KR20200145851A - Pdgf를 함유하는 ds 세포용 무혈청배지 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는, DS 세포의 배양에 알맞은 무혈청 배지를 제공한다.
본 발명은, 진피 모근초(DS) 세포를 배양하기 위한 무혈청 배지로서, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지, 또는 PDGF를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지를 이용하는 DS 세포를 배양하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

PDGF를 함유하는 DS 세포용 무혈청배지{SERUM-FREE MEDIUM CONTAINING PDGF FOR DS CELLS}
본 발명은 진피 모근초(DS) 세포를 배양하기 위한 무혈청 배지로서, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지, 또는 PDGF를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지를 이용하는 DS 세포를 배양하기 위한 방법에 관한 것이다.
모발은 미적 외관상 매우 중요시된다. 따라서, 선천적 또는 후천적 요인에 의한 탈모 또는 박모는 많은 사람들에게 있어서 심각한 고민이다. 특히 고령화 사회, 스트레스 사회라고 불리는 현대 사회에서는, 두부 모발이 여러가지 후천적인 원인에 의해, 탈모의 위기에 노출되는 기회가 점점 더 많아지고 있다. 이에 대응하여, 탈모증이나 박모로 고민하는 사람들에게, 안전 또한 유효하게 모포를 재생하기 위한 미용적 또는 의료적인 방법을 제공하기 위해, 여러가지 시도가 이루어지고 있다.
모포는 성숙한 생체로 자기 재생을 거의 한평생에 걸쳐 반복하는 예외적인 기관이다. 그 자기 재생의 구조를 해명하는 것은, 조직이나 세포 이식에 의한 탈모 치료, 모포나 피지선을 함유하는 자연에 가까운 기능적으로도 우수한 피부 시트의 구축 등, 요구가 높은 임상 응용에 연결될 것으로 기대된다. 최근, 간세포 연구에의 관심의 고조와 함께 모포 상피 간세포(상피 세포)의 연구가 급속하게 진전하고, 또한 모포 특이적인 간엽계 세포인 모유두 세포에 대해서도 그 성질을 조금씩 알 수 있게 되었다. 모유두 세포는 모포의 자기 재생을 위해 모포 상피 간세포에 활성화 시그널을 보내는 말하자면 사령탑의 역할을 담당하며，모포 재구성 평가계에 있어서는 모포 상피 간세포와 함께 빠뜨릴 수 없는 세포인 것이 알려져 있다(Kishimoto et al., Proc. Natl. AcaDSci. USA(1999), Vol.96, pp.7336-7341; 비특허문헌 1).
모유두(DP: dermal papilla) 및 모포의 주위를 에워싸는 진피 모근초(DS: dermal sheath)는, 모두, 모포의 대부분을 구성하는 상피계 세포와는 다르게, 간엽계 유래의 세포군으로 구성된다. DS 세포에 대해서, 모포 형성에 대한 중요성을 시사하는 지견이, 최근, 다수 보고되어 있다. 모유두 래트 수염의 모구부 절단 모포 이식 실험에 있어서는, DS 세포로부터 DP 세포가 재생되는 것과, 마우스로, 하반부를 절단한 모포의 DS 세포를 이식함으로써, 모포 재생이 유도되는 것도 보고되어 있다. 또한, Jahoda 등(Development. 1992 Apr: 114(4): 887-97; 비특허문헌 2)은, DS 세포를 인간에게 이식함으로써, 모포의 재구축을 유도할 수 있는 것도 보고하고 있다(Horne KA and Jahoda CA. Development. 1992 Nov: 116(3): 563-71; 비특허문헌 3). 또한, Tobin, Paus 등의 그룹은, 마우스 모주기에 있어서, DS 세포와 DP 세포 사이의 세포의 이동이 일어나, 발모기에 있어서 증식을 개시하는 DP 세포에 앞서 DS 세포의 증식이 개시하는 것을 보고하고 있다(Tobin DJ et al., J. Invest. Dermatol., 120: 895-904, 2003; 비특허문헌 4).
