の危険性を回避し、さら
に、ウイルスをはじめとする病原性微生物の感染の回避
が可能となる。
部位から、毛乳頭採取が行えるので、ドナーの苦痛を軽
減でき、採取部位の異常を来すことがない。また、移植
必要部位の大小にかかわらず、被移植部位の毛髪発毛に
必要な数の毛乳頭スフェロイドを容易に製造し、移植し
発毛させることができる。すなわち、採取部位の苦痛を
最小限にとどめて、多面積の皮膚における発毛処置が可
能となる。さらに、本発明の方法により、自家移植が容
易になり、免疫学的拒絶反応の危険性を回避し、さら
に、ウイルスをはじめとする病原性微生物の感染の回避
が可能となる。
【図１】毛乳頭細胞スフェロイドを含む人工皮膚のＨＥ
染色像を示した図面に代わる写真（顕微鏡写真）であ
り、表皮層／真皮層境界部に毛乳頭細胞スフェロイドが
組み込まれた像を示す。
染色像を示した図面に代わる写真（顕微鏡写真）であ
り、表皮層／真皮層境界部に毛乳頭細胞スフェロイドが
組み込まれた像を示す。
【図２】毛包様構造体を含む人工皮膚のＨＥ染色像を示
した図面に代わる写真（顕微鏡写真）であり、表皮層部
に毛幹様の角化した領域が形成されていることを示す。
した図面に代わる写真（顕微鏡写真）であり、表皮層部
に毛幹様の角化した領域が形成されていることを示す。
Claims (9)
- 【請求項１】 毛乳頭細胞スフェロイドを含有する発毛
誘導剤。 - 【請求項２】 毛乳頭細胞スフェロイドが毛乳頭細胞を
培養して得るものである請求項１記載の発毛誘導剤。 - 【請求項３】 毛乳頭細胞スフェロイドを皮膚に移植す
ることを特徴とする請求項１記載の発毛誘導剤。 - 【請求項４】 皮膚移植用毛乳頭細胞スフェロイド。
- 【請求項５】 毛乳頭細胞培養用培地、培養容器および
スフェロイド培養器を含有する皮膚移植用毛乳頭細胞ス
フェロイド作製用キット。 - 【請求項６】 毛乳頭細胞を培養しスフェロイドを形成
させ、そのスフェロイドを皮膚に移植することを特徴と
する、該部位に発毛を惹起させる方法。 - 【請求項７】 毛乳頭細胞がヒト起源毛乳頭細胞である
請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 毛乳頭細胞が自家又は同種細胞である請
求項６記載の方法。 - 【請求項９】 移植をあらかじめ穿孔された孔に行うこ
とを特徴とする請求項６記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36454597A JP4324988B2 (ja) | 1997-12-17 | 1997-12-17 | 発毛誘導剤および発毛方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36454597A JP4324988B2 (ja) | 1997-12-17 | 1997-12-17 | 発毛誘導剤および発毛方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11180878A true JPH11180878A (ja) | 1999-07-06 |
| JP4324988B2 JP4324988B2 (ja) | 2009-09-02 |
Family
ID=18482076
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36454597A Expired - Fee Related JP4324988B2 (ja) | 1997-12-17 | 1997-12-17 | 発毛誘導剤および発毛方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4324988B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005053763A1 (ja) * | 2003-12-05 | 2005-06-16 | Biointegrence Inc. | 発毛方法 |
| US7052720B1 (en) | 1999-06-17 | 2006-05-30 | University Of Wales College Of Medicine | Spheroid preparation |
| JP2008029342A (ja) * | 2006-07-13 | 2008-02-14 | L'oreal Sa | マトリックス細胞から得られる色素形成能のある表皮同等物、調製方法、及び使用 |
| JP2008125540A (ja) * | 2006-11-16 | 2008-06-05 | Lion Corp | 人工皮膚 |
| JP2008306938A (ja) * | 2007-06-12 | 2008-12-25 | Shiseido Co Ltd | 毛乳頭細胞培養方法 |
| EP1542976B1 (en) * | 2002-09-25 | 2009-02-04 | Wyeth | Substituted 4-(indazol-3-yl)phenols as estrogen receptor (er) ligands and their use in the treatment of inflammatory diseases |
| JP2009528062A (ja) * | 2006-02-28 | 2009-08-06 | ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク | 真皮細胞のコンパクト凝集のための方法 |
| JP2021505164A (ja) * | 2017-12-07 | 2021-02-18 | ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ | 多層皮膚構築物ならびにそれを製造および使用する方法 |
| KR102254911B1 (ko) * | 2020-08-12 | 2021-05-24 | 한모바이오 주식회사 | 천공을 통한 모유두세포 이식방법 |
-
1997
- 1997-12-17 JP JP36454597A patent/JP4324988B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US9550976B2 (en) | 2006-02-28 | 2017-01-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for compact aggregation of dermal cells |
| US9109204B2 (en) | 2006-02-28 | 2015-08-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for compact aggregation of dermal cells |
| US10039791B2 (en) | 2006-07-13 | 2018-08-07 | L'oreal | Pigmentable epidermis equivalent prepared from matrix cells and methods for the production thereof |
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| KR102254911B1 (ko) * | 2020-08-12 | 2021-05-24 | 한모바이오 주식회사 | 천공을 통한 모유두세포 이식방법 |
| WO2022035023A1 (ko) * | 2020-08-12 | 2022-02-17 | 한모바이오 주식회사 | 천공을 통한 모유두세포 이식방법 |
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|---|---|
| JP4324988B2 (ja) | 2009-09-02 |
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