JP5881272B2 - 細胞分化誘導ペプチド及びその利用 - Google Patents
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Description
例えば、近年、特に注目されているiPS細胞やES細胞を未分化状態で培養(増殖)し、当該培養(増殖)により細胞数が増大した未分化幹細胞を、所定の段階で高効率に且つ簡便な手法で目的の機能を有する細胞に分化誘導する方法の確立が求められている。例えば以下の非特許文献1には、培養したiPS細胞から肝細胞を分化誘導したとする技術が記載されている。その他、未分化状態のiPS細胞やES細胞を、心筋細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞等に分化誘導方法が多数報告されてきている。
即ち、ここで開示される一つの態様の細胞分化誘導ペプチドは、少なくとも1種の未分化細胞に対する分化誘導活性を有する人為的に合成されたペプチドであって、そのペプチド鎖中に以下の(A)と(B)にそれぞれ規定される部分アミノ酸配列:
(A)膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列と、
(B)配列番号19〜27のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択されたアミノ酸配列のうちの1個又は数個(典型的には2〜5個程度、例えば2個又は3個)のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加(挿入)されて形成されたアミノ酸配列と、
を有する合成ペプチドである。
典型的には、ここで開示される細胞分化誘導剤は、薬学上許容され得る少なくとも1種の担体(例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも1種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体)を含む。
(1)膜透過性ペプチドとして知られるペプチドモチーフ(特に、後述する核小体局在シグナルが好ましい。)を構成するアミノ酸配列と、
(2)神経系の発生段階における重要なプロセスである軸索誘導(axonal guidance)等のニューロン新生(neurogenesis)を制御する物質として知られるエフリン(Ephrin:非特許文献2参照)のAファミリー(細胞膜結合型)或いはBファミリー(細胞膜貫通型)に属するタンパク質のシグナルペプチド領域のアミノ酸配列と、
を有する(若しくは該(1)及び(2)のそれぞれのアミノ酸配列のうちの1個又は数個(典型的には2〜5個程度、例えば2個又は3個)のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加(挿入)されて形成された改変アミノ酸配列を有する)人為的に合成されたペプチドを提供する。
本発明者は、かかる2種類の機能の異なる(1)と(2)のアミノ酸配列を組み合わせて構築した合成ペプチドが優れた分化誘導活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、ここで開示される合成ペプチド(細胞分化誘導ペプチド)のペプチド鎖の一部を構成する上記(A)に規定されるアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドのアミノ酸配列である。一方、上記(B)に規定されるアミノ酸配列は、種々のエフリンのシグナルペプチド領域のアミノ酸配列の具体例であり、配列番号19〜27としてここで開示されている。
配列番号1〜18としてここで開示されているアミノ酸配列は、上記(A)膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、本発明の実施に好適に採用することができる。タンパク質を核内の核小体へ局在化させるシグナル配列であり核小体局在シグナル(NoLS:Nucleolar localization signal、非特許文献3参照)として知られるいずれかのアミノ酸配列(典型的には配列番号1〜15、例えば配列番号14や15)を採用することが特に好ましい。
このような構成のペプチドは、特に未分化細胞に対する分化誘導活性に優れる。該ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が50以下であるものが、シンプルな構成であり化学合成も容易であるために特に好ましい。
本発明によって提供される合成ペプチド(細胞分化誘導ペプチド)の好ましい具体例として配列番号28〜33のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド(特に全アミノ酸残基数が100以下若しくは50以下のもの)、或いは配列番号28〜33のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列から構成されているペプチドが挙げられる。このような合成ペプチド(細胞分化誘導ペプチド)を含む細胞分化誘導剤は、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞(例えば胚性幹細胞)若しくは人工多能性幹細胞(iPS細胞)の分化誘導ないし分化を促進する用途に好適である。
かかる分化誘導促進方法によると、上記のとおり単純な構成の合成ペプチドを細胞分化誘導因子として使用するという簡易な手法によって、目的の未分化細胞の分化誘導を効率的に実現することができる。
かかる生産方法によると、上記のとおり単純な構成の合成ペプチドを細胞分化誘導因子として使用するという簡易な手法によって、目的の分化された細胞若しくは該分化細胞から成る組織体(皮膚、神経、血管、各種の臓器、等)を効率的に生産することができる。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がN末端側であり右側がC末端側である。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね100以下、好ましくは50以下(例えば30〜50程度)のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー(核酸)を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのDNAフラグメント及びRNAフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖(全長)がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成(即ち遺伝子工学に基づく生産)によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。
