ES2539487T3 - Reprogramación episómica con compuestos químicos - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para producir una población de células iPS humanas capaces de diferenciarse hasta células o tejidos completamente diferenciados, en el que las células iPS están sustancialmente exentas de elementos genéticos exógenos, que comprende: a) obtener células somáticas que comprenden un elemento genético extracromosómico que expresa uno o más factores de reprogramación; b) cultivar las células somáticas y las células de la progenie de las mismas en una condición de reprogramación que comprende el inhibidor de GSK-3 añadido externamente y al menos uno de inhibidor de MEK, e inhibidor de receptores de TGF-β, por lo que se produce una población de células iPS; y c) expandir la población de células iPS en una condición de expansión que tiene un medio de expansión básicamente exento de inhibidor de GSK-3, inhibidor de MEK, e inhibidor de receptores de TGF-β añadidos externamente.

Description

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células iPS básicamente exentas de elementos genéticos exógenos y, por lo tanto, evitar los problemas provocados por la persistencia o los efectos mutagénicos de los elementos genéticos exógenos y la variabilidad o los efectos indeseados de las células de soporte.
También se describen más adelante los avances adicionales en la composición y los métodos para la producción de poblaciones de células iPS.
II. Definiciones
Una "célula primaria", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula obtenida directamente a partir de un organismo vivo o a la progenie de la misma sin establecerla o inmovilizarla en una línea celular. Una "célula primaria humana" se refiere a una célula primaria obtenida a partir de un sujeto humano vivo.
Las "células madre embrionarias (ES)" son células madre pluripotentes obtenidas de embriones tempranos. Se estableció una célula ES por primera vez en 1981, lo que también se ha aplicado a la producción de ratones con genes inactivados desde 1989. En 1998 se estableció una célula ES humana, lo cual ya está disponible en la actualidad para la medicina regenerativa.
Las "células madre pluripotentes inducidas", habitualmente abreviadas como células iPS o iPSCs, se refieren a un tipo de célula madre pluripotente preparada de manera artificial a partir de una célula que no es pluripotente, en general una célula somática de adulto, o célula diferenciada de manera terminal, tal como fibroblasto, una célula hematopoyética, un miocito, una neurona, una célula epidérmica, o similares, mediante reprogramación.
La "pluripotencia" se refiere a una célula madre que tiene la capacidad de diferenciarse hasta todas las células que constituyen uno o más tejidos u órganos, o, preferiblemente, cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (recubrimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, urogenital), o ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso). Las "células madre pluripotentes" usadas en la presente memoria se refieren a células que se pueden diferenciar hasta células derivadas de cualquiera de las tres capas germinales, por ejemplo, descendientes directos de células totipotentes, células madre embrionarias, o células pluripotentes inducidas.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "célula somática" se refiere a cualquier célula distinta de las células germinales, tal como un óvulo, un espermatozoide, o similares, que no transfieren directamente su ADN a la siguiente generación. En general, las células somáticas tienen una pluripotencia limitada o nula. Las células somáticas usadas en la presente memoria pueden ser naturales o genéticamente modificadas.
La "reprogramación" es un proceso que confiere a una célula una capacidad incrementada medible de formar una progenie de al menos un tipo celular nuevo, en cultivo o in vivo, respecto de la que tendría en las mismas condiciones sin la reprogramación. De manera más específica, la reprogramación es un proceso que confiere a una célula somática un potencial pluripotente. Esto significa que, tras una proliferación suficiente, una proporción medible de la progenie tiene las características fenotípicas del tipo celular nuevo si básicamente no se pudiera formar tal progenie antes de la reprogramación; de otra forma, la proporción que tiene las características del tipo celular nuevo es mayor de manera medible que antes de la reprogramación. En ciertas condiciones, la proporción de progenie con características del tipo celular nuevo puede ser al menos alrededor del 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 25% o más en orden de preferencia creciente.
Las células están "sustancialmente exentas" de elementos de vectores o elementos genéticos exógenos, tal como se usa en la presente memoria, cuando tienen menos del 10% de el/los elemento(s), y están "básicamente exentas" de elementos de vectores o elementos genéticos exógenos cuando tienen menos del 1% de el/los elemento(s). Sin embargo, son aún más deseables las poblaciones de células en las que menos del 0,5% o menos del 0,1% de la población total de células comprende elementos de vectores o elementos genéticos exógenos. Los medios están "básicamente exentos" de ciertos reactivos, tales como inhibidores de MEK, inhibidores de GSK, inhibidores de receptores de TGF-β, LIF, cuando el medio tiene un nivel de estos reactivos menor de un nivel detectable mediante el uso de los métodos de detección convencionales conocidos para una persona de experiencia habitual en la técnica.
El término "exógeno", cuando se usa con relación a una proteína, gen, ácido nucleico, polinucleótido, elementos genéticos, o elementos de vectores en una célula u organismo, se refiere a una proteína, gen, ácido nucleico, polinucleótido, elemento genético o elemento de vector que se ha introducido en la célula u organismo mediante medios artificiales o naturales, o con relación a una célula, se refiere a una célula que se aisló y posteriormente se introdujo en otras células o en un organismo mediante medios artificiales o naturales. Un ácido nucleico exógeno puede ser de un organismo o célula diferente, o puede ser una o más copias adicionales de un ácido nucleico que se da de manera natural dentro del organismo o célula. Una célula exógena puede ser de un organismo diferente, o puede ser del mismo organismo. A modo de ejemplo no limitante, un ácido nucleico exógeno está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales, o está flanqueado de otra manera por una secuencia de ácido nucleico diferente de la que se halla en la naturaleza.
