JP6629725B2 - 新規合成ペプチドおよびその利用 - Google Patents
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Description
なお、本出願は2014年6月23日に出願された日本国特許出願2014−128436号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
特にiPS細胞は、分化した細胞(典型液には体細胞、例えば皮膚の線維芽細胞等)を人為的に初期化(リプログラミング)することで多分化能と自己複製能を獲得させた細胞である。即ち、患者自身の体細胞(分化細胞)を利用してiPS細胞を作製可能である。このため、iPS細胞は、拒絶反応や倫理的課題がない若しくは少ないことから、再生医療用細胞資源として好適な細胞として期待され、臨床応用に向けた研究が急速に進められている。
即ち、ここで開示される合成ペプチド(初期化誘導ペプチド)は、少なくとも1種の分化細胞の初期化を誘導する人為的に合成されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列:
CKSKSRRSC(配列番号1);
若しくは、該アミノ酸配列において、1個、2個、又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加された改変アミノ酸配列であって、少なくとも1種の分化細胞の初期化を誘導する改変アミノ酸配列のいずれかからなる初期化誘導ペプチド配列を有する合成ペプチドである。
また、ここで開示される初期化誘導ペプチドを使用することで、従来のiPS細胞の作製方法で用いられる初期化因子(典型的には遺伝子、DNA)を使用することなく分化細胞の初期化を誘導することが可能である。換言すると、合成ペプチドの供給によって対象の分化細胞の初期化を誘導し得るため、遺伝子導入に起因するゲノムへの外来遺伝子の挿入の心配がない。
また、ここで開示される合成ペプチド(初期化誘導ペプチド)は、単純な構造(典型的には直鎖状のペプチド鎖)であり、化学合成(若しくは生合成)によって容易に人為的に製造することができる。さらに、ここで開示される初期化誘導ペプチドを使用することで、分化抑制因子(例えばbFGFやLIF等)に代表される高価な液性因子等を大量に使用することなく対象細胞の初期化を誘導することができるため、対象の分化細胞の初期化を低コストで実現することができる。このため、ここで開示される合成ペプチドは、分化細胞の初期化を誘導する用途に用いられる組成物の成分として好ましい。また、分化細胞を初期化して未分化細胞を生産する方法に利用することができる。
このような短いペプチド鎖からなるペプチドは構造安定性(例えばプロテアーゼ耐性)が高く、取扱い性や保存性に優れる。さらに、このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、比較的安価な製造コストで製造(入手)可能であるため好ましい。
かかる構成の組成物は、上述した初期化誘導ペプチドを含むため、該組成物を対象とする分化細胞(典型的には該細胞を培養する培地中)に供給することにより、該分化細胞の初期化を誘導することができる。このような組成物(初期化誘導剤)は、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の分化細胞(例えば線維芽細胞)の初期化を誘導する目的に好適に使用し得る。
かかる未分化細胞の生産方法によると、遺伝子導入等の煩雑な処理を行うことなくインビトロ(in vitro)培養系において未分化細胞を効率よく生産することができる。また、かかる未分化細胞の生産方法によると、上述のとおり単純な構成の合成ペプチド(あるいは該合成ペプチドを含む組成物)を細胞培養物中(典型的には当該細胞を培養する培地中)に供給して培養するという簡易な手法によって、目的の分化細胞(および該細胞からなる組織体)を初期化して未分化細胞を生産することができる。また、かかる未分化細胞の生産方法は、遺伝子導入を必要としないため、未分化細胞のゲノム中に導入遺伝子が挿入される心配がない。また、かかる未分化細胞の生産方法では、煩雑な操作や特別な装置を必要とすることなく、高い再現性をもって分化細胞の初期化を誘導し得るため、未分化細胞の生産方法として好ましい。
さらに、かかる未分化細胞の生産方法によると、分化抑制因子(例えばbFGFやLIF等)に代表される高価な液性因子等を大量に使用することなく(典型的には該液性因子を用いることなく)分化細胞から未分化細胞を作製し、該未分化細胞を未分化状態に長期間維持することができる。このため、未分化細胞の作製および作製した未分化細胞の維持を低コストで実現することができる。