이와 같이, DS 세포는 모포 형성에 대하여 중요한 역할을 달성하고 있을 가능성이 높지만, 그 작용 메커니즘에 대해서는 충분히 판명되어 있지 않다. 모포 형성에의 작용 메커니즘을 밝히기 위해서는, DS 세포를 대량으로 입수할 필요가 있지만, 생체 조직으로부터 채취할 수 있는 세포의 수는 적기 때문에, 이들 세포를 생체 밖에서 배양하여 효율적으로 증식시키는 것이 필요하다. 일반적으로, DS 세포를 배양하기 위해서는, 세포의 증식이나 배양 용기의 접착을 재촉하는 혈청이 첨가된 배지가 이용되지만, 이러한 조건에서는, 항원성의 변화나 병원체 혼입의 가능성이 존재하고, 또한, 혈청 중의 상세 불명한 미량 성분에 기인하는 실험 결과의 변동이 생길 우려가 있기 때문에, 재생 의료에의 임상 응용이나, 신약 개발·독성 시험 등에의 응용에는 부적당하다.
최근, 재생 의료에의 관심의 고조에 따라, 여러가지 간엽계 간세포의 배양 방법이나 배지의 개발이 행해지고 있지만(예컨대, 일본 특허 공개 제2006-311814호 공보; 특허문헌 1, 일본 특허 공개 제2006-325445호 공보; 특허문헌 2, 일본 특허 공개 제2005-151237호 공보; 특허문헌 3을 참조), DS 세포를 배양하기 위한, 혈소판 유래 증식 인자(PDGF)를 함유하는 무혈청 배지에 대해서는, 지금까지 알려져 있지 않다.
일본 특허 공개 제2006-311814호 공보 일본 특허 공개 제2006-325445호 공보 일본 특허 공개 제2005-151237호 공보 일본 특허 공개 평성7-274950호 공보
Kishimoto et al., Proc. Natl. AcaDSci. USA(1999), Vol.96, pp.7336-7341 Jahoda CA et al., Development. 1992 Apr; 114(4): 887-97. Horne KA and Jahoda CA. Development. 1992 Nov; 116(3): 563-71. Tobin DJ et al., J. Invest. Dermatol., 120: 895-904, 2003 Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan.2004
본 발명의 과제는, DS 세포의 배양에 알맞은 무혈청 배지를 제공하는 것에 있다.
본 발명자는, PDGF, 특히 PDGF-BB를 첨가한 무혈청 배지로 배양함으로써, DS 세포를 유의하게 증식시킬 수 있다고 하는 놀라운 지견을 얻었다.
따라서, 본원은 이하의 발명을 포함한다:
[1] 진피 모근초(DS) 세포를 배양하기 위한 무혈청 배지로서, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지.
[2] 상기 PDGF는 PDGF-BB인 [1]에 기재된 무혈청 배지.
[3] 상기 진피 모근초(DS) 세포는 진피 모근초 컵(DSC) 영역에서 유래하는 것인 [1] 또는 [2]에 기재된 무혈청 배지.
[4] 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지를 이용하는, 진피 모근초(DS) 세포를 배양하기 위한 방법.
[5] 상기 PDGF는 PDGF-BB인 [4]에 기재된 방법.
[6] 상기 진피 모근초(DS) 세포는 진피 모근초 컵(DSC) 영역에서 유래하는 것인 [4] 또는 [5]에 기재된 방법.
본 발명의 무혈청 배지에 의해, 재생 의료에의 임상 응용이나, 신약 개발·독성 시험 등에의 응용에 알맞은 DS 세포를 효율적으로 배양할 수 있다.
