KR102218727B1 - 두피조직 유래 모유두세포의 분리 및 대량증식방법 - Google Patents

두피조직 유래 모유두세포의 분리 및 대량증식방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모유두세포의 분리 및 대량증식방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 초핑(chopping)을 통하여 두피조직으로부터 분리된 모구에서 모유두세포를 분리한 후 계대배양하여 대량으로 모유두세포를 증식하는 방법에 관한 발명으로, 본 발명에 의하여 대량으로 증식된 모유두세포는 육모에 중요한 역할을 할 수 있는 점에서 본 발명은 의료분야, 미용분야 등 다양한 산업분야에서 활용이 가능하다.

Description

두피조직 유래 모유두세포의 분리 및 대량증식방법{Method for isolating and mass proliferation dermal papilla cells derived from scalp tissue}
본 발명은 두피조직 유래 모유두세포의 분리 및 대량증식방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 초핑(chopping)을 통하여 두피조직으로부터 분리된 모구에서 모유두세포를 분리한 후 계대배양하여 대량으로 모유두세포를 증식하는 방법에 관한 발명이다.
탈모증(alopecia)은 질병, 영양부족, 노화, 호르몬 불균형 등에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 많은 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고, 근본적인 탈모에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않으나, 일반적으로 모발은 일정한 모주기(hair cycle)를 거치게 되며, 모유두(dermal papilla)의 자극을 받은 모모세포(keratinocyte)가 활발히 분열·증식하여 모발이 자라는 성장기(anagen), 모구(hair bulb)에 혈액공급이 끊기고 모유두가 모낭으로부터 분리되는 퇴행기(catagen) 및 세포 증식이 멈춰 모발이 성장하지 않는 휴지기(telogen)를 거쳐 다시 성장기로 들어가거나 모발이 두피로부터 빠지는 탈락기(exogen)로 가게 된다. 사람의 모발은 각각 독립된 성장주기를 가져 일부는 탈락기로, 일부는 성장기로 들어가며 전체적으로 동일 수준의 모발수를 유지하게 되는데, 이러한 균형이 탈락기로 기울어 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없어지는 상태를 탈모증(alopecia)이라 한다.
또한 탈모를 치료하기 위한 노력도 진행되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 오직 두 개의 약물들 (피나스테라이드(finasteride) 및 미녹시딜(minoxidil))만이 탈모 치료를 위해 FDA(Food and Drug Administration) (U.S.A)에서 인가되었다.
인체의 모발은 약 10만∼15만 개 정도이며 모낭(hair follicle)에서 형성된다. 모낭에는 유두가 있는데, 이 부위에는 작은 혈관이 분포되어 모발의 성장에 필요한 영양분을 공급하고 유두 위의 옆으로는 모발에 윤기를 주는 기름을 공급해주는 지루샘이 있다. 모낭은 여러 다른 상피세포들(epithelial cells) 및 모유두세포들로 이루어진다. 모유두세포는 모낭의 기저부에 위치한 중간엽-유래 섬유아세포(mesenchymally-derived fibroblasts)이며 육모에 중요한 역할을 한다. 특히, 미녹시딜(minoxidil)은 모유두세포의 증식 및 항-세포사멸 효과를 가지는 것으로 보고되었다. 그러나, 육모에 중요한 역할을 하는 모유두세포는 두피로부터 분리 및 배양이 어렵고, 대량 배양시 모발재생능력이 저하되는 문제가 있었다.
