ES2425883T3 - Célula transformada por el gen WNT3A humano - Google Patents

Abstract

Una célula transformada con un vector que contiene el gen Wnt3a humano, en donde dicha célula es seleccionada de un grupo que consiste en células procedentes de folículos pilosos, en donde dichas células procedentes de folículos pilosos son células inmortalizadas de vaina radicular externa (IORS) o células inmortalizadas de papila dérmica (IDP), y células procedentes de cáncer de próstata que son células de cáncer de próstata humano (PC3).

Description

Celula transformada por el gen WNT3A humano

Campo tecnico

La presente invencion proporciona una celula transformada con un vector que contiene el gen de la proteina Wnt3a humana que presenta una elevada eficacia de expresion de la proteina Wnt3a humana.

Antecedentes de la tecnica

La proteina Wnt es una glicoproteina secretora que tiene un peso molecular de aproximadamente 40.000 y que es conocida por ser una importante molecula de senalizacion intercelular para la morfogenesis embrionaria y la regeneracion del foliculo piloso, y esta implicada en la diferenciacion y el mantenimiento funcional de los melanocitos. Se conocen casi 20 tipos de Wnt de vertebrado, estas Wnt forman subfamilias, y cada una se une a un receptor de siete dominios transmembranales conocido como Frizzled y a unos receptores de un solo dominio transmembranal conocidos como LRP de la membrana celular. Basandose en estudios sobre trasplantes en ratones, se ha demostrado claramente que Wnt3a, que es un miembro de la familia de Wnt, mantiene la actividad de la papila pilosa en cuanto a la induccion de la formacion de foliculos pilosos al actuar sobre celulas de la papila pilosa [J. Kishimoto et al., Genes & Dev., 15 de mayo de 2000, 14 (10), 1181-5], y, recientemente, se ha centrado una considerable atencion en su relacion con la induccion de foliculos pilosos. Se esta llevando a cabo una investigacion sobre la proteina Wnt3a recombinante aviar o de raton, producida por Wnt3a aviar o por celulas aviares transformadas con el gen Wnt3a de raton, dejando que esta proteina recombinante actue sobre celulas de papila pilosa de raton.

Cuando se tiene en cuenta un uso en estudios clinicos aplicables a seres humanos, es necesario preparar grandes cantidades de proteina recombinante Wnt3a humana en lugar de proteina humana o de raton. Sin embargo, la Wnt3a humana recombinante presenta el problema de que es dificil producir una proteina que conserve una actividad adecuada, probablemente a causa de problemas en la traduccion y la modificacion despues de la transcripcion. Por lo tanto, la seleccion de celulas huesped para uso en la produccion eficaz de una proteina recombinante Wnt3a humana que conserve la actividad de induccion de foliculos pilosos es un factor importante para elucidar los mecanismos de la formacion y regeneracion de foliculos pilosos, asi como para explorar y evaluar farmacos que induzcan y aceleren la formacion y regeneracion de foliculos pilosos.

Documento 1 que no es Patente: Genes & Dev., 15 de mayo de 2000, 14 (10), 1181-5.

Descripcion de la invencion

Problemas a resolver por la invencion

Un objeto de la presente invencion es proporcionar una celula capaz de expresar eficazmente una proteina recombinante Wnt3a humana que tenga una actividad que induzca la formacion de foliculos pilosos por celulas de papilas pilosas.

Medios para resolver los problemas

Como resultado de la realizacion de vastos estudios, los inventores de la presente invencion hallaron que celulas procedentes de foliculos pilosos y celulas procedentes de cancer de prostata son optimas como huespedes para la expresion eficaz de una proteina recombinante Wnt3a humana que conserve la actividad, lo que condujo a la complecion de la presente invencion.

Por lo tanto, la presente solicitud incluye las invenciones siguientes:

(1)

una celula transformada con un vector que contiene el gen Wnt3a humano, en donde la celula es seleccionada de un grupo que consiste en celulas procedentes de foliculos pilosos y celulas procedentes de cancer de prostata, en donde las celulas procedentes de foliculos pilosos son celulas IORS o IDP, y en donde las celulas procedentes de cancer de prostata son celulas PC3; y

(2)

la celula de (1), en donde el vector es un vector pTarget.