ここで上記未分化細胞の好適例としては、各種の幹細胞、特にヒト又は他の動物(典型的には脊椎動物、特に哺乳動物)由来の胚性幹細胞(ES細胞ともいう。)、体性幹細胞(神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、筋幹細胞、等)或いは人工多能性幹細胞(iPS細胞ともいう。)が挙げられる。ここで開示される細胞分化誘導ペプチドは、特にES細胞、iPS細胞に対する高い分化誘導活性を有する。
ここで開示される細胞分化誘導剤(細胞分化誘導ペプチド)によると、上記のような幹細胞(未分化細胞)を、心筋細胞、血液細胞、皮膚細胞、生殖細胞、神経細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵臓細胞(特にインスリン産生細胞)等に分化誘導することができる、ないしはそのような細胞種への分化誘導を促進することができる。
(A)パート配列は、細胞膜及び/又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。例えば、本明細書の配列表における配列番号1〜18に示すアミノ酸配列およびそれらの改変アミノ酸配列(膜透過性を保持しているものに限られる。)は、(A)パート配列を構成するアミノ酸配列として好ましい。具体的には以下のとおりである。
配列番号2のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の1種(ApLLP)由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号3のアミノ酸配列は、HSV−1(単純ヘルペスウイルス タイプ1)のタンパク質(γ(1)34.5)由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号4のアミノ酸配列は、HIC(human I-mfa domain-containing protein)のp40タンパク質由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号5のアミノ酸配列は、MDV(Marek病ウイルス)のMEQタンパク質由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号6のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計17アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号7のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計7アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号8のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってp53腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するMDM2由来の合計8アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号9のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるGGNNVα由来の合計9アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号10のアミノ酸配列は、NF−κB誘導性キナーゼ(NIK)由来の合計7アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号11のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計15アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号12のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるp120由来の合計18アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号13のアミノ酸配列は、HVS(ヘルペスウイルスsaimiri)のORF57タンパク質由来の合計14アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号14のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの1種であるヒト内皮細胞に存在するLIMキナーゼ2(LIM Kinase 2)の第491番目のアミノ酸残基から第503番目のアミノ酸残基までの合計13アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号15のアミノ酸配列は、IBV(トリ伝染性気管支炎ウイルス:avian infectious bronchitis virus)のNタンパク質(nucleocapsid protein)に含まれる合計8アミノ酸残基から成る核小体局在シグナル(Nucleolar localization sequence)に対応する。
配列番号16のアミノ酸配列は、HIV(ヒト免疫不全ウイルス:Human Immunodeficiency Virus)のTATに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計11アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号17のアミノ酸配列は、上記TATを改変したタンパク質導入ドメイン(PTD4)の合計11アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号18のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ(Drosophila)の変異体であるAntennapediaのANT由来の合計18アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
