WO2012096552A2 - Ｒｅｘ１을 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도 만능줄기세포 제조방법 - Google Patents

Ｒｅｘ１을 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도 만능줄기세포 제조방법 Download PDF

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    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention is a composition for inducing reprogramming comprising a Rex1 protein or a nucleic acid molecule encoding Rex1 protein for producing induced pluripotent stem cells from somatic or non-embryonic cells through a reprogramming process, and It relates to a method for producing induced pluripotent stem cells using the Rex1.
  • De-differentiation technology enables the production of induced pluripotent stem cells of the same characteristics as human embryonic stem cells from a patient-somatic cell by securing self-somatic cells in a relatively easy way with little physical damage and discomfort to the patient.
  • the company has evolved a strategy to establish customized self-differentiating stem cell lines and develops future regenerative medicine technology as recognized as the best solution to overcome the bioethics controversy and immunocompatibility problems that may occur when using human embryonic stem cells. It presents unlimited possibilities in the field.
  • the reprogramming efficiency is recognized to be the highest in the reprogramming efficiency of the pluripotent stem cells by overexpressing Yamanaka genes such as Oct4, Sox2, cMyc and Klf4 in human body cells using a retrovirus expression system. In this case, the inverse differentiation induction efficiency is very low, about 0.01 to 0.1%.
  • c-Myc and Klf4 which are known to be important factors in increasing reprogramming efficiency in the current reprogramming technique, are used to produce induced pluripotent stem cells by using them as a cancer gene, and to differentiate differentiated cells derived therefrom.
  • c-Myc and Klf4 which are known to be important factors in increasing reprogramming efficiency in the current reprogramming technique, are used to produce induced pluripotent stem cells by using them as a cancer gene, and to differentiate differentiated cells derived therefrom.
  • Rex1 reduced expression protein 1, ZFP42 transcription factor
  • EC F9 embryonic carcinoma
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a new dedifferentiation inducer and a redifferentiation induction system using the same to solve the problems of the existing dedifferentiation technology.
  • the induced pluripotent stem cells produced by using Rex1 are human embryonic stems.
  • the present invention was completed by confirming the preservation of multipotent characteristics such as cells.
  • the reprogramming improvement effect by Rex1 is similar in various somatic cells obtained from other sources, confirming that Rex1 can be used in various kinds of differentiated cells without line-specific restriction.
  • the reprogramming effect of the Rex1 transcription factor is an effect of improving cell proliferation inhibition and cell-cycle arrest, which is indicated as a reprogramming inhibition phenomenon occurring in the existing reprogramming technique.
  • the present invention has been completed.
  • It is an object of the present invention to provide a composition for inducing reprogramming of induced cells into induced pluripotent stem cells of differentiated cells comprising a Rex1 protein or a nucleic acid molecule encoding a Rex1 protein.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the composition for reprogramming differentiated cells into induced pluripotent stem cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a reprogrammed pluripotent stem cell by transferring a reprogramming inducer comprising a Rex1 protein or a nucleic acid molecule encoding a Rex1 protein to differentiated cells.
  • reprogramming completely from differentiated cells significantly improves the number of induced pluripotent stem cells established and reduces the time required for reprogramming.
  • Improves existing reprogramming techniques by replacing existing functions of reprogramming factors, such as replacing the use of the oncogene Klf, or by reprogramming while reducing the number of factors required for reprogramming. It can be effectively used for the purpose.
  • the present invention verifies that Rex1 can be used as a general purpose reprogramming factor that effectively works to produce induced pluripotent stem cells from small amounts of differentiated cells obtained from a variety of different sources, thereby reprogramming through existing factors.
  • the present invention greatly contributes to the development of a reprogramming technique that can effectively produce clinically safe induced pluripotent stem cells from various patient-somatic cells by providing Rex1 which can be utilized as a general purpose reprogramming factor. Induced pluripotent stem cells and differentiated cells derived on the basis of these can be applied to the development of customized stem cell therapeutics and new drug development processes, thereby substantially contributing to the advancement of the practical use of related products.
  • Figure 1 shows the expression patterns of lineage-specific markers (FIGS. 1A and B) and multipotency specific markers (FIGS. 1C and d) that characterize the differentiation and differentiation status of stem cells (FIGS. 1A-D). It is confirmed through the surface staining analysis (Fig. 1e).
  • human embryonic stem cells hES
  • human induced pluripotent stem cells hiPS
  • human embryonic tumor cells hEC
  • human foreskin fibroblasts hFF
  • Embryonic body early EB
  • embryonic body MV
  • RA-hES Embryonic body induced by differentiation by retinoic acid
  • hES-NP hES-neural bulb Cells
  • hES-CM cardiomyocytes
  • hES-OS bone cells
  • endothelial cells hES-EC
  • 2A shows agarose gel electrophoresis of the Rex1 gene product
  • B is a map of the retroviral expression vector pMXs cloned from Rex1.
  • FIG. 3 is a schematic of the reprogramming technique used in the present invention, and the diagram below is a representative picture of the somatic cells (CRL2097), established hiPS, and ALP-positive stained hiPS cell populations used in the reprogramming process.
  • Figure 4 shows the results of analyzing the reprogramming efficiency change when using the Rex1 factor in the reprogramming process with four reprogramming factors including Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 through ALP-positive staining. Values on the graph represent mean values ⁇ S.E.
  • the left panel is an ALP staining picture of the repopulated cell population.
  • the right panel shows the number of ALP-positive colonies and the values represent mean values ⁇ S.E.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the minimum and optimal reprogramming factor combinations required for reprogramming by confirming the contribution of Rex1 factor in the reprogramming process of human foreskin fibroblast cells by mixing them with other reprogramming factors.
  • Top panel shows ALP staining of repopulated cell populations.
  • the lower panel graphically displays the number of ALP-positive colonies, with the values on the graph representing the mean values.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the contribution of Rex1 factor in the reprogramming process of human foreskin fibroblast cells in conjunction with the amount of transforming the reprogramming factor.
  • the reprogramming efficiency change according to the amount of infection (MOI) of the Rex1 gene was graphically displayed by measuring the hES-like cell morphology and the number of ALP-positive colonies. Values on the graph represent mean values ⁇ S.E.
  • FIG. 7C is a representative staining picture confirming ALP-positive colonies after reprogramming with each indicated reprogramming factor in human foreskin fibroblast cells. O; Oct4, S; Sox2, M; cMyc, K; Klf 4, R; Rex1 is shown.
  • FIG. 8 is a photograph and a graph of inducing reprogramming and analyzing ALP-staining results under conditions specifically inhibiting Rex1 expression using Rex1-specific shRNA to confirm the contribution of Rex1 factor in the reprogramming process.
  • the value shown in the graph represents the mean value ⁇ SE. * p ⁇ 0.05.
  • FIG. 9 shows the characteristics of hiPS (pOSM-hiPS) reprogrammed in partially using three reprogramming factors, Oct4, Sox2, and c-Myc. At this time, the somatic cells used for reproducing are hFF.
  • 9B shows the results of real-time RT-PCR analysis of multipotent marker expression patterns in hFFs, H9 hES and pOSM-hiPS (piPS).
  • 9C shows the results of DNA methylation status in pOSM-hiPS in the promoter regions of Oct4 and Rex1. Empty circles and assay circles represent dimethylated CpG and methylated CpG, respectively, and the ratio of methylated CpG is expressed in terms of%.
  • FIG. 10 shows hiPS (OSKM-hiPS) fully reprogrammed using Oct4, Sox2, cMyc and Klf4 four reprogramming factors and hiPS (OSMR-hiPS) reprogrammed completely using Oct4, Sox2, cMyc and Rex1.
  • Figure 11 shows the results of analyzing the multipotential marker expression of OSKM-hiPS and OSMR-hiPS by Real-time RT-PCR.
  • Specific-specific PCR primers designed to comparatively analyze the total expression of the gene (Total), the endogenous gene expression (Endo), and the amount of genes expressed exogenously by the retrovirus (Trans) Time RT-PCR was performed.
  • Figure 13 shows the karyotype analysis of the cultured OSMR-iPSC.
  • Figure 14 shows the results of analysis of Oct4 and Rex1 transcription factor promoter methylation patterns in H9 hES, hFF, OSKM-hiPS (4F-hiPS), OSMR-hiPS (3F + R-hiPS). Empty circles and assay circles represent dimethylated CpG and methylated CpG, respectively, and the ratio of methylated CpG is expressed in terms of%.
  • FIG. 15 is an immunostaining photograph verifying in vitro trigeminal differentiation ability (ectoderm, endoderm, mesoderm) of OSKM-hiPS and OSMR-hiPS using a line-specific marker antibody.
  • Figure 16 shows the results of Real-time RT-PCR analysis of the in vitro trioderm differentiation of OSKM-hiPS and OSMR-hiPS using a line-specific gene marker.
  • 17 is a photograph showing the in vivo trigeminal differentiation ability of OSMR-hiPS through teratoma formation.
  • FIG. 18 shows the results of analyzing the contribution of Rex1 to reprogramming induction of induced pluripotent stem cells of human neural progenitor cells (FIG. 18A) and human mesenchymal stem cells (FIG. 18B).
  • FIG. 18 Changes in reprogramming induction efficiency induced by a combination of existing reprogramming factors (O, S, K, and / or M) and Rex1 factors were analyzed and graphically represented by ALP-positive staining analysis. Values on the graph represent mean values ⁇ S.E. * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01.
  • induced pluripotent stem cells (1F + R-hiPS) obtained through two factors Oct4, Rex1 in human neural progenitor cells and induced pluripotent stem cells secured through three factors Oct4, Sox2, Rex1 in human mesenchymal stem cells Embryonic stem cell-like cells, ALP positive staining, and multipotent marker expression patterns were verified at (2F + R-hiPS).
  • FIG. 20 shows induced pluripotent stem cells (1F + R-hiPS) obtained through two factors Oct4 and Rex1 in human neural progenitor cells and induced pluripotent stem cells secured through three factors Oct4, Sox2 and Rex1 in human mesenchymal stem cells.
  • Figure 2 shows the methylation of the Oct4, Nanog, and Rex1 promoter regions at (2F + R-hiPS). Empty circles and assay circles represent dimethylated CpG and methylated CpG, respectively, and the ratio of methylated CpG is expressed in terms of%.
  • Rex1 expression is specifically inhibited using Rex1-specific shRNAs in NCCIT human embryonic tumor cell lines, via Real-time RT-PCR (A) at the protein level, and via Western blot (B) at the protein level. This is the result of verification. Protein bands identified in the Western blot were analyzed quantitatively and the average value was displayed graphically. * p ⁇ 0.05.
  • FIG. 22 shows the results of real-time RT-PCR analysis on the expression level of multipotential markers and lineage-specific differentiation markers in human embryonic tumor cell lines which inhibited Rex1 expression.
  • FIG. 23 shows the results of analyzing the expression patterns of multipotential markers and lineage-specific differentiation markers in human embryonic tumor cell lines specifically inhibited by Rex1 expression through microarray analysis.
  • FIG. 24 is a result of reanalyzing Microarray data based on "Ingenuity Pathway Analysis software”. Expression in Rex1-specifically inhibited cell lines (shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13) compared to non-target control shRNA (shNT) -expressing cell lines that do not target any transcript of any gene as a negative control This is the result of analyzing the Biological function (Fig. 24a) and the canonical pathway (Fig. 24b) of the gene differing by at least 2 times the amount.
  • FIG. 25 is a diagram showing expression variation profiles of cell cycle G2 / M progression-related gene groups specifically expressed in human embryonic tumor cell lines with Rex1 expression inhibited by Microarray analysis.
  • FIG. 26 is a diagram showing that cell growth is inhibited in cell lines inhibited by Rex1 expression (shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13) (** P ⁇ 0.01, * P ⁇ 0.05). Changes in cell growth were analyzed by measuring cell numbers periodically (1, 3, 5 days) during cell culture (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01).
  • FIG. 27 is a diagram illustrating changes in cell cycle distribution in Rex1-inhibited cell lines (shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13).
  • the upper panel is a representative picture of the analysis results of the cell cycle distribution
  • the lower graph is a graph showing the percentage of cell groups distributed in G1, S, and G2 / M.
  • FIG. 29 shows Western blot expression patterns of G2 / M progression-related proteins in Rex1-inhibited cell lines (shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13).
  • FIG. 30 shows that the expression of cyclin B1 and cyclin B2 is enhanced by Rex1 gene overexpression through real-time RT-PCR (top) and Western blot (bottom) at the gene and protein levels, respectively. Protein blots of Western blots were graphically plotted for quantitative analysis. * P ⁇ 0.01.
  • FIG. 31 shows the results of analyzing cyclin B1 and cyclin B2 expression at the gene level by using real-time RT-PCR in the reprogramming process compared with the control group without using the Rex1 factor.
  • Oct4 + Sox2 + cMyc 3F
  • Oct4 + Sox2 + cMyc + Klf4 4F
  • Oct4 + Sox2 + cMyc + Rex1 3F + R
  • Oct4 + Sox2 + cMyc + Klf4 + Rex1 4F + R
  • the present invention provides a composition for inducing reprogramming of differentiated cells into induced pluripotent stem cells comprising a Rex1 protein or a nucleic acid molecule encoding a Rex1 protein.
  • the present invention provides the use of the composition for reprogramming differentiated cells into induced pluripotent stem cells.
  • Rex1 protein is a transcription factor first found in mouse F9 embryonic carcinoma cells, and refers to a type of zinc finger protein family, also known as ZFP42.
  • Rex1 used in the composition of the present invention includes all Rex1 derived from an animal such as human or rat, preferably human Rex1.
  • the Rex1 protein of the present invention may include not only a protein having an amino acid sequence of its wild type but also a variant thereof.
  • a variant of Rex1 protein refers to a protein in which the natural amino acid sequence of Rex1 and one or more amino acid residues have a sequence that differs by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • the variant may be a functional equivalent that exhibits the same biological activity as a natural protein or a variant in which the physicochemical properties of the protein are modified as necessary, and may be a variant in which structural stability to physical and chemical environments is increased or physiological activity is increased.
  • nucleic acid molecule encoding a Rex1 protein means a nucleotide sequence encoding a Rex1 protein in the wild type of the Rex1 protein or a variant form as described above, wherein one or more bases are substituted, deleted, inserted, or It can be mutated by a combination of and separated from nature or can be prepared using chemical synthesis.
  • Rex1 transcription factor of the present invention has the effect of enhancing the reprogramming efficiency of the differentiated cells to induced pluripotent stem cells, reprogramming that can be used to replace the existing reprogramming factors such as cancer gene Klf4 for reprogramming As an inducer, this effect of Rex1 was first discovered by the inventors.
  • the nucleic acid molecule encoding the Rex1 protein may have a form contained in the expression vector.
  • the Rex1 protein may be a protein expressed in a cell line in vitro using an expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding the Rex1 protein, the expression vector is Baculovirus expression vector, Mammalian Expression vectors or Bacterial expression vectors may be used, and the cell lines may be insect cell lines, mammalian cell lines or bacterial cell lines, but the expression vectors and cell lines usable in the present invention are not limited thereto.
  • expression vector refers to a gene construct comprising essential regulatory elements operably linked to express a gene insert, which is capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell.
  • the expression vector of the present invention can be used for the purpose of delivering a reverse differentiation inducer to differentiated cells.
  • the expression vector of the present invention includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, an operator, an initiation codon, a termination codon, a polyadenylation signal, an enhancer, and can be prepared in various ways according to the purpose. .
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, and, in the case of a replicable expression vector, includes a replication source.