Efectos de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, se puede expresar eficazmente una proteina recombinante Wnt3a humana que tenga una actividad que induzca la formacion de foliculos pilosos por celulas de papilas pilosas y se espera que se lleve eficazmente a cabo la elucidacion de los mecanismos de la formacion y regeneracion de foliculos pilosos, asi como la evaluacion de farmacos eficaces para la regeneracion de foliculos pilosos.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleotidos de un gen que codificaWnt3a.

La Figura 2 muestra una transferencia Western de celulas que contienenWnt3a.

La Figura 3 muestra la confirmacion de la expresion funcional de Wnt3a introducida por expresion acelerada de Lef

1.

Mejor modo de llevar la invencion a cabo

La Wnt3a humana es una proteina compuesta de 352 restos de aminoacido y, en la ID. SEC. n° 1 y la Figura 1, se muestra la secuencia de nucleotidos de un gen que codifica esta proteina. Se puede producir un vector de expresion que contenga el gen Wnt3a uniendo el gen Wnt3a a un vector por medio de un sitio de restriccion adecuado que se va a poner bajo el control de un promotor adecuado del vector usando un metodo conocido. No hay limitaciones particulares al tipo de vector y se pueden utilizar todos los tipos de vectores comercialmente asequibles, incluyendo vectores de expresion de celulas animales comercialmente disponibles tales como el vector pTarget (Promega), el vector pBK-CMV o el vector pBK-RSV (Stratagene). Es particularmente preferible el vector pTarget.

No hay limitaciones particulares a un promotor preferible utilizado en la presente invencion con tal de que sea un promotor adecuado que corresponda al huesped usado para que se exprese el gen, ejemplos del cual incluyen el promotor de CMV, el promotor de SRa, el promotor de SV40, el promotor de LTR, el promotor de HSV-TK y el promotor de �-actina.

Ademas, en el vector de expresion tambien pueden estar contenidos, segun se desee, un potenciador, una senal de corte y empalme, una senal de adicion de poli(A), un marcador de seleccion o un origen de replicacion de SV40 y similares.

Como celulas huesped se utilizan celulas procedentes de foliculos pilosos, tales como celulas inmortalizadas de vaina radicular externa (IORS; del ingles, inmortalized outer root sheath) humanas o celulas inmortalizadas de papila dermica (IDP; del ingles, inmortalized dermal papilla) humanas, o celulas procedentes de cancer de prostata humano (PC3). Son particularmente preferibles las celulas IORS.

Para obtener celulas humanas de vaina radicular externa, se obtiene cuero cabelludo humano como un subproducto de, por ejemplo, procedimientos de cirugia plastica o procedimientos de cirugia, y se obtiene tejido de foliculo piloso del cuero cabelludo bajo un microscopio estereoscopico. A continuacion, despues del tratamiento del tejido de foliculo piloso con una disolucion de hidrolasa, tal como una disolucion mixta de colagenasa y dispasa, durante 30 minutos a 37 aC, se deja reposar el tejido en una placa de cultivo revestida con colageno, lo que va seguido de un cultivo en un medio exento de suero y de bajo contenido en calcio, tal como K-GM (Clonetics) o Keratinocyte-SFM (Gibco BRL), y de sustitucion del medio cada 2 semanas. Una vez que se ha confirmado que las celulas han proliferado, se liberan las celulas adheridas al recipiente de cultivo y se recuperan por centrifugacion, lo que va seguido de un subcultivo en medio exento de suero.

Las celulas humanas de papila dermica se obtienen tambien de la misma manera que las celulas de vaina radicular externa a partir de cuero cabelludo humano obtenido como subproducto de procedimientos de cirugia plastica y procedimientos de cirugia, bajo un microscopio estereoscopico. A continuacion, se cultivan las papilas pilosas en un medio de cultivo ordinario para celulas animales, tal como Dulbecco's Modified Eagle Medium que contiene suero de ternera fetal, y se sustituye el medio cada 2 dias. Una vez que se ha confirmado que las celulas han proliferado, se liberan las celulas adheridas al recipiente de cultivo y se recuperan por centrifugacion, lo que va seguido de un subcultivo en medio exento de suero.

