WO2017217756A2 - 자살유전자를 포함한 에피솜 벡터 및 이를 이용한 리프로그래밍 방법 - Google Patents

자살유전자를 포함한 에피솜 벡터 및 이를 이용한 리프로그래밍 방법 Download PDF

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WO2017217756A2
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김장환
이민형
정초록
안현준
손명진
손미영
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한국생명공학연구원
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Definitions

  • the present invention relates to an episomal vector containing a suicide gene and a reprogramming method using the same, and in particular, an episomal vector comprising a reprogramming factor and a suicide gene, and a cell not containing foreign DNA using the same. To reprogram it.
  • iPSCs human induced pluripotent stem cells
  • One method for iPSC preparation includes a method using an episomal vector. This method shows relatively low reprogramming efficiency compared to other reprogramming methods, but it is a method to obtain a safe iPSC at low cost. Episomal vectors can naturally escape from cells during cell culture, allowing for the production of exogene-free iPSCs.
  • scURA3 The gene is Saccharomyces cerevisiae) is a gene encoding orotidine 5'-phosphate decarboxylase (ODCase) required for cell growth.
  • ODCase orotidine 5'-phosphate decarboxylase
  • 5-fluoroorotic acid 5-FOA
  • 5-fluorouracil 5-FU
  • S. cerevisiae with scURA3 is known to abandon the gene for survival in the condition of 5-FOA.
  • scFCY1 a suicide gene encoding cytosine deaminase (CD) can convert non-toxic prodrug 5-fluorocytosine (5-FC) to toxic drug 5-FU.
  • 5-FU cytotoxic mechanisms include misincorporation of 5-fluoro-uridine-triphosphate (5-FUTP) and 5-fluoro-deoxyuridine-triphosphate (5-FdUTP), and thymidylate synthase, a nucleotide synthetase (thymidylate synthase) has been shown to be due to inhibition.
  • the suicide gene has been reported in the treatment of cancer and tumor killing effects have been reported (Altanerova et al., Int J Cancer, 2012, 130: 2455-2463; Yi et al., Stem Cell Res, 2014, 12: 36-48)
  • the use of these suicide genes to produce reprogrammed cells that do not contain foreign DNA has not been reported to date.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method for producing reprogrammed cells that do not contain foreign DNA using episomal vectors. As a result, we have reprogrammed cells using episomal vectors containing reprogramming factors and suicide genes. Induction of the present invention was completed by confirming that the reprogrammed cells containing no foreign DNA can be easily obtained by negatively selecting the cells having the remaining episomal vector through pro-drug treatment. .
  • One object of the present invention is to provide an episomal vector comprising (i) a reprogramming factor and (ii) a suicide gene.
  • Another object of the present invention comprises introducing the episomal vector into an isolated cell, reprogramming the cell, and treating the pro-drug to select cells that do not contain foreign DNA. To provide a reprogramming method for cells.
  • the reprogramming method of the present invention can produce reprogrammed cells that do not contain foreign DNA by using episomal vectors containing reprogramming factors and suicide genes. It can be usefully used.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a process of inducing fibroblasts isolated from humans to induced pluripotent stem cells using an episomal vector containing cytosine deaminase of the present invention, and the process of not containing foreign DNA through 5-FC treatment. It is a schematic diagram of the process of rapidly inducing pluripotent stem cells.
  • FIGS. 2A and 2B are diagrams confirming the preparation of an episomal vector containing cytosine deaminase
  • FIG. 2A is a schematic diagram of the episomal vector containing a cytosine deaminase
  • FIG. In order to confirm the function of the episomal vector containing the minase is a diagram confirming the expression of the genes included in each episomal vector.
  • Figure 3 is a diagram showing a process of inducing fibroblasts isolated from humans to induced pluripotent stem cells using an episomal vector comprising a cytosine deaminase of the present invention.
  • FIG. 4A is a diagram confirming the amount of episomal vector remaining when 5-FC is treated to induced pluripotent stem cells made using episomal vectors that do not contain cytosine deaminase.
  • B is a diagram showing the amount of episomal vector remaining when 5-FC treatment to induced pluripotent stem cells made using episomal vector containing cytosine deaminase.
  • FIG. 5 shows the time points at which episomal vectors were completely removed by the presence of cytosine deaminase and the presence of externally treated 5-FCs in each case of induction of pluripotent stem cells at the mass or single cell level. It is confirmed figure.
  • FIG. 6A to 6B are diagrams confirming the toxicity of 5-FC and 5-FU in embryonic stem cells.
  • FIG. 6A is a diagram illustrating the concentration of each substance to be toxic by treating 5-FC or 5-FU to HuES9 cells at concentrations from 0 to 1, 10, 50, and 100 ⁇ M.
  • B is a concentration of 0 to 2.5, 5.0, 7.5, 10 ⁇ M treated with 5-FC or 5-FU to H9 cells to confirm the concentration of each substance is toxic.
  • FIG. 7A to 7C show that 293T cells in which the CD gene is inserted into the genome selectively undergo apoptosis when EGFP or CD-EGFP is inserted into the genome of 293T cells and 5-FC is treated using a lentivirus. It is also.
  • FIG. 7A is a diagram showing microscopic examination of the state of cells and expression of EGFP after 6, 0, 10, and 50 ⁇ M 5-FC treatment of 293T cells in which EGFP or CD-EGFP is inserted into the genome for 6 days.
  • FIG. 7B shows cells displaying green fluorescence through flow cytometry after collecting cells after treatment with 0, 10 and 50 ⁇ M 5-FC for 6 days in 293T cells inserted with EGFP or CD-EGFP into the genome, respectively.
  • Figure 7C shows the relative value, and C of FIG. 7 directly counts the number of cells after treatment of 0, 10, and 50 ⁇ M 5-FC for 6 days in 293T cells in which EGFP or CD-EGFP is inserted into the genome, respectively. Figure
  • FIG. 8A and 8B show that apoptosis of H9 cells with CD inserted into the genome selectively occurs when EGFP or CD-EGFP is inserted into the genome of H9 cells using a lentivirus and 5-FC treatment.
  • FIG. 8A is a diagram showing the direct counting of the number of cells after treatment with 50 ⁇ M 5-FC for 48 hours in H9 cells in which EGFP or CD-EGFP is inserted into the genome
  • FIG. 8B shows EGFP.
  • the state of the cells under microscope at 12 hours intervals before treatment with 50 ⁇ M 5-FC was inserted into the genome of CD-EGFP.
  • FIG. 9A to 9 are diagrams confirming the characteristics of the foreign gene-free induced pluripotent stem cells selected in the above experiment.
  • FIG. 9A is a diagram confirming the expression of a pluripotency maker protein in CD-iPSC
  • FIG. 9B is an alkaline phosphatase staining (AP staining) of CD-iPSC.
  • 9 is a diagram illustrating the characteristics of induced pluripotent stem cells
  • FIG. 9C shows the expression of ectoderm, mesoderm and endoderm marker proteins of embryoid body (EB) differentiated from CD-iPSC.
  • EB embryoid body
  • 9 is a diagram illustrating the differentiation of ectoderm, mesoderm and endoderm in vivo in mice
  • FIG. 9E shows karyotype analysis of CD-iPSC.
  • 9 is a diagram showing the results of short tandem repeat (STR) analysis of fibroblasts and CD-iPSCs before the reprogramm
  • FIG. 10 is a view showing the amount of episomal vector remaining inside the induced neuronal stem cells when 5-FC treatment to CD-iNSC, and the characteristics of the selected external gene-free induced neuronal stem cells.
  • FIG. 10A is a diagram showing the amount of episomal vector remaining when 5-FC is treated or not treated with induced neuronal stem cells prepared using an episomal vector containing cytosine deaminase.
  • FIG. 10B is a diagram confirming the expression of neural stem cell marker protein in the CD-iNSC selected from A of FIG.
  • Reprogramming cells by introducing foreign genes into the cells is a very useful method of securing patient-specific cells as a resource for regenerative medicine. Since the iPSC manufacturing method was first developed by the Yamanaka Group in 2006, research and clinical trials related to reprogramming have been very active worldwide. However, by introducing foreign genes into cells, not only the cancer-causing potential of the introduced genes themselves, but also foreign genes can be inserted into the genome of cells, resulting in problems such as cancer formation.
  • a method of introducing a reprogramming factor into a cell using an episomal vector has been developed, but it takes a long time to remove the episomal vector from the cell into which the episomal vector is introduced, and furthermore, remains in the cell.
  • the episomal vector may be inserted into the genome of the cell.
  • the present inventors have developed an episomal vector containing a reprogramming factor and a suicide gene in order to solve the problem of the episomal vector in reprogramming cells. Since the vector expresses not only a reprogramming factor but also a suicide gene, the vector is introduced to the reprogrammed cell to treat pro-drugs for the suicide gene, thereby rapidly removing a cell containing an episomal vector, By rapidly removing the episomal vector remaining in the reprogrammed cells, there is an advantage that a reprogrammed cell containing no foreign DNA can be secured in a short time.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object comprises the steps of (a) (i) introducing a episomal vector comprising a reprogramming factor and (ii) a suicide gene into isolated cells; (b) reprogramming the cells by culturing the cells into which the episomal vector is introduced; And (c) culturing the reprogrammed cells in a medium containing a pro-drug to select cells that do not contain foreign DNA.
  • reprogramming refers to a method of controlling a global gene expression pattern of a specific cell and converting the cell into a desired cell.
  • reprogramming refers to a method of artificially manipulating a cell and converting the cell into a cell having completely different characteristics.
  • the reprogramming refers to introducing a vector containing a foreign gene or DNA into a cell. It may be performed by.
  • reprogramming may include, but is not limited to, dedifferentiation or transdifferentiation of cells.
  • stem cells such as induced pluripotent stem cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, as well as fully differentiated cells such as neurons, pancreatic cells, liver cells, cardiomyocytes, bone cells, etc. All may be included in the scope of the present invention, since it can be prepared by varying the reprogramming factor according to the type of cells of interest, it is not particularly limited to the type.
  • the term "differentiation” refers to a phenomenon in which the structure or function of a cell is specialized. In other words, it refers to a process in which cells, tissues, etc. of an organism are transformed into suitable forms and functions in order to play a role given to each.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells are differentiated into ectoderm, mesoderm, and endoderm cells, and narrowly, hematopoietic stem cells turn into red blood cells, white blood cells, platelets, and the like.
  • the term “dedifferentiation” refers to a process by which differentiated cells can be restored to a state having the potential to differentiate into a new type
  • “transdifferentiation” refers to a completely different characteristic of the cells.
  • Eggplant refers to the conversion to cells. The mechanism of reverse differentiation and cross-differentiation of these cells is characterized by the different sets of epigenetic marks after the deletion of epigenetics in the nucleus (a DNA state associated with causing a genetic change in function without a change in nucleotide sequence). It may be to establish.
  • pluripotent stem cell refers to a pluripotent or totipotent self-renewal capable of differentiating into cells of all tissues of an individual.
  • Stem cells including but not limited to embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.
  • embryonic stem cell refers to an inner cell mass extracted from blastocyst embryos in which embryos are implanted in the mother's womb and cultured in vitro, and differentiated into cells of all tissues of the individual. It means a cell having a pluripotent or self-renewal capable of totipotent.
  • induced pluripotent stem cells refers to cells induced to have pluripotent differentiation ability through artificial dedifferentiation from differentiated cells and is also referred to as induced pluripotent stem cell (iPSC).
  • Artificial dedifferentiation process is performed by the use of virus-mediated or non-viral vectors with retroviruses and lentiviruses, introduction of non-virus-mediated dedifferentiation factors using protein and cell extracts, or by stem cell extracts, compounds, etc. Includes reverse differentiation process.
  • Induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells, specifically, have the same cell shape, have similar gene and protein expression patterns, and are pluripotent in vitro and in vivo .
  • Induced pluripotent stem cells of the present invention may include induced pluripotent stem cells of all derived from humans, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, and the like, specifically derived from humans It may be a pluripotent stem cell, but is not limited thereto.
  • step (a) first includes (i) introducing an episomal vector comprising a reprogramming factor and (ii) a suicide gene into isolated cells. to be.
  • the term "reprogramming factor” refers to a gene (or polynucleotide encoding it) that can be introduced into a cell to induce reprogramming.
