JP6231253B2 - 体細胞を再プログラムするためのrnaの使用 - Google Patents
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Description
また、本願は特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も含み得る。
1.(i)体細胞を含む細胞集団を用意するステップ、(ii)前記体細胞の少なくとも一部にRNAを導入して、幹細胞特性の発生を誘導するステップ、及び(iii)幹細胞特性を有する細胞を発生させるステップを含む、幹細胞特性を有する細胞を作出するための方法。
2.前記RNAが未分化細胞に由来する、上記1に記載の方法。
3.前記未分化細胞が幹細胞である、上記2に記載の方法。
4.前記幹細胞が胚性幹細胞又は成体幹細胞である、上記3に記載の方法。
5.前記RNAが全細胞RNAを含む、上記1〜4のいずれか一項に記載の方法。
6.前記RNAが前記未分化細胞に特異的なRNAを本質的に含む、上記2〜4のいずれか一項に記載の方法。
7.前記RNAがインビトロ転写によって得られたものである、上記1〜6のいずれか一項に記載の方法。
8.(i)体細胞を含む細胞集団を用意するステップ、(ii)OCT4を発現させることのできるRNA及びSOX2を発現させることのできるRNAを、前記体細胞の少なくとも一部に導入するステップ、及び(iii)幹細胞特性を有する細胞を発生させるステップを含む、幹細胞特性を有する細胞を作出するための方法。
9.NANOGを発現させることのできるRNA及び/又はLIN28を発現させることのできるRNAを導入することをさらに含む、上記8に記載の方法。
10.KLF4を発現させることのできるRNA及び/又はc−MYCを発現させることのできるRNAを導入することをさらに含む、上記8又は9に記載の方法。
11.ステップ(iii)が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、上記1〜10のいずれか一項に記載の方法。
12.前記幹細胞特性が胚性幹細胞形態を含む、上記1〜11のいずれか一項に記載の方法。
13.前記幹細胞特性を有する細胞が、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現させ、胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーを発現させ、且つ/又は胚性幹細胞に特有の遺伝子を発現させる、上記1〜12のいずれか一項に記載の方法。
14.前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、上記1〜13のいずれか一項に記載の方法。
15.前記幹細胞特性を有する細胞が3つの一次胚葉(primary germ layers)全ての高度派生物(advanced derivatives)へと分化する発生能を有する、上記1〜14のいずれか一項に記載の方法。
16.前記体細胞が線維芽細胞である、上記1〜15のいずれか一項に記載の方法。
17.前記線維芽細胞が肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞である、上記16に記載の方法。
18.前記体細胞が遺伝子改変される、上記1〜17のいずれか一項に記載の方法。
19.前記体細胞がヒト細胞である、上記1〜18のいずれか一項に記載の方法。
20.前記RNAが前記体細胞の少なくとも一部にエレクトロポレーションによって導入される、上記1〜19のいずれか一項に記載の方法。
21.上記1〜20のいずれか一項に記載の方法によって調製される、幹細胞特性を有する細胞。
22.上記1〜20のいずれか一項に記載の方法によって調製される幹細胞特性を有する細胞の組成物。
23.医薬組成物である上記22に記載の組成物。
24.医学に使用するための、上記21に記載の細胞又は上記22若しくは23に記載の細胞の組成物。
25.移植医学における上記21に記載の細胞又は上記22若しくは23に記載の細胞の組成物の使用。
26.疾患モデルを作出するための、上記21に記載の細胞又は上記22若しくは23に記載の細胞の組成物の使用。
27.薬物開発のための、上記21に記載の細胞又は上記22若しくは23に記載の細胞の組成物の使用。
28.上記21に記載の幹細胞特性を有する細胞又は上記22若しくは23に記載の幹細胞特性を有する細胞の組成物を、ある特定細胞タイプへの部分的な又は完全な分化を誘導する又は方向付ける条件下で培養するステップを含む、分化細胞タイプを派生させる方法。