도 1은 무혈청 배지로서, 1) HFDM-1(-) 배지, 2) HFDM-1(+) 배지, 3) PDGF-AA(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지 및 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지를 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 2일째 및 10일째에 있어서의 현미경 사진이다.
도 2는 무혈청 배지로서, 1) HFDM-1(-) 배지, 2) HFDM-1(+) 배지, 3) PDGF-AA(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지 및 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지를 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 세포수 변화(2일째, 5일째, 10일째)를 나타내는 그래프이다.
도 3은 무혈청 배지로서, 1) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 3) Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+, BD), 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+, BD)을 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 2일째 및 7일째에 있어서의 현미경 사진이다.
도 4는 무혈청 배지로서, 1) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 3) Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+, BD), 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+, BD)을 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 세포수 변화(2일째, 7일째)를 나타내는 그래프이다.
도 5는 무혈청 배지로서, 1) HFDM-1(-) 배지, 2) HFDM-1(+) 배지, 3) PDGF-AA(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지 및 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지를 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 2일째 및 7일째에 있어서의 현미경 사진이다.
도 6은 무혈청 배지로서, 1) HFDM-1(-) 배지, 2) HFDM-1(+) 배지, 3) PDGF-AA(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지 및 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지를 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 세포수 변화(2일째, 4일째, 7일째)를 나타내는 그래프이다.
도 7은 무혈청 배지로서, 1) StemProSFM CTS(sup-, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup-, Lifetechnologies), 3) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies)를 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 2일째 및 7일째에 있어서의 현미경 사진이다.
도 8은 무혈청 배지로서, 1) StemProSFM CTS(sup-, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup-, Lifetechnologies), 3) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies)를 이용하여 배양한 인간 DS 세포의 세포수 변화(2일째, 4일째, 7일째)를 나타내는 그래프이다.
도 9는 무혈청 배지로서, 1) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies)를 이용하여 배양한 인간 피부 섬유아 세포의 2일째 및 7일째에 있어서의 현미경 사진이다.
도 10은 무혈청 배지로서, 1) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies)를 이용하여 배양한 인간 피부 섬유아 세포의 세포수 변화(2일째, 7일째)를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 진피 모근초(DS) 세포를 배양하기 위한 무혈청 배지로서, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 특히 PDGF-BB를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지, 또는, 이러한 무혈청 배지를 이용한 DS 세포의 배양 방법을 제공한다.
진피 모근초(DS) 세포는, 진피 모근초에 존재하는 세포이며, 간엽계 세포의 일종이다. 진피 모근초(DS; Dermal seath)는, 결합 조직성 모초나 결합 조직초라고도 불리는 경우도 있으며, 상피성의 외모근초를 에워싸는 진피성의 조직이다. DS 세포는, 모유두(DP; hair papilla) 세포와 마찬가지로 간엽계 세포로 분류되고, DP 세포는 DS 세포에서 유래하는 것으로 되어 있다. 그 중에서도, 발모기에서의 DP 세포의 증식에 앞서, 진피 모근초(DS) 중 특히 모유두에 가까운 기저 부위인 진피 모근초 컵(DSC) 영역에서 유래하는 세포가 증식함으로써, DS 세포, 특히 DSC 영역에서 유래하는 세포(DSC 세포라고도 칭함)가 DP 세포를 공급한다고 생각되고 있다(Tobin DJ et al., J. Invest. Dermatol., 120: 895-904, 2003; 비특허문헌 4). 진피 모근초, 특히 DSC 영역은, 헤테로인 세포군으로 구성되어 있고, 모주기의 휴지기부터 성장기 사이에 분열과 이동에 따라 하강하며, 그 일부가 모유두 DP로 분화하여, 모의 신장이 개시된다고 생각되고 있다.
