CN113201498B - 一种oxld1基因过表达的细胞株及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种OXLD1基因过表达的细胞株及其构建方法，以及构建细胞株的过表达载体及其构建方法。构建出的细胞株能够长期持续稳定过表达大鼠OXLD1，避免瞬时感染基因表达持续时间短且不稳定的缺陷。同时，弥补现有技术中对于OXLD1基因在细胞能量代谢方面研究的空白以及推动对于线粒体功能的研究。

Description

一种OXLD1基因过表达的细胞株及其构建方法
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及一种OXLD1基因过表达细胞株的构建方法。
背景技术
线粒体结构损伤与心功能障碍有着密不可分的联系，维持线粒体结构正常，人工增加其表达可能是一种新的治疗方法。OXLD1(Oxidoreductase-Like Domain-ContainingProtein1)预测其与线粒体复合物V组装因子相互作用，与线粒体氧化呼吸功能相关，在决定心功能方面有着十分重要的作用。研究发现线粒体复合物V组装因子参与细胞应激反应(例如参考文献：Inoue N等，Unbiased compound screening with a reporter geneassay highlights the role of p13 in the cardiac cellular stress response，Biochem Biophys Res Commun，2018，495(2):1992-1997)。
OXLD1基因在细胞能量代谢方面研究还存在空白，故本申请构建了OXLD1基因过表达的稳转细胞株，其长期持续稳定过表达OXLD1，对于线粒体功能的研究具有推动作用。
发明内容
本发明提供了一种OXLD1基因过表达的细胞株，所述的细胞株的染色体上包含OXLD1基因。
优选的，所述的OXLD1基因可以来源于大鼠、蜥蜴或斑马鱼。进一步优选来源于大鼠。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的OXLD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述的细胞株为心肌细胞，例如来源于人或非人动物的心肌细胞，进一步优选为大鼠心肌细胞系。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞株为大鼠心肌细胞系H9C2细胞。
优选的，所述的细胞株中稳定过表达OXLD1基因。
优选的，所述的细胞株可以为稳定转染或瞬时转染后偶然筛选获得。
本发明还提供了上述细胞株的构建方法。其选自磷酸钙法、脂质体介导法或病毒介导法等可以制备稳转细胞株的方法。
优选的，所述的构建方法包括：
a)构建包含OXLD1基因的过表达载体；
b)将步骤a)所述的过表达载体转染至H9C2细胞；优选的，所述的转染为使用Lipofectamine 3000进行转染。
c)抗性筛选获得OXLD1基因过表达的细胞株。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括：
a)构建包含OXLD1基因的过表达载体，将过表达载体转化至感受态细菌，培养并提取过表达载体的质粒；
优选的，获得OXLD1基因的方法包括利用包含两个酶切位点的引物对，PCR扩增OXLD1基因。进一步优选的，所述的酶切位点为XhoI和KpnI。
优选的，所述的酶切反应体系为XhoI用量为6-20U，KpnI用量为8-20U，酶切反应缓冲液为10×，OXLD1用量为1-3μg，载体用量为1-3μg。酶切反应体系体积为20-50μL。
步骤2.3将连接反应的产物转化Stbl3感受态细菌，涂布氨苄抗性的LB平板，优选的37℃倒置培养18小时，将菌落PCR阳性的菌落进行小摇，保菌并提取质粒。
酶切反应的反应程序包括在37℃下持续1.5-5h。
优选的，还包含连接OXLD1基因与载体骨架的步骤，即利用与两个酶切位点相对应的限制性内切酶，分别酶切OXLD1 PCR产物和载体骨架并连接，获得过表达载体。
优选的，连接过程中的酶切反应体系：DNA连接酶的用量为200-800U，连接反应缓冲液为10×，OXLD1合成产物用量为100-500ng，载体的酶切产物用量为10-100ng。连接反应体系体积为20-50μL。
连接反应的反应程序包括在4-16℃过夜。
优选的，所述的感受态细菌可以为Stbl3或DH5a等等。