Un "origen de replicación" ("ori") es una secuencia de ADN, p.ej., en un herpesvirus linfotrópico, que cuando está 9
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células son prescindibles para la función de actuación en trans de EBNA-1 asociada a oriP (Yates et al. 1985; Kennedy et al. 2003). Por lo tanto, en una realización se podría usar la forma abreviada de EBNA-1, conocida como deltaUR1, al lado de oriP dentro de este sistema basado en vector episómico.
En ciertos aspectos, un derivado de EBNA-1 que se puede usar en la invención es un polipéptido que, respecto de un polipéptido de tipo natural correspondiente, tiene una secuencia de aminoácidos modificada. Las modificaciones incluyen la deleción, inserción o sustitución de al menos un residuo de aminoácido en una región correspondiente a la región única (los residuos alrededor de 65 a alrededor de 89) de LR1 (los residuos alrededor de 40 a alrededor de 89) en EBNA-1, y pueden incluir una deleción, inserción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido en las regiones correspondientes a otros residuos de EBNA-1, p.ej., alrededor del residuo 1 a alrededor del residuo 40, los residuos alrededor de 90 a alrededor de 328 (la región de repetición "Gly-Gly-Ala"), los residuos alrededor de 329 a alrededor de 377 (LR2), los residuos alrededor de 379 a alrededor de 386 (NLS), los residuos alrededor de 451 a alrededor de 608 (unión y dimerización de ADN), o los residuos alrededor de 609 a alrededor de 641, con tal de que el derivado resultante tenga las propiedades deseadas, p.ej., que dimerice y se una a ADN que contenga un ori correspondiente a oriP, se localice en el núcleo, no sea citotóxico, y active la transcripción de un vector extracromosómico pero no active sustancialmente la transcripción de un molde integrado.
D. Característica exenta de residuos
De manera importante, la replicación y el mantenimiento de un vector episómico basado en oriP es imperfecta, y se pierde rápidamente (25% por división celular) de las células en las dos primeras semanas tras haberlo introducido en las células; sin embargo, las células que conservan el plásmido lo pierden con menos frecuencia (3% por división celular) (Leight y Sugden, 2001; Nanbo y Sugden, 2007). Una vez que se elimina la selección de células que albergan el plásmido, los plásmidos se perderán durante cada división celular hasta que todos se hayan eliminado con el tiempo sin dejar huellas de su existencia anterior dentro de las células hijas resultantes. Ciertos aspectos de la invención hacen uso de esta característica sin huellas del sistema basado en oriP como alternativa a la aproximación asociada viral actual para administrar genes para generar células iPS. Otros vectores extracromosómicos también se perderán durante la replicación y la propagación de las células hospedadoras, y se podrían emplear también en la presente invención.
E. Factores de reprogramación
La generación de células iPS es crucial en los genes usados para la inducción. Se podrían usar los siguientes factores, o una combinación de los mismos, en el sistema de vector descrito en la presente invención. En ciertos aspectos, se incluirán ácidos nucleicos que codifican Sox y Oct (preferiblemente Oct3/4) en el vector de reprogramación. Por ejemplo, un vector de reprogramación puede comprender casetes de expresión que codifican Sox2, Oct4, Nanog y opcionalmente Lin-28, o casetes de expresión que codifican Sox2, Oct4, Klf4 y opcionalmente c-myc. Los ácidos nucleicos que codifican estos factores de reprogramación pueden estar comprendidos en el mismo casete de expresión, en casetes de expresión diferentes, en el mismo vector de reprogramación, o en vectores de reprogramación diferentes.
Oct-3/4 y ciertos miembros de la familia de genes Sox (Sox1, Sox2, Sox3, y Sox15) se han identificado como reguladores transcripcionales cruciales implicados en el proceso de inducción, cuya ausencia hace imposible la inducción. Se ha identificado que genes adicionales, no obstante, que incluyen ciertos miembros de la familia Klf (Klf1, Klf2, Klf4, y Klf5), la familia Myc (C-myc, L-myc, y N-myc), Nanog, y LIN28, incrementan la eficacia de inducción.
Oct-3/4 (Pou5f1) es un miembro de la familia de factores de transcripción de unión a octámero ("Oct"), y desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la pluripotencia. La ausencia de Oct-3/4 en las células Oct-3/4+, tales como blastómeros y células madre embrionarias, conduce a la diferenciación espontánea de trofoblastos, y la presencia de Oct-3/4 da lugar así a la pluripotencia y la diferenciación potencial de las células madre embrionarias. Otros diversos genes de la familia "Oct", que incluyen genes relacionados estrechamente con Oct-3/4, Oct1 y Oct6, no son capaces de generar la inducción.
La familia de genes Sox está asociada al mantenimiento de una pluripotencia similar a Oct-3/4, aunque está asociada a células madre multipotentes y unipotentes en contraste con Oct-3/4, que se expresa exclusivamente en las células madre pluripotentes. Aunque Sox2 fue el primer gen usado para la inducción por Takahashi et al. (2006), Wernig et al. (2007), y Yu et al. (2007), se ha descubierto que otros genes de la familia Sox también funcionan en el proceso de inducción. Sox1 produce células iPS con una eficacia similar a Sox2, y los genes Sox3, Sox15, y Sox18 también generan células iPS, aunque con una eficacia disminuida.
Nanog es un factor de transcripción implicado de manera crucial en la auto-renovación de las células madre embrionarias indiferenciadas. En seres humanos, esta proteína está codificada por el gen NANOG. Nanog es un gen expresado en las células madre embrionarias (ESCs), y se cree que es un factor clave en el mantenimiento de la pluripotencia. Se cree que NANOG funciona de acuerdo con otros factores tales como Oct4 (POU5F1) y Sox2 para establecer la identidad de ESC.