La inmortalizacion de celulas humanas de vaina radicular externa o celulas humanas de papila dermica obtenidas de esta manera puede ser llevada a cabo mediante metodos conocidos. Preferiblemente, se puede utilizar el gen del antigeno T grande del virus SV40, deficiente en cuanto a un origen de replicacion, como se describe en la Publicacion Japonesa de Patente no Examinada n° 2000-89. Este gen se utiliza normalmente en un estado que se introduce en un vector de plasmido o virus. Este gen se utiliza ampliamente en la tecnica como un gen tipico para inmortalizar celulas animales y se puede adquirir facilmente. Por ejemplo, en Doren et al., Mol. Cell. Biol., 1653-1656 (1984), se describe un virus en que la region EIA del vector adenovirico, LEI/X [Doren et al., J. Virol., Volumen 50, 606-614 (1984)], esta sustituida por el antigeno T grande de SV40, virus deficiente en cuanto a un punto de inicio de la replicacion. Ademas, se puede usar el vector retrovirico pZITtsa [W. Filsell et al., Journal of Cell Science, volumen 107, 1761-1772 (1994)], que se obtiene al escindir de pLTtsa [M. Rassoulzadegan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volumen 80, 4354-4358 (1983)], mediante el uso de BglI e HingII, un fragmento de 2491 pares de bases que contiene un gen que codifica el antigeno T grande de poliomavirus sensible a la temperatura (Plttsa), e insertar luego este fragmento en un sitio BamHI del vector retrovirico pZIPNeoSV(X)1 [C. L. Cepko et al., Cell, volumen 37, 10531062 (1984)]. Ademas, tambien se puede usar pSV40ori-, obtenido al clonar DNA viral de SV40, deficiente en cuanto a un origen de replicacion, en pBR322, o pSHPV16s [Tissue Cult. Res. Commun., volumen 11, 13-24 (1992)], obtenido al clonar DNA de papilomavirus humano de tipo 16 en el vector pSV2neo.

La linea celular PC3 de cancer de prostata es una linea celular comercialmente asequible que se puede obtener de, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC) o de DS Pharma Biomedical (antiguamente Dainippon Sumitomo Pharma).

La transformacion de celulas huesped puede ser llevada a cabo mediante un metodo comunmente conocido, tal

5 como el metodo del cloruro calcico, la coprecipitacion con fosfato calcico, el metodo de DEAE-dextrano, la lipofeccion, la fusion de protoplastos con polietileno o la electroporacion, y se selecciona un metodo adecuado de acuerdo con las celulas huesped que se van a utilizar. Ademas, tambien se puede emplear un adecuado kit comercialmente asequible para llevar la transformacion a cabo. Los ejemplos de dichos kits incluyen Fugene® (Roche Applied Science), CombiMag (Oz Biosciences) y PolyMag (Oz Biosciences).

10 Se cultivan las celulas huesped transformadas resultantes en un medio de cultivo adecuado, se separan las celulas del liquido de cultivo por un medio convencional tal como, sin limitacion, centrifugacion o filtracion, y se lisan las celulas cuando es necesario, se precipita el componente proteico del sobrenadante o del producto de filtracion con una sal del tipo sulfato amonico, y se puede recuperar la proteina diana llevando a cabo diversas tecnicas cromatograficas, tales como cromatografia de intercambio ionico y cromatografia de afinidad.

15 La actividad de Wnt3a en cuanto a la induccion de la formacion de foliculos pilosos puede ser medida usando, por ejemplo, el factor 1 potenciador de linfocitos (LEF-1; del ingles, lymphocyte enhancer factor 1), que es un factor cuya expresion genica resulta acelerada por la accion de Wnt3a, como un indicador (M. Filali et al., J. Biol. Chem., 277, 33.398-33.410, 2002). La Wnt instruye a las celulas para que no descompongan la -catenina (� -CAT), y, como resultado, la �-catenina se une con LEF-1 y proteinas similares para dar lugar a la induccion de la regeneracion de

20 foliculos pilosos y del crecimiento de pelo. La confirmacion de la expresion de LEF-1 puede ser llevada a cabo mediante un metodo comunmente conocido, tal como RT-PCR o transferencia Western.

A continuacion se proporciona una explicacion mas detallada de la presente invencion por medio de ejemplos especificos de la misma. Ademas, la presente invencion no esta limitada por estos ejemplos.