  • the reprogramming factor may vary depending on the cell of interest to which reprogramming is intended, and on the type of isolated cell from which reprogramming is induced.
  • the reprogramming factor includes one or more genes selected from the group consisting of Oct4, Sox2, Klf4, Lin28, C-myc and L-myc.
  • the reprogramming factor in addition to being capable of producing induced pluripotent stem cells may include all factors known in the art.
  • Ascl1, Pitx3, Nurr1, and Lmx1a can be introduced into cells as reprogramming factors to induce cross-differentiation into dopaminergic neurons.
  • the cross-differentiation methodology there is a method using pluripotent factors such as Oct4, Sox2, Klf4, Lin28, and C-myc, and the vector of the present invention can be used for such a purpose.
  • pluripotent factors such as Oct4, Sox2, Klf4, Lin28, and C-myc
  • those skilled in the art can select appropriate factors according to the cell of interest and the type of cell prior to reprogramming, which are all within the scope of the present invention as long as they are known in the art, and are not particularly limited to those types. Do not.
  • reprogramming regulates the gene expression pattern of a cell and induces conversion to a target cell. Therefore, the reprogramming factor is introduced into a cell and the cell is cultured for a certain period of time, thereby regenerating the gene of the desired type of cell. Cells
  • suicide gene refers to a gene encoding a protein (eg, an enzyme) that has the activity of converting a non-toxic prodrug into a cytotoxic drug.
  • the suicide gene may be used regardless of origin as long as it has a function of encoding a protein (eg, an enzyme) having an activity of converting a non-toxic prodrug into a drug having cytotoxicity.
  • the suicide gene and protein can be used without limitation as long as it is known in the art, the sequence can be obtained from the GenBank of NCBI known database.
  • the suicide gene may be cytosine deaminase (CD), thymidine kinase, or cytochrome P450, but is not limited thereto.
  • the prodrug may specifically be 5-fluorocytosine (5-FC), Ganciclovir or cyclophosphamide, but is not limited thereto.
  • cytosine deaminase (CD) in the suicide gene reacts with 5-fluorocytosine (5-FC) as a prodrug, and thymidine kinase (Ganciclovir) as a prodrug
  • cytochrome P450 may react with cyclophosphamide as a prodrug, but is not limited thereto.
  • the cytosine deaminase is an enzyme that catalyzes a reaction for generating uracil by hydrolyzing an amino group using cytosine as a substrate. Cytosine deaminase reacts with 5-fluorocytosine (5-FC), a non-toxic prodrug, to produce 5-FU (5-fluorouracil) by a deamino group reaction, and the resulting 5-FU is a misalignment of RNA and DNA. Can cause cytotoxicity.
  • the cytosine deaminase is specifically Saccharomyces ( Saccharomyces) cerevisiae ), but is not limited thereto.
  • an episomal vector is a non-viral non-insertable vector, and is known to have a property of expressing a gene included in the vector without being inserted into a chromosome.
  • the reprogramming factor may induce reprogramming to the episomal vector.
  • suicide genes were included to selectively remove cells containing episomal vectors.
  • the cell including the episomal vector includes all cases where the episomal vector is inserted into the genome or is present in the cell without being inserted into the genome.
  • the episomal vector may include one or two or more reprogramming factors together with a suicide gene.
  • the episomal vector may be specifically an Epstein-Barr Virus-based vector, and more specifically, may be a pCXLE vector or a pCEP4 vector, but is not limited thereto. Those skilled in the art may select an appropriate episomal vector according to the purpose. Applicable
  • a cell comprising an episomal vector comprising a reprogramming factor and a suicide gene can be prepared, and the prepared cell is reprogrammed by the introduced episomal vector and Can express suicide genes.
  • the isolated cells may be somatic cells or stem cells, and may be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose thereof, and are not particularly limited thereto. Incorporation of episomal vectors into cells in the present invention can be performed by those skilled in the art appropriately selected known transformation methods.
  • an episomal vector comprising three episomal vectors, a cytosine deaminase as a suicide gene, and an OCT4, or SOX2 and KLF4, or L-MYC and LIN28, respectively, as a reprogramming factor And, these were introduced into human cancer cell lines to confirm the expression of each gene (Fig. 2).
  • step (b) is a step of reprogramming the cells by culturing the cells into which the episomal vector is introduced.
  • the cells into which the episomal vector of step (a) is introduced may be reprogrammed by a reprogramming factor expressed by the episomal vector during the culturing process.
  • the term "culturing” means growing the cells under appropriately controlled environmental conditions, and the culturing process of the present invention may be performed according to appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the cells selected.
  • step (b) is a process of culturing the cells into which the reprogramming factor is introduced, so that the medium composition for culturing the cells is a composition suitable for the cells to be prepared by the introduction of the reprogramming factor. It may be to have.
  • the medium of step (b) may have a medium composition suitable for culturing induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells.
  • the medium of step (b) may have a medium composition suitable for the culture of neural stem cells.
  • a medium composition can be appropriately selected and applied by those skilled in the art within the range already known in the art.
  • the medium may further include a substance capable of enhancing reprogramming efficiency.
  • a substance capable of enhancing reprogramming efficiency may be, for example, ALK5 inhibitors, GSK-3 inhibitors, HDAC (histone deacetylase) inhibitors or nicotinamide, etc., specifically A83-01, CHIR99021, sodium butyrate or nicotine It may be an amide, but is not limited thereto.
  • the episomal vector comprising the reprogramming factor and cytosine deaminase gene is introduced into human-derived fibroblasts and cultured to thereby induce pluripotent stem cells (CD-iPSC).
  • CD-iPSC pluripotent stem cells
  • induced pluripotent stem cells prepared by introducing an episomal vector containing the cytosine deaminase gene were named CD-iPSC.
  • step (c) comprises culturing the reprogrammed cells in a medium containing a pre-drug through step (b) to select cells that do not contain foreign DNA. to be.
  • step (c) the suicide gene contained in the episomal vector introduced into the cell is expressed, whereby the prodrug is converted into a cytotoxic substance by the protein encoded by the suicide gene. Accordingly, the cells in which the genomic insertion of the episomal vector has been removed are removed, and the remaining episomal vector is removed quickly without genome insertion in the reprogrammed cells, so that only cells which do not contain the episomal vector can be selected.
  • the prodrug may be 5-fluorocytosine (5-FC) when the suicide gene is cytosine deaminase, the prodrug may be Ganciclovir when thymidine kinase, and the prodrug when cytochrome P450 May be cyclophosphamide. That is, the prodrug used in step (c) is determined in response to the suicide gene, and is converted into a cytotoxic substance by the suicide gene to selectively remove the episomal vector, ie, a cell in which the genomic insertion of foreign DNA has occurred. The foreign DNA remaining without genome insertion in the cell can be quickly removed to select cells that do not contain the foreign DNA.
  • 5-FC 5-fluorocytosine
  • 5-FC When 5-FC is used as a prodrug, 5-FC may be included in the medium at a concentration of 20 ⁇ M to 100 ⁇ M, specifically 50 ⁇ M to 100 ⁇ M, but is not limited thereto. 5-FC is not toxic when treated with cells, but may be toxic to cells when converted to 5-FU (5-fluorouracil) by a protein encoded by a suicide gene.
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • the episomal vector comprising the reprogramming factor and cytosine deaminase gene was introduced into human-derived fibroblasts and cultured to produce induced neuronal stem cells ( 10).
  • induced neuronal stem cells prepared by introducing an episomal vector containing the cytosine deaminase gene were named CD-iNSC.
  • episomal vectors In general, it is known to verify at least 10 passages for complete removal of episomal vectors, but when cultured at the single cell level using the method of the present invention, episomal vectors can be removed with only one passage. As can be seen, reprogrammed cells containing no foreign DNA can be obtained in a short time.
  • the reprogramming method using the episomal vector of the present invention can quickly remove foreign DNA from the reprogrammed cells, which is advantageous in terms of cost, time, and effort compared to the cell reprogramming method using the conventional episomal vector.
  • induced pluripotent stem cells and induced neuronal stem cells prepared through the reprogramming method of the present invention can be usefully used as a research on the mechanism of a specific disease or the development of cell therapeutics.
  • Another aspect of the invention is an episomal vector, comprising a gene of (i) a reprogramming factor and (ii) a cytosine deaminase (CD) that is a suicide gene.
  • Reprogramming factors, suicide genes and episomal vectors are as described above.
  • Example 1 cytosine Deaminase Containing Episomal Made and produced vector Episomal Check the function of the vector
  • DNA of OCT4 gene was obtained through PCR from pHAGE2-EF1a-hSTEMCCA-W- loxP vector.
  • DNA of the cytokine deaminase (CD) gene was obtained through polymerase chain reaction from the genome of Saccharomyces cerevisiae .
  • the two DNA fragments obtained were linked to one fragment using a Gibson assembly reaction kit (Gibson Assembly reaction kit; New England Biolabs, USA), and then amplified in bulk by polymerase chain reaction.
  • Eoteonaen Purification of the amplified DNA fragments was performed following the TOPO cloning reaction (TM pENTR Directional TOPO ® Cloning Kits; Invitrogen, USA). Next, the reactant was included in the kit of Escherichia coli ) cells were transformed and cultured in a 37 °C incubator. The plasmid DNA was obtained from some of the transformants shown the next day, and the sequencing was submitted to Genotech Corp. (GenoTech Corp., Korea) for sequencing. The analyzed plasmid DNA was cloned into pCXLE-GW vector via an LR cloning reaction (Gateway TM LR Clonase TM II Enzyme Mix; Invitrogen, USA).
  • the reaction was then transformed into DH5alpha E. coli cells and incubated in a 37 ° C. incubator.
  • the plasmid DNA was obtained from some of the transformants shown the next day, and the sequencing was submitted to Genotech Corp. (GenoTech Corp., Korea) for sequencing.
  • DNAs of SOX2 and KLF4 genes were obtained from polymerase chain reaction from pHAGE2-EF1a-hSTEMCCA-W-loxP vector. Subsequent steps are the same as the process of constructing the pCXLE-hOCT4-CD vector.
  • each episomal vector was transformed into 293T cells and the expression of the gene was confirmed at the mRNA level.
  • 293T cells were cultured in DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM; Invitrogen, USA) containing 10% FBS (fetal bovine serum; Invitrogen, USA).
  • 500 ng of each episomal vector was transformed into 293T cells using TransIT 2020 reagent (Mirus, USA) following the manufacturer's provided protocol.
  • RNA was extracted from cells cultured following the manufacturer's provided protocol using the RNeasy Mini Plus Kit (Qiagen, USA).
  • the cDNA was then synthesized using the iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad, USA) following the manufacturer's provided protocol.
  • RT-PCR was performed using the primers described in Table 2 below. PCR products were identified on 2% agarose gel. As a control, experiments were performed that did not include reverse transcriptase and PCR was performed using the same method as above and confirmed on 2% agarose gel.
  • Example 2 cytosine Deaminase (Cytosine deaminase Containing Episomal Induced Pluripotent Stem Cell Production Using Vectors
  • Human fibroblast line CRL2097 was cultured in DMEM containing 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen, USA) and 1 mM L-glutamine (Invitrogen, USA).
  • 500 ng episomal vector mixtures (pCXLE-hOCT4-CD, pCXLE-hSK-CD and pCXLE-hUL) were transduced using Neon-electroporator (Invitrogen, USA) to 100,000 CRL2097 cells for the production of induced pluripotent stem cells. Transformation was performed by perforation. Electroporation was performed at 1,650 V, 10 ms, 3 pulses.
  • Transformed CRL2097 cells were inoculated in 6-well plates coated with Geltrex (Invitrogen, USA) for 1 hour. Incubation for 5 days was followed by replacement with reprogramming medium in CRL2097 culture medium.
  • Reprogramming medium contains 1 mM nicotinamide (Nicotinamide, Sigma-Aldrich, USA), 0.5 ⁇ M A83-01 (Tocris Bioscience, UK), 3.0 ⁇ M CHIR99021 (Tocris Bioscience, UK), and 0.2 mM sodium butyrate, MTeSR-1 (Stemcell Technologies, USA) medium containing Sigma-Aldrich, USA) was used.