29.動物分化体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするための方法であって、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の前記再プログラミングを可能にする1種または2種以上の因子を発現させることのできるRNAを、前記体細胞中に導入するステップを含む方法。
30.前記1種または2種以上の因子がOCT4、SOX2、NANOG及びLIN28を含む、上記29に記載の方法。
31.前記1種または2種以上の因子がOCT4、SOX2、KLF4及びc−MYCを含む、上記29に記載の方法。
32.動物分化体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに役立つ1種または2種以上の因子を同定するためのアッセイであって、1種または2種以上の因子を発現させることのできるRNAを前記体細胞中に導入するステップ、及び前記体細胞が幹細胞特性を有する細胞に発生したかどうかを決定するステップを含むアッセイ。
33.前記体細胞が幹細胞特性を有する細胞に発生したかどうかを決定するステップが、前記RNAの前記導入によってもたらされる前記細胞の遺伝子発現を、同じタイプの胚性細胞と比較することを含む、上記32に記載のアッセイ。
34.OCT4を発現させることのできるRNA及びSOX2を発現させることのできるRNAを含む、幹細胞特性を有する細胞を作出するためのキット。
35.胚性幹細胞培養培地をさらに含む、上記34に記載のキット。
36.体細胞中に導入された時に前記細胞において幹細胞特性の発生を誘導することのできるRNAを含む医薬組成物。
IVT RNAの作製
IVT RNAの作製における第1ステップは、特定因子のコーディング配列を含有し、且つ開始コドンの前に、そこからのインビトロ転写の開始が可能なSP6プロモーター又はT7プロモーターを有するプラスミドの線状化を含む。この目的を達成するには、例えば制限酵素を使用する。線状化の後、酵素をフェノール-クロロホルム沈殿によって不活化し、除去する。そのために、等体積の、フェノールとクロロホルムの混合物を加え、よく混合する。
細胞のエレクトロポレーション
エレクトロポレーションの原理は、短い電流パルスによって細胞の膜内外電位差を乱すことに基づく。外部刺激による膜内外電位差の変化は、次の等式によって記載される:
ΔVm=fEextr cosφ
Vmは膜内外電位差であり、fは細胞外の電場分布に対する細胞の影響を記述する形状因子である。fEextは印加される電場、rは細胞半径、φは外から印加された電場に対する角度を記述する。因子fはしばしば1.5とされるが、これは他の多くの因子に依存する。細胞のエレクトロポレーションは、印加した電場が細胞膜の電気容量を超えれば、すなわちΔVmが、1Vとされる閾値ΔVsよりも大きければ成功である(Kinosita, K., Jr.及びTsong、T.Y. (1977) Nature 268, 438-441)。二重層という細胞膜の構造は、真核細胞に共通する特質であり、この値は、細胞株が異なっても、ほとんど変動を示さない。膜内外電位差の絶縁破壊により、一過性に親水性の細孔が形成され、そこを通って水が細胞中に浸透して、細胞中に核酸などの分子を輸送する(Weaver, J.C. (1995) Methods Mol. Biol. 55, 3-28;Neumann, E.ら. (1999) Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 3-16)。エレクトロポレーションに先立ち、使用する接着細胞をセミコンフルエントまで培養し、PBSで洗浄し、トリプシンを使って細胞培養フラスコから剥離する。細胞を、10%FCS(ウシ胎仔血清)を含む培地に移し、500×gで8分間遠心分離する。ペレットを無血清培地X-Vivoに再懸濁し、再び500×gで8分間遠心分離する。以降のエレクトロポレーションを妨害するであろうFCSの残渣を除去するために、この洗浄操作をさらに2回行なう。洗浄後に、細胞を250μl中で所望の細胞密度に調節し、エレクトロポレーションキュベットに移し、氷上に置く。適当な量のインビトロ転写RNAを加え、よく撹拌した後、200V及び250μFで、エレクトロポレーションを行なう。次に細胞を直ちに妥当な栄養培地に移してインキュベートする。