Ejemplos

25 Construccion de plasmidos de Wnt3a y Wnt7a

Se multiplico la longitud total de Wnt3a humano por PCR usando cDNA sintetizado a partir de RNA total placentario humano comercialmente asequible (Clonetech) como molde y utilizando un cebador de cadena sentido, gatggccccactcggata (ID. SEC. n° 2), y un cebador de cadena antisentido, ggtgcctacttgcaggtgt (ID. SEC. n° 3). Cada producto genico multiplicado por PCR fue purificado con un kit comercialmente asequible (Promega), copulado con

30 un vector pTarget y clonado usando E. coli. Una vez identificados los plasmidos que contenian cada gen basandose en un analisis de los patrones de escision por restrictasas, se determino la secuencia de nucleotidos de cada gen insertado usando un secuenciador de DNA. En la Figura 1 se muestra la secuencia de nucleotidos del gen que codifica Wnt3a.

Transfeccion de celulas

35 Se sembro cada una de las celulas mostradas en la Tabla 1 siguiente en una placa de 6 pocillos, en una cantidad de 1 a 3 x 105 celulas, lo que fue seguido de un cultivo hasta que las celulas alcanzaron la subconfluencia bajo unas condiciones de 37 aC y CO2 al 5%. A continuacion, se transfectaron las celulas cultivadas con el construido vector pTarget de Wnt3a o con un testigo usando reactivos para transfeccion genica comercialmente asequibles [Fugene® (Roche Applied Science), CombiMag (Oz Biosciences) y PolyMag (Oz Biosciences)]. En la Tabla 1 se muestra el

40 reactivo para transfeccion genica que se uso para cada una de las celulas. Los reactivos para transfeccion se utilizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado con cada reactivo. Ademas, se calculo la eficacia de la transferencia genica introduciendo un plasmido en el que estaba copulado el gen Azami Green (Medical & Biological Laboratories) con pTarget, y contando luego el numero de celulas positivas para fluorescencia de Azami Green usando un citometro de flujo (Beckman Coulter). En la Tabla 1 se muestran el medio, el reactivo para transfeccion

45 genica y los resultados de la eficacia de transferencia para cada celula.

Tabla 1

Nombre de las celulas

Especie Origen Eficacia de la transferencia genica Reactivo para la transfeccion genica

IORS

Ser humano Celulas inmortalizadas de vaina radicular externa 25 Fugene

hKC

Ser humano Queratinocitos epidermicos 8 CombiMag

CEF

Gallina Fibroblastos fetales 10 PolyMag

Nombre de las celulas

Especie Origen Eficacia de la transferencia genica Reactivo para la transfeccion genica

IDP

Ser humano Celulas inmortalizadas de papila dermica 18 PolyMag

HacaT

Ser humano Queratinocitos inmortalizados 7 PolyMag

Pam212

Raton Celulas epiteliales escamosas 32 PolyMag

PC3

Ser humano Celulas de cancer de prostata 46 Fugene

LNcap

Ser humano Celulas de cancer de prostata 10 PolyMag

hFB

Ser humano Fibroblastos 17 Fugene

MCF7

Ser humano Celulas de cancer de mama 0,8 Fugene

HeLa

Ser humano Celulas de cancer cervical 0,3 Fugene

mDC

Raton Celulas dermicas 0,4 Fugene

Como resultado, se hallo que el gen Wnt3a se introducia en celulas IORS, IDP y PC3 con una eficacia comparativamente elevada.

Confirmacion de la hiperexpresion de mRNA por Wnt3a segun se determina por RT-PCR

Se introdujo el construido vector pTarget de Wnt3a o el testigo en celulas IORS y se extrajo el RNA total 2 dias mas

5 tarde usando Isogen (Nippon Gene) para sintetizar cDNA. Usando el resultante cDNA de celulas IORS como molde, se llevo a cabo una reaccion PCR sobre Wnt3a humano usando un cebador sentido, caggaactacgtggagatca (ID. SEC. n° 4), y un cebador antisentido, ccatcccaccaaactcgatg (ID. SEC. n° 5), y se observo hiperexpresion cuando se investigo la expresion de Wnt3a por el plasmido introducido (datos no mostrados).

