JP3573488B2 - 毛乳頭細胞の長期継代培養法 - Google Patents
毛乳頭細胞の長期継代培養法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3573488B2 JP3573488B2 JP9805594A JP9805594A JP3573488B2 JP 3573488 B2 JP3573488 B2 JP 3573488B2 JP 9805594 A JP9805594 A JP 9805594A JP 9805594 A JP9805594 A JP 9805594A JP 3573488 B2 JP3573488 B2 JP 3573488B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hair
- cells
- papilla cells
- long
- hair papilla
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0627—Hair cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
- C12N2502/094—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells keratinocytes
Description
【産業上の利用分野】
この発明は、毛乳頭細胞の長期継代培養法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、毛包の分化誘導因子や成長因子の単離、解析を容易にすることや、移植材料としての毛乳頭細胞を短期間に多量に提供することを通して毛髪の分化、増殖の人為的制御に有用な、新しい毛乳頭細胞の長期継代培養法に関するものである。
【0002】
【従来の技術とその課題】
従来より、毛髪は皮膚の変化したもので、毛包上皮とそれらを裏打ちする毛乳頭細胞との相互作用の結果、毛母細胞が分化、増殖することにより毛幹(いわゆる毛の本体)が伸長することが知られている。
これまでにも、毛髪の増殖、成長については様々な観点より検討が進められてきているが、たとえばOliverは毛包(毛髪基部の皮膚に埋まっている部分)を半分に切った切り口に毛乳頭細胞を詰めることにより毛包が再生することを示し、毛乳頭細胞が毛包の分化、増殖に重要な役割を担っていると推察している(J. Embryol. Exp. Morph.,18:43−、’67)。つまり、毛乳頭細胞は、毛包の分化誘導因子や成長因子を分泌していると推定される。
【0003】
しかしながら、これらの因子は毛髪の分化、増殖の人為的制御には大変に重要であると考えられるものの、その実体についてはいまだに明らかにされていない。
このような状況においては、これらの因子を探索し、解析するため、あるいは生体移植の材料とするためには多量の毛乳頭細胞が必要である。しかしながら、毛包に存在する毛乳頭細胞は少数であるため培養に頼らなければいけないが、これまで毛乳頭細胞の継代培養はなかなかうまくゆかず、細胞の増殖が遅く継代数も7代ほどに限られていた。また、継代数の多い培養毛乳頭細胞は半分に切った毛包に詰めても毛包が再生しないことから(Jahoda et al., Nature,311:560−、’84)、すでに本来の毛乳頭細胞の機能を失っているものと考えられる。
【0004】
そこで、この発明は、以上の通りの従来技術の限界を克服し、毛包の分化誘導因子や成長因子の解明、そして毛髪の成長や生体移植材料としての開発にとって欠くことのできない手段として、毛乳頭細胞の長期の安定した継代培養が可能であって、しかも毛乳頭細胞の機能を失うことのない、新しい、毛乳頭細胞の長期継代培養法を提供することを目的としている。
【0005】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、毛乳頭細胞を足裏表皮細胞および/またはその培養上清とともに培養することを特徴とする毛乳頭細胞の長期継代培養法を提供する。
【0006】
【作用】
すなわち、この発明は、毛乳頭細胞を足裏表皮細胞とともに培養すると細胞の増殖が著しく改善するとの新しい知見に基づいて完成されたものである。そして、この効果は、足裏表皮細胞の培養上清(コンディションドメディウム)でもみられるものである。また、このコンディションドメディウムを用いることにより、足裏表皮細胞の混入のない純粋な毛乳頭細胞を40代以上安定して継代培養することが可能となる。さらに、30代培養した毛乳頭細胞を半分に切った毛包に詰めると毛包が再生したことから、この方法によって毛乳頭細胞を本来の機能を維持したまま長期間培養することが可能となる。
【0007】
以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明について説明する。
【0008】
【実施例】
−細胞培養−
1)ラット足裏表皮細胞の単離
ラット足裏より皮膚を切り取りディスパーゼ処理(Dispase,1000U/ml,4℃、一昼夜)して、表皮と真皮を分離する。得られた表皮をトリプシン処理(Trypsin,0.25%、37℃、10分間)したのち、先曲がりピンセットの背中を用いて細胞を表皮片より掻き取る。ナイロンメッシュを通して細胞塊を除く。
2)足裏表皮細胞と毛乳頭との共培養(co−culture)
1)で得られた足裏表皮細胞(3.6×105 細胞)とラット頬髭毛包より単離した毛乳頭8個を、D−MEM培地+10%牛胎児血清の入った35mmプラスチックシャーレに同時に播種し、5%CO2 ,37℃のインキュベーター内で培養する。
3)足裏表皮細胞のコンディションドメディウムの調製
1)で得られた足裏表皮細胞を4×104 細胞/cm2 の密度で10cmプラスチックシャーレに播種し、D−MEM培地+10%牛胎児血清で培養する。播種後5日目と8日目に培地交換を行い、その際得られた培養上清を0.22μmメンブランフィルターで濾過滅菌してそれぞれCM5、CM8とする。
