KR20210147343A - 세포외기질 모티프를 포함하는 세포배양용 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포배양용 융합 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포외기질 모티프 및 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포배양용 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포배양용 융합 단백질은 배양된 세포의 생물학적 활성, 즉 세포 부착능, 세포 이동능, 세포 노화 억제능 및 콜로니 형성능을 증가시킬 뿐만 아니라, 세포의 수확량을 현저히 향상시킨다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 세포배양용 융합 단백질은 세포배양 분야 및 세포 치료제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포배양용 융합 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포외기질 모티프 및 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포배양용 융합 단백질에 관한 것이다.
심혈관질환은 세계적으로 가장 사망률이 높은 질환 중 하나이다. 이에 대한 기존의 주된 치료방법은 약물 투여 중심의 내과적 치료법과 막힌 혈관을 뚫어주는 경피적 심혈관 중재술/관상동맥 우회 이식술 등의 중재적 치료가 행해지며, 말기심부전과 같은 말기 심장질환에 이르렀을 경우 심장이식이 요구된다. 표준치료법을 통해 심혈관 질환으로 인한 사망률은 감소하였지만 여전히 심혈관 질환은 전 세계 사망원인 1위로 손꼽히고 있으며, 급성 심근경색의 약 30%는 만성 심부전으로 발전된다고 보고되어진다. 때문에 현재 의학기술로 치료가 불가능한 광범위한 심혈관 질환의 경우 대안 치료로 허혈 부위 주변의 조직으로부터 심근재생을 촉진하여 허혈조직의 혈류를 확보하고 조직의 손상을 줄이고자 하는 줄기세포 치료법이 제안되고 있다. 또 다른 치료전략으로써, 심근재생 촉진인자를 직접 또는 이의 유전자를 투여하여 심장 내 세포의 증식 및 발달을 촉진하는 방법이 다수 진행되고 있으나 미약한 효과 및 부작용 문제가 제기되어 실질적인 도입까지는 더 많은 연구가 필요한 실정이다.
한편, 심장전구세포는 심근 세포, 평활근 세포, 혈관내피세포 등과 같은 세가지 세포유형으로 분화가 가능하며, 자가재생하는 능력을 가지고 있어 손상된 심장 조직의 재생에 관여한다고 알려져 있다. 현재 줄기세포를 이용한 혈관 신생 및 재생 분야에서는 임상적용을 위해 성체줄기세포를 이용하고 있는데 환자 자신의 몸에서 추출하여 필요한 조직에 자가 이식이 가능하며 배아줄기세포와 비교하여 윤리적 문제가 없다는 장점을 가지고 있다. 하지만 서구화된 식생활과 운동의 감소, 고령화 등으로 인한 환자유래 세포의 노화 및 기능 저하로 인하여 실용화 단계로 이어지는데 어려움이 있다. 때문에 줄기세포의 증폭 및 생물학적 활성 증진을 위한 연구는 세포 치료 실용화를 위한 핵심 요소이다. 이에, 기능적으로 보다 더 우수한 줄기세포를 수급할 수 있는 시스템을 갖추는 것이 필요하다. 이러한 요구에 최근 줄기세포 치료제 실용화를 위한 세포의 기능을 강화시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이에 본 발명자들은 세포외기질인 피브로넥틴 및 비트로넥틴 모티프 및 홍합 접착 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제조하고, 상기 융합 단백질의 세포 활성 및 수확량 증가를 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 세포외기질(extracellular matrix) 모티프 및 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포배양용 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포배양용 융합 단백질을 포함하는 배지 조성물, 세포배양기 및 줄기세포 활성 증가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포외기질 모티프 및 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포배양용 융합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질을 포함하는 배지 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질을 포함하는 줄기세포의 활성 증가용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질이 코팅된 세포배양기를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포배양용 융합 단백질은 배양된 세포의 생물학적 활성, 즉 세포 부착능, 세포 이동능, 세포 노화 억제능 및 콜로니 형성능을 증가시킬 뿐만 아니라, 세포의 수확량을 현저히 향상시킨다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 세포배양용 융합 단백질은 세포배양 분야 및 세포 치료제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 ECM 펩타이드 모티프 기반 융합 단백질을 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 MTS 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기의 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 유세포 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 표지자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 MTS 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에 초기에 부착된 세포의 수를 나타낸 도이다.