トランスフェクトされたRNAによって発現されるタンパク質の安定性
本発明者らは、次に、異なる半減期を有するタンパク質が、IVT RNAの導入後に、どのくらい長く細胞中に安定に検出され得るかについて調べた。786-0細胞に、20μgのeGFP IVT RNA及び2dGFP IVT RNAをそれぞれトランスフェクトし、蛍光強度を3時間〜120時間にわたって経時的に測定した。eGFPタンパク質は16時間の半減期を有し、一方、タンパク質分解を引き起こすPESTアミノ酸配列の組み込みによる不安定化変異体2dGFPの半減期は、2時間に減少する(Clontech, 1998)。実験により、4時間後には早くも、かなりの量の翻訳されたタンパク質が検出可能であり、それがトランスフェクションの24時間後までさらに増加することがわかった。eGFPタンパク質の量は120時間超にわたって比較的一定に保たれる。不安定化された2dGFPでさえ、48時間にわたって安定なタンパク質発現を示す(図1)。長期間にわたって安定な2dGFPのタンパク質発現を誘導するために、RNAを48時間ごとにトランスフェクトすることができる。
RNAエレクトロポレーション後の、方法論に起因する効果の検討
本発明者らは、次に、エレクトロポレーション及び細胞への一本鎖RNAの導入によって、どの非特異的効果が誘導されるかを調べた。これらの効果は、IVT RNAとして導入された特異的遺伝子産物によって誘導される細胞分化に重なって起こり得る。2×107個の786-0細胞に、20μgのeGFP IVT RNAをトランスフェクトし、さらに8時間、24時間及び72時間培養した。非トランスフェクト細胞との比較は成長挙動の変化を示さず、強化されたアポトーシスも示さなかった。いずれの場合も、トランスフェクション後の生細胞の割合は、約95%だった。
表1:20μgのeGFP IVT RNAをトランスフェクトした2×107個の786-0細胞における、非トランスフェクト対照細胞と比較して有意に調節された遺伝子の数。それぞれ2超及び0.5未満の調節だけを有意な変化であるとみなした。
転写因子をコードするRNAの導入による細胞の再プログラミング
細胞のプログラムを変化させるために遺伝子の導入を使用できるかどうかを調べるために、本発明者らは、転座t(X;18)(p11.2;q11.2)によって生じ(Clarkら, 1994;Crewら, 1995)、滑膜肉腫の90%超に検出され得る(Sreekantaiahら, 1994)、発癌性転写因子SYT-SSX1及びSYT-SSX2のトランスフェクションの効果を解析した。SYT-SSX1及びSYT-SSX2 IVT RNAのトランスフェクションによって引き起こされる分子変化を、Affymetrixオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使って解析した。異なるコンストラクトをそれぞれ三つ一組にしてトランスフェクトした。蛍光顕微鏡でトランスフェクション効率を調べることができるように、eGFPによるトランスフェクションを行なった。8時間後に、トランスフェクション効率は95%を上回ると決定された(データ未掲載)。細胞を8時間、24時間及び72時間後にそれぞれ収集し、RNAを抽出した。列挙した遺伝子のRNA導入後に起こる細胞中の分子変化を解析するために、本発明者らは、22,000遺伝子の発現の変化を同時に調べることができるAffymetrixオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使った。
転写因子カクテルをコードするRNAの導入による細胞の再プログラミング
TFカクテルOCT4、SOX2、KLF4及びc-MYC(OSKM)又はOCT4、SOX2、LIN28及びNANOG(OSLN)をコードするインビトロ翻訳mRNA(IVT-RNA)を、ヒト又はマウス線維芽細胞の細胞質中に電気導入(electro-transfer)した。
(i)エレクトロポレーションを受けたCCD1079Sk細胞において、24時間後に、qRT-PCRによって高レベルのIVT-RNAを検出することができる(図7)。
(ii)エレクトロポレーションの168時間後でさえ、6つの転写因子全てのIVT-RNAを、十分に検出することができる(図7)。
(iii)ウェスタンブロット解析によってモニターすると、4つのTF SOX2、OCT4、KLF4、及びcMYC(OSKM)をコードするIVT-RNAは、エレクトロポレーションの24時間後に、高いタンパク質レベルに翻訳される(図8)。