  • Colonies of induced pluripotent stem cells were isolated and transferred to geltrex coated 4-well plates, followed by additional cytosine (Sigma-Aldrich, USA) based on TeSR-E8 (Stemcell Technologies, USA) medium. Proliferation culture was performed using media not included.
  • the present inventors named the induced pluripotent stem cells produced by the above process as CD-iPSC.
  • FIG. 3 A simplified schematic of the process is shown in FIG. 3 (FIG. 3).
  • Induced pluripotent stem cells prepared using episomal vectors with or without cytosine deaminase were isolated and incubated with TeSR-E8 medium containing 0, 10 and 50 ⁇ M 5-FC (Abcam, USA), respectively. . Each cell was then isolated from the cell culture dish using Accutase (Millipore, Germany) and passaged back to the geltrex coated cell culture dish. Passage was performed at intervals of 5-7 days, and cells remaining in the passage were recovered for the purpose of obtaining DNA.
  • the cells remaining in the passage were centrifuged and the supernatant was removed to obtain the total DNA of the cells.
  • the remaining cells were resuspended using DirectPCR Lysis Reagent (Viagen, USA) and further added proteinase K (Invitrogen, USA) and reacted at 56 ° C. for 3 hours.
  • the reaction was stored at -20 °C and used for quantitative PCR analysis (qPCR).
  • Induced pluripotent stem cells prepared using episomal vectors containing cytosine deaminase were isolated and incubated with TeSR-E8 medium containing 0, 50 ⁇ M 5-FC (Abcam, USA) at the single cell level, respectively. Passage was performed every seven days, and the cells remaining in the passage were recovered for the purpose of obtaining DNA. The subsequent procedure is the same as the procedure of Example ⁇ 3-1>.
  • 5-FC was treated to human embryonic stem cells, HuES9 cells and H9 cells, at various concentrations.
  • 5-FU Sigma-Aldrich, USA
  • Embryonic stem cells were seeded in 96-well plates, and from the next day, various concentrations of 5-FC or 5-FU were added to the culture medium and treated for 48 hours.
  • WST-1 cell proliferation assay system (Takara, Japan) was used to measure the cytotoxicity of 5-FC and 5-FU.
  • Example 4 cytosine Deaminase Induce selective cell death of cells inserted into the genome
  • the package vector contains or contains psPAX2 (Addgene, USA), envelope vector pMD2.G (Addgene, USA), and pLX301 (Addgene, USA) containing CD-EGFP or EGFP and CD as an expression vector.
  • PWPXL Additional Biotech, USA
  • the construction of the lentiviral was performed using a method of co-transfection of 293T cells with a 8.75 ⁇ g expression vector, 3.75 ⁇ g envelope vector and 2.5 ⁇ g packaging vector using a TransIT-2020 Reagent (Mirus, USA). .
  • the cells 24 hours after the co-nucleic acid transfection, the cells were replaced with fresh medium, and total cell cultures were collected at 48 and 72 hours to obtain lentiviral particles.
  • the obtained lentiviral particles were concentrated by ultracentrifugation at 4 ° C. for 2 hours at a speed of 25,000 rpm, and stored at -80 ° C. until just before use.
  • EGFP and CD-EGFP were used in 293T cells using the lentiviral prepared by the method of Example ⁇ 4-1>. Were each transduced. 12-well plates were inoculated with cells transduced with each gene, and replaced with culture medium containing 5-FC the next day. Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) was used to count cells expressing EGFP in each transduced cell.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
  • Example ⁇ 4-1> In order to confirm whether apoptosis is induced in the embryonic stem cells by treatment with cytosine deaminase and 5-FC in the same manner as 293T cells, the lentiviral produced by the method of Example ⁇ 4-1> was used for H9 cells. EGFP and CD-EGFP were transduced. 12-well plates were inoculated with cells transfected with each gene and replaced with culture medium containing 5-FC two days later.
  • Example 5 does not contain foreign DNA ( exogene -free) Induced pluripotent stem cells Property check
  • the solution prepared by diluting 16% paraformaldehyde (Paraformaldehyde; Electron microscopy science, USA) in DPBS to 4% in the CD-iPSC selected in ⁇ Example 3> was reacted for 10 minutes at room temperature and fixed. Permeability to cell membranes by treatment with PBS solution containing 3% BSA (Bovine serum albumin; Invitrogen, USA), 0.3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA) for 1 hour It was.
  • BSA Bovine serum albumin
  • Triton X-100 Sigma-Aldrich, USA
  • anti-OCT4 antibody 500 dilution, Santa Cruz Biotechnology, USA
  • anti-NANOG antibody 1: 70 dilution, R & D systems, USA
  • primary antibody in 1% BSA anti-TRA-1- 81 Antibody (1: 500 Dilution, Milipore, Germany
  • Anti-SSEA3 Antibody 1: 500 Dilution, Milipore, Germany
  • Anti-SSEA4 Antibody 1: 500 Dilution, Milipore, Germany
  • Anti-TRA-1-60 Antibodies 1: 500 dilution, Millipore, Germany
  • alkaline phosphatase staining which is one of the methods of confirming the characteristics of pluripotent stem cells, was performed.
  • an AP staining kit (Alkaline phosphatase kit; Sigma Aldrich, USA) was used. 10% formalin (Formalin; Sigma Aldrich, USA) was added to the CD-iPSC selected in Example 3 as a fixed solution and reacted at room temperature for 30 seconds. Fixed cells were washed once with TBST. Next, 10 ⁇ l of sodium nitrate solution and 10 ⁇ l of FRV-alkaline solution were mixed and left for 2 minutes, followed by 0.15% sodium chloride (Sigma-Aldrich, USA). 300 ⁇ l of sterile water and 10 ⁇ l of Naphthol AS-BI alkaline solution were added thereto to prepare an AP staining mixture.
  • the fixed CD-iPSC was added to the prepared AP staining mixture and wrapped in foil to block light to react at room temperature for 20 minutes. After the reaction, the cells were washed twice with PBS and AP stained cells were observed under a phase contrast microscope. As a result, it was confirmed that CD-iPSC is positively stained on AP (FIG. 9B).
  • CD-iPSC derived embryoid bodies CD-ploids
  • the ectoderm marker proteins TUJ1, OTX2, endoderm marker proteins FOXA2, AFP, and mesoderm in CD-embryoderm Expression of the three germ layer marker proteins was confirmed by confirming the expression of the marker proteins ASMA and BRACHYURY.
  • CD-iPSCs were incubated for 7 days in embryoid body differentiation medium, DMED / F12 medium containing 10% serum replacement (SR), to induce differentiation into CD-embryoderm. . Thereafter, the CD-embryonic body was inoculated onto a geltrex coated plate and incubated for an additional 7 days to induce differentiation. Immunofluorescence staining was performed on the differentiated cells in the same manner as in Example ⁇ 5-1> to confirm the expression of TUJ1, OTX2, ASMA, BRACHYURY, AFP or FOXA2 protein.
  • Anti-TUJ1 antibody (1: 5000 dilution; PRB-435P, Covance, USA), anti-OTX2 antibody (1: 100 dilution; ab21990, Abcam, USA), anti-ASMA antibody as primary antibody for immunofluorescence staining (1: 200 dilution; A5228, Sigma-aldrich, USA), anti-BRACHYURY antibody (1: 300 dilution; sc-17745, Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-AFP antibody (1: 400 dilution; A0008, Dako, USA) or anti-FOXA2 antibody (1: 100 dilution; AF2400, R & D systems, USA) were used respectively, and the nuclei of cells were stained and compared by treatment with Hoechst33342 to control the degree of expression.
  • the cells differentiated from CD-iPSCs express all three ectoderm markers of TUJ1, OTX2, ASMA, BRACHYURY, AFP or FOXA2 protein, confirming that CD-iPSCs have pluripotency (FIG. 9C).
  • CD-iPSC was implanted in the shoulder area of nonobese diabetic / severe combined immunodeficient mice. After 12 weeks, the resulting teratoma was isolated and fixed with 10% formalin (Sigma-Aldrich, USA), and then paraffin blocks were prepared. Tissue sections were obtained from the prepared blocks, and hematoxylin / iocin staining confirmed the characteristics of cells and specific tissues.
  • STR analysis was performed to confirm that the selected CD-iPSC cells were made from fibroblasts, which are starting cells.
  • Example 6 cytosine Deaminase (Cytosine deaminase Containing Episomal Induction of Neural Stem Cells Using Vectors
  • Human fibroblast line CRL2097 was cultured in DMEM containing 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen, USA) and 1 mM L-glutamine (Invitrogen, USA). 10 ⁇ g of episomal vector mixture (pCXLE-hOCT4-CD, pCXLE-hSK-CD and pCXLE-hUL-CD) was used for the preparation of induced neural stem cells using NEPA21 Super Electroporator (Nepagene, Japan) in 2,000,000 CRL2097 cells. Transformation was performed by electroporation. Transformed CRL2097 cells were inoculated in 6-well plates coated with Geltrex (Invitrogen, USA) for 1 hour.
  • FBS fetal bovine serum, Invitrogen, USA
  • L-glutamine Invitrogen, USA
  • 10 ⁇ g of episomal vector mixture pCXLE-hOCT4-CD, pCXLE-hSK-CD and pCXLE-hUL-CD
  • Reprogramming medium was 0.05% AlbuMAX-I (Invitrogen, USA), 1x N2 (Invitrogen, USA), in a 1: 1 mixture of Advanced DMEM / F-12 (Invitrogen, USA) and Neurobasal medium (Invitrogen, USA), 1x B27 without vitamin A (Invitrogen, USA), 1 mM Glutamax (Invitrogen, USA), 0.11 mM ⁇ -mercapto ethanol ( ⁇ -mercaptoethanol; Sigma-Aldrich, USA), 0.5 ⁇ M A83-01 (Tocris Bioscience, UK) , 3.0 ⁇ M CHIR99021 (Tocris Bioscience, UK), 0.2 mM sodium butyrate (Sodium butyrate, Sigma-Aldrich, USA), and 10 ng / ml human LIF (Peprotech, USA) were used in addition.
  • Colonies of the induced neural stem cells were separated and transferred to a geltrex coated 4-well plate, and then cultured using a medium except sodium butyrate in reprogramming medium.
  • the present inventors named the induced neural stem cells produced by the above process as CD-iNSC.
  • Induced neural stem cells prepared using episomal vectors containing cytosine deaminase were isolated and cultured using a medium containing 0, 50 ⁇ M 5-FC (Abcam, USA), respectively. Each cell was then isolated from the cell culture dish using Accutase (Millipore, Germany) and passaged back to the geltrex coated cell culture dish. Passage was performed every seven days, and the cells remaining in the passage were recovered for the purpose of obtaining DNA.
  • CD-iNSC derived from fibroblasts exhibited the characteristics of neural stem cells
  • the expression of neural stem cell marker protein in CD-iNSC was confirmed.
  • Example 7-1> 16% paraformaldehyde (Paraformaldehyde; Electron microscopy science, USA) in the CD-iNSC selected in ⁇ Example 7-1> was diluted in DPBS and treated with a solution made of 4% to react for 10 minutes at room temperature Immobilized, permeability to cell membranes by treatment with PBS solution containing 3% BSA (Bovine serum albumin; Invitrogen, USA), 0.3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA) for 1 hour. Was given.
  • BSA Bovine serum albumin
  • Triton X-100 Sigma-Aldrich, USA
  • anti-PAX6 antibody 100 dilution, Covance, USA
  • anti-KI67 antibody 1: 200 dilution, BD, USA
  • anti-N-CADHERIN antibody 1: 200 dilutions, Santa Cruz Biotechnology, USA
  • CD-iNSC was immunofluorescent stained and observed by fluorescence microscope to confirm the expression of PAX6, KI67 and N-CADHERIN protein.
  • Hoechst33342 (Invitrogen, USA) was treated and stained for nuclei of cells and compared.