优选的，所述的转化反应体系可以包括过表达载体、感受态细胞及LB培养基。优选的，所述的转化过程中过表达载体、感受态细胞和LB培养基的体积比为1：15：100-1：60：800。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的转化包括将感受态细胞在冰上溶解，按比例将一定量的过表达载体、感受态细胞加入到离心管中，轻轻混匀，静置冰上10-30min；在42℃水浴锅中热休克感受态细胞1-2min，迅速移入冰中静置3-5min，按比例加入相应量的无抗生素LB培养基，37℃、120-200rpm条件下恒温摇床培养60min。
优选的，所述的提取包括利用与载体所对应的抗生素筛选转化后的感受态细胞，然后对筛选的单菌落扩增。即将转化后的感受态细胞涂于有抗性的LB琼脂平板上，倒置培养于37℃培养箱中，过夜。菌落分别平板挑菌，37℃、120-200rpm条件下摇菌12-18h。
b)将步骤a)获得的过表达载体的质粒与脂质体混合制备脂质体-DNA复合物，与H9C2细胞共孵育；
优选的，还包括H9C2细胞培养步骤，包括将H9C2细胞贴壁培养，稳定传代后接种((优选0.25-1×106的密度接种，更优选0.3×106的密度接种)至6孔板内，确认细胞在70-90％汇合度待用。其中，使用的培养基为完全培养基。细胞的培养条件为37℃、5％CO2的培养箱中培养。
优选的，所述的孵育温度为30-40℃，优选为37℃。
优选的，所述的孵育时间为24-48h。进一步优选为48h。
优选的，还包含加入转染试剂的步骤，所述的转染试剂为Lipofectamine 3000。
c)抗性筛选获得OXLD1基因过表达的细胞株。优选的，所述的抗性筛选为利用嘌呤霉素进行筛选。进一步优选为，在细胞培养基中加入梯度浓度的嘌呤霉素。
优选的，嘌呤霉素的梯度浓度在0.5-10μg/mL的范围内。
本发明还提供了一种包含OXLD1基因的过表达载体。
优选的，所述的OXLD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述的过表达载体还包含载体骨架，所述的载体骨架为慢病毒载体骨架。
优选的，所述的慢病毒载体骨架可以来自包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺损病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、猫科猛兽免疫缺陷病毒/猫科猛兽艾滋病毒(Pumalentivirus)、维斯那-梅迪病毒(Visna-maedi virus)。
优选的，所述的慢病毒载体骨架包含启动子、荧光标记和抗性标记。其中，所述的启动子包括但不限于CMV、H1、U6、MSCV或SV40。所述的荧光标记包括但不限于GFP、DesRed、CFP、BFP、YFP、mCherry、mOrange或EosFP及其衍生物。所述的抗性药物标记包括但不限于Puro、G418、Hyg、Blasticidin或Zeocin。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的慢病毒载体为pLenti CMV GFP Puro。
本发明还提供了上述过表达载体的构建方法，包括将OXLD1基因与载体骨架连接获得。
优选的，利用包含两个酶切位点的引物对，PCR扩增OXLD1基因，然后利用与两个酶切位点相对应的限制性内切酶，分别酶切OXLD1 PCR产物和载体骨架并连接，获得过表达载体。
本发明还提供了一种脂质体-DNA复合物，所述的脂质体-DNA复合物中包含OXLD1基因。
优选的，所述的脂质体-DNA复合物中包含阳离子聚合物。所述的阳离子聚合物与带负电荷的核酸形成复合物。
在本发明的一个具体实施方式中，使用LipofectamineTM3000试剂制备脂质体-DNA复合物。
本发明还提供了一种上述的细胞株或上述的过表达载体在研究细胞能量代谢或研究氧化应激能力或研究线粒体功能中的应用。
本发明所述的细胞株可以为任何细胞。其可以来源于人或非人动物。