LIN28 es una proteína de unión al mARN expresada en las células madre embrionarias y en las células de
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inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD 4, y activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7. Además, las categorizaciones descritas en la presente memoria tienen simplemente fines organizativos, y un experto en la técnica conocería que los compuestos pueden afectar a uno o más puntos dentro de una ruta, y así los compuestos pueden funcionar en más de una de las categorías definidas.
Los inhibidores de receptores de TGF beta pueden incluir anticuerpos hacia, variantes negativas dominantes de, y siARN o ácidos nucleicos inversos que seleccionan como objetivo los receptores de TGF beta. Los ejemplos específicos de inhibidores incluyen, pero sin limitación, SU5416; hidrocloruro de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-tercbutil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina (SB-505124); lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192); GC-1008; ID1 1; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Κi26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin); activina-M108A; P144; TBR2-Fc soluble; y células tumorales transfectadas con moléculas inversas que seleccionan como objetivo los receptores de TGF beta (véase, p.ej., Wrzesinski et al., 2007; Kaminska et al., 2005; y Chang et al., 2007.)
D. Inhibidores de ROCK e inhibidores de Miosina II ATPasa
Las células madre pluripotentes, especialmente las células ES humanas y las células iPS, son vulnerables a la apoptosis tras el desprendimiento y la disociación celular, que es importante para el aislamiento o la expansión clonal y para la inducción de la diferenciación. Recientemente, se ha descubierto que una pequeña clase de moléculas incrementa la eficacia y supervivencia clonal de las células madre pluripotentes disociadas, tales como los inhibidores de la quinasa asociada a Rho (ROCK), que son inhibidores de las rutas de señalización relacionadas con ROCK, por ejemplo, inhibidores específicos de Rho, inhibidores específicos de ROCK o inhibidores específicos de miosina II. En ciertos aspectos de la invención, los inhibidores de ROCK se pueden usar para cultivar y hacer pases de células madre pluripotentes y/o para la diferenciación de las células madre. Por lo tanto, los inhibidores de ROCK podrían estar presentes en cualquier medio de cultivo de células en el que crezcan células madre pluripotentes, se disocien, formen agregados, o experimenten diferenciación, tal como un cultivo adherente o un cultivo en suspensión. A menos que se indique de otra manera en la presente memoria, los inhibidores de miosina II, tales como blebistatina, se pueden sustituir por el uso experimental de los inhibidores de ROCK.
Las rutas de señalización de ROCK pueden incluir la familia de GTPasas Rho; ROCK, una quinasa efectora importante posterior a Rho; Miosina II, el efector predominante posterior a ROCK (Harb et al., 2008); y cualquier procesador de señales intermedio, anterior o posterior. ROCK puede fosforilar e inactivar la subunidad 1 selectiva de la miosina fosfatasa (MYPT1), uno de los objetivos posteriores importantes de ROCK que regulan negativamente la función de la miosina por medio de la desfosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina (MRLC).
Las ROCKs son quinasas específicas de serina/treonina que sirven como proteínas objetivo para Rho (de la que existen tres isoformas, RhoA, RhoB y RhoC). Estas quinasas se caracterizaron inicialmente como mediadores de la formación de fibras de estrés y adhesiones focales inducidas por RhoA. Las dos isoformas de ROCK, ROCK1 (p160ROCK, también denominada ROKβ) y ROCK2 (ROKα), consisten en un dominio de quinasa N-terminal, seguido de un dominio de hélices superenrolladas que contiene un dominio de unión a Rho y un dominio de homología con pleckstrina (PH). Ambas ROCKs son reguladores citoesqueléticos, que actúan como mediadores en los efectos de RhoA sobre la formación de fibras de estrés, la contracción del músculo liso, la adhesión celular, la ondulación de la membrana y la motilidad celular. Las ROCKs pueden ejercer su actividad biológica seleccionando como objetivo moléculas posteriores, tales como miosina II, la cadena ligera de miosina (MLC), MLC fosfatasa (MLCP) y el homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN).
Los ejemplos no limitantes de los inhibidores de ROCK incluyen HA-100, Y-27632, H-1152, Fasudil (también denominado HA1077), Y-30141 (descrito en la patente de EE.UU. 5.478.838), Wf-536, HA-1077, hidroxil-HA-1077, GSK269962A, SB-772077-B, y los derivados de los mismos, y ácido nucleico inverso para ROCK, ácido nucleico que induce la interferencia del ARN (por ejemplo, siARN), péptidos competitivos, péptidos antagonistas, anticuerpos inhibitorios, fragmentos de anticuerpos-ScFV, variantes negativas dominantes y vectores de expresión de los mismos. Además, debido a que se conocen otros compuestos de bajo peso molecular como inhibidores de ROCK, también se pueden usar tales compuestos o derivados de los mismos en las realizaciones (por ejemplo, véanse las Publicaciones de Patentes de EE.UU. Nºs 20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 y 20030087919, y las Publicaciones de Patentes Internacionales Nºs 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 y 2004/039796, que se incorporan en la presente memoria como referencia). En ciertos aspectos de la presente invención, también se puede usar una combinación de uno o dos o más de los inhibidores de ROCK.
También se pueden usar inhibidores específicos de Rho, tales como exoenzima C3 de Clostridium botulinum, y/o inhibidores específicos de Miosina II como inhibidores de ROCK en ciertos aspectos de la invención.
