CN105452441A - 含有pdgf的ds细胞用无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

提供适合DS细胞的培养的无血清培养基。本发明涉及用于培养真皮鞘(DS)细胞的、包含血小板衍生生长因子(PDGF)的无血清培养基，或使用了包含PDGF的无血清培养基的、用于培养DS细胞的方法。

Description

含有PDGF的DS细胞用无血清培养基
技术领域
本发明涉及用于培养真皮鞘(DS)细胞的、包含血小板衍生生长因子(PDGF)的无血清培养基，或使用了包含PDGF的无血清培养基的、用于培养DS细胞的方法。
背景技术
在美丽的外观方面，毛发极为受到重视。因此，先天或后天因素造成的脱发或头发稀少对许多人来说是深刻的苦恼。特别是在被称为高龄化社会、压力社会的现代社会，头部毛发由于各种各样的后天原因而暴露于脱发危机的机会越来越多。与此相应地，为了给苦于脱发症、头发稀少的人们提供安全且有效地用于再生毛囊的美容或医疗的方法，进行了各种尝试。
毛囊是成熟的生物体在几乎整个生涯中反复自身再生的例外器官。阐明其自身再生的机制，作为与通过组织、细胞移植进行的脱发治疗、含有毛囊、皮脂腺的自然上接近且功能也优异的皮肤片的构建等需求高的临床应用相联系的研究而被期待。近年，随着对干细胞研究的关注提高，毛囊上皮干细胞(上皮细胞)的研究迅速发展，另外对于作为毛囊特异性间充质系细胞的毛乳头细胞，其性质也渐渐被判明。已判明毛乳头细胞承担为了毛囊的自身再生而向毛囊上皮干细胞送出激活信号的所谓司令塔的作用，在毛囊再构成评价体系中与毛囊上皮干细胞都是不可缺少的细胞(Kishimoto等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),Vol.96,pp.7336-7341；非专利文献1)。
毛乳头(DP:dermalpapilla)、以及包围毛囊的周围的真皮鞘(DS:dermalsheath)均与构成毛囊的大部分的上皮系细胞不同，由来源于间充质系的细胞群构成。关于DS细胞，近年来大量报告了暗示其对毛囊形成的重要性的知识。还报告了在毛乳头大鼠胡须的毛球部切断毛囊移植实验中由DS细胞再生DP细胞，在小鼠中通过移植切断了下半部分的毛囊的DS细胞能诱导毛囊再生。另外、Jahoda等(Development.1992Apr:114(4):887-97；非专利文献2)还报告了通过将DS细胞移植到人能够诱导毛囊的再构建(HorneKA和JahodaCA.,Development.1992Nov:116(3):563-71；非专利文献3)。进而Tobin、Paus等的课题组报告了在小鼠毛发周期中DS细胞与DP细胞之间发生细胞移动，在生毛期开始增殖的DP细胞之前，DS细胞就已经开始增殖(TobinDJ等,J.Invest.Dermatol.,120:895-904,2003；非专利文献4)。
这样，虽然DS细胞很可能对毛囊形成发挥重要作用，但关于其作用机理尚未充分判明。为了弄清楚对毛囊形成的作用机理，需要大量获得DS细胞，但由于能够从生物体组织采集的细胞的数量少，因此需要将这些细胞在生物体外培养并使其高效地增殖。一般地，为了培养DS细胞，使用添加了促进细胞增殖、与培养容器的粘附的血清的培养基，但在这样的条件下，可能抗原性发生变化、混入病原体，另外，还可能由于血清中的详细情况不明的微量成分而造成实验结果的偏差，因而不适合向再生医疗的临床应用、向制药·毒性试验等的应用。
近年，随着对再生医疗的关注的提高，进行了各种间充质系干细胞的培养方法、培养基的开发(参照例如日本特开2006-311814号公报(专利文献1)、日本特开2006-325445号公报(专利文献2)、日本特开2005-151237号公报(专利文献3))，但是关于用于培养DS细胞的、含有血小板衍生生长因子(PDGF)的无血清培养基尚不为人们所知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-311814号公报
专利文献2：日本特开2006-325445号公报
专利文献3：日本特开2005-151237号公报
专利文献4：日本特开平7-274950号公报
非专利文献
非专利文献1：Kishimoto等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),Vol.96,pp.7336-7341
非专利文献2：JahodaCA等,Development.1992Apr；114(4):887-97.