본 발명은 두피조직으로부터 분리된 모구에서 초핑(chopping)을 통하여 모유두세포를 분리하고 계대배양하여, 모유두세포를 대량증식하는 방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명은 (A) 두피조직으로부터 모구를 분리하는 단계; (B) 모구로부터 모유두세포를 분리하는 단계; (C) 계대배양하는 단계;를 포함하는 모유두세포의 분리 및 대량증식방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, (A) 두피조직으로부터 모구를 분리하는 단계는, (a1) 멸균된 페트리 접시(petri dish)에 MEM alpha 배지를 피험자로부터 채취한 두피 조직(표피에서 진피층까지)이 잠기도록 채우는 단계; (a2) 페트리 접시(petri dish) 덮개에 MEM alpha 배지를 이용하여 드롭(drop)을 형성시키고, 미세수술용 가위와 포셉(forcep)을 이용하여 진피층의 모구를 하나씩 분리하여 준비한 드롭(drop)으로 이동시키는 단계; (a3) 드롭(drop)으로 이동된 모구를 실체현미경으로 관찰하며 시린지(syringe)와 미세수술용 포셉을 이용하여 모구 말단에 부착되어 있는 지방조직 및 모간(hair shaft)을 제거하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, (B) 모구로부터 모유두세포를 분리하는 단계는, (b1) 세포배양접시(cell culture dish)에 분리배지(Dissection media) 및 모구를 넣은 후 정밀미세가위로 모구를 초핑(chopping)하는 단계; (b2) 초핑(chopping)된 모구를 튜브에 모으고 원심분리하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, (b1) 단계에서 초핑(chopping)된 모구의 크기는 15μm 내지 120μm일 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 원심분리는 2200 rpm에서 5 분간 이루어질 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, (C) 계대배양하는 단계는, (c1) 세포수에 따라 계대배양 할 배양접시(culture dish)를 결정한 후, 배양접시(culture dish)에 들어있던 배지를 버리고, PBS로 세척하는 단계; (c2) 0.25% Trypsin/EDTA을 처리하고 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 5분간 incubation 하는 단계; (c3) 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 50ml centrifuge 튜브에 모은 후 원심분리 하는 단계; (c4) 상층액은 버리고 아래에 가라앉은 pellet을 tapping 한 후, MEM alpha, Basic FGF, 10% Fetal bovine serum, Penicillin-Streptomycin 및 Amphotericin B를 포함하는 Expansion Media 2를 넣고 세포수를 확인하는 단계; (c5) 계수된 세포수에 따라 1,500개/cm2가 되도록 다음 단계의 배양접시(culture dish)에 seeding 한 후, 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 배양접시(culture dish)가 세포로 가득 찰 때까지 증식시키는 단계; 를 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 계대배양은 (c1)부터 (c5) 단계를 3번 반복할 수 있다.
본 발명에 의하여 대량으로 증식된 모유두세포는 육모에 중요한 역할을 할 수 있는 점에서, 모유두세포를 대량증식하는 방법에 관한 본 발명은 의료분야, 미용분야 등 다양한 산업분야에서 활용이 가능하다.
도 1은 모구로부터 모유두세포를 분리하는 방법에 따른 세포수득률의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 모유두세포 분리방법과 배지조성에 따른 대량증식결과의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 case 별 계대배양에 따른 세포수득률 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 case 별 계대배양에 따른 모유두세포와 관련된 growth factor 분비량의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 초핑(chopping)의 단계에 따른 모구 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 초핑(chopping)의 단계에 따른 세포증식의 차이를 비교하여 나타낸 것이다.
본 발명에 의한 일 실시예에서는, (A) 두피조직으로부터 모구를 분리하는 단계; (B) 모구로부터 모유두세포를 분리하는 단계; (C) 계대배양하는 단계;를 포함하는 모유두세포의 분리 및 대량증식방법을 제공한다.
본 발명에서 “모구”는 모낭에 의하여 싸여 있는 모근의 하부에 형성되어 있는 두꺼운 곤봉형 구조로서, 모세혈관, 모유두세포, 모모세포 등이 위치하는 조직을 의미한다.
본 발명에 의한 다른 실시예에서, (A) 두피조직으로부터 모구를 분리하는 단계는, (a1) 멸균된 페트리 접시(petri dish)에 MEM alpha 배지를 피험자로부터 채취한 두피 조직(표피에서 진피층까지)이 잠기도록 채우는 단계; (a2) 페트리 접시 (petri dish) 덮개에 MEM alpha 배지를 이용하여 드롭(drop)을 형성시키고, 미세수술용 가위와 포셉(forcep)을 이용하여 진피층의 모구를 하나씩 분리하여 준비한 드롭(drop)으로 이동시키는 단계; (a3) 드롭(drop)으로 이동된 모구를 실체현미경으로 관찰하며 시린지(syringe)와 미세수술용 포셉을 이용하여 모구 말단에 부착되어 있는 지방조직 및 모간(hair shaft)을 제거하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, (B) 모구로부터 모유두세포를 분리하는 단계는, (b1) 세포배양접시(cell culture dish)에 분리배지(Dissection media) 및 모구를 넣은 후 정밀미세가위로 모구를 초핑(chopping)하는 단계; (b2) 초핑(chopping)된 모구를 튜브에 모으고 원심분리하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, (b1) 단계에서 초핑(chopping)된 모구의 크기는 15μm 내지 120μm일 수 있다.