VI. Cultivo de células reprogramadas
La célula inicial y la célula reprogramada final, en general, tienen diferentes necesidades para el medio y las condiciones de cultivo. Para tener en cuenta esto a la vez que también se permite que tenga lugar la reprogramación de la célula, normalmente se lleva a cabo al menos una etapa inicial de cultivo, tras la introducción de los factores de
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reprogramación, en presencia de medio y en condiciones de cultivo que se sabe que son adecuadas para la proliferación de la célula inicial. Esto va seguido de un periodo posterior de cultivo en presencia de un medio de reprogramación y en condiciones que se sabe que son adecuadas para las células pluripotentes, con células de soporte con suero o el uso de un medio químicamente definido o en condiciones exentas de células de soporte. Las células de soporte adecuadas incluyen líneas de fibroblastos primarias o inmortalizadas, en general inactivadas de forma que su crecimiento no supere el crecimiento de las células que se están reprogramando. Tras un tiempo suficiente para la reprogramación, las células reprogramadas se pueden cultivar adicionalmente para la expansión de las células iPS antes o después de la selección de las células iPS en un medio de expansión. Tal medio de expansión puede comprender uno o más inhibidores de la señalización como se describió anteriormente, o comprender un medio de cultivo básicamente exento de estos inhibidores.
La etapa inicial de cultivo es preferiblemente durante un periodo de hasta 6 días, más preferiblemente hasta 4 días y, en realizaciones particulares descritas más adelante, durante no más de 3 días, y más en particular hasta o alrededor de un día. La etapa posterior de cultivo en el medio de reprogramación que comprende uno o más inhibidores de la señalización es de manera adecuada durante un periodo de al menos o alrededor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 días, o cualquier intervalo derivable de ello, y puede ser durante un periodo de hasta 70 días, preferiblemente hasta 56 días, o hasta la detección de las células iPS. En una realización específica descrita más adelante usada para generar células humanas reprogramadas, la etapa inicial de cultivo fue durante un periodo de alrededor de 1 día, y la etapa posterior fue durante alrededor de 9 a 28 días mediante cultivo en una condición de reprogramación en presencia de un medio de reprogramación que comprendía un inhibidor de MEK, un inhibidor de receptores de TGF-β, y un inhibidor de GSK3. La condición de reprogramación puede estar básicamente exenta de células de soporte. En aspectos adicionales, el medio de reprogramación puede ser químicamente definido. Para mejorar la reprogramación, el medio de reprogramación puede comprender adicionalmente una concentración elevada de FGF, y puede estar básicamente exento de TGFβ.
La combinación de un inhibidor de MEK, un inhibidor de receptores de TGF-β, y un inhibidor de GSK3 puede facilitar el proceso de reprogramación, lo que incluye incrementar la eficacia de reprogramación y acortar el tiempo de reprogramación. LIF es un ejemplo de un activador de la señalización de gp130, y otro es IL-6 en combinación con el receptor soluble de IL-6, y favorece el crecimiento y la supervivencia de la célula que está en el proceso de ser reprogramada. Durante la reprogramación, las células se pueden cultivar en presencia de LIF; mediante el uso de LIF se puede ayudar a las células reprogramadas en ciertos aspectos de la presente invención para mejorar la supervivencia de las células y la clonogenicidad.
A. Condiciones de cultivo de células madre en general
Las condiciones de cultivo según la presente invención se definirán de manera adecuada dependiendo del medio y de las células madre usadas. El medio, según ciertos aspectos de la presente invención, se puede preparar mediante el uso de un medio usado para cultivar células animales como su medio basal, tal como cualquiera de los medios TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, MEM con zinc opcional mejorado, IMDM, Medio 199, MEM de Eagle, αMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640, y Fischer, así como cualquier combinación de los mismos, pero el medio no se limita en particular a ellos, con tal de que se pueda usar para el cultivo de células animales.
El medio según la presente invención puede ser un medio que contiene suero o exento de suero. El medio exento de suero se refiere a los medios con suero procesado o purificado, y por lo tanto puede incluir medios con componentes derivados de sangre purificados o componentes derivados de tejidos animales purificados (tales como factores de crecimiento). Desde el punto de vista de prevenir la contaminación con componentes heterogéneos procedentes de animales, el suero puede proceder del mismo animal del que procede(n) la(s) célula(s) madre.
El medio según la presente invención puede contener o no cualquier alternativa al suero. Las alternativas al suero pueden incluir materiales que contienen de manera adecuada albúmina (tales como albúmina rica en lípidos, sustitutos de la albúmina tales como albúmina recombinante, almidón vegetal, dextranos e hidrolizados de proteínas), transferrina (u otros transportadores de hierro), ácidos grasos, insulina, precursores de colágeno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 3'-tiolglicerol, o sus equivalentes. Las alternativas al suero se pueden preparar, por ejemplo, mediante el método descrito en la Publicación Internacional Nº 98/30679. De manera alternativa, se puede usar cualquier material disponible comercialmente para más comodidad. Los materiales disponibles comercialmente incluyen el sustituto de suero Knockout (KSR), concentrado de lípidos químicamente definido (Gibco), y Glutamax (Gibco).
El medio de la presente invención también puede contener ácidos grasos o lípidos, aminoácidos (tales como aminoácidos no esenciales), vitamina(s), factores de crecimiento, citocinas, sustancias antioxidantes, 2mercaptoetanol, ácido pirúvico, agentes tamponadores, y sales inorgánicas. La concentración de 2-mercaptoetanol puede ser, por ejemplo, alrededor de 0,05 a 1,0 mM, y en particular alrededor de 0,1 a 0,5 mM, pero la concentración no se limita en particular a ello, con tal de que sea adecuada para cultivar la(s) célula(s) madre.
