KR20020005331A - 모낭 세포의 배양 방법 및 모발 이식용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모낭 세포의 배양 방법에 관한 것으로서, 모낭 세포를 생물학적으로 이용될 수 있는 탄수화물, 아미노산, 비타민 및 염류, 그리고 인슐린, 소듐 셀레나이트, 인간의 트랜스페린, 히드로코티손 및 EGF(epidermal growth factor)를 포함하는 pH 7.4 내지 8.4인 배지에서, CO₂가 1 내지 5% 함유된 대기 조건하에, 배양시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 모낭 세포의 배양 방법을 이용하면, 모낭 세포에 최적인 조건이 형성되어 생장율이 향상되므로, 한 번에 많은 모낭 세포를 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 모낭 세포들을 탈모 증세가 있는 두피에 이식하면 심한 탈모증도 단기간에 치료할 수 있으며 수술에 드는 비용을 줄이는 효과가 있다.

Description

모낭 세포의 배양 방법{Method for culture of hair follicle cell}

본 발명은 모낭 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 모낭 세포의 증식을 최적화 하는 환경을 제공하기 위한 배지와 대기 조건을 이용하는 모낭 세포의 배양 방법에 관한 것이다.

남성들 중에는 탈모증으로 고생하는 경우가 많다. 탈모증에는 여러 가지 원인이 있지만, 그 중에서도 장년성 탈모증은 유전적인 소인과 남성 호르몬인 안드로겐이 관여한다.

이러한 종류의 탈모증을 치료하기 위해서 약물 요법 및 모발 이식술 등 여러 방법이 시도되어 왔다. 그러나 종래의 미녹시딜 등의 약물을 이용하는 요법 중에서는 아직까지 큰 효과를 보는 방법은 없었다. 결국은 모발 이식만이 가장 효과적이고 영구적인 것으로 나타났다. 그러나 이식 수술에는 너무 많은 비용과 노력이 드는 단점이 있었다. 종래의 방법으로는 보통 한 번의 수술 시 약 1000개 정도의 모발을 심게 된다. 인간의 모발이 10만가닥 정도 되는 것을 감안한다면, 전두부와 두정부의 모발이 거의 빠져있는 가장 탈모 증세가 심한 8등급 환자의 경우에 있어서는, 2만 내지 3만 가닥의 모근이 없는 것으로 추정할 수 있다. 이러한 8등급 환자에게는 1000가닥 정도의 모발을 이식한다 하더라도 미용적으로 크게 향상되지 않을 것이다. 따라서 수회 이상의 수술을 반복하여야 하는 어려움이 있었다.

최근 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 메가세션(Megasession)이라는 새로운 방법이 시도되었다. 이 방법을 이용하면 1회에 2000가닥 이상의 모발을 한번에 이식할 수 있다. 따라서 비용 및 노력을 2배 이상 감소시킬 수 있다.

그러나 상기와 같은 메가세션 방법은 한번에 많은 가닥의 모발을 이식시킬 수는 있었지만, 건강한 2000개 이상의 모발을 얻는 효과적인 수단은 제시하지 못하였다. 탈모증을 치료하기 위해서는 모근과 모낭이 위축되지 않은 상태로, 활발한 세포분열능력을 갖는 모발을 이식해야 한다. 그러나 아직까지 이러한 모발을 효과적으로 생산할 수 있는 방법에 대해서는 누구도 제시한 바 없다.