본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 원심분리는 2200 rpm에서 5 분간 이루어질 수 있다.
본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, (C) 계대배양하는 단계는, (c1) 세포수에 따라 계대배양 할 배양접시(culture dish)를 결정한 후, 배양접시(culture dish)에 들어있던 배지를 버리고, PBS로 세척하는 단계; (c2) 0.25% Trypsin/EDTA을 처리하고 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 5분간 incubation 하는 단계; (c3) 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 50ml centrifuge 튜브에 모은 후 원심분리 하는 단계; (c4) 상층액은 버리고 아래에 가라앉은 pellet을 tapping 한 후, MEM alpha, Basic FGF, 10% Fetal bovine serum, Penicillin-Streptomycin 및 Amphotericin B를 포함하는 Expansion Media 2를 넣고 세포수를 확인하는 단계; (c5) 계수된 세포수에 따라 1,500개/cm2가 되도록 다음 단계의 배양접시(culture dish)에 seeding 한 후, 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 배양접시(culture dish)가 세포로 가득 찰 때까지 증식시키는 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 계대배양은 (c1)부터 (c5) 단계를 3번 반복할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 두피조직으로부터 모구의 분리
멸균된 90 mm 페트리 접시(petri dish)에 MEM alpha 배지를 피험자로부터 채취한 두피 조직(표피에서 진피층까지)이 잠기도록 채운 후, 90 mm 페트리 접시(petri dish) 덮개에 MEM alpha 배지를 이용하여 여러 개의 드롭(drop)을 형성시키고, 미세수술용 가위와 포셉(forcep)을 이용하여 진피층의 모구를 하나씩 분리하여 준비한 드롭(drop)으로 옮겼다. 이 후, 드롭(drop)으로 이동된 모구를 실체현미경으로 관찰하며 26G 시린지(syringe)와 미세수술용 포셉을 이용하여 모구 말단에 부착되어 있는 지방조직 및 모간(hair shaft) 등을 제거하여 두피조직으로부터 모구를 분리하였다.
실시예 2. 모구로부터 모유두세포의 분리
모구로부터 모유두세포를 분리하는 최적의 방법을 선택하기 위하여 하기와 같은 비교실험을 하였다.
먼저, 분리 방법 1은 35 mm 세포배양접시(cell culture dish)에 1 ml의 분리배지(Dissection media)를 넣고 모구 약 50개를 넣은 후 정밀미세가위로 초핑(chopping)한 후 튜브에 모으고 2200 rpm에서 5 분간 원심분리하는 방법이다.
다음으로, 분리 방법 2는 모구 약 50개가 들어있는 35 mm 세포배양접시(cell culture dish)에 0.025% Collagenase type I 시약을 넣은 후 37 ℃, shaking incubator에서 2시간 30분 간 incubation 하고 튜브에 모아 2200 rpm에서 5 분간 원심분리하는 방법이다.
상기 분리 방법 1과 2의 결과를 비교하기 위하여, 각각의 Pellet을 tapping 하고 하기 표 1의 조성을 가지는 Attachment media 2 ml로 피펫팅(pipetting)을 충분히 한 후 35 mm 세포배양접시(cell culture dish)에 seeding 하고, 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 배양접시(culture dish)가 세포로 가득 찰 때까지 증식시켰다.