도 6은 형광 이미징을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에 부착된 세포 수를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 웨스턴 블롯팅을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 부착 관련 인자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 상처 회복 분석(wound healing assay)를 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 이동능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 SA-β-gal 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 노화를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 웨스턴 블롯팅을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 노화 마커의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구 줄기세포의 계대 수에 따른 배가 시간을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구 줄기세포의 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 qPT-PCR을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 줄기세포능 관련 mRNA의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 계대 수에 따른 세포 수확량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 MTS 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기의 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 유세포 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 표지자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 MTS 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에 초기에 부착된 세포의 수를 나타낸 도이다.
도 6은 형광 이미징을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에 부착된 세포 수를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 웨스턴 블롯팅을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 부착 관련 인자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 상처 회복 분석(wound healing assay)를 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 이동능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 SA-β-gal 분석을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 노화를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 웨스턴 블롯팅을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 노화 마커의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구 줄기세포의 계대 수에 따른 배가 시간을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구 줄기세포의 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 qPT-PCR을 통해 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 줄기세포능 관련 mRNA의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 계대 수에 따른 세포 수확량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 모티프 및 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포배양용 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 세포외기질은 세포가 세포의 외부로 분비한 여러 가지 물질이 형성하는 세포의 구조를 의미한다. 상기 세포외기질은 세포와 조직 사이의 공간을 채워줌으로써 세포를 보호 및 지지하는 기능을 한다. 또한 세포외기질은 세포 간 생화학적 신호 전달을 통해 세포의 발생 및 분화 메커니즘에서 중요한 역할을 한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포외기질은 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 피브로넥틴 또는 비트로넥틴일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포외기질 모티프는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 것이 바람직하다. 또한 상기 세포외기질 모티프의 범위에는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 기능적 동등물 및 그들의 염을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 1 또는 2의 펩타이드와 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 홍합 접착 단백질(mussel adhesive protein, MAP)은 홍합 접착 단백질-151(MAP-151)일 수 있다. 상기 홍합 접착 단백질-151은 발현 시스템에서 발현율이 낮다는 문제를 해결하기 위하여, 유전적 수준에서 홍합 접착 단백질-1의 10개 반복 아미노산의 6회 반복 구조를 홍합 접착 단백질-5의 N- 및 C- 말단에 연결하여 제조된 하이브리드 홍합 접착 단백질이다. 상기 홍합 접착 단백질-151은 대장균 발현 시스템에서 생산성이 높고, 아세트산을 이용하여 분리 및 정제할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포배양은 골수, 혈액, 지방, 태반, 제대혈, 뇌, 간, 췌장, 심장, 피부, 신경 및 근육으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에서 유래된 성체줄기세포를 배양하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포배양용 융합 단백질은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시예를 통해, 본 발명에 따른 세포배양용 융합 단백질이 코팅된 배양기로 성체줄기세포를 배양하는 경우 세포 부착능, 세포 이동능 및 콜로니 형성능을 현저히 증가시키고, 세포 노화를 감쇠시키며, 세포 수확량을 현저히 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 세포배양용 융합 단백질은 세포배양 분야 및 줄기세포 치료제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질을 포함하는 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 배지(media)는 체외배양 조건에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다.