これらのうち、特にNoLSに関連するアミノ酸配列(又はその改変アミノ酸配列)が好ましい。特に、配列番号14や15に示すようなNoLS関連のアミノ酸配列が細胞分化誘導ペプチドの(A)パート配列として好ましい。
具体的には、配列番号19は、ヒト由来のEphrin−A2のシグナルペプチド領域の合計24アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号20は、マウス由来のEphrin−A2のシグナルペプチド領域の合計24アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号21は、ヒト及びマウス由来のEphrin−A3のシグナルペプチド領域の合計22アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号22は、ヒト由来のEphrin−A1のシグナルペプチド領域の合計27アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号23は、ヒト由来のEphrin−A4のシグナルペプチド領域の合計27アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号24は、ヒト由来のEphrin−A5のシグナルペプチド領域の合計27アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号25は、ヒト由来のEphrin−B1のシグナルペプチド領域の合計27アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号26は、ヒト由来のEphrin−B2のシグナルペプチド領域の合計27アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号27は、ヒト由来のEphrin−B3のシグナルペプチド領域の合計27アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
好ましくは、細胞分化誘導ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基(典型的にはペプチド鎖のC末端アミノ酸残基)のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性(例えばプロテアーゼ耐性)を向上させ得る。
なお、本発明の細胞分化誘導ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がL型アミノ酸であるものが好ましいが、分化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がD型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
ここで開示される細胞分化誘導ペプチドは、市販のペプチド合成機(例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。)を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾(C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の細胞分化誘導ペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞(例えばイースト、昆虫細胞)に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の細胞分化誘導ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型DNA(即ち細胞分化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片)を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物(ATP、RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等)を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット(例えば、日本の東洋紡績(株)から入手可能なPROTEIOS(商標)Wheat germ cell-free protein synthesis kit)が市販されている。
従って、利用する(A)パート配列ならびに(B)パート配列をひとたび決定し、ペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の細胞分化誘導ペプチドを容易に合成・生産することができる。例えば、日本の(株)ポストゲノム研究所のピュアシステム(登録商標)に基づいて本発明の細胞分化誘導ペプチドを容易に生産することができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもよく、RNA(mRNA等)の形態であってもよい。DNAは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖(センス鎖)であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖(アンチセンス鎖)であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、細胞分化誘導ペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
本発明によると、新規なアミノ酸配列の細胞分化誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び/又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。例えば、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が100以下(好ましくは50以下)であって、配列番号28〜33で示されるアミノ酸配列或いは該配列の改変アミノ酸配列、または該配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び/又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む(又はそれら配列から実質的に構成された)人為的に設計されたポリヌクレオチドが提供される。