Confirmacion de la expresion de la proteina Wnt3a recombinante mediante transferencia Western

10 2 dias despues de la transfeccion genica, se lisaron celulas transfectadas con cada uno de los genes mostrados en la Tabla 1 y se sometio el lisado a un tratamiento termico en tampon de muestras para electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico (SDS-PAGE; del ingles, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) y se aplico despues a una SDS-PAGE. En ese momento, se prepararon muestras de modo que el numero de celulas medido antes de la extraccion proteica fuera igual entre las celulas transfectadas con el plasmido

15 Wnt y con el vector testigo. A continuacion, despues de la SDS-PAGE, se transfirio la proteina del gel a una membrana usando un metodo semiseco. Despues del tratamiento de la membrana con una disolucion de bloqueo comercialmente asequible, se dejo que la membrana reaccionara con anticuerpo Wnt3a (Abcam) diluido por un factor de 500 como anticuerpo primario. Despues de un lavado con PBS-T, se dejo que la membrana reaccionara adicionalmente con IgG anti-conejo marcada con HRP (GE Healthcare Life Sciences) diluida por un factor de 2000

20 como anticuerpo secundario. Ademas, despues de un lavado con PBS-T, se llevo a cabo la deteccion usando ECL Advance (GE Healthcare Life Sciences). Como testigo positivo se uso una proteina Wnt3a de raton comercialmente asequible (R&D System). Los resultados se muestran en la Figura 2. Se observo una elevada expresion de Wnt3a en celulas IORS e IDP, y tambien se observo expresion en celulas PC3.

Confirmacion de la expresion funcional del Wnt3a introducido, mediante la expresion acelerada de Lef-1

25 Se investigo si el Wnt3a hiperexpresado por la introduccion de un plasmido construido actua fisiologicamente o no, usando Lef-1, que es un factor cuya expresion genica resulta acelerada por la accion de Wnt (M. Filali et al., J. Biol. Chem., 277, 33.398-33.410, 2002), como un indicador. Se introdujo el vector pTarget del plasmido Wnt3a o el testigo en celulas IORS y se extrajo el RNA total 2 dias mas tarde usando Isogen (Nippon Gene) para sintetizar cDNA. Usando el resultante cDNA de las celulas IORS como molde, se llevo a cabo una reaccion PCR sobre Lef-1 humano

30 usando un cebador sentido, cttccttggtgaacgagtctg (ID. SEC. n° 6), y un cebador antisentido, gtgttctctggccttgtcgt (ID. SEC. n° 7).

Los resultados se muestran en la Figura 3. En el caso de haberse introducido el plasmido Wnt3a, se observo aceleracion de la expresion del gen Lef-1 en comparacion con el testigo y se determino que el Wnt3a introducido actua fisiologicamente.

LISTA DE SECUENCIAS

lt;110gt;

SHISEIDO COMPANY, LTD.

5

lt;120gt; Celula transformada con el gen Wnt3a humano

lt;130gt;

V724-PCT

10

lt;160gt; lt;170gt; 7 PatentIn version 3.1

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 1 2932 DNA Homo sapiins

lt;400gt;

1

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 2 18 DNA Artificial

10

lt;220gt; lt;223gt; lt;400gt; Cebador sentido de Wnt3a 2

lt;210gt;

3

lt;211gt;

19

lt;212gt;

DNA

lt;213gt;

Artificial

lt;220gt;

lt;223gt;

Cebador antisentido de Wnt3a

lt;400gt;

3

lt;210gt;

4

lt;211gt;

20

lt;212gt;

DNA

lt;213gt;

Artificial

lt;220gt;

lt;223gt;

Cebador sentido de Wnt3a

lt;400gt;

4

lt;210gt;

5

lt;211gt;

20

lt;212gt;

DNA

lt;213gt;

Artificial

lt;220gt;

lt;223gt;

Cebador antisentido de Wnt3a

lt;400gt;

5

lt;210gt;

6

lt;211gt;

21

lt;212gt;

DNA

lt;213gt;

Artificial

lt;220gt;

lt;223gt;

Cebador sentido de Lef-1

lt;400gt;

6

lt;210gt;

7

lt;211gt;

20

lt;212gt;

DNA

lt;213gt;

Artificial

lt;220gt;

lt;223gt;

Cebador antisentido de Lef-1

lt;400gt;

7

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una celula transformada con un vector que contiene el gen Wnt3a humano, en donde dicha celula es seleccionada de un grupo que consiste en celulas procedentes de foliculos pilosos, en donde dichas celulas procedentes de foliculos pilosos son celulas inmortalizadas de vaina radicular externa (IORS) o celulas inmortalizadas de papila dermica (IDP), y celulas procedentes de cancer de prostata que son celulas de cancer de prostata humano (PC3).

2. 2.

   La celula segun la Reivindicacion 1, en donde el vector es un vector pTarget.