CN113939320A - 用于合成的生物标志物的改进的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涵盖包含可用于检测患病细胞的基因元件的核酸的实施方案。在一些方面中，本公开内容提供一种方法，所述方法包括：(a)向受试者施用组合物，其中所述组合物在所述受试者中诱导生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对比率大于1.0；(b)检测所述生物标志物，以及(c)利用在(b)中检测到的生物标志物以至少70％的准确度确定所述受试者具有所述患病细胞。

Description

用于合成的生物标志物的改进的方法和组合物
交叉引用
在此要求2019年4月5日提交的名称为“IMPROVED METHODS AND COMPOSITIONSFOR SYNTHETIC BIOMARKERS”的美国临时申请62/830,279，以及2019年12月31日提交的名称为“IMPROVED METHODS AND COMPOSITIONS FOR SYNTHETIC BIOMARKERS”的美国临时申请62/955,925的权益，每件所述美国临时申请通过援引而整体地并入本文中。
背景技术
癌症是巨大的全球健康问题。世界卫生组织估计仅在2018中就有估计的1810万例新的癌症诊断和960万例起因于癌症的死亡。癌症被检测的时间，在初期癌症诊断之前以及在肿瘤复发期间，是影响患者结果的最重要因素之一，因为如果检测得早，那么目前的治疗可能更有效。令人遗憾地，大多数癌症被检测得相对晚，导致高死亡率。除非开发出更有效的检测策略和疗法，否则预期到这些死亡率到2030时将翻倍。为了遏止由于此可怕的疾病所致的巨大的生命损失，迫切地需要能够在其最早阶段检测癌症的广泛可应用的工具。
用于改进癌症检测的目前的两个范例包括开发基于血液的测定以及分子成像测定，所述基于血液的测定检测脱落或释放到血流中的内源性癌症生物标志物(例如蛋白质、微RNA、循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞等)，所述分子成像测定利用靶向生物标志物的成像探针来更好地可视化不可用常规解剖成像检测的肿瘤。
血液测定高度令人关注，是因为它们促进价格合理的癌症筛查程序，但是由于以下而时常遭遇灵敏度和特异性问题(Nagrath等人，(2007)Nature 450:1235-1239)：低血液生物标志物浓度，在体内和活体外快速生物标志物降解(Haun等人，(2011)Sci.Translational Med.3:71ra16)，以及在非恶性组织中高度可变的背景表达(Diamandis E P(2010)J.National Cancer Inst.102:1462-1467)。利用目前临床生物标志物测定，在内源性血液生物标志物量达到足以指示疾病的水平之前，已经估计肿瘤可能生长10-12年并且达到大于2.5cm的球形直径(Hori&Gambhir(2011)Sci.TranslationalMed.3:109ra116)。在报告的数千潜在的血液生物标志物中，小于1％用于临床(7)，并且新血液生物标志物在临床环境中的实施由于它们缺乏验证的特异性和诊断价值而减少(Haun等人，(2011)Sci.Translational Med.3:71ra16；Kern SE(2012)Cancer Res.72:6097-6101)。总之，虽然大量的尝试已经致力于开发用于检测内源性癌症血液生物标志物的工具，但是极少成功。因此，迫切需要能够灵敏且特异性癌症检测的新策略和工具。
发明内容
在一些方面中，本公开内容提供一种方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一种组合物，其中所述组合物在所述受试者中诱导生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对比率大于1.0；(b)检测所述生物标志物；以及(c)利用在(b)中检测到的所述生物标志物以至少70％的准确度确定所述受试者具有所述患病细胞。
在一些方面中，本公开内容提供一种治疗患有或疑似患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物在所述受试者中诱导与所述疾病相关的患病细胞对治疗有效剂的表达优先于非患病细胞对所述治疗有效剂的表达，以至由所述患病细胞相比于所述非患病细胞表达的所述治疗有效剂的相对浓度大于1.0，所述治疗有效剂以至少10％的治疗功效治疗所述受试者，如通过所述患病细胞的细胞群的减少来确定。
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含编码第一多肽或核酸生物标志物的第一核酸序列，以及编码第二多肽或第二核酸生物标志物的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：所述第二多肽或核酸生物标志物被表达的量反映所述第一核酸和所述第二核酸递送至所述细胞，并且所述第一多肽或核酸生物标志物在患病细胞相对于非患病细胞中被差异表达。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测受试者中的患病细胞的方法，所述方法包括将组合物施用于所述受试者，其中所述组合物包含：编码第一多肽或核酸生物标志物的第一核酸序列，以及编码第二多肽或第二核酸生物标志物的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：(i)所述细胞诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达，其中所述第一多肽是可检测的生物标志物或治疗剂；并且(ii)所述细胞诱导所述第二核酸序列同等地在患病细胞和非患病细胞中的等效表达并且所述第二核酸序列产生所述第二多肽，所述第二多肽不是可检测的生物标志物或治疗剂，以至所述第二多肽的表达水平提供用于评估在所述细胞中核酸序列的相对水平的对照。
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含编码第一多肽的第一核酸序列，以及编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：(i)所述细胞表达所述第一核酸序列以产生所述第一多肽；(ii)所述细胞表达所述第二核酸序列以产生所述第二多肽；以及(iii)由所述细胞表达的所述第一多肽和所述第二多肽被配置为组合以形成异二聚体蛋白质。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测或治疗患病细胞的方法，所述方法包括施用上述组合物，所述组合物包含编码第一多肽的第一核酸序列，以及编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一多肽和所述第二多肽在所述患病细胞中选择性地被转录或翻译。
在一些方面中，本公开内容提供一种包含非天然存在的重组基因构建体的组合物，所述重组基因构建体包含编码多肽或核酸序列的序列，其中所述序列包含第一启动子，所述所述序列当被活体外转导入细胞中时所述第一启动子在从受试者分离的多种不同类型的细胞中选择性地驱动所述多肽或核酸生物标志物序列的表达。
在一些方面中，本公开内容提供一种在活体外检测患病细胞或有障碍细胞的方法，所述方法包括在活体外将非天然存在的重组基因构建体递送至从受试者分离的细胞群，其中所述非天然存在的重组基因构建体包含：编码多肽或核酸生物标志物序列的序列，其中所述序列包含第一启动子，所述序列当被转导入细胞中时所述第一启动子选择性地驱动所述多肽或核酸生物标志物序列在从受试者分离的多种不同类型的细胞中的表达。
在一些方面中，本公开内容提供一种包含载体的组合物，其中所述载体包含与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子，其中每种所述启动子驱动在细胞中所述多种核酸序列的表达而产生多种多肽或核酸生物标志物序列，其中所述多种核酸序列中的各个多肽或核酸生物标志物序列的水平指示所述细胞的疾病的阶段或所述细胞来源于的组织。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测疾病的阶段的方法，所述方法包括向受试者施用包含载体的组合物，其中所述载体包含与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子，其中每种所述启动子驱动在细胞中的所述多种核酸序列表达而产生多种多肽或核酸生物标志物序列，其中所述多种核酸序列的各个多肽的水平指示所述细胞的疾病的阶段或所述细胞来源于的组织。
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含编码可表达的报告基因的工程化的核酸，其当相比于包含含有核酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的报告基因的重组核酸时在正常细胞相对于患病细胞中表现出约10％或更少的表达。
在一些方面中，本公开内容提供一种方法，所述方法包括向受试者施用所述组合物，所述组合物包含编码上述可表达的报告基因的工程化的核酸。
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物在正常细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达并且包含重组核酸，所述重组核酸包含编码报告基因的核酸序列，所述报告基因在所述报告基因的3′非翻译区中包含一个或多个miRNA结合序列。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用上述组合物，所述组合物在正常细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达。
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物相比于质粒DNA或微环DNA表现出合成的生物标志物的显著更长的表达，所述组合物包含线性载体，所述线性载体包含双链核酸，所述双链核酸包含与编码合成的生物标志物的DNA序列可操作地连接的启动子，其中所述双链核酸的正向链和反向链在它们各自的末端上共价连接，其中所述启动子诱导所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的合成生物标志物的相对浓度大于1.0。
在一些方面中，本公开内容提供一种鉴定患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用上述组合物，所述组合物相比于质粒DNA或微环DNA表现出合成的生物标志物的显著更长的表达，以及检测所述合成的生物标志物，其中在所述受试者中所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的合成生物标志物的相对浓度大于1.0。
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物相比于质粒DNA或微环DNA表现出合成的生物标志物的显著更长的表达，所述组合物包含线性载体，所述线性载体包含双链核酸，所述双链核酸包含与编码治疗有效剂的DNA序列可操作地连接的启动子，其中所述双链核酸的正向链和反向链在它们各自的末端上共价连接，其中所述启动子诱导所述治疗有效剂在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的治疗有效剂的相对浓度大于1.0。
在一些方面中，本公开内容提供一种治疗患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用上述组合物，以及检测所述合成的生物标志物，其中在所述受试者中所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的合成生物标志物的相对浓度大于1.0。
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含表达合成的生物标志物的非病毒载体，其中所述合成的生物标志物在正常器官细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达。
在一些方面中，本公开内容提供一种工程化的颗粒，其模拟生物细胞或巨噬细胞的一种或多种功能，包括诱导生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的生物标志物的相对浓度比率大于1.0。
在一些方面中，本公开内容提供至少一种载体，其中所述至少一种载体包含：与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子，其中所述启动子在细胞中驱动所述多种核酸序列的表达而产生多种多肽或核酸生物标志物序列，其中在受试者中所述启动子诱导所述多种多肽或核酸生物标志物序列在患病细胞中的表达优先于所述多种多肽或核酸生物标志物序列在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述多种多肽或核酸生物标志物序列的相对比率大于1.0。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测受试者中的疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用组合物，所述组合物包含至少一种载体，所述载体包含与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子；检测多种多肽或核酸生物标志物序列以获得表达谱(profile)；以及检测基于患病细胞的表达谱，从而检测所述疾病。
在一些方面中，本公开内容提供检测受试者的疾病或不存在疾病的方法，所述方法包括使所述受试者的一种或多种细胞与基因构建体在活体外接触，其中：所述基因构建体包含与条形码分子可操作地连接的疾病活化的启动子，并且所述疾病活化的启动子驱动所述条形码分子在患有所述疾病的细胞中的表达；量化所述条形码分子的表达水平；以及基于所述表达水平而检测所述疾病或其不存在。
通过将独有的标记归属于较大组内的独特成员，条形码提供在许多成员的较大且更复杂的混合物(例如在相同细胞内表达的多个启动子-报告基因构建体)的背景内鉴定和量化该成员(例如在特定的癌症特异性启动子的控制下报告基因的表达)的机会，而且提供从复杂的混合物中分离单个成员的机会。例如，在基于核酸的条形码的情况中，基于碱基配对互补性的条形码的杂交可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。对于基于肽的条形码，独特的特征(包括配体和受体的免疫捕获或相互作用)可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。
在一些方面中，本公开内容提供了产生受试者的疾病谱的方法，所述方法包括使所述受试者的一种或多种细胞与多种基因构建体接触，其中：所述多种基因构建体包含分别与多种条形码分子可操作地连接的多种疾病活化的启动子，并且所述疾病活化的启动子驱动对应的所述条形码分子在患有所述疾病的细胞中表达；以及量化所述多种条形码分子的表达水平以产生所述谱。
通过以下在其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。将会认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。因此，附图和说明书在本质上将被认为是说明性而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相抵触的程度下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(本文也称为“图”)，将会获得对本发明特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1示例性说明用于癌症检测的基于血液的肿瘤可活化的微环(MC)方法。(A)由肿瘤特异性启动子驱动并且编码分泌性报告蛋白质的肿瘤可活化的MC与非靶向转染剂(TA)络合。这些纳米复合物全身性(经由尾静脉)进行递送。(B)MC转染许多组织，但是报告蛋白质的产生几乎完全仅发生在肿瘤细胞内并且表达的报告物被分泌到血流(BS)中。由于启动子渗漏，所以最少的蛋白质表达应发生在无肿瘤的受试者中。(C)收集血液以及检测血浆中分泌的报告物能够实现有肿瘤(报告物阳性)和无肿瘤(报告物阴性)的受试者之间的辨别。
图2A-2B说明肿瘤可活化的载体的设计和构造。图2A说明存活蛋白启动子(pSurv)驱动的亲代质粒(PP；上图)和MC(下图)的载体图。这些构建体编码报告蛋白质分泌的胚碱性磷酸酶(SEAP)。PP和MC具有相同的转录单位(pSurv-SEAP-WPRE-聚A)，但是MC缺少原核骨架(浅灰色)。WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。图2B说明证实产生PP(7.9kb)和MC(4.1kb)二者的能力的琼脂糖凝胶电泳。
图3是微环载体构建体MC-pSurv-SEAP-WPRE-SV40聚A-暂停的示意图。
图4是微环载体构建体MC-pSurv-Luc2-WPRE-SV40聚A-暂停的示意图。
图5是说明在MeWo人黑素瘤癌细胞中肿瘤特异性质粒(PP-SEAP)和微环(MC-SEAP)的比较的图。
图6是说明在SK-MEL-28人黑素瘤癌细胞中肿瘤特异性质粒(PP-SEAP)和微环(MC-SEAP)的比较的图。
图7是在全身性施用肿瘤特异性SEAP微环之后基于血液的癌症检测的SEAP测定标准曲线。SEAP测定的标准曲线分析显示高于约104的RLU值在血浆中可检测的SEAP水平的线性区域内。
图8是说明肿瘤内施用肿瘤可活化的MC导致可检测的血液报告物活性的图。带有皮下人黑素瘤异种移植物的裸小鼠被肿瘤内(I.T.)施用表达SEAP的肿瘤可活化的MC(n＝4；MC I.T.)或5％葡萄糖(n＝3；模拟)。对照小鼠组也接受肌肉内(I.M.)注射MC(n＝3；MCI.M.)。在施用MC之前以及施用MC之后多达2周期间血浆SEAP测量显示从第3天至第14天仅MC I.T小鼠具有升高的SEAP水平(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。数据被表述为平均值±SD。
图9说明在全身性施用肿瘤特异性SEAP微环之后代表性小鼠血液SEAP活性。
图10是说明在全身性施用肿瘤特异性SEAP微环之后基于血液的癌症检测的图。p存活蛋白-SEAP MC注射后从第3天至第14天与对照小鼠相比来自有肿瘤的小鼠的血液样本中检测到显著更高的SEAP活性(p<0.05)。在接受MC或5％葡萄糖的对照小鼠之间未观察到显著差异。误差线代表SD。
图11是一系列数字图像，说明在全身性施用肿瘤特异性FLUC微环之后3天的分子基因成像癌症检测。
图12是说明在全身性施用肿瘤特异性FLUC微环之后的分子基因成像癌症检测的图。
图13说明微环MC-pSurv-SEAP-WPRE-pA的核酸序列。
图14说明微环MC-pSurv-Luc2-WPRE-pA的核酸序列。
图15是说明在培养的癌细胞中转染本公开内容的构建体的比较的图。利用等体积的转染剂将等质量的MC(n＝3)和PP(n＝3)转染入MeWo人黑素瘤细胞中导致从第3天至第8天在具有MC的培养基中显著更高的SEAP浓度(**p<0.01；***p<0.001)。数据被表述为平均值±SD。
图16A-16D说明全身性递送肿瘤可活化的MC允许鉴定有肿瘤的受试者。图16A-16C说明在利用生物发光成像(BLI)监测的裸小鼠(n＝7)中在静脉内细胞施用之后人黑素瘤肿瘤进展(左图像)。代表性BLI图像显示肿瘤生长主要在肺内并且各个小鼠在MC施用之前3天内具有宽范围的肿瘤负荷。BLI比例尺度在图16A和16B中是相同的，但图16C的比例尺度低一个数量级。肿瘤可活化的MC被全身性施用，并且在施用之前(第0天)以及在施用之后多达14天对SEAP水平进行测量(右图)。在14天期间在有肿瘤的小鼠中检测到变化的SEAP浓度。图16D说明接受MC(对照+MC；n＝7)或仅5％葡萄糖载剂(对照-MC；n＝5)的健康(无肿瘤)小鼠。在这两组之间没有检测到血浆中SEAP水平的统计学显著的差异。重要地，不管肿瘤负荷，在所有小鼠中，与对照组二者相比，在第3天至第14天在接受MC的有肿瘤的小鼠中检测到显著更高的血浆SEAP浓度(#*p<0.05；##**p<0.01)。数据被表述为平均值±SEM。
图17A-17C说明肿瘤可活化的MC可以稳健地鉴定有肿瘤的受试者并且测量肿瘤负荷。图17A：与接受MC(n＝7)或5％葡萄糖(n＝5)的健康小鼠相比，在2周期间血浆SEAP测量的曲线下面积(AUC)分析显示接受MC的有肿瘤的小鼠(n＝7)之间的显著差异(*p<0.05；**p<0.01)。数据被表述为平均值SD。图17B：ROC(接受者操作特性曲线)分析显示肿瘤可活化的MC系统通过测量和计算血浆SEAP AUC来辨别有肿瘤的受试者与健康受试者的显著能力。图17C：SEAP AUC测量和肺肿瘤负荷(如通过BLI肺平均辐亮度测量的)的相关性分析。在6只小鼠中，在这两个测量之间观察到显著的正相关性，显示我们的工具评估肿瘤负荷的能力，前提是肿瘤处于一个位置。将一只小鼠从分析除去(方形符号)，这是因为此小鼠在肺部以及肺部之外多个转移病灶中具有肿瘤(BLI测量仅在肺部内进行，解释了在此小鼠中总体低的BLI信号)。此小鼠具有与基于其肺肿瘤负荷可能预期的相比更高的SEAP AUC水平。
图18A-18D说明在健康(无肿瘤)小鼠中在体内启动子活性的比较。小鼠被全身性施用质粒(30μg；PGL4.2骨架；与PEI络合(N/P＝6))，所述质粒表达由pCMV(n＝3)、pSurv(n＝5)或pPEG(n＝3)驱动的生物发光成像(BLI)报告基因密码子优化的萤火虫萤光素酶(Luc2)。模拟注射的小鼠接受5％葡萄糖(n＝3)。每只小鼠还被共注射质粒，所述质粒表达由pCMV驱动的BLI报告基因人源化海肾萤光素酶(hRluc)以评估转染效率(3μg；10倍低于Luc2质粒质量)。图18A说明注射后48小时代表性BLI图像。用于pCMV小鼠的图像比例尺度比所有其他小鼠高2个数量级。在接受Luc2质粒的所有小鼠中观察到主要在肺部中的BLI信号。图18B说明在BLI图像上在整个小鼠中感兴趣区域的分析，显示与所有其他小鼠(*p<0.05)相比在接受pCMV-Luc2质粒的小鼠中显著更高(*p<0.05；约100倍)的BLI信号。与模拟注射的小鼠相比，在pPEG小鼠中也观察到显著更高的(*p<0.05)BLI信号。虽然与模拟注射的小鼠相比在pSurv小鼠中可观察到定性地更高的BLI信号，但是定量测量仅显示趋向更高BLI信号的趋势(p＝0.16)。因此，在此小鼠品系中，在肿瘤特异性pSurv情况下，在正常组织中Luc2表达最低。图18C说明在质粒注射之后48h在许多组织中Luc2活性的活体外分析显示与所有其他组相比在pCMV情况下显著更高的(*p<0.05)表达。与模拟注射的动物相比，在pPEG情况下，在心脏、肺部和脾中发现显著更高的(*p<0.05)Luc2活性。在pSurv情况下，Luc2活性在脾中显著更高的(*p<0.05)，并且在肺部中趋向较高活性的趋势(p＝0.13)。图18D说明表现出高于背景的较高hRluc活性的仅有组织是肺(显示的值被归一化至来自模拟注射的小鼠的平均背景值)。因此，从成像(图18B)和活体外组织分析(图18C)确定的Luc2值未被hRluc值归一化。在3个启动子小鼠组中在肺内没有观察到hRluc值的显著差异。因此，在3个组中Luc2测量值的差异不可能与转染效率的差异相关，而是与启动子活性的差异相关。数据被表述为平均值±SD。
图19A-19C说明在原代人成纤维细胞和人癌细胞系中肿瘤特异性启动子活性的比较。原代人成纤维细胞、MDA-MB-231细胞(人乳癌)和MeWo细胞(人黑素瘤)被转染pPEG-或pSurv-驱动的表达Luc2的质粒(1μg)，并且被共转染表达hRluc的无启动子的质粒(50ng)以归一化转染效率。在任何3种细胞类型中没有观察到Rluc转染效率的差异。与pSurv相比，pPEG驱动的质粒导致在成纤维细胞中显著更高的Luc2活性(*p<0.05)。pSurv驱动的质粒导致在MeWo细胞中显著更高的Luc2活性(***p<0.001)，以及在MDA-MB-231细胞中等同的活性。数据被表述为平均值±SD。
图20说明在培养的SK-MEL-28黑素瘤细胞中肿瘤可活化的PP和MC的比较。SK-MEL-28人黑素瘤细胞被转染等质量的肿瘤可活化的MC(n＝3)和PP(n＝3)以及等体积的转染剂PEI。第2天至第7天从10中在转染有MC的细胞的培养基中观察到显著更高的SEAP活性(**p<0.01；***p<0.001)。数据被表述为平均值±SD。
图21A和21B说明在健康(无肿瘤)小鼠中由强组成型启动子驱动的MC和PP之间转基因表达的比较。图21A说明小鼠接受全身性施用MC(n＝4)或PP(n＝5)，其在与PEI(40μg；N/P＝8)络合之后表达由强组成型EF1启动子驱动的hRluc。利用底物腔肠素在第1、2、3、5和7天进行BLI成像。代表性图像显示在所有检查的时间点在施用MC的小鼠中较高的BLI信号。为了比较显示了来自接受5％葡萄糖注射的小鼠的信号(在肝脏中的信号来自氧化的腔肠素)。图21B说明在肺部区域中感兴趣区域的分析显示在第1、2和5天相比于PP小鼠在MC小鼠中显著更高的BLI信号(*p<0.05；**p<0.01)。数据被表述为平均值±SD。
图22A说明血浆SEAP测定的标准曲线分析。在25IA的血浆中以10倍稀释的SEAP测量一式三份的样本。SEAP活性在5个数量级中是线性的并且显示出在25μl的血浆中约3x10-7μg(0.3pg)的检测限。图22B说明在整个线性范围中SEAP测量值是可再现的，测量的变异系数(％CV)小于4％。
图23说明在MC施用之前和之后的肿瘤负荷。在MC施用之前以及MC施用之后两周两只代表性小鼠(上图和下图)的生物发光(BLI)图像(左)，以及在牺牲时(MC施用之后2周)肺部的对应活体外图像(右)。每个BLI图像下方的值代表在肺部上画出的感兴趣区域中的平均辐亮度。这两只小鼠的图像比例尺度有差异。在MC施用后2周期间，两只小鼠均表现出BLI信号的约4.5倍增高，指示持续的肿瘤生长。在牺牲时，在肺内的肿瘤是黑色素性，并且在两只小鼠中均观察到在整个肺部中的多个肿瘤病灶(白色箭头)。基于BLI信号变化，在MC施用时(牺牲之前两周)总肿瘤负荷与在此所示的活体外图像中所见相比将小约4.5倍。
图24说明实施例11的实验结果，将表达FLuc的细胞掺杂于正常PBMC中，表明这种检测方法的检测限是至少3-10个患病细胞/5百万个正常PBMC。
图25说明实施例12的实验结果，癌活化的DNA构建体区分有肿瘤的小鼠和健康小鼠：在静脉内施用存活-SEAP DNA纳米质粒之后，全血通过下颌下放血来收集并且处理成血浆。SEAP测定在20μl等分试样上进行。队列大小是n＝5。
图26A-26F说明聚合物/DNA复合物的体内功效和体外细胞毒性。图26A显示了实验，其中将40μg编码CMV-萤光素酶的DNA配制成在聚合物制剂中或与JetPEI络合，随后静脉内施用于Balb/C小鼠中，在转染后四天将D-萤光素注射入动物中，其后使动物牺牲，并且将肺采集以供活体外BLI分析。为了细胞毒性评估(图26B、26C、26D、26E和26F)，在转染前当天将包含250ng的CMV-Luc DNA的多聚复合物(polyplex)添加至96孔板的每个孔中，接种10,000个细胞/孔。每个制剂进行3次重复测试。48小时后，细胞形态学通过显微镜来记录，并且在MTT测定期间对细胞生存力进行测量；图26B显示空白细胞；图26C显示体内递送具有JetPEI的构建体；图26D显示递送具有高分子量的氨基封端的聚(β-氨基酯)C32-122的DNA；图26E显示递送具有高分子量的氨基封端的聚(β-氨基酯)C32-145的DNA；以及图26F显示MTT测定的细胞生存力结果。
图27说明鱼精蛋白缩合DNA多聚复合物尺寸。将62.5μg的DNA通过与130μg的鱼精蛋白以1:1v/v在50mM乙酸钠缓冲剂(pH＝5.0)中完全混合进行缩合。然后，将DNA/鱼精蛋白复合物用50mM乙酸钠缓冲剂(pH＝5.0)稀释至1.5mL。将鱼精蛋白:DNA LNP在NanoAssemblr(Precision NanoSystems)上以12mL/min的总流量进行组装。将如此制备的颗粒用1X PBS透析至少18h，其后通过Zetasizer来测定尺寸。
图28说明利用萤光素酶来确定递送制剂的生物分布的示例。A)被施用40mg的尾静脉注射的CMV萤光素酶载体(其已经被配制在JetPEI中)的小鼠的体内生物发光成像(BLI)。施用后四天，将小鼠麻醉，施用D-萤光素底物并且立刻在AMI-HT(Spectral InstrumentsImaging)上成像。B)在体内成像之后，将小鼠牺牲并且将器官采集用于活体外BLI。
图29A和29B说明在犬PBMC和源于犬肿瘤的细胞中在活体外测定中Ad-存活蛋白-FLuc的灵敏度和特异性。将源于犬恶性病的各种亚型(包括骨肉瘤、黑素瘤和血管肉瘤)的未经转导的初始细胞掺入5e5个犬PBMC中，然后用0.3MOI的Ad-存活蛋白-FLuc进行转导。A)分析显示对A17骨肉瘤细胞的单细胞检测，或B)在源于多种肿瘤类型的细胞中检测的稳健性。
图30A-C说明在活体外测定中Ad-存活蛋白-FLuc的灵敏度和特异性。A)将被工程化为组成型地表达萤火虫萤光素酶蛋白质的H1299细胞掺入5e6个人正常PBMC中，然后对样本的整体进行处理，并且分析萤光素酶表达。B)将尚未被转导的初始H1299细胞掺入人PBMC中，然后用重组腺病毒进行转导，所述重组腺病毒具有驱动萤火虫萤光素酶的表达的人存活蛋白启动子的表达盒(Ad-存活蛋白-FLuc)。在生长48小时之后，对样本进行处理，并且分析萤光素酶表达。C)将具有仅人PBMC的样本用Ad-存活蛋白-FLuc或Ad-CMV-FLuc进行转导，后者受强组成型启动子控制。在2天孵育之后，发光测定用来量化FLuc表达。
图31显示Ad-存活蛋白-FLuc在对人PBMC的活体外测定中相对于正常区别癌症。对来自正常健康志愿者和癌症患者的人PBMC的商业上可获得的样本进行计数，然后将等效数量的细胞以一致的MOI用Ad-存活蛋白-Fluc进行转导，然后将样本拆分成一式三份。在孵育三天之后，将细胞裂解，并且分析萤光素酶活性。数据被计算为一式三份样本测量值的平均值和标准偏差。P值通过相对于正常PBMC学生T检验进行计算。
图32A和32B显示在辨别健康犬个体和犬淋巴瘤癌症患者方面存活蛋白活化的萤光素酶表达的诊断性能。(A)健康犬个体(n＝31)和犬淋巴瘤癌症患者(n＝17)的发光表达的倍数变化的比较。(B)存活蛋白活化的萤光素酶活性辨别犬淋巴瘤癌症受试者和健康犬受试者的诊断预测能力。
图33A、33B、33C、33D、33E和33F说明在不同组织来源的特定细胞系中各种启动子-报告物构建体的活化，其中基因标记表示构建体中使用的启动子的来源。图33A显示在肝脏来源的细胞系(例如HepG2和Hep3B)中各种启动子-报告物构建体，表明在肝癌中CXCR4、TRIP13、MCM10、COL10A1、BIRC5和BIRC5-501尤其被活化。图33B显示在卵巢来源的永生化细胞系(例如SKOV3和OVCAR)中各种启动子-报告物构建体的活化，表明在卵巢癌中COL10A1、MMP13、UBE2C、MUC1、CEP55、CEACAM5、KIF20A、FAM111B和CST1尤其被活化。图33C显示在胰脏来源的永生化细胞系(例如ASPC1、BXPC3和PANC1)中各种启动子-报告物构建体的活化，表明在胰腺癌中BIRC5、ABCC4、MMP13、CXCR4、UBE2C、MUC1、CDKN3、MCM10、CDC20、CEP55、CEACAM5、KIF20A、CST1和FAM111B尤其被活化。图33D显示在乳腺来源的细胞系(例如MDA-MB-231)中各种启动子-报告物构建体的活化，表明在乳癌中BIRC5、MCM10、MMP1、DTL、CEP55、KIF4A、RGS13、KIF20A、UBE2T、CENPF、CST1、TOP2A、FAM111B和MMP13尤其被活化。图33E显示在肺来源的细胞系(例如A549、H460和H1299)中各种启动子-报告物构建体的活化，表明在肺癌中MCM10、AFP、MMP1、CEP55、CEACAM5、RGS13、KIF20A、CST1、FAM111B和MMP13尤其被活化。图33F显示与33E相同的启动子-报告物构建体但在非转化的乳癌细胞系中的比较，表明除了MMP1之外的显示在33E中被活化的基因可能特别有用于从正常组织辨别乳癌。
图34A、34B和34C说明在黑素瘤、骨肉瘤和血管肉瘤癌细胞系中启动子-报告物构建体的组的活化，其中基因标记表示构建体中使用的启动子。图34A显示在黑素瘤来源的细胞系中该组的成员(例如M2、M3、M4、M5和CMGD)的活化，表明BIRC5、BIRC5-501、CXCR4、UBE2C、TRIP13、CDKN3、MCM10、CDC20、TROAP、CEP55、KIF20A和cBIRC5在黑素瘤中尤其被活化。图34B显示在骨肉瘤来源的细胞系中该组的成员(例如OS17、OS29、OS40和OS484)的活化，表明BIRC5、BIRC5-501、CXCR4、UBE2C、TRIP13、CDKN3、MCM10、CDC20、TROAP、CEP55、KIF20A和cBIRC5在骨肉瘤中尤其被活化。图34C显示在血管肉瘤来源的细胞系中该组的成员的活化，表明BIRC5、BIRC5-501、MMP13、CXCR4、UBE2C、TRIP13、CDKN3、MCM10、CDC20、TROAP、CEP55、KIF20A和cBIRC5在血管肉瘤中尤其被活化。
图35A、35B和35C显示利用多种不同的癌症特异性启动子和连接的条形码的多重检测测定的设计。35A显示多重构建体的设计，其中各种癌症特异性启动子(非描述性地表示为Px、Py和Pz)用于驱动由信号肽与萤光素酶融合而产生的正交报告物的表达，其中间插核酸条形码序列对于用于驱动构建体的所述启动子是独特的(条形码A、B和C分别用于启动子Px、Py和Pz)。图35B显示每个启动子构建体在单独地以等摩尔量转染至H1299细胞中时的相对表达，以及图35C显示每个启动子构建体在组合地以等摩尔量转染至H1299细胞中时的相对表达，表明多个报告物-启动子构建体共转染至同一细胞中没有在给定的细胞系中明显地改变给定启动子的表达模式，表明多重形式是用于产生在单一细胞类型中启动子活化的“谱”的可实施的形式。
图36A、36B和36C显示利用多种不同的肽表位来检测由单独的启动子驱动的报告物的多重检测测定的设计。36A显示多重构建体的设计，其中不同拷贝的CMV启动子驱动由信号肽与萤光素酶融合而产生的正交报告物的表达，其中间插表位肽(例如FLAG、HA、V5或HSV肽表位)条形码对于用于驱动构建体的所述启动子是独特的(36A显示CMV启动子被使用，但是最终设想到多种不同的启动子，例如图35的Px、Py、Pz等)。图36B显示多种表位条形码可以如何与对表位特异性的捕获抗体(例如抗FLAG、抗HA、抗V5或抗HSV)一起用于分离出分泌的报告物构建体以获得对每种启动子的活性的独立测量。图36C显示使用FLAG/HA/V5/HSV-条形码化的萤光素酶构建体共转染至细胞中，表明用每种肽表位加标签的萤光素酶构建体可以被分离，并且用于独立地读出相同细胞中的启动子活化。
图37A、37B和37C显示报告物-启动子构建体的设计，其被设计为使用现成的侧向流动测定(例如妊娠hCG侧向流动免疫测定)来检测在癌细胞系中启动子-报告物构建体的活化，以及对应的性能数据。在此设计中，癌症特异性启动子(Px，在此情况中由存活蛋白启动子代表)用于驱动分泌信号修饰的萤光素酶(其还与人绒毛膜促性腺素(hCG)表位融合)的表达。图37B显示通过各种相关构建体转染至H1299细胞中hCG标签没有明显地中断萤光素酶从存活蛋白启动子表达。图37C显示来自被转染细胞的上清液可以被加载至用于hCG的商业侧向流动免疫测定条上，并且侧向流动免疫测定可以检测加hCG-标签的萤光素酶，表明使用现有的表位免疫测定来读出启动子-报告物构建体的表达的实用性，其中报告物被加表位标签，该表位具有高置信度现成测定。
图38显示本文中所述的基于纳米质粒的启动子构建体的示例。此构建体的序列概述在SEQ ID NO:5中并且包括小R6K起点、RNA-out可选择性标志、存活蛋白启动子、作为报告物的SEAP，以及WPRE元件。
具体实施方式
虽然本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员显而易见，这样的实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员可在不偏离本发明的情况下想到许多变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文中所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
在更详细地描述本公开内容之前，应理解本公开内容不限于所述的具体实施方案，并且当然因此可以改变。还应理解，本文中使用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，而非意在限制，因为本公开内容的范围将仅受随附权利要求限制。
在提供值的范围之处，除非上下文另外明确指出，否则应该理解，在该范围的上限与下限之间的至该下限单位的十分之一的每个中间值，以及在该陈述的范围中的任何其他陈述的值或中间值，都被涵盖在本公开内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该较小范围内并且也被涵盖在本公开内容内，可能有所述范围内任何明确被排除的限制。当所述范围包括所述极限的一个或两个时，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也被包括在本公开内容中。
除非另有定义，本文中使用的所有技术与科学术语具有与本公开内容所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文中所述那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于实施或测试本公开内容，但是现在描述优选的方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同特别地且单独地指出每个单独的出版物专利通过引用而并入，并且通过引用而并入本文中以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是为了其在本申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开内容鉴于现有公开内容而没有资格早于这种出版物之前。此外，提供的出版物的日期可能不同于(可能需要独立地确认的)实际出版日期。
一经阅读本公开内容，对于本领域技术人员而言就变得明显，本文中所述和所示的每个单独的实施方案具有分立的组分和特征，所述组分和特征可以容易地与其他若干实施方案中的任一实施方案的特征分离或组合，而不脱离本公开内容的范围或精神。任一描述的方法可以按照所述事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序实施。
除非另外指出，本公开内容的实施方案将采用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药物学、毒理学等的技术，其在本领域技术内。此类技术在文献中被充分解释。
必须注意，如本说明书和随附权利要求书中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种支持物”包括多种支持物。在本说明书和以下权利要求中，将提及多个术语，其将被定义为具有以下意义，除非显然是相反之意。
如本文中使用的，除非另外指明，以下术语具有其所属的含义。在本公开内容中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”等可以具有在美国专利法中其所属的含义，并且可以意指“包括”、“包含”等；“基本上由……组成”或“基本上组成”等，当应用于本公开内容涵盖的方法和组合物时是指组合物，例如本文中公开的那些，但是其可以包含附加的结构基团、组合物组分或方法步骤(或如上所述其类似物或衍生物)。但是，与本文中公开的对应组合物或方法的那些相比，这种附加的结构基团、组合物组分或方法步骤等，实质上不影响所述组合物或方法的基本的和新颖的特征。
在描述各种实施方案之前，以下定义被提供，并且除非另外指出应被使用。
定义
术语“受试者”可以包括人类或非人类动物。因此，本文中所述的方法和组合物可应用于人类和兽医疾病和动物模型。优选的受试者是“患者”，即，针对疾病或病症接受医学护理的活着的人类。这包括没有定义的疾病的个人，对其研究病理学体征。还包括疑似具有或处于定义的疾病风险的个人。
如本文中使用的术语“基因”是指与具有遗传功能的单个遗传单位邻接地缔合的所有调节和编码序列。基因可以包括调节遗传功能的非编码序列，包括但不限于指定以下的那些序列：多腺苷酸化、转录调节、DNA构象、染色质构象、碱基甲基化的程度和位置，以及控制所有这些的蛋白质的结合位点。编码蛋白质的基因包括“外显子”(编码序列)，其可能被“内含子”(非编码序列)中断。在一些情形中，多种蛋白质或核酸或其他分子的复合物，或前述中的任何两种的复合物，可能是基因功能所需的。在另一方面，基因的遗传功能可能仅需要RNA表达或产生蛋白质，或者可能仅需要蛋白质和/或核酸的结合而无需相关的表达。在某些情况中，彼此相邻的基因可能共享序列，以至一个基因将与另一基因重叠。基因可以在生物体的基因组内、在人工染色体中、在质粒中、在任何其他种类的载体中找到，或者作为单独的分离的实体。
如本文中使用的术语“附加体复制载体”或“附加体载体”是指典型地未被整合入宿主细胞的基因组中但并行存在的载体。附加体复制载体可以在细胞周期期间被复制，并且在此复制的过程中载体拷贝根据在细胞分裂之前和之后存在的拷贝数而统计地分布在所得的细胞中。复制可以发生在宿主细胞的核中并且优选地在细胞周期的S期期间复制。此外，附加体复制载体可以在宿主细胞的核中在细胞周期的S期期间复制至少一次，即一次或多次。