Un recipiente de cultivo usado para cultivar la(s) célula(s) madre puede incluir, pero sin limitación particular: matraz, matraz para cultivo de tejidos, placa, placa petri, placa para cultivo de tejidos, multiplaca, microplaca, placa de
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micropocillos, multiplaca, placa de multipocillos, microportaobjetos, portaobjetos de cámara, tubo, bandeja, cámaras CellSTACK®, bolsa de cultivo, y botella para agitador de rodillos, con tal de que se puedan cultivar las células madre en ellos. Las células madre se pueden cultivar en un volumen de al menos o alrededor de 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, o cualquier intervalo derivable de ello, dependiendo de las necesidades del cultivo. En cierta realización, el recipiente de cultivo puede ser un biorreactor, que puede hacer referencia a cualquier dispositivo o sistema que mantenga un medio biológicamente activo. El biorreactor puede tener un volumen de al menos o alrededor de 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 litros, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 metros cúbicos, o cualquier intervalo derivable de ello.
El recipiente de cultivo puede ser adhesivo celular o no adhesivo, y se selecciona dependiendo del propósito. El recipiente de cultivo adhesivo celular se puede revestir con cualquier sustrato para proporcionar la adhesión celular, tal como matriz extracelular (ECM) para mejorar la adhesividad de la superficie del recipiente hacia las células. El sustrato para la adhesión celular puede ser cualquier material destinado a la unión de células madre o células de soporte (si se usan). El sustrato para la adhesión celular incluye colágeno, gelatina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, vitronectina, laminina, y fibronectina y las mezclas de los mismos, por ejemplo Matrigel™, y preparaciones de membranas de células lisadas (Klimanskaya et al., 2005).
Se pueden definir de manera adecuada otras condiciones de cultivo. Por ejemplo, la temperatura de cultivo puede ser de alrededor de 30 a 40 °C, por ejemplo, al menos o alrededor de 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 °C, pero sin limitación particular a ellas. La concentración de CO2 puede ser de alrededor del 1 al 10%, por ejemplo, alrededor del 2 al 5%, o cualquier intervalo derivable de ello. La tensión de oxígeno puede ser al menos o alrededor del 1, 5, 8, 10, 20%, o cualquier intervalo derivable de ello.
Los métodos de la presente invención se pueden usar en ciertos aspectos para el cultivo de adhesión de células madre, por ejemplo. En este caso, las células se pueden cultivar en presencia de células de soporte. En el caso en el que se usan las células de soporte en los métodos de la presente invención, se pueden usar células estromales tales como fibroblastos fetales como células de soporte (por ejemplo, véase; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (1994); Gene Targeting, A Practical Approach (1993); Martin (1981); Evans y Kaufman (1981); Jainchill et al., (1969); Nakano et al. (1996); Kodama et al. (1982); y los Nºs de Publicación Internacional 01/088100 y 2005/080554).
Los métodos de la presente invención en ciertos aspectos se pueden usar también para un cultivo en suspensión de células madre, que incluye el cultivo en suspensión en portadores (Fernandes et al., 2004) o encapsulación en gel/biopolímero (Publicación de Estados Unidos 2007/0116680). La expresión cultivo en suspensión de las células madre significa que las células madre se cultivan en una condición no adherente con respecto al recipiente de cultivo
o las células de soporte (si se usan) en un medio. El cultivo en suspensión de células madre incluye un cultivo de disociación de células madre y un cultivo en suspensión de agregados de células madre. La expresión cultivo de disociación de células madre significa que se cultivan las células madre suspendidas, y el cultivo de disociación de células madre incluye las células madre individuales o los pequeños agregados celulares compuestos de una diversidad de células madre (por ejemplo, de alrededor de 2 a 400 células). Cuando el cultivo de disociación anteriormente mencionado continúa, las células cultivadas, disociadas forman un agregado mayor de células madre, y después se puede llevar a cabo un cultivo en suspensión de agregados. El cultivo en suspensión de agregados incluye un método de cultivo embrionario (véase Keller et al., 1995), y un método SFEB (Watanabe et al., 2005; Publicación Internacional Nº 2005/123902).
B.
Cultivo de células madre pluripotentes
Dependiendo de las condiciones de cultivo, las células madre pluripotentes pueden producir colonias de células diferenciadas o de células indiferenciadas. La expresión "diferenciado" significa la progresión de una célula por una ruta del desarrollo. La expresión "diferenciado" es una expresión relativa que describe la progresión de una célula por una ruta del desarrollo en comparación con otra célula. Por ejemplo, una célula pluripotente puede dar lugar a cualquier célula del cuerpo, mientras una célula más diferenciada, tal como una célula hematopoyética, dará lugar a menos tipos de células.
Los cultivos de células madre pluripotentes se describen como "indiferenciados" cuando una proporción sustancial de células madre y sus derivados de la población exhiben características morfológicas de las células indiferenciadas, que las distinguen claramente de las células diferenciadas de origen embrionario o de adulto. Los expertos en la técnica reconocen las células iPS o ES indiferenciadas, y en general aparecen en las dos dimensiones de una vista microscópica en colonias de células con proporciones nucleares/citoplasmáticas elevadas y nucléolos prominentes. Se entiende que las colonias de células indiferenciadas pueden tener células cercanas que están diferenciadas.