非专利文献3：HorneKA和JahodaCA.,Development.1992Nov；116(3):563-71.
非专利文献4：TobinDJ等,J.Invest.Dermatol.,120:895-904,2003
非专利文献5：NoburoSato等,NatureMedicineVol.10,No.1,Jan.2004.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题是提供适合DS细胞的培养的无血清培养基。
用于解决课题的技术方案
本发明者获得了通过用添加了PDGF、特别是PDGF-BB的无血清培养基进行培养，能够使DS细胞有意义地增殖这样的令人惊讶的知识。
因此，本申请包含以下发明：
[1]一种无血清培养基，是用于培养真皮鞘(DS)细胞的无血清培养基，包含血小板衍生生长因子(PDGF)。
[2]根据[1]所述的无血清培养基，所述PDGF是PDGF-BB。
[3]根据[1]或[2]所述的无血清培养基，所述真皮鞘(DS)细胞来源于真皮鞘杯(DSC)区域。
[4]一种用于培养真皮鞘(DS)细胞的方法，使用了包含血小板衍生生长因子(PDGF)的无血清培养基。
[5]根据[4]所述的方法，所述PDGF是PDGF-BB。
[6]根据[4]或[5]所述的方法，所述真皮鞘(DS)细胞来源于真皮鞘杯(DSC)区域。
发明的效果
通过本发明的无血清培养基，能够高效地培养适合向再生医疗的临床应用、向制药·毒性试验等的应用的DS细胞。
附图说明
图1是使用1)HFDM-1(-)培养基、2)HFDM-1(+)培养基、3)溶解了PDGF-AA(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基、和4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的第2天和第10天的显微镜照片。
图2是显示使用1)HFDM-1(-)培养基、2)HFDM-1(+)培养基、3)溶解了PDGF-AA(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基、和4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的细胞数变化(第2、5、10天)的曲线图。
图3是使用1)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、3)MosaichMSCSFCultureMedium(sup+,BD)、4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的MosaichMSCSFCultureMedium(sup+,BD)作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的第2天和第7天的显微镜照片。
图4是显示使用1)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、3)MosaichMSCSFCultureMedium(sup+,BD)、4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的MosaichMSCSFCultureMedium(sup+,BD)作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的细胞数变化(第2、7天)的曲线图。
图5是使用1)HFDM-1(-)培养基、2)HFDM-1(+)培养基、3)溶解了PDGF-AA(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基、和4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的HFDM-1(-)作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的第2天和第7天的显微镜照片。
图6是显示使用1)HFDM-1(-)培养基、2)HFDM-1(+)培养基、3)溶解了PDGF-AA(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基、和4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的HFDM-1(-)作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的细胞数变化(第2、4、7天)的曲线图。
图7是使用1)StemProSFMCTS(sup-,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup-,Lifetechnologies)、3)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的第2天和第7天的显微镜照片。