术语“样本”被定义为在本文中所述的分析或实验方法中要被测试的任何材料。样本通常从本文中所述的受试者获得。样本包括但不限于血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑)、房水、羊水、胸膜液或受试者的呼气。在一些实施方案中，样本是经由非侵入性方法获得(例如是非侵入性样本)。示例性非侵入性方法包括但不限于被动收集体液或无伤害的刮擦从外部环境可接近的(例如表皮或嘴的)组织。示例性非侵入性样本包括但不限于唾液、痰液、粘液、汗液、尿液、粪便、精液、子宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液或脸颊上皮拭子。在一些实施方案中，样本是经由微侵入性方法获得。示例性微侵入性方法包括但不限于毛细管收集、静脉穿刺、胸腔穿刺、羊膜穿刺、针吸或洗胃。示例性微侵入性样本包括但不限于血液或血液级分(例如血浆或PBMC制品)、组织间液、胆汁、胃液和羊水。在一些实施方案中，样本是经由活检获得。示例性活检样本包括但不限于皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得内部器官的样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。
如本文中使用的术语“复制起点”是指由复制起始因子或DNA复制酶识别而导致复制包含该复制起点的质粒的DNA序列。表述“由复制起始因子识别”旨在意指复制起始因子可以与复制起点序列的全部或部分物理地相互作用，从而导致或刺激分子机制，其最终使包含该复制起点的DNA分子的全部或部分被复制。因此，复制起点典型地包含功能上所需的元件。这种功能上所需的元件的一个示例是EBV复制起点(OriP)的重复家族(FR)元件或二重对称(DS)元件。包含功能上所需的元件的其他复制起点是本领域中熟知的，并且在例如Bode等人，(2001)Gene Ther.Mol.Biol.6:33-46中描述。本公开内容的亲代核酸质粒载体优选地包含至少一个复制起点。
“载体”是能够将其他可操作地连接的异源或重组核酸序列转移至靶细胞的核酸序列。在一些实施例中，载体是微环、质粒、纳米质粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、粘粒、噬菌粒、噬菌体基因组或杆状病毒基因组。适合的载体还包括源于噬菌体或植物、无脊椎动物或动物(包括人类)、病毒的载体，例如CELiD载体、腺相关病毒载体(例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其假型组合例如AAV2/5、AAV2/2、AAV-DJ或AAV-DJ8)、反转录病毒载体(例如MLV或其自失活或SIN变化形式或其假型变化形式)、疱疹病毒的(基于例如HSV-或EBV的)、慢病毒载体(例如基于HIV、FIV或EIAV的或其假型变化形式)或腺病毒载体(例如基于Ad5的，包括其复制缺陷型、可复制型或辅助依赖型变化形式)。在一些实施方案中，载体是可复制型病毒衍生的载体。在一些实施方案中，载体是不可复制型病毒衍生的载体。在一些情况中，载体可以包含附加体维持元件以促进在一种或多种靶细胞类型中复制，例如支架/基质附着区(S/MAR)。S/MAR元件特别有用于促进在“裸”核酸载体例如微环的背景中复制。示例性适合的S/MAR元件包括但不限于，来自免疫球蛋白重链基因座的EμMAR、来自人载脂蛋白B基因座的apoB MAR、来自鸡溶菌酶基因座的Ch-LysMAR，以及来自人IFNβ-基因座的huIFNβMAR。载体可以包含能够在靶细胞中被表达的编码序列。因此，如本文中使用的术语“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”可以是指能够指导目的基因的表达并且有用于将该目的基因转移至靶细胞中的任何核酸构建体。本文中所述的载体还可以包含一种或多种顺式作用元件以稳定或改进来自其的mRNA的表达。这种顺式作用元件包括但不限于在例如Johansen等人，The Journal of Gene Medicine.(5)12:1080-1089(doi:10.1002/jgm.444)，或者Vlasova-St.Louis和Sagarsky.Mammalian Cis-Acting RNA Sequence Elements(doi:10.5772/intechopen.72124)中描述的任何元件。
作为载体形式之一，如本文中使用的术语“微环”是指小双链环形DNA分子，其提供存在于载体上的目的序列的持续高水平表达，所述目的序列可以编码多肽、shRNA、反义RNA、siRNA及诸如此类。目的序列与存在于微环载体上的调节序列可操作地连接，所述调节序列控制其表达。这种微环载体描述在例如公布的美国专利申请US20040214329中，其通过援引而明确地并入本文中。作为载体的不同形式，“纳米质粒”是指载体，该载体可以包含最小化的细菌ColE1或R6K复制起点(其允许这种纳米质粒在细菌宿主菌株中可复制)、细菌RNA-可选择性标志和真核基因区。这种纳米质粒可以包含SEQ ID NO:3的小R6K起点和/或SEQ ID NO:4的RNA-OUT可选择性标志。这种元件的其他示例(纳米质粒起点和RNA-out可选择性标志)描述在例如US9737620B2中，其出于描述纳米质粒序列元件的目的通过援引并入本文中。
微环载体的总长度足以包括如下所述的期望的元件，但并非如此长以至在不可接受的水平上防止或基本上抑制该载体在与细胞接触(例如通过全身性施用于包含该细胞的宿主)时进入靶细胞的能力。因此，微环载体通常可以是至少约0.3kb长，时常至少约1.0kb长，而亲代载体可以长达6kb、10kb或更长。
微环载体不同于细菌质粒载体在于它们缺少复制起点或缺少天然的复制起点(例如可以包含最小化的合成细菌复制起点)以及缺少细菌质粒中普遍存在的选择标志，例如p-内酰胺酶、四环素抗性(tet)、卡那霉素抗性(kan)或其他抗生素选择标志。因此，微环变得尺寸较小，允许更有效的递送。微环缺少转基因表达沉默效应，其与亲代质粒的载体骨架核酸序列相关，从所述亲代质粒切除微环载体。微环可以基本上没有除了重组酶杂交产物序列和目的序列(即，转录的序列和表达所需的调节序列)以外的其他载体序列。
如本文中使用的术语“纳米质粒”是指载体，该载体可以包含最小化的细菌ColE1或R6K复制起点(其允许这种纳米质粒在细菌宿主菌株中可复制)、细菌RNA-可选择性标志和真核基因区。纳米质粒的一些实施方案描述在例如US20150275221A1中。在一些实施方案中，纳米质粒可以包含融合细菌RNA-可选择性标志/最小化的复制起点。在一些实施方案中，该融合细菌RNA-可选择性标志/最小化的复制起点可以位于合成内含子内，该合成内含子位于纳米质粒的真核基因区内。
RNA可选择性标志是载体携带的被表达的非翻译的RNA，其调节染色体表达的靶基因以提供载体的选择。这可以是质粒携带的无义抑制tRNA，其调节无义可抑制性可选择性染色体靶，如通过援引而被包括在本文中的Crouzet J和Soubrier F的2005美国专利6,977,174所述。这还可以是质粒携带的反义阻遏RNA、阻遏RNA-IN调节的靶的RNA-OUT基因、阻遏RNAII调节的靶的编码pMBl质粒起点的RNAI、阻遏RNA II调节的靶的编码IncB质粒pMU720起点的RNAI、质粒RI的阻遏Hok调节的靶的ParB基因座Sok、F质粒的阻遏flmA调节的靶的Flm基因座FlmB、另一天然反义阻遏RNA，例如在比如Wagner EGH,Altuvia S,RombyP.2002.Adv Genet 46:361以及Franch T和Gerdes K.2000.Current Opin Microbiol 3:159中描述的那些，或者工程化的阻遏RNA，例如合成的小RNA例如SgrS、MicC或MicF支架，如Park等人，Nature Biotechnology 31卷，第170–174页(2013)中所述。
根据本公开内容多种适合的转染细胞的方法是可利用的。“转染”意指因摄取外源核酸(通常DNA)所致的细胞改变。术语“转染”的使用并非意在将外源核酸的引入限制于任何特定的方法。因此，适合的方法包括病毒感染/转导、接合、纳米颗粒递送、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射等。方法的选择取决于被转染的细胞类型以及转染发生所处的情况(即在体外、活体外或体内)。这些方法的概括论述可以在Ausubel等人，ShortProtocols in Molecular Biology,第3版，Wiley&Sons,1995中查到，其通过援引而并入。
术语“转染剂”可以涵盖介导DNA或RNA掺入宿主细胞中的任何化合物例如脂质体。用于转化或转染宿主细胞的适合方法可以在Sambrook等人，(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)、Ausubel等人，Short Protocols inMolecular Biology，第3版，Wiley&Sons,1995及其他实验室手册中查到，其通过援引而并入。适合的转染剂的示例包括但不限于线型或支化的聚乙烯亚胺、纳米颗粒、脂质体、亲脂性颗粒、固体纳米颗粒、两性肽、胶束、树枝状分子、聚合物组合物、水凝胶、合成的或天然衍生的外泌体、病毒样颗粒或其任何组合。
如本文中使用的术语“EXOmotif”是指控制miRNA加载入外泌体中的RNA序列。在一些实施方案中，EXOmotif可以介导miRNA与异质性核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)的结合，其已经被描述为控制miRNA加载入外泌体中。这种序列包括但不限于5′-GGAG-3′和5′-CCCU-3′。
如本文中使用的术语“核酸分子”和“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)聚合物形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的任何DNA序列、控制区、分离的任何RNA序列、核酸探针和引物。核酸分子可以是线型或环形。
术语“启动子”是指导多核苷酸的转录的DNA序列。典型地，启动子可以位于要被转录的多核苷酸的5'区中，邻近这种多核苷酸的转录起始位点。更典型地，启动子被定义为第一外显子上游的区域；更典型地，为多个转录起始位点中的第一个上游的区域。启动子时常能够指导位于互补DNA链的每个链上在启动子3'处基因的转录。换言之，许多启动子表现出双向性并且可以在以任一取向(即相对于该基因的编码区5'至3'或3'至5')存在时指导下游基因的转录。此外，启动子还可以包括至少一个控制元件例如上游元件。这种元件包括上游活化因子区(UAR)，任选地以及影响多核苷酸转录的其他DNA序列例如合成的上游元件。
当在本文中提及多肽时使用的术语“编码序列”和“编码”是指例如，当核酸存在于活细胞(在体内)并且处于适当的调节序列(或“控制元件”)控制下时被转录(在DNA情况中)和被翻译(在mRNA情况中)成多肽的核酸分子。编码序列的边界典型地取决于在5'(氨基)末端处的起始密码子以及在3'(羧基)末端处的翻译终止密码子。编码序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒、真核或原核DNA的基因组DNA序列，以及合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'处，并且启动子可以位于编码序列的5'处；以及另外的控制序列(若需要)，例如增强子、内含子、多聚腺苷酸化位点等。编码多肽的DNA序列可以通过利用由选择的细胞优选的密码子在选择的细胞中优化表达以呈现期望的多肽编码序列的DNA拷贝。
如本文中使用的术语“条形码”或“条形码分子”通常是指传递或能够传递关于与条形码/条形码分子附接的分子的信息的标记或标识符。条形码/条形码分子可以是独特的。条形码/条形码分子可以具有各种不同的形式。例如，条形码/条形码分子可以包括多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码/条形码分子可以以可逆或不可逆的方式附接至分子。条形码可以在对样本测序之前、期间和/或之后添加至例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样本的片段。条形码可以允许鉴定和/或量化各个测序读段。
如本文中使用的术语“可操作地连接”是指元件的排布，其中如此描述的组分被配置为执行其通常的功能。因此，与编码序列(例如报告物表达盒)可操作地连接的给定启动子能够在适当的酶存在时影响编码序列的表达。启动子或其他控制元件不需要与编码序列邻接，只要它们发挥功能指导其表达。例如，间插的未被翻译却转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且启动子序列仍然可以被视为“可操作地连接”至编码序列。
如本文中使用的术语“表达盒”是指能够指导任何RNA转录的表达的任何核酸构建体，包括基因/编码目的序列以及未翻译的RNA，例如shRNA、microRNA、siRNA、反义RNA及诸如此类。这种盒可以被构建于“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”中，以便将表达盒转移入靶细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。
如本文中使用的术语“靶细胞”是指其中需要基因修饰的细胞。靶细胞可以是分离的(例如在培养)或在多细胞生物体中(例如在胚泡中、在胎中、在出生后动物中等)。
如本文中使用的术语“药学上可接受的载剂”(药学上可接受的carrier)是指与本公开内容的探针一起施用的并且由联邦监管机构或州政府批准或列于美国药典或用于动物且更尤其人类的其他公认药典中的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。这种药物载体可以是液体例如水和油(包括石油、动物、植物或合成来源的那些油)，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及诸如此类。药物载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等。当施用于患者时，探针和药学上可接受的载剂可以是无菌的。当探针被静脉内施用时，水是有用的载体。盐水溶液和含水的右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其用于可注射的溶液。适合的药物载体还包括赋形剂例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇及诸如此类。本发明组合物(若需要)还可以包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。本发明组合物可以有利地采用溶液、乳剂、持续释放制剂的形式，或适合于使用的任何其他形式。
术语“可检测的”是指相对于背景信号检测信号的能力。可检测的信号被定义为利用可用于临床前用途的设备足以产生可接受的图像的量。可检测的信号可以通过一次或多次施用本公开内容的探针而产生。施用的量可以根据因素例如个体的敏感性程度、个体的年龄、性别和重量、个体的特异反应性、剂量学及诸如此类而改变。施用的量还可以根据仪器和数字处理相关的因素而改变。
如本文中使用的术语“体内成像”是指其中生命体的结构、功能或生理状态是可检查的而无需结束生命牺牲的方法或过程。
如本文中使用的术语“非侵入性体内成像”是指其中生命体的结构、功能或生理状态通过远程身体探查是可检查的而无需破坏身体的外(皮肤)表面或内(可接近的孔口)表面的身体完整性的方法或过程。
“成像部分”可以在受试者人类或非人动物体外部或经由使用被设计为体内使用的检测器例如血管内辐射或光学检测器例如内镜或被设计为手术内使用的辐射检测器进行检测。成像部分优选地是但不限于适合用于体内光学成像的报告物。
如本文中使用的术语“生物发光”是指由生物分子尤其蛋白质发射光的化学发光类型。生物发光的基本条件是在加氧酶存在下结合的或游离的分子氧、萤光素酶(其作用于底物)、萤光素(在分子氧存在下并且将底物转化成激发态，其一经返回至较低能级就以光的形式释放能量)。
如本文中使用的术语“萤光素酶”是指催化发光反应的加氧酶。例如，细菌萤光素酶催化黄素单核苷酸和脂肪族醛的氧化，该反应产生光。存在于海洋节肢动物中的另一类型的萤光素酶催化海萤萤光素的氧化，而另一类型的萤光素酶催化鞘翅目萤光素的氧化。因此，“萤光素酶”是指催化生物发光反应的酶或光蛋白。萤光素酶例如萤火虫和海肾萤光素酶是在生物发光反应期间发挥催化作用并且不改变的酶。与萤光素非共价结合的萤光素酶光蛋白例如水母发光蛋白和obelin光蛋白在生物发光反应期间通过释放萤光素而改变。萤光素酶是生物中天然存在的蛋白质或其变体或突变体，例如通过诱变而产生的具有一种或多种特性(例如热稳定性或pH稳定性)的不同于天然存在的蛋白质的变体。萤光素酶及其修饰的突变体或变体形式是熟知的。例如，提及的“海肾萤光素酶”意指从海肾(Renilla)属的成员分离的酶，或从任何其他来源获得例如从另一珊瑚虫纲或已经合成地制备的等效分子。
“生物发光蛋白质”是指能够作用于生物发光引发剂分子底物而产生或发射生物发光的蛋白质。
“生物发光引发剂分子”是可以与生物发光供体蛋白质反应而产生生物发光的分子。生物发光引发剂分子包括但不限于腔肠素、其类似物及其功能衍生物。腔肠素的衍生物包括但不限于腔肠素400a、腔肠素cp、腔肠素f、腔肠素fcp、腔肠素h、腔肠素hcp；腔肠素ip、腔肠素n、腔肠素0、腔肠素c、腔肠素c、腔肠素i、腔肠素icp、2-甲基腔肠素、苄基-腔肠素二脱氧腔肠素和深蓝腔肠素(DBC)(更详细地描述在美国专利第6,020,192；5,968,750和5,874,304号中)。
一般而言，腔肠素已知在受各种生物发光蛋白质尤其萤光素酶作用时发光。有用的但非限制性腔肠素公开在2001年11月2日提及的美国专利申请序列号10/053,482中，其公开内容通过援引以其整体并入本文中。腔肠素可从Promega Corporation,Madison,Wis.和Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg获得。腔肠素还可以被合成，如在例如Shimomura等人，(1989)Biochem.J.261:913-920；Inouye等人，(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.233:349-353,1997；以及Teranishi等人，(1997)Anal.Biochem.249:37-43中所述。
如本文中使用的术语“存活蛋白”是指也称为包含杆状病毒凋亡抑制剂重复5或BIRC5的蛋白质，是在人类中由BIRCS基因编码的蛋白质。(NCBI参考序列：NG 029069.1)。存活蛋白是凋亡抑制剂(IAP)家族的成员。存活蛋白抑制胱天蛋白酶活化，从而导致对凋亡的负调节或程序化细胞死亡。这已经通过存活蛋白诱导途径的中断而显示，导致凋亡的增长以及肿瘤生长的下降。存活蛋白在大多数人肿瘤和胎组织中高度表达，但是在晚期分化的细胞中完全不存在。存活蛋白表达也受细胞周期高度调控并且仅在G2-M期被表达。已了解存活蛋白在有丝分裂期间通过与微管蛋白相互作用而定位于有丝分裂纺锤体并且可以在调节有丝分裂方面起到促进作用。存活蛋白的调节似乎与p53蛋白质相关。它也是Wnt途径的直接靶基因并且由β-连环蛋白上调。
但是，考虑到本公开内容的微环可以利用与报告物或期望在靶细胞中表达的其他异源核酸序列可操作地连接的任何肿瘤特异性启动子。例如，但意在非限制性，本领域已知的适合的启动子包括：在黑素瘤中肿瘤特异性的CXCR4启动子；在肺癌中肿瘤特异性的己糖激酶II型启动子；在前列腺癌中优先活性的TRPM4(瞬时受体电位-Melastatin 4)启动子；乳癌细胞特异性的溶基质素3启动子(Basset等人，(1990)Nature 348:699)；非小细胞肺癌细胞特异性的表面活性蛋白质A启动子(Smith等人，1994)Hum.Gene Ther.5:29-35)；对表达SLPI的癌特异性的分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)启动子(Garver等人，(1994)GeneTher.1:46-50)；黑素瘤细胞特异性的酪氨酸酶启动子(Vile等人，(1994)Gene Ther.1:307)；纤维肉瘤/致肿瘤性细胞特异性的应激可诱导的grp78/BiP启动子(Gazit等人，(1995)Cancer Res.55:1660)；多形性胶质母细胞瘤细胞特异性的白介素-10启动子(Nitta等人，(1994)Brain Res.649:122)；脑瘤细胞特异性的a-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子(Aoyama等人，(1993)Int.J.Cancer 55:760)；对鳞状细胞癌、胶质瘤和乳房肿瘤细胞特异性的表皮生长因子受体启动子(Ishii等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:282)；乳癌细胞特异性的粘蛋白样糖蛋白(DF3,MUC1)启动子(Abe等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:282)；转移性肿瘤特异性的mts 1启动子(Tulchinsky等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:9146)；小细胞肺癌细胞特异性的NSE启动子(Forss-Petter等人，(1990)Neuron 5:187)；小细胞肺癌细胞特异性的生长抑素受体启动子(Bombardieri等人，(1995)Eur.J.Cancer 31A:184；Koh等人，(1995)Int.J.Cancer 60:843)；乳癌细胞特异性的c-erbB-3和c-erbB-2启动子(Quin等人，(1994)Histopathology25:247)；对乳癌和胃癌细胞特异性的c-erbB4启动子(Rajkumar等人，(1994)BreastCancer Res.Trends 29:3)；甲状腺癌细胞特异性的甲状腺球蛋白启动子(Mariotti等人，(1995)J.Clin.Endocrinol.Meth.80:468)；肝癌细胞特异性的甲胎蛋白启动子(Zuibel等人，(1995)J.Cell.Phys.162:36)；胃癌细胞特异性的绒毛蛋白启动子(Osborn等人，(1988)Virchows Arch.A.Pathol.Anat.Histopathol.413:303)；以及肝癌细胞特异性的清蛋白启动子(Huber,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8099)，其通过援引全部并入本文。启动子的其他示例是ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(calcyclin binding protein)(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关的激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框(chromobox)3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体(seven-pass G-type receptor)3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白(trophinin)相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、其功能片段或其任何组合。
其他定义在以下上下文中提供。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与分子生物学领域普通技术人员普遍理解的相同的含义。虽然与本文中所述那些相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本公开内容，但是本文中描述了适合的方法和材料。
缩写
SEAP，分泌的胚碱性磷酸酶；MRI，磁共振成像；SPECT，单光子发射计算机断层成像术；MC，微环；PP，亲代质粒；WPRE，土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE；Luc，萤光素酶；BLI，生物发光成像；ROI，目的区；AUC，曲线下面积；RG，报告基因；TS，肿瘤特异性；Fluc(FLUC)，萤火虫萤光素酶，ROC(接受者操作特性曲线)
引言
癌症的早期检测可以大幅地改进可利用的治疗策略的功效。然而，尽管数十年致力于基于血液的生物标志物癌症检测，许多有希望的内源性生物标志物已经由于棘手的问题例如来自非恶性组织的高度可变性背景表达而在临床上失败。改善的癌症诊断的策略传统上依赖于经由分子成像或基于血液的测定来测量在癌细胞中过度表达的内源性分子。这些策略的挑战在于在非癌组织内时常显著的表达，导致高背景水平和令人困惑的结果。替代策略是将肿瘤特异性(TS)蛋白质的启动子用在外源性递送的基因载体中以便严格地在肿瘤内驱动独特的报告基因(RG)的表达。为了使此策略变成现实，安全性、特异性和灵敏度非常重要。虽然比病毒载体更安全，但是非病毒载体的两个缺点是低基因转移率和短暂的表达谱。微环(MC)是缺少细菌骨架的质粒并且有利地克服了以上关键问题。
本公开内容提供基于全身性施用安全的肿瘤可活化的微环的替代且有利的检测策略的实施方案，其利用泛肿瘤特异性存活蛋白启动子来驱动分泌性报告基因的表达，所述分泌性报告基因几乎仅在有肿瘤的受试者中的血液中是可检测的。在全身性施用之后，已经显示在多达2周期间简单地通过测量血液报告物水平而从无肿瘤受试者辨别有实验人黑素瘤转移的小鼠的稳健能力。报告物水平的累积变化也鉴别出有肿瘤的受试者，并且接受者操作特性曲线分析以0.918±0.084的AUC突显了此测试的性能。与累积报告物水平相关的肺肿瘤负荷(r2＝0.714；p<0.05)表明确定疾病程度是可能的。继续开发我们的系统可能由于在肿瘤中暂时受控的高报告物表达而大幅改进肿瘤可检测性，并且来自健康组织的几乎零背景是可能的。
驱动分泌的胚碱性磷酸酶(SEAP)或萤火虫萤光素酶(FLUC)的表达的肿瘤特异性纳米质粒载体已经被开发，并且已经在全身性施用之后利用基于血液的和/或基于成像的测定验证了它们用于检测肿瘤的实用性。对于用于癌症筛查目的的基因载体而言，挑战包括有效的肿瘤递送、实现强大的表达以获得最大灵敏度、对表达的严格控制以获得肿瘤特异性，以及最小化安全问题。肿瘤特异性微环载体可以克服所有这些挑战，并且现已显示全身性施用的肿瘤特异性微环载体可以经由血清和非侵入性成像来测定以便从正常受试者差异性地鉴定有肿瘤的受试者。重要地，本公开内容的肿瘤特异性微环载体由于存活蛋白启动子在许多不同肿瘤类型的肿瘤细胞中都驱动表达故而有利地在许多患者群中具有广泛的可适用性。本公开内容的肿瘤特异性微环载体提供了新颖的癌症管理方案，其包括经由初始的基于血液的测定来检测肿瘤，经由分子基因成像来定位肿瘤，以及利用诊断治疗兼顾的肿瘤特异性微环载体来治疗肿瘤。
本公开内容涵盖非常有利于检测肿瘤细胞的核酸纳米质粒载体的实施方案。在实践中，本公开内容的微环包含肿瘤特异性启动子，其与期望要在肿瘤细胞或包含肿瘤细胞群的组织中选择性表达的核苷酸序列可操作地连接。在本公开内容的一些实施方案中，微环载体包含肿瘤特异性启动子，其与编码用作报告物的多肽的核苷酸序列可操作地连接。因此，当由接受者肿瘤细胞表达时，报告物可以是可检测的，从而提供信息，例如肿瘤细胞视觉图像和/或其在受试者人类或非人类动物的组织中的位置。
在一些实施方案中，根据本公开内容的纳米质粒载体可以有利地将可表达的报告基因递送至肿瘤细胞。报告基因可通过非侵入性检测方法诸如MRI成像、PET成像、SPECT成像、发光成像及诸如此类进行检测，这在本公开内容的范围内。例如，而非意在限制性，MRI报告基因编码肌酸激酶；酪氨酸酶；运铁蛋白受体；铁蛋白；Mag A。PET成像报告基因包括但不限于例如单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSV1-TK)；次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶；L-氨基酸脱羧酶；多巴胺2受体(D2R，包括突变D2RA80)；生长抑素受体；雌激素受体(hERL)；多巴胺转运体；碘化钠同向转运体；儿茶酚胺转运体；13-半乳糖苷酶。PET/SPECT成像报告基因包括但不限于单纯疱疹病毒1型胸苷激酶和多重优化的突变体，例如HSV1-sr39tk；多巴胺2型受体；碘化钠同向转运体；生长抑素2型受体；人去甲肾上腺素转运体；人雌激素受体；人脱氧胞苷激酶的突变体；以及重组癌胚抗原。生物发光报告基因包括但不限于萤火虫萤光素酶(fl)；合成海肾萤光素酶(hrl)；增强的绿色荧光蛋白(egfp)；红色荧光蛋白(rfp)；单体红色荧光蛋白(mrfp 1)及诸如此类。报告基因还可能适合于掺入本公开内容的微环中以提供多模式的成像方法。例如，而非意在限制性，适合用于光声成像、MRI和PET成像的报告基因是编码人酪氨酸酶的基因，如Qin等人所述，(2013),Sci.Rpts.3:Art.No.:1490，其通过援引以其整体并入本文中。
本公开内容的纳米质粒除了有利地用于选择性地检测接受者肿瘤细胞之外，为了减少或消除来自受试者人类或非人类动物的靶向肿瘤细胞，与肿瘤特异性启动子可操作地连接的核苷酸序列可以编码有用于调制接受者肿瘤细胞的增殖或代谢活性的多肽。
例如，而非意在限制性，有利于靶向和治疗性激惹肿瘤细胞的治疗有效的多肽包括HSVtk；胞嘧啶脱氨酶；DT黄递酶；硝基还原酶；鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；嘌呤核苷磷酸化酶；胸苷磷酸化酶(phorphorylase)；羧酸酯酶；叶酰基聚谷氨酰合成酶；羧肽酶Al；羧肽酶G2；细胞色素P-450(CYP2B1)及诸如此类。这些多肽用于将前药转化为有效治疗性组合物的活性描述在例如Harrington等人，(2002)Clinical Oncology 14:148-169中，其通过援引以其整体并入本文中。
在本公开内容的其他实施方案中，考虑到从微环肿瘤特异性表达的核苷酸序列可能不被翻译成异源性多肽，而是可能被表达为干扰短核糖核苷酸序列(siRNA)，其可以与接受者肿瘤细胞的至少一个基因调节元件相互作用，从而调制接受者肿瘤细胞的增殖或代谢活性。可替代地，考虑到，核苷酸序列可以被表达为微RNA序列(miRNA)或合成RNA序列，其不对应于任何已知的内源性序列并且仅用作通过基于核酸杂交或扩增的技术是可检测剂(核酸生物标志物)。
因此，提供核酸微环载体(及其亲代质粒)的实施方案被视为在本公开内容的范围内，其有用于选择性地靶向体外培养的肿瘤细胞，或者非常有利地体内获得可检测的信号以鉴定和/或定位受试者中的癌细胞或肿瘤细胞群，以及用于将治疗剂(肽、多肽、核酸)递送至被靶向的肿瘤细胞。
本公开内容提供用于向受试者人类或非人类动物施用的核酸微环载体，以便检测一个或多个靶向肿瘤细胞(包括肿瘤组织)的存在。例如，微环构建体MC-pSurv-SEAP-WPRE-SV40聚A(如图3中所示并且具有图13中所示的核苷酸序列SEQ ID NO:1)包含核酸片段，该核酸片段编码与肿瘤特异性启动子p存活蛋白可操作地连接的可检测的多肽分泌的胚碱性磷酸酶(SEAP)。
当递送至培养的黑素瘤细胞，皮下黑素瘤异种移植或静脉内递送至具有形成的肿瘤的动物，本公开内容的微环载体在微环载体构建体中提供可检测的信号，作为血清分泌的碱性磷酸酶多肽或生物发光信号，其中SEAP已经被替换为萤光素酶报告物，如图4中所示(并且具有图14中所示的核苷酸序列SEQ ID NO:2)。因此，已经证实本公开内容的微环构建体可以鉴定接受者动物或人类中的转移性肿瘤细胞或局限性肿瘤。
本公开内容进一步提供调制靶向的肿瘤细胞的生理或增殖的方法，所述方法是通过将微环核酸递送至所述肿瘤细胞，允许靶向的细胞从与肿瘤特异性启动子可操作地连接的核酸序列表达核苷酸序列，以及允许被表达的产物与靶向的细胞相互作用，从而调制一个或多个细胞的生理状态。
在第一情形中，本公开内容提供核酸微环的实施方案，其中肿瘤特异性启动子是例如但不限于存活蛋白启动子。
因此，为了克服内源性生物标志物检测的局限性，本公开内容提供基于利用基于血液检测外源递送的基因编码的报告物来鉴定有肿瘤的个体的策略的实施方案，所述报告物产生肿瘤驱动的生物标志物。此策略的主要优点在于能够调整生物标志物表达仅仅在特定表型的细胞(即肿瘤细胞)中，从而减少由于从非恶性组织产生的蛋白质所致的假阳性的数量。因此，全身性施用编码分泌性报告基因的肿瘤可活化的载体可以用于鉴定有肿瘤的受试者，条件是，通过利用肿瘤特异性启动子(表达仅存在于肿瘤中的蛋白质的基因的启动子)，使转基因表达转录地靶向癌细胞，如图1中所示。为了此策略转变至临床，安全性、特异性、灵敏度和广泛的可适用性是重要的，并且本公开内容的系统的每种组分被选择为提供最大的翻译潜力。具体地，本公开内容提供编码报告基因(包括但不限于人分泌的胚碱性磷酸酶(SEAP))的非病毒的肿瘤可活化的微环(MC)，其通过使用肿瘤特异性启动子(例如但不限于存活蛋白启动子(pSurv))来获得肿瘤特异性。
虽然比病毒载体更安全，但是传统的非病毒载体(即质粒)的两个缺点是低基因转移率和短暂的表达谱。MC基本上是缺少仅针对在细菌中扩增所需的原核骨架的质粒。MC已经重复地显示，相比于它们的质粒对应物，由于它们的较小尺寸和减少的启动子沉默而表现出改进的表达谱(在非分裂细胞中数月而在分裂细胞中数周)(Darquet等人，(1997)GeneTherapy 4:1341-1349；Darquet等人，(1999)Gene Therapy 6:209-218；Chen等人，(2003)Mol.Therapy:J.Am.Soc.Gene Therapy 8:495-500；Chen等人，(2004)Gene Therapy 11:856-864)。MC还符合调节“没有抗生素抗性基因的质粒”(pFAR)原理(Marie等人，(2010)J.Gene Med.12:323-332)，其已知相比于包含抗生素抗性基因的构建体对于人类施用而言更安全。此外，虽然在传统上制备MC是非常劳动密集且耗时的，MC制备方案的最新进展已经可以在短时间段中以相对容易且降低的成本进行大量生产(Kay等人，(2010)Nat.Biotech.28:1287-1289)。最后，虽然在许多基因(尤其病毒)载体的情况下，甚至利用有效的体内递送方法例如直接局部注射和电穿孔，整合是安全性问题，但是非病毒载体的整合率大约1-3个数量级地低于自发性基因灭活突变率(Wang等人，(2004)Gene Therapy11:711-721；Nichols等人，(1995)Annals New York Acad.Sci.772:30-39；Ledwith等人，(2000)Develop.Biologicals 104:33-43；Ledwith等人，(2000)Intervirology 43:258-272)。因此，就翻译潜力、效力和安全性而言，MC已经变为最有用的非病毒载体平台之一。
SEAP是常用的分泌性报告蛋白质并且具有许多理想的特性。它是仅在胚胎发生期间表达的人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的人工C末端截短的分泌性形式；因此，它是独特的报告物，通常不存在于血液中并且应具有接近零的背景(Berger等人，(1988)Gene 66:1-10)。相比于PLAP，SEAP不寻常地热稳定；因此，通过将样本加热至65℃允许SEAP被特异性地测定(Bronstein等人，(1994)BioTechniques 17:172-174,76-177)。商业SEAP检测测定在至少4-log量级浓度范围中极其灵敏，检测限在皮克/毫升范围。SEAP也是转变于临床中的有利的基于蛋白质的报告物，因为：1)在小鼠和大动物中它已表现出对非病毒基因转移的有效纵向监测(Brown等人，(2008)Methods Mol.Biol.423:215-224)；2)其人类来源表明它在患者中可能具有减弱的或零免疫原性潜力，类似于在免疫活性的小鼠中用鼠SEAP(mu-SEAP)已表现的(Wang等人，(2001)Gene 279:99-108)；和3)。SEAP已经用于临床中来监测在施用含有HPV16/18 AS04-佐剂的疫苗之后的抗体水平(Kemp等人，(2008)Vaccine 26:3608-3616)。
本公开内容的系统利用pSurv来驱动SEAP的表达。存活蛋白是凋亡抑制剂家族的成员，其有助于控制有丝分裂进程并且防止细胞死亡，并且在许多癌例如黑素瘤、肝癌、肺癌、乳癌、结肠癌和卵巢癌中过度表达，但是在健康成年组织中并非如此(Ito等人，(2000)Hepatology 31:1080
Figure BDA0003391146670000391
1085；Chen等人，(2004)Cancer Gene Therapy 11:740-747；Lu等人，(2005)Gene Therapy 12:330-338)。因此，pSurv有利于肿瘤的转录靶向，如在肺癌、黑素瘤、结肠癌、乳癌、卵巢癌和肝癌的模型中所示(Lu等人，(2005)Gene Therapy 12:330-338；Li等人，(2006)J.Gene Med.8:1232-1242；van Houdt等人，(2006)J.Neurosurgery104:583-592；Ahn等人，(2011)Gene Therapy 18:606-612；Ray等人，(2008)Mol.Therapy:J.Am.Soc.Gene Therapy 16:1848-1856)。因此，本公开内容的肿瘤特异性启动子驱动的肿瘤可活化的MC提供在多种肿瘤类型和患者群中有效筛查癌症的广泛的可适用性。
因此，已经开发了诊断性肿瘤可活化的MC，并且在全身性施用MC之后通过测量基因编码的癌症生物标志物的血液水平测试了从健康受试者辨别有肿瘤的受试者的能力。为了递送，将MC与非靶向转染剂进行比较，该非靶向转染剂已经显示出没有免疫原性(Bonnet等人，(2008)Pharmaceut.Res.25:2972-2982)、重复给药于动物的能力，以及在小鼠中在全身性(尾静脉)施用之后有效转染原发性肿瘤和转移性肿瘤的能力(Yang等人，(2013)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.110:14717-14722；Bhang等人，(2011)Nat.Med.17:123-129)。结果表明肿瘤可活化的MC的使用是安全且有效的癌症筛查的有利的有前景的平台技术。此系统有用于监测处于肿瘤复发高风险的患者，然后在肿瘤诊断之前筛查高风险群体，并且可以有利于筛查一般群体。
根据本公开内容的外源递送的基因编码的癌症血液生物标志物载体策略可以克服靶向内源性癌症血液生物标志物的癌症筛查的固有局限性中的一些局限，例如在健康组织中高背景表达，以及随着时间生物标志物表达的随机波动。本公开内容提供了肿瘤可活化的MC系统的实施方案，其可以被全身性施用以便利用简单且相对廉价的基于血液的测定来鉴定有肿瘤的受试者。该测定表现出可靠的检测能力和疾病程度的评估，表明肿瘤可活化的MC作为高度稳健且安全的癌症筛查系统的可行性。
癌症基因疗法的研究已寻求用于特异性地在肿瘤内表达治疗性转基因以避免非靶细胞或正常细胞中的不良效果的方法。为了达到此目的，已经探讨了若干策略，包括利用肿瘤特异性启动子对肿瘤的转录靶向(Aim等人，(2011)Gene Therapy 18:606-612；Ye等人，(2003)Biochem.Biophys.Res.Comms.307:759-764；Iyer等人，(2005)TransgenicRes.14:47-55)，利用内源性miRNA调节在健康组织中转录沉默或阻遏(Cawood等人，(2009)PLoS Pathogens 5:e 1 000440；Ronald等人，(2013)Gene Therapy 20:1006-1013)，病毒(转导靶向)和非病毒载体的增强的肿瘤趋向性(Chisholm等人，(2009)Cancer Res.69:2655-2662；Bachtarzi等人，(2008)Expert Opinion Drug Delivery 5:1231-1240)，或者这些策略的组合(Tsuruta等人，(2008)Clin.Cancer Res.14:3582-3588；Sugio等人，(2011)Clin.Cancer Res 17:2807-2818)。本公开内容的系统提供了表达用于癌症检测的分泌性报告基因的工具。随着基因载体的此应用而来的是克服增高的安全性问题的另外挑战，因为作为潜在的筛查工具，载体可以用于没有任何明确可见的癌症证据的患者。因此，此类型的系统的所有组分需要是安全的，包括递送媒剂(若需要)、DNA载体本身以及转基因(若被表达)。
虽然许多递送制剂是本领域已知的并且被考虑用于本公开内容的MC系统，但是特别优选具有期望的安全性谱(即无免疫刺激)的(Bonnet等人，(2008)Pharmaceut.Res.25:2972-2982)并且处于临床试验I/II期的体内转染剂(Lisziewicz等人，(2012)PLoS ONE 7:e35416)。此外，虽然非病毒载体远比病毒载体更安全(即低/几乎零整合率、降低的免疫原性潜力)，但是在传统质粒的骨架中关于免疫刺激性原核CpG基序仍然存在问题。此问题在MC和/或纳米质粒中减轻，因为这些载体缺少原核骨架或者具有小细菌区尺寸(小于500bp)。选择SEAP是因为它是人来源的，因此它不应引起免疫原性反应(Wang等人，(2001)Gene 279:99-108)并且已经在临床中显示出前景(Kemp等人，(2008)Vaccine 26:3608-3616)。
先前，病毒感染已被用于驱动癌症特异性基因构建体，例如MC-OriP-IFNy(Zuo等人，(2011)PLoS ONE 6:e19407)，其使用病毒OriP启动子/复制起点来驱动干扰素-y感染鼻咽癌(NPC)的Epstein-Barr病毒(EBV)中表达。相比之下，本公开内容的MC系统除了病毒感染的细胞之外还可以广泛地应用于许多不同的肿瘤类型。本公开内容的非病毒MC载体被开发用于使用基于血液的测定进行癌症筛查中。
虽然已经开发了用于癌症检测的表达肿瘤可活化的报告基因的载体(Bhang等人，(2011)Nat.Med.17:123-129；Chaudhuri等人，(2003)Technol.In Cancer Res.&Treat.2:171-180；Warram等人，(2011)Mol.成像Biol.13:452-461；Warram等人，(2012)Cancer GeneTherapy 19:545-552；Browne等人，(2011)PLoS ONE 6:e19530)。但是，在这些情况中使用的载体系统(腺病毒、单纯疱疹病毒和质粒)具有阻碍临床转化的安全性问题。病毒是高度免疫原性的并且人类中预先存在的病毒免疫性是普遍问题(Browne等人，(2011)PLoS ONE6:e19530；Sumida等人，(2005)J.Immunol.174:7179-7185；Schirmbeck等人，(2008)Mol.Therapy 16:1609-1616)。由于原核骨架中的未甲基化的CpG序列(仅为质粒制备所需)(Tan等人，(1999)Human Gene Therapy 10:2153-2161)，并且典型地将编码的抗生素抗性基因携载至内源性菌群(Marie等人，(2010)J.Gene Med.12:323-332)，所以质粒可能是免疫原性的。因此，本公开内容的肿瘤可活化的MC具有优于这些其他载体的优点并且主要由于更易于生产实践(相比于病毒)和更令人期望的谱而提供转化潜力。