본 발명의 DS 세포는, 모든 포유 동물, 예컨대 인간, 침팬지, 그 외의 영장류, 가축 동물, 예컨대 개, 고양이, 토끼, 말, 양, 염소, 소, 돼지, 그 외에 실험용 동물, 예컨대 래트, 마우스, 모르모트, 보다 바람직하게는 누드 마우스, 스키드 마우스, 누드 래트의 표피에서 유래할 수 있지만, 인간에의 이식이나, 연구용의 3차원 모델의 제조의 관점에서, 인간 유래의 세포가 바람직하다. 또한, 그 표피 부위는 유모 부위, 예컨대 두피여도 좋고, 무모 부위, 예컨대 포피여도 좋다.
또한, DS 세포는, 상기 포유 동물의 조직으로부터 초대 배양에 의해 취득된 세포여도 좋고, 계대 배양에 의해 취득된 세포여도 좋으며, 또한, 체성 간세포, iPS 세포 및 ES 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 세포여도 좋다. 이식을 행하는 관점에서는, 이식 대상으로부터 취득한 세포를 계대 배양에 의해 증식시킨 세포가 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용할 수 있는 기초 배지는, 인간이나 동물의 세포의 배양에 이용되는 무혈청 배지이면 특별히 제한되지 않는다. 다양한 종류의 무혈청 배지가 시판되어 있고, 예컨대, HFDM-1(+)(사이보카가쿠켄큐쇼), HFDM-1(-)(사이보카가쿠켄큐쇼), StemPro MSC SFM CTS(sup+)(Lifetechnologies), StemPro MSC SFM CTS(sup-)(Lifetechnologies), Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+)(BD) 등을 들 수 있다. 이들 시판 배지의 조성으로서, HFDM-1(-)는, 기초 배지 RITC80-7, 인슐린 5 ㎍/㎖, 덱사메타손 10-7 M을 함유하고 있고, HFDM-1(+)는, 이들에 더하여, EGF 10 ng/㎖를 함유하는 것이 알려져 있다.
본 발명의 무혈청 배지는, DS 세포의 증식 인자로서, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함한다. PDGF는, 주로 간엽계 세포(선유아 세포, 평활근 세포, 글리아 세포 등)의 유주나 증식 등의 조절에 관여하는 증식 인자이며, PDGF/VEGF 패밀리에 속한다. 주로 거핵구에 의해 산생되는 것 외에, 혈소판의 α 과립 중에도 포함되며, 상피 세포나 내피 세포 등의 여러가지 세포에 의해 산생되는 것이 알려져 있다. PDGF는, A쇄, B쇄, C쇄 및 D쇄에 의해, PDGF-A, B, C 및 D 중 적어도 4종류가 존재하고 있다. 이들은 모두, 호모 다이머 또는 헤테로 다이머를 형성하며, PDGF-AA, -AB, -BB, -CC, -DD의 5종류의 아이소폼이 존재하는 것이 알려져 있다. 이들 중, PDGF-BB가 특히 바람직하다.
기초 배지에 첨가되는 PDGF의 첨가량은 특별히 제한되는 것이 아니지만, 예컨대 0.01 ng/㎖∼10 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.1 ng/㎖∼100 ng/㎖, 보다 바람직하게는 1 ng/㎖∼10 ng/㎖ 정도이다.
본 발명의 무혈청 배지에는, Wnt 시그널 활성화제를 첨가하여도 좋다. Wnt 시그널이란, β-카테닌의 핵 이행을 재촉하여, 전사 인자로서의 기능을 발휘하는 일련의 작용을 말한다. 본 시그널은 세포간 상호 작용에 기인하며, 예컨대, 어떤 세포로부터 분비된 Wnt3A라고 하는 단백이 또 다른 세포에 작용하여, 세포 내의 β-카테닌이 핵 이행하여, 전사 인자로서 작용하는 일련의 흐름이 포함된다. 일련의 흐름은 상피 간엽 상호 작용을 예로 하는 기관 구축의 최초의 현상을 야기한다. Wnt 시그널은 β-카테닌 경로, PCP 경로, Ca2+ 경로의 3가지 경로를 활성화함으로써, 세포의 증식이나 분화, 기관 형성이나 초기 발생 시의 세포 운동 등 각종 세포 기능을 제어함으로써 알려진다. Wnt 시그널이 갖는 그 미분화 상태 유지 기능에 의해, 분화를 억제할 목적으로 ES 세포의 배양 시에 이용되고 있다(예컨대, Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan.2004; 비특허문헌 5).
