JP5300273B2 - ヒトWnt3a遺伝子形質転換細胞 - Google Patents
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Description
従って、本願は下記の発明を包含する:
(1)ヒトWnt3a遺伝子を含むベクターにより形質転換された、毛包由来細胞及び前立腺癌由来細胞からなる群から選択される細胞。
(2)前記毛包由来細胞がIORS又はIDP細胞である、(1)の細胞。
(3)前記前立腺癌由来細胞がPC3細胞である、(1)の細胞。
(4)前記ベクターがpTargetベクターである、(1)〜(3)のいずれかの細胞。
また、所望により、発現ベクターには更にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点、等を含んでよい。
ヒト外毛根鞘細胞を得るには、ヒトの頭皮を、例えば美容整形外科手術や外科手術の副産物として得、これをこの頭皮から実体顕微鏡下で毛包組織を得る。次にこの毛包組織を、加水分解酵素溶液、例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ混合溶液で37℃、30分間処理した後に、コラーゲンコーティングした培養皿に静置させ、低カルシウム無血清培地、例えばK−GM(Clonetics)やKeratinocyte−SFM(GIBCO BRL)中で培養し、この間2日間ごとに培地を交換する。細胞が増殖したことを確認した後、培養器に付着している細胞を遊離させ遠心分離により細胞を回収した後、無血清培地により継代培養を行う。
Wnt3a、Wnt7Aプラスミドの構築
市販のヒト胎盤total RNA(クロンテック)から合成したcDNAを鋳型に、センス鎖プライマーgatggccccactcggata(配列番号2)とアンチセンス鎖プライマーggtgcctacttgcaggtgt(配列番号3)を用いて、PCR法によりヒトWnt3aの全長を増幅した。増幅された各遺伝子のPCR産物を市販のキット(プロメガ)により精製した後、pTargetベクターに連結させ、大腸菌を用いてクローニングした。制限酵素の切断パターンの解析から各遺伝子を含むプラスミドを同定した後に、さらにDNAシーケンサーを用いて、挿入された各遺伝子の塩基配列を決定した。Wnt3aをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を図1に示す。
以下の表1に示す各細胞を6穴プレートに1〜3×105個を播種し、37℃、5% CO2の条件下で亜集密に達するまで培養を行った。次に、構築したWnt3aまたはコントロールのpTargetベクターを、市販の遺伝子導入試薬(Fugene(登録商標)(ロッシュアプライドサイエンス)、CombiMag(OZ Biosciences)、PolyMag(OZ Biosciences))を用い、これらの培養した細胞に導入した。どの細胞にどの遺伝子遺伝子導入試薬を使用したかは表1に示すとおりである。導入試薬の使用法は、各試薬の標準操作法に従った。また遺伝子導入効率は、pTrargetにアザミグリーン遺伝子(医学生物学研究所)を連結したプラスミドを各細胞に導入し、アザミグリーン蛍光陽性の細胞の数をフローサイトメーター(ベックマン・コールター)で計測することにより算出した。各細胞に対して使用した、培地、遺伝子導入試薬、導入効率結果を表1に示した。
構築したWnt3aまたはコントロールのpTargetベクターをIORS細胞に導入し、2日後にIsogen(ニッポンジーン)を用いてtotal RNAを抽出して、さらにcDNAを合成した。得られたIORS細胞のcDNAを鋳型に、ヒトWnt3aについてセンス鎖側プライマーcaggaactacgtggagatca(配列番号4)とアンチセンス鎖側プライマーccatcccaccaaactcgatg(配列番号5)を用いてPCR反応を行い、導入したプラスミドによるWnt3aの発現を調べたところ、その過剰発現が認められた(データーを示さない)。
遺伝子を導入して2日後に、表1に示す各遺伝子導入細胞をSDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)のサンプルバッファーに溶解させて熱処理を行い、SDS−PAGEに供した。その際、Wntプラスミドとコントロールベクターを導入した細胞間で、蛋白抽出前に計測した細胞数が同一となるようサンプルを調製した。次に、SDS−PAGE後のゲルからセミドライ法により、タンパク質をメンブレンにトランスファーした。メンブレンを市販のブロッキング液で処理した後に、1次抗体としてWnt3a抗体(アブカム)を500倍に希釈して反応させた。PBS−Tによる洗浄の後に、2次抗体のHRP標識抗ウサギIgG(GEヘルスケアサイエンス)を2000倍に希釈して反応させた。さらに、PBS−Tによる洗浄の後に、ECL Advance(GEヘルスケアサイエンス)用いて検出を行った。ポシティブコントロールとしては、市販のマウスWnt3a蛋白(R&D system)を用いた。その結果を図2に示す。IORS及びIDP細胞ではWnt3aの高発現が認められ、PC3細胞でも発現が認められた。
構築したプラスミドの導入により過剰発現させたWnt3aが生理的な機能しているか、Wntの作用により遺伝子発現が亢進する因子であるLef−1(Filali M et al, J Biol Chem 277, 33398-33410, 2002)を指標として調べた。Wnt3aプラスミドまたはコントロールのpTrargetベクターをIORS細胞に導入し、2日後にIsogen(ニッポンジーン)を用いてtotalRNAを抽出して、さらにcDNA合成を行った。得られたIORS細胞のcDNAを鋳型に、センス鎖側プライマーcttccttggtgaacgagtctg(配列番号6)とアンチセンス鎖側プライマーgtgttctctggccttgtcgt(配列番号7)を用いてヒトLef−1のPCR反応を行った。
その結果を図3に示す。Wnt3aプラスミドを導入した場合に、コントロールと比較してLef−1遺伝子の発現亢進が認められ、導入したWnt3aが生理的に機能していることが分かった。
Claims (2)
- ヒトWnt3a遺伝子を含むベクターにより形質転換された、IORS(不死化外毛根鞘)又はIDP(不死化毛乳頭)細胞である毛包由来細胞、及びPC3(ヒト前立腺癌)細胞からなる群から選択される細胞。
- 前記ベクターがpTargetベクターである、請求項1記載の細胞。
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