4)ラット頬髭毛乳頭細胞の培養
実体顕微鏡下でラット頬髭毛包より毛乳頭を単離し、35mmプラスチックシャーレに8個ずつ入れる。これをD−MEM培地+10%牛胎児血清のみ、あるいは、上述のCM5またはCM8をそれぞれ培地と1:1で混合したもの3種類の培養液で培養する。3〜4日おきに培地交換を行う。毛乳頭から遊走してきた細胞がシャーレいっぱい(confluent) に達したところで継代し、以後、3〜4日おきの培地交換と1週間おきの継代を繰り返す。
−細胞機能検査−
1)腎臓皮膜下移植
ラットの頬髭毛包を単離し、下半分を切断除去する。残った上半分の毛包から毛幹を取り除き、切り口の毛幹を抜いたあとの隙間に4)の培養毛乳頭細胞をペレット状にして詰め込む。また、陽性対照として切り口の隙間に毛包から単離した毛乳頭を詰め込んだものを用意する。これらをラットの腎臓皮膜下に移植する。8週間後に開腹し腎臓を摘出して観察するとともに免疫組織化学的に調べる。
−免疫組織化学−
1)培養細胞の抗体染色
培養毛乳頭細胞をSUMILONセルデスク上に培養し、セルデスクごとアセトン固定したのち我々の作製した13xx抗体と反応させ、パーオキシダーゼ標識2次抗体とジアミノベンジジン(3,3′−Diaminobenzidine)で発色させる。
2)腎臓皮膜下移植した毛包の抗体染色
開腹後回収した毛包を5μmの凍結切片とし、13xx抗体、パーオキシダーゼ標識2次抗体と反応させジアミノベンジジンで発色させる。
−結果−
単離した毛乳頭をプラスチックシャーレに入れて初代培養すると、シャーレに接着した毛乳頭から細胞が遊走を始める。図1に例示した通り、この毛乳頭細胞の遊走も遊走した細胞の増殖速度も、足裏表皮細胞と共培養した場合の方が明らかに良かった。つぎに、足裏表皮細胞の効果が細胞間の相互作用によるのか細胞から分泌された液性因子によるのかを知るために、図2の足裏表皮細胞のコンディションドメディウムを加えて初代培養を行った。その結果、図3に例示した通り、なにも加えていないコントロールに比べCM5、CM8のどちらのコンディションドメディウムを加えたものも毛乳頭細胞の遊走、増殖ともに優れていた。このことから、足裏表皮に由来する何らかの液性因子が、毛乳頭細胞の遊走および増殖を活性化するものと思われる。
【0009】
また、毛乳頭細胞がシャーレいっぱいに達したところで継代し、そのさい細胞数を数えて集団倍加時間(Population Doubling Time)を計算したところ、図4に示した通り、コンディションドメディウムを加えて培養したものでは継代10代目以降ほぼ安定して増殖したのに対し、なにも加えないで培養した毛乳頭細胞は徐々に増殖速度が鈍り、継代5代目でほとんど細胞数の増加がみられなくなった。コンディションドメディウムを加えて培養している毛乳頭細胞は現在までに40代以上継代しているが、正常細胞の指標の一つである接触阻止(contact inhibition)がみられる。図5に示した通り、細胞の形態は培養初期のものとは若干異なるが、およそ10代目以降安定し、CM5とCM8とではやや異なった形態を示した。
【0010】
足裏表皮細胞のコンディションドメディウムによる毛乳頭細胞の遊走および増殖の活性化は再現性があり、継代後の細胞形態の変化もそれぞれのコンディションドメディウムに特異的であった。
コンディションドメディウムにより長期継代培養した毛乳頭細胞が本来の毛乳頭細胞の機能を保持しているかどうかを調べるために、図6に示したように、毛包の腎臓皮膜下移植法による細胞機能検査を行った。その結果、図7に例示したが、30代継代された培養毛乳頭細胞を詰めた毛包でも陽性対照と同様に毛包が再生し毛幹の伸長がみられた。毛包の各組織を染め分けるモノクローナル抗体(K13xxシリーズ)で染色したところ、図8に例示した通り、再生した毛包は正常な毛包と同等の組織分化がみられた。
【0011】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、これまでは毛乳頭細胞を効率よく遊走、増殖させることができず、毛乳頭細胞の長期継代培養が不可能で、毛乳頭細胞を本来の機能(毛包再生能)を維持したまま継代培養することが困難であったが、この発明によって、足裏表皮細胞と共培養することあるいは足裏表皮細胞のコンディションドメディウムを加えることにより、毛乳頭細胞を効率よく継代培養する方法が確立され、しかも、この培養法により、毛乳頭細胞を本来の機能(毛包再生能)を維持したまま継代培養することが可能となる。
【0012】
このため、この発明の毛乳頭細胞を細胞機能を維持したまま長期培養する技術によって、毛乳頭細胞が分泌していると考えられる毛包の分化誘導因子や成長因子の単離、解析が容易となり、移植材料としての毛乳頭細胞を短期間に多量に提供することを通して毛髪の分化、増殖の人為的制御に大変に有用となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】毛乳頭と足裏表皮細胞との初代共培養を例示した培養8日後の状態図である。
【図2】足裏表皮細胞のコンディションドメディウムの調製法を示したプロセス図である。
【図3】(a)(b)(c)は、各々、コンディションドメディウム無添加、CM5、CM8添加の初代培養を例示した培養状態図である。
【図4】継代培養の結果を示した継代数と集団倍加時間(PDT)との相関図である。
【図5】(a)(b)は、各々、CM5およびCM8添加の場合の、継代による細胞形態の変化を示した状態図である。
【図6】腎臓皮膜下移植法を示した概要図である。
【図7】毛包の再生状態を示した図である。
【図8】再生した毛包の抗体染色図である。
Claims (1)
- 毛乳頭細胞を、その毛包再生能を保持した状態で長期継代培養する方法であって、毛乳頭細胞を足裏表皮細胞および/またはその培養上清とともに培養することを特徴とする毛乳頭細胞の長期継代培養法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9805594A JP3573488B2 (ja) | 1994-04-11 | 1994-04-11 | 毛乳頭細胞の長期継代培養法 |