Las células ES se pueden mantener en un estado indiferenciado cultivando las células en presencia de suero y una capa de células de soporte, en general fibroblastos embrionarios de ratón. También se conocen otros métodos para mantener las células madre en un estado indiferenciado. Por ejemplo, las células ES de ratón se pueden mantener en un estado indiferenciado cultivándolas en presencia de LIF sin una capa de células de soporte. Sin embargo, a diferencia de las células ES de ratón, las células ES humanas preexistentes no responden a LIF. Las células ES
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humanas se pueden mantener en un estado indiferenciado cultivando las células ES sobre una capa de soporte de fibroblastos en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos básico (Amit et al., 2000), o cultivando sobre una matriz de proteínas, tal como Matrigel™ o laminina, sin una capa de soporte y en presencia de medio acondicionado de fibroblastos más factor de crecimiento de fibroblastos básico (Xu et al., 2001; Patente de EE.UU. Nº 6.833.269).
Los métodos para preparar y cultivar células ES se pueden hallar en libros de texto y revistas habituales en biología celular, cultivo de tejidos y embriología, que incluyen Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (1987); Guide to Techniques in Mouse Development (1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (1998), todos incorporados en la presente memoria como referencia. Los métodos habituales usados en el cultivo de tejidos se describen en general en Animal Cell Culture (1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); y Current Protocols in Molecular Biology y Short Protocols in Molecular Biology (1987 y 1995).
Después de haber introducido o puesto en contacto las células somáticas con los factores de reprogramación, estas células se pueden cultivar en un medio suficiente para mantener la pluripotencia y el estado indiferenciado. El cultivo de las células madre pluripotentes inducidas (iPS) generadas en esta invención puede usar diversos medios y técnicas desarrolladas para cultivar células madre pluripotentes de primates, más en especial, células madre embrionarias, como se describió en la Publicación de Pat. de EE.UU. 20070238170 y en la Publicación de Pat. de EE.UU. 20030211603, y Publicación de Pat. de EE.UU. 20080171385, que se incorporan en la presente memoria como referencia. Se aprecia que se pueden usar métodos adicionales para el cultivo y el mantenimiento de las células madre pluripotentes, como conocería un experto, con la presente invención.
En ciertas realizaciones, se pueden usar condiciones indefinidas; por ejemplo, las células pluripotentes se pueden cultivar en células de soporte de fibroblastos o un medio que se ha expuesto a células de soporte de fibroblastos para mantener las células madre en un estado indiferenciado.
De manera alternativa, las células pluripotentes se pueden cultivar y mantener en un estado básicamente indiferenciado mediante el uso de un sistema de cultivo definido, independiente de células de soporte, tal como un medio TeSR (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b). Se pueden usar sistemas de cultivo y medios independientes de células de soporte para cultivar y mantener las células pluripotentes. Estas aproximaciones permiten que las células iPS humanas obtenidas, así como las células madre embrionarias humanas, permanezcan en un estado básicamente indiferenciado sin la necesidad de "capas de soporte" de fibroblastos de ratón. Como se describe en la presente memoria, se pueden hacer diversas modificaciones en estos métodos para reducir los costes como se desee.
Se pueden usar diversos componentes de la matriz en el cultivo y el mantenimiento de las células madre pluripotentes humanas. Por ejemplo, se puede usar Matrigel™, colágeno IV, fibronectina, laminina, y vitronectina en combinación para revestir una superficie de cultivo como medio para proporcionar un soporte sólido para el crecimiento de células pluripotentes, como se describe en Ludwig et al. (2006a; 2006b), que se incorpora como referencia en su totalidad. En particular, se puede usar Matrigel™ para proporcionar un sustrato para el cultivo celular y el mantenimiento de células madre pluripotentes humanas. Matrigel™ es una mezcla gelatinosa de proteínas secretadas por células tumorales de ratón, y está disponible comercialmente de BD Biosciences (Nueva Jersey, EE.UU.). Esta mezcla se parece al medio extracelular complejo hallado en muchos tejidos, y lo usan los biólogos celulares como sustrato para el cultivo de células.
C. Pase de células
Ciertos aspectos de la presente invención pueden implicar además una etapa de disociación de las células madre. La disociación de las células madre se puede llevar a cabo mediante el uso de cualquier procedimiento conocido. Estos procedimientos incluyen tratamientos con un agente quelante (tal como EDTA), una enzima (tal como tripsina, colagenasa), o similares, y operaciones tales como la disociación mecánica (tal como el pipeteo). La(s) célula(s) madre se puede(n) tratar con el inhibidor de ROCK antes y/o después de la disociación. Por ejemplo, la(s) célula(s) madre se puede(n) tratar solamente después de la disociación.
En ciertas realizaciones adicionales del cultivo de células madre pluripotentes, una vez que un recipiente de cultivo está lleno, la colonia se puede fraccionar en células agregadas o incluso en células individuales mediante cualquier método adecuado para la disociación, cuyas células se colocan después en recipientes de cultivo nuevos para realizar el pase. El pase de células es una técnica que permite mantener vivas las células y cultivarlas en condiciones de cultivo durante periodos de tiempo prolongados. Las células se someterían al pase normalmente cuando alcanzasen una confluencia de alrededor del 70%-100%.
Se puede usar la disociación en células individuales de las células madre pluripotentes, seguido del pase de las células individuales, en los presentes métodos con varias ventajas, como facilitar la expansión de las células, la clasificación de las células, y la siembra definida para la diferenciación, y permitir la automatización de los procedimientos de cultivo y de expansión clonal. Por ejemplo, las células de la progenie obtenibles de manera clonal a partir de una célula individual pueden ser homogéneas en su estructura genética y/o estar sincronizadas en el ciclo celular, lo que puede incrementar la diferenciación deseada. Los métodos ejemplares para realizar pases de células
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i. Promotor/potenciadores
Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controla el inicio y la velocidad de transcripción. Puede contener elementos genéticos a los que se pueden unir proteínas y moléculas reguladoras, tales como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción, para iniciar la transcripción específica de una secuencia de ácido nucleico. Las frases "colocado de forma operable", "unido de forma operable", "bajo control", y "bajo control transcripcional" significan que un promotor está en una localización y/u orientación funcional correcta con respecto a una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio transcripcional y/o la expresión de esa secuencia.