本公开内容的MC和/或纳米质粒系统可以通过两种机制提供改进的特异性：1)由于在MC施用之前在血液中没有SEAP可检测，所以生物标志物具有独特性；和2)能够驱动表达严格地在肿瘤内，从而减轻健康无肿瘤受试者中的信号。来自接受MC的无肿瘤小鼠的轻微SEAP信号可能来自pSurv的渗漏。但是，本公开内容的MC系统被视为不限于此特定的启动子和可替代的肿瘤可活化的启动子，例如，但不限于Idl或hTERT启动子(Warram等人，(2011)Mol.Imaging Biol.13:452-461；Zhang等人，(2008)Life sciences 82:1154-1161)及诸如此类，可用于本公开内容的MC中。另外，使用内源性生物标志物的灵敏度固有地受限于由肿瘤产生的生物标志物的量(Hori&Gambhir(2011)Sci.Translational Med.3:109ra116)。相比之下，本公开内容的MC系统的灵敏度可以被改进。
内源性血液生物标志物的优点之一在于它们可以用于确定个人可能有何种类型的癌症(例如高PSA水平可能指示前列腺癌)。但是，由本公开内容提供的MC系统还有利于筛查所有癌症，而非特定的肿瘤类型。进一步考虑到，用于筛查处于特定癌症高风险的患者的可替代的启动子(例如用于前列腺癌的前列腺特异性抗原增强子/启动子的变体)(Iyer等人，(2005)Transgenic Res.14:47-55；Iyer等人，(2004)Mol.Therapy 10:545-552；Iyer等人，(2006)Human Gene Therapy 17:125-132)或用于乳癌的粘蛋白-1启动子(Huyn等人，(2009)Clin.Cancer Res.15:3126-3134)及诸如此类可以被掺入本公开内容的MC系统中。
外源性生物标志物(即报告物)的另一局限是不能在身体中定位生物标志物起源的位点。通过替换为成像报告基因或共表达SEAP和成像报告基因(例如用于正电子发射断层成像术(PET)的单纯疱疹病毒胸苷激酶1，其描述在例如Yaghoubi SS和Gambhir SS(2006)Nat Protoc.1(6):3069-75.中)，本公开内容的系统还可以允许可视化肿瘤定位。Bhang等人最近描述了在全身性施用表达适当的成像报告基因的肿瘤可活化的质粒之后利用BLI和单光子发射计算机断层成像术(SPECT)二者能够对肿瘤成像(Bhang等人，(2011)Nat.Med.17:123-129)。此策略还使用迄今所述的表达SEAP的病毒载体来实施，因为这些载体共表达荧光蛋白质以便利用荧光立体显微术来可视化癌(Chaudhuri等人，(2003)Technol.In Cancer Res.&Treat.2:171-180；Warram等人，(2011)Mol.Imaging Biol.13:452-461；Warram等人，(2012)Cancer Gene Therapy 19:545-552)。而不是一种载体系统表达两种报告物。进一步考虑到可能递送被设计用于特定应用的两种不同的载体；一种用于筛查表达分泌性报告物的癌症，而一种用于表达成像报告物来定位肿瘤。
因此，本公开内容的一个方面涵盖重组核酸微环载体的实施方案，其包含与肿瘤特异性基因表达启动子可操作地连接的核苷酸序列并且导致由接受者中由肿瘤细胞表达的水平大于由非肿瘤细胞表达的水平。
在本公开内容的此方面的实施方案中，肿瘤特异性基因表达启动子可以选自：存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLMRecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，与肿瘤特异性启动子可操作地连接的核苷酸序列可以被表达为多肽。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，与肿瘤特异性启动子可操作地连接的核苷酸序列可以编码报告多肽。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，报告多肽可以是MRI报告物、PET报告物；SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物或其任何组合。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，多肽可以是分泌的胚碱性磷酸酶(SEAP)。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，重组核酸微环载体可以具有根据SEQID NO:1的核酸序列。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，多肽可以是生物发光报告物。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，重组核酸微环载体可以具有根据SEQID NO:2的核酸序列。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，与肿瘤特异性启动子可操作地连接的核苷酸序列可以被表达为小干扰RNA(siRNA)或治疗有效的多肽。
在本公开内容的另一方面涵盖药学上可接受的组合物的实施方案，所述组合物包含重组核酸微环载体和药学上可接受的载剂，所述重组核酸微环载体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与肿瘤特异性基因表达启动子可操作地连接并且由接受者肿瘤细胞可表达的水平高于由非肿瘤细胞表达的水平，其中：(i)所述肿瘤特异性基因表达启动子可以选自：存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLMRecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合，以及(ii)与肿瘤特异性启动子可操作地连接的核苷酸序列可以被表达为编码MRI报告物、PET报告物、SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物或其任何组合的多肽。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，重组核酸微环载体可以具有根据SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。
在本公开内容的又一方面涵盖检测人类或非人类受试者中的肿瘤细胞的方法的实施方案，所述方法包括步骤：(i)向第一受试者人类或非人类动物递送药学上可接受的组合物，所述组合物包含重组核酸微环载体和药学上可接受的载剂，所述重组核酸微环载体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与肿瘤特异性基因表达启动子可操作地连接并且由接受者肿瘤细胞可表达的水平高于由非肿瘤细胞表达的水平，其中：(a)所述肿瘤特异性基因表达启动子可以选自：存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物,MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性包含卷曲螺旋的蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGFLAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80,动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合；以及(b)与肿瘤特异性启动子可操作地连接的核苷酸序列可以被表达为编码MRI报告物、PET报告物、SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物或其任何组合的多肽；以及(ii)检测所述第一受试者中的表达产物，其中所述表达产物从与所述微环载体的肿瘤特异性基因表达启动子可操作地连接的核苷酸序列产生，并且其中对所述表达产物的检测指示在所述第一受试者中肿瘤细胞的存在。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，表达产物可以是血清多肽，并且步骤(ii)可以包括从第一受试者获得血清样本以及确定从微环载体产生的表达产物的血清水平。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，检测的表达产物可以是分泌的胚碱性磷酸酶(SEAP)。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，微环载体可以具有根据SEQ ID NO:1的核酸序列。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，表达产物可以是生物发光多肽，并且步骤(ii)可以包括产生源自所述表达产物的可检测的信号，测量从微环载体产生的可检测的信号的水平，以及将来自的第一受试者的信号的水平与从未接受微环载体的第二受试者获得的信号的水平比较，其中相比于从第二受试者获得的水平，来自第一受试者的升高的信号水平指示第一受试者包含肿瘤细胞或肿瘤细胞群。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，步骤(ii)可以进一步包括非侵入性检测可检测的信号，将所述信号转换成图像，将所述图像与第一受试者的图像叠加，以及相对于第一受试者定位可检测的信号，从而确定在第一受试者中肿瘤细胞或肿瘤细胞群的位置。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，表达产物可以是萤光素酶。
在本公开内容的此方面的一些实施方案中，微环载体可以具有根据SEQ ID NO:2的核酸序列。
用于疾病诊断、检测和监测的改进的合成的生物标志物
在一些方面中，本公开内容提供一种方法，所述方法包括：
(a)向受试者施用组合物，其中所述组合物在所述受试者中诱导合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对浓度比率大于1.0；(b)检测所述合成的生物标志物；以及(c)利用在(b)中检测到的所述生物标志物来检测所述受试者具有所述患病细胞。在一些实施方案中，所述检测具有至少90％的准确度。
在一些情况中，组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(brochioscope)(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology IntervPulmonol.2018Jul；25(3):168–17)。在一些实施方案中，组合物施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁(epitrochlear)淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上(supratrochlear)淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约50％、至少约53％、至少约55％、至少约57％、至少约60％、至少约63％、至少约65％、至少约67％、至少约70％、至少约72％、至少约75％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、83％、至少约84％、85％、至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或介于这些值之间的任何范围的准确度。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约53％、55％、57％、60％、63％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或介于这些值之间的任何范围的准确度。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的灵敏度。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的灵敏度。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的特异性。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的特异性。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.2％、95.5％、95.7％、96％、96.2％、96.5％、96.7％、97％、97.2％、97.5％、97.7％、98％、98.2％、98.5％、98.7％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％或介于这些值之间的任何范围的阴性预测值(NPV)。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.2％、95.5％、95.7％、96％、96.2％、96.5％、96.7％、97％、97.2％、97.5％、97.7％、98％、98.2％、98.5％、98.7％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％或介于这些值之间的任何范围的NPV。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、60％、63％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的阳性预测值(PPV)。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、60％、63％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的PPV。
在一些实施方案中，组合物可以包含编码合成的生物标志物的载体。适合的载体包括适合于施用至细胞体内的载体，包括但不限于微环、质粒、纳米质粒、小内含子质粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、粘粒、噬菌粒、噬菌体和杆状病毒。适合的载体还包括源于噬菌体或植物、无脊椎动物或动物(包括人类)、病毒的载体，例如CELiD载体、腺相关病毒载体(例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其假型组合例如AAV2/5、AAV2/2、AAV-DJ或AAV-DJ8)、反转录病毒载体(例如MLV或其自失活或SIN变化形式或其假型变化形式)、疱疹病毒的(基于例如HSV-或EBV的)、慢病毒载体(例如基于HIV、FIV或EIAV的或其假型变化形式)或腺病毒载体(例如基于Ad5的，包括其复制缺陷型、可复制型或辅助依赖型变化形式)。在一些情况中，载体可以包含附加体维持元件以促进在一种或多种靶细胞类型中复制，例如支架/基质附着区(S/MAR)。S/MAR元件特别有用于促进在“裸”核酸载体例如微环的背景中复制。示例性适合的S/MAR元件包括但不限于，来自免疫球蛋白重链基因座的EμMAR、来自人载脂蛋白B基因座的apoB MAR、来自鸡溶菌酶基因座的Ch-LysMAR，以及来自人IFNβ-基因座的huIFNβMAR。在一些实施方案中，载体可以是非病毒载体。
在一些情况中，组合物可以包含载体，该载体包含与启动子可操作地连接的编码合成的生物标志物的序列。适合的启动子包括天然泛肿瘤特异性启动子、天然组织特异性启动子、天然疾病特异性/疾病活化的启动子、天然组成型启动子及其任何组合物。启动子可以是存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLMRecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
在一些情况中，合成的生物标志物可以是多肽或核酸生物标志物。多肽包括本文中所述的任何报告多肽。核酸包括天然或工程化的miRNA、RNA发夹和RNA适配体或其有条形码的变化形式。当核酸是miRNA时，miRNA可以例如通过标准文库生成技术例如基于简并引物的退火和连接、聚(A)聚合酶标记随后RT或连接、或顺序衔接物连接偶联至q-PCR、测序或电泳检测方法进行检测。当生物标志物是多肽时，多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。
通过将独有的标记归属于较大组内的独特成员，条形码提供在许多成员的较大且更复杂的混合物(例如在相同细胞内表达的多个启动子-报告基因构建体)的背景内鉴定和量化该成员(例如在特定的癌症特异性启动子的控制下报告物的表达)的机会，而且提供从复杂的混合物中分离单个成员的机会。例如，在基于核酸的条形码的情况中，基于碱基配对互补性的条形码的杂交可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。对于基于肽的条形码，独特的特征(包括配体和受体的免疫捕获或相互作用)可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。
当核酸是工程化的miRNA时，核酸可以是在Ronald等人(Ronald等人，PLoS ONE 11(7):e0159369)中所述的Sec-miR或miR-neg构建体。这种构建体包含：(a)未被内源性表达并且没有任何已知的脊椎动物靶的编码序列(例如Sec-miR5′-AAAUGUACUGCGCGUGGAGAC-3′)；(b)miR骨架序列，其提供对前miRNA的处理以使该编码序列旁侧的miRNA成熟(例如miR-155或miR-130骨架序列)；以及(c)增强加载入外泌体中的EXOmotif(例如GGAG)。这种miRNA构建体可以在例如编码报告多肽的基因的3’-UTR中被表达，或来自编码适合的无毒性蛋白质(例如内源结构蛋白质例如肌动蛋白或微管蛋白或高度表达的蛋白质例如泛素)的基因的3’-UTR。在一些实施方案中，工程化的miRNA的多个(例如至少2、至少4个)拷贝可以串联地提供。
在一些情况中，合成的生物标志物可以是通过对受试者执行的非侵入性成像方法可检测的多肽生物标志物，和/或所述方法包括通过非侵入性成像而检测合成的生物标志物。这种非侵入性成像方法包括MRI成像、PET成像、SPECT成像、光声成像和生物发光成像。通过MRI成像可检测的合成的生物标志物包括多肽造影剂，例如铁蛋白(或其突变体，例如激烈火球菌(Pyrococcus furiousus)铁蛋白突变体L55P、F57S或F123S)或镧系结合蛋白(或其工程化的融合物，例如在Daughtry等人，ChemBioChem 2012,13,2567–2574中所述的LBT-泛素融合物)。通过PET或SPECT成像可检测的合成的生物标志物包括人碘化钠同向转运体(例如与施用PET活性碘/碘同位素联合，参见例如Penheiter等人，Curr GeneTher.2012Feb；12(1):33–47)，HSV-tk或其突变体例如HSV-sr39tk(例如与施用正电子标记的无环鸟苷或嘧啶类似物PET报告物例如[18F]FHBG联合，参见Yaghoubi SS等人，NatProtoc.2006；1(6):3069-75)，以及多巴胺D2受体或其突变体例如D2R80A或D2R194A(例如与施用正电子标记的D2结合剂例如3-(2'-[18F]-氟乙基)-螺旋哌丁苯联合)。通过光声成像可检测的合成的生物标志物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。通过生物发光成像可检测的合成的生物标志物包括萤光素酶(例如与施用本文中所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。在一些实施方案中，合成的生物标志物可以是造影剂、产生可检测的分子的酶，或驱动可检测的分子的累积的转运体。合成的生物标志物可以原位在受试者体内进行测量。
在合成的生物标志物是通过非侵入性成像方法可检测的多肽生物标志物的情形中，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物诱导合成的生物标志物在患病细胞中表达，所述方法可以进一步包括(d)在受试者的身体中定位患病细胞。定位可能与特定的分辨率相关，例如10mm至10cm，至少10mm或至多10cm。定位可能与特定的最小可检测的肿瘤尺寸相关，例如肿瘤尺寸在3mm3至5cm3。在一些情况中，特定的最小尺寸范围可以是1cm3至5cm3、或900mm3至1cm3、或800mm3至900mm3、或700mm3至800mm3、或600mm3至700mm3、或500mm3至600mm3、或400mm3至500mm3、或300mm3至400mm3、或200mm3至300mm3、或100mm3至200mm3、或50mm3至100mm3、或10mm3至50mm3、或3mm3至10mm3。在一些情况中，定位发生在非侵入性成像扫描(例如PET、MRI、SPECT等)中。在一些情况中，定位发生在现场手术干预期间，例如通过使用目视检查(在吸收报告物的目视范围的情况中)或通过目视检查与荧光激发联用。
在一些情况中，以上另外的定位步骤可以后随手术步骤以消除检测到的和/或定位的患病细胞。手术步骤可以对与将编码生物标志物的组合物施用于和/或定位患病细胞所在的部位相同或不同的部位进行。手术步骤可以是手术切除患病细胞或与患病细胞相关的肿瘤。手术或非手术消除步骤可以包括微侵入性杀死技术，例如放射外科学(包括但不限于伽玛刀、Reflexion、CyberKnife以及利用靶向电离辐射来杀死患病细胞的相关技术)。
在一些情况中，合成的生物标志物可以在来自受试者的生物样本中进行检测，该受试者被施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物。在一些情况中，合成的生物标志物在体内进行检测并且确定患病细胞的位置。
在一些情况中，施用于受试者的组合物可以包含转染剂。适合的转染剂包括但不限于线型或支化的聚乙烯亚胺、纳米颗粒、亲脂性颗粒、肽、胶束、树枝状分子、水凝胶、合成的或天然衍生的外泌体、聚合物组合物、病毒样颗粒及其任何组合。
在一些情况中，组合物可以进一步包含药学上可接受的载剂。示例性药学上可接受的载剂包括但不限于水、花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素、含水的右旋糖、甘油溶液、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油单硬脂酸酯、氯化钠溶液、丙二醇或乙醇或其任何组合。
生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。
在一些情况中，生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后某时间段时获得。生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月获得。生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月或至多约6个月获得。在一些实施方案中，生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后获得，并且任何生物标志物检测操作方案可以被执行多次(例如以随着时间监测合成生物标志物水平)。生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次获得。生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后每周或每月获得。
在一些情况中，患病细胞可能是癌细胞、指示自身免疫性疾病的细胞(例如具有自指导活性的T细胞或淋巴细胞，或者受损于自身免疫的正常细胞)、指示神经变性疾病的细胞(例如带有毒性淀粉样物质或邻近毒性淀粉样物质的细胞)或者由于细胞所来自的受试者患有疾病或将要患有疾病而可能具有改变的基因表达谱的细胞。包含具有改变的基因表达谱的细胞的细胞群可以被描述为转录改变的细胞(TAC)。在一些情况中，患病细胞可能是癌细胞。示例性癌症包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病和腺瘤。癌可能产生于覆盖身体的内部和外部部分例如肺、乳房和结肠的细胞。肉瘤可能产生于位于骨、软骨、脂肪、结缔组织、肌肉和其他支持性组织中的细胞。淋巴瘤可能产生在淋巴结和免疫系统组织中。白血病可能产生在骨髓中并且在血流中累积。腺瘤可能产生在甲状腺、垂体腺、肾上腺及其他腺体组织中。适合用根据本公开内容的方法检测的癌症类型的具体示例性示例包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌症、AIDS相关性淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑瘤、例如小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉途径和下丘脑胶质瘤、乳癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源的癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、恶性骨纤维性组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发性不明的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性骨纤维性组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤形成、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发灶不明癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、
Figure BDA0003391146670000661
巨球蛋白血症和Wilms肿瘤。
在一些情况中，患病细胞可能是病毒感染的细胞。示例性病毒包括但不限于HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型。
在一些情况中，患病细胞可能指示自身免疫性疾病。示例性自身免疫性疾病包括但不限于、失弛缓症、艾迪生病、成人Still病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴突&神经元神经病变(AMAN)、Baló病、白塞病、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、Castleman病(CD)、脂性腹泻、Chagas病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、Cogan综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、特发性混合性冷球蛋白血症、Evans综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性多血管炎、Grave病、Guillain-Barre综合征、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、Kawasaki病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性血管炎、扁平苔藓、硬化苔藓、木样结膜炎、线状IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病、梅尼埃尔病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、Mooren溃疡、Mucha-Habermann病、多灶性运动神经病变(MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、睫状体平坦部炎(周边葡萄膜炎)、Parsonage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、复发性多软骨炎、不安腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、结节病、Schmidt综合征、巩膜炎、硬皮病、
Figure BDA0003391146670000671
综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎(SO)、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化的结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-Koyanagi-Harada病。
在一些情况中，患病细胞可能指示神经变性疾病。神经变性疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)或者起因于感染以下病毒的神经变性：疱疹病毒科、多瘤病毒科、波纳病毒科(Bornaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)或反转录病毒科(Retroviridae)(参见Zhou等人，Virol J.2013；10:172)。
用于患病细胞的基于基因/DNA的疗法
在一些方面中，本公开内容提供一种治疗患有或疑似患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物在所述受试者中诱导与所述疾病相关的患病细胞对治疗有效剂的表达优先于非患病细胞对所述治疗有效剂的表达，以至由所述患病细胞相比于所述非患病细胞表达的所述治疗有效剂的相对浓度大于1.0，所述治疗有效剂以至少10％的治疗功效治疗所述受试者，如通过所述患病细胞的细胞群的减少来确定。
在一些情况中，组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology Interv Pulmonol.2018Jul；25(3):168–175)。在一些实施方案中，组合物施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。
在一些情况中，为了治疗患有或疑似患有疾病的受试者而施用的组合物可以包含与编码治疗有效剂的核苷酸序列可操作地连接的启动子。启动子可以是癌特异性启动子。适合的启动子包括天然泛肿瘤特异性启动子、天然组织特异性启动子、天然疾病特异性/疾病活化的启动子、天然组成型启动子及其任何组合物。启动子可以是存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80,动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
在一些情况中，与编码治疗有效剂的核苷酸序列可操作地连接的启动子可以存在于载体上，所述载体可以是施用于受试者的组合物的组分。适合的载体包括适合于施用至细胞体内的载体，包括但不限于微环、质粒、纳米质粒、小内含子质粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、粘粒、噬菌粒、噬菌体和杆状病毒。适合的载体还包括源于噬菌体或植物、无脊椎动物或动物(包括人类)、病毒的载体，例如CELiD载体、腺相关病毒载体(例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其假型组合例如AAV2/5、AAV2/2、AAV-DJ或AAV-DJ8)、反转录病毒载体(例如MLV或其自失活或SIN变化形式或其假型变化形式)、疱疹病毒(基于例如HSV-或EBV)、慢病毒载体(例如基于HIV、FIV或EIAV的或其假型变化形式)或腺病毒载体(例如基于Ad5的，包括其复制缺陷型、可复制型或辅助依赖型变化形式)。在一些情况中，载体可以包含附加体维持元件以促进在一种或多种靶细胞类型中复制，例如支架/基质附着区(S/MAR)。S/MAR元件特别有用于促进在“裸”核酸载体例如微环的背景中复制。示例性适合的S/MAR元件包括但不限于，来自免疫球蛋白重链基因座的EμMAR、来自人载脂蛋白B基因座的apoB MAR、来自鸡溶菌酶基因座的Ch-LysMAR，以及来自人IFNβ-基因座的huIFNβMAR。在一些实施方案中，载体可以是非病毒载体。
在一些情况中，治疗有效剂可以包含特定种类的治疗剂。适合于根据本公开内容的方法使用的示例性种类的治疗剂包括但不限于治疗有效的多肽(例如治疗性抗体、其片段或衍生物；细胞因子；生长因子；工程化的或替代的新陈代谢/分解代谢酶、工程化的短肽激动剂或拮抗剂或前药活化酶)、小活化RNA(saRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)或其任何组合。在一些情况中，治疗有效剂可以是前药活化酶。示例性前药活化酶包括但不限于HSVtk、胞嘧啶脱氨酶、DT黄递酶、硝基还原酶、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷磷酸化酶、羧酸酯酶、叶酰基聚谷氨酰合成酶、羧肽酶A1、羧肽酶G2和细胞色素P-450。在治疗有效剂是前药活化酶的情况中，所述方法可以包括根据本文所述的任何途径附加地施用药物。当治疗有效剂是多肽时，该多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。
改进的合成的生物标志物构建体以及跨各受试者转染率归一化的方法
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含编码第一多肽或核酸生物标志物的第一核酸序列，以及编码第二多肽或第二核酸生物标志物的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：所述第二多肽或核酸生物标志物被表达的量反映至少所述第一核酸和所述第二核酸递送至所述细胞，并且所述第一多肽或核酸生物标志物在患病细胞相对于非患病细胞中被差异表达。在一些情况中，(i)所述细胞诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达，其中所述第一多肽是可检测的生物标志物或治疗剂；并且(ii)所述细胞诱导所述第二核酸序列同等地在患病细胞和非患病细胞中的等效表达并且所述第二核酸序列产生所述第二多肽，所述第二多肽不是可检测的生物标志物或治疗剂，以至所述第二多肽的表达水平提供用于评估在所述细胞中核酸序列的相对水平的对照。在一些情况中，编码第一多肽的第一核酸序列以及编码第二多肽的第二核酸序列可以在独立的基因构建体上。在一些情况中，在组合物中，包含编码第一多肽的第一核酸序列以及编码第二多肽的第二核酸序列的序列可以在独立的基因构建体上。在一些情况中，载体包含：(a)与第一核酸序列可操作地连接的第一启动子，其中该启动子诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达；以及(b)第二启动子序列，所述第二启动子序列诱导在患病细胞和非患病细胞中同等地表达并且与第二核酸可操作地连接。
在一些情况中，第一多肽可以兼作可检测的生物标志物和治疗剂。在一些情况中，第一多肽是治疗性抗体、治疗性抗体片段或衍生物或前药活化酶。示例性前药活化酶包括但不限于HSVtk、胞嘧啶脱氨酶、DT黄递酶、硝基还原酶、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷磷酸化酶、羧酸酯酶、叶酰基聚谷氨酰合成酶、羧肽酶A1、羧肽酶G2和细胞色素P-450。该多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。
在一些情况中，第一和/或第二核酸可以在载体上。适合的载体包括适合于施用至细胞体内的载体，包括但不限于微环、质粒、纳米质粒、小内含子质粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、粘粒、噬菌粒、噬菌体和杆状病毒。适合的载体还包括源于噬菌体或植物、无脊椎动物或动物(包括人类)、病毒的载体，例如CELiD载体、腺相关病毒载体(例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其假型组合例如AAV2/5、AAV2/2、AAV-DJ或AAV-DJ8)、反转录病毒载体(例如MLV或其自失活或SIN变化形式或其假型变化形式)、疱疹病毒(基于例如HSV-或EBV)、慢病毒载体(例如基于HIV、FIV或EIAV的或其假型变化形式)或腺病毒载体(例如基于Ad5的，包括其复制缺陷型、可复制型或辅助依赖型变化形式)。在一些情况中，载体可以包含附加体维持元件以促进在一种或多种靶细胞类型中复制，例如支架/基质附着区(S/MAR)。S/MAR元件特别有用于促进在“裸”核酸载体例如微环的背景中复制。示例性适合的S/MAR元件包括但不限于，来自免疫球蛋白重链基因座的EμMAR、来自人载脂蛋白B基因座的apoB MAR、来自鸡溶菌酶基因座的Ch-LysMAR，以及来自人IFNβ-基因座的huIFNβMAR。在一些实施方案中，载体可以是非病毒载体。
在一些情况中，被递送第一和第二核酸的细胞可能是患病细胞。在一些情况中，患病细胞可能是癌细胞、指示自身免疫性疾病的细胞(例如具有自指导活性的T细胞或淋巴细胞，或者受损于自身免疫的正常细胞)、TAC或指示神经变性疾病的细胞(例如带有毒性淀粉样物质或邻近毒性淀粉样物质的细胞)。这种细胞可能指示的示例性癌症、自身免疫性疾病和神经变性疾病包括本文中所述的任何癌症、自身免疫性疾病和神经变性疾病。在一些情况中，患病细胞可能是病毒感染的细胞。示例性病毒包括但不限于HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型。
在一些情况中，第一或第二核酸可以是可检测的核酸生物标志物。示例性可检测的核酸包括但不限于天然或工程化的miRNA、RNA发夹和RNA适配体或其有条形码的变化形式。当核酸是miRNA时，miRNA可以例如通过标准文库生成技术例如基于简并引物的退火和连接、聚(A)聚合酶标记随后RT或连接、或顺序衔接物连接偶联至q-PCR、测序或电泳检测方法进行检测。当生物标志物是多肽时，多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。
当核酸是工程化的miRNA时，核酸可以是在Ronald等人(Ronald等人，PLoS ONE 11(7):e0159369)中所述的Sec-miR或miR-neg构建体。这种构建体包含：(a)未被内源性表达并且没有任何已知的脊椎动物靶的编码序列(例如Sec-miR5′-AAAUGUACUGCGCGUGGAGAC-3′)；(b)miR骨架序列，其提供对前miRNA的处理以使该编码序列旁侧的miRNA成熟(例如miR-155或miR-130骨架序列)；以及(c)增强加载入外泌体中的EXOmotif(例如GGAG)。这种miRNA构建体可以在例如编码报告多肽的基因的3’-UTR中被表达，或来自编码适合的无毒性蛋白质(例如内源结构蛋白质例如肌动蛋白或微管蛋白或高度表达的蛋白质例如泛素)的基因的3’-UTR。在一些实施方案中，工程化的miRNA的多个(例如至少2、至少4个)拷贝可以串联地提供。
在一些情况中，第二多肽或第一多肽可以是通过对受试者执行的非侵入性成像方法可检测的。这种非侵入性成像方法包括MRI成像、PET成像、SPECT成像、光声成像和生物发光成像。通过MRI成像可检测的合成的生物标志物包括多肽造影剂，例如铁蛋白(或其突变体，例如激烈火球菌铁蛋白突变体L55P、F57S或F123S)或镧系结合蛋白(或其工程化的融合物，例如在Daughtry等人，ChemBioChem 2012,13,2567–2574中所述的LBT-泛素融合物)。通过PET或SPECT成像可检测的合成的生物标志物包括人碘化钠同向转运体(例如与施用PET活性碘/碘同位素联合，参见例如Penheiter等人，Curr Gene Ther.2012 Feb；12(1):33–47)，HSV-tk或其突变体例如HSV-sr39tk(例如与施用正电子标记的无环鸟苷或嘧啶类似物PET报告物例如[18F]FHBG联合，参见Yaghoubi SS等人，Nat Protoc.2006；1(6):3069-75)，以及多巴胺D2受体或其突变体例如D2R80A或D2R194A(例如与施用正电子标记的D2结合剂例如3-(2'-[18F]-氟乙基)-螺旋哌丁苯联合)。通过光声成像可检测的合成的生物标志物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。通过生物发光成像可检测的合成的生物标志物包括萤光素酶(例如与施用本文中所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。在一些实施方案中，合成的生物标志物可以是造影剂、产生可检测的分子的酶，或驱动可检测的分子的累积的转运体。合成的生物标志物可以原位在受试者体内进行测量。