CA002146734A CA2146734C (en) | 1994-04-11 | 1995-04-10 | Method for long term subculture of dermal papilla cells |
AU16414/95A AU699407B2 (en) | 1994-04-11 | 1995-04-11 | Method for long term subculture of dermal papilla cells |
DE1995629244 DE69529244T2 (de) | 1994-04-11 | 1995-04-11 | Verfahren zur Langzeitkultur der dermalen Papillezellen |
US08/419,708 US5851831A (en) | 1994-04-11 | 1995-04-11 | Method for long term subculture of dermal papilla cells |
EP95302397A EP0682107B1 (en) | 1994-04-11 | 1995-04-11 | Method for the long term culturing of dermal papilla cells |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9805594A JP3573488B2 (ja) | 1994-04-11 | 1994-04-11 | 毛乳頭細胞の長期継代培養法 |
US08/419,708 US5851831A (en) | 1994-04-11 | 1995-04-11 | Method for long term subculture of dermal papilla cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07274950A JPH07274950A (ja) | 1995-10-24 |
JP3573488B2 true JP3573488B2 (ja) | 2004-10-06 |
Family
ID=26439258
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9805594A Expired - Lifetime JP3573488B2 (ja) | 1994-04-11 | 1994-04-11 | 毛乳頭細胞の長期継代培養法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5851831A (ja) |
EP (1) | EP0682107B1 (ja) |
JP (1) | JP3573488B2 (ja) |
AU (1) | AU699407B2 (ja) |
CA (1) | CA2146734C (ja) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL1005445C2 (nl) * | 1997-03-05 | 1998-09-21 | Gho St Holding B V | Werkwijze voor het vermenigvuldigen van haar. |
WO1999001034A1 (en) * | 1997-07-01 | 1999-01-14 | Cooley Jerry E | Method for producing new hair growth |
ES2290125T3 (es) * | 2000-03-31 | 2008-02-16 | The General Hospital Corporation | Metodos para incrementar el crecimiento capilar mediante un polipeptido wnt. |
KR20020005331A (ko) * | 2000-07-10 | 2002-01-17 | 정상훈 | 모낭 세포의 배양 방법 및 모발 이식용 키트 |
KR100371274B1 (ko) * | 2000-08-09 | 2003-02-06 | 정상훈 | 모발 이식용 키트 |
US20030161815A1 (en) * | 2002-02-12 | 2003-08-28 | Intercytex Limited | Cell delivery system |
DE10224982A1 (de) * | 2002-06-05 | 2003-12-24 | Rolf Hoffmann | Mesenchymale Stammzellen des Haarfollikels und deren Verwendung |
EP1563061B1 (en) * | 2002-11-14 | 2012-06-20 | Aderans Research Institute, Inc. | Cultivation of hair inductive cells |
KR101082621B1 (ko) * | 2003-10-06 | 2011-11-10 | 가부시키가이샤 시세이도 | 모유두 세포 조제품의 조제 방법 |
WO2005053763A1 (ja) | 2003-12-05 | 2005-06-16 | Biointegrence Inc. | 発毛方法 |
GB0328943D0 (en) * | 2003-12-15 | 2004-01-14 | Univ Durham | Differentiated cells |
US20050233450A1 (en) * | 2004-01-12 | 2005-10-20 | Goetinck Paul F | Methods of inducing hair growth |