구분 Attachment Media
(부착 단계)
Component MEM alpha
-
20% Fetal bovine serum
Penicillin-Streptomycin
Amphotericin B
상기 비교실험 결과, 0.025% Collagenase type I 시약을 넣은 분리방법 2와 비교하여, 모구 자체에 다른 처리를 하지 않고 초핑(chopping)만 진행한 분리방법 1에서 세포의 크기가 더 작고 일정하며 세포수득률도 높게 나오는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
실시예 3. 계대배양 단계
Passage 0 에서 Passage 1 로 계대배양하는 단계는 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 35 mm 세포배양접시(cell culture dish)에서 수집된 세포수에 따라 계대배양 할 배양접시(culture dish)를 결정한 후, 35 mm 세포배양접시(cell culture dish)에 들어있던 배지를 버리고, PBS로 1회 세척하였다. 다음으로, 0.25% Trypsin/EDTA을 처리하고 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 5분간 incubation 하였다. 이 후, inactivation을 위해 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 50ml centrifuge 튜브에 모은 후 2200 rpm에서 5 분간 원심분리 후, 상층액은 버리고 아래에 가라앉은 pellet을 충분히 tapping 한 후 표 2에 나타낸 적당량의 Expansion Media 1 또는 2를 넣고 세포수를 확인하였다.
구분 Expansion Media 1
(대량증식 단계)		 Expansion Media 2
(대량증식 단계)
Component MEM alpha MEM alpha
- Basic FGF
10% Fetal bovine serum 10% Fetal bovine serum
Penicillin-Streptomycin Penicillin-Streptomycin
Amphotericin B Amphotericin B
계수된 세포수에 따라 1,500개/cm2가 되도록 다음 단계의 배양접시(culture dish)에 seeding 한 후, 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 배양접시(culture dish)가 세포로 가득 찰 때까지 증식시켰다.
이 후, passage 1 내지 passage 4 로 계대배양하는 단계는 상기와 동일한 순서로 이루어지며, 계수되는 세포수에 따라 배양접시(culture dish)의 크기를 맞추어 passage 4까지 계대배양하였고, 중간 passage 단계에서 동결하였다가 해동할 경우에는 3,000개/cm2가 되도록 배양접시(culture dish)에 seeding하였다.
실시예 4. 모유두세포 분리 및 대량증식 조건에 따른 결과 도출
실시예 4-1. 세포 분리방법과 배지조성에 따른 차이
모유두세포 분리방법과 배지 조성에 따른 대량증식결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 case 1은 초핑(chopping)에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 1 배지에서 대량증식한 결과이고, case 2는 초핑(chopping)에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 2 배지에서 대량증식한 결과이며, case 3은 0.025% Collagenase type I 시약 처리에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 1 배지에서 대량증식한 결과이고, case 4 는 0.025% Collagenase type I 시약 처리에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 1 배지에서 대량증식한 결과를 나타낸 것이다. 각 case 별로 세포의 morphology를 확인해 본 결과 초핑(chopping)에 의하여 모구로부터 모유두세포를 분리한 후 Expansion media 2를 사용한 경우인 case 2에서 세포의 형태가 잘 유지되며 모유두 세포의 대량증식 증식률이 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, case 별로 계대 대량증식에 따른 세포 크기변화를 하기 표 3에 나타내었다.
(um) P1 P2 P3 P4 P5 P6
case1 18.99 19 19.28 17.78 17.58 17.66
case2 13.2 13 13.7 13.88 15.14 15.2
case3 17.1 17 17.6 18.75 18.94 19.22
case4 15.3 15 15.5 16.6 17.03 18.06
상기 표 3에 따르면, case 2의 세포 크기가 가장 작고 고르게 유지되었고, case 1을 제외한 나머지 군에서는 계대배양수가 늘어남에 따라 세포크기도 커지는 경향을 나타내었다. 나아가, case 2의 경우에는 P1 내지 P4까지는 큰 변화 없이 세포크기가 유지되는 것으로 보아 세포의 수득률 또한 높을 것으로 예상을 해 볼 수 있었고, 이를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 따르면, 세포의 수득률 역시 전체 계대에 걸쳐 case 2가 가장 높은 것을 확인 할 수 있었고, 특히 P3에서 가장 많은 양의 세포가 수집된 것으로 확인되었다.