더욱이 종래 다른 세포를 배양하기 위한 목적으로 사용되어 온 배지와 배양 조건으로는 모낭 세포가 효과적으로 증식하지 못하였고, 매우 제한적으로만 증식할 뿐이었다. 모낭 세포는 상피 세포의 일종이다. 상피 세포는 다른 세포들과는 다른 특성을 갖고 있다. 상피 세포는 지방 입자, 여러 종류의 알갱이, 단백질, 점액, 액성 입자나 글리코겐을 함유하기도 하며, 그 형태에 있어서도 원주형, 입방형, 편평형, 불규칙형, 모상 돌기를 가진 섬모형 등 다양하다. 따라서 상피 세포를 배양하기 위한 조건은 다른 세포를 배양하기 위한 조건과 다를 것이다. 그러나 이제까지 상피 세포, 특히 모낭 세포를 배양하는 구체적인 방법이 알려진 바 없었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 테스토스테론이 5α리덕타제에 의해 변환되어 생성된 활성형인 디히드로테스토스테론의 영향을 받지 않는 모낭 세포를 선택적으로 배양하여 얻어진 모발을 이식시킴으로써, 탈모증을 효과적으로 치료하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 모낭 세포의 배양 방법은, 모낭 세포를 생물학적으로 이용될 수 있는 탄수화물, 아미노산, 비타민 및 염류, 그리고 인슐린, 소듐 셀레나이트, 인간의 트랜스페린, 히드로코티손 및 EGF를 포함하는 pH 7.4 내지 8.4인 배지에서, CO₂가 1 내지 5% 함유된 대기 조건하에, 배양시키는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 모낭 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 pH는 7.8 내지 8.0인 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 모낭 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 방법은 pH 조정 수단으로서 중탄산염 완충용액을 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 모낭 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 pH 조정 수단은 배지에 첨가되는 저장 알칼리인 탄산염을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

모낭이란 모근을 싸고 있는 주머니 모양의 상피성 조직을 말한다.

모근이란 모발이 피부에 박힌 부분을 말한다.

모낭 근처에서 세포 분열이 활발히 일어나 모발이 생장한다. 만약 이 세포 분열 능력이 저하되면 모낭은 위축하게 되고 피부의 얕은 부위로 이동한다. 정상적으로는 세포 분열 능력을 다시 획득하게 되어 생성된 신생 세포군이 피부의 깊은 곳으로 이동하여 새로운 모낭이 형성되고 모발이 자라나 묵은 모발을 밀어내는데, 이를 '묵은 모발의 탈락'이라고 한다. 그러나 탈모증 환자들에 있어서는 이와 같은 '모발의 교환'이 이루어지지 않는다.

따라서 본 발명은 DHT 호르몬의 영향을 받지 않는 후두의 하부 내지는 측면에 있는 세포 분열이 활발한 모낭 세포를 미세 수술법으로 손상 없이 적출한 후 배양하여 얻은 모발을 DHT 호르몬의 영향을 받아 더 이상 모발이 자라지 않는 부위에 이식하는 것이다. 세포 분열이 활발한 모낭 세포를 이식한 부위에서는 세포 분열에 의해 새로운 세포군이 형성되고 이 부위에서 새로운 모발이 성장하게 된다. 기존 세포 및 새로운 세포 대부분이 계속적으로 세포 분열을 함으로써 낭모 세포가 계속 많아져서 이로부터 성장된 모발의 수가 점차 늘게 된다. 이렇게 생성된 모발을 기존의 메가세션 이식술을 이용하여 이식하면 지금까지 한 두차례의 수술만으로는 만족할 만한 성과를 거둘 수 없었던 심한 탈모증도 단시간에 근본적으로 치료할 수 있다.

동물 세포를 배양하기 위한 배양액의 기본 조건은 세포와 등장이고, 적당한 비율로 무기염류 예컨대, 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화칼슘 등을 함유하며 pH는 중성을 유지해야 한다. 생물학적으로 이용될 수 있는 글루코스 등의 탄수화물, 아미노산 및 비타민 뿐만 아니라 호르몬이나 성장인자가 첨가되기도 한다.

그런데 상피 세포, 특히 모낭 세포를 배양하기 위한 최적 조건은 상기 조건과 약간 다르며, 또 다른 조건들이 부가된다. 모낭 세포가 증식하기 위해서는 세포 구성 물질의 합성과 에너지의 생성에 요구되는 여러 가지 물질들로 구성되어야 한다.