CN1968713B (zh) * | 2004-06-14 | 2012-02-29 | 株式会社资生堂 | 通过抑制具有毛囊形成抑制能力的基因或通过活化具有毛囊形成诱导能力的基因而再生毛囊的方法 |
KR100616752B1 (ko) * | 2004-11-29 | 2006-08-31 | 박정극 | 모낭 유도 능력이 있는 모유두 조직의 제조방법 |
WO2006113629A1 (en) * | 2005-04-15 | 2006-10-26 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Chemically defined culture media for expansion and differentiation of epidermal cells and uses thereof for in vitro growth of hair follicles |
PL1945757T3 (pl) * | 2005-10-17 | 2018-05-30 | Aderans Research Institute, Inc. | Sposób dostarczania komórek progenitorowych mieszków włosowych do skóry |
US20070148138A1 (en) | 2005-11-22 | 2007-06-28 | Aderans Research Institute, Inc. | Hair follicle graft from tissue engineered skin |
GB0605450D0 (en) * | 2006-03-17 | 2006-04-26 | Intercytex Ltd | Cell co-culture |
US7922688B2 (en) | 2007-01-08 | 2011-04-12 | Restoration Robotics, Inc. | Automated delivery of a therapeutic or cosmetic substance to cutaneous, subcutaneous and intramuscular tissue regions |
JP5164439B2 (ja) * | 2007-06-12 | 2013-03-21 | 株式会社 資生堂 | 毛乳頭細胞培養方法 |
CA2917684C (en) | 2013-06-12 | 2021-07-20 | Shiseido Company, Ltd. | Serum-free medium containing pdgf for ds cells |
GB201816902D0 (en) * | 2018-10-17 | 2018-11-28 | Hairclone Ltd | Hair Rejuvenation |
CN114207112A (zh) * | 2019-08-07 | 2022-03-18 | 花王株式会社 | 毛乳头细胞的培养方法 |
KR102254911B1 (ko) * | 2020-08-12 | 2021-05-24 | 한모바이오 주식회사 | 천공을 통한 모유두세포 이식방법 |
JP7380998B1 (ja) * | 2022-03-01 | 2023-11-15 | 国立大学法人横浜国立大学 | 増幅毛包間葉系細胞の製造方法及びその使用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8604360D0 (en) * | 1986-02-21 | 1986-03-26 | Univ Dundee | Stimulation of hair growth |
US5423778A (en) * | 1989-12-14 | 1995-06-13 | Elof Eriksson | System and method for transplantation of cells |
GB8928634D0 (en) * | 1989-12-19 | 1990-02-21 | Unilever Plc | Method of testing |
US5130142A (en) * | 1990-10-31 | 1992-07-14 | The Practer & Gamble Company | Hair growth regulating composition comprising epithelium cell supernatant-derived growth factor |
-
1994
- 1994-04-11 JP JP9805594A patent/JP3573488B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-10 CA CA002146734A patent/CA2146734C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-11 US US08/419,708 patent/US5851831A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-11 AU AU16414/95A patent/AU699407B2/en not_active Expired
- 1995-04-11 EP EP95302397A patent/EP0682107B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2146734C (en) | 2007-06-05 |
AU1641495A (en) | 1995-10-19 |
AU699407B2 (en) | 1998-12-03 |
EP0682107A2 (en) | 1995-11-15 |
EP0682107B1 (en) | 2003-01-02 |
EP0682107A3 (en) | 1997-04-16 |