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Abstract

본 발명은 자살유전자를 포함한 에피솜 벡터의 제작 및 이를 이용한 리프로그래밍 방법에 관한 것으로, 구체적으로 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터, 및 이를 이용하여 리프로그래밍된 세포에서 외래 DNA를 포함하지 않는 세포를 선별하는 단계를 포함하는 세포의 리프로그래밍 방법에 관한 것이다. 본 발명의 리프로그래밍 방법은, 리프로그래밍 인자 및 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 이용하여 외래 DNA를 포함하지 않는 리프로그래밍된 세포를 제조할 수 있으므로, 세포 치료제 개발 연구 및 특정 질병의 기전 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자살유전자를 포함한 에피솜 벡터 및 이를 이용한 리프로그래밍 방법
본 발명은 자살유전자를 포함한 에피솜 벡터 및 이를 이용한 리프로그래밍 방법에 관한 것으로, 구체적으로 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터, 및 이를 이용하여 외래 DNA를 포함하지 않도록 세포를 리프로그래밍하는 방법에 관한 것이다.
인간 induced pluripotent stem cell (iPSC)은, 개발된 이래로, 인간의 질환을 직접적으로 연구하기 위한 도구, 및 재생의약의 자원으로 여겨져 왔다 (Takahashi et al., Cell, 2007, 131:861-872). iPSC 제조를 위한 하나의 방법으로, 에피솜 벡터 (episomal vector)를 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 방법은 다른 리프로그래밍 방법에 비해 상대적으로 낮은 리프로그래밍 효율을 보이지만, 낮은 비용으로 안전한 iPSC를 수득할 수 있는 방법이다. 에피솜 벡터는 세포 배양 과정에서 자연적으로 세포로부터 빠져나올 수 있으므로, 외래 DNA를 포함하지 않는 (exogene-free) iPSC 제조를 가능하게 한다. 그러나, 에피솜 벡터를 이용해 제조된 역분화 세포는 벡터가 기대했던 것 보다 자주 염색체 내에 삽입되고, 또한 10 계대 이상 배양 시에도 잔존 에피솜 벡터가 남아있을 수 있는 것으로 보고되었다 (Schlaeger et al., Nat Biotechnol, 2015, 33:58-63). 잔존 벡터가 세포 내 장기간 존재하면, 숙주의 게놈으로 삽입될 가능성이 증가하여, 이로 인해 암을 야기하고, 정상 세포의 특성을 파괴하고, 나아가 세포 사멸을 야기할 수 있다. 이러한 이유로, 연구자들은 재생의약 용도로 적용을 위해서 잔존 벡터가 존재하지 않는 iPSC를 분리해낼 필요가 있으나, 상기 분리 과정에는 많은 노동, 시간 및 비용이 소요될 수 있다. 외래 DNA를 포함하지 않는 iPSC를 쉽게 선별하기 위하여, mRNA 형질전환 또는 Sendai 바이러스가 리프로그래밍 도구로서 개발되었으나, 상기 방법들은 상당한 비용이 소요되므로, 여전히 새로운 리프로그래밍 시스템의 개발이 필요한 실정이다.
한편, scURA3 유전자는 사카로마이시스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에서 세포 성장에 필요한 orotidine 5'-phosphate decarboxylase (ODCase)를 코딩하는 유전자이다. 5-fluoroorotic acid (5-FOA)가 배지에 첨가되면, ODCase는 5-FOA를 세포에 독성을 가지는 5-fluorouracil (5-FU)로 전환시켜, 세포 사멸을 야기한다. scURA3를 가지는 S. 세레비지애는 5-FOA가 적용된 조건에서 생존을 위해 상기 유전자를 버리는 것으로 알려져 있다.
이와 유사하게, 시토신 디아미나제 (cytosine deaminase, CD)를 코딩하는 자살유전자인 scFCY1은 비독성 전구약물 (pro-drug) 5-fluorocytosine (5-FC)를 독성 약물 5-FU로 전환시킬 수 있다. 5-FU 세포독성 작용기전은 5-fluoro-uridine-triphosphate (5-FUTP) 및 5-fluoro-deoxyuridine-triphosphate (5-FdUTP)의 오편입 (misincorporation), 및 뉴클레오티드 합성 효소인 티미딜레이트 신테이즈 (thymidylate synthase)의 억제에 의한 것으로 증명되었다. 상기 자살유전자는 암 치료에 적용되어 종양 사멸 효과가 보고되었으나 (Altanerova et al., Int J Cancer, 2012, 130:2455-2463; Yi et al., Stem Cell Res, 2014, 12:36-48), 이러한 자살유전자를 이용하여 외래 DNA를 포함하지 않는 리프로그래밍된 세포를 제조하는 것은 현재까지 보고된바 없다.
본 발명자들은 에피솜 벡터를 이용하여 외래 DNA를 포함하지 않는 리프로그래밍된 세포를 제조하는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 리프로그래밍 인자 및 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 이용하여 세포에 리프로그래밍을 유도할 경우, 전구약물 (pro-drug)처리를 통해 잔존 에피솜 벡터를 가지는 세포를 음성 선별함으로써 외래 DNA를 포함하지 않는 리프로그래밍된 세포를 쉽게 수득할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, (i) 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 (ii) 자살유전자를 포함하는, 에피솜 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 에피솜 벡터를 분리된 세포에 도입하여 세포를 리프로그래밍시키고, 전구약물 (pro-drug)을 처리하여 외래 DNA를 포함하지 않는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 세포의 리프로그래밍 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 리프로그래밍 방법은, 리프로그래밍 인자 및 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 이용하여 외래 DNA를 포함하지 않는 리프로그래밍된 세포를 제조할 수 있으므로, 세포 치료제 개발 연구 및 특정 질병의 기전 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터를 사용하여 인간으로부터 분리된 섬유아세포를 유도만능줄기세포로 유도하는 과정 및 5-FC의 처리를 통해 외래 DNA를 포함하지 않는 상태의 유도만능줄기세포로 빠르게 유도하는 과정에 관한 모식도이다.
도 2의 A 및 B는 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터의 제작을 확인한 도로서, 도 2의 A는 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터의 모식도이며, 도 2의 B는 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터의 기능을 확인하기 위해 각각의 에피솜 벡터가 포함하는 유전자의 발현을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터를 사용하여 인간으로부터 분리된 섬유아세포를 유도만능줄기세포로 유도하는 과정을 나타낸 도이다.
도 4의 A 및 B는 5-FC를 처리하는 경우 에피솜 벡터가 포함하고 있는 시토신 디아미나제와 외부적으로 처리한 5-FC의 농도에 따른 유도만능줄기세포 내부에 잔존하는 에피솜 벡터의 양을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 4의 A는 시토신 디아미나제를 포함하지 않는 에피솜 벡터를 사용하여 만들어진 유도만능줄기세포에 5-FC를 처리하는 경우 잔존하는 에피솜 벡터의 양을 확인한 도이며, 도 4의 B는 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터를 사용하여 만들어진 유도만능줄기세포에 5-FC를 처리하는 경우 잔존하는 에피솜 벡터의 양을 확인한 도이다.
도 5는 유도만능줄기세포를 대량 배양 혹은 단일 세포 수준으로 배양하는 각각의 경우에 시토신 디아미나제의 발현 유무와 외부적으로 처리한 5-FC의 유무에 의해 에피솜 벡터가 완전히 제거된 시점을 확인한 도이다.
도 6의 A 내지 B는 배아줄기세포에서 5-FC와 5-FU의 독성을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 6의 A는 0부터 1, 10, 50, 100 μM의 농도로 5-FC 또는 5-FU를 HuES9세포에 처리하여 각각의 물질이 독성을 나타내는 농도를 확인한 도이고, 도 6의 B는 0부터 2.5, 5.0, 7.5, 10 μM의 농도로 5-FC 또는 5-FU를 H9세포에 처리하여 각각의 물질이 독성을 나타내는 농도를 확인한 도이다.
도 7의 A 내지 C는 렌티바이러스를 사용하여 EGFP또는 CD-EGFP를 293T 세포의 유전체로 삽입시키고 5-FC를 처리하였을 때 CD 유전자가 유전체로 삽입된 293T 세포가 선택적으로 세포사멸이 일어남을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 7의 A는 EGFP또는 CD-EGFP가 유전체에 삽입된 293T 세포에 0, 10, 50 μM 5-FC를 각각 6 일 동안 처리한 후의 세포들의 상태와 EGFP의 발현을 현미경으로 확인한 도이고, 도 7의 B는 EGFP또는 CD-EGFP가 유전체에 삽입된 293T 세포에 0, 10, 50 μM 5-FC를 각각 6일 동안 처리한 후 세포들을 모아 유세포분석을 통해 녹색형광을 나타내는 세포를 계수하여 상대적 값으로 나타낸 도이며, 도 7의 C는 EGFP 또는 CD-EGFP가 유전체에 삽입된 293T 세포에 0, 10, 50 μM 5-FC를 각각 6일 동안 처리한 후 세포의 수를 직접 계수하여 나타낸 도이다.
도 8의 A 및 B는 렌티바이러스를 사용하여 EGFP또는 CD-EGFP를 H9 세포의 유전체로 삽입시키고 5-FC를 처리하였을 때 CD가 유전체로 삽입된 H9 세포가 선택적으로 세포사멸이 일어남을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 8의 A는 EGFP또는 CD-EGFP가 유전체에 삽입된 H9 세포에 50 μM 5-FC를 48시간 동안 처리한 후 세포의 수를 직접 계수하여 나타낸 도이며, 도 8의 B는 EGFP또는 CD-EGFP가 유전체에 삽입된 H9 세포에 50 μM 5-FC를 처리하기 전부터 12시간 간격으로 세포들의 상태를 현미경상으로 확인한 도이다.
도 9의 A 내지 F는 상기 실험에서 선택된 외부유전자-불포함 유도만능줄기세포의 특성을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 9의 A는 CD-iPSC에서 만능성 마커 (pluripotency maker) 단백질의 발현을 확인한 도이며, 도 9의 B는 CD-iPSC를 알칼라인 포스파타아제 염색 (Alkaline phosphatase staining, AP staining)하여 유도만능줄기세포의 특성을 확인한 도이고, 도 9의 C는 CD-iPSC로부터 분화된 배상체 (embryoid body, EB)의 외배엽 (ectoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 내배엽 (endoderm) 마커 단백질의 발현을 확인한 도이고, 도 9의 D는 생쥐의 생체 내에서 외배엽 (ectoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 내배엽 (endoderm)의 분화를 확인한 도이고, 도 9의 E는 CD-iPSC의 핵형 (karyotype) 분석 결과를 나타낸 도이며, 도 9의 F는 리프로그래밍과정 이전의 섬유아세포와 CD-iPSC의 단연쇄반복(Short Tandem Repeat, STR) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 CD-iNSC에 5-FC를 처리하는 경우 유도신경줄기세포 내부에 잔존하는 에피솜 벡터의 양을 확인하고, 선택된 외부유전자-불포함 유도신경줄기세포의 특성을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 10의 A는 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터를 사용하여 만들어진 유도신경줄기세포에 5-FC를 처리하거나 처리하지 않는 경우 잔존하는 에피솜 벡터의 양을 확인한 도이다. 도 10의 B는 상기 도 10의 A에서 선택된 CD-iNSC에서 신경줄기세포 마커 단백질의 발현을 확인한 도이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
외래 유전자를 세포에 도입하여 세포를 리프로그래밍시키는 방법은 재생의약의 자원으로서 특히, 환자 맞춤형 세포를 확보할 수 있는 매우 유용한 방법이다. 2006년 야마나카 그룹에 의해 iPSC 제조 방법이 최초로 개발된 이래로 전세계적으로 리프로그래밍과 관련된 연구 및 임상시험이 매우 활발히 진행되고 있다. 그러나, 세포에 외래 유전자를 도입함으로써, 도입된 유전자 자체가 가지는 암 유발 가능성뿐만 아니라, 외래 DNA가 세포의 유전체 내에 삽입될 수 있어 이로부터 야기되는 암 형성 등의 문제가 꾸준히 제기되고 있다.
이러한 문제를 해결하기 위한 하나의 방법으로, 에피솜 벡터를 이용하여 리프로그래밍 인자를 세포에 도입하는 방법이 개발되었으나, 에피솜 벡터가 도입된 세포로부터 제거되는데 많은 시간이 필요하고, 나아가 세포 내 잔존하는 에피솜 벡터가 세포의 유전체 내에 삽입될 가능성이 있다.