Wnt 시그널 활성화제로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 글리코겐신타아제키나아제-3(GSK-3)의 저해 활성을 나타내는 것이면 어떠한 것이어도 좋고, 예컨대 비스-인돌로(인디루빈) 화합물(BIO)((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), 그 아세톡심 유사체(BIO-아세톡심)((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심), 티아디아졸리딘(TDZD) 유사체(4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), 옥소티아디아졸리딘-3-티온 유사체(2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온), 티에닐α-클로로메틸케톤 화합물(2-클로로-1-(4,4-디브로모-티오펜-2-일)-에탄올), 페닐α브로모메틸케톤 화합물(α-4-디브로모아세토페논), 티아졸 함유 요소 화합물(N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)유레아)이나 GSK-3β 펩티드 저해제, 예컨대 H-KEAPPAPPQSpP-NH2, 또한 염화리튬 등을 들 수 있다.
Wnt 시그널 활성화제의 첨가량은 특별히 제한되는 것이 아니며, Wnt 시그널 활성화, 바꾸어 말하면, GSK-3의 저해가 발휘되고, 또한 세포 증식이 정지하지 않는 양이면 좋으며, 사용하는 약제의 종류 및 증식하여야 하는 세포의 종류에 의존하여, 당업자에 의해 적절하게 결정될 것이다. 예컨대, Wnt 시그널 활성화제로서 BIO를 DS 세포에 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.01 μM∼100 μM, 바람직하게는 0.1 μM∼10 μM, 보다 바람직하게는 10 μM 정도이다.
또한, 본 발명의 무혈청 배지에는, 필요에 따라 그 외의 세포 증식 인자, 호르몬이나 그 외의 미량 영양소를 부가할 수 있다. 이들의 구체적인 것으로서, 예컨대, 상피 증식 인자(EGF), 종양 괴사 인자 α(TNFα), 간세포 증식 인자(HGF), 선유아 세포 증식 인자 7(FGF7), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 염기성 선유아 세포 증식 인자(bFGF), 트랜스포밍 증식 인자 β1,2,3(TGFβ1,2,3), 골형성 인자(BMP) 또는 인슐린 유사 성장 인자-1,2(IGF-1,2)를 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.1 ㎍/㎖∼100 ㎍/㎖ 정도이다. 인지질(예컨대, 포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨, 에탄올아민)을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.1 ㎍/㎖∼100 ㎍/㎖ 정도이다. 지방산(예컨대, 리놀레산, 올레인산, 아라키돈산)을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.001 ㎍/㎖ ∼100 ㎍/㎖ 정도이다. 프로스타글란딘류를 사용하는 경우, 그 양은 0.1 ng/㎖ ∼ 100 ng/㎖ 정도이다. 환원제(예컨대, 아스코르빈산, 환원형 글루타치온)을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 1 ㎍/㎖∼100 ㎍/㎖ 정도이다. 머캅토에탄올을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.1 ㎍/㎖∼100 ㎍/㎖ 정도이다. 트랜스페린 또는 인슐린을 사용하는 경우, 그 양은 0.01 ㎍/㎖∼100 ㎍/㎖ 정도이다. 덱사메타손을 사용하는 경우, 그 양은 0.000001 μM∼0.1 μM 정도이다. 트리요오드티로닌을 사용하는 경우, 그 양은 0.1 pM∼100 pM 정도이다. 글루카곤을 사용하는 경우, 그 양은 0.0001 μM∼0.1 μM 정도이다. 콜레스테롤을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.1 ㎍/㎖∼100 ㎍/㎖ 정도이다. 하이드로 코르티손을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.01 ㎍/㎖∼10 ㎍/㎖ 정도이다. 테스토스테론을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.1 μM∼100 μM 정도이다. 에스트라디올 또는 프로게스테론을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.01 ng/㎖∼100 ng/㎖ 정도이다. 미량 원소(예컨대, 구리, 아연, 코발트, 망간, 몰리브덴, 셀레늄)를 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.000001 mg/㎖∼0.1 mg/㎖ 정도이다. 알부민, 파이브로넥틴 또는 비트로넥틴을 사용하는 경우, 그 양은, 예컨대 0.1 ㎍/㎖∼1000 ㎍/㎖ 정도이다.
