JP5300273B2

JP5300273B2 - ヒトＷｎｔ３ａ遺伝子形質転換細胞

Info

Publication number: JP5300273B2
Application number: JP2008010823A
Authority: JP
Inventors: 弓子石松; 俊介入山; 重良藤原; 勤相馬; 治郎岸本
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2008-01-21
Filing date: 2008-01-21
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2028-01-21
Also published as: JP2009171852A; EP2239324B1; CN101925676B; KR20100102638A; EP2239324A4; WO2009093612A1; US8257972B2; CN101925676A; EP2239324A1; KR101596056B1; ES2425883T3; US20100311163A1

Description

本発明は、ヒトＷｎｔ３ａタンパク質の高い発現効率を示す、ヒトＷｎｔ３ａタンパク質遺伝子を含むベクターにより形質転換された細胞を提供する。

Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質は分子量約４万の分泌性糖タンパク質であり、胚の形態形成や毛包の再生などに重要な細胞間シグナル分子として知られ、またメラノサイトの分化と機能維持にも関与する。脊椎動物のＷｎｔは20種類近く知られており、サブファミリーを形成し、それぞれが細胞膜上の７回膜貫通型レセプターFrizzledと１回膜貫通型レセプターＬＲＰに結合する。Ｗｎｔファミリーの一員であるＷｎｔ３ａは毛乳頭細胞に作用させることで毛乳頭の毛包構築誘導活性が培養後も維持されることがマウスでの移植実験から明らかになっており（Kishimoto. J. et. al., Genes & Dev., 2000 May 15;14(10):1181-5）、近年その毛包誘導との関係が注目を浴びるに至っている。Ｗｎｔ３ａトリ又はマウスＷｎｔ３ａ遺伝子で形質転換されたトリ細胞により産生された組換トリ又はマウスＷｎｔ３ａタンパク質を用い、マウス毛乳頭細胞などに作用させ、研究が行われている。

ヒトに対して適用される臨床試験への使用を考慮すると、ヒトやマウスではなく、ヒトＷｎｔ３ａ組換タンパク質を大量調製する必要がある。しかしながら、組換えヒトＷｎｔ３ａは、おそらくはその後翻訳修飾を理由に、その活性を十分に保持したタンパク質を生産することが困難であるという問題を抱える。従って、毛包誘導活性を維持したヒトＷｎｔ３ａ組換タンパク質の効率の良い生産に用いるための宿主細胞の選定は、毛包の形成・再生メカニズムの解明、毛包形成・再生を誘導・亢進する薬剤のスクリーニング・評価にとって重要な事項である。

Genes & Dev., 2000 May 15;14(10):1181-5

本発明は、毛乳頭細胞の毛包構築誘導活性を有するヒトＷｎｔ３ａ組換タンパク質を効率よく発現できる細胞の提供を課題とする。

鋭意検討の結果、本発明者は活性を保持したヒトＷｎｔ３ａ組換タンパク質を効率よく発現するための宿主として、毛包由来細胞及び前立腺癌由来細胞が最適であることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本願は下記の発明を包含する：
（１）ヒトＷｎｔ３ａ遺伝子を含むベクターにより形質転換された、毛包由来細胞及び前立腺癌由来細胞からなる群から選択される細胞。
（２）前記毛包由来細胞がＩＯＲＳ又はＩＤＰ細胞である、（１）の細胞。
（３）前記前立腺癌由来細胞がＰＣ３細胞である、（１）の細胞。
（４）前記ベクターがｐＴａｒｇｅｔベクターである、（１）〜（３）のいずれかの細胞。

本発明により、毛乳頭細胞の毛包構築誘導活性を有するヒトＷｎｔ３ａ組換タンパク質を効率よく発現でき、毛包の形成・再生のメカニズムの解明や、毛包再生に有効な薬剤の評価を効率よく行うことが期待される。