다음으로, case 별로 계대배양에 따른 모유두세포와 관련된 Growth factor 분비량을 도 4에 나타내었다. 도 4에 따르면, 인체 모유두세포를 자극하여 상피 소낭 세포의 증식을 촉진시키는 HGF, 혈관확장에 관여하여 모발 성장을 유도하는 VEGF, 모낭조직의 성장을 촉진하는 FGF (KGF) 등 모유두세포의 성장인자로 알려져 있는 다양한 Growth factor의 분비량을 측정해 본 결과 전반적으로 case 2의 P3에서 가장 많은 양의 growth factor가 분비되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4-2. 초핑(chopping) 범위에 따른 차이
상기 실험결과를 토대로, 최적의 초핑(chopping) 범위를 결정하기 위한 실험을 진행하였다. 먼저, 두피 조직으로부터 펀칭되어져 나온 모구를 PBS 또는 basal media가 채워진 페트리 접시(petri dish)에 수집하고, 35 mm 세포배양접시(cell culture dish)에 1 ml의 분리배지(Dissection media)와 모구를 넣고 정밀미세가위로 모구를 초핑(chopping)한 후, 초핑(chopping)의 정도에 따른 모구 크기 변화를 현미경으로 관찰하였다. 초핑(chopping) 단계에 따른 모구의 크기를 측정한 결과 초핑(chopping) 전은 750μm 내지 900μm, 초핑(chopping) 1단계에서는 490μm 내지 630μm, 2단계에서는 300μm 내지 410μm, 3단계에서는 180μm 내지 260μm, 4단계에서는 15μm 내지 120μm 크기의 모구를 확인할 수 있었다(도 5).
이 후, 초핑(chopping)된 모구를 튜브에 모으고 2200 rpm에서 5 분간 원심분리 한 후, 상층액은 버리고 pellet을 수집하여 35 mm cell culture dish에 1ml 의 Attachment media를 넣고 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 세포의 증식을 확인하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 따르면, 초핑(chopping) 범위에 따라 총 4단계로 나눠 세포의 증식 및 부착 형태를 확인해 본 결과 초핑(chopping)의 정도에 따라 세포의 부착 형태가 상이한 것을 확인할 수 있었다. 도 6의 좌측은 초핑(chopping) 후 부착한지 3일째 된 사진이고, 우측은 초핑(chopping) 후 부착한지 5일째 된 세포 사진이다. 배양 3일째 관찰한 결과 초핑(chopping)의 단계가 낮은 경우 세포배양접시(cell culture dish)의 바닥면에 세포들이 고르게 부착되지 못하고 뭉쳐 자라는 현상이 일어났다. 반면 초핑(chopping)의 단계가 높아질수록 세포배양접시(cell culture dish) 바닥면에 세포들이 일정한 간격으로 고르게 부착되어 자랐으며 양끝이 뾰족한 방추 형태로 증식되었다. 나아가, 배양 5일째에 관찰한 결과 초핑(chopping)의 단계가 낮은 상태의 경우 뭉쳐 자란 곳과 뭉치지 않은 곳에서의 세포 증식이 현저하게 차이가 났으며 세포가 군데군데 퍼져 자라는 경향을 보였으나, 초핑(chopping)의 단계가 높아질수록 세포배양접시(cell culture dish) 바닥면 전체에 고르게 세포가 가득차 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 초핑(chopping)의 단계에 따른 세포수득률에서도 차이를 나타내었는 바, 이를 하기 표 4에 나타내었다.
T25 cell culture dish 기준 세포 수득률
초핑(Chopping) 1 단계 1.0E+05
초핑(Chopping) 2 단계 1.3E+05
초핑(Chopping) 3 단계 2.5E+05
초핑(Chopping) 4 단계 2.8E+05
상기 표 4에 따르면, 초핑(chopping)의 정도에 따라 세포의 부착 형태뿐만 아니라 수득률에서도 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 초핑(chopping) 정도에 따라 세포가 세포배양접시(cell culture dish)에 부착되는 형태가 달라지며 세포 사이의 간격 및 증식되는 모양에 따라 수득률에 크게 영향을 미치는 것으로 보인다. 대략적으로 1~2단계 초핑(chopping) 정도에서는 콜로니(colony)를 형성하여 증식되고, 그로인해 세포가 퍼져 자라는 경향이 있어 1.0E+05 ~ 1.3E+05 수준의 세포수득율을 보이며, 3단계 초핑(chopping) 정도에서는 세포의 뭉침은 1~2단계 초핑(chopping) 보다는 덜 하지만 약간의 뭉침으로 인해 초기 부착시 세포의 퍼짐이 관찰되고, 4단계 초핑(chopping) 에서는 세포들이 초기부터 single 상태로 잘 부착하여 세포의 퍼짐이나 뭉침들은 전혀 관찰되지 않았으며 배양일수가 늘어남에 따라 세포배양접시(cell culture dish) 바닥 전체에 고르게 부착하여 증식되는 것을 관찰 할 수 있었고, 이로 인해 초핑(chopping) 1단계와 비교 했을 때 수득율이 약 2배 정도 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 15μm 이하로 초핑(chopping)을 실시한 경우에는 모구 내부의 모유두세포가 손상되어 세포수득률이 현저히 낮아지는 문제가 있었고, 120μm 이상으로 초핑(chopping)을 실시한 경우에는 상기 실험에서 확인한 바와 같이 세포의 뭉침현상이 발생하여 세포가 배양접시(culture dish) 바닥 전체에 고르게 분포되지 아니하는 결과 세포증식이 현저히 저하되는 문제가 있었는데, 이는 고르게 분포되는 세포들에 비하여 뭉쳐진 세포들은 영양분 흡수율이 저하되고, 세포밀도 상승에 기인한 외부스트레스 증가의 결과로 보인다.