이러한 무혈청 배지로의 DS 세포의 배양은, 통상, 배양 접시를 이용하여, 5％ CO2 분위기 하, 37℃의 인큐베이터 내에 정치하여 행하고, 아웃 그로스(out growth)가 확인되었다면, 배지를 교환하여 더욱 배양을 계속함(계대 배양)으로써 실시한다. 이렇게 하여 얻어지는 배양 세포는 필요한 계대수에 걸쳐, 더욱 계대 배양을 행한다. 계대는 DS 세포가 원하는 양이 달성될 때까지 행할 수 있고, 예컨대 10회 이상의 계대, 소망량이 많은 경우는 바람직하게는 15회 이상, 더욱 바람직하게는 20회 이상까지 계대를 행할 수 있다.
바람직하게는, 이와 같이 하여 배양한 DS 세포를 스피어 형성시킨다(일본 특허 공개 평성7-274950호 공보; 특허문헌 4). 스피어 형성은, 포화 상태가 될 때까지 세포를 증식시켜, 세포를 박리한 후, 배지로 현탁시키고, 이 세포 현탁물을 비접착 처리한 배양 접시 중의 배지 상에 말아, 수일 방치함으로써 둥근 세포 덩어리(스페로이드)의 세포 집합체를 형성함으로써 행한다. 바람직하게는, 스피어 형성은 bFGF의 비존재 하에서 행하지만, bFGF 존재 하에서도 충분히 스피어 형성이 달성된다. 또한, 스피어 형성을 행하는 시기는 특별히 제한되는 것이 아니며, 최후의 계대를 끝낸 배양 세포에 대하여 행하여도 좋다. 스페로이드를 형성시키는 배양법으로서, 롤러 보틀 배양, 스피너 플라스크 배양, 현적 배양 등이 알려져 있고, 또한, 오목부를 갖는 배양 용기나, 세포 접착성이 낮은 코팅이 실시된 배양 용기가 시판되어 있다. 또한, 세포 접착성 영역과 세포 비접착성 영역이 공존하도록 코팅이 되며, 세포 비접착성 영역으로서, 포스포릴콜린(PC)기 코팅을 이용한 배양 용기를 이용하여 배양을 행함으로써, 사이즈가 정돈된 스페로이드를 대량으로 형성하는 것이 가능하게 되었다.
이와 같이 하여 조제한 스피어화한 DS 세포는, 모포 유도능을 유지하고 있으며, 따라서, 모포의 재구성의 메커니즘의 해명을 위해 연구의 in vitro 실험이나, 모재생 의료 등을 위해 이용할 수 있다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예
예 1. 무혈청 배지(HFDM-1)를 이용한 DS 세포(컵 영역)의 증식에 대해서
12웰 플레이트(BD)를 CELLStartTM(Lifetechnologies)로 코팅하고, 동결 보존한 DS 세포(21세 남성 두피 유래, DSC, 계대수 0)를, 상기 플레이트에 1웰당 4×104 세포를 1 ㎖의 무혈청 배지에 현탁하여, 파종하였다. 무혈청 배지로서는, 1) HFDM-1(-) 배지(사이보카가쿠켄큐쇼), 2) HFDM-1(+) 배지(사이보카가쿠켄큐쇼), 3) PDGF-AA(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지 및 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지를 이용하였다. 5％ 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 2일째, 5일째, 10일째에 세포를 현미경 관찰하여(도 1: 40배), 1시야당의 세포수를 계측하였다(도 2).