본 발명자가 연구한 바에 따르면, 모낭 세포 배양에 이용되는 배지는 기본적으로 포도당 또는 생물학적으로 이용될 수 있는 탄수화물, 많은 수의 아미노산, 비타민 및 염류를 포함한다. 최적 세포 생장을 얻기 위해서는 소량의 혈청이 필요하다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 6%의 태아 소 혈청이 바람직하다. 또한 세균 감염을 방지하기 위해서 몇 종의 항생제를 첨가한다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 페니실린 및 스트렙토마이신을 사용하는 것이 바람직하다. 스트렙토마이신의 경우에는 약 45IU/ml 정도를, 그리고 페니실린의 경우에는 약 45㎍/ml정도를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 배지는 인간의 트랜스페린, 소듐 셀레나이트, 히드로코티손 및 인슐린을 포함한다. 트랜스페린은 약 12㎍/ml정도, 소듐 셀레나이트는 약 12ng/ml정도, 히드로코티손은 약 12ng/ml정도, 그리고 인슐린은 약 12ng/ml정도인 것이 바람직하다.

광합성을 하는 생물과 무기물을 산화하여 에너지를 얻는 세균들은 주요한 탄소원 또는 유일한 탄소원으로서 가장 산화된 형태의 탄소인 CO₂를 이용한다. CO₂가 유기 세포의 구성 물질로 전환되는 과정은 총체적인 에너지의 공급이 요구되는 환원과정이다. 따라서 빛이나 환원형 무기 화합물의 산화로부터 생긴 에너지의 상당부분은 CO₂를 유기물의 수준으로까지 환원시키는 데에 사용된다.

상기 이외의 다른 모든 생물체들은 대부분 유기 영양분으로부터 탄소를 얻는다. 대부분의 유기 물질들은 모낭 세포 구성 물질과 동일한 산화수준에 있기 때문에 이들은 세포의 탄소원으로서 작용하기 위해 일반적으로 일차적인 환원을 하지는 않는다. 더욱이 세포가 생합성을 하는 데에 필요로 하는 탄소를 충족시키기 위해 유기 기질은 종종 세포의 에너지 필요량을 공급해 주어야 한다. 결과적으로 유기 기질 내에 있는 상당량의 탄소는 에너지를 생성하는 물질 대사 경로로 투입되어 결국 CO₂(에너지를 생성하는 호흡 대사의 주요 산물) 또는 CO₂와 유기 화합물(발효 대사의 대표적인 최종 산물)로서 세포에서 방출된다. 따라서 유기 기질은 이중의 영양 역할을 하게 된다.

유기 탄소원을 필요로 하는 대부분의 생물체들은 또한 영양분으로서 소량의 CO₂를 필요로 한다. 왜냐하면 이 화합물은 몇가지 생합성 반응에 이용되기 때문이다. 그러나 상기와 같이 유기 화합물을 사용하는 생물체에 의해 정상적으로 대량의 CO₂가 생산됨에도 불구하고, CO₂를 완전히 제거하면 유기 배지에 있는 미생물의 생장이 저해되거나 지연된다. 더구나 어떤 세균과 균류는 유기 배지에서 만족할 만한 생장을 하기 위해서는 비교적 높은 농도(약 5 내지 10%)의 대기 중의 CO₂를 필요로 한다. 본 발명에 의한 모낭 세포의 배양 방법에 있어서, CO₂의 공급은 공기 중 약 1 내지 5% 정도인 것이 바람직하다.

세포의 배양에 있어서 pH의 조절은 아주 중요하다. 세포의 생장에 직접 영향을 주기 때문이다. 본 발명의 목적을 달성하기 위한 pH는 7.9인 것이 가장 바람직하다. 그러나 모낭 세포 생장의 개시 단계에는 적합했을지라도, 세포가 생장함에 따라 배지의 pH가 변할 수 있다. 예를 들면 배지가 포도당을 함유할 경우, 발효의 결과로 유기산이 생성된다. 유기산이 생성됨으로써 배지가 산성으로 변한다면 세포의 생장을 현저히 저해하거나 심할 경우 사멸시킬 수도 있다. 반대로 아미노산이 포함된 배지에서는 암모니아가 생성되므로 배지를 염기성으로 변화시킨다. 따라서 pH의 급격한 변화를 막기 위해 완충제나 불용성 탄산염을 배지에 첨가해 주어야 한다. 본 발명의 목적을 달성하기 위한 완충제로서는 중탄산염 완충용액이 바람직하다.