进一步优选为实验室常用的细胞系，例如人原代胃癌细胞永生化细胞、小鼠多能胚胎干细胞(127TAg)、人胎肾(293)、人肝癌(2215)、人肾(293/CHE-Fc)、小鼠胚胎成纤维(3T3-L1或3T6)、人表皮细胞癌(A431)、人肺癌(A549)、小鼠结缔组织成纤维细胞(A9)、大鼠胰腺肿瘤(AR42J)、小鼠垂体肿瘤(AtT-20)、绒猴EB病毒感染的白血病细胞(B95-8)、小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/3T3)、人肝癌(bel7402)、人绒毛癌上皮细胞(BeWo)、仓鼠肾成纤维细胞(BHK-21)、人乳房上皮细胞(BHL-100)、大鼠肝上皮细胞(BRL 3A)、牛鼻甲骨细胞成纤维细胞(BT)、人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)、人肝脏上皮细胞(Chang)、仓鼠卵巢上皮细胞(CHO-K1)、小鼠B细胞(CL2或CL3)、大鼠肝脏上皮细胞(Clone9)、小鼠黑素瘤上皮细胞(Clone M-3)、猴肾成纤维细胞(COS-1或COS-3)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7或CV-1)、猫肾上皮细胞(CRFK)、HEK293、HeLa、LNCaP、HepG2、A549细胞或大鼠心肌细胞系(H9C2)。
本发明通过将线粒体氧化应激相关大鼠基因OXLD1整合到H9C2细胞染色体上，具体构建方法包括：构建包含OXLD1基因的过表达载体，过表达载体转染H9C2细胞系，利用载体所含抗性对应的抗生素筛选转染后的细胞，得到稳定转染的细胞株。通过RT-qPCR证实转染后上调OXLD1基因mRNA水平的表达。构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定表达OXLD1。构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定表达大鼠OXLD1，不具备瞬时感染所具有的基因表达持续时间短且不稳定的缺陷。同时，弥补现有技术中对于OXLD1基因在细胞能量代谢方面研究的空白以及推动对于线粒体功能的研究。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1为载体骨架结构示意图；
图2为过表达载体结构示意图；
图3为H9C2细胞药筛2周后的电子显微镜(左图)及荧光显微镜(右图)视野；
图4为稳转细胞单克隆株电子显微镜(左图)下及荧光显微镜(右图)下视野；
图5为目的基因OXLD1的溶解曲线，其中，RFU为relative fluorescence units，即相对荧光单位，-d(RFU)/dT代表随着时间推移的相对荧光单位；
图6为GAPDH内参基因溶解曲线，其中，RFU为relative fluorescence units，即相对荧光单位，-d(RFU)/dT代表随着时间推移的相对荧光单位；
图7为筛选后稳转H9C2细胞株目的基因OXLD1的RT-qPCR结果，其中，H9C2-OE-OXLD1为OXLD1基因过表达的H9C2细胞株；
图8为正常H9C2细胞(H9C2)与稳定OXLD1过表达H9C2细胞(H9C2-OE-OXLD1)常氧下进行安捷伦Seahorse线粒体压力测试的氧消耗速率对比结果。
具体实施方式
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请使用的部分试剂的来源如下：
pLenti CMV GFP Puro，购买自addgene，货号Plasmid#17448；
LipofectamineTM3000Transfection Reagent，购买自Thermo，货号L3000001；
H9C2细胞购买自connoisseur，货号L202009。
实施例1：过表达载体的构建
步骤1.NCBI查询获得所需要的大鼠OXLD1基因的序列，序列号为NM_001305985.1，OXLD1基因序列送测序公司进行基因合成，即合成目的片段，其中包含上游酶切位点XhoI及下游酶切位点KpnI；
详细地，过表达载体中需插入的目的片段，其序列为：
CTCGAGATGGGCTCGCTGCTGCGGAACCTGTCCCGGGGAGGTCGGGTGGGAGCTGCACTCTGGTGCTGGAGGAAGGCTCGCGGCCTAGGCGGCCCTCAGTGCCCCAGCTGGGTTACGCCAAGACTTTCGCGCAGCCGGGGTATCCCCGGTCTGGAAGACCGGCCAGCGCTTGGAGGAGTCATGGTCAGCGTGCTCACTGAGAGCTTTCTTCAGGGCAAGCACCACTTCTCCAGCTGGGGCTGCTGCCAGAGTCTTCCCCGAGGAAGACACAGTGTTCTTCACAGACACCGTGCTCCAGTGCAAACCACTGATAGCCGCAGAAAGTTGGGGACGGACCACAGGGAAGAAGGTTTCCAAGTAGGTACAGAGGTTGACAGGGAGCCAAAGGCCTCCCTGCCCAGGGGGAACCTCATAGGGCCTCCAGACTCTCTGCCACCTGAGCTTGAGCCTCCCACAAACTGCTGTATGAGTGGCTGTCCTAACTGTGTATGGGTAGATTATGCGGAAGCTCTGCTGAGGCTCTACCAGGATGGTGGGGAGAAGGCCCTGGCCCTTCTAGAGGAGCACGTGACTGATGAGAACCTCAAGGCCTTCCTCAGAATGGAGATCCGGCTACGCATGCAGAGCGGAGCCTGAGGTACC(SEQ ID NO：1)