在一些情况中，本公开内容提供一种检测受试者中的患病细胞的方法，所述方法包括将组合物施用于所述受试者，其中所述组合物包含：编码第一多肽或核酸生物标志物的第一核酸序列，以及编码第二多肽或第二核酸生物标志物的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：所述第二多肽或核酸生物标志物被表达的量反映至少所述第一核酸和所述第二核酸递送至所述细胞，并且所述第一多肽或核酸生物标志物在患病细胞相对于非患病细胞中被差异表达。在一些情况中，(i)所述细胞诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达，其中所述第一多肽是可检测的生物标志物或治疗剂；并且(ii)所述细胞诱导所述第二核酸序列同等地在患病细胞和非患病细胞中的表达并且所述第二核酸序列产生所述第二多肽，所述第二多肽不是可检测的生物标志物或治疗剂，以至所述第二多肽的表达水平提供用于评估在所述细胞中核酸序列的相对水平的对照。在一些情况中，编码第一多肽的第一核酸序列以及编码第二多肽的第二核酸序列可以在独立的基因构建体上。在一些情况中，在组合物中，包含编码第一多肽的第一核酸序列以及编码第二多肽的第二核酸序列的序列可以在独立的基因构建体上。在一些情况中，载体包含：(a)与第一核酸序列可操作地连接的第一启动子，其中该启动子诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达；以及(b)第二启动子序列，所述第二启动子序列诱导在患病细胞和非患病细胞中同等地表达并且与第二核酸可操作地连接。在一些情况中，所述方法可以包括检测第一多肽或核酸生物标志物和/或第二多肽或核酸生物标志物。在一些情况中，这种方法是对受试者执行非侵入性成像方法。这种非侵入性成像方法包括MRI成像、PET成像、SPECT成像、光声成像和生物发光成像。
在合成的生物标志物是通过非侵入性成像方法可检测的多肽生物标志物的情形中，所述方法可以进一步包括在受试者的身体中定位患病细胞。定位可能与特定的分辨率相关，例如10mm至10cm，至少10mm或至多10cm。定位可能与特定的最小可检测的肿瘤尺寸相关，例如肿瘤尺寸在3mm3至10cm3。在一些情况中，特定的最小尺寸范围可以是1cm3至10cm3、或900mm3至1cm3、或800mm3至900mm3、或700mm3至800mm3、或600mm3至700mm3、或500mm3至600mm3、或400mm3至500mm3、或300mm3至400mm3、或200mm3至300mm3、或100mm3至200mm3、或50mm3至100mm3、或10mm3至50mm3、或3mm3至10mm3。在一些情况中，定位发生在非侵入性成像扫描(例如PET、MRI、SPECT等)中。在一些情况中，定位发生在现场手术干预期间，例如通过使用目视检查(在吸收报告物的目视范围的情况中)或通过目视检查与荧光激发联用。
在一些情况中，以上另外的定位步骤可以后随手术步骤以消除检测到的和/或定位的患病细胞。手术步骤可以对与将编码生物标志物的组合物施用于和/或定位患病细胞所在的部位相同或不同的部位进行。手术步骤可以是手术切除患病细胞或与患病细胞相关的肿瘤。手术或非手术消除步骤可以包括微侵入性杀死技术，例如放射外科学(包括但不限于伽玛刀、Reflexion、CyberKnife以及利用靶向电离辐射来杀死患病细胞的相关技术)。
在一些情况中，非侵入性成像方法可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后某时间段时进行。非侵入性成像方法可以在施用包含第一和第二核酸的组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月或至少约1年进行。非侵入性成像方法可以在施用包含第一和第二核酸的组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月、至多约6个月或至多约1年进行。在一些实施方案中，非侵入性成像方法可以在施用包含第一和第二核酸的组合物之后执行多次(例如以随着时间监测合成生物标志物水平)。非侵入性成像方法可以在施用包含第一和第二核酸的组合物之后执行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次。非侵入性成像方法可以在施用包含第一和第二核酸的组合物之后每周或每月进行。
在一些情况中，第一多肽或核酸生物标志物和/或第二多肽或核酸生物标志物可以在来自受试者的生物样本中进行检测。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。在一些情况中，生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后某时间段时获得。生物样本可以在施用包含第一和第二核酸的组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月获得。生物样本可以在施用包含第一和第二核酸的组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月或至多约6个月获得。在一些实施方案中，生物样本可以在施用包含第一和第二核酸序列的组合物之后获得，并且任何生物标志物检测操作方案可以被执行多次(例如以随着时间监测合成生物标志物水平)。生物样本可以在施用包含第一和第二核酸序列的组合物之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次获得。生物样本可以在施用包含第一和第二核酸序列的组合物之后每周或每月获得。
在一些情况中，所述方法可以包括通过特异性核酸检测方法检测第一或第二核酸生物标志物。第一或第二核酸生物标志物可以通过测序进行检测。测序方法可以包括：下一代测序、高通量测序、焦磷酸测序、经典Sanger测序方法、连接法测序、合成法测序、杂交法测序、RNA-Seq(Illumina)、数字基因表达(Helicos)、下一代测序、单分子合成法测序(SMSS)(Helicos)、Ion Torrent测序机器(Life Technologies/Thermo-Fisher)、大规模平行测序、克隆单分子阵列(Solexa)、鸟枪法测序、Maxim-Gilbert测序和引物步移。
在一些情况中，第一或第二核酸生物标志物可以通过“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR))或Taqman(参见，例如美国专利号Gelfand的5,210,015、Livak等人的5,538,848，和Haaland的5,863,736，以及Heid,C.A.,等人，Genome Research,6:986-994(1996)；Gibson,U.E.M,等人，Genome Research 6:995-1001(1996)；Holland,P.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280，(1991)；以及Livak,K.J.,等人，PCR Methodsand Applications 357-362(1995))。监测扩增产物的形成的此方法的基础是利用双重标记的荧光寡核苷酸探针来连续测量PCR产物累积。在这种测定中使用的探针典型地是短(约20-25个碱基)多核苷酸，其标记有两种不同的荧光染料。该探针的5'末端典型地附接至报告染料并且3'末端附接至猝灭染料。探针被设计为具有与在靶mRNA或核酸上的位点至少基本互补的序列。与基因座的旁侧区结合的上游和下游PCR引物也被添加至反应混合物。当探针是完整的时，在两个荧光团之间发生能量转移，并且猝灭剂猝灭来自报告物的发射。在PCR的延伸期期间，探针被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割，从而从多核苷酸-猝灭剂释放报告物，并且导致报告物发射强度的增高，其可以通过适当的检测器来测量。然后，记录的值可以用于连续地计算归一化的报告物发射强度的增高，并且最终量化被扩增的mRNA的量。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测，RT-PCR步骤可以首先进行以从细胞RNA产生cDNA。这种通过RT-PCR扩增可以是普遍性的(例如用部分/完全地简并寡核苷酸引物扩增)或靶向的(例如用针对要在后续步骤中分析的特定基因的寡核苷酸引物扩增)。
在一些实施方案中，qPCR或Taqman可以在对分离的细胞mRNA进行反转录酶反应之后立即使用；此变化用来在qPCR期间量化各种mRNA的水平。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测或RNA测序，“预扩增”步骤可以首先对从细胞RNA转录的cDNA进行。这用来在要检测的RNA/cDNA的天然水平非常低的情况下增大信号。用于预扩增的适合方法包括但不限于LM-PCR、用随机寡核苷酸引物(例如随机六聚体PCR)进行PCR、用聚A特异性引物的PCR，及其任何组合。预扩增可以是普遍的或靶向的，以与上述反转录反应相同的方式进行。
RNA水平也可以在未扩增的情况下通过与探针(例如利用分支核酸探针(例如来自Panomics的
Figure BDA0003391146670000811
Reagent System))杂交进行测量。
基于异二聚体的合成的生物标志物设计
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含编码第一多肽的第一核酸序列，以及编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：(i)所述细胞表达所述第一核酸序列以产生所述第一多肽；(ii)所述细胞表达所述第二核酸序列以产生所述第二多肽；以及(iii)由所述细胞表达的所述第一多肽和所述第二多肽被配置为组合以形成异二聚体蛋白质。在一些情况中，所述第一多肽和所述第二多肽可以在独立的基因构建体上。在一些情况中，所述第一多肽和所述第二多肽可以在独立的基因构建体上。
在一些情况中，异二聚体蛋白质可以是天然存在的异二聚体或天然酶的衍生物或拆分成两半互补的肽的自发荧光蛋白。这种系统的示例包括但不限于FRB/FKBP12异二聚体、拆分的萤光素酶蛋白质或拆分的GFP蛋白质。
在一些情况中，当异二聚体蛋白质可能是天然存在的异二聚体的衍生物(例如FRB/FKBP12对)时，该异二聚体蛋白质每一半连接至酶或检测对的互补的半部分，从而异二聚体的二聚活化该酶，或者允许检测该检测对。在一些情况中，异二聚体蛋白质每一半可以连接至拆分的重组酶，例如Cre重组酶，由此当另外的元件(例如合成的生物标志物或治疗性分子)的活性通过异二聚体的二聚而重建时可以活化其表达。在一些情况中，异二聚体蛋白质的每一半可以与形成FRET对的两种自发荧光的蛋白质之一连接，从而当异二聚体形成时FRET可以被检测。
在一些情况中，第一核酸序列和第二核酸序列可以可操作地连接至第一基因元件和第二基因元件，其中第一基因元件和第二基因元件二者可以选择性地被活化而在相同的患病细胞类型中表达第一多肽和第二多肽。第一基因元件或第二基因元件可以是启动子、增强子或miRNA结合位点。示例性启动子包括但不限于存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族,包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。示例性miRNA结合位点包括但不限于至少一个miR-15、miR-16、let-7、miR-122或miR-34结合序列。
在一些情况中，编码第一多肽和第二多肽的基因构建体可以在载体上。示例性载体包括本文中所述的任何载体。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测或治疗患病细胞的方法，所述方法包括施用组合物，其中所述组合物包含：编码第一多肽的第一核酸序列，以及编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：(i)所述细胞表达所述第一核酸序列以产生所述第一多肽；(ii)所述细胞表达所述第二核酸序列以产生所述第二多肽；以及(iii)由所述细胞表达的所述第一多肽和所述第二多肽被配置为组合以形成异二聚体蛋白质。在一些情况中，组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology Interv Pulmonol.2018 Jul；25(3):168–175)。在一些实施方案中，组合物施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。在一些情况中，所述方法可以进一步包括检测异二聚体蛋白质。
在一些情况中，所述检测包括对受试者执行非侵入性检测方法。示例性非侵入性检测方法(例如对于自发荧光的或发光的蛋白质)包括但不限于SPECT成像和生物发光成像。成像方法可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月或至少约1年进行。成像方法可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月、至多约6个月或至多约1年进行。在一些实施方案中，成像方法可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后执行多次(例如以随着时间监测合成的生物标志物水平)。成像方法可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后执行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次。成像方法可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后每周或每月执行。
在一些情况中，该检测可以包括检测来自受试者的生物样本的异二聚体蛋白质。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。
在一些情况中，生物样本可以在施用诱导合成的生物标志物的表达的组合物之后某时间段时获得。生物样本可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月获得。生物样本可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月或至多约6个月获得。在一些实施方案中，生物样本可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后获得，并且任何生物标志物检测操作方案可以被执行多次。生物样本可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次获得。生物样本可以在施用编码异二聚体蛋白质的组合物之后每周或每月获得。生物样本中的异二聚体蛋白质可以通过荧光测定、FRET测定、TR-FRET测定或发光测定进行测定。
可替代地或另外地，异二聚体蛋白质可以在异二聚体特异性免疫检测测定中进行检测。若干方法和装置被熟知用于测定蛋白质的水平，包括免疫测定，例如描述在例如美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792中。这些测定包括各种夹心法、竞争性或非竞争性测定形式，以产生与目的蛋白质分析物的存在或量相关的信号。可以利用任何适合的免疫测定，例如，侧向流动、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定或其任何组合。
针对用于疾病检测、监测或诊断中的合成的生物标志物的活体外构建体和方法
在一些方面中，本公开内容提供一种包含非天然存在的重组基因构建体的组合物，所述重组基因构建体包含编码多肽或核酸序列的序列，其中所述序列包含第一启动子，所述序列当被活体外转导入细胞中时所述第一启动子在从受试者分离的多种不同类型的患病细胞中选择性地驱动所述多肽或核酸生物标志物序列的表达。
在一些情况中，所述组合物可以包含转导有所述重组基因构建体的细胞。在一些情况中，所述多种不同类型的细胞是患病细胞或有障碍细胞。在一些情况中，所述细胞是血液细胞、淋巴细胞、白细胞、上皮细胞、胃肠细胞、胎盘细胞、羊水细胞、肺上皮细胞、泌尿上皮细胞或肾细胞。
在一些情况中，患病细胞或有障碍细胞可能是癌细胞、指示自身免疫性疾病的细胞(例如具有自指导活性的T细胞或淋巴细胞，或者受损于自身免疫的正常细胞)、TAC或指示神经变性疾病的细胞(例如带有毒性淀粉样物质或邻近毒性淀粉样物质的细胞)。示例性癌症、自身免疫性和神经变性疾病包括本文中所述的任何疾病。在一些情况中，患病细胞或有障碍细胞可能是病毒感染的细胞。示例性病毒感染包括但不限于由HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型所致的那些病毒感染。
在一些情况中，第一启动子可以是当细胞处于患病状态时在所述细胞中被活化的启动子。第一启动子可以是泛肿瘤特异性启动子。在一些情况中，第一启动子是癌特异性启动子。在一些情况中，第一启动子是存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
在一些情况中，用于活体外检测的重组基因构建体可以包含反转录病毒的、慢病毒的或腺病毒的包装元件或长末端重复序列。重组基因构建体可以是CELiD载体。重组基因构建体可以是源于噬菌体或植物、无脊椎动物或动物(包括人类)、病毒的载体，例如腺相关病毒载体(例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其假型组合例如AAV2/5、AAV2/2、AAV-DJ或AAV-DJ8)、反转录病毒载体(例如MLV或其自失活或SIN变化形式或其假型变化形式)、疱疹病毒(基于例如HSV-或EBV)、慢病毒载体(例如基于HIV、FIV或EIAV的或其假型变化形式)或腺病毒载体(例如基于Ad5的，包括其复制缺陷型、可复制型或辅助依赖型变化形式)。重组基因构建体还可以是与任何这些病毒系统相容的包装载体。
载体可以是非病毒载体。非病毒载体可以是微环载体。微环可以是自我复制型微环。自我复制型微环可以包含S/MAR元件。非病毒载体可以是纳米质粒或小内含子质粒(MIP)。MIP将细菌复制起点和任何可选择性标志作为转基因表达盒中的内含子进行放置。此外，MIP可以保持转基因表达盒的5’和3’末端在微环中并置(参见例如Lu等人，a mini-intronic plasmid(MIP):a novel robust transgene expression vector in vivo andin vitro,mol.Ther.2013 May；21(5):954-963)
在一些情况中，当活体外被转导时被选择性表达的多肽或核酸序列可以选自光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物、可量化的核酸和其任何组合。自发荧光的报告物包括GFP、mCherry或其衍生物。比色报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)和酪氨酸酶。生物发光、化学发光或发光报告物包括萤光素酶(例如与施用本文所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。通过光声成像可检测的报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。可量化的核酸可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。当所述多肽或核酸是多肽时，多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。
在一些情况中，所述组合物可以具有一定诊断效率，其中所述诊断效率以在所述受试者中在患病细胞中优先于在非患病细胞中所述生物标志物的表达进行测量，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对比率大于1.0；(b)检测所述生物标志物；以及(c)利用在(b)中检测到的所述生物标志物以至少90％的准确度确定所述受试者具有所述患病细胞。
在一些情况中，活体外施用于细胞的组合物可以包含调制患病细胞或有障碍细胞的增殖的第二多肽或核酸。第二多肽可以处于第二启动子的控制下，所述第二启动子在患病细胞或有障碍细胞中选择性地驱动第二多肽或核酸的表达。所述第二启动子可以是泛癌症特异性启动子。所述第二启动子可以是癌特异性启动子。启动子可以是本文所述的任何特异性启动子。所述第二多肽可以包含转化剂或生长因子。转化剂可以包括端粒酶或SV40大T抗原。生长因子可以是例如EGF、PDGF、FGF、HGH或IGF-1。
在一些方面中，本公开内容提供一种在活体外检测患病细胞或有障碍细胞的方法，所述方法包括在活体外将非天然存在的重组基因构建体递送至从受试者分离的细胞群，其中所述非天然存在的重组基因构建体包含：编码多肽或核酸序列的序列，其中所述序列包含第一启动子，所述序列当被转导入细胞中时所述第一启动子选择性地驱动所述多肽或核酸序列在从受试者分离的多种不同类型的细胞中的表达。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测受试者的疾病或不存在疾病的方法，所述方法包括使所述受试者的一种或多种细胞与基因构建体在活体外接触，其中所述基因构建体包含与条形码分子可操作地连接的疾病活化的启动子，并且所述疾病活化的启动子驱动所述条形码分子在患有所述疾病的细胞中的表达；量化所述条形码分子的表达水平；以及基于所述表达水平而检测所述疾病或其不存在。
在一些情况中，在活体外检测患病细胞或有障碍细胞的方法可以在正常细胞的背景中能够检测特定数量的患病细胞。在一些实施方案中，所述方法可以能够检测约至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400或至少约500个患病细胞/5百万个正常细胞。在一些实施方案中，正常细胞是血液细胞(例如PBMC)。
在一些情况中，所述方法可以包括分离包含来自受试者的细胞的生物样本。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于，由自然脱落的身体物质或从外部可接近的组织的非破坏性刮屑构成的样本，例如唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、粘液、子宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本或其级分(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。
在一些情况中，所述方法可以包括在重组基因构建体被递送至细胞之后将细胞群培养一定时间段。细胞群可以在重组基因构建体递送至细胞之后被培养至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天或至少约1个月。细胞群可以在重组基因构建体递送至细胞之后被培养至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天或至多约1个月。
在一些情况中，所述方法可以包括检测多肽或核酸序列。该检测可以发生在培养细胞群之前或之后。该检测可以包括光声、生物发光、荧光报告物、化学发光、发光、比色或核酸测定。该检测还可以包括免疫测定。免疫测定包括在例如美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792中所述的那些。免疫测定包括各种夹心法、竞争性或非竞争性测定形式，其产生与目的蛋白质分析物的存在或量相关的信号。可以利用任何适合的免疫测定，例如，侧向流动、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定及诸如此类。
该检测方法可以包括测序。测序方法可以包括：下一代测序、高通量测序、焦磷酸测序、经典Sanger测序方法、连接法测序、合成法测序、杂交法测序、RNA-Seq(Illumina)、数字基因表达(Helicos)、下一代测序、单分子合成法测序(SMSS)(Helicos)、Ion Torrent测序机器(Life Technologies/Thermo-Fisher)、大规模平行测序、克隆单分子阵列(Solexa)、鸟枪法测序、Maxim-Gilbert测序和引物步移。
检测可以包括“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR))或Taqman(参见，例如美国专利号Gelfand的5,210,015、Livak等人的5,538,848，和Haaland的5,863,736，以及Heid,C.A.,等人，Genome Research,6:986-994(1996)；Gibson,U.E.M,等人，Genome Research6:995-1001(1996)；Holland,P.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280，(1991)；以及Livak,K.J.,等人，PCR Methods and Applications 357-362(1995))。监测扩增产物的形成的此方法的基础是利用双重标记的荧光寡核苷酸探针来连续测量PCR产物累积。在这种测定中使用的探针典型地是短(约20-25个碱基)多核苷酸，其标记有两种不同的荧光染料。该探针的5'末端典型地附接至报告染料并且3'末端附接至猝灭染料。探针被设计为具有与在靶mRNA或核酸上的位点至少基本互补的序列。与基因座的旁侧区结合的上游和下游PCR引物也被添加至反应混合物。当探针是完整的时，在两个荧光团之间发生能量转移，并且猝灭剂猝灭来自报告物的发射。在PCR的延伸期期间，探针被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割，从而从多核苷酸-猝灭剂释放报告物，并且导致报告物发射强度的增高，其可以通过适当的检测器来测量。然后，记录的值可以用于连续地计算归一化的报告物发射强度的增高，并且最终量化被扩增的mRNA的量。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测，RT-PCR步骤可以首先进行以从细胞RNA产生cDNA。这种通过RT-PCR扩增可以是普遍性的(例如用部分/完全地简并寡核苷酸引物扩增)或靶向的(例如用针对要在后续步骤中分析的特定基因的寡核苷酸引物扩增)。
在一些实施方案中，qPCR或Taqman可以在对分离的细胞mRNA进行反转录酶反应之后立即使用；此变化用来在qPCR期间量化各种mRNA的水平。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测或RNA测序，“预扩增”步骤可以首先对从细胞RNA转录的cDNA进行。这用来在要检测的RNA/cDNA的天然水平非常低的情况下增大信号。用于预扩增的适合方法包括但不限于LM-PCR、用随机寡核苷酸引物(例如随机六聚体PCR)进行PCR、用聚A特异性引物的PCR，及其任何组合。预扩增可以是普遍的或靶向的，以与上述反转录反应相同的方式进行。
用于疾病分期指示的改进的生物标志物、构建体设计和方法
在一些方面中，本公开内容提供一种包含载体的组合物，其中所述载体包含与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子，其中每种所述启动子驱动在细胞中所述多种核酸序列的表达而产生多种多肽或核酸生物标志物序列，其中所述多种核酸序列中的各个多肽或核酸生物标志物序列的水平指示所述细胞的疾病的阶段。在一些情况中，细胞的疾病的阶段是患病、未患病或中间状态。在一些情况中，多种不同的启动子可以被包括在被同时或分开地施用的多个独立的基因构建体或载体上。在一些实施方案中，分开地施用的多个独立的基因构建体在彼此相隔8、16、24、36、48、60或72小时内进行施用。在一些实施方案中，疾病阶段可以通过癌细胞远离其起始组织经由转移至远端组织而播散进行评估。在诸如此的情况中，多种不同的启动子可以包括在初始组织位点(例如乳房，当乳癌被分期时)具有高癌症特异性的至少一种启动子，以及在与初始位点不同的普通转移位点(例如肺、脾、肝)具有高特异性的活性启动子。在一些情况中，多种不同的启动子可以包括在初始组织位点(例如乳房，当乳癌被分期时)具有高癌症特异性的至少一种启动子，以及在多个不同的转移位点(例如肺、脾、肝)具有高特异性的多种活性启动子。因此，这种系统可以在癌从其原始位点转移至转移位点时提供对更多不同启动子的活化(可以通过下游它们可操作地连接的生物标志物读出)，从而提供对肿瘤已经如何广泛地转移的评估。在一些实施方案中，在普通转移位点具有高特异性的活性启动子之一是MMP-2，其在肺癌中在所有阶段都提供高表达，但是在乳癌中未被过度表达。
在一些情况中，疾病可能是癌症、自身免疫性疾病(例如具有自指导活性的T细胞或淋巴细胞，或者受损于自身免疫的正常细胞)、或神经变性疾病(例如带有毒性淀粉样物质或邻近毒性淀粉样物质的细胞)。示例性癌症包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病和腺瘤。癌可能产生于覆盖身体的内部和外部部分例如肺、乳房和结肠的细胞。肉瘤可能产生于位于骨、软骨、脂肪、结缔组织、肌肉和其他支持性组织中的细胞。淋巴瘤可能产生在淋巴结和免疫系统组织中。白血病可能产生在骨髓中并且在血流中累积。腺瘤可能产生在甲状腺、垂体腺、肾上腺及其他腺体组织中。适合用根据本公开内容的方法检测的癌症类型的具体示例性示例包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌、AIDS相关性淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑瘤、例如小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉途径和下丘脑胶质瘤、乳癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源的癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、恶性骨纤维性组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发性不明的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性骨纤维性组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤形成、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发灶不明癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、
Figure BDA0003391146670000991
巨球蛋白血症和Wilms肿瘤。
在一些情况中，疾病可能是病毒感染的细胞。示例性病毒感染包括但不限于由HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型所致的那些病毒感染。
在一些情况中，当疾病是癌症时，多种不同启动子可以包括在癌症的早期被活化的第一启动子。在一些情况中，多种不同启动子可以包括在癌症的中期被活化的第二启动子。在一些情况中，多种不同启动子可以包括在癌症的晚期被活化的第三启动子。
在一些情况中，疾病可能是自身免疫性疾病。示例性自身免疫性疾病包括但不限于失弛缓症、艾迪生病、成人Still病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴突&神经元神经病变(AMAN)、Baló病、白塞病、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、Castleman病(CD)、脂性腹泻、Chagas病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、Cogan综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、特发性混合性冷球蛋白血症、Evans综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性多血管炎、Grave病、Guillain-Barre综合征、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、Kawasaki病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性血管炎、扁平苔藓、硬化苔藓、木样结膜炎、线状IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病、梅尼埃尔病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、Mooren溃疡、Mucha-Habermann病、多灶性运动神经病变(MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、睫状体平坦部炎(周边葡萄膜炎)、Parsonage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、复发性多软骨炎、不安腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、结节病、Schmidt综合征、巩膜炎、硬皮病、
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综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎(SO)、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化的结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-Koyanagi-Harada病。
在一些情况中，疾病可能是神经变性疾病。神经变性疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)或者起因于感染以下病毒的神经变性：疱疹病毒科、多瘤病毒科、波纳病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、黄病毒科、小核糖核酸病毒科或反转录病毒科(参见Zhou等人，Virol J.2013；10:172)。
在一些情况中，核酸生物标志物可能是例如天然或工程化的miRNA、RNA发夹、RNA适配体或其有条形码的变化形式。
在一些情况中，用于检测疾病的阶段的组合物中提供的载体可以是本文所述的任何载体。
在一些情况中，多种多肽中的至少一种可以包括通过非侵入性成像可检测的多肽。这种非侵入性成像方法包括MRI成像、PET成像、SPECT成像、光声成像和生物发光成像。通过MRI成像可检测的合成的生物标志物包括但不限于多肽造影剂，例如铁蛋白(或其突变体，例如激烈火球菌铁蛋白突变体L55P、F57S或F123S)或镧系结合蛋白(或其工程化的融合物，例如在Daughtry等人，ChemBioChem 2012,13,2567–2574中所述的LBT-泛素融合物)。通过PET或SPECT成像可检测的合成的生物标志物包括人碘化钠同向转运体(例如与施用PET活性碘/碘同位素联合，参见例如Penheiter等人，Curr Gene Ther.2012Feb；12(1):33–47)，HSV-tk或其突变体例如HSV-sr39tk(例如与施用正电子标记的无环鸟苷或嘧啶类似物PET报告物例如[18F]FHBG联合，参见Yaghoubi SS等人，Nat Protoc.2006；1(6):3069-75)，以及多巴胺D2受体或其突变体例如D2R80A或D2R194A(例如与施用正电子标记的D2结合剂例如3-(2'-[18F]-氟乙基)-螺旋哌丁苯联合)。通过光声成像可检测的合成的生物标志物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。通过生物发光成像可检测的合成的生物标志物包括萤光素酶(例如与施用本文中所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。在一些实施方案中，合成的生物标志物可以是造影剂、产生可检测的分子的酶，或驱动可检测的分子的累积的转运体。合成的生物标志物可以原位在受试者体内进行测量。
在一些情况中，条形码分子可以是在来自受试者的生物样本中可检测的多肽或核酸。当条形码分子是多肽时，该多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。示例性多肽生物标志物包括但不限于光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物和其任何组合。自发荧光的报告物包括GFP、mCherry或其衍生物。比色报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)和酪氨酸酶。生物发光、化学发光或发光报告物包括萤光素酶(例如与施用本文所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。通过光声成像可检测的报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。当条形码分子是核酸序列时，可检测的核酸序列可以包括但不限于核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸序列可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。
通过将独有的标记归属于较大组内的独特成员，条形码提供在许多成员的较大且更复杂的混合物(例如在相同细胞内表达的多种启动子-报告基因构建体)的背景内鉴定和量化该成员(例如在特定的癌症特异性启动子的控制下报告基因的表达)的机会，而且提供从复杂的混合物中分离单个成员的机会。例如，在基于核酸的条形码的情况中，基于碱基配对互补性的条形码的杂交可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。对于基于肽的条形码，独特的特征(包括配体和受体的免疫捕获或相互作用)可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测疾病的阶段的方法，所述方法包括向受试者施用包含载体的组合物，其中所述载体包含：与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子，其中每种所述启动子驱动在细胞中的所述多种核酸序列表达而产生多种多肽或合成核酸序列，其中所述多种核酸序列的各个多肽的水平指示所述细胞的疾病的阶段。在一些情况中，细胞的疾病的阶段可能是患病、未患病或中间状态。在一些方面中，本公开内容提供一种检测不同类型的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用包含载体的组合物，其中在细胞中所述载体包含与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子以产生多种多肽或合成的核酸序列，其中所述多种核酸序列的各个多肽的水平指示在体内癌症的不同类型。在一些情况中，在体内检测到的癌症可以源于但不限于乳房、肝、结肠、脑、肺、肾、胰腺、睾丸、卵巢的组织、血液或血液的组分、骨、胃、眼、内分泌或神经内分泌组织、头颈、胃肠、肌肉骨骼、皮肤、呼吸器、神经或泌尿生殖器，或者源于身体的其他部分的癌症。
在一些情况中，组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology Interv Pulmonol.2018Jul；25(3):168–175)。在一些实施方案中，组合物施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。
在一些情况中，当疾病是癌症时，多种不同启动子可以包括在癌症的早期被活化的第一启动子。在一些情况中，多种不同启动子可以包括在癌症的中期被活化的第二启动子。在一些情况中，多种不同启动子包括在癌症的晚期被活化的第三启动子。在一些情况中，所述方法可以将受试者中的组织块或病变在性质上鉴定为癌前、良性、增生异常性或转移性。
在一些情况中，所述方法可以包括从受试者分离生物样本。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于，由自然脱落的身体物质或从外部可接近的组织的非破坏性刮屑构成的样本，例如唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、粘液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本或其级分(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。在一些情况中，生物样本可以在向受试者施用组合物之后的时间段进行收集。
细胞群可以在基因构建体递送至细胞之后被培养至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天或至少约1个月。细胞群可以在基因构建体递送至细胞之后被培养至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天或至多约1个月。
在一些情况中，所述方法可以包括检测多肽或核酸序列。该检测可以发生在培养细胞群之前或之后。该检测可以包括光声、生物发光、荧光报告物、化学发光、发光、比色或核酸测定。该检测还可以包括免疫测定。免疫测定包括在例如美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792中所述的那些。免疫测定包括各种夹心法、竞争性或非竞争性测定形式，其产生与目的蛋白质分析物的存在或量相关的信号。可以利用任何适合的免疫测定，例如，侧向流动、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定及诸如此类。
该检测方法可以包括测序。测序方法可以包括：下一代测序、高通量测序、焦磷酸测序、经典Sanger测序方法、连接法测序、合成法测序、杂交法测序、RNA-Seq(Illumina)、数字基因表达(Helicos)、下一代测序、单分子合成法测序(SMSS)(Helicos)、Ion Torrent测序机器(Life Technologies/Thermo-Fisher)、大规模平行测序、克隆单分子阵列(Solexa)、鸟枪法测序、Maxim-Gilbert测序和引物步移。