細胞分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液(例えばPBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、細胞分化誘導ペプチド(主成分)及び種々の担体(副成分)を材料にして種々の形態の薬剤(組成物)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
例えば、生体外(インビトロ)で培養(継代)している未分化培養細胞(例えばES細胞株やiPS細胞株)を分化誘導させる場合においては、ここで開示される細胞分化誘導剤(細胞分化誘導ペプチド)の適当量を、分化誘導する対象の未分化培養細胞に対し、培養過程のいずれかの段階(好ましくは未分化状態を維持しつつ所定期間の培養(増殖)や継代を行った後)で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、培養細胞の種類、細胞密度(培養開始時の細胞密度)、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。未分化の幹細胞(特にiPS細胞やES細胞)を培養する場合、培地中の細胞分化誘導ペプチド濃度が概ね0.1μM〜100μMの範囲内、好ましくは0.1μM〜20μM(例えば1μM〜10μM)の範囲内となるように、1〜複数回添加する(例えば細胞の継代時や培地交換時に合わせて複数回供給する)ことが好ましい。
また、ここで開示される細胞分化誘導ペプチドは、対象とする未分化細胞種や目的(生産したい分化細胞の種類)に応じ、他の細胞分化誘導因子と併用することができる。かかる細胞分化誘導因子としては、例えば、レチノイン酸、種々の骨形成因子(BMPファミリーに属する因子)、アクチビン等のTGF−βスーパーファミリーに属する因子、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞細胞増殖因子(aFGF)等のFGFスーパーファミリーに属する因子、白血病阻害因子(LIF)、コリン作働性神経分化因子(CDF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)その他のサイトカインファミリーに属する因子、各種インターロイキン、腫瘍壊死因子(TNF−α)、インターフェロン−γ等が挙げられる。
ここで開示される細胞分化誘導剤(細胞分化誘導ペプチド)を生体内の必要な部位に投与することにより、その分化誘導活性によって、神経再生能力、血管新生能力、皮膚再生能力、臓器再生能力等の向上を実現することができる。また、目的の細胞種や器官(臓器)への分化が促進されることにより、例えば、皮膚組織の改善、移植臓器の早期定着、交通事故その他の物理的障害による創傷部や火傷部の早期修復を実現することができる。また、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することに資する薬剤組成物として使用することができる。
計6種類のペプチド(サンプル1〜6)を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表1には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
また、サンプル2のペプチド(配列番号29)は、N末端側に(B)パート配列として配列番号20のマウスEphrin−A2のシグナルペプチド由来のアミノ酸配列を有し、該配列に隣接してそのC末端側に(A)パート配列として配列番号14の上記LIMキナーゼ2由来のアミノ酸配列(NoLS)を有する合計37アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル3のペプチド(配列番号30)は、N末端側に(B)パート配列として配列番号21のヒト及びマウスEphrin−A3のシグナルペプチド由来のアミノ酸配列を有し、該配列に隣接してそのC末端側に(A)パート配列として配列番号14の上記LIMキナーゼ2由来のアミノ酸配列(NoLS)を有する合計35アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル4(配列番号31)、サンプル5(配列番号32)及びサンプル6(配列番号33)は、それぞれ、サンプル1、サンプル2及びサンプル3の(A)パート配列と(B)パート配列とを逆にして構成したペプチドである。即ち、N末端側に(A)パート配列を配置しC末端側に(B)パート配列を配置した。
合成した各サンプルペプチドは、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)に溶かし、ペプチド濃度が1mMのストック液を調製した。
上記実施例1で得られた細胞分化誘導ペプチド(サンプル1〜6)についてインビトロで培養・継代したiPS細胞に対する分化誘導活性を調べた。また、比較例としてペプチド無添加で同様にiPS細胞を培養したものを設けた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
先ず、入手したMEFをマイトマイシンC処理(3時間)して不活性化し、1mMのEDTAを含む0.25%トリプシン溶液でトリプシン処理した。上記処理後、FBS含有培地にてトリプシンを失活させるとともに、MEF用培地(7%のFBS(Gibco社製品)、2mMのL−グルタミン(Gibco社製品)、50units/mLのペニシリンと50μg/mLのストレプトマイシン(Gibco社製品)を含むD−MEM培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium):Gibco社製品)を用いてMEFを適当な細胞密度に調整し、0.1%ゼラチンで表面コートした培養容器(直径10cmの培養ディッシュ)に上記MEFを播種した。ここでは細胞密度は、約1.25×105cells/mLとなるように播種した。次いで、上記容器をインキュベーターに入れ、5%CO2条件下、37℃で一晩インキュベートした。
その後、MEF用培地を除去し、PBSで洗浄することによってフィーダー細胞を作製した。