ヒト由来の細胞から生産された未分化細胞は、医療分野(再生医療分野、新薬開発分野、基礎医学分野等)での利用価値が極めて高い。また、線維芽細胞は増殖能が高く、インビトロ培養系での培養(維持)が容易(典型的には単独培養が可能)な細胞であるため、該細胞を対象の分化細胞とすることで、未分化細胞を効率よく生産することができる。
かかる未分化細胞は、その生産工程において外来遺伝子の導入を必要としないため、ゲノム中への外来遺伝子の挿入に起因する腫瘍化の心配が少ない細胞である。
また、内在性のOct3/4、Nanog、Sox2、TRA1−81、SSEA−3およびALPは、多能性幹細胞(例えばES細胞、iPS細胞等)で特異的に発現する遺伝子であり、分化が進むにつれて該遺伝子の発現が減少(典型的には消滅)することが知られている。このため、これらの遺伝子の発現(即ち該遺伝子から転写、翻訳されたタンパク質の存在)は、細胞が未分化状態であることを示す指標(マーカー)、即ち未分化マーカーとして広く利用されている。また、これらの遺伝子の発現は、細胞が多能性を有することを示す指標(マーカー)、即ち多能性マーカーとしても使用される。したがって、Oct3/4、Nanog、Sox2、TRA1−81、SSEA−3およびALPの群から選択される1つ以上(好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上、さらに好ましくは4つ以上)の内在性の遺伝子を発現する未分化細胞は、再生医療用細胞資源として好適に使用し得る。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね100以下(好ましくは60以下、特に好ましくは50以下、例えば30以下)のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸及びC末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がN末端側であり右側がC末端側である。
CKSKSRRSC(配列番号1)
若しくはその改変アミノ酸配列を含む合成ペプチドである。配列番号1に示される具体的なアミノ酸配列は、本発明者がヒト由来のセントリン2のsiRNAを構成するRNA配列を独自に翻訳して得た、合計9アミノ酸残基の人為的なアミノ酸配列であることに加え、分化細胞の初期化を誘導し得ることが本発明者によって新たに見出されたアミノ酸配列である。
ここで、セントリンとは、真核細胞の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、セントリン2とは、セントリンファミリー(典型的には、セントリン1、セントリン2、セントリン3等)に属するタンパク質のうちの一つである(非特許文献4参照)。
配列番号3のアミノ酸配列は、IBV(トリ伝染性気管支炎ウイルス:avian infectious bronchitis virus)のNタンパク質(nucleocapsid protein)に含まれる合計8アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号4のアミノ酸配列は、HIV(ヒト免疫不全ウイルス:Human Immunodeficiency Virus)のTATに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計11アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号5のアミノ酸配列は、上記TATを改変したタンパク質導入ドメイン(PTD4)の合計11アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号6のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ(Drosophila)の変異体であるAntennapediaのANT由来の合計16アミノ酸配列から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
ここで開示される初期化誘導ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されたものであり得る。アミノ酸残基(典型的にはペプチド鎖のC末端アミノ酸残基)のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性(例えばプロテアーゼ耐性)を向上させることができる。