ヒトＷｎｔ３ａはアミノ酸残基352のタンパク質であり、それをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１及び図１に示す。Ｗｎｔ３ａ遺伝子を含む発現ベクターは、Ｗｎｔ３ａ遺伝子を適当なベクターのプロモーターの制御下に、適当な制限部位を介して周知の方法で連結することにより製造できる。ベクターの種類も特に制限されるものではなく、市販のもの、例えばｐＴａｒｇｅｔベクター(Ｐｒｏｍｅｇａ)、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター、ｐＢＫ-ＲＳＶベクター(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)といった市販の動物細胞用発現ベクターなど、あらゆるベクターが使用できる。特に好ましいのはｐＴａｒｇｅｔベクターである。

本発明で用いられる好適なプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に制限されなく、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ40プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、β-アクチンプロモーター等が挙げられる。
また、所望により、発現ベクターには更にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点、等を含んでよい。

宿主細胞としてはヒト不死化外毛根鞘細胞（ＩＯＲＳ)、ヒト不死化毛乳頭細胞（ＩＤＰ)などといったヒト毛包由来細胞、あるいはヒト前立腺癌細胞（ＰＣ３)等が使用できる。ＩＯＲＳが特に好ましい。
ヒト外毛根鞘細胞を得るには、ヒトの頭皮を、例えば美容整形外科手術や外科手術の副産物として得、これをこの頭皮から実体顕微鏡下で毛包組織を得る。次にこの毛包組織を、加水分解酵素溶液、例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ混合溶液で３７℃、３０分間処理した後に、コラーゲンコーティングした培養皿に静置させ、低カルシウム無血清培地、例えばＫ−ＧＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）やＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中で培養し、この間２日間ごとに培地を交換する。細胞が増殖したことを確認した後、培養器に付着している細胞を遊離させ遠心分離により細胞を回収した後、無血清培地により継代培養を行う。

ヒト毛乳頭細胞も外毛根鞘細胞と同様、美容整形外科手術や外科手術の副産物としてヒト頭皮から実体顕微鏡下で毛乳頭を得る。次にこの毛乳頭を、常用の動物細胞培養培地、例えばウシ胎児血清を含むダルベコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium; D-MEM ）中で培養し、この間２日間ごとに培地を交換する。細胞が増殖したことを確認した後、培養器に付着している細胞を遊離させ遠心分離により細胞を回収した後、無血清培地により継代培養を行う。

このようにして得たヒト外毛根鞘細胞やヒト毛乳頭細胞の不死化は公知の方法で行うことができる。好ましくは、特開２０００−８９号に記載のごとき、複製起点を欠失させたＳＶ４０ウイルスのＬａｒｇｅＴ抗原遺伝子を用いることができる。この遺伝子は通常、プラスミドやウイルス等のベクターに挿入した状態で用いる。この遺伝子は、動物細胞を不死化するための典型的な遺伝子として当業界で広く使用されており、容易に入手することができる。例えば、アデノウイルスベクターであるΔＥｌ／Ｘ（Doren ら、J. Virol. vol.50, 606-614 (1984)）中のＥＩＡ領域を、複製開始点を欠失させたＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原ウイルスにより置換したウイルスがDoren ら、Mol. Cell. Biol. 1653-1656 (1984) に記載されている。また、ｐＬＴｔｓａ（M. Rassoulzadegan ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol.80, 4354-4358 (1983)）から、ＢｇｌＩ及びＨｉｎｇIIにより、温度感受性ポリオーマウイルスＬａｒｇｅＴ抗原（Ｐｌｔｔｓａ）をコードする遺伝子を含む２４９１bpの断片を切り出し、これをレトロウイルスベクターｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）ｌ（C.L.Cepko ら、Cell Vol.37, 1053-1062 (1984) のＢａｍＨＩ部位に挿入して得たレトロウイルスベクターｐＺＩＴｔｓａ（W. Filsellら、Journal of Cell Science Vol.107, 1761-1772 (1994) を用いることもできる。さらに、複製起点を欠失させたＳＶ４０ウイルスＤＮＡをｐＢＲ３２２にクローニングして得たｐＳＶ４０ｏｒｉ−やヒトパピロ−マウイルスのタイプ１６のＤＮＡをｐＳＶ２ｎｅｏベクターにクローニングして得たｐＳＨＰＶ１６ｓ（Tissue Cult. Res. Commun. vol.11, 13-24 (1992)）を用いることもできる。