步骤2：2.1合成的载体骨架pLenti CMV GFP Puro结构如图1所示，使用XhoI/KpnI双酶切并跑胶回收目的大小为8603bp的DNA片段；
酶切反应的反应程序包括在37℃下持续2h。
配制酶切反应体系。具体组成如下述表1所示。
表1
酶切体系 体积/μL
OXLD1 PCR扩增产物或过表达载体 2
XhoI 1
KpnI 1
10×酶切反应缓冲液 2
H2O 14
总计 20
其中，酶切试剂，如XhoI、KpnI、10×酶切反应缓冲液等，均为商品化酶切试剂，OXLD1用量为1μg，过表达载体用量为1μg。
步骤2.2使用双酶切将载体骨架和OXLD1基因合成产物进行连接反应，构建过表达载体，即pLenti CMV/OXLD1/GFP-Puro，结构如图2所示。
配制连接反应体系。具体组成如下述表2所示。
表2
连接体系 体积/μl
OXLD1酶切产物 6
载体酶切产物 1
10*buffer 2
DNA连接酶 1
H2O 10
总计 20
其中，连接试剂，如DNA连接酶、10*酶切反应缓冲液等，均为商品化DNA连接试剂，采用TaKaRa公司T4 DNA Ligase酶系，OXLD1酶切产物用量为200ng，酶切慢病毒载体用量为50ng。
执行连接反应以连接OXLD1酶切产物和载体酶切产物，反应条件为4℃过夜。连接产物为过表达载体。
步骤2.3将连接反应的产物转化Stbl3感受态细菌，涂布氨苄抗性的LB平板，37℃倒置培养18小时，将菌落PCR阳性的菌落进行小摇，保菌并提取质粒。
转化反应的反应体系中，过表达载体、感受态细胞和LB培养基的体积比为1：20：500。
具体的，将感受态细胞在冰上溶解，按比例将一定量的过表达载体、感受态细胞加入到离心管中，轻轻混匀，静置冰上10min；在42℃水浴锅中热休克感受态细胞1min，迅速移入冰中静置3min，按比例加入相应量的无抗生素LB培养基，37℃、180rpm条件下恒温摇床培养60min。
对于转化后细胞的鉴定操作，具体实现步骤可以包括：将转化后的感受态细胞涂于有抗性的LB琼脂平板上，倒置培养于37℃培养箱中，过夜。菌落分别平板挑菌，37℃、180rpm条件下摇菌16h，分别提取过表达载体的质粒。琼脂糖凝胶电泳初筛后将质粒送测序进行鉴定。
实施例2：OXLD1基因过表达H9C2细胞的构建
1、H9C2细胞常规培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。转染前1天，取细胞形态及对数生长好的细胞，以0.3×106个/孔的密度接种至六孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱过夜培养。当细胞达到大概80％汇合度时进行转染。
2、利用Lipofectamine 3000进行质粒转染
1)将细胞培养板置于37℃、5％CO2条件下孵育48h。
2)使用Opti-MEMTM培养基稀释LipofectamineTM3000试剂，充分混匀，A管；
3)使用Opti-MEMTM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加P3000TM试剂，充分混匀，B管；
4)在每管已稀释的LipofectamineTM3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)，将B管内容物转移至A管并充分混匀，室温孵育10min，获得脂质体-DNA复合物。向每孔加入250μL的脂质体-DNA复合物；
5)将细胞培养板置于37℃、5％CO2条件下孵育48h。；转染48h后于荧光显微镜下观察转染效果并拍照。
利用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent进行转染的体系见表3。
表3
Figure BDA0002984136660000091
3、嘌呤霉素抗性筛选
1)分别在培养基中加入0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL浓度的嘌呤霉素进行预实验，选择在三天内能够完全杀死细胞的浓度作为最终浓度；