이에, 본 발명자들은 세포를 리프로그래밍시키는데 있어서 에피솜 벡터가 가지는 문제점을 해결하기 위해, 리프로그래밍 인자 및 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 개발하였다. 상기 벡터는 리프로그래밍 인자뿐만 아니라 자살유전자를 발현하므로, 상기 벡터가 도입되어 리프로그래밍된 세포에 자살유전자에 대한 전구약물 (pro-drug)을 처리하여 에피솜 벡터를 포함하는 세포를 빠르게 제거하거나, 리프로그래밍된 세포에 잔존하는 에피솜 벡터를 빠르게 제거함으로써, 외래 DNA를 포함하지 않는 리프로그래밍된 세포를 단기간 내에 확보할 수 있다는 장점이 있다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, (a) (i) 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 (ii) 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 분리된 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 에피솜 벡터가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포를 리프로그래밍시키는 단계; 및 (c) 상기 리프로그래밍된 세포를 전구약물 (pro-drug)이 포함된 배지에서 배양하여 외래 DNA를 포함하지 않는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 세포의 리프로그래밍 방법이다.
본 발명에서 용어, “리프로그래밍 (reprogramming)”은 특정 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴 (global gene expression pattern)을 조절하여, 목적하는 세포로 전환시키는 방법을 의미한다. 다시 말해서, 본 발명에서 리프로그래밍은 세포를 인위적으로 조작하여 전혀 다른 특성을 가지는 세포로 전환시키는 방법을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 리프로그래밍은 외래 유전자 혹은 DNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 수행되는 것일 수 있다. 일례로, 리프로그래밍은 세포의 역분화 (dedifferentiation) 또는 교차분화 (transdifferentiation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 리프로그래밍 방법으로 제조될 수 있는 세포는, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 중간엽줄기세포 등의 줄기세포뿐만 아니라, 뉴런, 췌장 세포, 간 세포, 심근 세포, 골 세포 등 완전히 분화된 세포도 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 목적하는 세포의 종류에 따라 리프로그래밍 인자를 달리하여 제조될 수 있으므로, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "분화"란 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 만능성 줄기세포가 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화이며, 좁게는 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정도 분화에 해당된다.
본 발명에서 용어, "역분화 (dedifferentiation)"는 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 상태로 복원될 수 있는 프로세스를 의미하며, "교차분화 (transdifferentiation)"는 세포가 전혀 다른 특성을 가지는 세포로 전환되는 것을 말한다. 이러한 세포의 역분화 및 교차분화 기작은 핵 내의 후생유전학 (epigenetics, 뉴클레오타이드 서열에서의 변화 없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것일 수 있다.
본 발명에서의 용어 "만능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)"란 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 만능성 (pluripotent)이거나 전능성 (totipotent)이 있는 자가재생산능 (self-renewal)을 갖는 줄기세포를 말하며, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 용어 "배아줄기세포"란, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴 (inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 만능성 (pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미한다.
본 발명에서의 용어 "유도만능줄기세포"란, 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 만능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 induced pluripotent stem cell (iPSC)라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 동일한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, 인 비트로 (in vitro) 및 인 비보 (in vivo)에서 만능성을 가지며, 기형종 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함할 수 있고, 구체적으로는 인간 유래의 유도만능줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 리프로그래밍 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면, 먼저 (a) 단계는 (i) 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 (ii) 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 분리된 세포에 도입하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자 (reprogramming factor)"는 세포에 도입되어 리프로그래밍을 유도할 수 있는 유전자 (혹은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 의미한다. 상기 리프로그래밍 인자는 리프로그래밍을 유도하고자 하는 그 목적 세포에 따라, 그리고 리프로그래밍이 유도되는 분리된 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell)를 제조하는 경우에 있어서 리프로그래밍 인자는, Oct4, Sox2, Klf4, Lin28, C-myc 및 L-myc으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 그 외에도 유도만능줄기세포를 제조할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 모든 인자를 포함할 수 있다. 또한, Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a를 리프로그래밍 인자로서 세포에 도입하여, 도파민성 신경세포로의 교차분화를 유도할 수 있다. 교차분화 방법론에서 Oct4, Sox2, Klf4, Lin28, C-myc과 같은 만능성인자를 이용하는 방법이 있는데, 본 발명의 벡터는 이와 같은 용도로 활용될 수 있다. 따라서, 당업자는 그 목적 세포 및 리프로그래밍되기 전의 세포의 종류에 따라 적절한 인자를 선택할 수 있고, 이는 당업계에 공지된 범위 내에서라면 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것으로, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상술한 바와 같이 리프로그래밍은 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴을 조절하여 목적 세포로의 전환을 유도하는 것이므로, 상기 리프로그래밍 인자가 세포에 도입되고, 세포를 일정 기간 배양함으로써 목적하는 종류의 세포의 유전자 발현 패턴을 가지는 목적 세포로 세포를 리프로그래밍시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "자살유전자"는 무독성인 전구약물 (pro-drug)을 세포독성을 지닌 약물로 전환시키는 활성을 갖는 단백질 (예컨대, 효소)을 코딩하는 유전자를 말한다. 또한, 상기 자살유전자는 무독성인 전구약물 (pro-drug)을 세포독성을 지닌 약물로 전환시키는 활성을 갖는 단백질 (예컨대, 효소)을 코딩하는 기능만 가지고 있으면, 유래에 상관 없이 사용 가능하다. 아울러, 상기 자살유전자 및 단백질은 당업계에서 공지된 것이면 제한 없이 사용가능하며, 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다.
상기 자살유전자는 구체적으로 시토신 디아미나제 (cytosine deaminase, CD), 티미딘 키나아제 (Thymidine kinase) 또는 시토크롬 P450 (Cytochrome P450)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 전구약물은 구체적으로 5-fluorocytosine (5-FC), 간시클로버 (Ganciclovir) 또는 사이클로포스파마이드 (Cyclophosphamide)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는, 자살 유전자 중 시토신 디아미나제 (cytosine deaminase, CD)는 전구약물로 5-fluorocytosine (5-FC)과 반응하고, 티미딘 키나아제 (Thymidine kinase)는 전구약물로 간시클로버 (Ganciclovir)와 반응하고, 시토크롬 P450은 전구약물로 사이클로포스파마이드 (Cyclophosphamide)와 반응할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시토신 디아미나제는 시토신을 기질로 하여 아미노기를 가수분해함으로써 우라실 (uracil)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 시토신 디아미나제는 무독성의 전구약물인 5-fluorocytosine (5-FC)을 반응물로 탈아미노기 반응에 의해 5-FU (5-fluorouracil)을 생성하고, 생성된 5-FU는 RNA와 DNA의 오편입을 일으킴으로써 세포 독성을 나타낼 수 있다. 본 발명에서, 상기 시토신 디아미나제는 구체적으로 사카로마이시스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 에피솜 벡터 (episomal vector)는 비바이러스성 비삽입성 벡터로서, 염색체 내에 삽입되지 않고 벡터에 포함된 유전자를 발현시킬 수 있는 특성을 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상술한 바와 같이 에피솜 벡터를 세포에 도입한 경우에도 장기간 세포 내 잔류하거나, 유전체 내로 삽입되어 문제가 될 수 있어, 본 발명에서는 상기 에피솜 벡터에 리프로그래밍을 유도할 수 있는 리프로그래밍 인자와 함께, 에피솜 벡터를 포함하는 세포를 선택적으로 제거할 수 있도록 자살유전자를 포함시켰다. 본 발명에서 상기 에피솜 벡터를 포함하는 세포는, 에피솜 벡터가 유전체 내에 삽입되거나, 또는 유전체 내에 삽입되지 않은 상태로 세포 내 존재하는 경우를 모두 포함한다. 일례로, 상기 에피솜 벡터는 자살유전자와 함께 하나, 또는 둘 이상의 리프로그래밍 인자를 포함하는 것일 수 있다.
상기 에피솜 벡터는, 구체적으로 Epstein-Barr Virus 기반의 벡터일 수 있고, 더욱 구체적으로 pCXLE 벡터 또는 pCEP4 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 그 목적에 따라 적절한 에피솜 벡터를 선택하여 적용할 수 있다.
상기 에피솜 벡터를 분리된 세포에 도입함으로써, 리프로그래밍 인자 및 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 포함하는 세포를 제조할 수 있으며, 상기 제조된 세포는 도입된 에피솜 벡터에 의해 리프로그래밍 인자 및 자살유전자를 발현할 수 있다. 상기 분리된 세포는 체세포 또는 줄기세포 일 수 있는데, 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있고 그 종류에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 에피솜 벡터의 세포 내 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 세 가지 에피솜 벡터에 자살유전자로서 시토신 디아미나제, 및 리프로그래밍 인자로서 OCT4, 또는 SOX2 및 KLF4, 또는 L-MYC 및 LIN28를 각각 포함하는 에피솜 벡터를 제조하였으며, 이들을 인간 유래 암세포주에 도입하여 각 유전자의 발현을 확인하였다 (도 2).
본 발명의 리프로그래밍 방법에서, (b) 단계는 상기 에피솜 벡터가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포를 리프로그래밍시키는 단계이다. (a) 단계의 에피솜 벡터가 도입된 세포는 배양 과정 중 에피솜 벡터에 의해 발현되는 리프로그래밍 인자에 의해 세포가 리프로그래밍될 수 있다.
본 발명에서 용어, “배양”은 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미하며, 본 발명의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 세포에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
특히, (b) 단계는 리프로그래밍 인자가 도입된 세포를 배양하는 과정이므로, 세포를 배양하는 배지 조성은 리프로그래밍의 목적이 되는 세포, 즉 리프로그래밍 인자의 도입에 의해 제조하고자 하는 세포에 적합한 조성을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 예컨대 본 발명의 리프로그래밍 방법을 이용하여 유도만능줄기세포를 제조하고자 하는 경우라면, (b) 단계의 배지는 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포의 배양에 적합한 배지 조성을 갖는 것일 수 있다. 또한, 신경줄기세포를 제조하고자 하는 경우라면, (b) 단계의 배지는 신경줄기세포의 배양에 적합한 배지 조성을 갖는 것일 수 있다. 이러한 배지 조성은 당업계에 이미 공지된 범위 내에서라면 당업자가 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
특히, 본 발명의 리프로그래밍 방법을 이용하여 유도만능줄기세포를 제조하고자 하는 경우, 상기 배지는 추가적으로 리프로그래밍 효율을 증진시킬 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은, 예를 들어, ALK5 억제제, GSK-3 억제제, HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 니코틴아마이드 (nicotinamide) 등일 수 있고, 구체적으로는 A83-01, CHIR99021, 소듐 뷰티레이트 (Sodium butyrate) 또는 니코틴아마이드 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 리프로그래밍 인자 및 시토신 디아미나제 (cytosine deaminase) 유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 인간 유래 섬유아세포에 도입하고 이를 배양하여, 유도만능줄기세포 (CD-iPSC)를 제작하였다 (도 3). 본 발명에서는, 상기 시토신 디아미나제 유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 도입하여 제조한 유도만능줄기세포를 CD-iPSC로 명명하였다.
본 발명의 리프로그래밍 방법에서, (c) 단계는 상기 (b) 단계를 통해 리프로그래밍된 세포를 전구약물 (pre-drug)을 포함하는 배지에서 배양하여 외래 DNA를 포함하지 않는 세포를 선별하는 단계이다. (c) 단계에서는 세포에 도입된 에피솜 벡터에 포함된 자살유전자가 발현됨으로써, 상기 자살유전자가 코딩하는 단백질에 의해 전구약물이 세포 독성 물질로 전환된다. 이에 따라, 에피솜 벡터의 유전체 삽입이 일어난 세포는 제거되고, 리프로그래밍된 세포 내에 유전체 삽입이 일어나지 않고 잔존하는 에피솜 벡터는 빠르게 제거되어, 에피솜 벡터를 포함하지 않는 세포만을 선별할 수 있다.
자살유전자가 시토신 디아미나제인 경우 상기 전구약물은 5-fluorocytosine (5-FC)일 수 있고, 티미딘 키나아제인 경우 상기 전구 약물은 간시클로비어 (Ganciclovir)일 수 있고, 시토크롬 P450인 경우 상기 전구 약물은 사이클로포스파마이드 (Cyclophosphamide)일 수 있다. 즉, (c) 단계에서 사용되는 전구약물은 자살유전자에 대응하여 결정되는 것으로, 자살유전자에 의해 세포 독성 물질로 전환되어 에피솜 벡터, 즉 외래 DNA의 유전체 삽입이 일어난 세포를 선택적으로 제거할 수 있고, 세포 내에 유전체 삽입이 일어나지 않고 잔존하는 외래 DNA는 빠르게 제거되어, 외래 DNA를 포함하지 않는 세포를 선별할 수 있다.