前立腺癌細胞株ＰＣ３は市販され、例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC)やＤＳファーマバイオメディカル株式会社（旧大日本住友製薬株式会社）から入手できる。

宿主細胞の形質転換は周知の方法、例えば塩化カルシウム法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン法、プロトプラストポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法等が利用でき、利用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。また、形質転換には適宜市販のキットを使用して行うことができる。かかるキットの例としては、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）（ロッシュアプライドサイエンス）、ＣｏｍｂｉＭａｇ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｏｌｙＭａｇ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等が挙げられる。

得られる組換宿主細胞を適当な培養培地で培養し、培養液から、慣用の手順、例えば限定することなく、遠心又は濾過により培養液から細胞を分離させ、必要に応じて細胞を破壊し、硫酸アンモニウムの如き塩により上清液又は濾液のタンパク質性成分を沈殿させ、次いで様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を行うことにより目的の蛋白質を回収することができる。

Ｗｎｔ３ａの毛包形成誘導活性は、例えばＷｎｔ３ａの作用により遺伝子発現が亢進する因子であるＬＥＦ−１（リンパ球エンハンサー因子1）を指標として測定することができる（Filali M et al, J Biol Chem 277, 33398-33410, 2002）。Ｗｎｔは細胞にβカテニン（β-CAT）というタンパク質を分解しないよう指示を出し、その結果βカテニンがＬＥＦ−１やそれに類似のタンパク質と結合することで毛包の再生や発毛に誘導する。ＬＥｆ−１の発現の確認は、例えばＲＴ−ＰＣＲ法やウェスタンブロッティングなど、周知の方法で行うことができる。

以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。

実験方法
Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７Ａプラスミドの構築
市販のヒト胎盤ｔｏｔａｌＲＮＡ（クロンテック）から合成したｃＤＮＡを鋳型に、センス鎖プライマーgatggccccactcggata（配列番号２）とアンチセンス鎖プライマーggtgcctacttgcaggtgt（配列番号３）を用いて、ＰＣＲ法によりヒトＷｎｔ３ａの全長を増幅した。増幅された各遺伝子のＰＣＲ産物を市販のキット（プロメガ）により精製した後、ｐＴａｒｇｅｔベクターに連結させ、大腸菌を用いてクローニングした。制限酵素の切断パターンの解析から各遺伝子を含むプラスミドを同定した後に、さらにＤＮＡシーケンサーを用いて、挿入された各遺伝子の塩基配列を決定した。Ｗｎｔ３ａをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を図１に示す。

細胞への遺伝子導入
以下の表１に示す各細胞を６穴プレートに１〜３×１０⁵個を播種し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で亜集密に達するまで培養を行った。次に、構築したＷｎｔ３ａまたはコントロールのｐＴａｒｇｅｔベクターを、市販の遺伝子導入試薬(Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）（ロッシュアプライドサイエンス）、ＣｏｍｂｉＭａｇ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｏｌｙＭａｇ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用い、これらの培養した細胞に導入した。どの細胞にどの遺伝子遺伝子導入試薬を使用したかは表１に示すとおりである。導入試薬の使用法は、各試薬の標準操作法に従った。また遺伝子導入効率は、ｐＴｒａｒｇｅｔにアザミグリーン遺伝子（医学生物学研究所）を連結したプラスミドを各細胞に導入し、アザミグリーン蛍光陽性の細胞の数をフローサイトメーター（ベックマン・コールター）で計測することにより算出した。各細胞に対して使用した、培地、遺伝子導入試薬、導入効率結果を表１に示した。