(iv)SOX2と共に再プログラミングにとって最も重要なTFであるOCT4(Huangfuら, 2008)は、胚性癌細胞株NTERA細胞におけるレベルと類似するレベル又はそれより高いレベルで、72時間(CCD1079Sk細胞中)〜96時間(MEF中)にわたって発現され、SOX2発現は、48時間(CCD1079Sk細胞中)〜72時間(MEF中)にわたって検出可能だった(図8)。
(v)MYC及びKLF4は少なくとも24時間(CCD1079Sk細胞中)及び48時間(MEF中)にわたって発現された。どちらのTFについても、短い半減期が公表されている(Chenら, 2005, Cancer Res. 15:65(22), 10394-10400;Searsら, 2000, Genes及びDev. 14:2501-2514)(図8)。
(i)細胞は、APに関して再現性よく陽性染色された。APは最初の実験で解析した時点よりも早い時点でも誘導されていた(4〜7日)。AP陽性をもたらすIVT-RNAの量は、TFあたりわずか1.25μgからTFあたり5μgに達した(図10及び11)。
(ii)VPAの添加は、4つのTF OSKMをコードするIVT-RNAをエレクトロポレートされたAP陽性MEFのパーセンテージを著しく増加させる(図11)。
(iii)再プログラミングプロセスをさらにはっきり示すヒト及びマウスES細胞マーカー、すなわち内在性ヒトOCT4(図12)、ヒト及びマウスTERT(テロメラーゼ逆転写酵素)(図12〜14)、ヒトGDF3(増殖分化因子3)(図12及び13)並びにヒトDPPA4(developmental pluripotency associated 4)(図13)が誘導された。APの場合と同様に、VPAの添加は、ヒト及びマウスES細胞マーカーの誘導を増加させた(図12〜14)。
(iv)反復エレクトロポレーションは、2回目のエレクトロポレーション後に初めて明らかになった細胞生存性の喪失と関連する。その後はエレクトロポレーションの度に生存性がさらに低下した。
(i)ケラチノサイトは、線維芽細胞よりも迅速に且つ効率よく、多能性細胞に再プログラムされることが、最近公表されている(Aasenら, 2008, Nat. Biotechnol. 26, 1276-84)。したがって、初代ケラチノサイト(「正常ヒト表皮ケラチノサイト」Promocell、ドイツ・ハイデルベルク(Heidelberg,Germany))などのケラチノサイトを使用することにより、少ないエレクトロポレーション回数でも、必要な発現期間をカバーするのに十分になると予想される。
(ii)細胞を不死化することが知られているタンパク質hTERT及びSV40ラージT抗原の発現は、再プログラミングの効率及びペースを向上させることが、最近公表されている(Parkら, 2008, Nature Protocols 3, 1180-1186;Maliら, 2008)。したがって、そのようなタンパク質をコードするIVT-RNA、例えばコドン最適化されたラージT抗原をコードするIVT-RNAを、TFカクテルに添加すれば、有益な効果が得られると予想される。
(i)本明細書で使用したエレクトロポレーションの電圧及び電気容量設定は、1回のエレクトロポレーション後の最大発現レベルに関して最適化されたものである。しかし、GFPの平均蛍光によってモニターすると、より温和な条件でも、発現レベルがわずかに低下するだけで、同じようなパーセンテージのトランスフェクト細胞がもたらされた(図4)。したがって、75%より低いトランスフェクション効率を許容することなく、設定を、反復エレクトロポレーション後の生存率に関して、さらに最適化することができるはずである。
(ii)本発明者らの結果は、ヒト線維芽細胞が、1回のエレクトロポレーション後に少なくとも10日間は、AP陽性になり、且つその状態を保つことを示している。これは、外因性TFの発現よりも2又は3倍長い。本発明者らは、本発明者らの時間経過実験において、ヒト線維芽細胞がエレクトロポレーション誘発性損傷から約96時間後に回復しはじめることに気付いた。したがって本発明者らは、エレクトロポレーションの頻度を96又は120時間に引き上げることで、再プログラミングプロセスを損なうことなく、細胞をより良く回復させることができる可能性があると推論する。