전구약물로서 5-FC를 사용하는 경우, 상기 5-FC는 배지 내에 20 μM 내지 100 μM, 구체적으로는 50 μM 내지 100 μM 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 5-FC는 세포에 처리한 경우에도 독성을 나타내지 않으나, 자살유전자에 의해 코딩되는 단백질에 의해 5-FU (5-fluorouracil)로 전환되는 경우 세포에 독성을 나타낼 수 있다.
상기 (c) 단계에서 전구약물을 처리하여 에피솜 벡터를 포함하는 세포를 선택적으로 제거하는 과정은, 구체적으로 리프로그래밍된 세포를 1계대 이상, 2계대 이상, 3계대 이상, 또는 4계대 이상 배양하거나, 또는 7일 내지 28일 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 사용되는 세포, 자살유전자, 전구약물 등에 따라 선별에 소요되는 시간은 변경될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 CD-iPSC에서 5-FC의 처리에 의하여 잔존하는 에피솜 벡터의 양이 빠르게 감소함을 확인하였고 (도 4), 시토신 디아미나제가 유전체로 삽입된 인간 유래 암세포주와 인간 유래 배아줄기세포에 5-FC를 처리하여 선택적으로 제거가 가능함을 확인하였으며 (도 7 및 도 8), 상기 과정을 통하여 만들어진 외부유전자를 포함하지 않는 유도만능줄기세포는 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)에서 만능성을 가짐과 동시에 유전체 핵형의 이상이 발견되지 않음을 확인하였다 (도 9).
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 리프로그래밍 인자 및 시토신 디아미나제 (cytosine deaminase) 유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 인간 유래 섬유아세포에 도입하고 이를 배양하여, 유도신경줄기세포를 제작하였다 (도 10). 본 발명에서는, 상기 시토신 디아미나제 유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 도입하여 제조한 유도신경줄기세포를 CD-iNSC로 명명하였다.
CD-iNSC에서 5-FC 처리에 의하여 잔존하는 에피솜 벡터의 양이 빠르게 감소함을 확인하였으며, 상기 과정을 통하여 만들어진 외부유전자를 포함하지 않는 유도신경줄기세포는 대표적인 신경줄기세포 마커 단백질인 PAX6와 N-CADHERIN의 발현을 확인하였으며, 증식의 대표적인 마커 단백질인 KI67의 발현을 확인하였다 (도 10).
일반적으로 에피솜 벡터의 완벽한 제거를 위해서는 최소 10계대 이상의 배양을 한 후에 검증을 하는 것으로 알려져 있으나, 본 발명의 방법을 이용하여 단일세포 수준으로 배양하는 경우에는 1계대만으로도 에피솜 벡터가 제거될 수 있는 바, 외래 DNA를 포함하지 않는 리프로그래밍된 세포를 단기간 내에 확보할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 에피솜 벡터를 사용한 리프로그래밍 방법은 리프로그래밍된 세포에서 빠르게 외래 DNA를 제거할 수 있으므로, 기존의 에피솜 벡터를 이용한 세포 리프로그래밍 방법에 비해, 비용, 시간, 노력 측면에서 장점을 가진다. 나아가, 본 발명의 리프로그래밍 방법을 통해 제조된 유도만능줄기세포 및 유도신경줄기세포는 특정 질환의 기작 연구나 세포 치료제의 개발 용도로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, (i) 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 (ii) 자살유전자인 시토신 디아미나제 (cytosine deaminase, CD)의 유전자를 포함하는, 에피솜 벡터이다.
리프로그래밍 인자, 자살유전자 및 에피솜 벡터에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터의 제작 및 제작된 에피솜 벡터의 기능 확인
<1-1> 시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터의 제작
pCXLE-hOCT4-CD 벡터 (도 2의 A)를 제작하기 위하여 다음과 같은 방법을 사용하였다. OCT4 유전자의 DNA는 pHAGE2-EF1a-hSTEMCCA-W-loxP 벡터로부터 중합효소연쇄반응을 통해 획득하였다. 자살유전자인 시토신 디아미나제 (Cytosine deaminase, CD) 유전자의 DNA는 사카로마이시스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 유전체로부터 중합효소연쇄반응을 통해 획득하였다. 얻어진 두 개의 DNA 단편은 깁슨 조립 반응 키트를 이용해 하나의 단편으로 연결한 다음 (Gibson Assembly reaction kit; New England Biolabs, 미국), 중합효소연쇄반응을 통해 대량 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 정제하여 얻어낸 다음 토포 클로닝 반응을 진행하였다 (pENTRTM Directional TOPO® Cloning Kits; Invitrogen, 미국). 그 다음, 반응물을 키트에 포함되어 있는 대장균 (Escherichia coli) 세포에 형질전환 시키고 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 다음날 나타난 형질전환주 중 일부에서 플라스미드 DNA를 얻었고, 제노텍 사 (GenoTech Corp., 한국)에 시퀀싱을 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 플라스미드 DNA를 LR 클로닝 반응 (Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme Mix; Invitrogen, 미국)을 통해 pCXLE-GW 벡터로 클로닝을 진행하였다. 그 다음, 반응물을 DH5alpha E. coli 세포로 형질전환 시키고 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 다음날 나타난 형질전환주 중 일부에서 플라스미드 DNA를 얻었고, 제노텍 사 (GenoTech Corp., 한국)에 시퀀싱을 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
pCXLE-hSK-CD 벡터 (도 2의 A)를 제작하기 위해서 다음과 같은 방법을 사용하였다. SOX2 와 KLF4 유전자의 DNA는 pHAGE2-EF1a-hSTEMCCA-W-loxP 벡터로부터 중합효소연쇄반응을 통해 획득하였다. 이 후의 단계는 상기 pCXLE-hOCT4-CD 벡터를 제작한 과정과 동일하다.
pCXLE-hUL-CD 벡터 (도 2의 A)의 제작은 엔지노믹스 사(Enzynomics Corp., 한국)에 의뢰하여 제작하였다.
상기 벡터 제작 과정에서 사용한 프라이머의 목록은 하기 표 1에 기재하였다.
프라이머 이름 목적 서열
TOPO-hOCT4-CD-F OCT4 PCR 5'-CACCATGGCGGGACAC-3' (서열번호 1)
GA_Oct_CD_R2 OCT4 PCR 5'-CGCCCTTACCCCTACTCACCAATATCTTCAAACC-3' (서열번호 2)
TOPO-GA-SOX2-P2A-F SOX2-2A PCR 5'-CACCATGTACAACATGAT-3' (서열번호 3)
TOPO-GA-SOX2-P2A-R SOX2-2A PCR 5'-GTCGCTGACAGCCATTGGCCCGGGATTCTCTTCGACAT-3' (서열번호 4)
TOPO-GA-P2A-KLF4-IRES-F KLF4-IRES PCR 5'-GAGAATCCCGGGCCAATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCT-3' (서열번호 5)
TOPO-GA-P2A-KLF4-IRES-R KLF4-IRES PCR 5'-TCCCCCTGTCACCATCATATGTGTGGCCATATTATCAT-3' (서열번호 6)
TOPO-GA-IRES-CD-F IRES-CD PCR 5'-ATGGTGACAGGGGGAATG-3' (서열번호 7)
TOPO-GA-IRES-CD-R IRES-CD PCR 5'-CTACTCACCAATATCTTCAAACCA-3' (서열번호 8)
<1-2> 제작된 에피솜 벡터의 기능 확인
만들어진 에피솜 벡터의 기능을 인간 세포에서 확인하기 위하여 293T 세포에 각각의 에피솜 벡터를 형질 전환하고 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 확인하였다.
구체적으로, 293T 세포를 10% FBS (fetal bovine serum; Invitrogen 사, 미국)을 포함하는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle`s medium, DMEM; Invitrogen 사, 미국)에서 배양하였다. 각각의 에피솜 벡터 500 ng을 TransIT 2020 reagent (Mirus, 미국)를 사용하여 제조사의 제공된 프로토콜을 따라 293T 세포에 형질전환하였다. 3일 간의 배양 후, RNeasy 미니 플러스 키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 제조사의 제공된 프로토콜을 따라 배양한 세포로부터 RNA를 추출하였다. 그 다음, iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad, 미국)를 사용하여 제조사의 제공된 프로토콜을 따라 cDNA를 합성하였다. 하기 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 산물은 2% 아가로즈 겔에서 확인하였다. 대조군으로, 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 포함하지 않는 실험을 수행하였고 상기와 동일한 방법을 사용하여 PCR을 수행하고 2% 아가로즈 겔에서 확인하였다.
타겟 유전자 정방향 서열 역방향 서열
OCT4 5'-GAGGAGTCCCAGGACATCAA-3' (서열번호 9) 5'-AATAGAACCCCCAGGGTGAG-3' (서열번호 10)
SOX2 5'-GCCGAGTGGAAACTTTTGTCG-3' (서열번호 11) 5'-GGCAGCGTGTACTTATCCTTCT-3' (서열번호 12)
KLF4 5'-CCCACATGAAGCGACTTCCC-3' (서열번호 13) 5'-CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA-3' (서열번호 14)
yCD 5'-TGACAGGGGGAATGGCAAGC-3' (서열번호 15) 5'-ACATCCGCCAATAGGAACACCAC-3' (서열번호 16)
GAPDH 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (서열번호 17) 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (서열번호 18)
LIN28 5'-TGCGGGCATCTGTAAGTGG-3' (서열번호 19) 5'-GGAACCCTTCCATGTGCAG-3' (서열번호 20)
L-MYC 5'-CTGCGGGGAGGATTTCTACC-3' (서열번호 21) 5'-CATGCAGTCACGGCGTATGAT-3' (서열번호 22)
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 각각의 에피솜 벡터가 포함하는 유전자가 인간 유래 세포에서 잘 발현되는 것을 확인하였다 (도 2의 B).
실시예 2 : 시토신 디아미나제 (Cytosine deaminase )를 포함하는 에피솜 벡터를 사용한 유도만능줄기세포제작
<2-1> 유도만능줄기세포의 제작
인간 섬유아세포주인 CRL2097 (ATCC, 미국)은 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen, 미국) 및 1 mM L-글루타민 (Invitrogen, 미국)을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 유도만능줄기세포의 제작을 위하여 500 ng의 에피솜 벡터 혼합물 (pCXLE-hOCT4-CD, pCXLE-hSK-CD 및 pCXLE-hUL)을 100,000개의 CRL2097세포에 Neon-electroporator (Invitrogen, 미국)를 사용하여 전기 천공법으로 형질전환시켰다. 전기 천공법은 1,650 V, 10 ms, 3 pulses 조건에서 수행하였다. 형질 전환된 CRL2097 세포는 1시간 동안 젤트렉스로 (Geltrex; Invitrogen, 미국)코팅한 6-웰 플레이트에 접종하였다. 5일 동안 배양한 다음 CRL2097 배양 배지에서 리프로그래밍 배지로 교체하였다. 리프로그래밍 배지는 1 mM 니코틴아마이드 (Nicotinamide, Sigma-Aldrich, 미국), 0.5 μM A83-01 (Tocris Bioscience, 영국), 3.0 μM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 영국), 및 0.2 mM 소듐 뷰티레이트 (Sodium butyrate, Sigma-Aldrich, 미국)를 포함하는 mTeSR-1 (Stemcell Technologies, 미국) 배지를 사용하였다. 만들어진 유도만능줄기세포의 콜로니는 분리하여 젤트렉스로 코팅된 4-웰 플레이트로 옮긴 후, TeSR-E8 (Stemcell Technologies, 미국) 배지를 기본으로 하여 추가로 시토신 (Sigma-Aldrich, 미국)이 포함되거나 포함되지 않은 배지를 사용하여 증식 배양하였다. 본 발명자들은 상기 과정으로 만들어진 유도만능줄기세포를 CD-iPSC로 명명하였다.
상기 과정의 간략한 모식도를 도 3에 나타내었다 (도 3).