根据结果最终确定为5μg/mL，在加入含5μg/mL嘌呤霉素的培养基中持续药筛两周，收集抗性细胞，命名为(H9C2-OE-OXLD1)，备用；
2)转染细胞药筛2周后电子显微镜下及荧光显微镜下观察视野如图3所示。
3)筛选单克隆细胞株。具体实现过程为：
将步骤1)中筛选出的细胞消化计数并调整浓度为0.5个细胞/100μL；向96孔板中每孔加100μL细胞悬液，并含终浓度为5μg/mL的嘌呤霉素。
当孔中有细胞培养增殖到显微镜下可见，在移液器尖端吸取少量胰酶，缓慢滴至细胞处，待细胞消化后，迅速吹打，将消化下的细胞转移至48孔板中，继续传代扩增，即为单克隆细胞株。该细胞即为筛选出的稳转单克隆细胞株。稳转单克隆细胞株电子显微镜下及荧光显微镜下观察视野如图4，由图4可以看出，筛选出的稳转细胞株的生长状态良好且均具有荧光。
4)RT-qPCR法基因验证
设计OXLD1和GAPDH特异性引物序列，引物序列见表4：
表4
OXLD1-F GCTTGGAGGAGTCATGGTCA(SEQ ID NO：2)
OXLD1-R TTCTGCGGCTATCAGTGGTT(SEQ ID NO：3)
GAPDH-F ACCACAGTCCATGCCATAAC(SEQ ID NO：4)
GAPDH-R TCCACCACCCTGTTGCTGTA(SEQ ID NO：5)
以GAPDH基因为内参，利用SYBR Green I染料法对目的基因在实验组和对照组中的OXLD1基因表达情况进行相对定量分析，每个样本做三个平行，相对定量法采用2-ΔΔCt法；目的基因的表达参数如下表5所示，目的基因表达变化分析如图7，溶解曲线如图5、图6所示。
表5
Figure BDA0002984136660000101
Figure BDA0002984136660000111
从图7可知，药物筛选转染组OXLD1基因表达显著升高，基因过表达成功。图5中是实验组和对照组扩增目的基因OXLD1的溶解曲线图，上方表达组曲线形成一个单峰说明设计的引物特异性好；图6代表的是GAPDH内参基因溶解曲线。
实施例3：OXLD1基因过表达H9C2细胞的应用
本发明的构建方法重复性及效率高，构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定表达OXLD1，该OXLD1基因过表达H9C2细胞株可用于线粒体功能的研究的相关安捷伦SeahorseXF实时ATP速率测定、细胞线粒体压力测试、细胞糖酵解压力测试，活性氧检测，线粒体膜电位测定实验，并且检测结果稳定可靠可以反应细胞能量代谢及线粒体功能的变化情况。
本实施例以安捷伦Seahorse线粒体压力测试为例，验证实施例2中制备的OXLD1基因过表达H9C2细胞株在氧消耗速率中的优势。
1、试验步骤
实验前一天
1)将H9C2细胞以1×104个细胞/孔接种到24孔Seahorse XF细胞培养微孔板的AB两排，同时将OXLD1基因过表达H9C2细胞株(H9C2-OE-OXLD1)以1×104个细胞/孔接种到24孔Seahorse XF细胞培养微孔板的CD两排。在37℃，CO2培养箱中过夜；
2)用Seahorse XF校准液水化一块传感器探针板，每孔加1mL校准液，在37℃，CO2培养箱过夜。
实验当天
1)往50mL Seahorse XF DMEM培养基中加入丙酮酸钠、葡萄糖，分别配制为1mmol/L丙酮酸钠、2mmol/L谷氨酰胺和10mmol/L葡萄糖做为检测液；
从Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒中取出寡霉素、羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙FCCP和鱼藤酮/抗霉素A三管化合物。分别加入630，720，540μL步骤1)中配制的检测液，配置成100μmol/L寡霉素浓缩液，100μmol/L FCCP浓缩液，50μmol/L鱼藤酮/抗霉素A浓缩液；
2)把细胞培养微孔板中的细胞生长培养基换成检测液，将细胞培养微孔板放入37℃无CO2培养箱中45分钟到1个小时。
3)取三个试管，分别加入2550，2400，2700μL检测液及450，600，300的步骤2)中配制的三种化合物浓缩液，分别配成1.5μM寡霉素，2μMFCCP，0.5μM鱼藤酮/抗霉素A的工作液；
4)将步骤3)中配制的化合物工作液加入探针板加药孔中，A孔中加入56μL寡霉素工作液，B孔中加入62μLFCCP工作液，C孔中加入69μL鱼藤酮/抗霉素A的工作液；