  • Expression vectors can be self-replicating or integrated into host DNA.
  • the vector may include a plasmid vector, a cosmid vector, an episomal vector, a viral vector, and the like, and preferably a viral vector.
  • Viral vectors include retroviruses such as the Human immunodeficiency virus HIV (Murineleukemia virus) Avian sarcoma / leukosis (ASLV), the Spleen necrosis virus (SNV), the Rous sarcoma virus (RSV), Mouse mammary tumor virus (MMTV), and the like. , Adenoviruses, Adeno-associated virus, herpes simplex virus, Sendai virus (Sendai virus) and the like derived from the vector, but is not limited thereto.
  • HIV Human immunodeficiency virus
  • ASLV Avian sarcoma / leukosis
  • SNV Spleen necrosis virus
  • RSV Rous sarcoma virus
  • MMTV Mouse mammary tumor virus
  • the nucleic acid molecule encoding the Rex1 protein may be messenger RNA (mRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • the term "reprogramming" or “de-differentiation” refers to a finally new type of differentiation cells from differentiation cells, such as non-differentiating cells or cells with partial differentiation. It means a process that can be restored or converted to a state having a differentiation potential.
  • the reprogramming mechanism of these cells means establishing a different set of epigenetic marks after the epigenetics in the nucleus (the DNA state associated with causing a genetic change in function without a change in nucleotide sequence) are deleted. While multicellular organisms differentiate and grow, different cells and tissues acquire different gene expression programs.
  • the 'reprogramming' may be included in the process of returning the differentiated cells having differentiation capacity of 0% to less than 100% to an undifferentiated state, and preferably have a differentiation capacity of 0%.
  • the differentiated cells having differentiation capacity of 0% may be included in the process of returning the differentiated cells having differentiation capacity of 0% to less than 100% to an undifferentiated state, and preferably have a differentiation capacity of 0%.
  • the term "reprogramming inducer” refers to a substance that induces finally or partially differentiated cells to be reprogrammed into induced pluripotent stem cells having a new type of differentiation potential, and encodes a Rex1 protein or Rex1 protein. Contains nucleic acid molecules.
  • the reprogramming inducer may be included as long as it is a substance that induces reprogramming of differentiated cells, and may be selected according to the type of cells to be finally differentiated.
  • the composition of the present invention is at least one protein selected from the group consisting of Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog and Lin-28 as a reprogramming inducer, or one encoding these proteins
  • the nucleic acid molecule may be further included, but is not limited thereto.
  • the differentiated cells may be cells derived from various animals such as humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice and rabbits, preferably derived from humans It may be one cell, but this does not limit the differentiated cells that can be differentiated into induced pluripotent stem cells.
  • the differentiated cells may be somatic cells or somatic stem cells.
  • the term 'somatic cell' refers to a cell constituting an adult and having limited ability to differentiate and autologously produce.
  • the somatic cells may be somatic cells constituting human skin, hair, fat, preferably human fibroblasts, but is not limited thereto.
  • the somatic stem cells are blood stem cells (Hematopoietic stem cells), mammary stem cells (Mammary stem cells), Intestinal stem cells (Mesenchymal stem cells) (Mesenchymal stem cells) , Endothelial stem cells, endothelial stem cells, neural stem cells, neural stem cells, Olfactory adult stem cells, or neural crest stem cells, preferably neural stem cells, Neuronal precursor cells) or mesenchymal stem cells, but is not limited thereto.
  • induced pluripotent stem cells or "redifferentiated stem cells” is a method of establishing undifferentiated stem cells having similar pluripotency as embryonic stem cells using reprogramming to differentiated cells. Refers to the cells made. Induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells, specifically showing similar cell shapes, similar gene and protein expression patterns, multipotent in vitro and in vitro, forming teratomas, and When inserted into the blastocyst, chimeric mice are formed and / or have germline transmission of genes.
  • the existing reprogramming factors including Oct4, Sox2, Klf4 and cMyc, etc.
  • Rex1 was overexpressed in the overexpressed condition, and reprogramming efficiency was verified through continuous cell-like mutation and ALP-positive colony analysis.
  • the reprogramming efficiency increased depending on the concentration of Rex1 added externally (4.9 times in Rex1 MOI and 2.6 times in 5 MOI).
  • induced pluripotent stem cell colony was formed about 5 days early when reprogramming with Rex1 (see Example 11-3 and FIG. 4).
  • Rex1 may contribute to effective reprogramming of neural progenitor cells (FIG. 18A) and mesenchymal stem cells (FIG.
  • the present invention provides a method for producing reprogrammed pluripotent stem cells reprogrammed from differentiated cells.
  • the preparation method of the present invention comprises the steps of (a) delivering a reprogramming inducer comprising a Rex1 protein or a nucleic acid molecule encoding Rex1 protein to the differentiated cells; And (b) culturing the cells of step (a).
  • the method of the present invention may further comprise the step of (c) separating embryonic stem cell-like colonies from the culture obtained from step (b).
  • the method of delivering the reprogramming inducer of the step (a) to the cell can be used without limitation the method of providing a nucleic acid molecule or protein to cells commonly used in the art, preferably differentiation of the reprogramming inducer Or a method of directly injecting a reprogramming inducer into a differentiated cell, wherein the reprogramming inducer used is packaged by transfection with a viral vector into which the gene of the factor is inserted. It may be used in the form of a virus obtained from a cell, messenger RNA produced by in vitro transcription, or a protein produced in various cell lines.
  • the method of directly injecting the reprogramming inducer into the differentiated cells can be used by selecting any method known in the art, but is not limited thereto, microinjection (microijection), electroporation, particles It may be appropriately selected and applied from a method using a particle bombardment, a direct muscle injection method, an insulator and a transposon.
  • microinjection microijection
  • electroporation particles It may be appropriately selected and applied from a method using a particle bombardment, a direct muscle injection method, an insulator and a transposon.
  • the viral vector may be a vector derived from a retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, Sendai virus, etc., but is not limited thereto, and preferably a retroviral vector may be used. More preferably, retroviral vectors pMXs can be used.
  • the packaging cells may be used by selecting a variety of cells known in the art according to the viral vector used, but is not limited thereto, preferably GP2-293 packaging cells can be used.
  • a nucleic acid molecule encoding a protein may be used in vitro, a Baculovirus expression vector using an insect cell line, a Mammalian expression vector using a mammalian cell line, or a Bacterial expression vector system using a bacterial cell line. .
  • the reprogramming inducer may be selected according to the type of cells to be differentiated.
  • the reprogramming inducer comprises at least one protein selected from the group consisting of Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog and Lin-28, or at least one nucleic acid molecule encoding these proteins. May be further included.
  • the differentiated cells are as described in the composition for inducing reprogramming.
  • Cultivation of the cells may be made according to suitable media and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the cells selected.
  • Oct4, Sox2, cMyc and Rex1 induced pluripotent stem cell lines were prepared, and stem cell characteristics were analyzed by ALP staining and immunostaining. The cell lines were similar in form and indistinguishable in terms of multipotent marker expression (see FIGS. 10-11). It was confirmed by RT-PCR that Oct4, Sox2, c-Myc, and Rex1, which were externally added to the induced pluripotent stem cells, were introduced into the reprogrammed cell genome.
  • the induced pluripotent stem cell line showed a pattern similar to that of the human embryonic stem cell line (see FIG. 14), and differentiation of the embryoid body derived from the induced pluripotent stem cell line. Investigations of the ability showed that induced pluripotent stem cells established using Rex1 have the potential to differentiate into trioderm in vitro and in vitro (see Example 16 and Figures 15-17) and are normal even after prolonged sustained culture. It was confirmed that the karyotype (Fig. 13).
  • hESC Human Embryonic Stem Cells
  • hiPSC induced pluripotent stem cells
  • Undifferentiated human embryonic stem cells spontaneous differentiation embryonic bodies (early embryonic bodies, 5 days of differentiation), late embryonic bodies (28 days of differentiation) and human embryonic stem cells treated with retinoic acid (RA) and human Expression patterns of Rex1 mRNA were confirmed in cells differentiated into specific lineages derived from embryonic stem cells. Characterization of cells differentiated from human embryonic stem cells into specific lineages was confirmed through increased lineage-specific marker expression (FIGS. 1A and 1B). Real-time RT-PCR confirmed the expression of various pluripotency-specific markers with Rex1, and the expression of Rex1 decreased or disappeared in all of the differentiated cells.
  • Rex1 protein expression was confirmed in undifferentiated and differentiated human pluripotent stem cells (hES, hiPS) and partially reprogrammed human induced pluripotent stem cells (phiPS) by immunostaining. As a result, it was confirmed that Rex1 protein was expressed exclusively in undifferentiated hES and intact reprogrammed undifferentiated hiPS, but not in incompletely reprogrammed cells (phiPS) (FIG. 1E). Through these results, it was confirmed that Rex1 is a very strictly undifferentiated specific multipotent marker capable of sensitively detecting early differentiation in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.
  • PCR amplification was performed using cDNA made from RNA of human embryonic stem cells and primer sets of SEQ ID NOs: 2 and 3, and PCR conditions are the same as in Example 2.
  • PCR amplification was performed using cDNA made from RNA of human embryonic stem cells and primer sets of SEQ ID NOs: 2 and 3, and PCR conditions are the same as in Example 2.
  • the vector and the retroviral vector pMXs vector were digested with restriction enzymes, and then ligated to prepare a gene expression vector pMXs-Rex1 for reprogramming induction (FIG. 2B).
  • PMXs vectors comprising human cDNAs of Oct4 (POU5F1), Sox2, c-Myc (MYC) and KlF4 as disclosed in the paper, Takahashi, K. et al. (Cell 131, 2007, 861-872) from Addgene Purchased.
  • Rex1 expression retroviral vector was prepared in Example 4 was used.
  • Package cell line GP2-293 cells were transformed with retroviral vector DNA and VSV-G envelope vector using lipofectamine 2000. At 24 hours after transformation, the supernatant containing the first virus was recovered and the medium was changed, and after 24 hours the supernatant containing the second virus was recovered.
  • induced pluripotent stem cells each of the cells in gelatin-coated 6-well plates 6 hours before transduction of human neural progenitor cells (hNPs), mouse embryonic fibroblasts (MEF), including human foreskin fibroblasts (hFFs) Inoculated at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells per well and infected with the virus in the presence of polybrene (6 ⁇ g / ml).
  • hNPs human neural progenitor cells
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • hFFs human foreskin fibroblasts
  • hFFs cells or hNPCs cells were recovered by trypsin treatment, and after gelatin coating, MEFs were collected at a concentration of 5 to 6 ⁇ 10 4 cells per well in a 6-well plate on which a feeder layer was attached. Re-inoculation. In addition, Matrigel-coated 6-well plates were re-inoculated at 5 to 6 ⁇ 10 4 cell concentrations per well for experiments in feeder-free conditions. The next day, hFFs cells or hNPCs cells were replaced with hESC medium containing 10 ng / ml of bFGF and 1000 U / ml leukemia inhibitors (ESGRO; Chemicon, Temecula, CA) for MEF cells.
  • ESGRO U / ml leukemia inhibitors
  • mESC medium [DMEM; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD; 15% fetal bovine serum, 100 ⁇ M non-essential amino acids (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mM sodium pyruvate (Invitrogen), 100 ⁇ M 2-mercapto ethanol (Invitrogen), 1X antibiotic-antimycotic (Invitrogen)] .
  • the medium was changed once every two days. Twenty days after transfection, hESC type colonies were obtained and transferred to 12-well plates containing MEFs as feeder cells, followed by continuous proliferation culture using the hESC culture method of Example 1.
  • hEBs human embryos
  • DMEM / containing HEB medium with suspension (10% serum replacement) Incubated in F12). After 5 days of growth in suspension, embryos were transferred to gelatin-coated plates and cultured in hEB medium. Under the above conditions, the cells attached to the bottom of the plate were left to differentiate for an additional 15 days while changing the medium as needed.
  • the DNA modification process using sodium hydrogen sulfite was carried out using a commercialized kit EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research).
  • EZ DNA Methylation Kit Zymo Research
  • methylated cytosine does not change, whereas unmethylated cytosine is converted to uracil. do. Therefore, when amplified by PCR using primers specific for cytosine and uracil sequences, methylated DNA and non-methylated DNA can be distinguished.
  • the primers used are shown in Table 3 below.
  • PCR reaction mixtures consisted of bisulfite treated DNA 1 ⁇ g, dNTP 0.25 mM / l, MgCl 2 1.5 mM / l, primer 50 pM, 1 ⁇ PCR buffer, Taq polymerase (Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 2.5 units, to a final 20 ⁇ l.
  • Taq polymerase Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
  • PCR reaction products were identified on a 1.5% agarose gel and cloned into pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) after gel elution. Methylated and non-methylated sequences were analyzed by sequencing using M13 primer pairs.
  • the reprogramming technique was constructed based on Yamanaka's reverse differentiation induction system (Cell 126, 2006, 663-676), and the pMXs-EGFP-Rheb-IP vector was used to confirm the transformation efficiency.
  • Virus concentrations of 1 to 5 MOIs were transduced into somatic cells by calculating the multiplicity of infection (MOI) values of the virus by measuring the number of GFP positive cells through FACS analysis. Change the medium the next day after transduction, remove the cells using Trypsin-EDTA on the 5th day, sprinkle the cells on basal cells, culture the cells with somatic cell medium, and then exchange the medium with human embryonic stem cell culture the next day. The cells were cultivated continuously by periodically replacing them with new culture medium. After about 2-4 weeks, it was confirmed that cells having the shape of human embryonic stem cells were generated, and the induced pluripotent stem cell line was stably maintained through passage culture (FIG. 3).
  • ALP staining was performed using a commercially available ALP kit according to the manufacturer's (Sigma) instructions. Images of ALP-positive cells were recorded with the HP Scanjet G4010. In addition, bright field images were obtained by an Olympus microscope (IX51, Olympus, Japan).
  • reprogramming induction efficiency In order to measure reprogramming induction efficiency to human induced pluripotent stem cells, the number of colonies formed in a shape similar to human embryonic stem cells produced in MEF feeder or Matrigel-coated 6-well plate after reprogramming culture was measured. The cell number was initially divided. In addition, the reprogramming induction efficiency was calculated by measuring the number of colonies stained with ALP, a multipotency marker, and dividing by the number of cells initially inoculated. At this time, each experiment was performed three times.
  • Yamanaka's retrodifferentiation induction system screens 24 candidate genes using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) derived from Fbx15 ⁇ geo / ⁇ geo embryos, among which the essential factors for induction of differentiation are Oct4, Sox2, and c-Myc. And Klf4 (Cell 126, 2006, 663-676).
  • MEFs mouse embryonic fibroblasts
  • Rex1 was excluded from the reprogramming factor group.
  • the present inventors observed reprogramming variation by the addition of Rex1 after adding Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 in different combinations in MEFs cells.
  • Figure 5 These results suggest that reprogramming induction mechanisms in humans and mice may be different.
  • Rex1 may function differently in human and mouse systems in early development and in the regulation of stem cell pluripotency. will be.
  • Rex1 could replace or reduce existing reprogramming inducers.
  • orphan nuclear receptor Nr5a2 can replace Oct4 in MEF cells, there are no examples in human cells, and in general Oct4 is known as an irreplaceable essential factor for induction of reprogramming (Cell Stem Cell. 2010 Feb). 5; 6 (2): 167-74).
  • Reprogramming induction efficiency was measured in the same manner as in Examples 11-1 and 11-2. As a result, as shown in FIG. 6, even when only Oct4, Sox2 and cMyc were used, a small number of ALP-positive colonies could be confirmed, but it was not possible to establish a fully reprogrammed induced pluripotent stem cell line.