Los promotores adecuados para el uso en el vector que codifica EBNA-1 de la invención son aquellos que dirigen la expresión de los casetes de expresión que codifican la proteína EBNA-1 para dar como resultado unos niveles constantes suficientes de proteína EBNA-1 para mantener de manera estable los vectores que contienen oriP de EBV. Los promotores se pueden usar también para la expresión eficaz de factores de reprogramación que codifican casetes de expresión.
Un promotor comprende en general una secuencia que funciona para colocar el sitio de inicio para la síntesis del ARN. El ejemplo más conocido de esto es la caja TATA, pero en ciertos promotores que carecen de una caja TATA, tales como, por ejemplo, el promotor del gen de desoxinucleotidil transferasa terminal de mamíferos y el promotor de los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que cubre el propio sitio de inicio para ayudar a reparar el lugar de inicio. Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia del inicio transcripcional. En general, estos se localizan en la región de 30-110 pb en dirección 5' respecto del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que varios promotores también contienen elementos funcionales posteriores al sitio de inicio. Para poner una secuencia codificante "bajo el control de" un promotor, se coloca el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción del marco de lectura transcripcional "en dirección 3'" (es decir, en posición 3') del promotor elegido. El promotor "en dirección 5'" estimula la transcripción del ADN y favorece la expresión del ARN codificado.
El espaciado entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de forma que se conserva la función del promotor cuando se invierten o se mueven los elementos unos respecto de otros. En el promotor tk, el espaciado entre los elementos promotores se puede incrementar hasta 50 pb antes de que la actividad comience a decaer. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción. Un promotor se puede usar o no junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.
Un promotor puede ser uno asociado de manera natural a una secuencia de ácido nucleico, tal como se puede obtener aislando las secuencias no codificantes de 5' localizadas en dirección 5' del segmento codificante y/o exón. Tal promotor se puede denominar "endógeno". De forma similar, un potenciador puede ser uno asociado de manera natural a una secuencia de ácido nucleico, localizado en dirección 3' o 5' de esa secuencia. De manera alternativa, se obtendrán ciertas ventajas colocando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, lo que se refiere a un promotor que no está asociado normalmente a una secuencia de ácido nucleico en su medio natural. Un potenciador recombinante o heterólogo se refiere también a un potenciador que normalmente no está asociado a una secuencia de ácido nucleico en su medio natural. Tales promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otro virus, o célula procariótica o eucariótica, y promotores o potenciadores que no "se dan de manera natural", es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras transcripcionales, y/o mutaciones que alteran la expresión. Por ejemplo, los promotores que se usan de manera más habitual en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas de promotores de β-lactamasa (penicilinasa), lactosa y triptófano (trp). Además de producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores de manera sintética, se pueden producir secuencias mediante el uso de clonación recombinante y/o tecnología de amplificación de ácido nucleico, que incluye PCR™, en relación a las composiciones descritas en la presente memoria (véanse las Patentes de EE.UU. Nºs 4.683.202 y 5.928.906, cada una incorporada en la presente memoria como referencia). Además, se contempla que se puedan usar también secuencias de control que dirigen la transcripción y/o la expresión de secuencias dentro de orgánulos que no son nucleares, tales como las mitocondrias, cloroplastos, y similares.
Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija de manera eficaz la expresión del segmento de ADN en el orgánulo, tipo de célula, tejido, órgano, u organismo elegido para la expresión. Los expertos en la técnica de biología molecular conocen en general el uso de promotores, potenciadores, y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989, incorporado en la presente memoria como referencia). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles, y/o útiles en las condiciones adecuadas para dirigir la expresión a nivel elevado del segmento de ADN introducido, como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.
Además, también se podría usar cualquier combinación promotor/potenciador (por ejemplo, la base de datos de promotores eucarióticos EPDB, en internet en epd.isb-sib.ch/) para controlar la expresión. Otra realización posible es
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vivo para alcanzar niveles deseables de mensaje.
En los sistemas eucarióticos, la región del terminador puede comprender además secuencias de ADN específicas que permitan la escisión específica de sitio del transcrito nuevo para exponer un sitio de poliadenilación. Esto actúa como señalización para que una polimerasa endógena especializada añada un tramo de alrededor de 200 residuos de A (poliA) en el extremo 3' del transcrito. Las moléculas de ARN modificadas con esta cola de poliA parecen más estables y se traducen de manera más eficaz. Así, en otras realizaciones que implican a los eucariotas, se prefiere que ese terminador comprenda una señal para la escisión del ARN, y se prefiere más que la señal del terminador favorezca la poliadenilación del mensaje. El terminador y/o los elementos del sitio de poliadenilación pueden servir para aumentar los niveles del mensaje y para minimizar la lectura del casete hacia otras secuencias.