또한 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 상기 세포배양 최소 배지의 예로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질을 포함하는 줄기세포의 활성 증가용 조성물를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포의 활성은 세포 부착능, 세포 이동능, 세포 노화 억제능 및 콜로니 형성능으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질이 코팅된 세포배양기를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 세포배양기는 세포 배양 플레이트, 페트리 디쉬, 배양 플라스크, 챔버 슬라이드, 챔버 또는 튜브 형태일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 세포배양기는 유리, 폴리스티렌, 폴리카프로락톤 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 소재일 수 있으나, 세포가 부착되기에 적합한 소재라면 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포는 골수, 혈액, 지방, 태반, 제대혈, 뇌, 간, 췌장, 심장, 피부, 신경 및 근육으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에서 유래된 성체줄기세포인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 심장 유래 성체줄기세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포의 활성은 세포 부착능, 세포 이동능, 세포 노화 억제능 및 콜로니 형성능으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 대량 생산 방법을 제공한다.
일반적으로, 세포의 계대배양을 할 경우 세포의 노화(senescence)로 인해 세포 성장 및 분열이 정지되거나 유의성있게 지연된다. 본 발명에 따른 줄기세포의 대량 생산 방법은 줄기세포의 생물학적 활성을 증가시킴으로써, 계대 수가 증가하여도 줄기세포의 수확량이 유지 또는 증가될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 방법을 통해 줄기세포의 대량 확보가 가능하다는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. ECM(extracellular matrix) 펩타이드 모티프 기반 융합 단백질 제작 및 ECM 기반 배양기 제조
1-1. ECM 펩타이드 모티프 선별
ECM(extracellular matrix)인 피브로넥틴(fibronectin) 및 비트로넥틴(vitronectin)으로부터 펩타이드 모티프를 선별하였다. 선별된 피브로넥틴 기반 모티프는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되며, 비트로넥틴 기반 모티프는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시된다.
1-2. ECM 펩타이드 모티프 기반 융합 단백질 제작
도 1에 나타낸 바와 같이, 홍합 접착 단백질-151(mussel adhesive protein-151, MAP-151)(서열번호 5)의 말단에 상기 실시예 1-1에서 선별된 ECM 펩타이드 모티프를 결합시켜, ECM 펩타이드 모티프 기반 융합 단백질을 제작하였다.
제작된 ECM 펩타이드 모티프 기반 융합 단백질은 각각 Fibro-P(Fibronectin-MAP) 및 Vitro-P(Vitronectin-MAP)로 명명하였다. 상기 Fibro-P는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되며, Vitro-P는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된다.
1-3. ECM 기반 배양기 제조
상기 실시예 1-2에서 제작된 ECM 펩타이드 모티프 기반 융합 단백질을 이용하여 ECM 기반 배양기를 제조하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 제작된 융합 단백질을 각각 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 2.4 및 4.8 mg/ml의 농도로 플레이트에 코팅하였다. 제조된 ECM 기반 배양기는 후술된 실험에 사용하였다.
또한 후술되는 실험의 대조군은 시판중인 배양 플레이트(Cell Culture Dish, SPL, Cat. 20100)를 이용하였고, ‘No treat’ 또는 ‘Normal’로 표시하였다.
실시예 2. ECM 기반 배양기의 세포독성 분석
상기 실시예 1에서 제조된 ECM 기반 배양기의 세포독성은 MTS 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, C-kit 양성 인간심장전구줄기세포(cardiac progenitor cell, CSC) 5,000개를 ECM 배양기(96웰 플레이트)에 시딩한 후 배양하였다. 상기 배양에 사용한 배지는 F-12 Ham's Medium(Hyclone, #SH30026.01, GE healthcare, Chicago IL, USA), 10% FBS(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA), 1% penicillin/streptomycin, 2mM glutathione(sigma-Aldrich, St.Louis, CA, USA), 10ng/mL recombinant human basic fibroblast growth factor(rb-FGF; Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 0.005 unit/mL human erythropoietin(hEPO; R&D system, Minneapolis, MN, USA)을 포함한다. 또한 상기 세포는 5% CO2 및 37˚C 조건의 배양기에서 배양하였으며, 2일 마다 배지를 교체 및 계대배양하였다. 한편, WST-기반 세포 생존능/독성 평가 키트의 CCK(Cell Counting Kit) 용액 및 배양 배지를 1:10의 부피비로 혼합하여 카운팅 배지를 준비하였다. 세포 배양 24시간 후 각 웰에 상기 카운팅 배지 100 μl씩 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정값에 기초하여 세포 생존율을 도출하였고, 이로부터 세포 독성을 확인하였다. 세포독성 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 배양된 C-kit 양성 심장전구줄기세포는 시판중인 배양기(즉, 대조군)에 비해 세포 생존율이 높은 것을 확인하였다. 상기 결과는 실시예 1에서 제조된 ECM 기반 배양기는 세포 독성이 매우 낮다는 것을 의미한다.