  • Colonies were found to be partially reprogrammed retrodifferentiated cell lines (pOSM-iPSCs). However, it was confirmed that addition of Klf4 or Rex1 produced fully reprogrammed induced pluripotent stem cell lines (OSMK-iPSCs, OSMR-iPSCs), and ALP-positive OSMK-iPSCs and OSMR-iPSCs. As a result of comparison by colony number, it was confirmed that using Rex1 was more efficient than Klf4 and reprogramming was successfully performed under the condition of using a smaller amount of c-Myc (FIG. 6).
  • Rex1 functions as a reprogramming inducer
  • Rex1 functions as a reprogramming inducer
  • reprogramming enhancement effect of Rex1 increases with the amount of ectopic expression.
  • cells were infected with viruses containing Oct4, Sox2, and c-Myc genes with High MOI (5 MOI) and Low MOI (1-0.5 MOI), respectively.
  • changes in reprogramming efficiency according to the concentration of Rex1 were confirmed. It was.
  • Rex1 increased the reprogramming efficiency in a concentration-dependent pattern
  • OSM-iPSCs were added under the condition that Rex1 was added at 5 MOI.
  • Rex1 specific lentiviral shRNAs were prepared using the method of Example 18-2 below.
  • Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 and Rex1 were used to verify the effect by simultaneously introducing various combinations of reprogramming factors and Rex1-shRNA into human fibroblast cells.
  • OSM, OSMK, OSMR, and OSKMR are isoexpressed by retroviruses, ALP-positive colonies were not observed in OSM, and ALP-positive in OSMK or OSMR added with Klf4 or Rex1.
  • pOSM-iPSC is expressed as human embryonic stem cells in the multipotent marker genes at the total and intrinsic levels It was confirmed that the silencing of each transgene introduced through the retrovirus was not completed sufficiently (FIG. 9B).
  • the degree of methylation of the promoter region of Oct4 and Rex1 gene in pOSM-iPSC was confirmed by bisulfite sequencing analysis. As a result, it was confirmed that methylation was maintained in pOSM-iPSC cells as shown in FIG. 9C.
  • TRA-1-60, TRA-1-81) similar to the one not distinguishable (Fig. 10).
  • real-time RT-PCR was performed using the primers of Table 1 to confirm Oct4, Sox2, cMyc, Klf4, and Rex1 mRNA expression.
  • OSMR-iPSC (4F-hiPS) and OSMK-iPSC (3F + R- hiPS) was expressing Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 and Rex1 as human embryonic stem cells at the total and endogenous level, it was confirmed that the silencing of each transgene introduced through the retrovirus is complete (Fig. 11).
  • OSMK-iPSC 4F-hiPS
  • OSMR-iPSC 3F + R-hiPS
  • Genomic DNA was extracted using DNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA), and each PCR amplification reaction was carried out using primers (Table 2) capable of specifically amplifying only 300 ng of genomic DNA and a transgene. It was.
  • OSMK-iPSC and OSMR-iPSC confirmed that exogenous Oct4, Sox2, cMyc and Klf4 and Oct4, Sox2, cMyc and Rex1 genes were integrated in the genome, respectively (FIG. 12).
  • human embryonic stem cell line H9, hES
  • human fibroblast cell line CTL2097, hFF
  • the degree of methylation of the promoter regions of the multipotency markers Oct4 and Rex1 genes of OSMK-iPSC and OSMR-iPSC were confirmed by bisulfite sequencing analysis.
  • OSMK-iPSC and OSMR-iPSC showed a similar pattern to the human embryonic stem cell line (H9), it was confirmed that the mFF of the parental cell is still maintained (Fig. 14) .
  • OSMK-iPSC and OSMR-iPSC possess pluripotent potential which is characteristic of stem cells
  • embryonic bodies were constructed from each established cell line and additionally examined for their differentiation capacity. After the embryos were formed under floating culture conditions, the embryos were attached and cultured for 10 days using a differentiation medium in a gelatin-coated plate, and then immunochemical staining for the expression of markers specifically expressed in the cells differentiated into trioderm. And Real-time RT-PCR method.
  • Tuj1 ectoderm
  • Nestin ectoderm
  • desmin meoderm
  • ⁇ -SMA ⁇ -smooth muscle actin, mesoderm
  • Sox17 endoderm
  • FoxA2 as shown in FIG.
  • OSMR-iPSC induced pluripotent stem cell lines were injected subcutaneously into dorsal flasks of immunodeficiency (SCID) mice in order to confirm the in vivo multipotency of human induced pluripotent stem cell lines prepared by Rex1.
  • SCID immunodeficiency
  • teratoma was formed.
  • Hematoxylin / eosin staining revealed neural rosette (ectoderm), epidermis containing melanocytes (ectoderm), cartilage (mesoderm), and gut-like epithelium (endoderm) in teratoma (Fig. 17). This shows that human induced pluripotent stem cell lines reprogrammed by Rex1 have a multipotent ability to differentiate into trioderm in vitro and in vivo.
  • ReNcell CX Immortalized cells hNP
  • hMS human mesenchymal stem cells
  • Rex1 enhances reprogramming efficiency not only in human fibroblast somatic cells, but also in multipotent stem cells (somatic stem cells) including human neuroprogenitor cells and human mesenchymal stem cells of different strains. It is also possible in other human differentiated cells, such as.
  • multipotency of OR-iPSC (1F + R-hiPS) established from human neural progenitor cells and OSR-iPSC (2F + R-hiPS) established from human mesenchymal stem cells showed ALP activity, Oct4, Nanog, and SSEA4.
  • TRA-1-60 and other multipotent marker expression FIG. 19
  • the promoter region demethylation of Oct4, Nanog, Rex1 genes, etc. were verified.
  • NCCIT human embryonal carcinoma cells which have self-renewal and pluripotency, are multipotent specific markers Oct4, Nanog, Sox2 and Rex1. Is expressed in large quantities. Therefore, in the present invention, NCCIT hEC cells were used to study Rex1 expression inhibition and related mechanisms.
  • the lentiviral-containing medium was recovered, and after replacement with a fresh medium, the lentiviral-containing medium was recovered a second time after 24 hours, and then filtered with a filter of 0.45 mm pore-size, and 20,000. Concentrated at rpm for 90 minutes and stored at -70 °C until use.
  • sustained Rex1 expression suppression cell lines NCCIT cells were infected with lentiviral REX1-targeting shRNA and Non-Target shRNA with polybrene (6 mg / ml) at 3 MOI. Cell lines were selected using a medium containing 1 ⁇ g / ml puromycin.
  • shRNA constructs (shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13) targeting different regions of the Rex1 transcript were used, and each cell line was established by the method of Example 18-2.
  • As a negative control cell lines using non-target control shRNA (shNT) that do not target any gene transcript were also established.
  • Real-time RT-PCR revealed that Rex1 mRNA expression was significantly reduced in shREX1-10, shREX1-11 and shREX1-13 cell lines (p ⁇ 0.01, A in FIG. 21). It was also confirmed that the expression of significantly decreased in shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13 cell lines (p ⁇ 0.01, FIG. 21B).
  • RNA isolated from hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13 cell lines and shNT control cell lines were extracted using RNA Mini Kit (Qiagen), labeled with Cy3, and subjected to the Agilent Human Whole Genome 4X44K according to the manufacturer's instructions Hybridization to microarray (single color based). Hybridization images were scanned using Agilent's DNA microarray scanner and quantified using Feature extraction software (Agilent Technology, Palo Alto, Calif.). All data normalization and selection of fold-change genes were performed using GeneSpringGX 7.3 (Agilent Technology, USA).
  • the mean of the normalization ratios was calculated by dividing the mean value of the normalized signal channel intensity by the mean value of the normalized control channel intensity.
  • GeneSpringGX 7.3 Functional annotation of genes performed according to the Gene OntologyTM Consortium (http://www.geneontology.org/index.shtml) by gene classification can be found in BioCarta (http://www.biocarta.com/), GenMAPP (http: // based on studies conducted by www.genmapp.org/), DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/), and Medline databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) .
  • Rex1 expression inhibitory cell lines showed that the expression levels of the multipotent markers Oct4 and Sox2 were reduced by 1.5 and 4 times, respectively, and the ectoderm markers (NCAM, SOX1) were confirmed. , OTX1), mesoderm markers (IGF2, FOXF1, MSX1), endoderm markers (HGF, AFP, GATA6) was confirmed to increase from 2.4 times to 22.9 times compared to the control (Fig. 22).
  • the microarray-based global gene expression profile was analyzed by the method of Example 18-4. As a result, as in the result of FIG. 22, the expression level of the multipotential markers was decreased and the expression of each trioderm-specific differentiation marker gene was increased even in the heat map analysis of the gene expression by the microarray analysis. (FIG. 23).
  • the expression patterns of genes related to the G2 / M cell cycle, which are located at the highest level among the canonical pathways changed by Rex1 expression inhibition, are also shown in the heatmap analysis of gene expression by microarray analysis as shown in FIG. 25. It was confirmed that the expression differently by suppressing the expression.
  • inhibition of Rex1 expression inhibited the expression of CCNB1 (cyclin B1) and CCNB2 (cyclin B2), which are major regulators of G2 / M migration.
  • YWHAH 14-3-3 eta
  • TOP2B topoisomerase IIbeta
  • PI propidium iodide
  • BrdU bromodeoxyuridine
  • the relationship between S group and DNA synthesis can be determined by analyzing BrdU influx. Therefore, as a flow cytometry method to measure the cell proliferation during the period of DNA synthesis of the S phase, we tried to determine the extent to which the thymidine analog BrdU is inserted into the DNA to be replicated. After 4 hours of incubation of the cultured cells with 10 mM BrdU, the cells were harvested and fixed in 3% formaldehyde diluted at PBS at 4 ° C for 1 hour, followed by centrifugation and the 1% Triton X-100 at room temperature. Treated for a minute.
  • Cells were harvested by centrifugation, washed with PBS, treated with 4N HCl at room temperature for 10 minutes to release DNA double strands, and neutralized with sodium tetraborate. Treated with blocking solution (4% BSA, 0.01% Tween 20 in PBS) at room temperature for 30 minutes, and then reacted with anti-BrdU mouse IgG at 4 ° C for 30 minutes, followed by 30 minutes of Fluorescein (FITC) -conjugated goat anti-mouse IgG. After reacting at 4 ° C, it was analyzed by flow cytometry.
  • blocking solution 4% BSA, 0.01% Tween 20 in PBS
  • FITC Fluorescein
  • Phosphorylation of serine residue 10 of histone H3 was confirmed to distinguish whether it is stopped at G2 or M (mitosis) phase by inhibition of Rex1 expression.
  • Phosphorylation of serine residue 10 (ser10) of histone H3 is an M-specific marker that is phosphorylated during M phase during chromosome condensation (Chromosoma 1997; 106: 348-360.). Immunostaining and western blot were performed using antibodies capable of detecting histone H3 (ser10) phosphorylation.
  • control cells control and shNT cell groups
  • control and shNT cell groups were about 11%, and when treated with nocodazole, which stopped the cells in phase M, about 37% of the cells were identified as histone H3 (ser10) phosphorylation-positive cells.
  • less than 4% of the cells in the Rex1 suppressed cell lines were histone H3 (ser10) phosphorylation-positive cells (Fig. 28A).
  • These results could also be reconfirmed through Western blot results using histone H3 (ser10) phosphorylation-specific antibodies (FIG. 28B). Through these results, it was confirmed that the cells were stopped by G2 phase by suppressing Rex1 expression.
  • Cyclin B the central regulator of G2 to M phase, has two isoforms, cyclin B1 and cyclin B2. Both proteins expressed markedly decreased expression levels in Rex1 suppressor cell lines (hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13). However, no significant differences in expression levels were observed in other G2 / M progression-related proteins CDK1, CDC25C and cyclin A in Rex1 expression inhibiting cell lines (FIG. 29).
  • Rex1 and cyclin B2 expression are induced by Rex1, retroviral vectors encoding Rex1 were transduced into human fibroblast cells. After 5 days of infection, the expression level of Rex1 transcript was confirmed by real-time RT-PCR, and it was confirmed that Rex1 was overexpressed (top of FIG. 30). In addition, it was confirmed by Western blot that the expression of Rex1 protein was also increased 5 days after infection (bottom of FIG. 30).
  • cyclin B1 and cyclin B2 were significantly increased by 2.1 and 1.7 times, respectively, at the mRNA level (p ⁇ 0.01, top 30), and cyclin B1 and cyclin B2 proteins were increased by 2.3 and 2.4 times, respectively. It was confirmed that (p ⁇ 0.01, Figure 30 bottom).
  • Rex1 and other reprogramming factors (Oct4, Sox2, cMyc, Klf4) are expressed in human fibroblasts to determine whether cyclin B1 and cyclin B2 expression is induced more or faster during redifferentiation Reprogramming was performed using various combinations of Oct4, Sox2, cMyc (OSM, 3F), Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 (OSMK, 4F), Oct4, Sox2, cMyc, Rex1 (OSMR, 3F + R), and Oct4, Sox2, cMyc, Klf4, Rex1 ( OSMKR, 4F + R) were transformed with each of the reprogramming factors, and at the 13th and 20th day, total RNA was extracted from each fibroblast cell, and multi-functional markers and cyclin B1 and cyclin B2 were obtained by real-time RT-PCR.

Abstract

본 발명은 리프로그래밍 과정을 통해 체세포 또는 비-배아성 세포로부터 유도만능줄기세포를 제작하기 위한 Rex1 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 리프로그래밍 유도용 조성물, 및 상기 Rex1을 이용하여 유도만능줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＲＥＸ１을 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도 만능줄기세포 제조방법
본 발명은 리프로그래밍 과정을 통해 체세포 또는 비-배아성 세포(non-embryonic cells)로부터 유도만능줄기세포를 제작하기 위한 Rex1 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 리프로그래밍 유도용 조성물, 및 상기 Rex1을 이용하여 유도만능줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
2006년 세계 최초로 일본 교토대 야마나카 교수팀에 의해 다분화능 (Pluripotency)에 핵심적인 역할을 하는 리프로그래밍 유도 전사인자들(Oct4, Sox2, Klf4, cMyc)의 복합적인 과발현을 통해 체세포로부터 유도만능줄기세포를 생산할수 있는 역분화 기술이 개발됨에 따라(Cell, 126: 663-676, 2006), 상기 기술을 바탕으로 세포치료제 및 신약개발을 주도하기 위한 세계 각국의 기술 개발 경쟁이 치열하게 진행되고 있다. 역분화 기술은 환자에게 신체적 손상 및 불편함이 거의 없는 비교적 손쉬운 방법으로 자가-체세포를 확보하고, 이로부터 인간배아줄기세포와 같은 특성의 유도만능줄기세포를 제조하는 것을 가능케 함으로써, 환자-체세포로부터 맞춤형 자가 전분화능 줄기세포주를 확립하는 전략을 획기적으로 진화시켰으며, 인간배아줄기세포 이용 시 야기될 수 있는 생명윤리 논란 및 면역 적합성 문제를 극복할 수 있는 최적의 해법으로 인식되면서 미래 재생의료 기술 개발 분야에 무한한 가능성을 제시하고 있다.