检测可以包括“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR))或Taqman(参见，例如美国专利号Gelfand的5,210,015、Livak等人的5,538,848，和Haaland的5,863,736，以及Heid,C.A.,等人，Genome Research,6:986-994(1996)；Gibson,U.E.M,等人，Genome Research6:995-1001(1996)；Holland,P.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280，(1991)；以及Livak,K.J.,等人，PCR Methods and Applications 357-362(1995))。监测扩增产物的形成的此方法的基础是利用双重标记的荧光寡核苷酸探针来连续测量PCR产物累积。在这种测定中使用的探针典型地是短(约20-25个碱基)多核苷酸，其标记有两种不同的荧光染料。该探针的5'末端典型地附接至报告染料并且3'末端附接至猝灭染料。探针被设计为具有与在靶mRNA或核酸上的位点至少基本互补的序列。与基因座的旁侧区结合的上游和下游PCR引物也被添加至反应混合物。当探针是完整的时，在两个荧光团之间发生能量转移，并且猝灭剂猝灭来自报告物的发射。在PCR的延伸期期间，探针被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割，从而从多核苷酸-猝灭剂释放报告物，并且导致报告物发射强度的增高，其可以通过适当的检测器来测量。然后，记录的值可以用于连续地计算归一化的报告物发射强度的增高，并且最终量化被扩增的mRNA的量。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测，RT-PCR步骤可以首先进行以从细胞RNA产生cDNA。这种通过RT-PCR扩增可以是普遍性的(例如用部分/完全地简并寡核苷酸引物扩增)或靶向的(例如用针对要在后续步骤中分析的特定基因的寡核苷酸引物扩增)。
在一些实施方案中，qPCR或Taqman可以在对分离的细胞mRNA进行反转录酶反应之后立即使用；此变化用来在qPCR期间量化各种mRNA的水平。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测或RNA测序，“预扩增”步骤可以首先对从细胞RNA转录的cDNA进行。这用来在要检测的RNA/cDNA的天然水平非常低的情况下增大信号。用于预扩增的适合方法包括但不限于LM-PCR、用随机寡核苷酸引物(例如随机六聚体PCR)进行PCR、用聚A特异性引物的PCR，及其任何组合。预扩增可以是普遍的或靶向的，以与上述反转录反应相同的方式进行。
用于降低表达渗漏度的改进的合成生物标志物设计和方法
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含编码可表达的报告基因的工程化的核酸，其当相比于包含含有核酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的报告基因的重组核酸时在正常细胞相对于患病细胞中表现出约10％或更少的表达。
在一些情况中，工程化的核酸可以包含与可表达的报告基因可操作地连接的泛肿瘤特异性启动子。在一些情况中，泛肿瘤特异性启动子可以包含转录应答元件。转录应答元件可以包含经修饰的p53应答元件。经修饰的p53应答元件内的修饰可能导致相对于患病细胞在正常细胞中降低的启动子活性。经修饰的p53应答元件内的修饰可能导致相对于正常细胞在患病细胞中增高的启动子活性。
在一些情况中，编码可表达的报告基因的工程化的核酸可以是本文所述的任何载体。
在一些情况中，报告基因可以编码可检测的多肽或可检测的核酸。可检测的核酸生物标志物可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA、RNA适配体或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。
报告基因可以编码光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物和其任何组合。自发荧光的报告物包括GFP、mCherry或其衍生物。比色报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)和酪氨酸酶。生物发光、化学发光或发光报告物包括萤光素酶(例如与施用本文所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。通过光声成像可检测的报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。可检测的核酸生物标志物可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸序列可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。报告基因可以编码通过非侵入性成像方法可检测的多肽。这种非侵入性成像方法包括MRI成像、PET成像、SPECT成像、光声成像和生物发光成像。通过MRI成像可检测的多肽包括多肽造影剂，例如铁蛋白(或其突变体，例如激烈火球菌铁蛋白突变体L55P、F57S或F123S)或镧系结合蛋白(或其工程化的融合物，例如在Daughtry等人，ChemBioChem 2012,13,2567–2574中所述的LBT-泛素融合物)。通过PET或SPECT成像可检测的多肽包括人碘化钠同向转运体(例如与施用PET活性碘/碘同位素联合，参见例如Penheiter等人，Curr Gene Ther.2012 Feb；12(1):33–47)，HSV-tk或其突变体例如HSV-sr39tk(例如与施用正电子标记的无环鸟苷或嘧啶类似物PET报告物例如[18F]FHBG联合，参见Yaghoubi SS等人，Nat Protoc.2006；1(6):3069-75)，以及多巴胺D2受体或其突变体例如D2R80A或D2R194A(例如与施用正电子标记的D2结合剂例如3-(2'-[18F]-氟乙基)-螺旋哌丁苯联合)。通过光声成像可检测的多肽包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。通过生物发光成像可检测的多肽包括萤光素酶(例如与施用本文中所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。在一些实施方案中，多肽可以是造影剂、产生可检测的分子的酶，或驱动可检测的分子的累积的转运体。
在一些情况中，侵袭患病细胞的疾病可能是癌症。示例性癌症包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病和腺瘤。癌可能产生于覆盖身体的内部和外部部分例如肺、乳房和结肠的细胞。肉瘤可能产生于位于骨、软骨、脂肪、结缔组织、肌肉和其他支持性组织中的细胞。淋巴瘤可能产生在淋巴结和免疫系统组织中。白血病可能产生在骨髓中并且在血流中累积。腺瘤可能产生在甲状腺、垂体腺、肾上腺及其他腺体组织中。适合用根据本公开内容的方法检测的癌症类型的具体示例性示例包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌、AIDS相关性淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑瘤、例如小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉途径和下丘脑胶质瘤、乳癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源的癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、恶性骨纤维性组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发性不明的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性骨纤维性组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤形成、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发灶不明癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、
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巨球蛋白血症和Wilms肿瘤。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测受试者中的疾病的方法，包括编码可表达的报告基因的工程化的核酸，其当相比于包含含有核酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的报告基因的重组核酸时在正常细胞相对于来自受试者的患病细胞中表现出约10％或更少的表达。受试者可能疑似患有癌症。该疾病可能是癌症或本文中提及的任何亚类型。
在一些情况中，工程化的核酸可以通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology Interv Pulmonol.2018Jul；25(3):168–175)。在一些实施方案中，工程化的核酸可以施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。
在一些情况中，所述方法可以包括从受试者分离生物样本。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于，由自然脱落的身体物质或从外部可接近的组织的非破坏性刮屑构成的样本，例如唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、粘液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本或其级分(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。在一些情况中，生物样本可以在向受试者施用组合物之后的时间段进行收集。
细胞群可以在基因构建体递送至细胞之后被培养至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天或至少约1个月。细胞群可以在基因构建体递送至细胞之后被培养至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天或至多约1个月。
在一些情况中，所述方法可以包括检测多肽或核酸序列。该检测可以包括光声、生物发光、荧光报告物、化学发光、发光、比色或核酸测定。该检测还可以包括免疫测定。免疫测定包括在例如美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792中所述的那些。免疫测定包括各种夹心法、竞争性或非竞争性测定形式，其产生与目的蛋白质分析物的存在或量相关的信号。可以利用任何适合的免疫测定，例如，侧向流动、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定及诸如此类。
该检测方法可以包括测序。测序方法可以包括：下一代测序、高通量测序、焦磷酸测序、经典Sanger测序方法、连接法测序、合成法测序、杂交法测序、RNA-Seq(Illumina)、数字基因表达(Helicos)、下一代测序、单分子合成法测序(SMSS)(Helicos)、Ion Torrent测序机器(Life Technologies/Thermo-Fisher)、大规模平行测序、克隆单分子阵列(Solexa)、鸟枪法测序、Maxim-Gilbert测序和引物步移。
检测可以包括“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR))或Taqman(参见，例如美国专利号Gelfand的5,210,015、Livak等人的5,538,848，和Haaland的5,863,736，以及Heid,C.A.,等人，Genome Research,6:986-994(1996)；Gibson,U.E.M,等人，Genome Research6:995-1001(1996)；Holland,P.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280，(1991)；以及Livak,K.J.,等人，PCR Methods and Applications 357-362(1995))。监测扩增产物的形成的此方法的基础是利用双重标记的荧光寡核苷酸探针来连续测量PCR产物累积。在这种测定中使用的探针典型地是短(约20-25个碱基)多核苷酸，其标记有两种不同的荧光染料。该探针的5'末端典型地附接至报告染料并且3'末端附接至猝灭染料。探针被设计为具有与在靶mRNA或核酸上的位点至少基本互补的序列。与基因座的旁侧区结合的上游和下游PCR引物也被添加至反应混合物。当探针是完整的时，在两个荧光团之间发生能量转移，并且猝灭剂猝灭来自报告物的发射。在PCR的延伸期期间，探针被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割，从而从多核苷酸-猝灭剂释放报告物，并且导致报告物发射强度的增高，其可以通过适当的检测器来测量。然后，记录的值可以用于连续地计算归一化的报告物发射强度的增高，并且最终量化被扩增的mRNA的量。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测，RT-PCR步骤可以首先进行以从细胞RNA产生cDNA。这种通过RT-PCR扩增可以是普遍性的(例如用部分/完全地简并寡核苷酸引物扩增)或靶向的(例如用针对要在后续步骤中分析的特定基因的寡核苷酸引物扩增)。
在一些实施方案中，qPCR或Taqman可以在对分离的细胞mRNA进行反转录酶反应之后立即使用；此变化用来在qPCR期间量化各种mRNA的水平。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测或RNA测序，“预扩增”步骤可以首先对从细胞RNA转录的cDNA进行。这用来在要检测的RNA/cDNA的天然水平非常低的情况下增大信号。用于预扩增的适合方法包括但不限于LM-PCR、用随机寡核苷酸引物(例如随机六聚体PCR)进行PCR、用聚A特异性引物的PCR，及其任何组合。预扩增可以是普遍的或靶向的，以与上述反转录反应相同的方式进行。
利用用来调制标志物表达的miRNA结合位点的合成生物标志物设计和方法
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物在正常细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达并且包含重组核酸，所述重组核酸包含编码报告基因的核酸序列，所述报告基因在所述报告基因的3′非翻译区中包含一个或多个miRNA结合序列。
在一些情况中，在患病细胞中表达的miRNA与一个或多个miRNA结合序列中的至少一个结合或缺少结合可能导致编码报告基因的mRNA的差异翻译或半衰期。在一些情况中，在患病细胞中表达的miRNA与一个或多个miRNA结合序列中的至少一个结合可能导致报告基因的翻译减少或者编码报告基因的mRNA的半衰期降低。在一些情况中，报告基因由于在癌细胞中表达的至少一种miRNA的下调而表现出在癌细胞中增高的表达。
在一些情况中，患病细胞可能是癌细胞、指示自身免疫性疾病的细胞(例如具有自指导活性的T细胞或淋巴细胞，或者受损于自身免疫的正常细胞)、或指示神经变性疾病的细胞(例如带有毒性淀粉样物质或邻近毒性淀粉样物质的细胞)。癌症、神经变性疾病和自身免疫性疾病包括本文中所述的任何疾病。在一些情况中，患病细胞可能是病毒感染的细胞。示例性病毒包括但不限于HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型。
在一些情况中，组合物可以包含多于一个miRNA结合序列在报告基因的3’非翻译区中。组合物可以包含至少两个miRNA结合序列在报告基因的3’非翻译区中，其中两个miRNA结合序列具有能够结合至相同miRNA的基本上一致的核苷酸序列。组合物可以包含至少两个miRNA结合序列在报告基因的3’非翻译区中，其中所述至少两个miRNA结合序列具有不同的核苷酸序列，所述不同的核苷酸序列各自能够结合至不同miRNA。组合物可以包含能够结合相同miRNA的至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个miRNA结合序列，或miRNA的组合。
在一些情况中，重组核酸可以包含DNA。当重组核酸包含DNA时，该重组核酸可以是本文所述的任何载体的部分。
重组核酸可以是合成的或体外转录的mRNA。
一个或多个miRNA结合序列可以包括至少一个miR-15、miR-16、let-7、miR-122或miR-34结合序列。
在一些情况中，报告基因可以编码可检测的多肽或可检测的核酸。可检测的核酸可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA、RNA适配体或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。
报告基因可以编码光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物或其任何组合。自发荧光的报告物包括GFP、mCherry或其衍生物。比色报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)和酪氨酸酶。生物发光、化学发光或发光报告物包括萤光素酶(例如与施用本文所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。通过光声成像可检测的报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。可检测的核酸可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸序列可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。
报告基因可以编码通过非侵入性成像方法可检测的多肽。这种非侵入性成像方法包括MRI成像、PET成像、SPECT成像、光声成像和生物发光成像。通过MRI成像可检测的多肽包括多肽造影剂，例如铁蛋白(或其突变体，例如激烈火球菌铁蛋白突变体L55P、F57S或F123S)或镧系结合蛋白(或其工程化的融合物，例如在Daughtry等人，ChemBioChem 2012,13,2567–2574中所述的LBT-泛素融合物)。通过PET或SPECT成像可检测的多肽包括人碘化钠同向转运体(例如与施用PET活性碘/碘同位素联合，参见例如Penheiter等人，Curr GeneTher.2012 Feb；12(1):33–47)，HSV-tk或其突变体例如HSV-sr39tk(例如与施用正电子标记的无环鸟苷或嘧啶类似物PET报告物例如[18F]FHBG联合，参见Yaghoubi SS等人，NatProtoc.2006；1(6):3069-75)，以及多巴胺D2受体或其突变体例如D2R80A或D2R194A(例如与施用正电子标记的D2结合剂例如3-(2'-[18F]-氟乙基)-螺旋哌丁苯联合)。通过光声成像可检测的多肽包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。通过生物发光成像可检测的多肽包括萤光素酶(例如与施用本文中所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。在一些实施方案中，多肽可以是造影剂、产生可检测的分子的酶，或驱动可检测的分子的累积的转运体。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物在正常细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达并且包含重组核酸，所述重组核酸包含编码报告基因的核酸序列，所述报告基因在所述报告基因的3′非翻译区中包含一个或多个miRNA结合序列。
在报告基因是通过非侵入性成像方法可检测的多肽生物标志物的情形中，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物诱导合成的生物标志物在患病细胞中表达，所述方法可以进一步包括在受试者的身体中定位患病细胞。定位可能与特定的分辨率相关，例如10mm至10cm，至少10mm或至多10cm。定位可能与特定的最小可检测的肿瘤尺寸相关，例如肿瘤尺寸在3mm3至10cm3。在一些情况中，特定的最小尺寸范围可以是1cm3至10cm3、或900mm3至1cm3、或800mm3至900mm3、或700mm3至800mm3、或600mm3至700mm3、或500mm3至600mm3、或400mm3至500mm3、或300mm3至400mm3、或200mm3至300mm3、或100mm3至200mm3、或50mm3至100mm3、或10mm3至50mm3、或3mm3至10mm3。在一些情况中，定位发生在非侵入性成像扫描(例如PET、MRI、SPECT等)中。在一些情况中，定位发生在现场手术干预期间，例如通过使用目视检查(在吸收报告物的目视范围的情况中)或通过目视检查与荧光激发联用。
在一些情况中，以上另外的定位步骤可以后随手术步骤以消除检测到的和/或定位的患病细胞。手术步骤可以对与将编码生物标志物的组合物施用于和/或定位患病细胞所在的部位相同或不同的部位进行。手术步骤可以是手术切除患病细胞或与患病细胞相关的肿瘤。手术或非手术消除步骤可以包括微侵入性杀死技术，例如放射外科学(包括但不限于伽玛刀、Reflexion、CyberKnife以及利用靶向电离辐射来杀死患病细胞的相关技术)。
在一些情况中，工程化的核酸可以通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology Interv Pulmonol.2018 Jul；25(3):168–175)。在一些实施方案中，工程化的核酸可以施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。
在一些情况中，所述方法可以包括从受试者分离生物样本。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于，由自然脱落的身体物质或从外部可接近的组织的非破坏性刮屑构成的样本，例如唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、粘液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本或其级分(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。在一些情况中，生物样本可以在向受试者施用组合物之后的时间段进行收集。
细胞群可以在基因构建体递送至细胞之后被培养至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天或至少约1个月。细胞群可以在基因构建体递送至细胞之后被培养至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天或至多约1个月。
在一些情况中，所述方法可以包括检测多肽或核酸序列。该检测可以包括光声、生物发光、荧光报告物、化学发光、发光、比色或核酸测定。该检测还可以包括免疫测定。免疫测定包括在例如美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792中所述的那些。免疫测定包括各种夹心法、竞争性或非竞争性测定形式，其产生与目的蛋白质分析物的存在或量相关的信号。可以利用任何适合的免疫测定，例如，侧向流动、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定及诸如此类。
该检测方法可以包括测序。测序方法可以包括：下一代测序、高通量测序、焦磷酸测序、经典Sanger测序方法、连接法测序、合成法测序、杂交法测序、RNA-Seq(Illumina)、数字基因表达(Helicos)、下一代测序、单分子合成法测序(SMSS)(Helicos)、Ion Torrent测序机器(Life Technologies/Thermo-Fisher)、大规模平行测序、克隆单分子阵列(Solexa)、鸟枪法测序、Maxim-Gilbert测序和引物步移。
检测可以包括“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR))或Taqman(参见，例如美国专利号Gelfand的5,210,015、Livak等人的5,538,848，和Haaland的5,863,736，以及Heid,C.A.,等人，Genome Research,6:986-994(1996)；Gibson,U.E.M,等人，Genome Research6:995-1001(1996)；Holland,P.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280，(1991)；以及Livak,K.J.,等人，PCR Methods and Applications 357-362(1995))。监测扩增产物的形成的此方法的基础是利用双重标记的荧光寡核苷酸探针来连续测量PCR产物累积。在这种测定中使用的探针典型地是短(约20-25个碱基)多核苷酸，其标记有两种不同的荧光染料。该探针的5'末端典型地附接至报告染料并且3'末端附接至猝灭染料。探针被设计为具有与在靶mRNA或核酸上的位点至少基本互补的序列。与基因座的旁侧区结合的上游和下游PCR引物也被添加至反应混合物。当探针是完整的时，在两个荧光团之间发生能量转移，并且猝灭剂猝灭来自报告物的发射。在PCR的延伸期期间，探针被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割，从而从多核苷酸-猝灭剂释放报告物，并且导致报告物发射强度的增高，其可以通过适当的检测器来测量。然后，记录的值可以用于连续地计算归一化的报告物发射强度的增高，并且最终量化被扩增的mRNA的量。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测，RT-PCR步骤可以首先进行以从细胞RNA产生cDNA。这种通过RT-PCR扩增可以是普遍性的(例如用部分/完全地简并寡核苷酸引物扩增)或靶向的(例如用针对要在后续步骤中分析的特定基因的寡核苷酸引物扩增)。
在一些实施方案中，qPCR或Taqman可以在对分离的细胞mRNA进行反转录酶反应之后立即使用；此变化用来在qPCR期间量化各种mRNA的水平。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测或RNA测序，“预扩增”步骤可以首先对从细胞RNA转录的cDNA进行。这用来在要检测的RNA/cDNA的天然水平非常低的情况下增大信号。用于预扩增的适合方法包括但不限于LM-PCR、用随机寡核苷酸引物(例如随机六聚体PCR)进行PCR、用聚A特异性引物的PCR，及其任何组合。预扩增可以是普遍的或靶向的，以与上述反转录反应相同的方式进行。
用于改进的安全且持续性合成生物标志物表达的基于CELiD的设计和方法
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物相比于质粒DNA或微环DNA表现出合成的生物标志物的显著更长的表达，所述组合物包含线性载体，所述线性载体包含双链核酸，所述双链核酸包含与编码合成的生物标志物的DNA序列可操作地连接的启动子，其中所述双链核酸的正向链和反向链在它们各自的末端上共价连接，其中所述启动子诱导所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的合成生物标志物的相对浓度大于1.0。
在一些情况中，疾病可能是癌症、自身免疫性疾病(例如具有自指导活性的T细胞或淋巴细胞，或者受损于自身免疫的正常细胞)、或神经变性疾病(例如带有毒性淀粉样物质或邻近毒性淀粉样物质的细胞)。示例性癌症、自身免疫性疾病和神经变性疾病包括本文中所述的任何那些疾病。在一些情况中，疾病可能是病毒感染的细胞。示例性病毒感染包括但不限于由HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型所致的那些病毒感染。
在一些情况中，线性载体可以包含启动子旁侧的末端反向重复序列(ITR)，所述启动子可操作地连接至编码合成的生物标志物的DNA序列，其中所述ITR源于腺相关病毒(AAV)。在一些情况中，AAV可以是AAV2。在一些情况中，启动子可以在受试者中选择性地驱动合成生物标志物在多种患病细胞中的表达。
在一些情况中，启动子可以具有细胞类型特异性。在一些情况中，启动子是泛癌症特异性启动子。在一些情况中，启动子可以是癌特异性启动子。在一些情况中，启动子可以是本文中提及的任何特异性启动子。
在一些情况中，合成的生物标志物可以包含MRI报告物、PET报告物、SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物、荧光报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物、可量化的核酸生物标志物和其组合和其任何组合。可检测的核酸生物标志物可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸生物标志物可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。
在一些方面中，本公开内容提供一种鉴定患病细胞的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用组合物，其中所述组合物相比于质粒DNA或微环DNA表现出合成的生物标志物的显著更长的表达，所述组合物包含线性载体，所述线性载体包含双链核酸，所述双链核酸包含与编码合成的生物标志物的DNA序列可操作地连接的启动子，其中所述双链核酸的正向链和反向链在它们各自的末端上共价连接；以及(b)检测所述合成的生物标志物，其中在所述受试者中所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的合成的生物标志物的相对浓度大于1.0。
在合成的生物标志物是通过非侵入性成像方法可检测的多肽生物标志物的情形中，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物诱导合成的生物标志物在患病细胞中表达，所述方法可以进一步包括(d)在受试者的身体中定位患病细胞。定位可能与特定的分辨率相关，例如10mm至10cm，至少10mm或至多10cm。定位可能与特定的最小可检测的肿瘤尺寸相关，例如肿瘤尺寸在3mm3至10cm3。在一些情况中，特定的最小尺寸范围可以是1cm3至10cm3、或900mm3至1cm3、或800mm3至900mm3、或700mm3至800mm3、或600mm3至700mm3、或500mm3至600mm3、或400mm3至500mm3、或300mm3至400mm3、或200mm3至300mm3、或100mm3至200mm3、或50mm3至100mm3、或10mm3至50mm3、或3mm3至10mm3。在一些情况中，定位发生在非侵入性成像扫描(例如PET、MRI、SPECT等)中。在一些情况中，定位发生在现场手术干预期间，例如通过使用目视检查(在吸收报告物的目视范围的情况中)或通过目视检查与荧光激发联用。
在一些情况中，以上另外的定位步骤可以后随手术步骤以消除检测到的和/或定位的患病细胞。手术步骤可以对与将编码生物标志物的组合物施用于和/或定位患病细胞所在的部位相同或不同的部位进行。手术步骤可以是手术切除患病细胞或与患病细胞相关的肿瘤。手术或非手术消除步骤可以包括微侵入性杀死技术，例如放射外科学(包括但不限于伽玛刀、Reflexion、CyberKnife以及利用靶向电离辐射来杀死患病细胞的相关技术)。
在一些情况中，组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology Interv Pulmonol.2018Jul；25(3):168–175)。在一些实施方案中，组合物施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约50％、至少约53％、至少约55％、至少约57％、至少约60％、至少约63％、至少约65％、至少约67％、至少约70％、至少约72％、至少约75％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、83％、至少约84％、85％、至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或介于这些值之间的任何范围的准确度。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约53％、55％、57％、60％、63％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或介于这些值之间的任何范围的准确度。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的灵敏度。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的灵敏度。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的特异性。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的特异性。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.2％、95.5％、95.7％、96％、96.2％、96.5％、96.7％、97％、97.2％、97.5％、97.7％、98％、98.2％、98.5％、98.7％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％或介于这些值之间的任何范围的阴性预测值(NPV)。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.2％、95.5％、95.7％、96％、96.2％、96.5％、96.7％、97％、97.2％、97.5％、97.7％、98％、98.2％、98.5％、98.7％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％或介于这些值之间的任何范围的NPV。
在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、60％、63％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的阳性预测值(PPV)。在一些情况中，对患病细胞的检测可以具有至多约31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、60％、63％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或介于这些值之间的任何范围的PPV。
在一些情况中，检测患病细胞可以包括利用非侵入性成像方法对受试者进行。非侵入性成像方法可以是光声、MRI、SPECT或PET成像。成像方法可以在向受试者施用组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月或至少约1年执行。成像方法可以在向受试者施用组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月、至多约6个月或至多约1年执行。在一些实施方案中，成像方法可以在向受试者施用组合物之后执行多次(例如以随着时间监测合成生物标志物水平)。成像方法可以在向受试者施用组合物之后执行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次。成像方法可以在向受试者施用组合物之后每周或每月执行。
在一些情况中，检测患病细胞可以包括检测来自受试者的生物样本。在一些情况中，所述方法可以包括从受试者分离生物样本。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于，由自然脱落的身体物质或从外部可接近的组织的非破坏性刮屑构成的样本，例如唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、粘液、子宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本或其级分(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。
在一些情况中，检测可以在向受试者施用组合物之后的时间段执行。该时间段可以是在向受试者施用组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。该时间段可以是在向受试者施用组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月或至多约6个月。在一些实施方案中，生物样本可以在向受试者施用组合物之后获得，并且任何生物标志物检测操作方案可以被执行多次(例如以随着时间监测合成生物标志物水平)。检测生物样本可以在向受试者施用组合物之后发生至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次。检测生物样本可以在向受试者施用组合物之后每周或每月地发生。
降低来自正常器官组织的背景生物标志物表达的设计和方法
在一些方面中，本公开内容提供一种组合物，所述组合物包含表达合成的生物标志物的载体，其中所述合成的生物标志物在正常器官细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达。在一些情况中，所述器官可能是肝、肾、脾或其组合。在一些情况中，所述载体可以包含编码与合成的生物标志物可操作地连接的启动子的重组核酸。
启动子可以包括泛癌症特异性启动子、癌特异性启动子或本文中所述的任何特异性启动子。
合成的生物标志物可以包含MRI报告物、PET报告物、SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物、自发荧光报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物、可量化的核酸和其任何组合。可检测的核酸可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。
载体可以包含调节元件，所述调节元件使在正常肝、脾或肾细胞中核酸序列的转录或mRNA半衰期沉默或变小。调节元件可以在重组核酸的转录但非翻译区中包含一个或多个miRNA靶序列。一个或多个miRNA靶序列的存在可以抑制从重组核酸序列表达。一个或多个miRNA靶序列可以包括针对至少一种组织特异性miRNA的至少一个miRNA靶序列。至少一种组织特异性miRNA可以包括富集于正常肝组织、肾组织或脾组织中的至少一种miRNA。富集于正常肝组织中的至少一种miRNA可以包括但不限于miR-122、miR-33、miR-33*、miR-223、miR-30c、miR-144、miR-148a、miR-24、miR-29或其任何组合。
组合物可以包含本文中所述的转染剂。
用于与合成的生物标志物使用的合成的或工程化的细胞设计/方法
在一些方面中，本公开内容提供一种工程化的颗粒，其模拟生物细胞或巨噬细胞的一种或多种功能，包括诱导生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的生物标志物的相对浓度比率大于1.0。
工程化的颗粒可以是人工细胞、最小细胞或脂质包封的合成颗粒。人工细胞的制备在例如Bastiaan等人，Acc.Chem.Res.,2017,50(4)，第769–777页中描述，其通过援引而并入本文中。工程化的颗粒可以包含生物膜、聚合物膜、简单聚合物、交联蛋白质、脂质膜或聚合物-脂质复合物，其在体外或体内与纯化的组分形成为纳米颗粒、脂质体、聚合物体(polymersome)、外泌体、微囊泡、凋亡小泡(apoptotic bleb)、转运囊泡、突触囊泡、分泌囊泡或微胶囊。工程化的颗粒可以包含跨膜嵌合蛋白质或天然存在的蛋白质，所述蛋白质包含与颗粒内信号传导结构域可操作地连接的颗粒外特异性结合结构域，其中所述颗粒内信号传导结构域能够在工程化的颗粒内活化至少一种酶反应。工程化的颗粒可以包含编码合成的生物标志物的核酸序列，其中所述至少一种酶反应导致在工程化的颗粒内产生合成的生物标志物。示例性的合成的生物标志物包括本文所述的任何报告物。颗粒外特异性结合结构域可以包含scFv或Fab片段。工程化的颗粒可以包含细胞质以及从完整细胞分离的其他组分。工程化的颗粒可以包含纯化的重组大分子组分或大分子组分，例如但不限于，细胞蛋白质、DNA、合成基因回路(gene circuit)、细胞器、ATP、酶、NADP、转录因子、核苷酸或无细胞转录-翻译提取物。
利用多重组合生物标志物进行疾病检测和/或产生受试者疾病谱的合成生物标志物设计和方法
在一些方面中，本公开内容提供至少一种载体，其中所述至少一种载体包含：与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子，其中所述启动子在细胞中驱动所述多种核酸序列的表达而产生多种多肽或核酸生物标志物序列，其中在受试者中所述启动子诱导所述多种多肽或核酸生物标志物序列在患病细胞中的表达优先于所述多种多肽或核酸生物标志物序列在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述多种多肽或核酸生物标志物序列的相对比率大于1.0。在一些实施方案中，每种所述启动子可以在所述受试者中诱导所述多种多肽或核酸生物标志物序列在患病细胞中的表达优先于所述多种多肽或核酸生物标志物序列在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述多种多肽或核酸生物标志物序列的相对比率大于1.0。
在一些方面中，本公开内容提供产生受试者的疾病谱的方法，所述方法包括使所述受试者的一种或多种细胞与多种基因构建体接触，其中所述多种基因构建体包含分别与多种条形码分子可操作地连接的多种疾病活化的启动子，并且所述疾病活化的启动子驱动对应的条形码分子在患有所述疾病的细胞中表达。此外，所述方法包括量化所述多种条形码分子的表达水平以产生所述谱。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于产生的所述谱检测疾病，所述谱包括与所述多种疾病活化的启动子对应的条形码分子的表达水平，利用分类器(机器学习或分类器算法)来检测所述疾病或其不存在。