图8是显示使用1)StemProSFMCTS(sup-,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup-,Lifetechnologies)、3)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)作为无血清培养基进行了培养的人DS细胞的细胞数变化(第2、4、7天)的曲线图。
图9是使用1)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)作为无血清培养基进行了培养的人皮肤成纤维细胞的第2天和第7天的显微镜照片。
图10是显示使用1)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)作为无血清培养基进行了培养的人皮肤成纤维细胞的细胞数变化(第2、7天)的曲线图。
本发明提供用于培养真皮鞘(DS)细胞的、包含血小板衍生生长因子(PDGF)、特别是PDGF-BB的无血清培养基，或者使用了该无血清培养基的DS细胞的培养方法。
真皮鞘(DS)细胞存在于真皮鞘中的细胞，是间充质系细胞的一种。真皮鞘(DS；Dermalseath)有时也成为结缔组织性毛鞘、结缔组织鞘，是包围上皮性的外毛根鞘的真皮性的组织。DS细胞与毛乳头(DP；hairpapilla)细胞同样地被分类为间充质系细胞，DP细胞被认为来源于DS细胞。其中，特别是由于在生毛期DP细胞增殖之前，来源于真皮鞘(DS)中的特别是作为靠近毛乳头的基底部位的真皮鞘杯(DSC)区域的细胞增殖，因而认为来源于DS细胞、特别是DSC区域的细胞(也称为DSC细胞)供应DP细胞(TobinDJ等,J.Invest.Dermatol.,120:895-904,2003；非专利文献4)。认为真皮鞘、特别是DSC区域由异种的细胞群构成，在毛发周期的休止期到生长期期间随着分裂和移动而下降，其一部分分化成毛乳头DP，从而毛发的增长开始。
本发明的DS细胞可以来源于所有哺乳动物的表皮，所述所有哺乳动物例如人、黑猩猩、其他灵长类、家畜动物、例如狗、猫、兔、马、绵羊、山羊、牛、猪、以及实验用动物、例如大鼠、小鼠、豚鼠、更优选裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠，从对人移植、制造研究用的三维模型的观点出发，优选来源于人的细胞。另外，其表皮部位可以是有毛发部位、例如头皮，也可以是无毛发部位、例如包皮。
另外，DS细胞可以是从上述哺乳动物的组织通过原代培养获得的细胞，也可以是通过传代培养获得的细胞，另外还可以是从体性干细胞、iPS细胞和ES细胞分化诱导而得的细胞。从进行移植的观点出发，优选通过传代培养使从移植对象获得的细胞增殖而得的细胞。
作为能够在本发明中使用的基础培养基只要是用于人、动物的细胞的培养的无血清培养基就不特别限制。市售有多种无血清培养基，可列举例如，HFDM-1(+)(细胞科学研究所)、HFDM-1(-)(细胞科学研究所)、StemProMSCSFMCTS(sup+)(Lifetechnologies)、StemProMSCSFMCTS(sup-)(Lifetechnologies)、MosaichMSCSFCultureMedium(sup+)(BD)等。作为这些市售培养基的组成，已知HFDM-1(-)含有基础培养基RITC80-7、胰岛素5μg/ml、地塞米松10-7M，HFDM-1(+)除此以外还含有EGF10ng/ml。
本发明的无血清培养基包含血小板衍生生长因子(PDGF)作为DS细胞的增殖因子。PDGF是主要参与间充质系细胞(成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等)的迁移、增殖等的调节的增殖因子，属于PDGF/VEGF家族。已知主要由巨核细胞产生，此外在血小板的α颗粒中也包含，还由上皮细胞、内皮细胞等各种细胞产生。PDGF通过A链、B链、C链和D链，而存在PDGF-A、B、C和D的至少4种。已知它们均形成同源二聚体或异源二聚体，存在PDGF-AA、-AB、-BB、-CC、-DD的5种同种型。其中，特别优选PDGF-BB。
对添加于基础培养基中的PDGF的添加量不特别限制，例如为0.01ng/ml～10μg/ml，优选为0.1ng/ml～100ng/ml，更优选为1～10ng/ml左右。
本发明的无血清培养基中可以添加Wnt信号激活剂。所谓Wnt信号，是指促进β-联蛋白的核转运、发挥作为转录因子的功能的一系列作用。本信号起因于细胞间相互作用，包括例如，从某细胞分泌的称为Wnt3A的蛋白质进一步作用于别的细胞，细胞内的β-联蛋白进行核转运，作为转录因子发挥作用的一系列流程。一系列流程引起以上皮间充质相互作用为例的器官构建的最初现象。已知Wnt信号通过激活β-联蛋白途径、PCP途径、Ca2+途径三个途径，来控制细胞的增殖、分化、器官形成、早期发育时的细胞运动等各种细胞功能。由于Wnt信号所具有的该未分化状态维持功能，可以为了抑制分化而在培养ES细胞时利用(例如，NoburoSato等,NatureMedicineVol.10,No.1,Jan.2004；非专利文献5)。