하지만, 역분화 기술의 우수성에도 불구하고, 이를 실질적으로 세포치료제 및 신약 개발 단계에 활용하기 위해서는 암발생 위험, 낮은 역분화 효율, 역분화 과정에 소요되는 긴 시간 프레임 등 현 기술 수준에서는 극복되어야만 할 문제점들이 아직 남아 있는 실정이다. 표준적으로, 레트로바이러스 발현시스템을 이용하여 야마나카 인자 즉, Oct4, Sox2, cMyc 및 Klf4 등의 유전자군을 인간체세포에 과발현하여 유도만능줄기세포를 제작하는 경우가 가장 리프로그래밍 효율이 높다고 인정되고 있으나, 이 경우에도 역분화 유도 효율이 0.01 내지 0.1% 정도로 매우 저조하다. 또한, 현 리프로그래밍 기법에서 리프로그래밍 유도 효율을 높이는데 중요한 영향을 미치는 인자로 알려진 c-Myc과 Klf4는 암 유전자로서의 기능 때문에 이를 이용하여 유도만능줄기세포를 제작하고, 이로부터 파생된 분화 세포를 세포치료제 개발에 이용할 경우 암 형성 가능성을 배제할 수 없다는 안정성 문제가 있다. 따라서, 실용화 단계에서 요구되는 세포의 양과 질을 충족시키기 위해서는 암발생 가능성이 있는 기존 인자의 기능을 대체하고 리프로그래밍 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 새로운 리프로그래밍 인자를 발굴과 이를 역분화 과정에서 실질적으로 활용할 수 있는 후속 기술을 개발하는 것이 필수적으로 요구된다.
한편, Rex1(reduced expression protein 1, ZFP42) 전사인자는 징크핑거 단백질(zinc finger protein) 패밀리의 한 종류로서 다분화능을 가진 생쥐의 F9 배아 암종(embryonal carcinoma: EC) 세포의 분화유도 과정에서 발현이 특이적으로 감소되는 현상이 관찰됨으로써 처음 발견되었다(Mol Cell Biol, 9: 5623-5659, 1989). 그러나, 분화된 세포의 역분화와 Rex1과의 연관성에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명자들은 기존 역분화 기술의 문제점을 해결할 수 있는 새로운 역분화 유도인자 및 이를 이용한 역분화 유도 시스템을 개발하기 위하여 예의노력한 결과,인간 체세포를 유도만능줄기세포로 리프로그래밍하는 과정에서 Rex1 전사인자를 사용한 경우에 리프로그래밍 효율이 효과적으로 증진되고, 리프로그래밍에 소요되는 시간과 요구되는 리프로그래밍 인자의 수를 획기적으로 줄이는 효과가 있음을 검증하였으며, Rex1을 이용하여 생산된 유도만능줄기세포가 인간배아줄기세포와 같은 다분화능 특성을 보존하고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 또한, Rex1에 의한 리프로그래밍 개선 효과가 계통이 다른 소스에서 확보한 다양한 체세포에서 유사하게 나타남을 확인함으로써 Rex1이 계통-특이적인 제한이 없이 다양한 종류의 분화 세포에서 이용될 수 있음을 확인하였다. 추가적으로, 이러한 Rex1 전사인자의 리프로그래밍 개선 효과가 기존 리프로그래밍 기법에서 발생하는 리프로그래밍 저해 현상으로 지적되고 있는 세포 증식 억제 및 세포주기 정지(cell-cycle arrest) 등을 개선함으로써 나타나는 효과임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Rex1 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 분화된 세포를 유도만능줄기세포로 리프로그래밍시키기 위한 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Rex1 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 전달하여 리프로그래밍된 유도만능줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, Rex1을 사용하지 않은 조건에 비해, Rex1을 사용한 경우 분화된 세포로부터 온전하게 리프로그래밍되어 확립된 유도만능줄기세포의 수를 획기적으로 증진시킴과 함께, 리프로그래밍에 소요되는 시간을 단축할 수 있고, 암유전자인 Klf의 사용을 대체하는 등 기존 리프로그래밍 인자의 기능을 대체하거나, 리프로그래밍에 요구되는 인자의 수를 줄인 상태에서 리프로그래밍을 가능케 한다는 점에서 기존 리프로그래밍 기법을 개선하기 위한 목적으로 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명은 계통이 다른 다양한 소스에서 확보된 적은 양의 분화세포로부터 유도만능줄기세포를 제작하는데 효과적으로 작용하는 범용 리프로그래밍 인자로서 Rex1이 사용될 수 있음을 검증함으로써, 기존 인자를 통해 리프로그래밍이 어려웠거나 불가능했던 체세포의 리프로그래밍을 Rex1을 이용하여 개선할 수 있는 이점이 있다. 결론적으로, 본 발명은 범용 리프로그래밍 인자로서 활용될 수 있는 Rex1을 제공함으로써 다양한 환자-체세포로부터 임상적으로 안전한 유도만능줄기세포를 효과적으로 제작할 수 있는 리프로그래밍 기법을 개발하는데 획기적으로 기여한다. 이를 기반으로 파생되는 유도만능줄기세포와 분화세포는 맞춤형 줄기세포 세포치료제 개발 및 신약개발과정에 적용 가능함으로써 연관 산물의 실용화 시기를 앞당기는데 실질적으로 기여할 것이다.
도 1은 줄기세포의 미분화 및 분화 상태를 특징짓는 계통-특이 마커(도 1a 및 b) 및 다분화능 특이 마커(도 1c 및 d)의 발현 양상을 Real-time RT-PCR(도 1a-d)과 면염염색분석(도 1e)을 통해 확인한 결과이다. 본 실험에서 미분화 상태의 줄기세포로는 인간배아줄기세포(hES), 인간유도만능줄기세포(hiPS) 및 인간배아종양세포(hEC)를 테스트하였고, 분화세포로는 인간포피섬유아세포(hFF), 5일 동안의 부유배양을 통해 형성된 배아체(early EB), 28일 동안의 부유배양을 통해 형성된 배아체(late EB), 레티노산에 의해 분화 유도된 hES(RA-hES), hES-신경전구세포(hES-NP), 심근세포(hES-CM), 골세포(hES-OS), 내피세포(hES-EC)를 테스트에 이용하였다. 또한, 불온전하게 리프로그래밍된 hiPS(partial hiPS)의 발현을 비교 분석 하였다.
도 2의 A는 Rex1 유전자 산물의 아가로 젤 전기영동 결과이며, B는 Rex1을 클로닝한 레트로바이러스 발현벡터 pMXs의 지도이다.
도 3은 본 발명에서 사용한 리프로그래밍 기법을 요약 정리하여 도식으로 표현하였으며, 도식 아래쪽 그림은 리프로그래밍 과정에 이용한 체세포(CRL2097), 확립된 hiPS, 및 ALP-양성 염색 hiPS 세포군의 대표 사진이다.
도 4는 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 포함하는 네가지 리프로그래밍 인자와 함께 Rex1인자를 리프로그래밍 과정에 이용하였을 때 나타나는 리프로그래밍 효율 변화를 ALP-양성 염색을 통해 분석한 결과이다. 그래프 상의 값은 평균값±S.E.을 나타낸다. 본 테스트에서 사용된 체세포는 hFF이다. Low; 레트로바이러스 MOI=1, High; 레트로바이러스 MOI=5.
도 5는 생쥐배아섬유아세포 리프로그래밍 과정에서 Rex1 인자의 기여를 확인한 도면이다. 왼쪽 패널은 리프로그래밍 과정을 거친 세포군의 ALP 염색 사진이다. 오른쪽 패널은 ALP-양성 콜로니 수를 표시하였으며, 값은 평균값±S.E.를 나타낸다.
도 6은 인간포피섬유아체세포의 리프로그래밍과정에서의 Rex1 인자의 기여를 기존의 리프로그래밍 인자와 다른 조합으로 섞어 확인함으로써 리프로그래밍에 요구되는 최소 및 최적의 리프로그래밍 인자 조합을 확인한 도면이다. 위쪽 패널은 리프로그래밍 과정을 거친 세포군의 ALP 염색 사진이다. 아래쪽 패널은 ALP-양성 콜로니 수를 그래프로 표시하였으며, 그래프 상의 값은 평균값을 나타낸다.
도 7은 인간포피섬유아체세포의 리프로그래밍 과정에서의 Rex1 인자의 기여를 리프로그래밍 인자 형질전환 양에 연계하여 확인한 도면이다. Rex1 유전자의 감염양(MOI)에 따른 리프로그래밍 효율 변화를 hES-유사 세포 모양 및 ALP-양성 콜로니의 수를 측정하여 그래프로 표시하였다. 그래프 상의 값은 평균값±S.E.를 나타낸다. 도 7c는 인간포피섬유아체세포에 각 표시된 리프로그래밍 인자를 이용하여 리프로그래밍한 후 ALP-양성 콜로니를 확인한 대표적인 염색 사진이다. O; Oct4, S; Sox2, M; cMyc, K; Klf4, R; Rex1을 나타낸다.
도 8은 리프로그래밍 과정에서의 Rex1 인자의 기여를 확인하기 위해 Rex1-특이적 shRNA를 이용하여 Rex1의 발현을 특이적으로 저해하는 조건에서 리프로그래밍을 유도하고 ALP-염색 결과를 분석한 사진 및 그래프이며, 그래프에서 나타난 값은 평균값±S.E.를 나타낸다. *p<0.05.
도 9는 Oct4, Sox2, c-Myc 세가지 리프로그래밍 인자를 이용하여 불온전하게 (partially) 리프로그래밍된 hiPS(pOSM-hiPS)의 특성을 보여준다. 이때, 리프로그레밍에 이용된 체세포는 hFF이다. 도 9a는 pOSM-hiPS의 대표적인 세포 모양, ALP 염색, 다분화능 마커 발현 양상을 면역염색 분석을 통해 보여준다(크기 바=200 μm). 도 9b는 hFFs, H9 hES 및 pOSM-hiPS(piPS)에서의 다분화능 마커 발현 양상을 Real-time RT-PCR 분석한 결과이다. 도 9c는 Oct4 및 Rex1의 프로모터 영역 내의 DNA 메틸화 상태를 pOSM-hiPS에서 분석한 결과이다. 빈 원 및 검정 원은 각각 디메틸화된 CpG 및 메틸화된 CpG를 나타내며, 메틸화된 CpG의 비율을 %로 환산하여 표기하였다.
도 10은 Oct4, Sox2, cMyc 및 Klf4 네가지 리프로그래밍 인자를 이용하여 온전하게 리프로그래밍된 hiPS(OSKM-hiPS)와 Oct4, Sox2, cMyc 및 Rex1을 이용하여 온전하게 리프로그래밍된 hiPS(OSMR-hiPS)의 대표적인 세포 모양과 ALP 양성 염색, 다분화능 마커의 발현을 면역연색법을 통해 분석한 결과이다(크기 바=200 μm). 이때 사용한 체세포는 hFF 이다.
도 11은 OSKM-hiPS와 OSMR-hiPS의 다분화능 마커 발현 양상을 Real-time RT-PCR로 분석한 결과이다. 해당 유전자의 발현 총량(Total), 내인성 유전자 발현양 (Endo) 및 레트로바이러스에 의해 외인성으로 발현되는 유전자의 양(Trans)을 상대적으로 비교 분석하기 위해 제작된 특이적으로 PCR 프라이머를 사용하여 Real-Time RT-PCR을 수행하였다.
도 12는 OSKM-hiPS와 OSMR-hiPS에서 외인성 리프로그래밍 인자의 게놈내 삽입 여부를 RT-PCR을 통해 분석한 결과이다.
도 13은 배양된 OSMR-iPSC의 핵형 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 H9 hES, hFF, OSKM-hiPS(4F-hiPS), OSMR-hiPS(3F+R-hiPS)에서의 Oct4 및 Rex1 전사인자 프로모터 메틸화 패턴을 분석한 결과를 나타낸다. 빈 원 및 검정 원은 각각 디메틸화된 CpG 및 메틸화된 CpG를 나타내며, 메틸화된 CpG의 비율을 %로 환산하여 표기하였다.
도 15는 OSKM-hiPS과 OSMR-hiPS의 시험관내 삼배엽 분화능(외배엽, 내배엽, 중배엽)을 계통-특이 마커 항체를 이용하여 검증한 면역염색 분석 사진이다.
도 16은 OSKM-hiPS과 OSMR-hiPS의 시험관내 삼배엽 분화능을 계통-특이 유전자 마커를 이용하여 검증한 Real-time RT-PCR 분석 결과이다.
도 17은 OSMR-hiPS의 생체내 삼배엽 분화능을 테라토마 형성을 통해 검증한 사진이다.
도 18은 인간신경전구세포(도 18a)와 인간중간엽줄기세포(도 18b)의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 유도에 있어서 Rex1의 기여를 분석한 결과이다. 기존 리프로그래밍 인자(O, S, K, 및/또는 M)와 Rex1 인자의 조합을 통해 유도되는 리프로그래밍 유도 효율 변화를 ALP-양성 염색 분석을 통해 분석하여 그래프로 표시하였다. 그래프 상의 값은 평균값±S.E.를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01.
도 19는 인간신경전구세포에서 Oct4, Rex1 두가지 인자를 통해 확보한 유도만능줄기세포(1F+R-hiPS)와 인간중간엽줄기세포에서 Oct4, Sox2, Rex1 세가지 인자를 통해 확보한 유도만능줄기세포(2F+R-hiPS)에서 배아줄기세포 유사 세포모양, ALP 양성 염색, 다분화능 마커 발현 양상을 검증한 결과이다.
도 20은 인간신경전구세포에서 Oct4, Rex1 두가지 인자를 통해 확보한 유도만능줄기세포(1F+R-hiPS)와 인간중간엽줄기세포에서 Oct4, Sox2, Rex1 세가지 인자를 통해 확보한 유도만능줄기세포(2F+R-hiPS)에서 Oct4, Nanog, Rex1 프로모터 영역의 메틸화 양상을 분석한 도면이다. 빈 원 및 검정 원은 각각 디메틸화된 CpG 및 메틸화된 CpG를 나타내며, 메틸화된 CpG의 비율을 %로 환산하여 표기하였다.
도 21은 NCCIT 인간배아종양세포주에서 Rex1-특이적 shRNA을 이용하여 Rex1 발현이 특이적으로 저해됨을 유전자 수준에서 Real-time RT-PCR(A)을 통해, 단백질 수준에서 웨스턴 블롯(B)을 통해 검증한 결과이다. 웨스턴 블롯에서 확인한 단백질 밴드는 정량적으로 분석하여 그 평균값을 그래프로 표시 하였다. *p<0.05.
도 22는 Rex1의 발현이 저해된 인간배아종양세포주에서 다분화능 마커, 계통-특이적 분화 마커의 발현 양상을 유전자 수준에서 Real-time RT-PCR 분석한 결과이다.
도 23은 Rex1의 발현이 특이적으로 저해된 인간배아종양세포주에서 다분화능 마커 및 계통-특이적 분화 마커의 발현 양상을 microarray 분석을 통해 분석한 결과이다.
도 24는 Microarray 데이타를 "Ingenuity Pathway Analysis 소프트웨어"를 기반으로 재분석한 결과이다. 음성 대조군인 어떠한 유전자의 전사체도 targeting하지 않는 non-target control shRNA(shNT)를 발현시킨 세포주에 비해서 Rex1의 발현이 특이적으로 저해된 세포주(shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서 발현량이 최소 2배 이상 차이 나는 유전자의 Biological function (도 24a) 및 canonical pathway (도 24b)를 분석한 결과이다.
도 25는 Microarray 분석을 통해 확인된 Rex1의 발현이 저해된 인간배아종양세포주에서 특이적으로 나타나는 세포주기 G2/M 진행 관련 유전자군의 발현 변이 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 26은 Rex1의 발현이 저해된 세포주(shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서 세포 성장이 억제됨을 보이는 도면이다(** P< 0.01, *P< 0.05). 세포 성장의 변화는 세포 배양 동안 주기적으로(1, 3, 5일) 세포 수를 측정함으로써 분석하였다(*p<0.05, **p<0.01).