初期化誘導ペプチドのコンホメーション(立体構造)については、使用する環境下(生体外若しくは生体内)で初期化誘導活性を発揮し得る限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原(抗原)になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。また初期化ペプチドのペプチド鎖を構成するアミノ酸の残基数は特に限定されないが、化学合成が容易であり、安価に初期化誘導ペプチドを提供することができる観点から、鎖長の短いペプチドが好ましい。このような短鎖ペプチドは、典型的に構造安定性(例えばプロテアーゼ耐性)が高く、取扱い性や保存性に優れる。かかる観点から、初期化誘導ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量(典型的には50以下、好ましくは30以下のアミノ酸残基数、例えば25以下のアミノ酸残基数)のものが好適である。例えばアミノ酸残基数が10以下の合成ペプチドであってもよい。配列番号1のアミノ酸配列のみから成る短鎖ペプチドは好適な一例である。
或いはまた、ペプチド鎖中に膜透過性ペプチド配列を有しない場合は、全体のアミノ酸配列に対する初期化誘導ペプチド配列の占める割合は、概ね60%以上が望ましく、80%以上が好ましい。90%以上が特に好ましい。初期化誘導ペプチド配列から成る(即ち、初期化誘導ペプチド配列が全アミノ酸配列の100%を占める)ペプチドは好適な一例である。
なお、本発明の初期化誘導ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がL型アミノ酸であるものが好ましいが、初期化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がD型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
ここで開示される初期化誘導ペプチドは、市販のペプチド合成機(例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。)を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾(C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞(例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞)に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の初期化誘導ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型DNA(即ち初期化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片)を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物(ATP、RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等)を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット(例えば、日本の(株)セルフリーサイエンスから入手可能なPROTEIOS(商標)Wheat germ cell-free protein synthesis kit)が市販されている。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、初期化誘導ペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
初期化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液(例えばPBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、初期化誘導ペプチド(主成分)及び種々の担体(副成分)を材料にして種々の形態の薬剤(組成物)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
例えば、生体外(インビトロ)で培養(継代)している分化細胞を初期化する場合は、ここで開示される初期化誘導ペプチド(あるいは該ペプチドを含む初期化誘導剤)の適当量を、初期化を行う対象の分化細胞(細胞培養物)に対し、培養過程のいずれかの段階(好ましくは培養開始と同時、若しくは培養開始後の早い段階)で培地に少なくとも1回供給するとよい。供給量及び供給回数は、培養細胞の種類、細胞密度(培養開始時の細胞密度)、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。哺乳動物由来の分化細胞(典型的にはヒト由来の分化細胞)を初期化する場合であれば、培地中の初期化誘導ペプチド濃度が概ね0.1μM〜100μMの範囲内、好ましくは0.5μM〜50μM(例えば1μM〜20μM)の範囲内となるように、培養細胞(細胞培養物)に対して1〜複数回供給する(例えば培養開始時ならびに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加供給する)ことが好ましい。