JPH07274950A (ja) | 1995-10-24 |
CA2146734A1 (en) | 1995-10-12 |
US5851831A (en) | 1998-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3573488B2 (ja) | 毛乳頭細胞の長期継代培養法 | |
Holbrook et al. | Phenotypic expression of epidermal cells in vitro: a review | |
US6916655B2 (en) | Cultured skin and method of manufacturing the same | |
US5858721A (en) | Three-dimensional cell and tissue culture system | |
CA1335657C (en) | Three-dimensional cell and tissue culture system | |
EP2105499A1 (en) | Methods for producing de novo papillae and hair microfollicles and their use for in vitro tests and in vivo implantations | |
JPH0747043B2 (ja) | 合成生体皮膚等価物 | |
KR20070015519A (ko) | 생체 조직 시트, 그것의 제조 방법, 및 그것을 이용한 이식방법 | |
KR102426746B1 (ko) | 모낭 줄기 세포의 3d 오가노이드 시스템을 이용하여 모발을 재생시키기 위한 방법 및 시스템 | |
JP4550582B2 (ja) | 毛髪誘導細胞の培養 | |
Lorenti | Wound healing: from epidermis culture to tissue engineering | |
JP6839003B2 (ja) | 再構成頭皮モデルおよび活性分子のスクリーニング方法 | |
JP4324988B2 (ja) | 発毛誘導剤および発毛方法 | |
Berg et al. | Cultured myofibroblasts: a useful model to study wound contraction and pathological contracture | |
CN103893831B (zh) | 一种器官型人工皮肤、其制备方法及应用 | |
EP1337624B1 (de) | Zellkonstrukte erhältlich aus mesenchymalen stammzellen und davon ableitbaren zellen und ihre verwendung | |
AU644578B2 (en) | Three-dimensional cell and tissue culture system | |
Malik et al. | Organ, Histotypic and Organotypic Culture, and Tissue Engineering | |
JP2004121419A (ja) | 臍帯上皮細胞含有培養皮膚 | |
KR0156685B1 (ko) | 3차원 배양물을 이용한 약물의 효과를 테스트하는 방법 | |
KR0156571B1 (ko) | 3차원 세포 및 조직 배양계 | |
Linge | Establishment and maintenance of normal human keratinocyte cultures | |
Germain et al. | Improved methods to produce tissue-engineered skin substitutes suitable for the permanent closure of full-thickness skin injuries | |
JPH05276939A (ja) | ヒト毛細胞の培養方法並びに培地 | |
JPS59501298A (ja) | 骨同等物およびその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031031 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20031210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040309 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040507 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040608 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040629 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080709 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090709 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100709 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110709 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120709 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130709 Year of fee payment: 9 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |