JP5858284B2 - キャリアペプチドフラグメントとその利用 - Google Patents

キャリアペプチドフラグメントとその利用 Download PDF

Info

Publication number
JP5858284B2
JP5858284B2 JP2011524809A JP2011524809A JP5858284B2 JP 5858284 B2 JP5858284 B2 JP 5858284B2 JP 2011524809 A JP2011524809 A JP 2011524809A JP 2011524809 A JP2011524809 A JP 2011524809A JP 5858284 B2 JP5858284 B2 JP 5858284B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
foreign substance
amino acid
peptide
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2011524809A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2011013699A1 (ja
Inventor
徹彦 吉田
徹彦 吉田
菜穂子 小林
菜穂子 小林
幹夫 丹羽
幹夫 丹羽
憲一 田中
憲一 田中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toagosei Co Ltd
Original Assignee
Toagosei Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toagosei Co Ltd filed Critical Toagosei Co Ltd
Priority to JP2011524809A priority Critical patent/JP5858284B2/ja
Publication of JPWO2011013699A1 publication Critical patent/JPWO2011013699A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5858284B2 publication Critical patent/JP5858284B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

本発明は、真核細胞の外部から該細胞の内部に外来物質を導入（移送）する方法と該方法に用いられるキャリアペプチドフラグメントに関する。
なお、本出願は２００９年７月２９日に出願された日本国特許出願２００９−１７７１０２号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内にポリペプチド等の外来物質、とりわけ生理活性物質を導入し、当該細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質を転換したり或いは当該細胞の機能を改善・向上させることが行われている。
例えば、特許文献１には、ポリペプチド、ＤＮＡ等の外来物質を細胞内に導入するための細胞透過性キャリアペプチドが記載されている。この特許文献には、細胞透過性キャリアペプチドと異種ポリペプチド、ＤＮＡ等を連結したキャリアペプチドコンジュゲートを用いることによって、ポリペプチド、ＤＮＡ等の生理活性物質を高効率に細胞内に導入することができると記載されている。
また、導入したい外来物質（生理活性物質）として比較的分子量の大きいポリペプチド全体を特別な装置を用いることなく目的の細胞内に容易に導入して当該細胞の形質を転換したり機能を改善（若しくは向上）させたりする手法が求められている。
或いはまた、ポリペプチドやタンパク質全体を導入することに代えて、当該ポリペプチドの有するある特定の機能に着目し、その機能を発現させ得る最小単位であるアミノ酸配列部分、即ちペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列（外来物質）を細胞内に効率よく導入する方法も求められている。
例えば、特許文献２には、ＳＯＣＳタンパク質及びそれらのファミリータンパク質（以下総称して「ＳＯＣＳ系タンパク質」という。）を構成するペプチド鎖（アミノ酸配列）の一部であって、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「ＢＣ−ボックス」の全部又は一部を構成するアミノ酸配列が体性幹細胞に対する高い神経分化誘導活性を有するモチーフであることが開示されており、該モチーフを哺乳動物の体性幹細胞に導入することにより該導入細胞を神経細胞に分化誘導し得ることが開示されている。
日本国特許第３８５４９９５号公報 国際公開第２００７／０１０９８９号 日本国特許出願公開第２００５−３３０２０６号公報
ＥＭＢＯレポート(EMBO reports)、１０巻（３号）、２００９年、ｐｐ．２３１−２３８ ＰＮＡＳ、９５巻、１９９８年、ｐｐ．１１４−１１９ ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１２巻、１９９８年、ｐｐ．３８７２−３８８１ ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．２８６７−２８７２ ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．３０５５−３０６５
ところで、ある種の機能を有するポリペプチド、タンパク質またはペプチドモチーフ等のペプチド系外来物質、或いはペプチド以外の外来物質（核酸等）を細胞内に導入するにあたって、細胞内のどの部位（或いはオルガネラ）に目的の外来物質を導入し得るかは重大な問題である。移送される部位によって当該導入細胞に与える効果の度合いが著しく異なることが考えられるからである。例えば、上記の神経分化誘導のような、細胞の分化や形質転換に関わる機能を有するモチーフを導入する場合、当該モチーフを細胞質内のみならず更に核内に導入（移送）することが望ましい場合もあり得る。
本発明は、かかる従来の要望に対応すべく創出された発明であり、外来物質を細胞（典型的には真核細胞、特に細胞壁を有さない哺乳動物細胞等の動物細胞）外から当該細胞内に導入するために用いられるキャリアペプチドフラグメントであって、当該ペプチドフラグメント自体が本来的に核への移行を指向する配列モチーフであるキャリアペプチドフラグメントを提供することを目的とする。また、本発明は、かかるキャリアペプチドフラグメントを使用して、種々の外来物質を細胞外から細胞膜を通過させて細胞質内（典型的にはさらに核内）に導入する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントと外来物質とを含むように作製された当該外来物質を導入するための構築物を提供する。また、本発明は、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントと外来物質とを有する構築物が細胞質内（典型的にはさらに核内）に導入された細胞、器官その他の生体組織を提供する。
本発明者は、細胞内において何らかの機能を有するペプチドとしてアミノ酸配列が既に同定されているペプチド（若しくはペプチドの一部（即ち機能が特定されているモチーフ）を構成するアミノ酸配列）を種々検討し、タンパク質を核内の核小体へ局在化させるシグナル配列（非特許文献１）として知られている核小体局在シグナル（Nucleolar localization signal：以下「ＮｏＬＳ」と略称する。）のうちの幾つかが、従来予想されなかった機能を奏し得るアミノ酸配列（配列モチーフ）として利用し得ることを見出して本発明を完成するに至った。
即ち、幾つかのＮｏＬＳは、それ単独で、細胞の外部から細胞膜を通過して細胞質内に外来物質を導入させ得るキャリアペプチドとして機能することを見出し本発明を完成するに至った。
本発明によって提供される方法の一つは、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部（即ち細胞膜の外側）から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入する（移送する）方法である。
即ち、ここで開示される外来物質導入方法は、核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ）として知られるアミノ酸配列であって、配列番号１、２，３，４，５及び６のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択された配列番号のアミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列、から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
前記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
前記外来物質導入用構築物が供給された前記試料をインキュベートして（即ち対象の細胞が生存可能な条件下に試料を一定期間保持して）、前記試料中の真核細胞内に前記構築物を導入する工程とを包含する。
ここで「外来物質」は、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合可能な無機化合物及び有機化合物であって、真核細胞内に導入可能な分子サイズ及び化学的性質を有するものをいう。
上記構成の本発明の導入方法によると、目的とする外来物質（典型的にはペプチド、核酸、色素、薬剤等の有機化合物）を上記何れかの配列番号によって規定されるアミノ酸配列のキャリアペプチド（フラグメント）のＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合させて構築した外来物質導入用構築物を、対象とする真核細胞を含む試料（典型的には該細胞を含む培養物）中に供給する（即ち生存する真核細胞に添加する）ことによって、当該目的の外来物質を真核細胞の外部（細胞膜の外側）から細胞膜を通過させて細胞質内（好ましくはさらに核膜を通過させて核内）に高効率に移送することができる。
ここで開示される外来物質導入方法の好ましい一態様では、上記外来物質がペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物であることを特徴とする。
ここで「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有する有機化合物をいい、ポリペプチド（典型的にはアミノ酸残基数が１０以上３００未満）やタンパク質（典型的には上記ポリペプチドよりも多い数（３００以上）のアミノ酸残基から成る高分子化合物）を包含する。
また、ここで「核酸」は、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
この種の有機化合物を含むように作製された構築物は、効率よく目的の細胞内に導入することができる。
また、ここで開示される外来物質導入方法の好ましい他の一態様では、上記外来物質はペプチドであり、上記外来物質導入用構築物は、該外来物質としてのペプチドから成るフラグメントと上記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである。
本態様の方法によると、上記合成ペプチドの状態で、目的のペプチド（即ち該ペプチドを構成するアミノ酸配列）を一つのペプチドモチーフとして標的とする細胞内に導入することができる。
ここで開示される外来物質導入方法の好ましい他の一態様では、上記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞（人工多能性幹細胞を包含する。以下同じ。）であることを特徴とする。
本発明によると、ヒトその他哺乳類の幹細胞（例えば体性幹細胞や人工多能性幹細胞）に所定の機能を有する目的の外来物質を導入することができる。このことにより、導入する外来物質（ペプチド等）に応じて当該幹細胞の形質転換、例えば特定の細胞（神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、等）への分化を実現することができる。
また、本発明は、上記目的を実現するべく、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製された構築物を提供する。
即ち、ここで開示される外来物質導入用構築物は、核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ）として知られるアミノ酸配列であって、配列番号１、２，３，４，５及び６のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択された配列番号のアミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列、から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質とを有する。
かかる構築物を利用して本発明の外来物質導入方法を実施することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入することができる。また、該外来物質が細胞質内（好ましくは核内）に導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官その他の生体組織を得ることができる。
好ましくは、上述のとおり、上記外来物質は、ペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である。
また、特に好ましくは、上記外来物質はペプチドであり、上記外来物質導入用構築物は、該外来物質としてのペプチドのフラグメントと上記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである。
図１は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル１４）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図２は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル４）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図３は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル５）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図４は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル６）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図５は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル１４）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を４時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図６は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル２）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を４時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図７は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル３）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を４時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図８は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル４）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を４時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図９は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル１４）を供給したヒトｉＰＳ細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図１０は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル４）を供給したヒトｉＰＳ細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図１１は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル６）を供給したヒトｉＰＳ細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図１２は、一比較例に係る外来物質導入用構築物（サンプル７）を供給したヒトｉＰＳ細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。 図１３は、一比較例に係る外来物質導入用構築物（サンプル８）を供給したヒトｉＰＳ細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成や細胞培養に関するような一般的事項）は、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
また、本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
ここで開示される本発明に係る「キャリアペプチドフラグメント」は、上記配列番号１〜６のうちから選択される何れかのアミノ酸配列により規定される配列（若しくはその改変配列）であって、真核細胞の細胞膜透過性（さらに好ましくは核移行性（核膜透過性））を発揮させるアミノ酸配列である。或いはまた、本発明に係る「キャリアペプチドフラグメント」は、上記配列番号９〜１３のうちから選択される何れかのアミノ酸配列により規定される配列（若しくはその改変配列）であって、真核細胞の細胞膜透過性（さらに好ましくは核移行性（核膜透過性））を発揮させるアミノ酸配列である。
ここで、配列番号１のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の一種（ＡｐＬＬＰ）由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３のアミノ酸配列は、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス タイプ１）のタンパク質（γ（１）３４．５）由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号４のアミノ酸配列は、ＨＩＣ（human I-mfa domain-containing protein）のｐ４０タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号５のアミノ酸配列は、ＭＤＶ（Ｍａｒｅｋ病ウイルス）のＭＥＱタンパク質由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号６のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計１７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号７のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号８のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってｐ５３腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するＭＤＭ２由来の合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号９のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるＧＧＮＮＶα由来の合計９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１０のアミノ酸配列は、ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１１のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計１５アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１２のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるｐ１２０由来の合計１８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１３のアミノ酸配列は、ＨＶＳ（ヘルペスウイルスsaimiri）のＯＲＦ５７タンパク質由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
ここで開示される「キャリアペプチドフラグメント」は、典型的には配列番号１〜６にそれぞれ記載のアミノ酸配列（或いは配列番号９、１０、１１、１２または１３）と同一の配列であるが、当該同一配列の他に、細胞膜透過性を損なうことなく１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列を包含する。即ち、そのような軽微な改変配列は、ここで開示される情報に基づいて当業者にとって容易に利用されるものであり、ここで開示される技術的思想としての「キャリアペプチドフラグメント」に包含されるからである。典型例として、配列番号１のアミノ酸配列のうち１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列が挙げられる。
ここで開示される外来物質導入用構築物は、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、所望する外来物質を直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合（連結）することによって設計・構築され得る構築物である。例えば、外来物質がペプチドである場合には、該ペプチドを構成するアミノ酸配列と、キャリアペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を合成することによって、目的の外来物質導入用構築物を作製することができる。また、種々のＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、あるいは色素（例えばＦＩＴＣ等の蛍光色素化合物）や薬剤（例えば５−フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗ガン剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤）として機能する有機化合物を従来公知の種々の化学的手法により、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的若しくは間接的に結合させて外来物質導入用構築物を構築することができる。
なお、外来物質がペプチドの場合、採用するペプチド（アミノ酸配列）としては特に限定されない。比較的アミノ酸残基数が多い、例えばアミノ酸残基数が１００〜１０００程度のポリペプチドも外来物質として採用し得る。
典型的には、外来物質導入用構築物として作製する合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数が１０００以下が適当であり、好ましくは６００以下であり、さらに好ましくは５００以下であり、特に３００以下（更には１００以下、例えば１０〜５０）が好適である。このような比較的短いペプチドは合成が容易であり、使用しやすい。
採用する外来物質としては、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、ガン化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるペプチド（ポリペプチド、タンパク質を包含する。）の成熟型或いは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）が好ましい。また、機能が従来知られていないペプチドを細胞内に導入して当該ペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明に本発明を実施することもできる。
例えば、導入対象の真核細胞がヒトその他哺乳動物の幹細胞（体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：以下ｉＰＳ細胞という。）を包含する。）である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するペプチドの成熟型又はその前駆体の利用が好ましい。また、導入対象の真核細胞が癌細胞（腫瘍細胞）である場合、当該癌細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のペプチドの利用が好ましい。
或いはまた、従来、所定の細胞（例えばヒト又は他の哺乳動物の皮膚細胞その他の体細胞）に複数の遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８）を導入してｉＰＳ細胞を作製しているが、該手法に代えて、これら遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の産物（ペプチド）を本発明の導入方法により導入してもよい。これにより、上記遺伝子の直接的な導入に代えて当該遺伝子の産物（即ちペプチド）を細胞内（好ましくは核内）に導入することによってｉＰＳ細胞を作製することが可能となる。
従って、本発明の好適な一実施形態として、ｉＰＳ細胞の作製に関与する複数の遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子（例えばＳｏｘ２）がコードするペプチド（例えばＳＯＸ２タンパク質）を外来物質として本発明に係る外来物質導入用構築物を作製し、該構築物を所定の真核細胞（ヒト皮膚線維芽細胞等）に導入することを特徴とするｉＰＳ細胞作製方法が挙げられる。
また、従来知られた種々の配列モチーフ（ペプチドモチーフ）を利用することができる。例えば、導入対象の真核細胞がヒトその他哺乳動物の幹細胞（体性幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞を包含する。）である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々のペプチドモチーフの利用が好ましい。また、導入対象の真核細胞が癌細胞（腫瘍細胞）である場合、当該癌細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のペプチドモチーフの利用が好ましい。
本発明の実施に特に好ましく使用され得るペプチドモチーフの好適例として、上述の特許文献２に記載される、神経分化誘導性を発揮し得る種々のアミノ酸配列（モチーフ）が挙げられる。
即ち、特許文献２には、エロンジンＡ（ＥｌｏｎｇｉｎＡ）と複合体を形成して転写調節因子として働くことが知られているエロンジンＢＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＢＣ）コンプレックス（具体的にはＥｌｏｎｇｉｎＣの一部）に結合し得る領域（アミノ酸配列）であるＳＯＣＳ−ボックスを有する種々のＳＯＣＳタンパク質（サイトカイン情報伝達のサプレッサー）及びそれらのファミリータンパク質（以下総称して「ＳＯＣＳ系タンパク質」という。）を構成するアミノ酸配列の一部であって、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「ＢＣ−ボックス」に包含されるアミノ酸配列が、体性幹細胞に対して高い神経分化誘導活性を有することが記載されている。
その典型例である配列番号１４〜３１は、ＳＯＣＳ系タンパク質として同定された各種タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である（非特許文献２〜５参照）。
具体的には、ｍＳＯＣＳ−１（配列番号１４），ｍＳＯＣＳ−２（配列番号１５），ｍＳＯＣＳ−３（配列番号１６），ｍＳＯＣＳ−４（配列番号１７），ｍＳＯＣＳ−５（配列番号１８），ｈＳＯＣＳ−６（配列番号１９），ｈＳＯＣＳ−７（配列番号２０），ｈＲＡＲ−１（配列番号２１），ｈＲＡＲ−ｌｉｋｅ（配列番号２２），ｍＷＳＢ−１（配列番号２３），ｍＷＳＢ−２（配列番号２４），ｍＡＳＢ−１（配列番号２５），ｍＡＳＢ−２（配列番号２６），ｈＡＳＢ−３（配列番号２７），ＬＲＲ−１（配列番号２８），ｈＡＳＢ−７（配列番号２９），ｍＡＳＢ−１０（配列番号３０），ｈＡＳＢ−１４（配列番号３１），に含まれるＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を示している（非特許文献２〜５参照）。
また、特に詳細な説明は省略するが、配列番号３２〜９２は、ウイルス（ＨＩＶ、ＡｄＶ、ＳＩＶ等）や哺乳動物から同定された種々のＳＯＣＳ系タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列及び該配列から成るペプチドを示している。例えば、配列番号８７および配列番号９１は、ヒトから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質（ＭＵＦ１）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。また、配列番号９２は、マウスから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質ｍＣＩＳ（cytokine-inducible SH2-containing protein）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。
これらは例示であり、ＢＣ−ボックスの構成アミノ酸配列（モチーフ）をこれらに限定することを意図したものではない。ここに例示するまでもなく、様々なＢＣ−ボックスの構成アミノ酸配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それらアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
本発明の好適な一実施形態では、上述したいずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（典型的には配列番号１４〜９２のうちの何れかのアミノ酸配列）を神経分化誘導に関与するペプチドモチーフ（配列モチーフ）として使用し、標的とする真核細胞（例えばヒトや哺乳動物由来の体性幹細胞）に導入する合成ペプチドを構築することができる。従って、上記説明から明らかなように、本発明によって、少なくとも一種の真核細胞を神経細胞に分化誘導する方法が提供される。即ち、本方法は、本発明に係る上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしていずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（典型的には配列番号１４〜９２のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個（例えばＮ末端から少なくとも１０個）の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列）を備えるペプチド鎖を合成すること、および、該合成ペプチド（即ち外来物質導入用構築物である人工ペプチド）を対象である真核細胞又は該細胞を有する組織を含有する試料（典型的には該細胞を含む培養物）に供給すること、を包含する。典型的には、さらに該合成ペプチドが供給された試料をインキュベートすること、を包含する。
また、上記説明から明らかなように、本発明によって、そのような神経細胞への分化誘導方法に利用する人工ペプチドとその製法が提供される。
即ち、かかる構成の人工ペプチド（神経分化誘導ペプチド）は、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしていずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（以下「ＢＣ−ボックス関連配列」ともいう。典型的には配列番号１４〜９２のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個（例えばＮ末端から少なくとも１０個）の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列）を備えるように合成され得る。
或いはまた、配列番号９３に示す１５個の連続するアミノ酸配列もまた上記ＢＣ−ボックス関連配列と同様の目的に使用することができる。即ち、配列番号９３に示すアミノ酸配列は、特許文献３に記載されるように、神経分化誘導性を示すことが知られているＶＨＬ（フォン・ヒッペル・リンド）タンパク質のアミノ酸配列の第１５７番目〜第１７１番目までの１５個の連続するアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列（ＶＨＬ関連ペプチドモチーフ）である。
なお、上述した本発明に係るキャリアペプチドフラグメントの場合と同様、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしての機能を保持する限りにおいて、１個または数個（例えば５個以下典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列もまた神経分化誘導に関するペプチドモチーフ（外来物質）として使用し得ることは勿論である。
上記のような構成の外来物質導入用構築物は、神経分化誘導ペプチドとして少なくとも一種の細胞（典型的には幹細胞）に対して高い神経分化誘導活性を有する。このため、神経分化誘導剤の有効成分として好適に使用し得る。なお、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドは、神経分化誘導活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、神経分化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。
神経分化誘導剤は、有効成分である上記構成の神経分化誘導ペプチドの他、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。神経分化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、神経分化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
神経分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、神経分化誘導ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
本発明によって提供される神経分化誘導剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、ここで開示されるＢＣ−ボックス関連配列或いはＶＨＬペプチドモチーフと、キャリアペプチドフラグメントと、を含むように合成された神経分化誘導ペプチド(即ち該合成ペプチドを含む神経分化誘導剤）は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。これにより、生体内で、典型的には患部又はその周辺に存在する体性幹細胞から、神経細胞を発生(生産)させることができる。このため、神経再生が有力な治療法となる種々の神経疾患を効果的に治療することが可能となる。例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することが実現される。
或いはまた、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料、即ち生組織や細胞塊(例えば体性幹細胞の培養物)に、適当量の神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を供給することによって、効率よく目的のペプチドモチーフ（ＢＣ−ボックス関連配列等）を細胞外から細胞質内（さらに好ましくは核体）に導入することができ、神経細胞を効率よく発生させることができる。このことは当該細胞材料中に所望する神経細胞を大量に生産し得ることを意味する。而して、大量に生産された神経細胞、或いは該生産された神経細胞を含む細胞材料（生組織や細胞塊）を再び生体内(典型的には神経再生が要求されている患部）に戻すことによっても、生体に直接神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を投与する場合と同様の治療効果が得られ得る。
以上の説明から明らかなように、本発明は別の側面として、ここで開示される上記構成の神経分化誘導ペプチドのいずれかを利用することによって、神経疾患治療に有用な、神経細胞に分化誘導された細胞、細胞塊又は生組織を提供することができる。
また、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、神経分化誘導ペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時、生体（細胞）内で本発明に係る神経分化誘導ペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、上述した患者等に対し、神経疾患を治療し又は予防する薬剤として有用である。
典型例として説明した上記神経分化誘導ペプチドのような、本発明によって提供される外来物質がペプチドである外来物質導入用構築物（即ち、人工的に合成されたペプチド）は、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されていてもよい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、当該ペプチドの細胞質内及び核内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させ得る。
人工ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１０００以下（好適には６００以下、特に好ましくは３００以下、例えば５０以下）であるものが望ましい。このような短鎖長のペプチドは化学合成手法によって容易に構築することができるため、目的とする真核細胞を含む試料に供給し易い。
なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。
なお、人工ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、内在するキャリアペプチドフラグメントならびにペプチドモチーフの所望する機能を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
また、内在するキャリアペプチドフラグメントならびに外来物質であるペプチドモチーフの所望する機能を失わない限りにおいて、これら配列に含まれ得ない付加的な配列を部分的に含み得る。例えばリンカーとして機能する数個のアミノ酸残基（例えばグリシン残基）をキャリアペプチドフラグメントと外来ペプチドモチーフとの間に配置した構成のアミノ酸配列を構築してもよい。
使用する人工ペプチド（外来物質導入用構築物）のうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機（例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて人工ペプチド（外来物質導入用構築物）を生合成してもよい。このアプローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する人工ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類）細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のアミノ酸配列から成るペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のペプチド（即ち外来物質導入用構築物）を得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（即ち設計した人工ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的の外来物質導入用構築物（人工ペプチド）を製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち目的とする人工ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
従って、細胞質内（好ましくは核内）への導入対象であるペプチドモチーフに対応するアミノ酸配列（例えば上述したＢＣ−ボックス関連配列）を決定し、上記配列番号１に示す細胞膜透過性のキャリアペプチドフラグメントと合わせてペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の人工ペプチドを容易に合成・生産することができる。例えば、日本の（株）ポストゲノム研究所のピュアシステム（登録商標）に基づいてペプチドを容易に生産することができる。
ここで開示されるいずれのキャリアペプチドフラグメントも特に制限なく、真核細胞に外来物質を導入する方法に使用し得る。しかしながら、個々のフラグメント（アミノ酸配列）は、真核細胞の種類に応じて外来物質の導入効率が異なり得る。
例えば、外来物質導入対象の細胞が、ヒト又は他の哺乳動物由来の幹細胞（ｉＰＳ細胞細胞を包含する）である場合、配列番号４若しくは配列番号６に示すアミノ酸配列（若しくはその改変配列）から成るキャリアペプチドフラグメントが外来物質の導入効率が特に高く、使用に好ましい。
従って、本発明は、ここで開示される外来物質導入方法の特に好適な一態様として、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞（特にＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、あるいは体性幹細胞）の外部から該細胞の細胞質内（より好ましくは更に核内）に目的とする外来物質を導入する方法であって、上記キャリアペプチドフラグメントとして配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成された改変アミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントを使用することを特徴とする方法を提供する。上記二つの配列番号（４，６）のアミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントは、特にｉＰＳ細胞やＥＳ細胞にタンパク質（典型的にはアミノ酸残基数：３００〜１０００程度（例えば３００〜６００程度））若しくはアミノ酸残基数が３００未満のポリペプチド、或いはアミノ酸残基数が１００以下（特に５０以下）のペプチドモチーフ、を導入する目的に好適である。
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜実施例１：外来物質導入用構築物の作製＞
計１４種類のペプチド（サンプル１〜１４）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列を列挙している。
表１に示すように、サンプルＮｏｓ．１〜１３は、配列番号１〜１３のキャリアペプチドフラグメントからなる合成ペプチドである。また、ペプチドＮｏ．１４は、配列番号１に示すキャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に外来物質として上記ＶＨＬペプチドモチーフ（配列番号９３：ＴＬＫＥＲＣＬＱＶＶＲＳＬＶＫ）を有するように構築されている。
なお、いずれのペプチドも、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている。いずれのペプチドも、市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
上記得られた各合成ペプチドのＮ末端側には、外来物質として蛍光色素を連結して外来物質導入用構築物を作製した。
具体的には、サンプルＮｏ．２，６，９〜１３については蛍光色素として一般的なＦＡＭ（即ち、Ｃ２１Ｈ１２Ｏ７：5(6)-Carboxyfluorescein、分子量３７６．３）を常法に基づいてペプチドのＮ末端側に直接的に結合させた。
他方、サンプルＮｏ．１，３〜５，７，８，１４については蛍光色素として一般的なＦＩＴＣ（即ち、Ｃ２１Ｈ１１ＮＯ５Ｓ： Fluorescein isothiocyanate 、分子量３８９．４）をリンカーとしてよく知られているＡｃｐ即ち６−アミノヘキサン酸（６-Aminocaproic acid、分子量１３１．２）を介在させて常法に基づいてペプチドのＮ末端側に間接的に結合させた。
こうして得られた各サンプルペプチドをそれぞれＰＢＳ（Phosphate buffered saline）に希釈し、サンプル（ペプチド）濃度が１ｍＭのサンプル溶液を計１４種類作製した。
＜実施例２：各サンプル（構築物）の細胞膜透過機能評価（１）＞
真核細胞としてヒト新生児包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−２０９７）を使用し、上記実施例１で得られた各サンプル（外来物質導入用構築物）の細胞膜透過機能を調べた。
即ち、９０％イーグルＭＥＭ培地（０．１％の非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含む。）および１０％血清（ＦＢＳ）の混合液を培地として使用し、上記線維芽細胞を培養した。
培養細胞は、０．２５％トリプシン溶液で３７℃１分間のトリプシン処理を行った。上記処理後、ＦＢＳ含有培地にてトリプシンを失活させるとともに、当該培地により細胞濃度が凡そ５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した細胞懸濁液（外来物質導入用の試料）を調製した。
次いで、上記細胞懸濁液０．５ｍＬを所定の細胞培養容器（０．１％ゼラチンで表面コートしたカルチャースライド）に入れて５％ＣＯ２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。その後、培地を新鮮なものに置換し、上記実施例１で調製した何れかの１ｍＭサンプル溶液を最終的にサンプル濃度（ペプチド濃度）が１μＭとなるように細胞培養容器に添加した。ここでは０．５μＬのサンプル溶液を容器に添加した。そして、５％ＣＯ２条件下、３７℃で１時間若しくは４時間インキュベートした。
１時間培養後の細胞、４時間培養後の細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄し、該細胞をメタノールで固定した（氷上で１０分間）。
次いで、核染色剤であるＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を含むProlong（登録商標）Gold Antifade Reagent（Invitrogen社製品）を使用して該メタノール固定された試料（細胞）を封入した。そして、各試料（メタノール固定後に上記封入した試料）について、共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いて蛍光色素が結合した（即ち蛍光色素ラベル化された）ペプチドの細胞内の局在を調べた。その一部の結果を顕微鏡写真で示す。
即ち、図１は上記サンプル１４を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図２は上記サンプル４を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図３は上記サンプル５を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図４は上記サンプル６を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。
また、図５は上記サンプル１４を添加して４時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図６は上記サンプル２を添加して４時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図７は上記サンプル３を添加して４時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図８は上記サンプル４を添加して４時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。
これら顕微鏡写真から明らかなように、サンプル２，３，４，５，６及び１４は、添加後迅速に細胞外から細胞膜を透過して細胞質内に導入されていることが確認された。特に配列番号１、配列番号４及び配列番号６のアミノ酸配列をキャリアペプチドフラグメントとしてそれぞれ用いたサンプル１４（サンプル１も同じ）、サンプル４及びサンプル６は、線維芽細胞のような体細胞に対しての外来物質（ここでは蛍光色素及びＶＨＬペプチドモチーフ）の導入効率が非常に高いことが確認された。
更にＤＡＰＩによる核染色の結果から細胞質内に導入されたこれらサンプルの一部は核内にも移行していること（即ち核内に導入されたこと）が確認された。
なお、顕微鏡写真を添付していないが、サンプル１、９〜１３についてもほぼサンプル１４と同様の結果であった。これに対し、サンプル７及びサンプル８については、細胞外から細胞膜を透過して細胞内への外来物質（即ちサンプルペプチド）の導入が殆ど認められなかった。
＜実施例３：サンプル１およびサンプル２の細胞膜透過機能評価（２）＞
外来物質を導入する対象の細胞をヒト新生児包皮線維芽細胞からヒト由来のｉＰＳ細胞（Human induced pluripotent stem cells）に変更して上記実施例１で得られた２種のサンプル（外来物質導入用構築物）の細胞膜透過機能を調べた。なお、本実施例で使用するｉＰＳ細胞（細胞株：２０１Ｂ２−０８２００８ＫＵ）とフィーダー細胞であるマウス胎児線維芽細胞（細胞株：ＳＮＬ ７６／７、以下「ＭＥＦ」という。）は、京都大学再生医科学研究所山中研究室（山中伸弥教授）から供与されたものを使用した。
先ず、入手したＭＥＦをマイトマイシンＣ処理（３時間）して不活性化し、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン溶液でトリプシン処理した。上記処理後、ＦＢＳ含有培地にてトリプシンを失活させるとともに、ＭＥＦ用培地（７％のＦＢＳ（Gibco社製品）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco社製品）、５０units／ｍＬのペニシリンと５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Gibco社製品）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）：Gibco社製品）を用いてＭＥＦを適当な細胞密度に調整し、０．１％ゼラチンで表面コートした培養容器（カルチャースライド形状又はプレート形状）に上記ＭＥＦを播種した。ここでは細胞密度は、約１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種した。次いで、上記容器をインキュベーターに入れ、５％ＣＯ２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。
その後、ＭＥＦ用培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することによってフィーダー細胞を作製した。
一方、入手したｉＰＳ細胞株にＣＴＫ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（Gibco社製品）、１ｍＭの塩化カルシウム、２０％のＫＳＲ（KnockOut（商標）Serum Replacement）を含む０．２５％トリプシン溶液）を添加してＭＥＦを剥がし、ＰＢＳで洗浄した。
次いで、１ｍＬのｈＥＳＣ培地（即ちヒトＥＳ細胞培地、ここでは２０％のＫＳＲ（Gibco社製品）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco社製品）、０．１％の非必須アミノ酸（Gibco社製品）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Gibco社製品）、５０units／ｍＬのペニシリンと５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Invitrogen社製品、４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Basic Fibroblast Growth Factor）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Gibco社製品））を添加し、セルスクレーパを用いてｉＰＳ細胞を剥がし、軽くピペッティングを行ってコロニーを崩した。
こうして得られたｉＰＳ細胞の懸濁物を上記のように作製しておいた培養容器中のフィーダー細胞上に播種した。そして上記ｈＥＳＣ培地を添加し、培養容器をインキュベーターに入れ、５％ＣＯ２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。
一晩のインキュベート後、培養容器から培地を除去し、最終的にサンプル濃度（ペプチド濃度）が１μＭとなるように上記実施例１で調製した何れかの１ｍＭサンプル溶液を添加した上記ｈＥＳＣ培地を培養容器に添加した。そして、５％ＣＯ２条件下、３７℃で１時間若しくは４時間インキュベートした。
１時間培養後の細胞、４時間培養後の細胞をそれぞれＰＢＳ（Phosphate buffered saline）で洗浄し、該細胞をメタノールで固定した（氷上で１０分間）。
次いで、実施例２と同様の処理を行って、共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いて蛍光色素が結合した（即ち蛍光色素ラベル化された）ペプチドのｉＰＳ細胞内の局在を調べた。その一部の結果を顕微鏡写真で示す。
即ち、図９は上記サンプル１４を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図１０は上記サンプル４を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図１１は上記サンプル６を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図１２は上記サンプル７を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。図１３は上記サンプル８を添加して１時間培養後の細胞試料についての結果を示す顕微鏡写真である。
これら顕微鏡写真から明らかなように、サンプル４，６及び１４は、添加後迅速に細胞外から細胞膜を透過してｉＰＳ細胞の細胞質内に導入されていることが確認された。特に配列番号４及び配列番号６のアミノ酸配列をキャリアペプチドフラグメントとしてそれぞれ用いたサンプル４及びサンプル６は、ｉＰＳ細胞のような幹細胞に対しての外来物質の導入効率が非常に高いことが確認された。更にＤＡＰＩによる核染色の結果から細胞質内に導入されたこれらサンプルの一部は核内にも移行していること（即ち核内に導入されたこと）が確認された。
これに対し、サンプル７及びサンプル８については、細胞外から細胞膜を透過してｉＰＳ細胞内への外来物質（即ちサンプルペプチド）の導入が殆ど認められなかった。
なお、顕微鏡写真を添付していないが、他のサンプルについてはほぼサンプル１４と同様の結果であった。
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
本発明によると、ヒトその他哺乳類の幹細胞（例えば体性幹細胞や人工多能性幹細胞）、その他の目的の細胞に所定の機能を有する目的の外来物質を導入することができる。このことにより、導入する外来物質（ペプチド等）に応じて当該目的の細胞の形質転換、例えば特定の細胞（神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、等）への分化を実現することができる。
また、本発明によって、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製された構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入させ、該外来物質が細胞質内（好ましくは核内）に導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官その他の生体組織を得ることができる。
配列番号１〜配列番号９４ 合成ペプチド

Claims (7)

  1. 真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
    核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ）として知られるアミノ酸配列であって、
    配列番号１、２，４，５及び６のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
    前記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
    前記外来物質導入用構築物が供給された前記試料をインキュベートして、前記試料中の真核細胞内に前記構築物を導入する工程と、
    を包含する方法。
  2. 前記外来物質は、ペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記外来物質はペプチドであり、前記外来物質導入用構築物は、該外来物質としてのペプチドのフラグメントと前記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞である、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
  5. 真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物であって、
    核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ）として知られるアミノ酸配列であって、
    配列番号１、２，４，５及び６のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物。
  6. 前記外来物質は、ペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項５に記載の構築物。
  7. 前記外来物質はペプチドであり、該外来物質としてのペプチドのフラグメントと前記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである、請求項６に記載の構築物。
JP2011524809A 2009-07-29 2010-07-28 キャリアペプチドフラグメントとその利用 Active JP5858284B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011524809A JP5858284B2 (ja) 2009-07-29 2010-07-28 キャリアペプチドフラグメントとその利用

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009177102 2009-07-29
JP2009177102 2009-07-29
JP2011524809A JP5858284B2 (ja) 2009-07-29 2010-07-28 キャリアペプチドフラグメントとその利用
PCT/JP2010/062692 WO2011013699A1 (ja) 2009-07-29 2010-07-28 キャリアペプチドフラグメントとその利用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2011013699A1 JPWO2011013699A1 (ja) 2013-01-10
JP5858284B2 true JP5858284B2 (ja) 2016-02-10

Family

ID=43529352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011524809A Active JP5858284B2 (ja) 2009-07-29 2010-07-28 キャリアペプチドフラグメントとその利用

Country Status (3)

Country Link
US (2) US20120149053A1 (ja)
JP (1) JP5858284B2 (ja)
WO (1) WO2011013699A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5967448B2 (ja) * 2011-05-02 2016-08-10 東亞合成株式会社 ２型ｔｎｆ受容体の発現を誘導する合成ペプチド及びその利用
WO2013094699A1 (ja) * 2011-12-20 2013-06-27 東亞合成株式会社 多極化細胞の作製方法
US9296787B2 (en) 2011-12-20 2016-03-29 Toagosei Co. Ltd. Antitumor peptide and use thereof
US9353350B2 (en) 2011-12-20 2016-05-31 Toagosei Co. Ltd. Method for producing multipolar cell
US20230399368A1 (en) * 2020-10-23 2023-12-14 Toagosei Co., Ltd. Carrier peptide fragment and use thereof
WO2022230484A1 (ja) * 2021-04-28 2022-11-03 東亞合成株式会社 ペプチドフラグメントおよびその利用
JP7096990B1 (ja) * 2022-04-20 2022-07-07 東亞合成株式会社 外来物質導入用構築物およびその利用
WO2024053630A1 (ja) * 2022-09-07 2024-03-14 東亞合成株式会社 キャリアペプチドフラグメント及びその利用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001199997A (ja) * 2000-01-21 2001-07-24 Kansai Tlo Kk 細胞透過性キャリアペプチド
JP2004512275A (ja) * 2000-08-25 2004-04-22 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド 膜透過性ペプチドおよびその使用
CN1757738A (zh) * 2005-07-22 2006-04-12 浙江大学 双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的转基因载体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020168766A1 (en) * 2000-01-11 2002-11-14 Gold Joseph D. Genetically altered human pluripotent stem cells
IL154589A0 (en) * 2000-08-25 2003-09-17 Aventis Pharma Inc Membrane penetrating peptides and uses thereof
WO2004018499A2 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Synthetic heparin-binding growth factor analogs
WO2009032456A2 (en) * 2007-08-01 2009-03-12 Primegen Biotech Llc Non-viral delivery of transcription factors that reprogram human somatic cells into a stem cell-like state

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001199997A (ja) * 2000-01-21 2001-07-24 Kansai Tlo Kk 細胞透過性キャリアペプチド
JP2004512275A (ja) * 2000-08-25 2004-04-22 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド 膜透過性ペプチドおよびその使用
CN1757738A (zh) * 2005-07-22 2006-04-12 浙江大学 双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的转基因载体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014048156; Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７７，　Ｎｏ．１３, 2002, ｐ．１１４２３-１１４３１ *
JPN6014048157; Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． Ｖｏｌ．７３，　Ｐｔ．４, 1992, ｐ．９７１-９７３ *

Also Published As

Publication number Publication date
US20130323776A1 (en) 2013-12-05
US20120149053A1 (en) 2012-06-14
JPWO2011013699A1 (ja) 2013-01-10
WO2011013699A1 (ja) 2011-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5858283B2 (ja) キャリアペプチドフラグメント及びその利用
JP5858285B2 (ja) キャリアペプチドフラグメント及びその利用
JP4573143B2 (ja) 人工ペプチド及びその利用
JP5858284B2 (ja) キャリアペプチドフラグメントとその利用
JP5854283B2 (ja) 細胞増殖促進ペプチド及びその利用
JP6011892B2 (ja) 細胞増殖促進ペプチド及びその利用
US20130005034A1 (en) Artificial peptide and use thereof
JP6156698B2 (ja) 抗腫瘍ペプチド及びその利用
JP5881272B2 (ja) 細胞分化誘導ペプチド及びその利用
JP6654899B2 (ja) カルレティキュリンの発現促進方法および該方法に用いられる合成ペプチド
JP6629725B2 (ja) 新規合成ペプチドおよびその利用
JP5967448B2 (ja) ２型ｔｎｆ受容体の発現を誘導する合成ペプチド及びその利用
JP6691756B2 (ja) 合成ペプチドを用いた神経幹細胞の生産方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130722

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20141113

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150109

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150625

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150717

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20151119

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20151202

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5858284

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250