도 27은 Rex1의 발현이 저해된 세포주(shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서 세포주기 분포의 변화를 분석한 도면이다. 위쪽 패널은 세포주기 분포의 분석결과의 대표사진이며, 아래쪽 그래프는 G1, S, 및 G2/M에 분포한 세포군을 %로 환산하여 도시한 그래프이다.
도 28은 Rex1의 발현이 저해된 세포주(shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)가 G2/M 세포주기 중 G2기에 정지되고 있음을 p-histone H3 양성 형광면역염색(A)과 웨스턴 블롯(B)을 통해 확인한 결과이다.
도 29는 Rex1의 발현이 저해된 세포주(shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서 G2/M 진행 관련 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과이다.
도 30은 Rex1유전자 과발현에 의해 cyclin B1과 cyclin B2의 발현이 증진됨을 유전자 및 단백질 수준에서 Real-time RT-PCR(상단)과 웨스턴 블롯(하단)을 통해 각각 확인한 결과이다. 웨스턴 블롯의 단백질 밴드는 정량 분석을 통해 그 값을 그래프로 표시하였다. * P< 0.01.
도 31은 리프로그래밍 과정에서 Rex1인자를 사용한 경우 사용하지 않은 대조군에 비해 cyclin B1 및 cyclin B2 발현이 증진됨을 유전자 수준에서 real-time RT-PCR을 통해 분석한 결과이다. Oct4+Sox2+cMyc =3F, Oct4+ Sox2+ cMyc+ Klf4=4F, Oct4+Sox2+cMyc+Rex1=3F+R, Oct4+Sox2+cMyc+Klf4+ Rex1=4F+R; *** P< 0.01, ** P< 0.05, * P< 0. 1.
하나의 양태로서, 본 발명은 Rex1(reduced expression protein 1) 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 분화된 세포를 유도만능줄기세포로 리프로그래밍하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 용어 "Rex1 단백질"은 생쥐의 F9 배아 암종 세포에서 처음 발견된 전사인자로서, 징크 핑거 단백질 패밀리의 한 종류를 의미하며, ZFP42로도 알려져 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 Rex1은 인간 또는 쥐 등 동물 유래의 모든 Rex1을 포함하며, 바람직하게는 인간 Rex1일 수 있다. 또한, 본 발명의 Rex1 단백질은 이의 야생형의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 변이체도 포함할 수 있다. Rex1 단백질의 변이체란 Rex1의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체로서, 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자"는 Rex1 단백질의 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Rex1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 Rex1 전사인자는 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 유도 효율을 증진시키는 효과를 가지며, 리프로그래밍을 위하여 암 유전자인 Klf4 등 기존의 리프로그래밍 인자를 대체하여 사용할 수 있는 리프로그래밍 유도인자로서, Rex1의 이러한 효과는 본 발명자들에 의해 최초로 발견되었다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자는 발현벡터에 포함된 형태를 가질 수 있다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 Rex1 단백질은 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 이용하여 시험관 내에서 세포주로부터 발현된 형태의 단백질일 수 있으며, 상기 발현벡터는 Baculovirus expression vector, Mammalian expression vector 또는 Bacterial expression vector를 이용할 수 있으며, 상기 세포주는 곤충세포주, 포유동물 세포주 또는 박테리아 세포주를 이용할 수 있으나, 이에 의하여 본 발명에서 이용가능한 발현벡터 및 세포주가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 분화된 세포에 역분화 유도인자를 전달하기 위한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현조절요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제기원을 포함한다. 발현벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스, 센다이 바이러스 (Sendai virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자는 messenger RNA(mRNA)일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "리프로그래밍(Reprogramming)" 또는 "역분화(de-differentiation)"이란 분화능이 없는 세포 또는 일정부분 분화능이 있는 세포 등 서로 다른 양태로 존재하는 분화돤 세포로부터 최종적으로 새로운 유형의 분화잠재력을 갖는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 이러한 세포의 리프로그래밍 기작은 핵 내의 후생유전학(뉴클레오타이드 서열에서의 변화 없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미하는데, 다세포 생물이 분화 및 성장하는 동안, 상이한 세포 및 조직은 상이한 유전자 발현 프로그램을 획득한다. 본 발명에서의 목적에 따라, 상기 '리프로그래밍'이란 0% 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함될 수 있고, 바람직하게는 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포 또는 0% 초과 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 일정부분 분화된 세포를 100% 분화능을 가지는 세포로 복원 또는 전환시키는 것이다.
본 발명에서, 용어 "리프로그래밍 유도인자"란 최종적으로 또는 일정부분 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 유도만능줄기세포로 리프로그래밍되도록 유도하는 물질로서, Rex1 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함한다. 상기 리프로그래밍 유도인자는 분화된 세포의 리프로그래밍를 유도하는 물질이면 제한 없이 포함할 수 있으며, 최종적으로 분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 리프로그래밍 유도인자로서 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질, 또는 이들 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산분자를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 분화된 세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐 및 토끼 등의 다양한 동물로부터 유래한 세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간으로부터 유래한 세포일 수 있으나, 이에 의하여 유도 만능줄기세포로 역분화시킬 수 있는 분화된 세포가 제한되는 것은 아니다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 분화된 세포는 체세포 또는 체세포 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서의 용어, '체세포'란 성체를 구성하는 세포로서 분화능 및 자가생산능이 제한된 세포를 의미한다. 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 체세포는 인간의 피부, 모발, 지방을 구성하는 체세포일 수 있고, 바람직하게는 인간 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 체세포 줄기세포는 혈액줄기세포(Hematopoietic stem cells), 유방성체줄기세포(Mammary stem cells), 장줄기세포(Intestinal stem cells), 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells), 내피줄기세포(Endothelial stem cells), 신경줄기세포(neural stem cells), 후각성체줄기세포(Olfactory adult stem cells), 또는 신경능줄기세포(Neural crest stem cells)일 수 있고, 바람직하게는 신경줄기세포(신경전구세포) 또는 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 용어 "유도만능줄기세포" 또는 "역분화 줄기세포" 란 분화된 세포에 리프로그래밍 기술을 이용하여 배아줄기세포와 유사한 다분화능(pluripotency)을 가진 미분화 상태의 줄기세포를 확립하는 방식으로 만들어진 세포들을 의미한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지고 있는데, 구체적으로는 비슷한 세포모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체내외 에서 다분화능을 가지며, 테라토마를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때 키메라 생쥐를 형성하며, 및/또는 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능한 특성을 가지고 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 분화능이 없는 인간섬유아체세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 유도 과정에서 Rex1의 기여를 확인하기 위하여 Oct4, Sox2, Klf4 및 cMyc 등을 포함하는 기존 리프로그래밍 인자를 과발현시키는 조건에서 추가적으로 Rex1을 함께 과발현시켰고, 지속적으로 세포모양 변이와 ALP-양성 콜로니 분석을 통해 리프로그래밍 유도 효율을 검증하였다. 그 결과 외부에서 첨가하는 Rex1의 농도에 의존적으로 리프로그래밍 효율이 증가함을 ALP-양성 콜로니 수의 증가로 확인할 수 있었다(Rex1 1 MOI에서 4.9배, 5 MOI에서 2.6배 증가). 특히, Rex1과 함께 리프로그래밍을 유도한 경우 5일 정도 일찍 유도만능줄기세포 콜로니가 형성됨을 확인하였다(실시예 11-3 및 도 4 참조).
또한, Rex1의 리프로그래밍인자 대체 가능성을 조사한 결과, 분화능이 없는 인간섬유아체세포에서 Rex1을 사용하는 경우 Klf4를 사용하지 않고도 리프로그래밍 유도 효율이 Klf4를 사용한 경우보다 높음을 확인하였다(실시예 12, 13 및 도 6, 7 참조). 이러한 결과는 Rex1이 리프로그래밍 유도인자인 Klf4를 대체할 수 있을 뿐만 아니라, 리프로그래밍 유도 효율도 Klf4에 비해 현저히 향상함으로써 기존 리프로그래밍 기법을 개선시킬 수 있음을 시사한다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에서는 Rex1이 제한된 분화능을 보유한 신경전구세포(도 18a)와 중간엽줄기세포(도 18b)를 다분화능 상태의 유도만능줄기세포로 효과적으로 리프로그래밍시키는데 기여할 수 있음을 확인하였으며, 특히, Rex1에 의하여 리프로그래밍 효율이 향상되고, 리프로그래밍에 요구되는 시간이 단축됨을 확인하였다(실시예 17 및 도 18 내지 20). 인간신경전구세포의 경우 Oct4 한가지 인자를 이용하여 리프로그래밍이 불가능한 조건에서 Rex1과 함께 두가지 인자를 이용하는 경우 리프로그래밍이 온전하게 효과적으로 7일 정도 빠르게 진행됨을 확인하였다(리프로그래밍 유도 효율 0.039%). 인간 중간엽줄기세포의 경우 Oct4, Sox2, Rex1 세가지 인자를 이용하는 경우 리프로그래밍이 온전하게 효과적으로 10-14일 빠르게 진행됨을 확인하였다(리프로그래밍 유도 효율 0.039%). 이러한 결과는 Rex1을 리프로그래밍 유도인자로 사용하여 체세포뿐만 아니라, 체세포 줄기세포 및 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell) 역시 유도만능줄기세포로 효과적으로 리프로그래밍 시킬 수 있음을 나타낸다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 분화된 세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 제조방법은 (a) Rex1 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 전달하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 (c) 단계 (b)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계의 리프로그래밍 유도인자를 세포에 전달하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자 또는 단백질을 제공하는 방법을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포의 배양액에 투여하는 방법 또는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법을 사용할 수 있으며, 이 때 사용되는 리프로그래밍 유도인자는 해당인자의 유전자를 삽입한 바이러스 벡터로 형질감염시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스, 시험관내 전사 (in vitro transcription)에 의해 생산한 메신저 RNA, 또는 다양한 세포주 내에서 생산된 단백질 등의 형태로 사용할 수 있다.
상기 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(microijection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스바이러스, 센다이 바이러스 등에서 유래한 벡터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터 pMXs를 사용할 수 있다. 또한, 상기 패키징 세포는 사용된 바이러스 벡터에 따라 당업계에 공지된 다양한 세포를 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 GP2-293 패키징 세포를 사용할 수 있다.
상기 리프로그래밍 유도인자 단백질을 제조하기 위해서 단백질을 코딩하는 핵산분자를 시험관 내에서 곤충세포주를 이용한 Baculovirus expression vector, 포유동물세포주를 이용한 Mammalian expression vector 또는 박테리아세포주를 이용한 Bacterial expression vector 시스템 등을 사용할 수 있다.
상기 리프로그래밍 유도인자는 분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 리프로그래밍 유도인자에는 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질, 또는 이들 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산분자가 추가로 포함될 수 있다.
상기 분화된 세포는 상기 리프로그래밍 유도용 조성물에서 설명한 바와 같다.
상기 세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 세포에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　
본 발명의 일실시예에서는, Rex1을 리프로그래밍 유도인자로 이용하여 Oct4, Sox2, cMyc 및 Rex1 유도만능줄기세포주를 제조하고, 줄기세포 특성을 ALP 염색 및 면역 염색으로 분석한 결과, 상기 유도만능줄기세포주는 형태적으로나 다분화능 마커 발현 양상으로는 구별이 되지 않을 만큼 흡사하였다(도 10-11 참조). 상기 유도만능줄기세포에 리프로그래밍을 위해 외부에서 첨가한 Oct4, Sox2, c-Myc, Rex1이 리프로그래밍된 세포 게놈내로 유입되었음을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 또한, 다분화능 마커 유전자의 프로모터 영역의 메틸화를 분석한 결과, 상기 유도만능줄기세포주는 인간배아줄기세포주와 유사한 패턴을 보여주었으며(도 14 참조), 상기 유도만능줄기세포주로부터 유래된 배아체의 분화능력을 조사한 결과, Rex1을 사용하여 확립된 유도만능줄기세포가 생체내외에서 삼배엽으로 분화할 수 있는 잠재력을 보유하고 있고(실시예 16 및 도 15-17 참조), 장시간의 지속된 배양 후에도 정상핵형을 보유하고 있음을 확인하였다(도 13).
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간배아줄기세포 배양
인간배아줄기세포(hESC) H9(NIH Code, WA09; WiCell Research Institute, Madison, WI) 및 유도만능줄기세포(hiPSC)는 γ-선을 조사한 생쥐 배아섬유아세포 위에서 80% DMEM/F12, 20% 넉아웃 혈청대체제(Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% 비필수 아미노산(Invitrogen), 1 mM L-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM β-머캡토 에탄올(Sigma, St. Louis, MO) 및 6 ng/㎖ 염기성 섬유아세포생장인자(Invitrogen)로 이루어진 hESC 배양배지에서 배양하였다. 세포들을 1 ㎎/㎖ 콜라게네이즈 IV(Invitrogen)로 매 5 내지 6일 마다 계대 배양하였다. 인간 신생 포피섬유아세포(Human newborn foreskin fibroblasts; hFF, ATCC, catalog number CRL-2097; American Type Culture Collection, Manassas, VA)는 10% FBS(Invitrogen), 1% 비필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캡토 에탄올을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 인간 신경전구세포(hNPs, ReNcell CX Immortalized cells, Millipore, SCC007)는 FGF-2(20 ng/㎖) 및 EGF(20 ng/㎖)를 첨가한 Complete ReNcell NSC 배지를 이용하여 배양하였다. 생쥐 배아섬유아세포는 10% FBS(Invitrogen), 1% 비필수 아미노산 및 0.1 mM β-머캡토 에탄올을 포함하는 DMEM에서 배양하였다.
실시예 2. RNA 추출, 역전사 및 PCR 분석
RNeasy Mini 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 생성한 세포로부터 전체 RNA를 분리한 후, SuperScript First-strand 합성 시스템 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 역전사하였다. 이후, 반-정량 RT-PCR은 platinum Tag SuperMix 키트(Invitrogen)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 94℃ 3분 후, 94℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초의 25 내지 30 사이클 후 신장을 위하여 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2012000363-appb-T000001
Figure PCTKR2012000363-appb-I000001
Figure PCTKR2012000363-appb-I000002
실시예 3. 미분화 상태의 만능줄기세포(배아줄기세포 및 유도만능줄기세포)에서의 Rex1의 특이적 발현 확인
미분화 인간배아줄기세포, 이로부터 자연분화(spontaneous differentiation)된 배아체(초기배아체, 5일간 분화), 후기배아체(28일간 분화)와 레티노산(RA)을 처리한 인간배아줄기세포 및 인간배아줄기세포로부터 유래 특정 계통으로 분화시킨 세포 등에서 Rex1 mRNA의 발현양상을 확인하였다. 인간배아줄기세포로부터 특정 계통으로 분화된 세포의 특성은 계통-특이적 마커 발현의 증가를 통해 확인하였다(도 1a 및 1b). Rex1과 함께 다양한 다분화능 특이 마커의 발현을 Real-time RT-PCR로 확인한 결과, Rex1이 분화 세포 모두에서 발현이 급격히 줄어들거나, 사라지는 양상을 보였고, 다른 마커에 비해 특히, 초기 분화단계(초기배아체 및 RA-처리 인간배아줄기세포)에서 그 발현이 매우 낮았으며, 부분적으로 리프로그래밍된 인간 유도만능줄기세포에서는 발현이 확인되지 않았다 (도 1d). Rex1 단백질 발현은 면역염색법을 통하여 미분화 및 분화 인간만능줄기세포(hES, hiPS) 그리고 부분적으로 리프로그래밍된 인간유도만능줄기세포(phiPS)에서 확인하였다. 그 결과, Rex1 단백질은 미분화 hES 및 온전하게 리프로그래밍된 미분화 hiPS에서만 독점적으로 발현되고, 불온전하게 리프로그래밍된 세포(phiPS)에서는 발현되지 않음을 확인하였다(도 1e). 이러한 결과를 통하여, Rex1이 인간배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포에서의 초기 분화를 매우 민감하게 감지할 수 있는 매우 엄격하게 작용하는 미분화 특이적인 다분화능 마커임을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 인간 Rex1 유전자 발현 벡터 제작
서열번호 1의 염기서열을 갖는 Rex1 유전자를 확보하기 위해서 인간배아줄기세포의 RNA로부터 만든 cDNA와 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하였으며, PCR 조건은 상기 실시예 2와 같다. PCR을 통하여 933 bp 크기의 Rex1 유전자를 확보한 후(도 2의 A), 이를 TA 클로닝 방법을 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입하고, Rex1 유전자가 삽입된 pCR2.1-TOPO 벡터와 레트로 바이러스 벡터인 pMXs 벡터를 각각 제한효소를 처리하여 절단한 후, 라이게이션하여, 리프로그래밍 유도를 위한 유전자 발현 벡터 pMXs-Rex1을 제조하였다(도 2의 B).