作为Wnt信号激活剂，不特别限定，只要显示糖原合成酶激酶3(GSK-3)的抑制活性，则可以是任何物质，可列举例如，双吲哚(靛玉红)化合物(BIO)((2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)、其丙酮肟类似物BIO-丙酮肟((2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-丙酮肟)、噻二唑烷(TDZD)类似物(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)、氧代噻二唑烷-3-硫酮类似物(2,4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮)、噻吩基-α-氯甲基酮化合物(2-氯-1-(4,4-二溴噻吩-2-基)-乙酮)、苯基-α-溴甲基酮化合物(α-4-二溴苯乙酮)、含有噻唑的脲化合物(N-(4-甲氧基苄基)-N’-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲)、GSK-3β肽抑制剂例如H-KEAPPAPPQSpP-NH2、以及氯化锂等。
对Wnt信号激活剂的添加量并不特别限制，只要是能够实现激活Wnt信号、换而言之实现抑制GSK-3、且细胞增殖不停止的量即可，依据所使用药剂的种类和应该增殖的细胞的种类，可由本领域技术人员适当确定。例如，在DS细胞中使用BIO作为Wnt信号激活剂时，其量例如为0.01μM～100μM，优选为0.1μM～10μM，更优选为10μM左右。
进而，本发明的无血清培养基中可以根据需要添加其他细胞增殖因子、激素、其他微量营养素。作为这些物质的具体例，例如，在使用表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1,2,3(TGFβ1,2,3)、骨形成因子(BMP)或胰岛素样生长因子-1,2(IGF-1,2)的情况下，其量例如为0.1μg/ml～100μg/ml左右。在使用磷酯(例如，磷脂酸、磷脂酰肌醇、乙醇胺)的情况下，其量例如为0.1μg/ml～100μg/ml左右。在使用脂肪酸(例如，亚油酸、油酸、花生四烯酸)的情况下，其量例如为0.001μg/ml～100μg/ml左右。在使用前列腺素类的情况下，其量为0.1ng/ml～100ng/ml左右。在使用还原剂(例如，抗坏血酸、还原型谷胱甘肽)的情况下，其量例如为1μg/ml～100μg/ml左右。在使用巯基乙醇的情况下，其量例如为0.1μg/ml～100μg/ml左右。在使用转铁蛋白或胰岛素的情况下，其量为0.01μg/ml～100μg/ml左右。在使用地塞米松的情况下，其量为0.000001μM～0.1μM左右。在使用三碘甲状腺原氨酸的情况下，其量为0.1pM～100pM左右。在使用胰高血糖素的情况下，其量为0.0001μM～0.1μM左右。在使用胆固醇的情况下，其量例如为0.1μg/ml～100μg/ml左右。在使用氢化可的松的情况下，其量例如为0.01μg/ml～10μg/ml左右。在使用睾酮的情况下，其量例如为0.1μM～100μM左右。在使用雌二醇或孕酮的情况下，其量例如为0.01ng/ml～100ng/ml左右。在使用微量元素(例如，铜、锌、钴、锰、钼、硒)的情况下，其量例如为0.000001mg/ml～0.1mg/ml左右。在使用白蛋白、纤连蛋白或玻连蛋白的情况下，其量例如为0.1μg/ml～1000μg/ml左右。
利用这样的无血清培养基的DS细胞的培养通常如下实施：使用培养皿，在5％CO2气氛下静置于37℃的孵化器内进行，如果确认了生长晕，则交换培养基再继续培养(传代培养)。这样得到的培养细胞进一步经过必要的传代数进行传代培养。传代可以进行到DS细胞达到所希望的量，例如可以进行10次以上的传代，所希望的量多的情况下，可以进行传代到优选15次以上、进一步优选20次以上。
优选使这样培养的DS细胞进行球形成(日本特开平7-274950号公报(专利文献4))。球形成如下进行：使细胞增殖到饱和状态，剥离细胞后，用培养基使其悬浮，将该细胞悬浮物接种到进行了非粘附处理的培养皿中的培养基上，放置数天，从而形成圆的细胞块(球状体)的细胞集合体。优选球形成在bFGF不存在下进行，但在bFGF存在下也能充分实现球形成。此外，对进行球形成的时期不特别是限制，对结束了最后的传代的培养细胞进行即可。作为形成球状体的培养法，已知滚瓶(RollerBottle)培养、转瓶(SpinnerFlask)培养、悬滴(hanging-drop)培养等，另外市售有具有凹陷部的培养容器、实施了细胞粘附性低的涂覆的培养容器。进而，通过使用进行涂覆使得细胞粘附性区域和细胞非粘附性区域共存，作为细胞非粘附性区域涂覆了胆碱磷酸(PC)基的培养容器进行培养，能够大量形成具有尺寸的球状体。
这样制备的球化的DS细胞维持着毛囊诱导能力，因此能够用于为了阐明毛囊再构成的机制而进行研究的体外(invitro)实验、毛再生医疗等。
以下列举实施例更详细地说明本发明。
实施例
例1.关于使用了无血清培养基(HFDM-1)的DS细胞(杯区域)的增殖