실시예 3 : 유도만능줄기세포에 잔존하는 에피솜 벡터의 제거
<3-1> 5-FC 처리를 통한 에피솜 벡터의 제거 및 잔존하는 에피솜 벡터 확인
시토신 디아미나제를 포함하거나 포함하지 않는 에피솜 벡터를 사용해 제작된 유도만능줄기세포를 분리 하고, 각각 0, 10, 50 μM 5-FC (Abcam, 미국)를 포함한 TeSR-E8배지를 사용해 배양하였다. 그 다음 각각의 세포들을 Accutase (Millipore, 독일)를 사용해 세포배양접시에서부터 분리하고 다시 젤트렉스로 코팅한 세포배양접시로 계대하였다. 계대는 5 내지 7일 간격으로 수행하였고, 계대하는 과정에서 남은 세포들은 DNA를 얻기 위한 목적으로 회수하였다.
세포가 가지고 있는 전체 DNA를 획득하기 위하여 계대과정에서 남은 세포들을 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 남아있는 세포는 DirectPCR Lysis Reagent (Viagen, 미국)를 사용하여 재현탁하고 proteinase K (Invitrogen, 미국)을 추가로 넣고 56 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 만들어진 반응물은 -20 ℃에 보관하고 정량분석 중합효소연쇄반응 (Quantitative PCR analysis, qPCR)에 사용하였다.
에피솜 벡터의 수를 결정하기 위하여 pCXLE-hFbx15-cont2 벡터를 사용하여 FBXO15와 EBNA-1에 대한 표준곡선을 만들었다. 각각의 샘플에서 관찰된 Ct (Threshold cycle)값은 FBXO15와 EBNA-1의 개수를 추정하는데 사용하였다. 한 번의 qPCR반응에서 사용된 세포의 수를 계산하기 위해 FBXO15는 세포당 2개의 대립유전자 (Allele)를 갖기 때문에 측정된 값을 마지막에 2로 나누어 계산하였다. 세포당 에피솜 벡터의 개수는 측정된 EBNA-1의 전체 개수를 사용된 세포의 수로 나누어 계산하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 50 μM 5-FC를 처리한 조건에서 4번의 계대배양 (약 20~28일) 이전에 모든 에피솜 벡터가 제거된 것을 확인하였다 (도 4의 B). 대조군으로, 같은 조건에서 0 μM 5-FC를 처리한 조건에서는 6번 이상의 계대배양 (약 30~42일)에서도 계속해서 잔존하는 에피솜 벡터가 나타남을 확인하였으며, 시토신 디아미나제를 포함하지 않는 조건에서 제작된 유도만능줄기세포의 경우 50 μM 5-FC를 처리하더라도 에피솜 벡터가 빠져나가는 속도는 증가하지 않았다 (도 4의 A).
<3-2> 단일 세포 수준의 배양을 통한 에피솜 벡터의 제거 및 잔존하는 에피솜 벡터 확인
시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터를 사용해 제작된 유도만능줄기세포를 분리 하고, 단일 세포 수준에서 각각 0, 50 μM 5-FC (Abcam, 미국)를 포함한 TeSR-E8배지를 사용해 배양하였다. 계대는 7일 간격으로 수행하였고, 계대하는 과정에서 남은 세포들은 DNA를 얻기 위한 목적으로 회수하였다. 이 후의 과정은 상기 실시예 <3-1>의 과정과 동일하다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 50 μM 5-FC를 처리한 조건에서 1~2번의 계대배양 (7~14일) 이전에 모든 에피솜 벡터가 제거된 것을 확인하였다 (도 5). 대조군으로, 같은 조건에서 0 μM 5-FC를 처리한 조건에서는 동일한 시간에서 잔존하는 에피솜 벡터가 나타남을 확인하였다 (도 5). 일반적으로 에피솜 벡터의 완벽한 제거를 위해서는 최소 10계대 이상 (약 70일)의 배양 후에 검증을 하기 시작하는 것으로 보고되고 있다.
<3-3> 5-FC와 5-FU의 농도에 따른 배아줄기세포에서의 독성 확인
5-FC의 처리가 배아줄기세포에 독성을 일으키는지 확인하기 위하여 여러 가지 농도로 5-FC를 인간 배아줄기세포인 HuES9 세포 및 H9 세포에 처리하였다. 5-FC가 시토신 디아미나제에 의해 5-FU로 변환되고 독성을 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에 5-FU (Sigma-Aldrich, 미국)를 대조군으로 사용하였다.
배아줄기세포를 96-웰 플레이트에 접종시키고, 다음날부터 여러 가지 농도의 5-FC 혹은 5-FU를 배양배지에 첨가하여 48시간 동안 처리하였다. 5-FC와 5-FU의 세포독성을 측정하기 위하여 WST-1 세포증식 측정 시스템 (WST-1 cell proliferation assay system; Takara, 일본)을 사용하였다.
그 결과, HuES9 세포와 H9 세포에서 5-FU는 세포독성을 나타내는 반면, 5-FC는 독성이 나타나지 않음을 확인하였다 (도 6). 이는 상기 실시예 <3-1>과 <3-2>에서 사용한 5-FC의 농도가 독성을 나타내지 않는 범위에 있음을 증명한 것이다.
실시예 4 : 시토신 디아미나제가 유전체에 삽입된 세포의 선택적인 세포 사멸 유도
<4-1> 렌티바이러스의 제작
렌티바이러스를 제작하기 위하여 포장 벡터인 psPAX2 (Addgene, 미국), 외피 벡터인 pMD2.G (Addgene, 미국)와 발현 벡터로 CD-EGFP 또는 EGFP를 포함한 pLX301　(Addgene, 미국)과 CD를 포함하거나 포함하지 않은 pWPXL (Addgene, 미국)을 사용하였다. 렌티바이러스의 제작은 8.75 μg 발현 벡터, 3.75 μg 외피 벡터 및 2.5 μg 포장 벡터를 TransIT-2020 Reagent (Mirus, 미국)를 사용해 293T 세포에 동시핵산전달감염 (Co-transfection)시키는 방법을 이용하여 수행하였다. 동시핵산전달감염을 수행하고 24 시간이 지난 후 신선한 배지로 교체해 주었으며, 48시간, 72시간째에 전체 세포 배양액을 수집하여 렌티바이러스 입자를 획득하였다. 획득한 렌티바이러스 입자는 25,000 rpm의 속도로 4 ℃에서 2시간 동안 초원심분리를 통해 농축하여 -80 ℃에서 사용 직전까지 보관하였다.
<4-2> 5- FC의 처리에 따른 시토신 디아미나제가 유전체에 삽입된 293T 세포의 선택적 세포 사멸의 확인
인간의 세포에서 시토신 디아미나제와 5-FC의 처리에 의하여 세포 사멸이 유도되는지 확인하기 위하여, 293T 세포에 상기 실시예 <4-1>의 방법으로 제작한 렌티바이러스를 사용해 EGFP와 CD-EGFP를 각각 형질도입시켰다. 12-웰 플레이트에 각각의 유전자가 형질도입된 세포를 접종하였고, 다음날 5-FC가 포함되어 있는 배양 배지로 교체하였다. 각각의 형질도입된 세포에서 EGFP를 발현하는 세포를 계수하기 위하여 형광표지세포분리기 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)를 사용하였다. 구체적으로, 아큐타제 (Accutase; Milipore, 독일)를 37 ℃에서 10분 이상 처리하여 293T 세포를 단일 세포로 분리하고 DPBS (Welgene, 한국)로 세척하고 원심분리 하였다. 재현탁한 293T 세포의 수를 자동 세포 계수기 (Invitrogen, 미국)를 통해 측정하였고, FACS 분석을 위하여 샘플당 200,000개의 세포를 준비하였다. FACSCalibur flow cytometer (BD, 미국)를 사용하여 분석을 진행하였고, 실험 결과는 FlowJo 10.1 소프트웨어를 통해 정리하였다.
그 결과, CD-EGFP를 발현하는 세포에 50 μM 5-FC를 처리한 조건에서만 EGFP를 발현하는 세포의 수가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다 (도 7의 A 및 B). 대조군으로 사용한 EGFP를 발현하는 세포에서는 50 μM 5-FC를 처리하더라도 EGFP를 발현하는 세포의 수가 변화하지 않음을 확인하였다. 또한, 세포의 수를 계수하는 과정에서 CD-EGFP를 발현하는 세포에 50 μM 5-FC를 처리한 조건에서 살아있는 세포의 수가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다 (도 7의 C).
<4-3> 5- FC의 처리에 따른 시토신 디아미나제가 유전체에 삽입된 배아줄기세포의 선택적 세포 사멸의 확인
배아줄기세포에서도 293T 세포와 동일하게 시토신 디아미나제와 5-FC의 처리에 의하여 세포 사멸이 유도되는지 확인하기 위하여, H9 세포에 상기 실시예 <4-1>의 방법으로 제작한 렌티바이러스를 사용해 EGFP와 CD-EGFP를 형질도입 시켰다. 12-웰 플레이트에 각각의 유전자가 형질도입된 세포를 접종하였고, 이틀 후 5-FC가 포함되어 있는 배양 배지로 교체하였다.
그 결과, CD-EGFP를 발현하는 세포에 50 μM 5-FC를 처리한 조건에서 48시간이 경과하였을 때 살아있는 세포의 수가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다 (도 8의 A 및 B). 대조군으로 사용한 EGFP를 발현하는 세포에서는 50 μM 5-FC를 처리한 조건에서 세포가 자라는 것을 확인하였다 (도 8의 A 및 B).
실시예 5 : 외래 DNA를 포함하지 않는 ( exogene -free) 유도만능줄기세포의 특성 확인
<5-1> 선별된 유도만능줄기세포의 만능성 (Pluripotency) 확인
섬유아세포로부터 유래된 미분화 상태의 CD-iPSC가 만능성을 나타내는지 확인하기 위하여, CD-iPSC에서 만능성 마커 (pluripotency maker) 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 선택한 CD-iPSC에 16% 파라포름알데히드 (Paraformaldehyde; Electron microscopy science, 미국)를 DPBS에 희석하여 4%로 만든 용액을 처리하여 실온에서 10분간 반응시켜 고정하고, 3% BSA (Bovine serum albumin; Invitrogen, 미국), 0.3% 트리톤 X-100 (Triton X-100; Sigma-Aldrich, 미국)을 포함하는 PBS 용액을 1시간 처리하여 세포막에 투과성 (Permeability)을 부여하였다. 처리 후, 1% BSA에 1차 항체로 항-OCT4 항체(1 : 500 희석, Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-NANOG 항체 (1 : 70 희석, R&D systems, 미국), 항-TRA-1-81 항체 (1 : 500 희석, Milipore, 독일), 항-SSEA3 항체 (1 : 500 희석, Milipore, 독일), 항-SSEA4 항체 (1 : 500 희석, Milipore, 독일), 항-TRA-1-60 항체 (1 : 500 희석, Millipore, 독일)를 각각 처리하여 4 ℃에서 밤새 방치하였다. 0.1% BSA로 3회 세척하고, 알렉사 플루오르 488 (Alexa Fluor 488) 또는 알렉사 플루오르 594 (Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체 (Invitrogen, 미국)를 처리하고 1시간 동안 실온에서 방치하여 CD-iPSC를 면역형광염색하고, 형광 현미경 (fluorescence microscope)으로 관찰하여 OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-80 및 TRA-1-61 단백질의 발현을 확인하였다. Hoechst33342 (Invitrogen, 미국)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여 비교하였다.
그 결과, CD-iPSC에서 만능성 마커인 OCT4, NANOG, TRA-1-81, SSEA3, SSEA4 및 TRA-1-60 단백질이 발현되는 것을 확인하였다 (도 9의 A).
<5-2> CD-iPSC의 AP (Alkaline phosphatase) 염색
섬유아세포로부터 유래한 CD-iPSC의 특성을 확인하기 위하여, 만능성줄기세포의 특성을 확인하는 방법 중 하나인 알칼라인 포스파타아제 염색 (Alkaline phosphatase staining, AP staining)을 실시하였다.