Los terminadores contemplados para el uso en la invención incluyen cualquier terminador conocido de la transcripción descrito en la presente memoria o conocido para alguien de experiencia habitual en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, las secuencias de terminación de genes, tales como, por ejemplo, el terminador de la hormona del crecimiento bovina o las secuencias de terminación virales, tales como, por ejemplo, el terminador de SV40. En ciertas realizaciones, la señal de terminación puede ser la ausencia de una secuencia transcribible o traducible, tal como la debida a un truncamiento de secuencia.
vi. Señales de poliadenilación
En la expresión, en particular en la expresión eucariótica, en general se incluirá una señal de poliadenilación para llevar a cabo la poliadenilación adecuada del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica eficaz de la invención, y se puede emplear cualquiera de tales secuencias. Las realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 o la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina, que se sabe que funcionan de manera adecuada y conocida en las diversas células objetivo. La poliadenilación puede incrementar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplasmático.
vii. Orígenes de replicación
Para propagar un vector en una célula hospedadora, el vector puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (a menudo denominados "ori"), por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que corresponde a oriP de EBV como se describió anteriormente, que es una secuencia de ácido nucleico específica en la que se inicia la replicación. De manera alternativa, se puede emplear un origen de replicación de otro virus de replicación extracromosómica como se describió anteriormente o una secuencia de replicación autónoma (ARS).
viii. Marcadores de selección y cribables
En ciertas realizaciones de la invención, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la presente invención se pueden identificar in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Tales marcadores conferirían un cambio identificable a la célula que permitiese la identificación sencilla de las células que contienen el vector de expresión. En general, un marcador de selección es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador de selección positiva es uno en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras un marcador de selección negativa es uno en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de un marcador de selección positiva es un marcador de resistencia a fármacos.
Normalmente, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación y la identificación de los transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a neomicina, blasticidina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores de selección útiles. Además de los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de los transformantes basándose en la aplicación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores que incluyen marcadores cribables, tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. De manera alternativa, se pueden utilizar enzimas cribables como marcadores de selección negativa, tales como timidina quinasa del virus herpes simplex (tk) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la técnica también sabría emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con el análisis mediante FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, con tal de que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Los ejemplos adicionales de marcadores de selección y cribables son muy conocidos para un experto en la técnica.
C. Administración de vectores
La introducción de un vector de reprogramación en las células somáticas con la presente invención puede usar cualquier método adecuado para la administración de ácidos nucleicos para la transformación de una célula, como se describe en la presente memoria o como conocería alguien de experiencia habitual en la técnica. Tales métodos incluyen, pero sin limitación, la administración directa de ADN, tal como mediante transfección ex vivo (Wilson et al., 1989, Nabel et al., 1989); mediante inyección (Patentes de EE.UU. Nºs 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859, todas incorporadas en la presente memoria como referencia), que incluye la microinyección (Harland y Weintraub, 1985; Patente de EE.UU. Nº 5.789.215, incorporada en la presente memoria como referencia); mediante electroporación (Patente de EE.UU. Nº 5.384.253, incorporada en la presente memoria como referencia; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); mediante precipitación con
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SOX2
189 SOX2-F2 9 AGTCTCCAAGCGACGAAAAA Endógeno
SOX2-R2
10 TTTCACGTTTGCAACTGTCC
LIN28
104 LIN28-F2 11 AGTGGCCTGGATAGGGAAGT Endógeno
LIN28-R2
12 CTTGGCTCCATGAATCTGGT
GAPDH
152 GAPDH-F 13 GTGGACCTGACCTGCCGTCT Endógeno
GAPDH-R
14 GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT
Para RT-PCR normal
T-OCT4
657 Oct4-SF1 15 AGTGAGAGGCAACCTGGAGA Exógeno
IRES2-SR
16 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T-NANOG
732 Nanog-F1 17 CAGAAGGCCTCAGCACCTAC Exógeno
IRES2-SR
18 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T1-KLF4
442 Klf4-SF1 19 CCCACACAGGTGAGAAACCT Exógeno
IRES2-SR
20 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T2-KLF4
253 IRES2-SF 21 TGGCTCTCCTCAAGCGTATT Exógeno
Klf4-SR
22 GTGGAGAAAGATGGGAGCAG
T-SV40LT
491 SV40T-SF1 23 TGGGGAGAAGAACATGGAAG Exógeno
IRES2-SR
24 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T-SOX2
498 IRES2-SF 25 TGGCTCTCCTCAAGCGTATT Exógeno
Sox2-SR
26 GCTTAGCCTCGTCGATGAAC
T-LIN28
245 IRES2-SF 27 TGGCTCTCCTCAAGCGTATT Exógeno
Lin28-SR
28 GCAAACTGCTGGTTGGACAC
T-c-MYC
298 IRES2-SF 29 TGGCTCTCCTCAAGCGTATT Exógeno
Myc-SR
30 CACCGAGTCGTAGTCGAGGT
OCT4
113 OCT4-F2 31 AGTTTGTGCCAGGGTTTTTG Endógeno
OCT4-R2
32 ACTTCACCTTCCCTCCAACC
GAPDH
152 GAPDH-F 33 GTGGACCTGACCTGCCGTCT Endógeno
GAPDH-R
34 GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT
Para PCR
T-OCT4
657 Oct4-SF1 35 AGTGAGAGGCAACCTGGAGA Exógeno
IRES2-SR
36 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T-NANOG
732 Nanog-F1 37 CAGAAGGCCTCAGCACCTAC Exógeno
IRES2-SR
38 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T1-KLF4
442 Klf4-SF1 39 CCCACACAGGTGAGAAACCT Exógeno
IRES2-SR
40 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T2-KLF4
401 Klf4-SF1 41 CCCACACAGGTGAGAAACCT Exógeno
SV40pA-R
42 CCCCCTGAACCTGAAACATA
T-SV40LT
491 SV40T-SF1 43 TGGGGAGAAGAACATGGAAG Exógeno
IRES2-SR
44 AGGAACTGCTTCCTTCACGA
T-SOX2
534 Sox2-SF1 45 ACCAGCTCGCAGACCTACAT Exógeno
SV40pA-R
46 CCCCCTGAACCTGAAACATA
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