将12孔板(BD)用CELLStartTM(Lifetechnologies)涂覆，在该板的每1孔中，将冻结保存后的DS细胞(来源于21岁男性头皮、DSC、传代数0)4×104细胞悬浮于1ml的无血清培养基中，从而进行了接种。作为无血清培养基，使用了1)HFDM-1(-)培养基(细胞科学研究所)、2)HFDM-1(+)培养基(细胞科学研究所)、3)溶解了PDGF-AA(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基、和4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基。在5％二氧化碳存在下、在37℃进行了培养。在第2、5、10天对细胞进行显微镜观察(图1：40倍)，测量每1视野的细胞数(图2)。
例2.关于使用了无血清培养基(StemProSFMCTS/MosaichMSCSFCulture)的DS细胞(杯区域)的增殖
将12孔板(BD)用CELLStartTM(Lifetechnologies)涂覆，在该板的每1孔中，将冻结保存后的DS细胞(来源于50岁男性头皮、DSC、传代数0)4×104细胞悬浮于1ml的无血清培养基中，从而进行了接种。作为无血清培养基，使用了1)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、3)MosaichMSCSFCultureMedium(sup+,BD)、4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的MosaichMSCSFCultureMedium(sup+,BD)。在5％二氧化碳存在下、在37℃进行了培养。在第2、7天对细胞进行显微镜观察(图3：40倍)，测量每1视野的细胞数(图4)。
例3.关于使用了无血清培养基(HFDM-1)的DS细胞的增殖
将12孔板(BD)用CELLStartTM(Lifetechnologies)涂覆，在该板的每1孔中，将冻结保存后的DS细胞(来源于43岁男性头皮、DS、传代数0)4×104细胞悬浮于1ml的无血清培养基中，从而进行了接种。作为无血清培养基，使用了1)HFDM-1(-)培养基(细胞科学研究所)、2)HFDM-1(+)培养基(细胞科学研究所)、3)溶解了PDGF-AA(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基、和4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的HFDM-1(-)培养基。在5％二氧化碳存在下、在37℃进行了培养。在第2、4、7天对细胞进行显微镜观察(图5：40倍；关于第4天未示出)，测量每1视野的细胞数(图6)。
例4.关于使用了无血清培养基(StemProSFMCTSsup+/StemProSFMCTSsup-)的DS细胞的增殖
将12孔板(BD)用CELLStartTM(Lifetechnologies)涂覆，在该板的每1孔中，将冻结保存后的DS细胞(来源于43岁男性头皮、DS、传代数0)4×104细胞悬浮于1ml的无血清培养基中，从而进行了接种。作为无血清培养基，使用了1)StemProSFMCTS(sup-,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup-,Lifetechnologies)、3)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、4)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)。在5％二氧化碳存在下、在37℃进行了培养。在第2、4、7天对细胞进行显微镜观察(图7：40倍；关于第4天未示出)，测量每1视野的细胞数(图8)。
例5.关于使用了无血清培养基(StemProSFMCTSsup+)的成纤维细胞的增殖
将12孔板(BD)用CELLStartTM(Lifetechnologies)涂覆，在该板的每1孔中，将冻结保存后的人皮肤成纤维细胞4×104细胞悬浮于1ml的无血清培养基中，从而进行了接种。作为无血清培养基，使用了1)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)。在5％二氧化碳存在下、在37℃进行了培养。在第2、7天对细胞进行显微镜观察(图9：40倍)，测量每1视野的细胞数(图10)。

Claims (6)

1.一种无血清培养基，是用于培养真皮鞘细胞即DS细胞的无血清培养基，包含血小板衍生生长因子即PDGF。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，所述PDGF是PDGF-BB。
3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，所述真皮鞘细胞即DS细胞来源于真皮鞘杯区域即DSC区域。
4.一种用于培养真皮鞘细胞即DS细胞的方法，使用了包含血小板衍生生长因子即PDGF的无血清培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，所述PDGF是PDGF-BB。
6.根据权利要求4或5所述的方法，所述真皮鞘细胞即DS细胞来源于真皮鞘杯区域即DSC区域。
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