上記初期化誘導ペプチドを供給した細胞培養物を培養する時間は、対象細胞の初期化を誘導することが可能な時間であれば、特に制限されない。例えば1日以上、好ましくは3日以上、より好ましくは7日以上の培養を行うとよい。通常35日以内(好ましくは28日以内、より好ましくは21日以内、例えば14日以内)には対象の分化細胞の初期化を誘導し得る。
未分化細胞を含む細胞培養物中から未分化細胞を選別(分離)する方法としては、例えばiPS細胞を含む細胞培養物中から未分化なiPS細胞を選別(分離)する方法を特に制限なく適用することができる。例えば、かかる選別方法としては、適当な選択培地を用いること、顕微鏡下でクラスターを構成する細胞を採取(ピックアップ)すること、未分化マーカー遺伝子の発現状態(典型的には、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質の存在)を基準にした細胞選別(セルソーティング、例えばFACSを用いたセルソーティング)を行うこと等により選別することができる。
評価の正確性の向上の観点からは、複数の未分化マーカー遺伝子の発現を確認することが好ましい。好ましくは、少なくともOct3/4およびNanogが発現していること、より好ましくは、Oct3/4およびNanogの他に、Sox2、TRA1−81、SSEA−3およびALPから選択される1つ以上の未分化マーカー遺伝子が発現していること、さらに好ましくはOct3/4、Nanog、Sox2、TRA1−81、SSEA−3およびALPが発現していること、を確認する。
なお、未分化マーカー遺伝子の発現は、例えば、酵素反応を利用した手法や抗原抗体反応を利用した免疫学的手法等の一般的な分子生物学的手法、具体的には、qPCR(定量ポリメラーゼ連鎖反応;Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)、ウエスタンブロッティング、細胞免疫染色等の手法により該遺伝子の遺伝子産物であるmRNAやタンパク質の存在を検出することで、確認することができる。
或いはまた、初期化された細胞は、典型的に多能性幹細胞(例えばES細胞、iPS細胞)が形成するクラスター(細胞の集合体、コロニー)に類似した形態のクラスター、即ち多能性幹細胞様クラスター(ES細胞様クラスター、或いはiPS細胞様クラスター)を形成するため、顕微鏡(位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡等)を用いて細胞の形態を観察することで確認してもよい。
また、ヒト由来のSIRIUS細胞(例えば患者由来のSIRIUS細胞、特に遺伝的要因による疾患を有する患者由来のSIRIUS細胞)は、疾患の病態解明や治療薬の研究開発等に好適に利用可能であり、これら研究分野における研究対象細胞としての利用価値が高い。
初期化誘導ペプチドとして、CKSKSRRSC(配列番号1)の初期化誘導ペプチド配列からなるペプチドを市販のペプチド合成機(Intavis AG社製品)を用いてマニュアルどおりに固相合成法(Fmoc法)を実施して合成した。以下、かかる合計9アミノ酸残基からなる直鎖状の合成ペプチドを「サンプル1」と呼称する。
なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。合成したサンプル1は、PBS(−)に溶かし、ペプチドストック液を調製した。
上記実施例1で得られたサンプル1を用いて、SIRIUS細胞を作製した。供試細胞として、ヒトの皮膚組織由来の線維芽細胞の培養細胞株である、CCD1079SK細胞(ATCC(登録商標) CRL-2097)を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
そして、上記60mmディッシュ中に播種したCCD1079SK細胞を、5%CO2、37℃の条件下のインキュベータ内で数時間(凡そ6時間)前培養(プレ培養)した。
上記数時間のプレ培養後のCCD1079SK細胞を、表1に示す例1〜例6にかかる培養条件のうちのいずれかで、本培養を行った。具体的な培養条件は、以下のとおりである。
例1にかかる培養条件は、CCD1079SK細胞を培養しているDMEM培地中(60mmディッシュ中)に、培地中のペプチド濃度が20μMとなる量のサンプル1の上記ストック液を添加し、30℃の温度条件下で培養するものである。
例2にかかる培養条件は、CCD1079SK細胞を培養しているDMEM培地中(60mmディッシュ中)に、培地中のペプチド濃度が20μMとなる量のサンプル1の上記ストック液を添加し、37℃の温度条件下で培養するものである。
例3にかかる培養条件は、CCD1079SK細胞を培養しているDMEM培地中(60mmディッシュ中)に、上記サンプル1添加区に添加したペプチドストック液と同容量のPBS(−)を添加し、30℃の温度条件下で培養するものである。