실시예 3. ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 형태학적 분석
상기 실시예 1에서 제조된 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 형태학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2와 같은 조건으로 C-kit 양성 인간심장전구줄기세포를 배양하였다. 배양된 인간심장전구줄기세포를 광학현미경으로 세포를 관찰하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 배양된 인간심장전구줄기세포는 대조군과 형태학적으로 유사한 것을 확인하였다.
실시예 4. ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 표지자 발현 분석
유세포 분석을 통해 상기 실시예 1의 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 대표적인 세포 표지자(CD34, CD45, CD133, CD90, CD29, CD44 및 CD105)의 발현을 분석하였다. 구체적으로, ECM 기반 배양기 Fibro-P 및 Vitro-P에서 인간심장전구줄기세포를 각각 시딩한 후 14일 동안 배양하였다. 상기 세포배양은 실시예 2의 배양조건과 동일하게 배양하였다. 배양된 인간심장전구줄기세포를 유세포 분석 버퍼(2 mM EDTA, 2% FBS in PBS solultion) 100 μl에 희석하여 세포 희석액을 제조하였다. 각 세포 표지자에 대한 항체ff 1:100 내지 1:200의 비율로 희석한 후 상기 세포 희석액에 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 유세포 분석 버퍼로 세포를 3회 세척한 후 원심분리하여 세포 펠릿을 얻었다. 상기 세포 펠릿을 유세포 분석 버퍼 100 μl에 재부유시켰으며, 유세포 분석기를 이용하여 형광으로 표지된 세포를 분석하였다. 유세포 분석 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기로 배양된 세포는 배양 후 세포 표지자의 발현이 대조군(Normal)과 유사하였다. 상기 결과는 ECM 기반 배양기 Fibro-P 및 Vitro-P에서 인간심장전구줄기세포를 장기배양하여도, 표현형에는 큰 영향을 받지 않는다는 것, 즉 배양된 세포에 변형이 일어나지 않는다는 것을 의미한다.
실시예 5. ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 부착능 분석
5-1. 초기 부착세포 확인
Fibro-P 및 Vitro-P를 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 2.4 및 4.8 mg/ml)로 코팅한 ECM 기반 배양기(96웰)에 인간심장전구내피세포를 시딩하였다. 세포가 충분히 부착되기 전에 상층액을 제거하고, PBS로 세포를 세척하였다. 위의 경우 시딩 초기에 빠르게 부착된 세포만 배양기에 남게된다. 배양기에 남아있는 세포를 상기 실시예 2의 MTS 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기는 초기에 부착된 세포수가 대조군(No treat)에 비해 현저히 많은 것을 확인하였다.
5-2. 형광 이미징
Fibro-P 및 Vitro-P를 다양한 농도(0.05 및 0.1 mg/ml)로 코팅한 ECM 기반 배양기(6웰)에 인간심장전구내피세포를 1x105개 시딩한 후 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세척된 세포를 NucBlue Live Ready Probes Reagent를 이용하여 형광염색하였다. Lion heart 기기를 이용하여 형광염색된 세포를 이미징하였다. 본 실시예에서 대조군은 상기 실시예 1-3의 시판중인 플레이트 및 피브로넥틴을 0.05 mg/ml의 농도로 코팅한 플레이트를 이용하였다. 형광이미징 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기는 시판중인 플레이트(Normal)에 비해 부착된 세포의 수가 많은 것을 확인하였다. 특히, 0.1 mg/ml Fibro-P, 0.05 mg/ml Vitro-P 및 0.1 mg/ml Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기는 피브로넥틴으로 코팅한 플레이트에 비해 부착된 세포가 많은 것을 확인하였다.