Claims (5)

  1. (A) 두피조직으로부터 모구를 분리하는 단계;
    (B) 모구로부터 모유두세포를 분리하는 단계;
    (C) 계대배양하는 단계;를 포함하는 모유두세포의 분리 및 대량증식방법으로,
    상기 (B) 모구로부터 모유두세포를 분리하는 단계는,
    (b1) 세포배양접시(cell culture dish)에 분리배지(Dissection media) 및 모구를 넣은 후 정밀미세가위로 모구를 초핑(chopping)하는 단계;
    (b2) 초핑(chopping)된 모구를 튜브에 모으고 원심분리하는 단계;를 포함하고,
    상기 (b1) 단계에서 초핑(chopping)된 모구의 크기는 15μm 내지 120μm이고, 상기 (C) 계대배양하는 단계는 MEM alpha, Basic FGF, 10% Fetal bvine serum, Penicillin-Streptomycin 및 Amphotericin B를 포함하는 배지를 이용하여 3회 반복하는 것을 특징으로 하는 모유두세포의 분리 및 대량증식방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (A) 두피조직으로부터 모구를 분리하는 단계는,
    (a1) 멸균된 페트리 접시(petri dish)에 MEM alpha 배지를 피험자로부터 채취한 두피 조직이 잠기도록 채우는 단계;
    (a2) 페트리 접시(petri dish) 덮개에 MEM alpha 배지를 이용하여 드롭(drop)을 형성시키고, 미세수술용 가위와 포셉(forcep)을 이용하여 진피층의 모구를 하나씩 분리하여 준비한 드롭(drop)으로 이동시키는 단계;
    (a3) 드롭(drop)으로 이동된 모구를 실체현미경으로 관찰하며 시린지(syringe)와 미세수술용 포셉을 이용하여 모구 말단에 부착되어 있는 지방조직 및 모간(hair shaft)을 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 모유두세포의 분리 및 대량증식방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (C) 계대배양하는 단계는,
    (c1) 세포수에 따라 계대배양 할 배양접시(culture dish)를 결정한 후, 배양접시(culture dish)에 들어있던 배지를 버리고, PBS로 세척하는 단계;
    (c2) 0.25% Trypsin/EDTA을 처리하고 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 5분간 incubation 하는 단계;
    (c3) 1% FBS가 들어있는 MEM alpha 배지를 넣고 50ml centrifuge 튜브에 모은 후 원심분리 하는 단계;
    (c4) 상층액은 버리고 아래에 가라앉은 pellet을 tapping 한 후, MEM alpha, Basic FGF, 10% Fetal bovine serum, Penicillin-Streptomycin 및 Amphotericin B를 포함하는 Expansion Media 2를 넣고 세포수를 확인하는 단계;
    (c5) 계수된 세포수에 따라 1,500개/cm2가 되도록 다음 단계의 배양접시(culture dish)에 seeding 한 후, 37℃, 5% CO2 대량증식기에서 3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 배양접시(culture dish)가 세포로 가득 찰 때까지 증식시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 모유두세포의 분리 및 대량증식방법.


  5. 삭제
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