例4にかかる培養条件は、CCD1079SK細胞を培養しているDMEM培地中(60mmディッシュ中)に、上記サンプル1添加区に添加したペプチドストック液と同容量のPBS(−)を添加し、37℃の温度条件下で培養するものである。
例5に係る培養条件は、CCD1079SK細胞を培養しているDMEM培地中(60mmディッシュ中)に、培地中のペプチド濃度が20μMとなる量のサンプル1の上記ストック液を添加し、13℃の温度条件下で培養するものである。
例6に係る培養条件は、CCD1079SK細胞を培養しているDMEM培地中(60mmディッシュ中)に、培地中のペプチド濃度が20μMとなる量のサンプル1の上記ストック液を添加し、22℃の温度条件下で培養するものである。
なお、ペプチドの添加の有無および培養温度以外の培養条件は、例1〜6のいずれも同様の条件とした。即ち、例1〜6のいずれにおいても、同じ組成のDMEM培地(上記プレ培養に用いたものと同様)を用い、5%CO2雰囲気下で培養を行った。また、例1〜6のいずれにおいても、本培養を開始してから2日毎に培地交換とペプチド添加(ペプチド無添加区ではPBS(−)添加)を行った。
例1と同じ条件での試験を相互に独立して複数回繰り返したところ、ペプチド存在下での培養開始後3日目以内に、95%以上の確率(27回の試験のうちの26回)で60mmディッシュ内に1個以上のクラスターが形成されることを確認した。このとき、60mmディッシュ1枚あたりに形成されるクラスターの個数(頻度)は、平均3個であった。
一方、図1に示すように、例2〜4の培養物中には、本培養開始後3日以内に細胞の集合体(クラスター)が形成されない若しくはその形成頻度が極めて低かった。なお、例2〜4と同じ条件での試験を相互に独立して複数回繰り返したときに稀に確認された細胞の集合体(クラスター)の形態を詳細に観察すると、例1で観察されるクラスターと比較して細胞の集合具合が緩く、クラスターの辺縁が曖昧であった。
なお、例5および例6の培養物中の細胞は、培養容器に接着することなく浮遊していた。図7に、例4〜6に係る試験区の細胞について、上記本培養を開始後1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目に各例における細胞の形態を位相差顕微鏡を用いて観察した結果を示す。図7に示すように、例5および例6の培養物中の細胞の形態は、対象細胞にペプチドを添加することなく37℃の温度条件で培養した例4に係る細胞と比べて細胞の形態が明らかに異なっていた。具体的には、例5および例6の培養物中の細胞は細胞の形態が丸く、光学顕微鏡下の観察で白く光って見えた。即ち、例5および例6の培養物中の細胞の形態は、死細胞の形態に極めて近かった。このことは、培養温度が低すぎるために、対象細胞(ここではCCD1079SK細胞)を初期化する(SIRIUS細胞の作製)どころか、細胞の生存(増殖)に適さなかったと考える。
即ち、サンプル1存在下でCCD1079SK細胞を培養することで、該細胞培養物中に、多能性幹細胞のクラスターに類似した形態のクラスターを、短期間(典型的には3日以内)且つ高効率に形成し得ることを確認した。また、CCD1079SK細胞の初期化を誘導する場合の温度条件は25℃以上37℃未満(例えば25℃以上35℃以下、典型的には30℃)が好ましいことを確認した。
これらの結果は、ここで開示する初期化誘導ペプチド(即ち、該ペプチドを含有する初期化誘導剤)が初期化誘導活性を有することを示している。換言すると、分化細胞を培養する培養物中(典型的には培地中)にここで開示する初期化誘導ペプチドを供給(添加)し、該ペプチドを供給した細胞培養物を培養することで、分化細胞の初期化を誘導し得る、即ち、未分化細胞(SIRIUS細胞)を作製し得ることを示している。
これに対して、図2に示すように、例3の培養物中で稀に観察されるクラスターは、培養期間を延長するにつれて細胞どうしの凝集が緩くなり、34日目頃までにはクラスターが消滅した。また、例2および4において稀に観察されたクラスターについても、例3と同様に、本培養開始後34日目までに該クラスターは消滅することを確認した。例2〜4で観察されるクラスターの形態を示す写真として、例3の培養条件での培養開始後21日目のクラスターを高倍率で観察した顕微鏡画像を図5に示す。ここで、図5に示す写真は、例2〜4で観察されたクラスターのなかで、例1で観察されるクラスターの形態と最も類似していたものである。
これらの観察結果より、例1の培養条件(本実施例に係る分化細胞初期化方法)によって形成されたクラスターは、サンプル1を含む培地中で培養することで、長期間にわたって多能性幹細胞と類似したクラスターの形態を維持し得ることを確認した。このことは、未分化細胞(SIRIUS細胞)は、初期化誘導ペプチドを含む培地中で培養することで、長期間に渡り未分化状態を維持し得ることを示している。換言すると、ここで開示する初期化誘導ペプチドが、未分化細胞(SIRIUS細胞)を未分化状態に維持する能力を有することを示している。