その結果、ＩＯＲＳ、ＩＤＰ及びＰＣ３細胞において比較的高い効率でＷｎｔ３ａ遺伝子が導入されることがわかった。

ＲＴ−ＰＣＲによるＷｎｔ３ａのｍＲＮＡ過剰発現の確認
構築したＷｎｔ３ａまたはコントロールのpTargetベクターをＩＯＲＳ細胞に導入し、２日後にIsogen（ニッポンジーン）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出して、さらにｃＤＮＡを合成した。得られたＩＯＲＳ細胞のｃＤＮＡを鋳型に、ヒトＷｎｔ３ａについてセンス鎖側プライマーcaggaactacgtggagatca（配列番号４）とアンチセンス鎖側プライマーccatcccaccaaactcgatg（配列番号５）を用いてＰＣＲ反応を行い、導入したプラスミドによるＷｎｔ３ａの発現を調べたところ、その過剰発現が認められた（データーを示さない）。

ウエスタンブロット法による組換えＷｎｔ３ａタンパク質の発現の確認
遺伝子を導入して２日後に、表１に示す各遺伝子導入細胞をＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のサンプルバッファーに溶解させて熱処理を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その際、Ｗｎｔプラスミドとコントロールベクターを導入した細胞間で、蛋白抽出前に計測した細胞数が同一となるようサンプルを調製した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルからセミドライ法により、タンパク質をメンブレンにトランスファーした。メンブレンを市販のブロッキング液で処理した後に、１次抗体としてＷｎｔ３ａ抗体(アブカム)を５００倍に希釈して反応させた。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後に、２次抗体のＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＧＥヘルスケアサイエンス）を２０００倍に希釈して反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後に、ＥＣＬＡｄｖａｎｃｅ（ＧＥヘルスケアサイエンス）用いて検出を行った。ポシティブコントロールとしては、市販のマウスＷｎｔ３ａ蛋白(Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ)を用いた。その結果を図２に示す。ＩＯＲＳ及びＩＤＰ細胞ではＷｎｔ３ａの高発現が認められ、ＰＣ３細胞でも発現が認められた。

Ｌｅｆ−１の発現亢進による導入したＷｎｔ３ａの機能発現の確認
構築したプラスミドの導入により過剰発現させたＷｎｔ３ａが生理的な機能しているか、Ｗｎｔの作用により遺伝子発現が亢進する因子であるＬｅｆ−１（Filali M et al, J Biol Chem 277, 33398-33410, 2002）を指標として調べた。Ｗｎｔ３ａプラスミドまたはコントロールのｐＴｒａｒｇｅｔベクターをＩＯＲＳ細胞に導入し、２日後にＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出して、さらにｃＤＮＡ合成を行った。得られたＩＯＲＳ細胞のｃＤＮＡを鋳型に、センス鎖側プライマーcttccttggtgaacgagtctg（配列番号６）とアンチセンス鎖側プライマーgtgttctctggccttgtcgt（配列番号７）を用いてヒトＬｅｆ−１のＰＣＲ反応を行った。
その結果を図３に示す。Ｗｎｔ３ａプラスミドを導入した場合に、コントロールと比較してＬｅｆ−１遺伝子の発現亢進が認められ、導入したＷｎｔ３ａが生理的に機能していることが分かった。

Ｗｎｔ３ａをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。Ｗｎｔ３ａ導入細胞のウェスタンブロッティング。Ｌｅｆ−１の発現亢進による導入したＷｎｔ３ａの機能発現の確認。

Claims

ヒトＷｎｔ３ａ遺伝子を含むベクターにより形質転換された、ＩＯＲＳ（不死化外毛根鞘）又はＩＤＰ（不死化毛乳頭）細胞である毛包由来細胞、及びＰＣ３（ヒト前立腺癌）細胞からなる群から選択される細胞。
前記ベクターがｐＴａｒｇｅｔベクターである、請求項１記載の細胞。