次いで、1mLのhESC培地(即ちヒトES細胞培地、ここでは20%のKSR(Gibco社製品)、2mMのL−グルタミン(Gibco社製品)、0.1%の非必須アミノ酸(Gibco社製品)、0.1mMの2−メルカプトエタノール(Gibco社製品)、50units/mLのペニシリンと50μg/mLのストレプトマイシン(Invitrogen社製品)、4ng/mLのbFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)を含むDMEM/F12培地(Gibco社製品))を添加し、セルスクレーパを用いてiPS細胞を剥がし、軽くピペッティングを行ってコロニーを崩した。
こうして得られたiPS細胞の懸濁物を上記のように作製しておいた培養容器中のフィーダー細胞上に播種した。そして上記hESC培地を添加し、培養容器をインキュベーターに入れ、5%CO2条件下、37℃で継代培養した。
そして、bFGFを添加しないこと以外は上記組成であるhESC培地(bFGFフリー培地)を上記培養容器に10mL添加して培養細胞を新たな培養容器(直径10cmの培養ディッシュ)に移した。該培養容器にROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ)阻害剤であるY−27632(商品名:(R)-(+)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide・2HCl・H2O)を適量添加し、5%CO2条件下、37℃で3時間インキュベートしてフィーダー細胞を容器に付着させた。
細胞密度が2.0×104cells/mLである供試細胞懸濁液を18mLほど調製し、Y−27632を適量添加した。
而して、各ウェルに上記ペプチドサンプル1〜6のいずれかをウェル中の培養液のペプチド濃度が2μMとなるように添加した。また、比較例として幾つかのウェルにはペプチドを添加することなく、他のペプチド添加ウェルと同様に培養を行った。
さらに上記プレートを5%CO2条件下、37℃でインキュベートし、培養開始から3日経過後、培地交換とペプチドの追加添加を上記培養開始1日経過時と同様に行った。
さらに上記プレートを5%CO2条件下、37℃でインキュベートし、培養開始から5日経過後、6日経過後、8日経過後、9日経過後にそれぞれ培地交換とペプチドの追加添加を行った。具体的には、各ウェルから培地を除去し、新鮮なbFGFフリー培地を1ウェルあたり0.5mL注入し且つ上記ペプチドサンプル1〜6のいずれかをウェル中の培養液のペプチド濃度が4μMとなるように添加した。
その結果、いずれのサンプルペプチド(細胞分化誘導ペプチド)も添加していない比較例の培養iPS細胞は、図4に示すように、光の透過性が低く顕微鏡下で細胞が白っぽく観察された。
一方、サンプル1〜6を添加して培養したiPS細胞では、サンプル1〜3についてそれぞれ図1〜3に示すように、光の透過性が高く顕微鏡下で細胞が顕著に黒っぽく観察された。かかる光透過性の変化は、iPS細胞の形態が変化した(具体的には細胞質部分が肥大して光の透過性が向上した)ことを示すものであり、比較例に比べて細胞分化誘導(具体的には肝細胞への分化誘導)が著しく促進されたことが確認された。
サンプル1のペプチド50mgと結晶化セルロース50mg及び乳糖400mgとを混合した後、エタノールと水の混合液1mLを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、細胞分化誘導ペプチドを主成分とする顆粒剤(即ち、顆粒状の細胞分化誘導剤)を得た。
Claims (12)
- 少なくとも1種の未分化細胞に対する分化誘導活性を有する人為的に合成されたペプチドであって、
(A)膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列と、
(B)配列番号19〜21のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択されたアミノ酸配列のうちの1個、2個又は3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成されたアミノ酸配列と、
を有する合成ペプチド。 - 前記(A)膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列として、配列番号1〜18のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択されたアミノ酸配列のうちの1個、2個又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の合成ペプチド。
- 全アミノ酸残基数が100以下である、請求項1又は2に記載の合成ペプチド。
- 前記(A)で規定されるアミノ酸配列のN末端側またはC末端側に隣接して前記(B)で規定されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の合成ペプチド。
- 全アミノ酸残基数が50以下である、請求項4に記載の合成ペプチド。
- 配列番号28〜33のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれかに記載の合成ペプチド。
- 配列番号28〜33のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列から構成されている、請求項1〜5のいずれかに合成ペプチド。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の合成ペプチドを有効成分として含む、少なくとも1種の未分化細胞に対する細胞分化誘導剤。
- 少なくとも1種の未分化細胞の分化誘導をインビトロにおいて促進する方法であって、
前記未分化細胞に対して、請求項1〜7のいずれかに記載の合成ペプチド若しくは請求項8に記載の細胞分化誘導剤を少なくとも1回供給することを特徴とする、方法。 - 前記未分化細胞は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞若しくは人工多能性幹細胞である、請求項9に記載の方法。
- 所定の未分化細胞を分化誘導して該分化した細胞又は該分化した細胞から成る組織体をインビトロにおいて生産する方法であって、
前記未分化細胞に対して、請求項1〜7のいずれかに記載の合成ペプチド若しくは請求項8に記載の細胞分化誘導剤を少なくとも1回供給することを特徴とする、方法。 - 前記未分化細胞は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞若しくは人工多能性幹細胞である、請求項11に記載の方法。
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