(iii)エレクトロポレーションの条件及び頻度の変更の他に、アポトーシス促進タンパク質p53のアップレギュレーションを妨げることでアポトーシスを阻害することによっても、増加した生存率を得ることができる。この目的を達成するために、本発明者らは、ヒトパピローマウイルス16トランスフォーミングタンパク質E6(HPV-16 E6)を本発明者らのTFカクテルに加えるつもりである。E6は、p53のポリユビキチン化及びプロテアソーム分解を誘導し、他のアポトーシス促進タンパク質(Bak、FADD、プロカスパーゼ8)を妨害することによって、アポトーシスを阻害する。さらにまた、これは、hTERTの発現を誘導し、c-MYCと正に協同する(Ristrianiら, 2008, Oncogene [出版前の電子ジャーナル];Narisawa-Saito及びKiyono 2007, Cancer Sci., 98(10),1505-11)。
(iv)加えて、本発明者らは、バーキットリンパ腫に見いだされ既に記述されている安定化点突然変異(Thr-58→Ala-58)(Searsら, 2000;Gregory及びHann 2000 Mol. Cell. Biol., 20(7) 2423-2435)を導入することによって、MYCタンパク質の半減期を増加させるつもりである。
(v)本発明者らは、半減期をさらに増加させるために、c-MYC中の不安定化PESTドメインを機能的に欠失させるつもりである。PESTドメイン欠失は、c-MYCの安定性を増加させることが示されている(Gregory及びHann 2000)。
Claims (11)
- (i)体細胞を含む細胞集団を用意するステップ、(ii)前記体細胞の少なくとも一部にRNAを導入して、幹細胞特性の発生を誘導するステップ、及び(iii)幹細胞特性を有する細胞を発生させるステップを含む、幹細胞特性を有する細胞を作出するための方法であって、前記RNAが(a)OCT4をコードするmRNA、SOX2をコードするmRNA、NANOGをコードするmRNA及びLIN28をコードするmRNAであるか、または(b)OCT4をコードするmRNA、SOX2をコードするmRNA、KLF4をコードするmRNA及びc−MYCをコードするmRNAであり、そして
前記RNAがインビトロ転写または化学合成により得られ、
前記RNAが前記体細胞の少なくとも一部に反復エレクトロポレーションによって導入され、
前記体細胞が哺乳動物細胞である、
方法。 - ステップ(iii)が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞特性が胚性幹細胞形態を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記幹細胞特性を有する細胞が、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現させ、胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーを発現させ、且つ/又は胚性幹細胞に特有の遺伝子を発現させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞特性を有する細胞が3つの一次胚葉(primary germ layers)全ての高度派生物(advanced derivatives)へと分化する発生能を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記体細胞が遺伝子改変される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体細胞がヒト細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 動物分化体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするための方法であって、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の前記再プログラミングを可能にする1種または2種以上の因子をコードするmRNAを、前記体細胞中に導入するステップを含み、前記1種または2種以上の因子が(a)OCT4、SOX2、NANOG及びLIN28を含むか、または前記1種または2種以上の因子が(b)OCT4、SOX2、KLF4及びc−MYCを含み、そして、前記RNAがインビトロ転写または化学合成により得られ、
前記RNAが前記体細胞に反復エレクトロポレーションによって導入され、
前記体細胞が哺乳動物細胞である、
方法。
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