5)将加入药物的传感器探针板放入安捷伦Seahorse仪器，进行仪器校准，校准成功后，将24孔Seahorse XF细胞培养微孔板上机进行检测。
2、试验结果
试验结果见图8，实验应用正常H9C2细胞与本发明构建的稳定OXLD1过表达H9C2细胞常氧下进行安捷伦Seahorse线粒体压力测试，结果表明，OXLD1稳定过表达显著增加了常氧条件下的基础、最大呼吸、备用容量、非线粒体耗氧量和ATP产量。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 一种OXLD1基因过表达的细胞株及其构建方法
<130> 1
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgagatgg gctcgctgct gcggaacctg tcccggggag gtcgggtggg agctgcactc 60
tggtgctgga ggaaggctcg cggcctaggc ggccctcagt gccccagctg ggttacgcca 120
agactttcgc gcagccgggg tatccccggt ctggaagacc ggccagcgct tggaggagtc 180
atggtcagcg tgctcactga gagctttctt cagggcaagc accacttctc cagctggggc 240
tgctgccaga gtcttccccg aggaagacac agtgttcttc acagacaccg tgctccagtg 300
caaaccactg atagccgcag aaagttgggg acggaccaca gggaagaagg tttccaagta 360
ggtacagagg ttgacaggga gccaaaggcc tccctgccca gggggaacct catagggcct 420
ccagactctc tgccacctga gcttgagcct cccacaaact gctgtatgag tggctgtcct 480
aactgtgtat gggtagatta tgcggaagct ctgctgaggc tctaccagga tggtggggag 540
aaggccctgg cccttctaga ggagcacgtg actgatgaga acctcaaggc cttcctcaga 600
atggagatcc ggctacgcat gcagagcgga gcctgaggta cc 642
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttggagga gtcatggtca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttctgcggct atcagtggtt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accacagtcc atgccataac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (4)

1.一种OXLD1基因过表达的细胞株的应用，其特征在于，所述的OXLD1基因过表达的细胞株的染色体上包含OXLD1基因，所述的OXLD1基因来源于大鼠，所述的OXLD1基因的核苷酸序列如NM_001305985.1所示，所述的细胞株为大鼠心肌细胞系H9C2细胞；
所述的应用为增加常氧条件下的细胞的氧消耗速率。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的OXLD1基因过表达的细胞株的构建方法包括：
a)构建包含OXLD1基因的过表达载体；
b)将步骤a)所述的过表达载体转染至H9C2细胞；
c)抗性筛选获得OXLD1基因过表达的细胞株；
其中，所述的过表达载体中包含SEQ ID NO：1。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的构建方法包括：
a)构建包含OXLD1基因的过表达载体，将过表达载体转化至感受态细菌，培养并提取过表达载体的质粒；
b)将步骤a)获得的过表达载体的质粒与脂质体混合制备脂质体-DNA复合物，与H9C2细胞共孵育；
c)抗性筛选获得OXLD1基因过表达的细胞株。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的过表达载体还包含载体骨架，所述的载体骨架为慢病毒载体骨架。
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