본 발명에 따른 모낭 세포의 배양 방법에 있어서, 배지에 상당량의 산이 생성되는 것을 방지하기에는 제한된 양의 완충제만으로는 부족하다. 따라서 배지에 저장 알칼리로서 탄산염을 첨가시키는 것이 바람직하다.

상기와 같은 조건에서 생장된 모낭 세포 배양기를 영속 세포계로 안정화시킬 수 있다. 영속 세포계는 지속적으로 세포를 이용할 수 있는 특징이 있다. 만일 영속 세포계를 얻을 수 없는 경우에는 수일 동안 살아남을 수 있는 일차 세포 배양 방법(primary cell culture)을 이용한다. 그러나 이런 방법은 배양기를 정기적으로 새로 마련해야 한다는 단점이 있다.

본 발명에 따른 모낭 세포의 배양 방법은 여러 유전자를 이용함으로써 그 효과를 증진시킬 수 있다. 이러한 유전자는 세포의 신호전달에 관여하는 유전자, 유전자 발현에 관여하는 유전자 및 대사에 관여하는 유전자를 포함한다.

이하 본 발명의 목적을 달성하기 위한 최선의 실시 형태를 기술하지만, 이는일 실시예에 불과할 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

종래 기술에 따라 통상적으로 사용되는 양의 포도당, 아미노산, 비타민 및 염류를 기본적으로 첨가하였다. 그리고 철 공급원으로서 인간의 트랜스페린 12㎍/ml을 넣고, 무기 염류로서 소듐 셀레나이트 12ng/ml, 호르몬으로서 히드로코티손 및 인슐린 각각 12ng/ml씩, 천연 배양기로서 6% 태아 소 혈청, 성장인자로서 EGF 12ng/ml, 그리고 항생제로서 스트렙토마이신 45IU/ml, 페니실린 45㎍/ml를 더욱 첨가하였다.

배지의 pH는 7.9로 조절하였으며, 완충제로서 중탄산염 완충용액을 사용하였고, 완충 효과를 증진시키기 위해 배지에 저장 알칼리로서 통상의 양의 탄산염을 첨가하였다. 이렇게 형성된 배양기를 CO₂농도 3%인 대기 조건하에서 배양시켰다. 그 결과 많은 수의 모낭 세포를 얻을 수 있었다.

본 발명에 따른 모낭 세포의 배양 방법을 이용하면, 모낭 세포에 최적인 조건이 형성되어 세포의 생장율이 향상되므로, 한 번에 많은 모낭 세포를 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 모낭 세포들을 탈모 증세가 있는 두피에 이식하면 심한 탈모증도 단기간에 치료할 수 있으며 수술에 드는 비용을 줄이는 효과가 있다.

Claims (4)

1. 생물학적으로 이용될 수 있는 탄수화물, 아미노산, 비타민 및 염류, 그리고 인슐린, 소듐 셀레나이트, 인간의 트랜스페린, 히드로코티손 및 EGF(epidermal growth factor)를 포함하는 pH 7.4 내지 8.4인 배지에서, CO₂가 1 내지 5% 함유된 대기 조건하에, 모낭 세포를 배양시키는 것을 특징으로 하는 모낭 세포의 배양 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 pH는 7.8 내지 8.0인 것을 특징으로 하는 모낭 세포의 배양 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법은 pH 조정 수단으로서 중탄산염 완충용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 모낭 세포의 배양 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 pH 조정 수단은 배지에 첨가되는 저장 알칼리인 탄산염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 모낭 세포의 배양 방법.