예 2. 무혈청 배지(StemProSFM CTS/Mosaic hMSC SF Culture)를 이용한 DS 세포(컵 영역)의 증식에 대해서
12웰 플레이트(BD)를 CELLStartTM(Lifetechnologies)로 코팅하고, 동결 보존한 DS 세포(50세 남성 두피 유래, DSC, 계대수 0)를, 상기 플레이트에 1웰당 4×104 세포를 1 ㎖의 무혈청 배지에 현탁하여, 파종하였다. 무혈청 배지로서는, 1) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 3) Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+, BD), 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+, BD)을 이용하였다. 5％ 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 2일째, 7일째에 세포를 현미경 관찰하여(도 3: 40배), 1시야당의 세포수를 계측하였다(도 4).
예 3. 무혈청 배지(HFDM-1)를 이용한 DS 세포의 증식에 대해서
12웰 플레이트(BD)를 CELLStartTM(Lifetechnologies)로 코팅하고, 동결 보존한 DS 세포(43세 남성 두피 유래, DS, 계대수 0)를, 상기 플레이트에 1웰당 4×104 세포를 1 ㎖의 무혈청 배지에 현탁하여, 파종하였다. 무혈청 배지로서는, 1) HFDM-1(-) 배지(사이보카가쿠켄큐쇼), 2) HFDM-1(+) 배지(사이보카가쿠켄큐쇼), 3) PDGF-AA(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지 및 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 HFDM-1(-) 배지를 이용하였다. 5％ 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 2일째, 4일째, 7일째에 세포를 현미경 관찰하여(도 5: 40배; 4일째에 대해서는 나타내고 있지 않음), 1시야당의 세포수를 계측하였다(도 6).
예 4. 무혈청 배지(StemProSFM CTS sup+/StemProSFM CTS sup-)를 이용한 DS 세포의 증식에 대해서
12웰 플레이트(BD)를 CELLStartTM(Lifetechnologies)로 코팅하고, 동결 보존한 DS 세포(43세 남성 두피 유래, DS, 계대수 0)를, 상기 플레이트에 1웰당 4×104 세포를 1 ㎖의 무혈청 배지에 현탁하여, 파종하였다. 무혈청 배지로서는, 1) StemProSFM CTS(sup-, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup-, Lifetechnologies), 3) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 4) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies)를 이용하였다. 5％ 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 2일째, 4일째, 7일째에 세포를 현미경 관찰하여(도 7: 40배; 4일째에 대해서는 나타내고 있지 않음), 1시야당의 세포수를 계측하였다(도 8).
예 5. 무혈청 배지(StemProSFM CTS sup+)를 이용한 섬유아 세포의 증식에 대해서
12웰 플레이트(BD)를 CELLStartTM(Lifetechnologies)로 코팅하고, 동결 보존한 인간 피부 섬유아 세포를, 상기 플레이트에 1웰당 4×104 세포를 1 ㎖의 무혈청 배지에 현탁하여, 파종하였다. 무혈청 배지로서는, 1) StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies), 2) PDGF-BB(10 ng/㎖)를 용해시킨 StemProSFM CTS(sup+, Lifetechnologies)를 이용하였다. 5％ 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 2일째, 7일째에 세포를 현미경 관찰하여(도 9: 40배), 1시야당의 세포수를 계측하였다(도 10).

Claims (1)

  1. 진피 모근초(DS) 세포를 배양하기 위한 무혈청 배지로서, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함하여 이루어지는 무혈청 배지.
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