通过将独有的标记归属于较大组内的独特成员，条形码提供在许多成员的较大且更复杂的混合物(例如在相同细胞内表达的多种启动子-报告基因构建体)的背景内鉴定和量化该成员(例如在特定的癌症特异性启动子的控制下报告基因的表达)的机会，而且提供从复杂的混合物中分离单个成员的机会。例如，在基于核酸的条形码的情况中，基于碱基配对互补性的条形码的杂交可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。对于基于肽的条形码，独特的特征(包括配体和受体的免疫捕获或相互作用)可以用于捕获和分离，或以其他方式通过所述捕获事件降低混合物的复杂性。
所述方法进一步包括检测所述疾病或其不存在，AUC(曲线下的面积)值为至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大。所述方法可以进一步包括检测所述疾病或其不存在，特异性为至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。所述方法进一步包括检测所述疾病或其不存在，灵敏度为至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
在第一轮筛查并确定特定的疾病例如特定癌症(即乳癌)或在特定组织起源内的癌症中量化条形码分子水平之后，包含特定癌症(即乳癌)活化的启动子的多种基因构建体可以在活体外或体内用于转染已经经历第一轮筛查的同一受试者的一种或多种细胞。后续数轮(例如多于两轮、三轮、四轮、五轮、六轮、七轮、八轮、九轮、十轮或更多轮)可以用来提高疾病鉴定(包括组织起源鉴定)的准确度。
在一些实施方案中，接触一种或多种细胞的方法可以在活体外执行。在一些实施方案中，接触一种或多种细胞的方法可以在体内执行。
在一些实施方案中，至少一种载体可以是包含所有上述元件的单个载体。在一些实施方案中，至少一种载体可以是各自包含不同启动子的多种载体。在一些实施方案中，各自包含不同启动子的每种所述多种载体还包含不同的多肽或核酸生物标志物序列。当所述至少一种载体是各自包含不同启动子的多种载体时，载体可以在彼此相隔至少8、至少12、至少16、至少24、至少32、至少48、至少56或至少72小时内被施用。当至多一种载体是各自包含不同启动子的多种载体时，载体可以在彼此相隔至多8、至多12、至多16、至多24、至多32、至多48、至多56或至多72小时内被施用。
在一些实施方案中，所述不同启动子是疾病活化的启动子。在一些实施方案中，疾病活化的启动子是本文中公开的癌活化的启动子。在一些实施方案中，多种癌活化的启动子包括在不同组织起源内的多种癌中活化的启动子。例如，多种癌活化的启动子包括在肺组织内的肺癌中活化的第一启动子、在肝组织内的肝癌中活化的第二启动子、在乳房组织内的乳癌中活化的第三启动子、以及在胰腺组织内的胰腺癌中活化的第四启动子等。在一些实施方案中，多种癌特异性启动子在多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、十六种或更多种、十七种或更多种、十八种或更多种、十九种或更多种、二十种或更多种、二十五种或更多种或三十种或更多种)不同组织起源中被活化。
在一些实施方案中，多种癌特异性启动子包括第一启动子，其在一种或多种不同类型的癌中被活化之后在检测时产生强信号。例如，启动子MMP11在癌例如BLCA、BRCA、CESE、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、LUAD、LUSC、PAAD、OV、READ、STAD、SARC等中被活化之后在检测时产生强信号。在一些实施方案中，多种癌特异性启动子包括第二启动子，其产生低背景信号。例如，启动子MMP13在MMP13未被活化的癌症类型中在检测时产生几乎不存在的信号。在一些实施方案中，多种癌特异性启动子包括第三启动子，其具有高信号与背景信号比率。例如，启动子MMP12在MMP12可被活化的特定癌症类型中被活化之后在检测时产生足量的信号，并且同时在MMP12被设计为不被活化的特定癌症类型中在检测时产生低信号。在某些实施方案中，多种癌特异性启动子包括本文公开的所有三种类型的启动子。在某些实施方案中，多种癌特异性启动子包括在检测时具有高信号的一种或多种启动子，以及在检测时具有低背景信号的一种或多种启动子。在某些实施方案中，多种癌特异性启动子包括在检测时具有高信号的一种或多种启动子，以及具有高信号与背景信号比率的一种或多种启动子。在某些实施方案中，多种癌特异性启动子包括在检测时具有低背景信号的一种或多种启动子，以及具有高信号与背景信号比率的一种或多种启动子。
在某些实施方案中，多种疾病活化的启动子包括多种癌活化的启动子，其对组织起源的选定组具有选择性并且在其中被活化。例如，多种疾病活化的启动子包括一种或多种启动子，其对多种组织例如乳房、肺、肝等具有选择性并且在其中被活化。在一些实施方案中，多种疾病活化的启动子包括对相同组织起源具有选择性并且在其中被活化的多种癌活化的启动子。例如，多种疾病活化的启动子包括若干不同启动子并且它们各自对相同组织例如乳房组织具有选择性并且在其中被活化。
在某些实施方案中，多种疾病活化的启动子包括在相同组织起源内的癌症的多种不同分子亚型中分别被活化的多种癌活化的启动子。例如，多种疾病活化的启动子包括在luminal A型乳癌、luminal B型乳癌、三阴性/基底样乳癌、HER2富集型乳癌和/或正常样乳癌中被活化的多种疾病特异性启动子。多种疾病活化的启动子包括在CMS1、CMS2、CMS3和/或CMS4结直肠癌中被活化的多种疾病特异性启动子。在某些实施方案中，多种疾病活化的启动子包括在组织起源内的癌症的一种分子亚型中被活化的多种癌活化的启动子。例如，多种疾病活化的启动子包括在luminal A型乳癌中被活化的多于一种不同启动子。在某些实施方案中，多种疾病活化的启动子包括在组织起源内的癌症的一个阶段中被活化的两种或更多种不同的癌活化的启动子。在某些实施方案中，多种疾病活化的启动子包括在组织起源内的癌症的分子亚型的不同阶段中被活化的疾病特异性启动子。
在一些情况中，所述疾病是癌症、自身免疫性疾病(例如具有自指导活性的T细胞或淋巴细胞，或者受损于自身免疫的正常细胞)、或神经变性疾病(例如带有毒性淀粉样物质或邻近毒性淀粉样物质的细胞)。示例性癌症包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病和腺瘤。癌可能产生于覆盖身体的内部和外部部分例如肺、乳房和结肠的细胞。肉瘤可能产生于位于骨、软骨、脂肪、结缔组织、肌肉和其他支持性组织中的细胞。淋巴瘤可能产生在淋巴结和免疫系统组织中。白血病可能产生在骨髓中并且在血流中累积。腺瘤可能产生在甲状腺、垂体腺、肾上腺及其他腺体组织中。适合用根据本公开内容的方法检测的癌症类型的具体示例性示例包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌、AIDS相关性淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑瘤、例如小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉途径和下丘脑胶质瘤、乳癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源的癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、恶性骨纤维性组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发性不明的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性骨纤维性组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤形成、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发灶不明癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、
Figure BDA0003391146670001341
巨球蛋白血症、Wilms肿瘤、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠腺癌、食管癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别胶质瘤、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、副神经节胶质瘤&嗜铬细胞瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑素瘤、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤、甲状腺乳头状癌、子宫癌肉瘤、子宫体内膜样癌、葡萄膜黑素瘤、唇黑素瘤、梭形细胞癌、脂肪肉瘤、鼻肉瘤、乳腺癌、胰岛瘤、骨肉瘤、肥大细胞瘤、血管肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、边缘区淋巴瘤、恶性黑素瘤或慢性淋巴细胞白血病。
在一些情况中，所述疾病可能是病毒感染。示例性病毒感染包括但不限于由HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型所致的那些病毒感染。
在一些情况中，所述疾病可能是自身免疫性疾病。示例性自身免疫性疾病包括但不限于失弛缓症、艾迪生病、成人Still病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴突&神经元神经病变(AMAN)、Baló病、白塞病、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、Castleman病(CD)、脂性腹泻、Chagas病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、Cogan综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、特发性混合性冷球蛋白血症、Evans综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性多血管炎、Grave病、Guillain-Barre综合征、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、Kawasaki病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性血管炎、扁平苔藓、硬化苔藓、木样结膜炎、线状IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病、梅尼埃尔病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、Mooren溃疡、Mucha-Habermann病、多灶性运动神经病变(MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、睫状体平坦部炎(周边葡萄膜炎)、Parsonage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、复发性多软骨炎、不安腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、结节病、Schmidt综合征、巩膜炎、硬皮病、
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综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎(SO)、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化的结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-Koyanagi-Harada病。
在一些情况中，所述疾病可能是神经变性疾病。神经变性疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)或者起因于感染以下病毒的神经变性：疱疹病毒科、多瘤病毒科、波纳病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、黄病毒科、小核糖核酸病毒科或反转录病毒科(参见Zhou等人，Virol J.2013；10:172)。
在一些情况中，所述疾病可能是病毒感染。示例性病毒感染包括但不限于由HIV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和人嗜T淋巴细胞病毒III型所致的那些病毒感染。
在一些情况中，多种多肽或核酸生物标志物序列中的至少一种可以包含通过非侵入性成像可检测的多肽序列。这种非侵入性成像方法包括MRI成像、PET成像、SPECT成像、光声成像和生物发光成像。通过MRI成像可检测的合成的生物标志物多肽包括多肽造影剂，例如铁蛋白(或其突变体，例如激烈火球菌铁蛋白突变体L55P、F57S或F123S)或镧系结合蛋白(或其工程化的融合物，例如在Daughtry等人，ChemBioChem 2012,13,2567–2574中所述的LBT-泛素融合物)。通过PET或SPECT成像可检测的合成的生物标志物包括人碘化钠同向转运体(例如与施用PET活性碘/碘同位素联合，参见例如Penheiter等人，Curr GeneTher.2012Feb；12(1):33–47)，HSV-tk或其突变体例如HSV-sr39tk(例如与施用正电子标记的无环鸟苷或嘧啶类似物PET报告物例如[18F]FHBG联合，参见Yaghoubi SS等人，NatProtoc.2006；1(6):3069-75)，以及多巴胺D2受体或其突变体例如D2R80A或D2R194A(例如与施用正电子标记的D2结合剂例如3-(2'-[18F]-氟乙基)-螺旋哌丁苯联合)。通过光声成像可检测的合成的生物标志物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。通过生物发光成像可检测的合成的生物标志物包括萤光素酶(例如与施用本文中所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。在一些实施方案中，合成的生物标志物可以是造影剂、产生可检测的分子的酶，或驱动可检测的分子的累积的转运体。合成的生物标志物可以原位在受试者体内进行测量。合成的生物标志物可以选自光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物或比色报告物，或其任何组合。
在一些情况中，多种多肽或核酸生物标志物序列中的至少一种可以编码在来自受试者的生物样本中可检测的多肽或核酸。当生物标志物是多肽时，该多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。示例性多肽生物标志物包括但不限于光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物和其任何组合。自发荧光的报告物包括GFP、mCherry或其衍生物。比色报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)和酪氨酸酶。生物发光、化学发光或发光报告物包括萤光素酶(例如与施用本文所述的腔肠素联合)，包括高斯萤光素酶、海肾萤光素酶和Photinus萤光素酶(例如包括工程化的Ppy RE8和RE9变化形式，描述在Branchini等人，Anal.Biochem.396(2010):290-297中)。通过光声成像可检测的报告物包括产生色素的酶，例如β-半乳糖苷酶(例如与施用X-gal联合)，以及酪氨酸酶、自发荧光的蛋白质(例如GFP、mCherry或其衍生物)、非荧光GFP样色蛋白(例如aeCP597和cjBlue和其衍生物)、基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白(例如IFP1.4、Wi-Phy、IFP1.4rev、IFP2.0、iRFP713、iRFP720、iRFP713/V256C、iRFP682、iRFP702、iRFP670、mIFP、iBlueberry、GAF-FP、BphP1-FP/C20S或AphB变体)，以及可逆地可光控开关的蛋白质(例如Dronpa、Dronpa-M159T和BphP1或其变体)。合成的生物标志物可以原位在受试者体内进行测量。合成的生物标志物可以选自光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物或比色报告物，或其任何组合。
在一些情况中，核酸生物标志物是例如天然或工程化的miRNA、RNA发夹、RNA适配体或其有条形码的变化形式。可检测的核酸生物标志物可以是核酶、自剪接内含子、RNA发夹、微RNA或其有条形码的变化形式，或其他类型的可量化的RNA。可量化的核酸可以包含通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的独特序列。当核酸是miRNA时，miRNA可以例如通过标准文库生成技术例如基于简并引物的退火和连接、聚(A)聚合酶标记随后RT或连接、或顺序衔接物连接偶联至q-PCR、测序或电泳检测方法进行检测。当生物标志物是多肽时，多肽可以包含N末端分泌信号序列(例如来自CD33或CD8a的N末端信号肽)。
当核酸是工程化的miRNA时，核酸可以是在Ronald等人(Ronald等人，PLoS ONE 11(7):e0159369)中所述的Sec-miR或miR-neg构建体。这种构建体包含：(a)未被内源性表达并且没有任何已知的脊椎动物靶的编码序列(例如Sec-miR5′-AAAUGUACUGCGCGUGGAGAC-3′)；(b)miR骨架序列，其提供对前miRNA的处理以使该编码序列旁侧的miRNA成熟(例如miR-155或miR-130骨架序列)；以及(c)增强加载入外泌体中的EXOmotif(例如GGAG)。这种miRNA构建体可以在例如编码报告多肽的基因的3’-UTR中被表达，或来自编码适合的无毒性蛋白质(例如内源结构蛋白质例如肌动蛋白或微管蛋白或高度表达的蛋白质例如泛素)的基因的3’-UTR。在一些实施方案中，工程化的miRNA的多个(例如至少2、至少4个)拷贝可以串联地提供。
在某些实施方案中，条形码分子可以独特地鉴定所述基因构建体的疾病特异性启动子。条形码分子可以包含核苷酸序列或肽序列。在某些实施方案中，条形码分子可以包含独特的DNA或RNA。当条形码分子包含RNA时，所述RNA是从miRNA支架加工的条形码。在某些实施方案中，miRNA支架包含5′、3′和环区衍生的所述miRNA支架以及包含所述条形码的茎区。在某些实施方案中，miRNA可以是本文中所述的工程化的miRNA。当条形码包含肽序列时，该条形码包含酶报告物。该肽序列可以包含本文中所述的N末端分泌信号序列。此外，该肽序列可以是通过本文中所述的非侵入性成像可检测的。
在一些情况中，至少一种载体可以是本文中所述的任何载体。在一些实施方案中，基因构建体包含非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是纳米质粒。在一些实施方案中，基因构建体包含不可复制型重组病毒体或源于其的分离的末端反向重复序列(ITR)。在一些实施方案中，病毒体可以是慢病毒的、腺相关病毒的、腺病毒的或γ-反转录病毒的病毒体。在一些实施方案中，病毒体源于在感染细胞内具有主要附加体基因组维持的病毒。在一些实施方案中，不可复制型病毒体是重组腺病毒载体。在一些实施方案中，AAV是血清型1、2、3、4、5、6、8、9、Ad5、Ad-RGD或Ad-19a/64或其假型变体。
在一些情况中，与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同启动子可以包含至少一种启动子。与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同启动子可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15种启动子。与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同启动子可以包含至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14或至多15种启动子。
在一些情况中，与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同启动子可以包含来自表2的至少一种启动子。与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同启动子可以包含来自表2的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15种启动子。与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同启动子可以包含来自表2的至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14或至多15种启动子。
在一些方面中，本公开内容提供一种检测受试者中的疾病的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用组合物，所述组合物包含上述至少一种载体(例如包含与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同启动子，其中所述启动子在细胞中驱动所述多种核酸序列的表达而产生多种多肽或核酸生物标志物序列，其中在受试者中所述启动子诱导所述多种多肽或核酸生物标志物序列在患病细胞中的表达优先于所述多种多肽或核酸生物标志物序列在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述多种多肽或核酸生物标志物序列的相对比率大于1.0；(b)检测所述多种多肽或核酸生物标志物序列以获得表达谱；以及(c)基于所述表达谱检测所述患病细胞，从而检测所述疾病。
在一些情况中，检测受试者中的疾病的方法包括检测来自受试者的样本的所述多种多肽或核酸生物标志物序列。在一些情况中，所述方法可以包括从受试者分离生物样本。生物样本可以是通过非侵入性方法从受试者收集的样本。示例性非侵入性样本包括但不限于，由自然脱落的身体物质或从外部可接近的组织的非破坏性刮屑构成的样本，例如唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、粘液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮拭子。生物样本可以是通过微侵入性方法从受试者收集的样本。示例性微侵入性样本包括但不限于血液样本或其级分(例如通过静脉穿刺或毛细管获得)、胸膜液样本(例如通过胸腔穿刺获得)、羊水样本(例如通过羊膜穿刺获得)和胃液样本(例如通过洗胃获得)。生物样本可以是通过活检获得的样本，例如皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得的内部器官样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。
在一些情况中，生物样本可以在向受试者施用包含至少一种载体的组合物之后的时间段获得。生物样本可以在向受试者施用包含至少一种载体的组合物之后至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约16小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月获得。生物样本可以在向受试者施用包含至少一种载体的组合物之后至多约15分钟、至多约30分钟、至多约1小时、至多约2小时、至多约4小时、至多约8小时、至多约16小时、至多约24小时、至多约36小时、至多约48小时、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月或至多约6个月获得。在一些实施方案中，生物样本可以在施用包含至少一种载体的组合物之后获得，并且任何生物标志物检测操作方案可以被执行多次(例如以随着时间监测合成生物标志物水平)。生物样本可以在施用包含至少一种载体的组合物之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25次获得。生物样本可以在施用包含至少一种载体的组合物之后每周或每月获得。
在一些情况中，包含至少一种载体的组合物可以通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤地施用于受试者。邻近肿瘤可以表示施用于在肿瘤附近内的组织，或者施用于可被预测为经由淋巴系统(例如邻接的淋巴结)可接近肿瘤的区域中。肿瘤内或邻近肿瘤的方法可以包括使用另外的成像技术例如超声内镜(参见例如Shirley等人，Gastroenterol Res Pract.2013；2013:207129)或经由支气管镜检(参见例如Rojas-Solano等人，J Bronchology IntervPulmonol.2018 Jul；25(3):168–175)。在一些实施方案中，包含至少一种载体的组合物可以施用于以下淋巴结的至少一个中：颈淋巴结、肱骨内上髁淋巴结、锁骨上淋巴结、颈淋巴结、腋淋巴结、纵隔淋巴结、滑车上淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、股淋巴结或腘淋巴结。在一些情况中，基于淋巴结的施用可以用作集中局部递送至组织区的方法。
在一些情况中，包含至少一种载体的组合物可以包含本文中所述的转染剂。
在一些情况中，包含至少一种载体的组合物可以包含本文中所述的药学上可接受的载剂。
在一些情况中，检测受试者中的疾病的方法可以包括将机器学习或分类器算法应用于所述表达谱，其中所述机器学习或分类器算法被配置为从指示非患病细胞的表达谱辨别指示患病细胞的表达谱。
机器学习或分类器算法一般是指由计算机系统执行的监督式学习和分类方法。在监督式学习方法中，来自两组或更多组的(例如患病的和非患病的)样品组通过统计分类方法进行分析。生物标志物存在/不存在/水平数据可以用作分类器，其在两组或更多组之间进行区分。然后，可以对新样本进行分析，从而分类器可以将新样本与所述两组或更多组之一关联。常用的监督式分类器/分类器算法非限制性包括神经网络(多层感知机)、支持向量机、k近邻、高斯混合模型、高斯、朴素贝叶斯、决策树和径向基函数(RBF)分类器。线性分类方法包括费雪线性判别、逻辑回归、朴素贝叶斯分类器、感知机和支持向量机(SVM)。用于本发明的其他分类器/分类器算法包括二次分类器、k近邻、提升、决策树、随机森林、神经网络、模式识别、贝叶斯网络和隐马尔可夫模型。
利用监督式方法分类通常通过以下方法执行：
为了解决监督式学习的给定问题(例如学习识别笔迹)，必须考虑各种步骤：
1.聚集训练集。这些可以包括，例如，来自食物或环境的被或未被特定微生物污染的样本、被相同微生物的不同血清型污染的样本、被或未被不同物种和微生物的血清型等的组合污染的样本。训练样本用来“训练”分类器。
2.确定学习函数的输入“特征”表示。学习函数的准确度取决于如何表示输入对象。典型地，输入对象被转化成特征向量，其包含描述该对象的多种特征。由于维数的困扰，所以特征的数目不应太大；但是应足够大以准确地预测结果。特征可能包括存在于本文中所述的食物或环境样本中的细菌物种或血清型的集。
3.确定学习函数和相应学习算法的结构。学习算法被选择，例如人工神经网络、决策树、贝叶斯分类器或支持向量机。学习算法用来构建分类器。
4.构建分类器(例如分类模型)。学习算法在聚集的训练集上运行。学习算法的参数可以通过在训练集的子集(称为验证集)上优化性能或经由交叉验证来调整。在参数调整和学习之后，该算法的性能可以在从训练集分离的初始样本的测试集上进行测量。
一旦如上所述确定机器学习分类器(例如分类模型)，它就可以用于分类样本，例如来自已经接受上述包含至少一种载体的组合物的受试者的样本。
在一些情况中，来自多种载体的生物标志物或条形码分子表达的相对模式提供与一种或多种不同类型的癌症对应的“独特指纹”。
在一些情况中，借助于人工智能和机器学习的方法可以应用于生物标志物表达的模式，以便开发用于准确的癌症检测的多种载体的预测系列。
在一些情况中，所述方法包括检测由至少一种载体编码的多肽或核酸序列。该检测还可以包括免疫测定。免疫测定包括在例如美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792中所述的那些。免疫测定包括各种夹心法、竞争性或非竞争性测定形式，其产生与目的蛋白质分析物的存在或量相关的信号。可以利用任何适合的免疫测定，例如，侧向流动、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定及诸如此类。当所述多肽是报告多肽时，所述检测可以包括光声测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、比色测定或其任何组合。
该检测方法可以包括测序。测序方法可以包括：下一代测序、高通量测序、焦磷酸测序、经典Sanger测序方法、连接法测序、合成法测序、杂交法测序、RNA-Seq(Illumina)、数字基因表达(Helicos)、下一代测序、单分子合成法测序(SMSS)(Helicos)、Ion Torrent测序机器(Life Technologies/Thermo-Fisher)、大规模平行测序、克隆单分子阵列(Solexa)、鸟枪法测序、Maxim-Gilbert测序和引物步移。
该检测可以包括“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR))或Taqman(参见，例如美国专利号Gelfand的5,210,015、Livak等人的5,538,848，和Haaland的5,863,736，以及Heid,C.A.,等人，Genome Research,6:986-994(1996)；Gibson,U.E.M,等人，GenomeResearch 6:995-1001(1996)；Holland,P.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280，(1991)；以及Livak,K.J.,等人，PCR Methods and Applications 357-362(1995))。监测扩增产物的形成的此方法的基础是利用双重标记的荧光寡核苷酸探针来连续测量PCR产物累积。在这种测定中使用的探针典型地是短(约20-25个碱基)多核苷酸，其标记有两种不同的荧光染料。该探针的5'末端典型地附接至报告染料并且3'末端附接至猝灭染料。探针被设计为具有与在靶mRNA或核酸上的位点至少基本互补的序列。与基因座的旁侧区结合的上游和下游PCR引物也被添加至反应混合物。当探针是完整的时，在两个荧光团之间发生能量转移，并且猝灭剂猝灭来自报告物的发射。在PCR的延伸期期间，探针被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割，从而从多核苷酸-猝灭剂释放报告物，并且导致报告物发射强度的增高，其可以通过适当的检测器来测量。然后，记录的值可以用于连续地计算归一化的报告物发射强度的增高，并且最终量化被扩增的mRNA的量。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测，RT-PCR步骤可以首先进行以从细胞RNA产生cDNA。这种通过RT-PCR扩增可以是普遍性的(例如用部分/完全地简并寡核苷酸引物扩增)或靶向的(例如用针对要在后续步骤中分析的特定基因的寡核苷酸引物扩增)。
在一些实施方案中，qPCR或Taqman可以在对分离的细胞mRNA进行反转录酶反应之后立即使用；此变化用来在qPCR期间量化各种mRNA的水平。
在一些实施方案中，针对qPCR或Taqman检测或RNA测序，“预扩增”步骤可以首先对从细胞RNA转录的cDNA进行。这用来在要检测的RNA/cDNA的天然水平非常低的情况下增大信号。用于预扩增的适合方法包括但不限于LM-PCR、用随机寡核苷酸引物(例如随机六聚体PCR)进行PCR、用聚A特异性引物的PCR，及其任何组合。预扩增可以是普遍的或靶向的，以与上述反转录反应相同的方式进行。
以下具体实施例应被解释为仅仅说明性而绝非限制本公开内容的其余部分。无需进一步阐述，相信本领域技术人员可以基于本文中的描述在其最完全的程度上利用本公开内容。本文中引用的所有出版物通过援引以其整体并入本文中。
陈述以下实施例是为了向本领域技术人员提供对如何执行本文中公开和要求保护的方法和使用组合物和化合物的完整的公开内容和描述。已经致力于确保关于数值(例如量、温度等)的准确度，但是应考虑到一些误差和偏差。除非另有说明，份是重量份，温度℃和压力处于或接近大气。标准温度和压力被定义为20℃和1大气压。
表1：用于根据本公开内容的方法和组合物的示例性序列
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实施例
实施例1.–质粒和微环构建
所有质粒都利用标准PCR和克隆技术进行构建并且通过Sequetech(MountainView,Calif.)进行测序。为了产生亲代质粒(PP)和MC二者，使用了Kay等人，(2010)Nat.Biotechnol.28:1287-1289中所述的系统(System Biosciences,Mountain View,Calif.)，其通过援引以其整体并入本文中。将977个碱基对(bp)存活蛋白启动子从pSurv-FL(Ray S等人，(2008)Molecular therapy:J.Am.Soc.Gene Therapy 16:1848-1856)亚克隆至包含SV40聚A和土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)的MN-100PP骨架(SystemBiosciences,Mountain View,Calif.)中以产生PP-pSurv-WPRE。接着，将来自pSELECT-zeo-SEAP的SEAP转基因(Invivogen,San Diego,Calif.)亚克隆至PP-pSurv-WPRE中以产生PP-pSurv-SEAP-WPRE(图2A-上图)。将PP-pSurv-SEAP-WPRE(PP)和MC-pSurv-SEAP-WPRE(MC)(图2A-下图)二者根据Kay等人，(2010)Nat.Biotechnol.28:1287-1289)中概述的操作方案以及供应商的说明书(System Biosciences,Mountain View,Calif.)进行扩增和纯化。
将ZYCY10P3S2T(大肠杆菌)用PP转化，挑选菌落并且将大肠杆菌在TB肉汤中培养过夜。为了产生MC，经由phiC31整合酶的表达而位点特异性重组是通过添加等体积的LB肉汤(包含0.001％L-阿拉伯糖)和16mL NaOH来引发，并且在30℃进行另外的5.5h培养。对于PP，将细胞在未补充L-阿拉伯糖的相同培养基中培养。无内毒素mega试剂盒(Qiagen,Valencia,Calif.)用来纯化PP和MC二者。
实施例2.-细胞培养和转染
将MDA-MB-231(ATCC,Manassas,Va.)、MeWo(ATCC,Manassas,Va.)和SK-MEL-28人黑素瘤细胞系分别维持在MEM和DMEM(Gibco,Carlsbad,Calif.)上。培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和1x抗生素-抗真菌溶液(Life Technologies)并且将细胞维持在37℃在5％CO2培养箱中。
在转染之前1天将细胞系平板接种(1.25x105个细胞/孔)在24孔板中。根据生产商的说明书将细胞用等质量的PP或MC(1μg)和2μl线型聚乙烯亚胺转染剂(jetPEI,Polyplus转染,Illkirch,France)进行转染。将培养基每天收集，以1200rpm离心3分钟并且将上清液储存在-20℃直至测量SEAP浓度。在收集培养基之后，将每个孔用PBS洗涤并且添加新鲜培养基；因此，SEAP测量反映了在24小时期间蛋白质产量。
实施例3.-皮下肿瘤模型和肿瘤内施用微环
将2x106个MeWo细胞植入雌性裸小鼠(Nu/Nu；Charles River)的右肋中并且肿瘤经3周时间形成(n＝4)。使MC(20μg)与线型聚乙烯亚胺转染剂(体内-jetPEI,Polyplus转染,Illkirch,France)以N/P比率6(N/P是体内jetPEI/核酸磷酸中氮残基的数量)络合并且重悬浮于50μL 5％葡萄糖中。
肿瘤内(I.T.)注射是在大约2min期间通过将DNA-转染剂复合物注射在每个肿瘤内的多灶处进行。两个队列的对照小鼠以相同剂量接受肌肉内(I.M.)注射MC(n＝3)或者仅I.T.注射5％葡萄糖(n＝3)。
实施例4.-实验黑素瘤转移模型、BLI和全身性施用微环
为了在全身性施用MC之后评价检测肿瘤的能力，采用先前描述的实验转移模型(Bhang等人，(2011)Nat.Med.17:123-129)。将稳定表达BRET融合蛋白(RLuc8.6-TurboFP-BRET6)(Dra-gulescu-Andrasi等人，(2011)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.108:12060-12065)的5x106个MeWo细胞经由尾静脉(200μL PBS总体积)注射至被辐射(5Gy)雌性裸小鼠(Nu/Nu；Charles River)中。在静脉内施用底物腔肠素(35μg/小鼠；稀释于150μl的PBS中)之后立即用BLI利用IVIS-200成像系统(PerkinElmer)在注射细胞之后以每周间隔对肿瘤生长进行监测。利用软件包Living Image 4.1，将目的区(ROI)在每个图像中画在肺上以量化肿瘤负荷。BLI数据被表述为肺平均辐亮度(光子/秒/cm2/球面度)。
向有肿瘤的小鼠(n＝7)或被辐射的对照小鼠(n＝7)施用与线型聚乙烯亚胺转染剂(N/P比率8；体内-jetPEI，Polyplus转染，Illkirch，France)络合并且重悬浮于400μl的5％葡萄糖中的40μg的MC。然后对小鼠经由尾静脉进行两次200μl注射并且第一次和第二次注射之间间隔5分钟。向被辐射小鼠的另一对照组(n＝5)仅施用400μl的5％葡萄糖。
实施例5.-血浆收集
在MC注射之前至少1天以及在注射后多达2周经由下颌下静脉收集血液样本。将血液(大约75-100ml)收集在肝素锂涂布的微管(BD)中，在处理之前保持在冰上，然后以10,000xg在4℃下离心5分钟。在SEAP测量之前，将血浆收集并储存在-80℃。
实施例6.-SEAP测定
为了测量培养基和血浆中的SEAP浓度，根据生产商(Clontech)的说明书使用Great EscAPe SEAP化学发光测定试剂盒2.0。简言之，将25μl的培养基或血浆添加至lx稀释缓冲液，并且将内源性碱性磷酸酶在65℃在30分钟期间进行热失活。将样本置于冰上3分钟，然后允许其恢复至室温。将100μl的SEAP底物加入，在室温下孵育30分钟，并且利用TD20/20光度计(Turner Designs,Sunnyvale,Calif.)在10秒期间对发光(相对光单位；RLU)进行测量。
实施例7.-在多个黑素瘤细胞系中肿瘤可活化的微环优于质粒
将两种肿瘤特异性启动子pSury和进展升高的基因-3启动子(pPEG)(Bhang等人，(2011)Nat.Med.17:123-129)的转录活性进行比较以评估哪种启动子将在健康组织中给出最低背景。将表达由pSurv或pPEG驱动的密码子优化的萤火虫萤光素酶(Luc2)的质粒构建并且全身性递送至健康雌性Nu/Nu小鼠中。两天之后，pSurv驱动的质粒相比于pPEG驱动的构建体表现出显著较低的背景Luc2表达，尤其在心和肺中(图18A-18D)。还比较了在原代人成纤维细胞系和两种人肿瘤细胞系中肿瘤特异性启动子的活性。pSurv也在人成纤维细胞系中具有较低的背景活性，以及在肿瘤细胞系中的等效或较高表达(图19A-19C)。
显现了肿瘤可活化的亲代质粒(PP；大约7.9kb)和微环(MC；大约4.1kb)(其中pSurv驱动的SEAP表达)(图2A-4)。为了比较用这两种构建体可获得的SEAP浓度，将两种人黑素瘤细胞系(MeWo，图15；和SK-MEL-28，图20)用等质量的PP和MC和等体积的线型聚乙烯亚胺(PEI)转染剂进行转染。在等质量下进行比较，这是因为使用MC的主要优点在于其尺寸较小，并且在体内非病毒DNA载体的主要剂量限制通常是转染剂的量，而不是DNA的量。在转染后，在多达8天期间每天测量培养基中的SEAP浓度。每个数据点反映在之前24小时时间内的SEAP累积而不是多天中累积的SEAP浓度。在第3天，在MeWo细胞中，与PP相比，MC在培养基中具有显著更高SEAP浓度，并且这些差异维持直至实验的最后一天(第8天)(图15)。对于SK-MEL-28细胞，获得了相似的结果。在第2天注意到仅有的显著差异(图20)。因此，由肿瘤可活化的pSurv驱动的MC相比于它们的亲代质粒对应物在黑素瘤癌细胞中具有改进的转基因表达谱。为了确保在体内MC比PP提供优势，比较了在小鼠(n＝5，用于PP；和n＝4，用于MC)中在全身性施用之后由强组成型延伸因子-1α启动子(pEF1)驱动的PP和MC达到的转基因表达水平，并且发现在递送后多个时间点时MC肺表达显著更高(p<0.05)(图21A和21B)。
实施例8.-肿瘤内注射肿瘤可活化的MC导致可检测的血浆SEAP浓度
由于pSurv转录活性相比于强启动子例如pCMV相对较低(图18A-18D)，所以确定直接肿瘤内(I.T.)施用肿瘤可活化的MC是否将导致血液中的可检测的SEAP信号。向带有皮下MeWo异种移植物(大约50-80mm3)的小鼠I.T.施用与PEI络合的20μg的MC(n＝4)或仅PBS(n＝3)，并且在注射之前和注射之后1、3、5、7、11和14天测量SEAP浓度(图7)。标准曲线分析显示，在血浆中SEAP测量值在5个数量级中是可再现的，并且低达0.3ng/25μl血浆的SEAP浓度是可检测的(图22A和22B)。至第3天，相比于对照小鼠(图15A-15D；p<0.01)，在接受MC的小鼠中检测到血浆SEAP浓度的显著增高(p<0.01)。此外，在施用后多达2周期间注意到这两组之间的显著差异。表达的肿瘤特异性还通过对小鼠组(n＝3)进行肌肉内(I.M.)MC注射来检查。在接受I.T.5％葡萄糖(Mock)注射的有肿瘤的小鼠或I.M.MC注射的小鼠之间注意到无显著差异。因此，当达到足够的转染效率时，pSurv驱动的肿瘤可活化的MC在肿瘤内产生足够的SEAP水平足以在施用后多个时间点在血液中可检测到。