실시예 5. 레트로바이러스 생산 및 hiPSC의 유도
논문, Takahashi, K. et al.(Cell 131, 2007, 861-872)에 개시된 바와 같은 Oct4(POU5F1), Sox2, c-Myc(MYC) 및 KlF4의 인간 cDNA를 포함하는 pMXs 벡터를 Addgene사로부터 구입하였다. Rex1 발현 레트로바이러스 벡터는 상기 실시예 4에서 제작한 것을 사용하였다. 패키지 세포주 GP2-293 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 레트로바이러스 벡터 DNA 및 VSV-G 외피 벡터로 형질전환하였다. 형질전환 24 시간째, 첫 번째 바이러스가 포함된 상등액을 회수한 후 배지를 교환하였고, 24시간 후 두 번째 바이러스가 포함된 상등액을 회수하였다. 상등액을 0.45 μm 공극 사이즈 필터로 멸균한 후, 20,000 rpm에서 90분간 원심분리한 후 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 유도만능줄기세포의 생성을 위하여 인간포피섬유아세포(hFFs)를 비롯한 인간 신경전구세포(hNPs), 생쥐 배아섬유아세포(MEF) 등을 형질도입하기 6시간 전에 젤라틴이 코팅된 6-웰 플레이트에 각 웰당 1 X 105 세포 농도로 접종하였고, polybrene(6 ㎍/㎖) 존재하에 바이러스를 감염시켰다. 형질도입 5일 후, hFFs 세포 또는 hNPCs 세포를 트립신으로 처리하여 회수하고, 젤라틴 코팅 후 MEF를 기저세포(feeder layer)를 부착시켜 놓은 6-웰 플레이트에 각 웰당 5 내지 6 X 104 세포 농도로 재접종하였다. 또한, 기저세포가 없는(feeder-free) 조건에서의 실험을 위하여 마트리겔이 코팅된 6-웰 플레이트에 각 웰당 5 내지 6 X 104 세포 농도로 재접종하였다. 다음날 hFFs 세포 또는 hNPCs 세포의 경우에는 10 ng/㎖ 농도의 bFGF가 첨가된 hESC 배지로 교환하였고, MEF 세포의 경우에는 1000 U/㎖의 백혈병 억제인자(ESGRO; Chemicon, Temecula, CA)가 첨가된 mESC 배지[DMEM; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD; 15% 소태아혈청, 100 μM 비필수 아미노산(Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mM sodium pyruvate(Invitrogen), 100 μM 2-머캡토 에탄올(Invitrogen), 1X antibiotic-antimycotic(Invitrogen) 포함]로 교환하였다. 배지는 이틀에 한 번씩 교환하였다. 형질 도입 20일 후, hESC 형태의 콜로니를 획득하여 MEF를 영양세포로 하는 12-웰 플레이트에 옮긴 후, 상기 실시예 1의 hESC 배양 방법을 이용하여 지속적으로 증식 배양하였다.
실시예 6. 배아체 분화(Embryoid body differentiation)
hESC 분화의 잠재성을 측정하기 위하여 인간 배아체(hEBs)를 비-조직 배양 처리 페트리 디쉬(non-tissue culture treated Petri dishes)를 사용하여 부유액이 있는 hEB 배지(10% 혈청 대체제를 포함하는 DMEM/F12)에서 배양하였다. 부유액에서의 성장 5일 후, 배아체를 젤라틴-코팅 플레이트로 옮겨서 hEB 배지에서 배양하였다. 상기와 같은 조건하에서 플레이트의 바닥에 부착된 세포를 필요에 따라 배지를 교환하면서 추가로 15일 동안 분화되도록 방치하였다.
실시예 7. 면역세포화학적 방법(Immunocytochemistry)
면역염색법을 위하여 세포를 마트리겔로 코팅된 4-웰 Lab-Tek 챔버 슬라이드(Nunc, Naperville, IL)에 접종하고, 개시된 조건 하에서 5일 동안 배양하였다. 세포를 실온(RT)에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드에 고정시킨 후 PBS/0.2% BSA를 사용하여 세척하고, 세포를 15분 동안 PBS/0.2% BSA/0.1% 트리톤 X-100에 투과시킨 뒤, 실온에서 1시간 동안 PBS/0.2% BSA에서 4% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 반응시켰다. 세포를 PBS/0.2% BSA로 희석시킨 각각의 1차 항체를 사용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척한 후, 세포를 1시간 동안 실온에서 PBS/0.2% BSA에 있는 2차 항체(Invitrogen)가 부착된 FITC 또는 Alexa594를 사용하여 반응시켰다. 세포를 10 ㎍/㎖ DAPI를 사용하여 대비 염색시켰다. 챔버 슬라이드는 올림푸스 현미경 또는 Axiovert 200M 현미경(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)으로 분석하였다. 사용한 항체를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2012000363-appb-T000002
실시예 8. 리프로그래밍 전사인자 프로모터 메틸화 분석
인간배아줄기세포와 유전자 이입 레트로바이러스를 이용하여 확립된 유도만능줄기세포의 특성을 검증하기 위하여, 인간배아줄기세포 특이 전사인자인 Oct3/4, Nanog 프로모터 메틸화 상태를 분석하였다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여 인간배아줄기세포 배지에서 6일간 배양한 인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 DNA 추출 키트(Qiagen Genomic DNA purification kit)를 이용하여 추출하였다. Bisulfite 시퀀싱을 3단계로 수행하였다. 1 단계는 아황산수소나트륨(sodium bisulfite)을 이용하여 DNA를 변형시키는 과정이고, 2 단계는 분석하고자 하는 유전자 부위(보통 프로모터 부위)를 PCR로 증폭하는 과정이며, 3 단계는 PCR 산물을 시퀀싱하여 DNA 메틸화 정도를 분석하는 과정이다. 아황산수소나트륨을 이용한 DNA 변형 과정은 상품화된 키트 EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)를 이용하였으며, DNA를 bisulfite로 처리를 할 경우 메틸화되어 있는 시토신은 변하지 않는 반면, 비메틸화되어 있는 시토신은 우라실로 전환된다. 따라서, 시토신과 우라실 염기서열에 특이한 프라이머를 이용하여 각각 PCR로 증폭시킬 경우 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 구분할 수 있게 된다. 사용한 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
Figure PCTKR2012000363-appb-T000003
PCR 반응 혼합액은 bisulfite로 처리한 DNA 1 μg, dNTP 0.25 mM/ℓ, MgCl2 1.5 mM/ℓ, 프라이머 50 pM, 1× PCR 버퍼, Taq 폴리머라제(Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 2.5 유닛으로서, 최종 20 ㎕가 되게 하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 10분 시행 후 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 과정을 40주기 시행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응 생산물을 1.5% 아가로스 젤에서 확인하였으며, 젤 용리 후 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen)에 클로닝 하였다. 메틸화 및 비-메틸화 염기서열은 M13 프라이머쌍을 사용하여 시퀀싱하여 분석하였다.
실시예 9. 핵형분석(Karyotype Analysis)
배양된 인간 역분화 줄기세포를 G-banding 분석법에 의해 확인하였다. 대표 이미지를 ChIPS-Karyo(Chromosome Image Processing System, GenDix)를 사용하여 얻었다.
실시예 10. 유도만능 줄기세포 유도 배양 시스템 확립
야마나카의 역분화 유도 시스템(Cell 126, 2006, 663-676)을 기반으로 리프로그래밍 기법을 구축하였고, 이때 형질전환 효율을 확인하기 위하여 pMXs-EGFP-Rheb-IP 벡터를 사용하였다. FACS 분석방법을 통해 GFP 양성 세포수를 측정함으로써 바이러스의 MOI(multiplicity of infection)값을 계산하여 1 내지 5 MOI의 바이러스 농축액을 체세포에 형질도입하였다. 형질도입 후 다음날 배지를 교환해 주고, 5일째 Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 떼어낸 후, 기저세포에 세포를 뿌려주고 체세포 배지로 세포를 배양한 후, 다음날 인간배아줄기세포 배양액으로 배지를 교환하였고 주기적으로 새로운 배양배지로 교환하면서 지속적으로 배양하였다. 약 2-4주가 지났을 때 인간배아줄기세포 모양을 가진 세포가 생성됨을 확인하였으며, 계대배양을 통하여 안정적으로 유지되는 유도만능줄기세포주를 확립하였다(도 3).
실시예 11. Rex1에 의한 리프로그래밍 유도 효율 증가 확인
11-1. ALP 염색(Alkaline Phosphatase Staining)
ALP 염색은 제조사(Sigma)의 지침에 따라 시판되는 ALP 키트를 사용하여 수행하였다. ALP-양성 세포의 이미지를 HP Scanjet G4010으로 기록하였다. 또한, 올림푸스 현미경(IX51, Olympus, Japan)으로 명시야상(bight field images)을 얻었다.
11-2. 리프로그래밍 효율 시험(Reprogramming efficiency test)
인간유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 유도 효율을 측정하기 위하여 리프로그래밍 배양 이후 MEF feeder 또는 마트리겔이 코팅된 6-웰 플레이트에서 생성되는 인간배아줄기세포와 유사한 모양으로 형성된 콜로니의 수를 측정하고, 처음 접종한 세포수로 나누어 주었다. 또한, 다분화능 마커인 ALP로 염색된 콜로니의 수를 측정하여 처음 접종한 세포수로 나누어 줌으로써 리프로그래밍 유도 효율을 계산하였다. 이때, 각 실험은 세 번 실시하였다.
11-3. Rex1에 의한 리프로그래밍 유도 효율 확인 결과
Rex1에 의해 매개되는 인간섬유아체세포의 리프로그래밍 효율의 변화를 확인하기 위하여, Oct4, Sox2, Klf4 및 cMyc 유전자 발현 레트로바이러스 벡터 첨가를 표준으로 하고 Rex1을 첨가함에 따른 리프로그래밍 유도 효율 변이를 관찰하였다. 결과로, Rex1 1 MOI를 사용했을 때는 4.9 배, 5 MOI를 사용했을 때는 2.6 배 리프로그래밍 유도 효율이 증가함을 ALP-양성 콜로니 수의 증가로 확인할 수 있었다(도 4). 이러한 Rex1에 의해 매개되는 리프로그래밍 유도는 Rex1의 농도에 의존적으로 효율이 증가함을 확인하였다. 또한, hFF에서 Rex1을 첨가한 경우에 5일 정도 일찍 유도만능줄기세포 콜로니가 형성됨을 확인할 수 있었다.
야마나카의 역분화 유도 시스템은 Fbx15βgeo/βgeo 배아로부터 얻은 생쥐 배아 섬유아세포(MEFs)를 사용하여 24개 후보 유전자를 스크리닝하여 그 중에서 역분화 유도에 반드시 필요한 역분화 유도인자 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 선별하였다(Cell 126, 2006, 663-676). 그러나, 이후 선별과정에서 Rex1이 리프로그래밍 인자군에서 제외된 바 있다. 본 발명자들은 MEFs 세포에서 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 서로 다른 조합으로 첨가한 후 Rex1의 첨가에 의한 리프로그래밍 변이를 관찰하였으나, 첨가에 따른 특이한 변이, 특히, 리프로그래밍 증진 효과를 관찰할 수 없었다(도 5). 이러한 결과를 통하여 인간과 생쥐의 리프로그래밍 유도 기작이 다름을 예상할 수 있으며, 이러한 결과는 초기 발생과정과 줄기세포의 다분화능 조절에 있어 Rex1이 인간과 생쥐시스템에서 다르게 기능할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 12. Rex1의 Klf4 리프로그래밍 유도인자 대체 효과 확인
Rex1이 기존의 리프로그래밍 유도인자를 대체하거나, 줄일 수 있는지 확인하였다. 비록 MEF 세포에서 orphan nuclear receptor Nr5a2가 Oct4를 대체할 수 있다는 보고가 있었지만 인간세포에서는 그 예가 없었고, 일반적으로 Oct4는 리프로그래밍 유도에 있어 대체할 수 없는 필수 인자로 알려져 있다(Cell Stem Cell. 2010 Feb 5;6(2):167-74). 리프로그래밍 유도 효율은 상기 실시예 11-1 및 11-2의 방법과 동일하게 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, Oct4, Sox2 및 cMyc만을 사용한 경우에도 적은 수의 ALP-양성 콜로니를 확인할 수 있었으나, 이로부터 온전하게 리프로그래밍된 유도만능줄기세포주를 확립할 수는 없었고, 이들 콜로니는 부분적으로 리프로그램된 역분화 세포주(pOSM-iPSC)임을 확인할 수 있었다. 그러나, 여기에 Klf4 또는 Rex1을 첨가했을 때 온전하게 리프로그램(fully reprogrammed)된 유도만능줄기세포주(OSMK-iPSCs, OSMR-iPSCs)가 제작됨을 확인하였고, OSMK-iPSCs와 OSMR-iPSCs을 ALP-양성 콜로니 수로 비교한 결과, Rex1을 사용하면 Klf4를 사용한 경우보다 효율이 높고 보다 적은 양의 c-Myc을 사용하는 조건에서 리프로그래밍이 성공적으로 진행될 수 있음을 확인하였다(도 6). 또한, 인간섬유아체세포의 리프로그래밍 유도시 Rex1이 Klf4를 온전하게, c-Myc을 부분적으로 대체할 수 있었으나, Oct4와 Sox2를 대체할 수 없음을 확인하였다. 이러한 결과는 인간섬유아체세포에서의 역분화 유도 최소인자는 Oct4, Sox2, cMyc, Klf4, 또는 Oct4, Sox2, cMyc, Rex1임을 나타낸다(도 6 및 도 7).