구체적으로, AP 염색 키트 (Alkaline phosphatase kit; Sigma Aldrich, 미국)를 사용하였다. 상기 실시예 3에서 선택한 CD-iPSC에 10% 포르말린 (Formalin; Sigma Aldrich, 미국)을 고정 용액 (Fixative solution)으로 가하여 30초 동안 상온에서 반응시켰다. 고정된 세포는 TBST로 1회 세척하였다. 그 다음, 질산나트륨 용액 (Sodium nitrate solution) 10 ㎕ 및 FRV-알칼린 용액 (FRV-alkaline solution) 10 ㎕과 혼합하여 2분 동안 방치한 뒤, 0.15% 염화나트륨 (Sodium chloride, Sigma-Aldrich, 미국)이 포함된 300 ㎕ 멸균수 및 Naphthol AS-BI 알칼리 용액 10 ㎕을 첨가하여 AP 염색 혼합액을 제조하였다. 고정된 CD-iPSC는 상기 준비한 AP 염색 혼합액을 넣고 호일로 감싸 빛을 차단하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후, PBS로 2회 세척하였고 AP 염색된 세포를 위상차 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, CD-iPSC는 AP에 양성 염색됨을 확인하였다(도 9의 B).
<5-3> 시험관 내 ( In vitro )에서 CD-iPSC의 삼배엽성 분화능 확인
CD-iPSC 유래 배상체 (CD-배상체)의 분화능을 확인하기 위하여, CD-배상체에서 외배엽 (ectoderm) 마커 단백질인 TUJ1, OTX2, 내배엽 (endoderm) 마커 단백질인 FOXA2, AFP, 및 중배엽 (mesoderm) 마커 단백질인 ASMA, BRACHYURY의 발현을 확인함으로써, 삼배엽성(three germ layer) 마커 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, CD-iPSC의 콜로니를 10% 혈청 대체물 (serum replacement, SR)을 포함하는 DMED/F12 배지인 배상체 분화 배지 (embryoid body differentiation medium)에서 7일간 배양하여 CD-배상체로 분화를 유도하였다. 이 후 젤트렉스로 코팅된 플레이트위로 CD-배상체를 접종하고 추가로 7일간 배양하여 분화를 유도하였다. 분화된 세포에 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 면역형광염색을 수행하여 TUJ1, OTX2, ASMA, BRACHYURY, AFP 또는 FOXA2 단백질의 발현을 확인하였다. 상기 면역형광염색을 위한 1차 항체로서 항-TUJ1 항체 (1:5000 희석; PRB-435P, Covance, 미국), 항-OTX2 항체 (1:100 희석; ab21990, Abcam, 미국), 항-ASMA 항체 (1:200 희석; A5228, Sigma-aldrich, 미국), 항-BRACHYURY 항체 (1:300 희석; sc-17745, Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-AFP 항체 (1:400 희석; A0008, Dako, 미국) 또는 항-FOXA2 항체 (1:100 희석; AF2400, R&D systems, 미국) 를 각각 사용하였고, 발현의 정도를 대조하기 위해 Hoechst33342를 처리하여 세포의 핵을 염색하여 비교하였다.
그 결과, CD-iPSC로부터 분화된 세포는 TUJ1, OTX2, ASMA, BRACHYURY, AFP 또는 FOXA2 단백질의 삼배엽성 마커를 모두 발현하므로, CD-iPSC가 만능성을 가지는 것을 확인하였다 (도 9의 C).
<5-4> 생체 내 ( In vivo )에서 CD-iPSC의 삼배엽성 분화능 확인
CD-iPSC의 분화능을 확인하기 위하여, 생쥐로 세포이식 후 기형종의 생성 여부를 확인하였다.
구체적으로 CD-iPSC를 nonobese diabetic/severe combined immunodeficient 생쥐의 어깨부근에 이식하였다. 12주 후 생성된 기형종을 분리하여 10% formalin (Sigma-Aldrich, 미국)으로 고정한 다음 파라핀블럭을 제작하였다. 제작한 블럭으로 부터 조직의 절편을 얻었으며, 헤마톡실린/이오신 염색을 통해 세포 및 특정 조직의 특징을 확인하였다.
그 결과, 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 세포가 하나의 기형종 조직안에 형성되어 있음을 관찰하였고, 이를 통해 CD-iPSC가 삼배엽성 분화능을 가지는 것을 확인하였다 (도 9의 D).
<5-5> 유전체 핵형 분석
5-FC를 처리하여 선별된 CD-iPSC가 상기 실시예의 과정 중 유전체의 이상이 발생하지 않았음을 확인하기 위하여 다음의 분석을 실시하였다. 젠딕스 사 (GenDix Inc., 한국)에 의뢰하여 염색체 G-결합 분석 (Chromosomal G-banding analysis)을 통해 핵형 분석을 수행하였다.
그 결과, 선별된 CD-iPSC는 정상적인 인간의 핵형을 나타내는 것을 확인하였다 (도 9의 E).
<5-6> CD-iPSC의 STR (Short tandom repeat) 분석
선별된 CD-iPSC가 시작세포인 섬유아세포에서부터 제작된 세포임을 확인하기 위하여 STR 분석을 실시하였다.
섬유아세포주 (CRL2097)와 CD-iPSC로부터 각각 유전체 DNA를 분리한 다음 휴먼패스 사 (HumanPass Inc., 한국)에 의뢰하여 섬유아세포주 및 CD-iPSC의 STR 유전형질 분석 (STR genotyping)을 수행하였다.
그 결과, CD-iPSC와 리프로그래밍 이전의 섬유아세포주의 STR 분석 결과가 동일하게 나타났으며, 이로부터 선별된 CD-iPSC는 시작세포로부터 기원하였음을 확인하였다 (도 9의 F).
실시예 6 : 시토신 디아미나제 (Cytosine deaminase )를 포함하는 에피솜 벡터를 사용한 유도신경줄기세포제작
<6-1> 유도신경줄기세포의 제작
인간 섬유아세포주인 CRL2097 (ATCC, 미국)은 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen, 미국) 및 1 mM L-글루타민 (Invitrogen, 미국)을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 유도신경줄기세포의 제작을 위하여 10 μg의 에피솜 벡터 혼합물 (pCXLE-hOCT4-CD, pCXLE-hSK-CD 및 pCXLE-hUL-CD)을 2,000,000개의 CRL2097세포에 NEPA21 Super Electroporator (Nepagene, 일본)를 사용하여 전기 천공법으로 형질전환시켰다. 형질 전환된 CRL2097 세포는 1시간 동안 젤트렉스로 (Geltrex; Invitrogen, 미국)코팅한 6-웰 플레이트에 접종하였다. 3일 동안 배양한 다음 CRL2097 배양 배지에서 리프로그래밍 배지로 교체하였다. 리프로그래밍 배지는 Advanced DMEM/F-12 (Invitrogen, 미국)와 Neurobasal medium (Invitrogen, 미국)을 1:1로 섞은 배지에 0.05% AlbuMAX-I (Invitrogen, 미국), 1x N2 (Invitrogen, 미국), 1x B27 without vitamin A (Invitrogen, 미국), 1 mM Glutamax (Invitrogen, 미국), 0.11 mM β-머캡토 에탄올 (β-mercaptoethanol; Sigma-Aldrich, 미국), 0.5 μM A83-01 (Tocris Bioscience, 영국), 3.0 μM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 영국), 0.2 mM 소듐 뷰티레이트 (Sodium butyrate, Sigma-Aldrich, 미국), 및 10 ng/ml human LIF (Peprotech, 미국)를 더하여 사용하였다. 만들어진 유도신경줄기세포의 콜로니는 분리하여 젤트렉스로 코팅된 4-웰 플레이트로 옮긴 후, 리프로그래밍 배지에서 소듐 뷰티레이트만을 제외한 배지를 사용하여 증식 배양하였다. 본 발명자들은 상기 과정으로 만들어진 유도신경줄기세포를 CD-iNSC로 명명하였다.
실시예 7 : 유도신경줄기세포에 잔존하는 에피솜 벡터의 제거
<7-1> 5- fluorocytosine (5- FC ) 처리를 통한 에피솜 벡터의 제거 및 잔존하는 에피솜 벡터 확인
시토신 디아미나제를 포함하는 에피솜 벡터를 사용해 제작된 유도신경줄기세포를 분리 하고, 각각 0, 50 μM 5-FC (Abcam, 미국)를 포함한 배지를 사용해 배양하였다. 그 다음 각각의 세포들을 Accutase (Millipore, 독일)를 사용해 세포배양접시에서부터 분리하고 다시 젤트렉스로 코팅한 세포배양접시로 계대하였다. 계대는 7일 간격으로 수행하였고, 계대하는 과정에서 남은 세포들은 DNA를 얻기 위한 목적으로 회수하였다.
이후의 과정은 상기 실시예 <3-1> 과 동일하다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, 50 μM 5-FC를 처리한 조건에서 2번의 계대배양(14일) 이전에 모든 에피솜 벡터가 제거된 것을 확인하였다. 대조군으로, 같은 조건에서 0 μM 5-FC를 처리한 조건에서는 3번 이상의 계대배양 (21일)에서도 계속해서 잔존하는 에피솜 벡터가 나타남을 확인하였다 (도 10의 A).
<7-2> 선별된 유도신경줄기세포의 특성 확인
섬유아세포로부터 유래된 CD-iNSC가 신경줄기세포의 특성을 나타내는지 확인하기 위하여, CD-iNSC에서 신경줄기세포 마커 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 7-1>에서 선택한 CD-iNSC에 16% 파라포름알데히드 (Paraformaldehyde; Electron microscopy science, 미국)를 DPBS에 희석하여 4%로 만든 용액을 처리하여 실온에서 10분간 반응시켜 고정하고, 3% BSA (Bovine serum albumin; Invitrogen, 미국), 0.3% 트리톤 X-100 (Triton X-100; Sigma-Aldrich, 미국)을 포함하는 PBS 용액을 1시간 처리하여 세포막에 투과성 (Permeability)을 부여하였다. 처리 후, 1% BSA에 1차 항체로 항-PAX6 항체(1 : 100 희석, Covance, 미국), 항-KI67 항체 (1 : 200 희석, BD, 미국) 및 항-N-CADHERIN 항체 (1 : 200 희석, Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 각각 처리하여 4 ℃에서 밤새 방치하였다. 0.1% BSA로 3회 세척하고, 알렉사 플루오르 488 (Alexa Fluor 488) 또는 알렉사 플루오르 594 (Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체 (Invitrogen, 미국)를 처리하고 1시간 동안 실온에서 방치하여 CD-iNSC를 면역형광염색하고, 형광 현미경 (fluorescence microscope)으로 관찰하여 PAX6, KI67 및 N-CADHERIN 단백질의 발현을 확인하였다. Hoechst33342 (Invitrogen, 미국)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여 비교하였다.
그 결과, CD-iNSC에서 신경줄기세포 마커인 PAX6, KI67 및 N-CADHERIN 단백질이 발현되는 것을 확인하였다 (도 10의 B).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. (a) (i) 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 (ii) 자살유전자를 포함하는 에피솜 벡터를 분리된 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 에피솜 벡터가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포를 리프로그래밍시키는 단계; 및
    (c) 상기 리프로그래밍된 세포를 도입된 자살유전자에 대한 전구약물 (pro-drug)이 포함된 배지에서 배양하여 외래 DNA를 포함하지 않는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 세포의 리프로그래밍 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 Oct4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-myc으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 자살유전자는 시토신 디아미나제 (cytosine deaminase, CD), 티미딘 키나아제 (thymidine kinase) 및 시토크롬 P450 (cytochrome P450)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 자살유전자는 사카로마이시스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래인 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전구약물은 5-fluorocytosine (5-FC), 간시클로버 (Ganciclovir) 및 사이클로포스파마이드 (Cyclophosphamide)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포는 체세포 또는 줄기세포인 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍은 세포의 역분화 (dedifferentiation) 또는 교차분화 (transdifferentiation)인 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 에피솜 벡터는 pCXLE 벡터 또는 pCEP4 벡터인 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 배지는 ALK5 억제제, GSK-3 억제제, HDAC (histone deacetylase) 억제제 및 니코틴아마이드 (nicotinamide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 5-FC는 배지 내에 20 μM 내지 100 μM 농도로 포함된 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 7 내지 28 일 동안 수행되는 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 리프로그래밍된 세포를 단일세포 수준으로 1 계대 이상 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. (i) 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor) 및 (ii) 자살유전자를 포함하는, 에피솜 벡터.
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