5-3. 세포 부착 관련 인자의 발현 분석
ECM 기반 배양기에서 배양된 인간심장전구줄기세포에서 세포 부착 관련인자인 Fak-Src의 발현 및 인산화 여부를 웨스턴 블롯팅을 통해 분석하였다. 구체적으로, Fibro-P 및 Vitro-P를 다양한 농도(0.05 및 0.1 mg/ml)로 코팅한 ECM 기반 배양기(6웰)를 준비하였다. 준비된 ECM 기반 배앙기에 인간심장전구줄기세포를 시딩한 후 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하였고, 단백질 용해 버퍼를 처리하여 세포 내 단백질을 추출 및 정량하였다. 단백질 정량 결과를 토대로, 동량의 단백질을 이용하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다. 그 후, 전기영동된 단백질을 PVDF 멤브레인에 옮겨 5% 스킴밀크로 30분 동안 블로킹(blocking)하였다. 블로킹된 PVDF 멤브레인에 각 단백질에 대한 1차 항체(1:1000)를 첨가하여 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 상기 1차 항체는 FAK(Santa Cruz), p-FAK(Cell Signalling), Src(Cell Singnaling), p-Src(Santa Cruz) 및 b-actin(Santa Cruz)이다. 1차 항체와 반응시킨 후 HRP가 결합된 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 X-ray 필름 및 Automatic X-ray Film Processor(JPI Healthcare)를 이용하여 현상하였다. 또한 이미지J 소프트웨어를 이용하여 X-Ray 현상 결과에 기초한 그래프를 작성하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포는 인산화된 FAK 및 Src의 발현이 대조군(Nermal)에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다. 상기 결과는 ECM 기반 배양기로 배양된 세포의 세포 부착능이 증가하는 것은, 다양한 세포의 부착을 조절하는 대표적인 신호전달 경로인 Fak-Src 신호의 활성화에 의한 것임을 의미한다.
실시예 6. ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 이동능 분석
세포의 이동능을 분석하기 위하여, Fibro-P 및 Vitro-P가 0.1mg/ml로 코팅된 ECM 기반 배양기의 각 웰에 인간심장전구줄기세포 1x105개를 시딩한 후 2일 동안 배양하였다. 배양기에 세포가 90% 이상 찼을 때 상층액을 제거한 후 PBS로 1회 세척하였다. 그 후 웰에 PBS를 첨가하였고, 옐로우팁을 이용하여 스크래치를 냈다. 스크래치를 낸지 3 및 6시간 후 세포의 이동을 광학현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포는 대조군(Normal)에 비해 스크래치 범위가 현저시 감소, 즉, 세포가 많이 이동한 것을 확인하였다.
실시예 7. ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 세포의 노화 분석
실시예 1에서 제조된 ECM 기반 배양기로 C-kit 양성 인간심장전구줄기세포를 24일 동안 배양하였다. 상기 세포배양은 실시예 2의 배양조건과 동일하게 배양하였다. 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 후술되는 세포 노화 분석에 사용하였다.
7-1. 형태학적 분석
계대배양된 인간심장전구줄기세포의 형태학적 분석을 실시하였다. 배양된 인간심장전구줄기세포를 광학현미경으로 세포를 관찰하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 배양 기간 및 계대 수에 따라 세포 노화가 진행되며, 상기 세포 노화에 따라 세포의 길이 및 너비가 증가하는 양상을 보였다. 다만, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기로 배양된 인간심장전구줄기세포는 대조군(Normal)에 비해 세포의 길이 및 너비가 현저히 작은 것을 확인하였다.