上記実施例1で得られたサンプル1を用いて作製したSIRIUS細胞(クラスターを形成する細胞)の分化状態を、未分化マーカー遺伝子(内在性のOct3/4、Nanog、Sox2、TRA1−81、SSEA−3およびALP)の発現状態、即ち該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質(以下、該タンパク質を「未分化マーカータンパク質」ともいう)の発現状態を細胞免疫染色(蛍光免疫染色)することで評価した。評価試験の詳細は、以下のとおりである。
次いで、0.25体積%のTriton(登録商標) X−100を含むPBS(0.25%Triton(登録商標) X−100溶液)を各チャンバースライド内に添加し、氷上で15分間静置して細胞膜の透過処理を行った。所定時間が経過後、0.25%Triton(登録商標) X−100溶液を除去し、冷PBSで各チャンバースライド内の細胞を洗浄した。
そして、1%のBSAを含むPBS(1%BSA含有PBS)を各チャンバースライド内に添加して室温で1時間のブロッキング処理を行った。所定時間が経過後、1%BSA含有PBSを除去し、冷PBSで各チャンバースライド内の細胞を洗浄した。
表2に、本実施例にて発現状態を評価した未分化マーカーと、各未分化マーカータンパク質の認識に用いた一次抗体の詳細(製品名、製品番号、免疫動物、抗体のクラス)と、該一次抗体の希釈倍率とを示す。なお、表2に示す一次抗体のうち、抗Oct3/4抗体はSanta Cruz Biotechnology 社製のものを用い、抗Nanog抗体、抗Sox2抗体、抗TRA1−81抗体、抗EESA−3抗体および抗ALP抗体はAbcam 社製のものを用いた。
ここで、抗Oct3/4抗体の検出には蛍光色素(Alexa Fluor(登録商標) 555)で標識された蛍光標識二次抗体を使用し、抗Nanog抗体、抗Sox2抗体、抗TRA1−81抗体、抗SSEA−3抗体、抗ALP抗体の検出には、蛍光色素(Alexa Fluor(登録商標) 488)で標識された蛍光標識二次抗体を使用した。表3に、目的の未分化マーカーと、各未分化マーカータンパク質を認識する一次抗体の検出に用いた二次抗体の詳細(製品名、製品番号、免疫動物)とを示す。なお、表3に示す二次抗体はいずれもLife Technologies社製のものを用いた。
これらの結果は、ここで開示する初期化誘導ペプチド(即ち、該ぺプチドを含有する初期化誘導剤)が初期化誘導活性を有することを示している。換言すると、分化細胞を培養する培養物中(典型的には培地中)にここで開示する初期化誘導ペプチドを供給(添加)し、該ペプチドを供給した細胞培養物を培養することで、分化細胞の初期化を誘導し得る、即ち、未分化細胞(SIRIUS細胞)を作製し得ることを示している。
上記サンプル1を50mgと結晶化セルロース50mg及び乳糖400mgとを混合した後、エタノールと水の混合液1mLを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、初期化誘導ペプチドを主成分とする顆粒剤(顆粒状組成物)を得た。
Claims (5)
- 少なくとも一種の分化細胞の初期化を誘導する人為的に合成されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列:
CKSKSRRSC(配列番号1);
からなる初期化誘導ペプチド配列を有しており、
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が30以下である、合成ペプチド。 - 前記初期化誘導ペプチド配列のN末端側もしくはC末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項1に記載の合成ペプチド。
- 少なくとも一種の分化細胞の初期化を誘導するために用いられる組成物であって、
請求項1または2に記載の合成ペプチドと、
薬学的に許容可能な少なくとも1種以上の担体と、
を含む、組成物。 - 少なくとも一種の分化細胞を初期化して未分化細胞を生産する方法であって、
対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、
前記細胞培養物中に、請求項1または2に記載の合成ペプチドを供給すること、および、
該ペプチドを供給した前記細胞培養物を培養して対象細胞の初期化を誘導すること、
を含む、未分化細胞の生産方法。 - 前記分化細胞が、ヒトの線維芽細胞である、請求項4に記載の生産方法。
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