实施例9.-全身性注射肿瘤可活化的MC可以鉴定有肿瘤的受试者和评估肿瘤负荷
测试了在全身性施用肿瘤可活化的MC后测量血浆SEAP浓度来从健康受试者辨别有肿瘤的受试者的能力。将稳定表达生物发光共振能量传递(BRET)融合报告物的MeWo黑素瘤细胞经由尾静脉施用于被辐射的裸小鼠(n＝7)，并且利用生物发光成像(BLI)随着时间检测肿瘤形成(图15A-15C)并且在牺牲时进行定性评估(图23)。虽然在MC施用之前3天定性地观察到宽范围的肿瘤负荷，但是所有肿瘤主要局限在肺内(图15A-15C)。在牺牲后，如预期的，在整个肺中注意到多个黑色素性肿瘤病灶(图23)。基于BLI信号的变化，肿瘤已经大约4.5倍小于MC施用时(2周前)的肿瘤。
对于每只小鼠，在尾静脉施用40μg的MC(肿瘤+MC)之前(0天)和之后1、3、7、11和14天时测量血浆SEAP浓度。作为对照组，健康(无肿瘤)小鼠也接受MC(对照+MC；n＝6)或5％葡萄糖(对照MC；n＝5)。如图16A-16C中所见，对于各个有肿瘤的小鼠，血浆SEAP浓度在MC注射后升高。无论肿瘤负荷如何，相比于对照组，在施用后第3-14天有肿瘤的小鼠表现出显著(p<0.05)更高的血浆SEAP浓度谱(图15)。接受MC的一些健康小鼠表现出稍微阳性SEAP信号(很可能反映了启动子渗漏，在图18A-18D中也在pSury情况中注意到)，总体而言，在两个对照小鼠组之间注意到无显著差异(图16D)。因此，在全身性施用肿瘤可活化的MC后测量血浆SEAP水平可以区分有肿瘤的受试者和健康受试者，并且宽机会窗口(>1周)可用于鉴定有肿瘤的受试者。
因为SEAP水平在MC施用后多个时间点升高，所以对于每只小鼠，累积的脱落入血浆中的SEAP通过计算血浆SEAP浓度曲线下面积(AUC)来评价。在所有小鼠中此单度量的比较揭示两个对照组之间无差异(对照+/-MC)，但是在有肿瘤的小鼠和两个对照组之间有显著(p<0.05)升高的值(图17A)。
评价了该测定通过接受者操作特性曲线(ROC)分析辨别有肿瘤的受试者和健康受试者的能力，如图17B中所示。这显示0.918(±0.084SE)的显著(p<0.05)面积以及0.754至1.083的95％置信区间。因此，在所述的MC剂量使用此第一代载体，该测定可靠地鉴定有肿瘤的受试者。
一些有肿瘤的受试者具有的AUC值仅略微高于接受MC的对照小鼠的平均值(图17A)。此外，如图16A-16C中所示，血浆SEAP浓度的变化似乎定性地对应于肿瘤负荷的程度。基于这两个观察，假设SEAP AUC可能与肺肿瘤负荷相关(如通过在MC施用前的3天内通过BLI评估的)。因为肿瘤主要位于肺内并且光学BLI信号是组织深度依赖性的，因此该评价局限于仅有肺肿瘤的小鼠(n＝6)。具有在肺外的多个转移病灶的一只小鼠被排除，但是包括此小鼠显示0.056的r2和接近显著性的p值(p＝0.0541)。如预期的，在MC施用之前肺BLI信号的ROI分析显示肺肿瘤尺寸的宽范围(图17)。重要地，肺肿瘤负荷显著地与SEAP AUC值相关(r2＝0.714；p<0.05)(图16C)。因此，我们的肿瘤可活化的MC系统不仅显示鉴定有肿瘤的受试者的稳健能力，而且在肿瘤负荷局限于一个器官的条件下还可以用于评价疾病程度。
实施例10.-统计分析
所有统计分析都是利用Prism 6.0软件(Graphpad软件)进行。来自细胞培养基的SEAP测量值比较是利用双因素方差分析(ANOVA)，随后Sidak多重比较检验来进行。来自小鼠的纵向血浆SEAP测量值是利用双因素重复测量ANOVA而后Tukey多重比较检验来比较。在小鼠队列中SEAP AUC测量值的比较是利用单因素ANOVA而后Tukey多重比较检验进行。ROC分析在来自接受MC的有肿瘤的小鼠和健康小鼠的SEAP AUC数据之间进行。最后，对SEAPAUC和肺肿瘤负荷测量值进行Pearson相关性分析。对于所有检验，标称的p-值小于0.05被视为显著。
实施例11.-用于肿瘤检测的新启动子的发现
挖掘了公开可获得的数据库以发现新的内源性基因(因此和启动子)，其可以用作替代或除了存活蛋白/BIRC5之外的合成生物标志物构建体的部分。采用了两个数据源：来自The Cancer Genome Atlas(TCGA)的肿瘤样本表达，其已经归档超过20,000个原发性癌症样本，来自33种癌症类型，与匹配的正常组织对照；和Genotype-Tissue Expression(GTEx)数据库，其包含关于正常组织中的表达数据的多样性信息。算法应用于组合的数据集，所述组合的数据集将靶基因按照不同肿瘤类型的数量进行评级，其中该靶的基因表达的最低四分位数显著更高于在所有对应的正常组织中基因表达的最高四分位数(例如为了发现在若干肿瘤类型中在比所有正常组织中的“背景”水平高的水平被表达的基因)。来自GTEx的正常组织表达数据被选择作为比TCGA数据库中来自癌症患者的匹配正常组织更好的健康正常组织指示。该算法相对于来自人类基因组中的所有19,000种基因的表达数据运行，并且该算法显示在大量肿瘤类型中相比于在所有正常组织中基因的过度表达。许多这些基因示于下表2中。
表2：肿瘤对其表达显著高于所有正常组织的基因
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对乳癌进行更详细的分析，其中以上120种基因的列表中的各种基因被筛选以发现哪些基因满足以下谱，其中：(i)相对于匹配的正常组织在癌中的表达升高；和(ii)在取样的所有正常组织中背景表达低(例如为了发现对乳癌尤其有效的“高置信度”标志物)。此细分析鉴定出4种候选物，其中的2种，泛素缀合酶E2 C(UBE2C)和胶原X型α1链(COL10A1)在TCGA中相对于在正常组织中在侵袭性乳癌中表现出显著量的表达和低背景表达。
当针对乳癌之外每种肿瘤类型单独地完成此分析时，表明两种其他基因钙粘着蛋白6(CDH6)和ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)分别在肾(肾细胞癌和肾透明细胞癌)和前列腺(前列腺癌)中表现出升高的特异性表达。
实施例11.-活体外启动子方法的检测灵敏度分析
为了确定活体外启动子方法的灵敏度的极限，将细胞经由例如抽血而从患者分离，将细胞用合成的生物标志物转染并且对生物标志物的表达进行评估以确定患病细胞的存在，将含有FLuc-慢病毒转导的初始H1299细胞掺入正常人PBMC的背景中进行实验。将不同数量的转导细胞掺入5百万个分离的人PBMC中(从8ml抽血获得的大致细胞数量的一半)并且对样本进行处理并且分析萤光素酶表达。结果示于图24中(图24)，其估计FLuc用作合成的生物标志物利用此方法检测限是3-10个“患病”报告物活性细胞/5百万个正常细胞。
实施例12.-癌活化的DNA构建体区分有肿瘤的小鼠和健康小鼠
将存活蛋白-SEAP纳米质粒(nDNA-存活蛋白-SEAP)与体内JetPEI、线型聚乙烯亚胺衍生物(也用于PoC实验中)一起配制(图16A-16D)。DNA纳米质粒例如DNA微环消除细菌骨架，并且需要抗生素抗性基因作为转化选择的标志物，使用生长限制性非编码反义RNA序列。共享增强的表达的相似特性，DNA纳米质粒在不使用复杂重组事件的情况下进行制备，因此，DNA纳米质粒可以实现稳健的表达并且可以以与普通DNA质粒相当的规模进行生产。在体内应用之前，大量工作用来优化和表征制剂。因此，纳米质粒/JetPEI多聚复合物以及早期使用的任何三元转染复合物按照尺寸、电荷和多分散性进行表征。优化过程还考虑了壳体化效率、血清稳定性和保护载荷对抗核酸酶的能力。总之，这些优化提供了具有增强的灵敏度和转染能力的系统。
将15μg的nDNA-存活蛋白-SEAP与JetPEI的制剂进行制备、表征并且静脉内注射入有中等肿瘤负荷的动物中。结果表明，在第4天在最高差异点，相比于以相同水平的配制的纳米质粒给药的无肿瘤动物，SEAP水平增高36倍(图26，参见JetPEI递送)。灵敏度大幅增高，并且根据信噪比差异的评估，总体的特异性水平增高超过10倍。在本研究的后部分中SEAP的癌活化的表达下降可能是由于细胞分裂以及DNA模板从核失去。由于多个时间点显示SEAP水平的升高，所以对每只小鼠进行AUC分析。相比于被给药纳米质粒的无肿瘤动物，在所有天中AUC提供19倍差异。鉴于每个队列的组内数据密集性和SEAP水平的明显差异，并不意外ROC分析得出100％灵敏度和100％特异性。利用相关的聚(β-氨基酯)的DNA递送C32-122和C32-145(参见例如Mol Ther.2007 Jul；15(7):1306-1312.doi:10.1038/sj.mt.6300132，关于结构)也被示出；这种递送剂的递送效率略逊于JetPEI(图26A)但是毒性稍微较低(图26F)。
实施例13.-在不同肿瘤模型中评估癌活化的DNA构建体
为了避免在使用基于生物发光的技术时与肿瘤尺寸的评估相关联的复杂性，采用了其中疾病负荷可以经由卡尺测量来确定的肿瘤模型(包括皮下肿瘤)，或者疾病负荷存在于动物的外表面附近的模型。研究了至少两个正常位模型，其中组织是物理测量工具卡尺可接近的。在建立每个模型之前，对用于患者衍生的异种移植物(CDX)中的每种细胞系进行表征。另外的验证通过体外转染进行，以确认从癌活化的DNA构建体的SEAP表达。在可能时，使用具有完整免疫系统的致肿瘤性模型。
首先表征从nDNA-存活蛋白-SEAP表达的生物标志物的活性，这是利用通过将1x106个4T1细胞注射入Balb/c裸小鼠的乳脂肪垫中而建立的同基因乳腺肿瘤模型进行。当肿瘤达到20mm3、50mm3、100mm3或200mm3的尺寸时，将配制的载体通过静脉内注射入有肿瘤的动物队列中来施用。在第-2天(注射前)以及注射后第2、6、9、13天通过下颌下放血而从动物收集血浆，并且进行处理以供所有体内研究的SEAP量化和AUC和ROC分析。基于图25中数据的准确性，每个队列由五只动物构成。动物数/队列增大至10或更大以弥补准确度的潜在损失和SEAP信号的差分。
在最终尸检时，对具有高水平的载体但低水平的转录物的组织进行亚硫酸氢盐测序，以便确定在那些组织中纳米质粒DNA的甲基化状态。此外，显示高水平的载体DNA或SEAP转录物的任何器官将在重复实验中收集以便经由外部第三方组织学确定是否存在肉眼可见的组织学变化(Histowiz,Brooklyn,NY)。总之，这些数据提供信息来进行IND实现的GLP毒理学和生物分布研究。
实施例14.-开发用于体外转染的新DNA递送剂
全身性基因递送的挑战提供开发新剂型的指导原则。核酸需要有效地被包封在纳米颗粒中以保护载荷免受核酸酶降解。一旦被施用，DNA纳米颗粒可以在血流中避免被固有的或适应性免疫监视检测和破坏。通过被称为外渗的过程，纳米颗粒被组织(包括癌细胞)摄取，其中DNA模板从递送材料释放并被转运至核中而充当转录模板。最终，纳米颗粒壳的组分被代谢并且从细胞消除而不引起全身性毒性。虽然这些挑战已经长久地困扰成功开发非病毒DNA递送技术的尝试，但是在细胞溶质递送RNA方面已有显著进展。这已经通过新一代可离子化阳离子材料(既是聚合物，又是基于脂质的)实现，该材料具有优异的细胞摄取和内体逃逸谱，并且已经达到第一RNAi药物(Alnylam的Patisiran)的监管机构批准和商业化。开发策略将是利用在核酸络合、颗粒表面工程化和内体逃逸方面的改进，同时提供附加的功能以改善核转运，以实现在用于癌症检测的诊断相关浓度进行非病毒DNA递送。
为了开发DNA纳米颗粒的新携带体，采取双管齐下的方法。第一是基于修饰已被开发的脂质纳米颗粒(LNP)制剂，其已经利用在基因疗法应用中已用于递送核酸的可离子化的阳离子脂质得以研发。LNP是在缩合阴离子DNA方面非常有效并且显示高包囊效率，并且已经常应用于针对肝组织转染的各种载荷。但是，可离子化的脂质结构和降解谱可以被工程化以便分布至其他组织。由于尺寸和电荷的固有性质适合于外渗入肝中，所以这些颗粒的表面被聚合物修饰以延长循环。
第二方案利用具有独特生物可降解性的新聚合物组合物。设计有可水解的键的称为聚(β-氨基酯)(PBAE)的聚合物已经表现出有效转染各种细胞的能力，并且一旦它们的载荷已被递送就容易地从细胞和身体消除。配制在涂布有多聚谷氨酸的PBAE复合物中的DNA能够有效地在体内靶向和转导T细胞。制备了利用新聚合物亚基的PBAE/DNA多聚复合物。这些新PBAE相比于JetPEI表现出显著较低的毒性(图26B-F)。研究了其他种类的可降解的阳离子聚合物，例如电荷改变的可逆转运体。
体内递送的挑战在于通过toll样受体活化被固有免疫性从血流清除、肝清除、巨噬细胞摄取或者通过中和抗体而引发适应性免疫应答。因此，研究了屏蔽配制的颗粒的表面电荷以增大持久性以及复合物广泛分布的能力的策略。采用了以各种比率的共价附接的聚乙二醇(PEG)涂覆纳米颗粒的策略。还研发了通过静电相互作用使多聚谷氨酸(PGA)吸收于纳米颗粒表面上的方法。然而，这些涂层可能大幅增大颗粒尺寸并且降低细胞摄取，这两方面都可能损及转染效率。因此，考虑到修饰亚基，所述修饰响应于肿瘤微环境的性质(包括低pH、低氧或局部蛋白酶)可能随着时间降解隐形涂层或可能使纳米颗粒上去屏蔽。
LNP和聚合物纳米颗粒递送DNA的能力通过包含特异性核靶向部分(其可以保持DNA致密性)而增高，并且通过被动扩散或定向转运而增强核定位。一种这样的潜在核递送剂是鱼精蛋白，其包含以非特异性方式结合DNA的富精氨酸序列并且被认为在精子头凝聚期间充当组蛋白替代物来稳定化DNA。鱼精蛋白的添加可以产生显著更致密的递送复合物。如图27中可见，DNA与鱼精蛋白一起预孵育导致产生适度较小的脂质纳米颗粒复合物。仍然要确定相对较小的颗粒是否具有增强的转导特性。在本文公开的制剂中掺入微管相关序列(MTAS)和核定位信号(NLS)也可以用来增强核转运。
为了在动物模型中测试生物分布和功效之前评估我们的制剂的品质，采用体内物理表征方法的严格集合，包括理解该制剂的囊化效率、尺寸、电荷和异质性以及在包含生理缓冲剂的血清中的稳定性。多聚复合物的参数可以包括：(1)尺寸范围75nm–150nm(2)净中性电荷或稍微负表面电荷(3)具有小于0.15的多分散性指数(4)具有大于85％的囊化效率，以及(5)大于30分钟的血清稳定性。
对生物分布和转染强度的初始体内测试是用DNA纳米质粒的配制复合物进行，其利用强组成型CMV启动子来驱动萤火虫萤光素酶的表达(图28)。每次实验测试具有大约20种不同制剂的批次。Balb/c小鼠队列(n＝3/队列)被注射包含25μg DNA纳米质粒的配制复合物。在中间时间点取得的血液样本用于综合临床化学，而末梢放血用于血液学和细胞因子分析以界定在体内或活体外产生高发光水平的纳米颗粒制剂的毒性谱。此外，对具有较高发光水平的动物收集另外的器官用于通过QPCR进行更广泛的生物分布分析来估算DNA载体拷贝数。要收集的另外组织包括脑、生殖腺、注射部位和骨髓。
具有相当于或替代由对照JetPEI组提供的水平的广泛分布和发光的制剂进入功效研究。如同生物分布和安全性研究，新多聚复合物可以表现出与用JetPEI配制的相同纳米质粒相似或更好的功效。新制剂的使用还可以在无肿瘤动物中产生SEAP的低背景水平。
实施例15.-将癌活化的纳米质粒平台升级为较大动物模型
虽然在研究小鼠模型中建立的肿瘤异种移植物的背景下已经测试和验证了许多基于癌症的药物，但是这些系统具有固有的限制，包括以下一种或多种的组合：缺乏基因多样性和适合的肿瘤微环境、关于增强的渗透性和保留(EPR)在肿瘤类型之间的异质性，以及在具有严重受损的免疫系统或完全缺乏免疫系统的动物中要建立的这些模型中的许多而非全部的习性。将该平台移入在较大的动物模型中天然存在的癌中避免了许多这些限制。同样，使用鼠异种移植物模型的一个挑战是尝试领悟安全且有效的剂量的升级，尤其当考虑重量20-35克的年轻鼠物种与北美中超过65千克的成人的平均重量之间规模的巨大差异时。在将我们的平台转变成犬模型中，根据狗的品种，在动物尺寸的多样性范围中评价各种天然存在的肿瘤类型。
关于测试品的性质，用包含驱动人SEAP蛋白质表达的人存活蛋白启动子的构建体进行初始研究。人和犬存活蛋白启动子中的序列之间的同一性程度被保留。nDNA-存活蛋白-SEAP构建体短暂转染入源于犬癌的细胞中，表明启动子在各种犬细胞中是功能性的(图29A和29B)。
为了体内功效研究，仅具有恶性肿瘤的狗被录入。收集了关于狗年龄、尺寸、重量、品种以及当前治疗(若有治疗)的信息。如果是可获得的，临床上还提供了关于当前治疗、肿瘤分期、伴随的放射学数据的另外信息。为了初始研究，具有高现存疾病负荷并且尚未治疗的动物被录入，但是对快速有效治疗的期望可能需要我们放松对后一项的要求。三个给药组(n＝3只狗/队列)经由静脉内给药途径而被注射配制的癌活化的纳米质粒。可能因非癌性疾病而垂危的另外三只狗(若它们可被录入)可以用作对照，但是可能证明难以确定该动物真正地没有癌症。为了PK数据，涉及临床化学和血液学的抽血就在给药前以及给药后1、2、4和6小时进行。另外的血液样本在给药后3、6、9、12和15天收集以监测临床化学并且检测血浆中人SEAP的存在。基于急性毒性研究的结果，可以收集另外的血液参数。在可能时，临床医师从施用本公开的测试品后肿瘤的后续活检或手术切除收集样本并且传递该材料。在核酸分离之后，对样本通过QPCR探询纳米质粒DNA的存在并且通过RT-QPCR探询SEAP转录物的存在。RT-QPCR用来评估在肿瘤内存活蛋白转录物的相对水平。
实施例16.-针对使用癌活化的合成生物标志物构建体的活体外方法
如果我们拥有在活体外环境中使用癌活化的合成生物标志物表达系统的能力，那么作为大规模检测早期癌症的通用工具，开发成本可以显著降低并且时间期限将明显缩短。许多最近的报告已经发表，表明在活体外活着的循环肿瘤细胞(CTC)可以被分离和扩增，维持那些细胞特有的生物功能，因此，使得可能将本公开的癌活化的合成生物标志物平台应用于这些细胞。脱落入血液中的这些细胞的数量可能少。
癌活化的合成生物标志物平台的活体外应用可能不限于尝试利用CTC中的失调表达。通过将从乳癌患者分离的PBMC的基因表达谱与来自健康志愿者血液的表达谱或来自肺癌患者的全血的表达谱进行比较，多个组已经鉴定癌症的基于血液的生物标志物。此外，已经报告了针对已经用肿瘤可活化的合成生物标志物表达系统工程化的活化的M2巨噬细胞的基于细胞的体内传感器。总之，在与癌细胞相同的环境中至少在短暂水平非致肿瘤性细胞可能具有短暂改变的转录谱，其可以用于采用本公开的癌活化的生物合成标志物平台的活体外方法中。总之，由于癌症而可能具有改变的基因表达谱的任何细胞群(包括CTC)可以被称为“转录改变的细胞”或简称TAC。
通过为了有效递送而使用具有广泛趋向性的重组腺病毒或慢病毒，可以用本公开的癌活化的生物标志物构建体来探询全血的细胞部分，即PBMC及存在的其他细胞。许多不同的细胞类型可用重组病毒进行高效率基因转移，导致能够在每个细胞的基础上引入每个转录单位的数十或甚至数百的拷贝。那些转录单位各自都可以驱动分析物例如萤光素酶的表达，具有可能易于量化的高灵敏度水平。
除了高度灵敏的报告物之外，由于有效的转导免除对富集特定细胞亚型或稀少细胞群例如EpCAM阳性CTC的需要，所以有效转导宽范围的细胞类型的能力可以提供增强的灵敏度，如通过增大的信号输出测量的。
为了确定活体外测定的理论灵敏度，将被工程化为组成型表达萤火虫萤光素酶(FLuc)蛋白质的H1299细胞掺入来自健康志愿者的5e6个PBMC(来自标准8mL抽血的大致细胞数量)中。在处理之后，注意到萤光素酶表达与掺入的H1299之间的线性关系，检测限为3-10个细胞(图24)。为了理解我们的病毒载体是否可以在人PBMC的复杂混合物中转导癌细胞，包含驱动萤火虫萤光素酶(Ad-存活蛋白-FLuc)的表达的人存活蛋白启动子的重组腺病毒用来转导混合物，在来自健康志愿者的5e6个PBMC的背景下增大初始(未经操作的)H1299细胞的数量。由于源于人非小细胞肺癌细胞系的H1299细胞已表现出高水平的存活蛋白表达，因此如果转导有我们的载体则应提供强劲的萤光素酶表达。在2天孵育期之后，萤光素酶活性分析表明，该活体外测定的灵敏度可以检测掺入5e6个人PBMC中的少达2个初始细胞(图30A和30B)，表明在复杂混合物中用此平台转导和检测癌细胞的能力。为了确定特异性，将包含仅PBMC的样本用Ad-CMV-FLuc转导(图30C，蓝色柱)，导致强劲的萤光素酶表达并且表明PBMC部分内的细胞能够被腺病毒转导。相比于未经转导的PBMC(图30C，灰色柱)，转导有Ad-存活蛋白-FLuc的PBMC(图30C，红色柱)缺少可测量的萤光素酶活性，表明该载体仅在具有失调的存活蛋白表达的细胞(例如图31B中掺入PBMC中的H1299细胞)存在下产生强劲信号。
进行了相似的实验，其中相同的Ad-存活蛋白-Fluc载体用来转导样本，该样本包含已经掺有源于狗肿瘤的初始犬癌细胞的5x105个犬PBMC。先前也已经报告在包括骨肉瘤的犬肿瘤中高水平的犬存活蛋白表达。虽然在该载体中所用的存活蛋白启动子是人源的，但是来自两个物种的启动子序列之间的相似性导致萤光素酶报告物的强劲产生。检测犬肿瘤细胞的灵敏度下至单细胞水平(图29A)并且检测源于多种犬肿瘤类型的细胞(图29B)。最后，源于正常健康志愿者以及源于癌症患者的人PBMC的初始集合是从商业来源获得。在用Ad-存活蛋白-Fluc构建体转导之后，将样本孵育72小时，裂解并且测定萤光素酶活性(图31)。健康人志愿者正常PBMC设定基线，同时源于各种癌的患者样本具有升高的萤光素酶水平。意外地，具有统计显著性的数据的若干样本收集自处于1期和2期的患者。获得此实验的结果，作为概念研究的证明，存在必须优化的参数，例如利用可替代的启动子或启动子的组合来影响检测特异性和检测率。
实施例17.–利用第一代活体外测定的犬研究表现出对淋巴瘤的89％检测率
利用BD
Figure BDA0003391146670001781
CPTTM单核细胞制备管(BD Biosciences,362753)从犬全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的PBMC重悬浮于RPMI培养基中(ATCC,302001)，该培养基补充有热失活的胎牛血清(VWR,89510-184)、青霉素-链霉素抗生素(Gibco,目录号15140-122)和L-谷氨酰胺(ThermoFisher,25030081)。细胞生存力是通过台盼蓝染料排斥实验(Gibco,T10282)进行测定。活体外生物测定以以下方式进行：将约3x106个PBMC以200微升的最终体积接种于96孔板的单孔中(VWR,10861)。然后，将细胞以0.3的MOI用腺病毒载体转导，该腺病毒载体被工程化为包含由BIRC5/存活蛋白启动子驱动的萤火虫萤光素酶报告基因。使转导的细胞能够在37℃(5％CO2)孵育72小时。其后，将培养基除去，并且将细胞在孔中用20微升被动裂解缓冲液(Promega,E1910)进行裂解。然后，将裂解产物转移至96孔白色固体测定板(Corning,CLS3912)的单孔中，随后添加100微升萤光素酶底物缓冲液(Promega,E4550)。发光是利用Promega GloMax Navigator微量板读板器以0.3秒积分时间进行测量。所有数据被收集并且用Graphpad Prism进行分析。图32A显示健康犬个体(n＝31)和犬淋巴瘤癌症患者(n＝17)的发光表达的倍数变化的比较。图32B显示存活蛋白活化的萤光素酶活性辨别犬淋巴瘤癌症受试者和健康犬受试者的诊断预测能力。
实施例18.-利用癌活化的启动子的组合检测的组合癌症检测方法的开发
可以将驱动那些失调基因的表达的调节序列的级联与癌活化的生物合成标志物平台偶联以促成改进癌症检测率所需的特异性和灵敏度以及超过仅简单查找单独基因产物的高准确度。
新启动子是通过将生物信息学方法应用于关于恶性病中失调基因表达的之前发表的文献而进行鉴定。对于前者，开始分析TCGA，其已经归档了超过20,000个原发性癌样本，来自33种癌症类型，与匹配的正常组织对照。还可以使用各种其他数据库，例如ICGC和Clinical Proteome Tumor Analyses Consortium(CPTAC)。
工作流程允许在特定的肿瘤类型和匹配的正常对照中使用一系列过滤器(包括滑动条)来选择定制水平和信噪比阈值。由于首先研究了发生在癌症早期的失调基因表达模式，所以对肿瘤分期过滤的能力是关键。最后，生物分布过滤器可以有助于预测在本文公开的不同类型的转染剂制剂的背景下渗漏启动子的相对贡献。
多个步骤的有效性和理论依据是通过将过滤器独立地应用于TCGA数据库并且相比于发表的文献评估靶输出来测试。在初步数据中，在癌组织相比于匹配的正常组织中信噪比的阈值过滤器被应用并且严格性逐步地增高。对于正常组织表达数据，相比于TCGA中的匹配的正常组织数据，基因型-组织表达(GTEx)数据库数据被选择作为健康组织的指示。此步骤的结果显示相比于正常组织在大量肿瘤类型中88种基因过度表达。为了验证癌活化的启动子活性，将来自每个新鉴定的启动子靶的调节序列：(a)亚克隆至纳米质粒表达构建体中，以至它们与报告物可读框(例如萤光素酶基因)可操作地连接而产生启动子-报告物构建体；以及(b)转染至各种癌细胞系中。具体地，若干单独的启动子序列被亚克隆至萤火虫(Photinus)萤光素酶报告基因的克隆序列上游，并且在每种载体被转染至源于癌的组织培养细胞系中之后对萤火虫萤光素酶生物标志物表达进行分析。将利用CMV启动子(强组成型启动子)驱动正交海肾萤光素酶的表达的单独的表达质粒以50倍低于测试质粒的浓度添加至转染混合物，作为内部对照(对从共转染的质粒产生的海肾萤光素酶水平的评估允许在不同细胞系之间归一化转染效率)。
用于转染的细胞系包括：(a)根据来自Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)的表达数据指导而选择的永生化细胞系；(b)从不同起源(例如肺、乳房和胰腺组织)的肿瘤建立的原发性患者人细胞系；以及(c)从各种类型的狗/犬癌分离的犬细胞系。每种细胞系的体外转染是利用Lipofectamine 3000作为转染剂进行(但是本公开的盒也易于转移至重组表达构建体中以供包装入重组病毒载体例如腺病毒中)。在用海肾萤光素酶信号对转染归一化之后，每种基因的相对水平通过评估萤火虫(Photinus)萤光素酶活性来证实。在源于肝癌、卵巢癌和胰腺癌的细胞系中每种报告物构建体的活性分别示于图33A、33B和33C中，其中在每种细胞系中每种报告物-启动子构建体的表达的相对强度经由色密度来描绘(具体值参照每幅图右侧的密度图例来显示)。而且，在源于乳房和肺的细胞系中报告物-启动子构建体的活性分别示于图33D和33E中。通过将启动子-报告物构建体转染至源于正常肺组织的未经转化的细胞系中产生了相同的数据；在这些未经转化的细胞中相同启动子的相应低水平活性(图33F)表明许多这些癌活化的启动子可以用于将肿瘤组织与无肿瘤组织区分(参见例如MMP12、CEP55、COL10A1、KIF20A、FAM111B、CST1、AFP、BIRC5、UBE2C、MCM10)。最后，构建体的活性在源于犬癌的细胞系中进行测试(图34)。尽管启动子序列源于人序列，但是许多构建体在犬细胞系中产生强劲的活性(参见例如BIRC5、BIRC5-501、CXCR4、UBE2C、TRIP13、CDKN3、MCM10、CDC20、TROAP、CEP55、KIF20A和cBIRC5)。
实施例19.-开发多重核酸/蛋白质条形码方法与癌活化的启动子联合来改进癌症检测率
容易地可量化的合成的条形码用作活性的替代报告物标志物可以简化分析，其中多个输出要被分析(例如在细胞系中多种启动子的活性的同时分析)。为了评估同时使用多种独特启动子(即多重化)是否可以易于使用核酸或蛋白质条形码，一系列各种启动子被首先克隆在分泌的萤光素酶分子上游。将来自IL-6蛋白质的分泌性结构域/信号肽包括在蛋白质的端部，导致萤光素酶(正常受限于细胞内定位)转变为从细胞分泌的酶。随后，产生多种DNA构建体，其中一系列独特的核酸条形码被引入在编码信号肽和萤光素酶的序列之间(图35A，参见信号肽和萤光素酶之间的有色插入物)。在此情况中，虽然使用了6个核苷酸的条形码(其可提供用于检测的多达4096种独特序列)，但是也设想到较长的(例如至少6、至少7、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20或更多个)核苷酸串，并且提供较大的组合集合。因为每种不同启动子被指定于对应的独特条形码(由于包含在被表达的蛋白质构建体中)，所以应该能够量化作为报告物表达的替代标志物的条形码的水平。然后，将这些信号肽-条形码-萤光素酶构建体亚克隆至纳米质粒构建体中，以若干候选报告物例如ABCC4、BIRC5(即存活蛋白)、UBE2C、COL10A1、E2F、FOXA1和MCM10作为对照，并且转染至细胞系中以供表达分析(参见例如图36)。
通过转染H1299细胞的平行板而单独地测试每种条形码化的癌活化的萤光素酶报告物构建体。将包含CMV驱动的海肾萤光素酶表达盒的DNA构建体包含在每种转染混合物中以控制转染效率变动。在转染后另外孵育24小时之后，将细胞裂解并且测定发光活性。图35B显示，当单独地测试时，每种启动子在H1299细胞内产生可分辨的萤光素酶活性水平。此外，每种启动子的相对强度的差异产生独特的模式。在平行板集合中，将H1299细胞用条形码化的构建体的混合物(包含等摩尔比的每种癌活化的报告物构建体)进行转染。在转染的细胞孵育24小时之后，将RNA从细胞中纯化并且通过下一代测序进行分析以量化存在于细胞转录物内的条形码化的序列的相对水平。图35C显示用多重化混合物转染H1299细胞产生与单独转染的细胞几乎相同模式的相对表达模式，如通过量化核酸条形码所评估的。这些组合实验的结果证明，来自启动子的这些独特的癌活化的表达模式或指纹可以用于鉴定与正被测试的特定细胞相关的分子特征。此外，条形码化可以提供有用的替代方案来以多重形式评估相对活性水平。
实施例20.-在细胞中使用抗体捕获形式来检测启动子-报告物构建体的活化
用于鉴定独特的启动子/报告物组合的条形码类型可以作为核酸序列存在(图35A)。可替代地，条形码可以采取其他形式，包括但不限于使用小蛋白质或肽片段。在此实施例中，融合于萤光素酶报告蛋白质的末端上的肽条形码片段允许分泌的萤光素酶在基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的测定中被捕获，其中用于测定的96孔板的每个单独的孔首先涂覆有对独特的蛋白质标签之一具有亲和力的特异性抗体。以此方式，该板的每个孔可以用于淘选和监视分泌的培养基复杂混合物中各种肽标签的存在。为了显示此方法的实用性，通过将来自IL-6的分泌性结构域/信号肽融合至萤光素酶的N末端而产生萤光素酶蛋白质的工程化的分泌形式。此外，将一系列基于肽表位的条形码引入编码信号肽和萤光素酶的序列之间(图36A)。初步概念验证实验中包括的表位标签包括FLAG(DYKDDDDK)、HA(流感血凝素蛋白质的片段)、V5(来自副粘病毒(称为猴病毒5)的V和P蛋白质上存在的肽结构域)和HSV(由单纯疱疹病毒表达的蛋白质的片段)。利用相同的CMV启动子，将具有独特的蛋白质条形码的四种构建体单独地转染至细胞中(参见例如图36A)。在孵育另外24小时之后，将培养基等分试样从每种转染条件收集并且在96孔板中淘选，其中每个单独的孔涂覆有针对每种独特表位的独特捕获性抗体(图36B)。在一系列缓冲液洗涤以消除非特异性结合之后，针对萤光素酶活性，将每个孔显影。图36C中所示的数据表明用含有特异性蛋白质表位的构建体转染的H1299细胞可以被捕获在涂覆有对应抗体的孔中—如萤光素酶活性的大幅增高所示。反之，该相同裂解产物在无抗体涂覆的对照孔(阻断非特异性结合)或在涂覆有针对其他表位的抗体的孔中不导致发光的增高。总之，这些数据表明条形码除了可以提供相对启动子活性的替代测量之外，还可以提供物理的分离方法。
用作条形码的肽片段可以被设计用于与ELISA形式不同的可替代的筛查和淘选方法。可替代的测定形式可以用于提供对检测特异性分析物的快速、高质量且廉价的解决方案。作为一个示例，利用侧向流动色谱法快速测试患者尿液已经常用于检测人妊娠。为了测试可替代的测定形式检测癌活化的标志物的能力，将插入萤光素酶的分泌性变体中的核酸条形码替换为来自人绒毛膜促性腺素(hCG)蛋白质的β亚基。将嵌合蛋白质克隆在癌活化的人存活蛋白启动子或CMV启动子的下游(图37A)。为了确保hCG条形码不改变构建体的活性，将H1299细胞的平行板集合用重组DNA构建体转染。缺少hCG条形码的相同DNA构建体用作对照。将包含CMV驱动的海肾萤光素酶表达盒的DNA构建体包含在每种转染混合物中以控制转染效率变动。在转染后另外孵育24小时之后，将细胞裂解并且对培养基的等分试样测定发光活性。如图37B中所见，hCG条形码的存在基本上没有改变萤光素酶报告蛋白质的表达。最后，700ul的相同上清液加载至在当地药房购买的商业妊娠测试试剂盒中。图37中可见，妊娠测试试剂盒可以明显地区分已转染有报告物的非条形码化变体相比于hCG条形码化变体的细胞。
尽管本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是：这些实施方案仅以示例的方式提供。本发明旨在不限于本说明书中提供的具体实施例。虽然已经参考以上说明书描述了本发明，但是本文中对实施方案的描述和说明并非意在以限制性含义进行解释。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的特定描述、配置或相对比例，而是取决于各种条件和变量。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。因此考虑本发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
实施方案以下意在是示例性实施方案并且绝非限制性。
1.一种方法，其包括：
(a)向受试者施用组合物，其中所述组合物在所述受试者中诱导生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对比率大于1.0；
(b)检测所述生物标志物；以及
(c)利用在(b)中检测到的所述生物标志物以至少70％的准确度确定所述受试者具有所述患病细胞。
2.实施方案1的方法，其中所述相对比率是浓度比率。
3.实施方案1或2的方法，其中所述生物标志物在来自所述受试者的生物样本进行检测。
4.实施方案3的方法，其中所述生物样本是来自所述受试者的体液。
5.实施方案4的方法，其中所述生物样本是来自所述受试者的血液或基于血液的样本。
6.实施方案3的方法，其中所述生物样本是来自所述受试者的气态样本。
7.实施方案6的方法，其中所述气态样本是来自所述受试者的呼气。
8.实施方案1-7中的任一个的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
9.实施方案8的方法，其中所述受试者是人类。
10.实施方案8的方法，其中所述受试者是动物。
11.实施方案3的方法，其中所述生物样本在人类或动物体内原位进行测量。
12.实施方案1-11中的任一个的方法，其中所述组合物包含核酸载体。
13.实施方案12的方法，其中所述载体选自纳米质粒、质粒、微环、重组病毒载体或CELiD。
14.实施方案13的方法，其中所述组合物包含微环，其中所述微环是自我复制型微环。
15.实施方案14的方法，其中所述自我复制型微环包含S/MAR元件。
16.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述组合物包含与编码所述生物标志物的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
17.实施方案16的方法，其中所述启动子在所述受试者中驱动在多种不同类型的患病细胞中表达。
18.实施方案1-17中的任一个的方法，其中所述启动子在所述受试者中驱动所述生物标志物在所述多种不同类型的患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在所述非患病细胞中的表达。
19.实施方案17的方法，其中启动子选自存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
20.实施方案1-19中的任一个的方法，其中所述生物标志物选自MRI报告物、PET报告物、SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物、荧光报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物、可量化的核酸生物标志物和其任何组合。
21.实施方案20的方法，其中所述可量化的核酸生物标志物是工程化的miRNA。
22.实施方案20或21的方法，其中对所述生物标志物的检测确定所述患病细胞的位置。
23.实施方案1-22中的任一个的方法，其中所述生物标志物是通过非侵入性成像或其组合在所述受试者的身体样本中可检测的。
24.实施方案23的方法，其中所述生物标志物是利用基于血液的测定进行检测。
25.实施方案1-24中的任一个的方法，其中所述组合物还包含转染剂。
26.实施方案25的方法，其中所述转染剂是线型或支化的聚乙烯亚胺、纳米颗粒、亲脂性颗粒、固体纳米颗粒、肽、胶束、树枝状分子、聚合物组合物、水凝胶、合成的或天然衍生的外泌体、病毒样颗粒或其任何组合。
27.实施方案1-26中的任一个的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载剂。
28.实施方案27的方法，其中所述药学上可接受的载剂选自水、花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素、含水的右旋糖、甘油溶液、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油单硬脂酸酯、氯化钠溶液、丙二醇、可可油或乙醇。
29.一种治疗患有或疑似患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物在所述受试者中诱导与所述疾病相关的患病细胞对治疗有效剂的表达优先于非患病细胞对所述治疗有效剂的表达，以至由所述患病细胞相比于所述非患病细胞表达的所述治疗有效剂的相对浓度大于1.0，所述治疗有效剂以至少10％的治疗功效治疗所述受试者，如通过所述患病细胞的细胞群的减少来确定。
30.实施方案29的方法，其中所述组合物包含载体。
31.实施方案29或30的方法，其中所述组合物包含与编码治疗有效剂的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
32.实施方案31的方法，其中所述治疗有效剂选自治疗有效的多肽、小活化RNA(saRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)或多肽和所述核酸的组合。
33.实施方案32的方法，其中所述治疗有效剂选自HSVtk、胞嘧啶脱氨酶、DT黄递酶、硝基还原酶、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷磷酸化酶、羧酸酯酶、叶酰基聚谷氨酰合成酶、羧肽酶A1、羧肽酶G2、细胞色素P-450。
34.一种组合物，其包含编码第一多肽或核酸生物标志物的第一核酸序列，以及编码第二多肽或第二核酸生物标志物的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：所述第二多肽或核酸生物标志物被表达的量反映所述第一核酸和所述第二核酸递送至所述细胞，并且所述第一多肽或核酸生物标志物在患病细胞相对于非患病细胞中被差异表达。
35.实施方案34的组合物，其中：
(i)所述细胞诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达，其中所述表达的第一多肽或核酸是可检测的生物标志物或治疗剂；并且
(ii)所述细胞诱导所述第二核酸序列同等地在患病细胞和非患病细胞中表达并且所述第二核酸序列产生所述第二多肽或核酸生物标志物，所述第二多肽或核酸生物标志物不是所述可检测的生物标志物或所述治疗剂，以至所述第二多肽或核酸生物标志物的表达水平提供用于评估在所述细胞中所述核酸序列的相对水平的对照。
36.实施方案34或35的组合物，其中在所述组合物中包含编码所述第一多肽的所述第一核酸序列和编码所述第二多肽的所述第二核酸序列的所述序列在独立的基因构建体上。
37.实施方案34-36中的任一个的组合物，其中所述第一多肽是所述可检测的生物标志物和所述治疗剂。
38.实施方案34-37中的任一个的组合物，其中所述细胞是患病细胞。
39.实施方案34-38中的任一个的组合物，其中所述组合物还包含载体，所述载体包含所述第一核酸和所述第二核酸。
40.实施方案39的组合物，其中所述载体包含：
(a)与所述第一核酸序列可操作地连接的第一启动子，
其中所述启动子诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达；以及
(b)第二启动子序列，所述第二启动子序列诱导在患病细胞和非患病细胞中同等地表达并且与所述第二核酸可操作地连接。
41.实施方案39或40的组合物，其中所述载体是非病毒载体。
42.实施方案41的组合物，其中所述非病毒载体是微环载体。
43.实施方案39或40的组合物，其中所述载体是纳米质粒载体。
44.实施方案34-42中的任一个的组合物，其中所述第一和第二多肽或核酸生物标志物是通过非侵入性成像或其组合在所述受试者的身体样本中可检测的。
45.一种检测受试者中的患病细胞的方法，所述方法包括将组合物施用于所述受试者，其中所述组合物包含：
编码第一多肽或核酸生物标志物的第一核酸序列，以及
编码第二多肽或第二核酸生物标志物的第二核酸序列，
其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：
(i)所述细胞诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达，其中所述第一多肽是可检测的生物标志物或治疗剂；并且
(ii)所述细胞诱导所述第二核酸序列同等地在患病细胞和非患病细胞中的等效表达并且所述第二核酸序列产生所述第二多肽，所述第二多肽不是所述可检测的生物标志物或所述治疗剂，以至所述第二多肽的表达水平提供用于评估在所述细胞中所述核酸序列的相对水平的对照。
46.实施方案45的方法，其中在所述组合物中，包含编码所述第一多肽或核酸生物标志物的所述第一核酸序列以及编码所述第二多肽或核酸生物标志物的所述第二核酸序列的所述序列在独立的构建体上。
47.实施方案45或46的方法，其中所述第一多肽是所述可检测的生物标志物和所述治疗剂。
48.实施方案45-47中的任一个的方法，其中所述细胞是患病细胞。
49.实施方案45-48中的任一个的方法，其中所述组合物还包含载体，所述载体包含所述第一核酸和所述第二核酸。
50.实施方案49的方法，其中所述载体包含：