7-2. 세포 노화에 대한 방어능 분석
SA-β-gal assay kit(cell signaling)를 이용하여 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 노화를 분석하였다. 상기 세포 노화 분석은 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였다. 실험 결과는 현미경 이미징을 통해 확인하였고, 이를 토대로 세포그룹 당 노화된 세포, 즉 β-gal 양성 세포(녹색)의 수를 측정하여 그래프화하였다. 세포 노화 분석 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 대조군(Normal)에 비해 노화된 세포가 유의하게 적은 것을 확인하였다. 이는 Fibro-P 및 Vitro-P가 세포 노화를 감쇠시킨다는 것을 의미한다.
7-3. 세포 노화 마커의 발현 분석
웨스턴 블롯팅을 통해 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 세포 노화 마커 P53 및 P16의 발현을 분석하였다. 상기 웨스턴 블롯팅은 실시예 5-3의 방법으로 실시하였고, 1차 항체는 p16(Abcam) 및 p53(Abcam)을 사용하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 대조군(Normal)에 비해 세포 노화 마커의 발현이 낮은 것을 확인하였다.
7-4. 계대 수에 따른 배가 시간 확인
성체줄기세포의 경우 지속적으로 계대배양할 경우 노화로 인해 세포의 배가 시간(doubling time)이 증가한다. 이에, 인간심장전구줄기세포의 계대 수에 따른 배가 시간을 확인하였다. 구체적으로, 인간심장전구줄기세포를 ECM 기반 배양기에서 배양하였고, 계대배양할 때 마다 시간 및 세포 수를 측정하였다. 측정된 결과를 바탕으로 배가 시간을 계산하였으며, 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 배가 시간이 대조군(Normal)에 비해 현저히 짧은 것을 확인하였다.
상기 결과는 Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 대조군에 비해 유의적으로 세포 노화가 감쇠한다는 것을 의미한다.
실시예 8. ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 줄기세포능 분석
8-1. 콜로니 형성능
심장줄기세포의 주요 특징 중 하나인 줄기세포능에 미치는 영향을 콜로니 형성능 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, 인간심장전구줄기세포를 ECM 기반 배양기에서 3회 계대배양한 후 세포를 수확하였다. 수확된 세포(계대 수 : 4)를 단일세포로 준비하였다. 상기 단일세포를 96웰 플레이트(1% 젤라틴 코팅)에 시딩하고, 7 내지 14일 동안 배양하였다. 배양 기간 동안 현미경을 통해 콜로니 형성 여부를 확인하였다. 실험 결과는 콜로니가 형성된 웰의 수를 측정하여 그래프로 나타내었다. 콜로니 형성능 분석 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 콜로니 형성능이 대조군에 비해 유의하게 높은 것을 확인하였다.
8-2. mRNA 발현 확인
ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포에서 줄기세포능 관련 mRNA(c-kit, Klf4 및 Nanog)의 발현을 분석하였다. 구체적으로, 인간심장전구줄기세포를 ECM 기반 배양기에서 3회 계대배양한 후 세포 펠릿을 수득하였다. 수득된 세포 펠릿에 TRIzol을 처리하여 RNA를 분리하였고, PrimeScript 1st stand cDNA Synthesis Kit(Takara)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, 프라이머(c-kit, Klf4, Nanog) 및 Faststart Essential DNA green master mix(Roche)를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 상기 qRT-PCR은 Lightcycle 96 real-time pcr system(Roche)을 이용하였다. 줄기세포능 관련 mRNA의 발현을 분석한 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 c-kit 및 Klf4의 발현이 대조군(Normal)에 비해 유의하게 높은 것을 확인하였다. 특히, Fibro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대 배양된 인간심장전구줄기세포는 Nanog의 발현도 현저히 높은 것을 확인하였다.