실시예 13. 리프로그래밍 유도인자 Rex1의 농도-의존적 리프로그래밍 유도 효과
Rex1이 리프로그래밍 유도인자로 기능을 가지고 있음을 확인함에 따라 Rex1에 의해 나타나는 리프로그래밍 증진 효과가 이소발현(ectopic expression)량에 따라 증가하는지 조사하였다. 이를 위하여 High MOI(5 MOI) 및 Low MOI(1-0.5 MOI)로 각각 Oct4, Sox2 및 c-Myc 유전자를 포함하는 바이러스로 세포를 감염시킨 후 여기에서 Rex1의 농도에 따른 리프로그래밍 효율 변화를 확인하였다. 그 결과, Low MOI(1 MOI)로 Oct4, Sox2 및 cMyc 유전자를 포함하는 바이러스에 감염시킨 경우 Rex1은 농도 의존적 패턴으로 리프로그래밍 효율을 증가시켰고, Rex1을 5 MOI로 첨가한 조건에서는 OSM-iPSCs에 비해 약 19배 이상, OSMK-iPSCs에 비해 약 4.8배 이상 증가시켰음을 확인할 수 있었다(도 7). 특히, 이러한 효과를 더욱 정량적으로 확인하기 위해 다양한 농도의 리프로그래밍 유도인자와 Rex1을 첨가하여 실험하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, Oct4, Sox2, cMyc 및 Rex1 모두의 농도가 높아질수록 리프로그래밍 효율이 증가하는 패턴을 보여주지만, Oct4, Sox2 및 cMyc의 비율이 3:1:1이고, Rex1을 5 MOI로 첨가한 경우에 가장 효과적으로 상조적인 리프로그래밍 효과(synergistic reprogramming effect)를 보임을 확인할 수 있었다. 또한, 동일한 MOI를 사용한 OSMR-iPSCs와 OSMK-iPSCs를 비교한 결과, OSMK-iPSCs에 비해 OSMR-iPSCs의 경우에 각 리프로그래밍 유도인자가 1 MOI 일 때 1.6배, 5 MOI 일 때 1.8배로 ALP-양성 콜로니의 수가 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Rex1이 Klf4의 대체 효과를 가질 뿐만 아니라, 리프로그래밍 효율 측면에서도 보다 우수함을 시사한다.
실시예 14. Rex1-특이적 shRNA을 이용한 리프로그래밍 유도 효율 감소 확인
렌티바이러스에 의한 short hairpin RNA(shRNA) 전달 시스템을 이용하여, Rex1의 발현을 특이적으로 저해함으로써 Rex1에 의한 리프로그래밍 유도 효과를 재확인하였다. Rex1 특이적인 렌티바이러스 shRNA는 하기 실시예 18-2의 방법을 이용하여 제조하였다. Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 및 Rex1을 이용하여 다양한 조합의 리프로그래밍 인자와 Rex1-shRNA를 인간 섬유아체세포에 동시에 도입시킴으로써 그 효과를 검증하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 OSM, OSMK, OSMR, OSKMR을 레트로바이러스에 의해 이소발현시키면 OSM에서는 ALP-양성 콜로니가 관찰되지 않으며, 여기에 Klf4 또는 Rex1을 첨가한 OSMK 또는 OSMR에서는 ALP-양성 콜로니가 관찰되었고, OSKMR에서는 ALP-양성 콜로니의 수가 증가하였음을 확인할 수 있었다. 그러나, ALP-양성 콜로니가 관찰되는 경우에도 Rex1-shRNA를 동시에 첨가하여 리프로그래밍을 유도한 경우에는 음성대조군인 non-target shRNA(shNT)를 사용한 그룹에 비해 ALP-양성 콜로니의 수가 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다(p<0.01, 도 8). 이러한 결과는 Rex1의 내재적 발현 및/또는 이소발현을 억제하면 리프로그래밍 유도 효율이 감소됨을 시사하는 것이다.
실시예 15. 부분적으로 리프로그래밍(부분적 역분화)된 인간 유도만능 줄기세포 특성 분석
Rex1 또는 Klf4가 없는 상태에서 Oct4, Sox2, cMyc에 의해 불온전하게 제작된 유도만능줄기세포주(pOSM-iPSC)의 특성을 분석하였다. pOSM-iPSC를 ALP 염색 및 면역염색으로 분석한 결과, Oct4 및 Nanog 등을 포함하는 다분화능 특이 마커가 부분적으로 적은 양 확인되거나, 발현이 확인되지 않았다(도 9a). 또한, 상기 실시예 2의 방법에 따라 표 1의 프라이머를 사용한 Real-time RT-PCR을 통해 mRNA 발현을 확인한 결과, pOSM-iPSC은 다분화능 마커 유전자들이 전체 및 내재적 수준에서 인간배아줄기세포만큼 발현하지 않았으며, 레트로바이러스를 통해 도입된 각 전이유전자(transgene)의 silencing이 충분이 완료되지 않음을 확인할 수 있었다(도 9b). 상기 실시예 8의 방법에 따라, pOSM-iPSC에서Oct4와 Rex1 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 정도를 bisulfite 시퀀싱 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, 도 9c에 나타난 바와 같이 pOSM-iPSC 세포에서 메틸화가 유지되고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는, Rex1 또는 Klf4가 없이 리프로그래밍된 pOSM-iPSC 세포주는 완전히 리프로그래밍되어 인간배아줄기세포의 특성을 획득한 것이 아니라, 부분적으로 리프로그래밍(부분적 역분화) 되었음을 나타낸다.
실시예 16. Rex1에 의해 확립된 유도만능줄기세포의 특성 분석
16-1. 인간배아줄기세포 마커 발현 확인
Oct4, Sox2, cMyc 및 Klf4에 의해 확립된 유도만능 줄기세포주(OSMK-iPSC; 4F-hiPS)와 Oct4, Sox2, cMyc 및 Rex1에 의해 확립된 유도만능 줄기세포주(OSMR-iPSC; 3F+R-hiPS)의 다분화능 특성을 ALP 염색 및 면역염색으로 분석하였다. 각각 독립적으로 확립된 두 개의 세포주를 확인하였다. 그 결과, OSMK-iPSC(4F-hiPS)과 OSMR-iPSC(3F+R-hiPS)은 형태적으로나 인간배아줄기세포 마커의 염색(ALP) 및 면역염색(OCT4, NANOG, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81)으로는 구별이 되지 않을 만큼 흡사하였다(도 10). 또한, 표 1의 프라이머를 이용하여 Real-time RT-PCR을 수행함으로써 Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 및 Rex1 mRNA 발현을 확인한 결과, OSMR-iPSC(4F-hiPS)와 OSMK-iPSC(3F+R-hiPS)는 Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 및 Rex1을 total 및 endogenous level에서 인간배아줄기세포만큼 발현하고 있었으며, 레트로바이러스를 통해 도입된 각 전이유전자의 silencing이 충분이 완료되었음을 확인하였다(도 11).
16-2 Rex1에 의해 확립된 유도만능줄기세포에서 외부 유입 리프로그래밍 인자의 genomic integration 확인
OSMK-iPSC(4F-hiPS)와 OSMR-iPSC(3F+R-hiPS)에서 외부유입 유전자(transgene)의 genomic integration을 각각 두 개의 세포주에서 확인하였다. 게놈 DNA를 DNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 추출하였고, 각 300 ng의 게놈 DNA와 전이유전자만을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머(표 2)를 이용하여 각각의 PCR 증폭반응을 수행하였다. 그 결과, OSMK-iPSC와 OSMR-iPSC는 각각 외인성 Oct4, Sox2, cMyc 및 Klf4와, Oct4, Sox2, cMyc 및 Rex1 유전자가 게놈내에 integration 되어 있음을 확인하였다(도 12). 이때, 인간배아줄기세포주(H9, hES)와 인간 섬유아체세포주(CRL2097, hFF)를 대조군으로 사용하였다.
16-3 Rex1에 의해 확립된 유도만능줄기세포의 정상 핵형 확인
OSMR-iPSC세포주의 핵형 분석을 상기 실시예 9의 방법으로 실시한 결과, 15계대 동안 배양한 OSMR-iPSC 세포주는 정상 핵형을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 13).
16-4. Rex1에 의해 확립된 유도만능 역분화 줄기세포의 메틸화 양상 분석
상기 실시예 8의 방법에 따라, OSMK-iPSC와 OSMR-iPSC의 다분화능 마커 Oct4및 Rex1 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 정도를 bisulfite 시퀀싱 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, OSMK-iPSC와 OSMR-iPSC 는 인간배아줄기세포주(H9)와 유사한 패턴을 보여주었으나, 모세포인 hFFs는 여전히 메틸화가 유지되고 있음을 확인하였다(도 14).
16-5. Rex1에 의해 확립된 유도만능줄기세포의 전분화능 확인
OSMK-iPSC와 OSMR-iPSC가 줄기세포의 특성인 다분화능 잠재력을 보유하고 있는지 확인하기 위하여, 각 확립된 세포주로부터 배아체를 제작하고 이를 이용하여 추가적으로 분화능력을 조사하였다. 배아체를 부유배양 조건에서 형성한 후, 젤라틴-코팅된 플레이트에서 분화배지를 이용하여 10일간 배아체를 부착 배양한 후, 삼배엽으로 분화된 세포에서 특이적으로 발현되는 마커 발현을 면역화학염색 및 Real-time RT-PCR 방법으로 확인하였다. 그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 면역세포화학 염색법을 통해 Tuj1(외배엽), Nestin(외배엽), desmin(중배엽), α-SMA(α-smooth muscle actin, 중배엽), Sox17(내배엽) 및 FoxA2(내배엽)에 양성인 세포가 확인됨을 검증하였다(도 15). 또한, OSMK-iPSC(4F-hiPS)와 OSMR-iPSC(3F+R-hiPS)로부터 형성된 배아체를 추가적으로 분화시킨 분화세포(각각 두 개의 세포주를 사용)를 사용하여, 표 1의 프라이머를 사용한 Real-time RT-PCR을 통해 각 삼배엽 특이적 발현양상을 분석하였다. 그 결과, 외배엽(NCAM, SOX1, TUBB3, OTX1), 중배엽(MSX1, COL1A1, FOXF1, HAND1) 및 내배엽(AMYLASE, GATA6, SOX17, HGF) 특이적 유전자가 모두 발현되고 있음을 확인하였다(도 16). 이러한 결과는 Rex1에 의해 제작된 인간유도만능줄기세포주가 삼배엽으로 분화할 수 있는 다분화능 잠재력을 보유하고 있음을 나타낸다. 결과적으로, 상기 결과는 Rex1이 분화능이 없는 분화된 체세포를 삼배엽으로 분화될 수 있는 분화능을 갖는 유도만능줄기세포로 리프로그래밍 시키는데 과정에서 기능적으로 우수하게 작용하고 있음을 시사하고 있다.
또한, Rex1에 의해 제작된 인간유도만능줄기세포주의 생체내에서의 다분화능을 확인하기 위하여, OSMR-iPSC 유도만능줄기세포주를 면역결핍 (SCID) 생쥐의 dorsal flask에 피하 주사하였다. 약 12주 후에 테라토마가 형성됨을 확인할 수 있었으며, Hematoxylin/eosin 염색을 통해 테라토마 내의 neural rosette(외배엽), epidermis containing melanocytes(외배엽), cartilage(중배엽) 및 gut-like epithelium(내배엽)을 관찰하였다(도 17). 이는 Rex1에 의하여 리프로그래밍된 인간 유도만능 줄기세포주가 생체내외에서 삼배엽으로 분화할 수 있는 다분화능을 가짐을 보여준다.
실시예 17. 계통이 서로 다른 소스에서 확보한 다양한 분화 세포에서 Rex1에 의한 리프로그래밍 유도 증진 효과 확인
Rex1에 의한 리프로그래밍 효율의 개선 효과가 계통이 다른 인간 분화 세포주에서도 가능한지 확인하였다. 이를 위하여 인간신경전구세포(ReNcell CX Immortalized cells; hNP)와 인간중간엽줄기세포(hMS)를 이용하였다. 인간 신경전구세포는 이미 발표된 연구 결과와 마찬가지로 Oct4만으로 역분화가 가능하였으나, 그 효율은 기저세포가 없는 조건에서 0.011%로 매우 낮았다(Nature 461, 649-643, 2009). 그러나, 본 발명에서 Rex1을 첨가한 경우에는 ALP-양성 콜로니의 수가 기저세포가 없는 조건에서 약 2.4배 증가함을 확인하였다. 또한, Oct4에 Klf를 첨가한 경우(OK), Oct4, Klf4에 cMyc 또는 Sox2를 첨가한 경우(OKM 또는 OKS)에도 Rex1을 첨가하면 ALP-양성 콜로니의 수가 유의성 있게 증가함을 확인할 수 있었다(* p<0.05, ** p<0.01, 도 18a). 마찬가지로, 인간중간엽줄기세포는 Oct4 및 Sox2에 Rex1을 첨가하면 ALP-양성 콜로니의 수가 유의성 있게 증가하였다(** p<0.01). 또한, Oct4, Sox2에 cMyc을 첨가한 경우(OSM), 또는 Oct4, Sox2에 Klf4를 첨가한 경우(OSK)에도 Rex1을 첨가하면 ALP-양성 콜로니의 수가 유의성 있게 증가함을 확인할 수 있었다(* p<0.05, ** p<0.01, 도 18b). 이러한 결과는 Rex1에 의한 리프로그래밍 효율의 증진 효과가 인간섬유아 체세포에서 뿐만 아니라, 계통이 다른 인간 신경전구세포 및 인간 중간엽줄기세포를 포함하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cell, somatic stem cell)등의 다른 인간 분화 세포에서도 가능함을 나타낸다. 또한, 인간신경전구세포로부터 확립한 OR-iPSC(1F+R-hiPS)와 인간 중간엽줄기세포로부터 확립한 OSR-iPSC(2F+R-hiPS)의 다분화능은 ALP 활성, Oct4, Nanog, SSEA4, TRA-1-60 등의 다분화능 마커 발현(도 19) 및 Oct4, Nanog, Rex1 유전자의 프로모터 영역 탈메틸화 등(도 20)을 확인함으로써 검증하였다.
실시예 18. Rex1 특이적인 발현 억제를 통해 나타나는 세포 성장 및 세포 주기 변화 확인
18-1. Rex1-특이적 shRNA에 의한 Rex1 발현 저해 확인
다분화능 유지 및 획득 과정에 연관된 Rex1의 분자적 조절 기작을 이해하기 위해 렌티바이러스에 의한 shRNA 전달 시스템을 이용하여, 다분화능 세포에서Rex1의 발현을 특이적으로 저해한 후 Rex1의 기능을 확인 하였다. 인간배아줄기세포와 마찬가지로 자가 재생산(self-renewal) 및 다분화능(pluripotency)을 가지고 있는 NCCIT 인간배아종양세포(human embryonal carcinoma cell, hEC cell)주는 다분화능 특이적 마커인 Oct4, Nanog, Sox2 및 Rex1을 다량 발현하고 있다. 따라서 본 발명에서는 Rex1 발현 저해 및 연관된 기작 탐색 연구에 NCCIT hEC세포를 이용 하였다.
18-2. Lentiviral Rex1-특이적 shRNA 제조 및 이를 이용한 Rex1 발현 저해 세포주 확립
293FT 세포주에 리포펙타민 2000을 이용하여 인간 Rex1을 타겟하는 shRNA 염기서열을 가진 벡터[TRCN0000107810 (for clone shREX1 #10), TRCN0000107811 (for clone shREX1 #11) 및 TRCN0000107813 (for clone shREX1 #13), Sigma] 및 음성 대조군으로 어떠한 유전자의 전사체도 타겟하지 않는 non-target control shRNA 염기서열을 가진 벡터(shNT, SHC002, Sigma)를 각각 형질전환 하였으며, 이때 Mission lentiviral packaging mix (sigma)를 이용하여 각 shRNA의 렌티바이러스를 만들었다. 형질전환 24시간 후에 렌티바이러스를 포함하는 배지를 회수하였고, 새로운 배지로 교체한 후 다시 24시간 후에 두 번째로 렌티바이러스를 포함하는 배지를 회수한 후 0.45 mm pore-size의 필터로 필터링하고, 20,000rpm에서 90분간 농축한 후 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다. 지속적인 Rex1 발현 억제 세포주를 확립하기 위해, NCCIT 세포에 lentiviral REX1-targeting shRNA와 Non-Target shRNA를 3 MOI로 polybrene (6 mg/ml)과 함께 감염시켰다. 세포주는 1 μg/ml 퓨로마이신이 들어있는 배지를 이용하여 선별하였다.