실시예 9. ECM 기반 배양기로 계대배양된 인간심장전구줄기세포의 수확량 분석
줄기세포 치료제로 이용하기 위해서는 세포 수를 다량 확보하는 것이 중요하다. 이에, ECM 기반 배양기에서 배양된 인간심장전구줄기세포의 수확량을 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 7-4에서 계대 수에 따른 배가 시간을 확인하기 위해 측정한 세포수 측정 데이터를 토대로, accumulation curve를 작성하였다. 작성된 accumulation curve는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, Fibro-P 및 Vitro-P로 코팅된 ECM 기반 배양기에서 계대배양된 인간심장전구줄기세포는 계대 수가 증가할수록 대조군(Normal)에 비해 세포 수확량이 통계적으로 유의하게 많은 것을 확인하였다. 상기 결과는 ECM 기반 배양기를 이용할 경우 세포의 대량 확보가 가능한바, 상기 ECM 기반 배양기는 세포 치료제 제조에 유용하게 활용될 수 있음을 의미한다.
종합적으로 본 발명자들은 ECM 모티프 및 홍합 접착 단백질의 융합단백질을 제조하고, 이를 이용하여 ECM 기반 배양기를 제조하였다. 상기 ECM 기반 배양기는 인간심장전구줄기세포의 세포 부착능, 세포 이동능 및 콜로니 형성능을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 노화를 감쇠시키고, 세포 수확량을 현저히 증가시킨다는 것을 확인하였다. 이는 ECM 기반 배양기가 줄기세포의 생물학적 활성을 증가시킨다는 것을 의미하는 바, 세포배양 분야 및 줄기세포 치료제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation
<120> Fusion protein for cell culture including extracellular matrix
motif and use thereof
<130> 1.411
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin motif
<400> 1
Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg
1 5 10 15
Gly Asp Ser Pro
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> vitronectin motif
<400> 2
Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro
1 5 10 15
<210> 3
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fibro-P
<400> 3
Met Ala Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
20 25 30
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
35 40 45
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly
50 55 60
Cys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr
65 70 75 80
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly
85 90 95
Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr
100 105 110
Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His
115 120 125
Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Glu Phe
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
165 170 175
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
180 185 190
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Lys Leu Pro His
195 200 205
Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg
210 215 220
Gly Asp Ser Pro
225
<210> 4
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vitro-P
<400> 4
Met Ala Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
20 25 30
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
35 40 45
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly
50 55 60
Cys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr
65 70 75 80
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly
85 90 95
Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr
100 105 110
Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His
115 120 125
Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Glu Phe
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
165 170 175
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
180 185 190
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Lys Leu Lys Gly
195 200 205
Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro
210 215 220
<210> 5
<211> 206
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mussel adhesive protein-151
<400> 5
Met Ala Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
20 25 30
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
35 40 45
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly
50 55 60
Cys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr
65 70 75 80
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly
85 90 95
Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr
100 105 110
Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His
115 120 125
Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Glu Phe
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
165 170 175
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
180 185 190
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Lys Leu
195 200 205
Claims (11)
- 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 모티프 및 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포배양용 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 세포외기질은 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 세포배양용 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
상기 세포외기질 모티프는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 세포배양용 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
상기 세포배양용 융합 단백질은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 세포배양용 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
상기 세포배양은 골수, 혈액, 지방, 태반, 제대혈, 뇌, 간, 췌장, 심장, 피부, 신경 및 근육으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에서 유래된 성체줄기세포를 배양하는 것인, 세포배양용 융합 단백질. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 세포배양용 융합 단백질을 포함하는, 배지 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 세포배양용 융합 단백질을 포함하는, 줄기세포의 활성 증가용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 줄기세포의 활성은 세포 부착능, 세포 이동능, 세포 노화 억제능 및 콜로니 형성능으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 줄기세포의 활성 증가용 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 세포배양용 융합 단백질이 코팅된, 세포배양기.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포배양용 융합 단백질 및 줄기세포를 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 대량 생산 방법.
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|---|---|---|---|
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| E601 | Decision to refuse application |