18-3. Rex1-특이적 shRNA에 의한 Rex1 발현 억제 확인
Rex1 전사체의 서로 다른 영역을 타겟팅하는 세 개의 shRNA 구조체(shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)를 사용하였으며, 실시예 18-2의 방법으로 각 세포주를 확립하였다. 음성 대조군으로 어떠한 유전자의 전사체도 타겟팅하지 않는 non-target control shRNA (shNT)를 이용한 세포주도 확립하였다. Real-time RT-PCR을 통해 Rex1 mRNA의 발현이 shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13 세포주에서 유의성 있게 감소하였음을 확인하였으며(p<0.01, 도 21의 A), 웨스턴 블롯을 통해서 Rex1 단백질의 발현이 shREX1-10, shREX1-11, shREX1-13 세포주에서 유의성 있게 감소하였음 역시 동시에 확인하였다(p<0.01, 도 21의 B).
18-4. Rex1 발현 억제-세포주의 마이크로어레이 분석
hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13 세포주 및 shNT 대조군 세포주에서 분리한 전체 RNA를 RNA Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였고, Cy3를 표지하였으며, 제조사의 지시에 따라 에질런트 인간 전체 게놈 4X44K 마이크로어레이(단일 색깔 기반)에 혼성화하였다. 혼성화 이미지를 에질런트사의 DNA 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 스캔하였고, Feature 추출 소프트웨어를 사용하여 정량하였다 (Agilent Technology, Palo Alto, CA). 모든 데이터 표준화 및 배수-변화 유전자의 선별은 GeneSpringGX 7.3을 사용하여 수행하였다(Agilent Technology, USA). 표준화 비율의 평균을 표준화된 신호 채널 강도의 평균값을 표준화된 대조군 채널 강도의 평균값으로 나눠서 계산하였다. GeneSpringGX 7.3. 유전자 분류에 의한 Gene OntologyTM Consortium(http://www.geneontology.org/index.shtml)에 따라 수행된 유전자의 기능적 주석은 BioCarta(http://www.biocarta.com/), GenMAPP (http://www.genmapp.org/), DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/) 및 Medline databases(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의해 수행된 연구에 기반하였다.
18-5. Rex1 발현 억제에 의한 세포 분화 확인
Real-time RT-PCR 결과, Rex1 발현 억제 세포주들은 다분화능 마커인 Oct4 및 Sox2의 발현량이 평균 1.5배, 4배 각각 감소하였고, 각 삼배엽 마커의 발현량을 확인한 결과, 외배엽 마커(NCAM, SOX1, OTX1), 중배엽 마커(IGF2, FOXF1, MSX1), 내배엽 마커(HGF, AFP, GATA6)가 대조군에 비해 2.4배에서 22.9배까지 증가하였음을 확인하였다(도 22). 이러한 Rex1 발현 억제 세포주들을 이용하여, 실시예 18-4의 방법으로 마이크로어레이-기반 global gene expression profile을 분석하였다. 그 결과, 도 22의 결과와 마찬가지로, 마이크로어레이 분석에 의한 유전자 발현의 히트맵(heat map) 분석 결과에서도 다분화능 마커의 발현량은 감소하였고, 각 삼배엽-특이적인 분화 마커 유전자의 발현은 증가하였다(도 23).
18-6. Rex1 발현 억제에 의한 세포 주기 관련 유전자의 발현 변화 확인
Rex1 발현 억제 세포주(hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서, 다르게 발현하는 유전자의 기능적 분류는 "Ingenuity Pathway Analysis 소프트웨어"를 기반으로 분석하였으며, biological functional category 측면에서는 cellular assembly and organization, cell morphology, cellular growth and proliferation, cellular development 및 cellular function and maintenance와 관련된 유전자가 유의성 있게 변화하였으며(도 24a), canonical pathways 측면에서는 세포주기, 특히 G2/M DNA damage checkpoint regulation이 가장 유의성 있게 변화하였다(도 24b). 특히, Rex1 발현 억제에 의해 변화하는 canonical pathways 중에서도 가장 상위에 위치하는 G2/M 세포주기와 관련된 유전자의 발현양상은, 도 25에서 보는 바와 같이 마이크로어레이 분석에 의한 유전자 발현의 히트맵 분석 결과에서도 Rex1 발현 억제에 의해 다르게 발현됨을 확인 할 수 있었다. 특히, Rex1 발현 억제에 의해 G2/M 이행의 주요한 조절자인 CCNB1(cyclin B1)과 CCNB2(cyclin B2)의 발현이 억제되었다. 그 외의 G2/M 이행의 양성 조절자인 YWHAH(14-3-3 eta), BTRC(beta-transducinrepeatcontaining), TOP2B (topoisomeraseIIbeta)의 발현이 억제됨을 확인하였고, 이와는 반대로 과발현되면 MDM2에 의한 p53 분해를 저해함으로써 세포주기를 지연시키는 MDM4 및 과발현되면 세포주기 정지를 이끄는 PCAF가 Rex1 발현 억제에 의해 발현량이 증가함을 확인하였다(도 25). 이러한 모든 결과는 Rex1 발현 억제에 의해 세포주기가 저해될 수 있음을 시사한다.
18-7. Rex1 발현 억제에 의한 세포 성장 저해 확인
Rex1 발현 억제에 의한 세포 성장 변화를 확인하기 위해서, 동일한 수의 세포(50,000개/12웰)를 분주한 후, 각 1, 3, 5일 후에 세포수를 트리판블루 용액을 이용하여 측정하였다. 그 결과, Rex1 발현 억제 세포주(hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서, 세포 성장이 유의성 있게 감소하였음을 확인하였다(** P< 0.01, *P< 0.05) (도 26).
18-8. Rex1 발현 억제에 의한 세포주기 분포 변화 확인
세포주기 분포의 분석은 propidium iodide(PI)과 핵산 동종체인 bromodeoxyuridine(BrdU)에 대한 단클론 항체를 이용하여 각각 분석 하였다. 먼저 PI를 이용한 DNA양 측정은 1×105 cell/mL로 세포를 부유 시킨 후 PBS(1200 rpm, 5분)로 세척한 다음 70% 알코올 1 mL에 4℃에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 다음날 PBS 3 mL을 더넣고 원심분리한 후 PI(400 mg/mL) 50 μL, RNase A(1 mg/mL) 50 μL, Triton X-100(10%) 1 μL를 넣은 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 염색된 시료는 유세포 분석기로 DNA의 양을 측정하였다. S기의 대표적인 대사과정은 DNA 합성이므로 BrdU 유입 분석을 통해 S기와 DNA 합성의 관계를 알아볼 수 있다. 이에 따라 S기의 DNA 합성 기간 동안의 세포 증식을 측정하기 위한 유세포 분석 방법으로, thymidine 유사체인 BrdU가 복제되는 DNA에 끼어 들어가는 정도를 알아보고자 하였다. 배양된 세포를 10 mM BrdU로 4시간 동안 처리 후, 세포를 수확하여 PBS에 희석된 3% 포름알데히드로 4°C에서 1시간 고정시킨 뒤, 원심분리하고 1% Triton X-100를 실온에서 5분간 처리하였다. 다시 세포를 원심분리하여 수확한 뒤 PBS로 씻어주고, 4N HCl을 10분간 실온에서 처리하여 DNA 이중가닥을 풀어준 뒤 Sodium tetraborate로 중화하였다. 실온에서 30분간 블록킹 용액(4% BSA, 0.01% Tween 20 in PBS)을 처리한 뒤 anti-BrdU mouse IgG를 30분간 4℃에서 반응시킨 다음 Fluorescein(FITC)-conjugated goat anti-mouse IgG를 30분간 4℃에서 반응시킨 후 유세포 분석기로 분석하였다. PI와 BrdU를 사용하여 유세포 분석기를 이용하여 세포주기 분포를 분석한 결과, 도 27에 나타난 바와 같이 Rex1 발현 억제 세포주(hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서는 G1기는 감소하고, G2/M기는 유의성 있게 증가하였고, S기는 다소 감소하였다(P<0.01, 도 27).
18-9. Rex1 발현 억제에 의한 G2기 정지 확인
Rex1 발현 억제에 의해 G2기에 정지되는지 혹은 M(mitosis)기에 정지되는지 구별하기 위해, 히스톤 H3의 세린 10번 잔기의 인산화를 확인하였다. 히스톤 H3의 세린 10번 잔기(ser10)의 인산화는 염색체 응축(chromosome condensation)이 일어나는 M기 동안 인산화되는 M기 특이적 마커이다(Chromosoma 1997; 106:348-360.). 히스톤 H3(ser10) 인산화를 검출할 수 있는 항체를 이용하여, 면역염색법과 웨스턴 블롯을 수행하였다. 면역염색 결과, 대조군 세포(control 및 shNT 세포군)는 약 11%, M기에서 세포를 정지시키는 nocodazole을 처리한 경우에는 약 37%의 세포가 히스톤 H3(ser10) 인산화-양성 세포로 확인되었다. 반면에 Rex1의 발현이 억제된 세포주(hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서는 4% 미만의 세포만이 히스톤 H3(ser10) 인산화-양성 세포였다(도 28의 A). 이러한 결과는 히스톤 H3(ser10) 인산화-특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯 결과를 통해서도 재확인 할 수 있었다(도 28의 B). 이러한 결과를 통하여, Rex1 발현 억제에 의해 세포들은 G2기에 정지됨을 확인할 수 있었다.
18-10. Rex1 발현 억제에 의한 G2/M 진행 관련 단백질의 발현 변화 확인
Rex1 발현 억제에 의한 G2/M 진행과 관련된 중요 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. G2에서 M기로 진행하는데 있어서 중심 조절자인 cyclin B는 cyclin B1 및 cyclin B2 두 개의 isoform을 가진다. 이 두 단백질은 Rex1 발현 억제 세포주(hREX1-10, shREX1-11, shREX1-13)에서 발현량이 현저하게 감소하였다. 그러나, 그 외의 G2/M 진행 관련 중요 단백질인 CDK1, CDC25C 및 cyclin A는 Rex1 발현 억제 세포주에서 발현량의 차이가 관찰되지 않았다(도 29). cyclin B1 및 cyclin B2의 활성은 주로 그들의 발현량에 의해 조절되므로, 이러한 결과는 G2/M 진행 관련 중심 조절자인 cyclin B1 및 cyclin B2의 발현은 Rex1에 의해 조절되고, 이를 통해 G2/M 진행이 원활하게 됨으로써 세포의 증식을 유지하게 됨을 시사한다.
실시예 19. Rex1에 의한 cyclin B1 및 cyclin B2의 발현 유도 확인
19-1. 인간섬유아체세포에서 Rex1에 의한 cyclin B1 및 cyclin B2 발현 유도 확인
Rex1에 의해 cyclin B1 및 cyclin B2 발현이 유도됨을 확인하기 위하여, Rex1을 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 인간섬유아체세포에 형질도입하였다. 감염 5일 후 Rex1 전사체의 발현량을 real-time RT-PCR을 통해 확인한 결과, Rex1이 과발현 되었음을 확인할 수 있었다(도 30 상단). 또한, 감염 5일 후 Rex1 단백질의 발현도 증가되었음을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다(도 30 하단). 이러한 Rex1 과발현에 의해 cyclin B1과 cyclin B2는 mRNA 레벨에서 각 2.1배, 1.7배 유의성 있게 증가하였고(p<0.01, 도 30 상단), cyclin B1과 cyclin B2 단백질은 각각 2.3배, 2.4배 유의성 있게 증가되었음을 확인하였다(p<0.01, 도 30 하단).
19-2. 인간섬유아체세포의 리프로그래밍 과정에서 Rex1에 의한 cyclin B1 및 cyclin B2 발현 증가 확인
Rex1을 리프로그래밍 인자로 사용한 경우, 역분화 과정 동안 cyclin B1 및 cyclin B2 발현이 더 많이 또는 빨리 유도되는지 확인하기 위하여, 인간 섬유아체세포에 Rex1과 다른 리프로그래밍 인자들(Oct4, Sox2, cMyc, Klf4)의 다양한 조합을 이용하여 리프로그래밍을 실시하였다. Oct4, Sox2, cMyc(OSM, 3F), Oct4, Sox2, cMyc, Klf4(OSMK, 4F), Oct4, Sox2, cMyc, Rex1(OSMR, 3F+R), 및 Oct4, Sox2, cMyc, Klf4, Rex1(OSMKR, 4F+R)의 리프로그래밍 인자로 각각 형질전환한 후 13일, 20일째 되었을 때 각 섬유아체세포로부터 전체 RNA을 추출하여, real-time RT-PCR로 다분화능 마커 및 cyclin B1, cyclin B2의 발현량을 확인하였다. 그 결과, 3F만을 형질도입한 경우를 제외하고, 줄기세포 마커 Nanog 및 Rex1의 발현이 유도되었으며, 특히 4F만을 형질도입한 경우보다, Klf4 대신 Rex1를 형질도입한 3F+R 및 4F에 Rex1을 추가적으로 형질도입한 4F+R 조합을 형질도입한 경우에는 cyclin B1, cyclin B2의 발현량이 유의성 있게 증가되었다(* p<0.1, ** p<0.05, *** p<0.01, 도 31). 이러한 결과는 Rex1에 의한 cyclin B1 및 cyclin B2 등의 M기 중요 조절인자의 발현 증가에 의한 활성화에 의해 G2/M 진행을 가속화하고, 세포증식을 개선하는데 기여할 수 있음을 시사한다. 또한, 이러한 Rex1의 기능은 기존 리프로그래밍 기법에서 발생하는 세포주기 정지 및 세포 증식 억제 현상을 개선함으로써 리프로그래밍 효율을 높이는데 기여할 것으로 예상된다.

Claims (18)

  1. Rex1(reduced expression protein 1) 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자는 발현벡터에 포함된 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자는 messenger RNA(mRNA)인 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산분자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포는 인간으로부터 유래된 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분화된 세포는 체세포 또는 체세포 줄기세포(somatic stem cell) 인 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 체세포 줄기세포는 신경줄기세포 또는 중간엽줄기세포인 것인 조성물.
  8. (a) Rex1(reduced expression protein 1) 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 전달하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 분화된 세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, (c) 단계 (b)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 리프로그래밍 유도인자는 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산분자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포의 배양액에 투여하는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계는 리프로그래밍 유도인자의 유전자를 삽입한 바이러스 벡터로 형질감염(transfection)시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스로 분화된 세포를 감염시키는 것인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 리프로그래밍 유도인자는 messenger RNA(mRNA)인 것인 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 세포는 인간으로부터 유래된 것인 방법.
  16. 제8항에 있어서, 상기 분화된 세포는 체세포 또는 체세포 줄기세포(somatic stem cell)인 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 체세포 줄기세포는 신경줄기세포 또는 중간엽줄기세포인 것인 방법.
  18. 분화된 세포를 유도만능줄기세포로 리프로그래밍시키기 위한 Rex1(reduced expression protein 1) 단백질 또는 Rex1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는조성물의 용도.
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