(a)与所述第一核酸序列可操作地连接的第一启动子，
其中所述启动子诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达；以及
(b)第二启动子序列，所述第二启动子序列诱导同等地在患病细胞和非患病细胞中等效表达并且与所述第二核酸可操作地连接。
51.实施方案49或50的方法，其中所述载体是非病毒载体。
52.实施方案51的方法，其中所述非病毒载体是微环载体。
53.实施方案49或50的方法，其中所述载体是纳米质粒载体。
54.实施方案45-52中的任一个的方法，其中所述第一多肽和第二多肽是通过非侵入性成像或其组合在所述受试者的身体样本中可检测的。
55.一种组合物，其包含
编码第一多肽的第一核酸序列，以及
编码第二多肽的第二核酸序列，
其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：(i)所述细胞表达所述第一核酸序列以产生所述第一多肽；
(ii)所述细胞表达所述第二核酸序列以产生所述第二多肽；以及
(iii)由所述细胞表达的所述第一多肽和所述第二多肽被配置为组合以形成异二聚体蛋白质。
56.实施方案55的组合物，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至第一基因元件和第二基因元件，其中所述第一基因元件和所述第二基因元件二者选择性地被活化而在相同的患病细胞类型中表达所述第一多肽和所述第二多肽。
57.实施方案56的组合物，其中所述第一基因元件或所述第二基因元件是启动子、增强子或miRNA结合位点。
58.实施方案55-57中的任一个的组合物，其中所述异二聚体蛋白质是FRB/FKBP12异二聚体、拆分的萤光素酶蛋白质或拆分的GFP蛋白质。
59.实施方案58的组合物，其中所述FRB/FKBP12异二聚体与Cre重组酶的第一半部和第二半部连接。
60.实施方案55-59中的任一个的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽连接至第一自发荧光的蛋白质和第二自发荧光的蛋白质，其中所述第一自发荧光的蛋白质和所述第二自发荧光的蛋白质形成FRET对。
61.实施方案55-60中的任一个的组合物，其中所述异二聚体蛋白质被配置为调制患病细胞的活性。
62.实施方案55-61中的任一个的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽在独立的基因构建体上。
63.一种检测或治疗患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案55-62中的任一个的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽在所述患病细胞中被选择性地转录或翻译。
64.实施方案63的方法，其包括检测所述异二聚体蛋白质。
65.一种包含非天然存在的重组基因构建体的组合物，所述重组基因构建体包含编码多肽或核酸序列的序列，其中所述序列包含第一启动子，所述序列当被活体外转导入所述细胞中时所述第一启动子在从受试者分离的多种不同类型的细胞中选择性地驱动所述多肽或核酸生物标志物序列的表达。
66.实施方案65的组合物，其包含所述细胞。
67.实施方案65或66的组合物，其中所述细胞包括存在于以下中的细胞：血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑))、房水、羊水、胸膜液或呼气。
68.实施方案65-67中的任一个的组合物，其中所述多种不同类型的细胞是患病细胞或有障碍细胞。
69.实施方案68的组合物，其中所述患病细胞或有障碍细胞是多种不同类型的肿瘤细胞。
70.实施方案65-69中的任一个的组合物，其中所述第一启动子是泛肿瘤特异性启动子。
71.实施方案65-70中的任一个的组合物，其中所述第一启动子是癌特异性启动子。
72.实施方案65-71中的任一个的组合物，其中当所述细胞处于患病状态时所述第一启动子是来自活化的所述细胞的内源性启动子。
73.实施方案65-72中的任一个的组合物，其中所述重组基因构建体包含反转录病毒的、慢病毒的或腺病毒的包装元件或长末端重复序列。
74.实施方案65-73中的任一个的组合物，其中所述重组基因构建体是非病毒载体。
75.实施方案74的组合物，其中所述非病毒载体是微环载体。
76.实施方案65-75中的任一个的组合物，其中所述组合物具有一定诊断效率，其中所述诊断效率在所述受试者中以在患病细胞中优先于在非患病细胞中所述生物标志物的表达进行测量，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对比率大于1.0；
(b)检测所述生物标志物；以及(c)利用在(b)中检测到的所述生物标志物以至少90％的准确度确定所述受试者具有所述患病细胞。
77.实施方案65-76中的任一个的组合物，其中所述多肽或核酸序列是报告多肽，并且选自光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物或比色报告物、可量化的核酸生物标志物或其任何组合。
78.实施方案77的组合物，其中所述报告多肽是发光报告物，并且所述发光报告物是萤光素酶。
79.实施方案65-78中的任一个的方法，其中所述多肽或核酸序列是核酸序列，并且是核酶、自剪接内含子、微RNA、RNA适配体，或其他类型的可量化的RNA生物标志物。
80.实施方案79的组合物，其中所述核酸序列生物标志物是通过定量PCR或基于杂交的技术可检测的。
81.实施方案65-80中的任一个的组合物，其中所述细胞是患病细胞或有障碍细胞，其中所述基因构建体进一步编码第二多肽，所述第二多肽在第二启动子的控制下调制所述患病细胞或有障碍细胞的增殖，所述第二启动子选择性地驱动所述第二多肽在所述患病细胞或有障碍细胞中的表达。
82.一种在活体外检测患病细胞或有障碍细胞的方法，所述方法包括在活体外将非天然存在的重组基因构建体递送至从受试者分离的细胞群，其中所述非天然存在的重组基因构建体包含：
编码多肽或核酸生物标志物序列的序列，
其中所述序列包含第一启动子，所述序列当被转导入所述细胞中时所述第一启动子选择性地驱动所述多肽或核酸生物标志物序列在从受试者分离的多种不同类型的细胞中的表达。
83.实施方案82的方法，其包括分离所述细胞群。
84.实施方案83的方法，其包括经由非侵入性方法分离所述细胞。
85.实施方案84的方法，其包括通过唾液、痰液、汗液、尿液、粪便、精液、宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液和脸颊上皮获得所述细胞。
86.实施方案85的方法，其包括经由微侵入性方法分离细胞。
87.实施方案86的方法，其包括通过静脉穿刺、胸腔穿刺、羊膜穿刺或洗胃获得所述细胞。
88.实施方案87的方法，其包括通过活检分离所述细胞。
89.实施方案82-88中的任一个的方法，其中所述细胞包括存在于以下中的细胞：血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑))、房水、羊水、胸膜液或呼气。
90.实施方案82-89中的任一个的方法，其包括检测所述多肽或核酸序列。
91.实施方案82-90中的任一个的方法，其中所述疾病是癌症、自身免疫性疾病或神经变性疾病。
92.实施方案82-91中的任一个的方法，其中所述启动子是泛癌症特异性启动子。
93.一种包含载体的组合物，其中所述载体包含与多种条形码分子可操作地连接的多种不同的启动子，其中每种所述启动子驱动在细胞中所述多种条形码分子的表达，并且其中所述多种条形码分子的水平指示所述细胞的疾病的阶段。
94.实施方案93的组合物，其中所述细胞的所述疾病的所述阶段是患病、未患病或中间状态。
95.实施方案93-94中的任一个的组合物，其中所述疾病是癌症，其中所述多种不同启动子包括在癌症的早期被活化的第一启动子。
96.实施方案93-95中的任一个的组合物，其中所述疾病是癌症，其中所述多种不同启动子包括在癌症的中期被活化的第二启动子。
97.实施方案93-96中的任一个的组合物，其中所述疾病是癌症，其中所述多种不同启动子包括在癌症的晚期被活化的第三启动子。
98.实施方案93-97中的任一个的组合物，其中所述载体是非病毒载体。
99.实施方案93-98中的任一个的组合物，其中所述非病毒载体是微环载体。
100.实施方案93-97中的任一个的组合物，其中所述载体是纳米质粒载体。
101.实施方案93-99中的任一个的组合物，其中当所述多种条形码分子包含多种多肽时，每种所述多肽是通过非侵入性成像可检测的。
102.实施方案101的组合物，其中非侵入性成像包括光声、MRI或PET成像。
103.实施方案101中的任一个的组合物，其中每种所述多肽是在身体样本中可检测的。
104.实施方案103的组合物，其中所述身体样本是血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑))、房水、羊水、胸膜液或呼气。
105.一种检测疾病的阶段的方法，所述方法包括向受试者施用包含载体的组合物，其中所述载体包含：
与多种不同的条形码分子可操作地连接的多种不同的启动子，其中每种所述启动子驱动在细胞中所述多种条形码分子的表达，其中各种条形码分子的水平指示所述细胞的疾病的阶段。
106.实施方案105的方法，其中所述细胞的所述疾病的所述阶段是患病、未患病或中间状态。
107.实施方案105或106的方法，所述方法将受试者中的结节、组织块或病变在性质上确定为癌前、良性、增生异常性或转移性。
108.实施方案105-107中的任一个的方法，其中所述疾病是癌症，其中所述多种不同启动子包括在癌症的早期被活化的第一启动子。
109.实施方案105-108中的任一个的方法，其中所述疾病是癌症，其中所述多种不同启动子包括在癌症的中期被活化的第二启动子。
110.实施方案105-109中的任一个的方法，其中所述疾病是癌症，其中所述多种不同启动子包括在癌症的晚期被活化的第三启动子。
111.实施方案105-110中的任一个的方法，其中所述载体是非病毒载体。
112.实施方案105-111中的任一个的方法，其中所述非病毒载体是微环载体。
113.实施方案105-110中的任一个的方法，其中所述载体是纳米质粒载体。
114.实施方案105-112中的任一个的方法，其中当所述多种条形码分子包含多种多肽时，所述方法进一步包括通过非侵入性成像检测所述多种多肽中的至少一种。
115.实施方案114的方法，其中非侵入性成像包括光声、MRI、SPECT或PET成像。
116.实施方案105-115中的任一个的方法，其包括检测身体样本中的所述多种条形码分子中的至少一种。
117.实施方案116的方法，其中所述身体样本是血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑))、房水、羊水、胸膜液或呼气。
118.实施方案105-117中的任一个的方法，其中所述组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤或淋巴结内地施用于所述受试者中。
119.一种组合物，其包含编码可表达的报告基因的工程化的核酸，所述核酸当相比于包含含有核酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的报告基因的重组核酸时在正常细胞相对于患病细胞中表现出约10％或更少的表达。
120.实施方案119的组合物，其中所述工程化的核酸包含泛肿瘤特异性启动子。
121.实施方案120的组合物，其中所述泛肿瘤特异性启动子包含转录应答元件。
122.实施方案121的组合物，其中所述转录应答元件包含经修饰的p53应答元件。
123.实施方案122的组合物，其中所述经修饰的p53应答元件内的修饰导致相对于患病细胞在正常细胞中降低的启动子活性。
124.实施方案122或123的组合物，其中所述经修饰的p53应答元件内的修饰导致相对于正常细胞在患病细胞中增高的启动子活性。
125.实施方案119-124中的任一个的组合物，其中所述疾病是癌症。
126.一种方法，其包括向受试者施用根据实施方案119-125中的任一个的组合物。
127.实施方案126的方法，其中所述受试者疑似患有癌症。
128.实施方案125或126的方法，其中所述组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤或淋巴结内地施用于所述受试者中。
129.一种组合物，所述组合物在正常细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达并且包含重组核酸，所述重组核酸包含编码报告基因的核酸序列，所述报告基因在所述报告基因的3′非翻译区中包含一个或多个miRNA结合序列。
130.实施方案129的组合物，其中在所述患病细胞中表达的miRNA与一个或多个miRNA结合序列中的至少一个结合导致所述报告基因的翻译减少或编码所述报告基因的mRNA的半衰期降低。
131.实施方案129或130的组合物，其中所述患病细胞是癌细胞。
132.实施方案131的组合物，其中所述报告基因由于在所述癌细胞中表达的至少一种miRNA的下调而在所述癌细胞中表现出增高的表达。
133.实施方案129-132中的任一个的组合物，其中所述组合物包含至少两个miRNA结合序列在所述报告基因的所述3’非翻译区中，其中两个miRNA结合序列具有能够结合至相同miRNA的基本上一致的核苷酸序列。
134.实施方案129-133中的任一个的组合物，其中所述组合物包含至少两个miRNA结合序列在所述报告基因的所述3’非翻译区中，其中所述至少两个miRNA结合序列具有不同的核苷酸序列，所述不同的核苷酸序列各自都能够结合至不同miRNA。
135.实施方案129-134中的任一个的组合物，其中所述重组核酸包含DNA。
136.实施方案129-135中的任一个的组合物，其中所述重组核酸是合成的或体外转录的mRNA。
137.实施方案129-136中的任一个的组合物，其中所述一个或多个miRNA结合序列包括至少一个miR-15、miR-16、let-7、miR-122或miR-34结合序列。
138.一种检测患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案129-137中的任一个的组合物。
139.实施方案138的方法，其包括检测所述报告基因。
140.实施方案138的方法，其中所述受试者疑似患有癌症。
141.实施方案138-140中的任一个的方法，其中所述组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤或淋巴结内地施用于所述受试者中。
142.一种组合物，所述组合物相比于质粒DNA、微环DNA或纳米质粒DNA表现出合成的生物标志物的显著更长的表达，所述组合物包含线性载体，所述线性载体包含双链核酸，所述双链核酸包含与编码合成的生物标志物的DNA序列可操作地连接的启动子，其中所述双链核酸的正向链和反向链在它们各自的末端上共价连接，其中所述启动子诱导所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述合成的生物标志物的相对浓度大于1.0。
143.实施方案142的组合物，其中所述线性载体包含所述启动子旁侧的末端反向重复序列(ITR)，所述启动子可操作地连接至编码所述合成的生物标志物的所述DNA序列，其中所述ITR源于腺相关病毒(AAV)。
144.实施方案143的组合物，其中所述AAV是AAV2。
145.实施方案142-144中的任一个的组合物，其中所述启动子在受试者中选择性地驱动所述合成的生物标志物在多种患病细胞中的表达。
146.实施方案145的组合物，其中所述启动子是存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80,动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
147.实施方案142-146中的任一个的组合物，其中所述MRI报告物、PET报告物、SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物、荧光报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物、可量化的核酸生物标志物和其组合和其任何组合。
148.实施方案147的组合物，其中对所述生物标志物的检测确定所述患病细胞的位置。
149.一种鉴定患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案142-148中的任一个的组合物，以及检测所述合成的生物标志物，其中在所述受试者中所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述合成的生物标志物的相对浓度大于1.0。
150.实施方案149的方法，其中所述患病细胞是癌细胞。
151.实施方案149-150中的任一个的方法，其中检测所述合成的生物标志物以至少90％的准确度鉴定所述患病细胞。
152.实施方案149-151中的任一个的方法，其包括利用非侵入性成像方法对所述受试者检测所述合成的生物标志物。
153.实施方案中的任一个的方法，其中非侵入性成像包括光声、MRI、SPECT或PET成像。
154.实施方案149-153中的任一个的方法，其包括检测来自所述受试者的身体样本中的所述合成的生物标志物。
155.实施方案154的方法，其中所述身体样本是血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑))、房水、羊水、胸膜液或呼气。
156.实施方案154的方法，其中所述样本是活检样本。
157.实施方案152或153的方法，其中对所述生物标志物的检测确定所述患病细胞的位置。
158.实施方案149-157中的任一个的方法，其中所述受试者疑似患有癌症。
159.实施方案149-158中的任一个的方法，其中所述组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内或邻近肿瘤或淋巴结内地施用于所述受试者中。
160.一种组合物，所述组合物相比于质粒DNA或微环DNA表现出合成的生物标志物的显著更长的表达，所述组合物包含线性载体，所述线性载体包含双链核酸，所述双链核酸包含与编码治疗有效剂的DNA序列可操作地连接的启动子，其中所述双链核酸的正向链和反向链在它们各自的末端上共价连接，其中所述启动子诱导所述治疗有效剂在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述治疗有效剂的相对浓度大于1.0。
161.实施方案160的组合物，其中所述线性载体包含所述启动子旁侧的末端反向重复序列(ITR)，所述启动子可操作地连接至编码所述治疗有效剂的所述DNA序列，其中所述ITR源于腺相关病毒(AAV)。
162.实施方案160或161的组合物，其中所述AAV是AAV2。
163.实施方案160-162中的任一个的组合物，其中所述启动子在受试者中选择性地驱动所述治疗有效剂在多种患病细胞中的表达。
164.实施方案163的组合物，其中所述启动子是存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80,动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
165.实施方案160-164中的任一个的组合物，其中所述治疗有效剂选自治疗有效的多肽、小活化RNA(saRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)或所述治疗有效的多肽和所述核酸的组合。
166.实施方案165的组合物，其中所述治疗有效剂选自HSVtk、胞嘧啶脱氨酶、DT黄递酶、硝基还原酶、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷磷酸化酶、羧酸酯酶、叶酰基聚谷氨酰合成酶、羧肽酶A1、羧肽酶G2、细胞色素P-450。
167.一种治疗患病细胞的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案160-166中的任一个的组合物，以及检测所述合成的生物标志物，其中在所述受试者中所述合成的生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述合成的生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述合成的生物标志物的相对浓度大于1.0。
168.实施方案167的方法，其中所述患病细胞是癌细胞。
169.实施方案167-168中的任一个的方法，其中所述受试者疑似患有癌症。
170.实施方案167-169中的任一个的方法，其中所述组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内、邻近肿瘤或淋巴结内地施用于所述受试者中。
171.一种组合物，其包含表达合成的生物标志物的非病毒载体，其中所述合成的生物标志物在正常器官细胞相比于患病细胞中表现出约10％或更少的表达。
172.实施方案171的组合物，其中所述器官是肝、肾、脾或其组合。
173.实施方案171的组合物，其中所述非病毒载体包含编码与合成的生物标志物可操作地连接的启动子的重组核酸。
174.实施方案173的组合物，其中所述启动子是存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
175.实施方案173或174的组合物，其中所述重组核酸包含调节元件，所述调节元件使在正常肝细胞中所述核酸序列的转录或mRNA半衰期沉默或变小。
176.实施方案175的组合物，其中所述调节元件在所述重组核酸的转录但非翻译区中包含一个或多个miRNA靶序列。
177.实施方案176的组合物，其中所述一个或多个miRNA靶序列的存在抑制从所述重组核酸序列表达。
178.实施方案中176-177的任一个的组合物，其中所述一个或多个miRNA靶序列包括针对至少一种组织特异性miRNA的至少一个miRNA靶序列。
179.实施方案178的组合物，其中所述至少一种组织特异性miRNA包括富集于正常肝组织中的至少一种miRNA。
180.实施方案179的组合物，其中富集于正常肝组织中的所述至少一种miRNA包括miR-122、miR-33、miR-33*、miR-223、miR-30c、miR-144、miR-148a、miR-24、miR-29或其任何组合。
181.实施方案171-180中的任一个的组合物，其中所述组合物还包含转染剂。
182.实施方案181的组合物，其中所述转染剂是线型或支化的聚乙烯亚胺、纳米颗粒、亲脂性颗粒、固体纳米颗粒、肽、胶束、树枝状分子、聚合物组合物、水凝胶、合成或天然衍生的纳米细胞、外泌体、病毒样颗粒或其任何组合。
183.一种工程化的颗粒，其模拟生物细胞或巨噬细胞的一种或多种功能，包括诱导生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对浓度比率大于1.0。
184.实施方案183的工程化的颗粒，其中所述工程化的颗粒是人工细胞、最小细胞或脂质包封的合成颗粒。
185.实施方案183或184的工程化的颗粒，其中所述工程化的颗粒包含生物膜、聚合物膜、简单聚合物、交联蛋白质、脂质膜或聚合物-脂质复合物，其在体外或体内与纯化的组分形成为纳米颗粒、脂质体、聚合物体、外泌体、微囊泡、凋亡小泡、转运囊泡、突触囊泡、分泌囊泡或微胶囊。
186.实施方案183-185中的任一个的工程化的颗粒，其中所述工程化的颗粒包含跨膜嵌合蛋白质或天然存在的蛋白质，所述蛋白质包含与颗粒内信号传导结构域可操作地连接的颗粒外特异性结合结构域，其中所述颗粒内信号传导结构域能够在所述工程化的颗粒内活化至少一种酶反应。
187.实施方案186的工程化的颗粒，其中所述工程化的颗粒包含编码合成的生物标志物的核酸序列，其中所述至少一种酶反应导致在所述工程化的颗粒内产生所述合成的生物标志物。
188.实施方案186或187的工程化的颗粒，其中所述颗粒外特异性结合结构域包含scFv或Fab片段。
189.实施方案183-188中的任一个的工程化的颗粒，其中所述工程化的颗粒包含细胞质以及从完整细胞分离的其他组分。
190.实施方案183-173中的任一个的工程化的颗粒，其中所述工程化的颗粒包含纯化的重组大分子组分或大分子组分，例如但不限于，细胞蛋白质、DNA、合成基因回路、细胞器、ATP、酶、NADP、转录因子、核苷酸或无细胞转录-翻译提取物。
191.至少一种载体，其中所述至少一种载体包含：
与多种不同的核酸序列可操作地连接的多种不同的启动子，其中所述启动子在细胞中驱动所述多种核酸序列的表达而产生多种多肽或核酸生物标志物序列，
其中在受试者中所述启动子诱导所述多种多肽或核酸生物标志物序列在患病细胞中的表达优先于所述多种多肽或核酸生物标志物序列在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述多种多肽或核酸生物标志物序列的相对比率大于1.0。
192.实施方案191的载体，其中每种所述启动子在所述受试者中诱导所述多种多肽或核酸生物标志物序列在患病细胞中的表达优先于所述多种多肽或核酸生物标志物序列在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述多种多肽或核酸生物标志物序列的相对比率大于1.0。
193.实施方案191或192的载体，其中所述多种不同启动子包括至少2、至少3、至少4或至少5种启动子。
194.实施方案191-193中的任一个的载体，其中所述多种不同启动子包括至多12、至多13、至多14或至多15种启动子。
195.实施方案191-194中的任一个的载体，其中所述多种不同启动子中的至少两种选自表1中。
196.实施方案191-195中的任一个的载体，其中所述载体是质粒、纳米质粒、微环、重组病毒载体或CELiD。
197.实施方案196的载体，其中所述微环是自我复制型微环。
198.实施方案197的载体，其中所述自我复制型微环包含S/MAR元件。
199.实施方案191-198中的任一个的载体，其中所述多种多肽或核酸生物标志物序列包含选自光声报告物、生物发光报告物、自发荧光的报告物、化学发光报告物、发光报告物或比色报告物或其任何组合中的至少一种报告多肽。
200.实施方案191-199中的任一个的载体，其中所述多种多肽或核酸生物标志物序列包含具有N末端分泌信号序列的至少一种多肽。
201.实施方案191-200中的任一个的载体，其中所述多种多肽或核酸生物标志物序列包含选自核酶、自剪接内含子、微RNA、RNA适配体或其他类型的可量化的RNA生物标志物中的至少一种核酸生物标志物序列。
202.实施方案191-201中的任一个的载体，其中所述疾病是癌症、自身免疫性疾病或神经变性疾病。
203.一种检测受试者中的疾病的方法，所述方法包括：
向受试者施用组合物，所述组合物包含根据实施方案191-201中的任一个的载体；
检测所述多种多肽或核酸生物标志物序列以获得表达谱；以及基于所述表达谱检测所述患病细胞，从而检测所述疾病。
204.实施方案203的方法，其中(b)包括检测来自所述受试者的样本的所述多种多肽或核酸生物标志物序列。
205.实施方案204的方法，其中所述样本是来自所述受试者的体液。
206.实施方案205的方法，其中所述生物样本是来自所述受试者的血液或基于血液的样本。
207.实施方案203-206中的任一个的方法，其中所述多种多肽或核酸生物标志物序列包含至少一种核酸生物标志物序列，其中(b)包括通过定量PCR、测序或基于杂交的技术检测所述至少一种核酸生物标志物序列。
208.实施方案203-207中的任一个的方法，其中所述多种多肽或核酸生物标志物序列包含至少一种报告多肽，所述方法包括通过光声测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、比色测定或其任何组合检测所述至少一种报告多肽。
209.实施方案203-208中的任一个的方法，其中(c)包括将机器学习或分类器算法应用于所述表达谱，其中所述机器学习或分类器算法被配置为从指示非患病细胞的表达谱辨别指示患病细胞的表达谱。
210.实施方案203-209中的任一个的方法，其中所述组合物通过静脉内、皮下、心室内、鞘内、脑室内、经皮、肌肉内、经口腔、通过吸入、经鼻腔、经直肠、肿瘤内、邻近肿瘤或淋巴结内地施用于所述受试者中。
211.实施方案203-210中的任一个的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载剂。
212.实施方案203-211中的任一个的方法，其中所述组合物还包含转染剂。
213.一种检测受试者的疾病或不存在疾病的方法，所述方法包括：
(a)使所述受试者的一种或多种细胞与基因构建体在活体外接触，其中：
所述基因构建体包含与条形码分子可操作地连接的疾病活化的启动子，并且所述疾病活化的启动子驱动所述条形码分子在患有所述疾病的细胞中的表达；
(b)量化所述条形码分子的表达水平；以及
(c)基于所述表达水平而检测所述疾病或其不存在。
214.一种产生受试者的疾病谱的方法，所述方法包括：
(a)使所述受试者的一种或多种细胞与多种基因构建体接触，其中：
所述多种基因构建体包含分别与多种条形码分子可操作地连接的多种疾病活化的启动子，并且所述疾病活化的启动子驱动所述对应条形码分子在患有所述疾病的细胞中表达；以及
(b)量化所述多种条形码分子的表达水平以产生所述谱。
215.实施方案214的方法，其中所述接触是在活体外。
216.实施方案214的方法，其中所述接触是在体内。
217.实施方案213或214的方法，其进一步包括从所述受试者分离所述一种或多种细胞。
218.实施方案213或214的方法，其中所述疾病活化的启动子包括癌活化的启动子，或所述多种疾病活化的启动子包括多种癌特异性启动子。
219.实施方案218的方法，其中所述癌活化的启动子或多种癌活化的启动子在急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠腺癌、食管癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别胶质瘤、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、副神经节胶质瘤&嗜铬细胞瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑素瘤、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤、甲状腺乳头状癌、子宫癌肉瘤、子宫体内膜样癌、葡萄膜黑素瘤、唇黑素瘤、梭形细胞癌、脂肪肉瘤、鼻肉瘤、乳腺癌、胰岛瘤、骨肉瘤、肥大细胞瘤、血管肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、边缘区淋巴瘤、恶性黑素瘤或慢性淋巴细胞白血病中活化。
220.实施方案218-219中的任一个的方法，其包括多种癌活化的启动子，其中所述多种癌活化的启动子包括在不同组织起源内的多种癌中活化的启动子。
221.实施方案220中的任一个的方法，其中所述多种癌特异性启动子在多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、十六种或更多种、十七种或更多种、十八种或更多种、十九种或更多种、二十种或更多种、二十五种或更多种或三十种或更多种)不同组织起源中被活化。
222.实施方案220-221中的任一个的方法，其中所述多种癌特异性启动子包括产生强信号的第一启动子、产生低背景信号的第二启动子、具有高信号与背景信号比率的第三启动子，或其任何组合。
223.实施方案222的方法，其中所述多种癌特异性启动子包括至少一种所述第一启动子、至少一种所述第二启动子，以及至少一种所述第三启动子。
224.实施方案214的方法，其中所述多种疾病活化的启动子包括多种癌活化的启动子，其对组织起源的选定组具有选择性并且在其中被活化。
225.实施方案214的方法，其中所述多种疾病活化的启动子包括对相同组织起源具有选择性并且在其中被活化的多种癌活化的启动子。
226.实施方案214的方法，其中所述多种疾病活化的启动子包括在相同组织起源内的癌症的多种不同分子亚型中分别被活化的多种癌活化的启动子。
227.实施方案214的方法，其中所述多种疾病特异性启动子包括在组织起源内的癌症的一种分子亚型中被活化的多种癌活化的启动子。
228.实施方案214的方法，其中所述多种基因构建体包括在组织起源内的癌症的一个阶段中被活化的两种或更多种不同的癌活化的启动子。
229.实施方案213-228中的任一个的方法，其包括使至少一种细胞与所述多种基因构建体或所述基因构建体接触。
230.实施方案213-229中的任一个的方法，其中所述基因构建体或所述多种基因构建体包含非病毒载体。
231.实施方案230的方法，其中所述非病毒载体是纳米质粒。
232.实施方案213-229中的任一个的方法，其中所述基因构建体或所述多种基因构建体包含不可复制型重组病毒体或源于其的分离的末端反向重复序列(ITR)。
233.实施方案232的方法，其中所述病毒体是慢病毒的、腺相关病毒的、腺病毒的或γ-反转录病毒的病毒体。
234.实施方案232的方法，其中所述病毒体源于在感染细胞内具有主要附加体基因组维持的病毒。
235.实施方案233的方法，其中所述不可复制型病毒体是重组腺病毒载体。
236.实施方235案的方法，其中所述AAV是血清型1、2、3、4、
5、6、8、9、Ad5、Ad-RGD或Ad-19a/64或其假型变体。
237.实施方案232-236中的任一个的方法，其中将所述不可复制型重组病毒体在0.001–10的感染复数(MOI)下与来自所述受试者的所述细胞组合。
238.实施方案213-237中的任一个的方法，其中所述受试者是人或犬。
239.实施方案213-238中的任一个的方法，其中所述受试者先前已经接受对癌症的手术治疗、化疗、放射治疗或免疫治疗。
240.实施方案213-239中的任一个的方法，其中所述受试者具有癌症的至少一种风险因素，例如，患有Li-Fraumeni综合征、lynch综合征、家族性腺瘤性息肉病、VonHippel-Lindau病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、Cowden综合征、遗传性乳腺和卵巢癌综合征(HBOC)或BRCA突变；当前吸烟者、前吸烟者或暴露于高剂量二手烟；暴露于致癌物、过量日光、免疫抑制剂、感染剂例如乙型或丙型肝炎以及人乳头状病毒；或肥胖。
241.实施方案213-239中的任一个的方法，其中所述受试者具有癌症的至少一种症状，例如乳房X光检查或癌症筛查诊断测试的阳性信号、不成比例的血液细胞分布、体重减轻、肿胀的块或腺体、盗汗、血尿、血便、身体(包括乳头)意外出血或排出物、眩晕、视力模糊或丧失平衡、腹泻、剧痛、低级别发热、便秘、食欲不振、持久性咳嗽或嘶哑或黄疸。
242.实施方案214-241中的任一个的方法，其进一步包括(c)基于所述谱而检测所述疾病。
243.实施方案242的方法，其进一步包括利用分类器处理所述谱来检测所述疾病或其不存在，所述谱包括与所述多种疾病活化的启动子对应的所述条形码分子的表达水平，。
244.实施方案243的方法，其中检测所述疾病或其不存在进一步包括确定组织起源。
245.实施方案213的方法，其包括检测所述疾病或其不存在，AUC为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
246.实施方案213的方法，其包括检测所述疾病或其不存在，灵敏度为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
247.实施方案213的方法，其包括检测所述疾病或其不存在，特异性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
248.实施方案242的方法，在(c)之后，进一步包括(d)利用与在(c)中检测的疾病对应的一种或多种疾病活化的启动子重复(a)和(b)以确认在(c)中检测的所述疾病和/或检测在(c)中检测的所述疾病的亚型。
249.实施方案248的方法，其进一步包括重复(d)以确认在(c)中检测的所述疾病和/或检测在(c)中检测的所述疾病的亚型。250.实施方案213-249中的任一个的方法，其中条形码分子独特地鉴定所述基因构建体的疾病特异性启动子。
251.实施方案中213-249的任一个的方法，其中所述条形码分子包含核苷酸序列或肽序列。
252.实施方案251的方法，其中所述条形码分子包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含独特的DNA或RNA。
253.实施方案252的方法，其中所述条形码分子包含RNA，其中所述RNA是从miRNA支架加工的条形码。
254.实施方案253的方法，其中所述miRNA支架包含5′、3′和环区衍生的所述miRNA支架以及包含所述条形码的茎区。
255.实施方案251的方法，其中所述条形码分子包含肽序列，其中所述肽序列包含酶报告物。
256.实施方案251的方法，其中所述酶报告物是萤光素酶、EGFP、GFP、RFP、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(GO)或β半乳糖苷酶(BGAL)或其任何组合。
257.实施方案213-256中的任一个的方法，其中所述条形码分子是从所述细胞分泌的或脱离的。
258.实施方案257的方法，其包括量化在与所述细胞接触的细胞外流体中一种或多种所述条形码的表达水平。
259.实施方案258的方法，其中与所述细胞的所述接触是在体内，并且所述细胞外流体包括血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、房水、羊水或胸膜液。
260.实施方案257或258的方法，其包括在与所述细胞的所述接触之后至少8小时、至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时量化在细胞外流体中的一种或多种所述条形码的表达水平。
261.实施方案252-254中的任一个的方法，其中所述量化包括测序一种或多种所述条形码分子。
262.实施方案255-257中的任一个的方法，其中所述量化包括测量一种或多种所述酶报告物的活性。
263.实施方案262的方法，其中一种或多种所述酶报告物的所述活性通过免疫化学反应、侧向流动电泳或质谱仪来测量。
264.实施方案214-265中的任一个的方法，其进一步包括将所述谱传输在内联网或互联网上。
265.实施方案213-264中的任一个的方法，其进一步包括基于所述检测所述疾病或其不存在或所述谱而提供治疗性治疗。

Claims (44)

1.一种方法，其包括：
(a)向受试者施用组合物，其中所述组合物在所述受试者中诱导生物标志物在患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在非患病细胞中的表达，以至在所述患病细胞相比于所述非患病细胞中表达的所述生物标志物的相对比率大于1.0；
(b)检测所述生物标志物；以及
(c)利用(b)中检测到的所述生物标志物以至少70％的准确度确定所述受试者具有所述患病细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述相对比率是浓度比率。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物在来自所述受试者的生物样本中被检测。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述生物样本是来自所述受试者的体液。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述生物样本是来自所述受试者的血液或基于血液的样本。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述生物样本是来自所述受试者的气态样本。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述气态样本是来自所述受试者的呼气。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述受试者是人类。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述受试者是动物。
11.如权利要求3所述的方法，其中所述生物样本在人类或动物体内原位进行测量。
12.如权利要求1中的任一项所述的方法，其中所述组合物包含核酸载体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述载体选自纳米质粒、质粒、微环、重组病毒载体或CELiD。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物包含微环，其中所述微环是自我复制型微环。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述自我复制型微环包含S/MAR元件。
16.如权利要求12中的任一项所述的方法，其中所述组合物包含与编码所述生物标志物的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述启动子驱动在所述受试者中的多种不同类型的患病细胞中的表达。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述启动子在所述受试者中驱动所述生物标志物在所述患病的多种不同类型的患病细胞中的表达优先于所述生物标志物在所述非患病细胞中的表达。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述启动子选自存活蛋白启动子(BIRC5)、CXCR4启动子、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)启动子、前梯度蛋白2、蛋白质二硫键异构酶家族成员(AGR2)启动子、活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)启动子、UDP-GlcNAc:βGalβ-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(B3GNT3)启动子、钙粘着蛋白3(CDH3)启动子、CEA细胞粘附分子5(CEACAM5)启动子、着丝粒蛋白F(CENPF)启动子、中心体蛋白55(CEP55)启动子、密封蛋白3(CLDN3)启动子、密封蛋白4(CLDN4)启动子、胶原XI型α1链(COL11A1)启动子、胶原I型α1链(COL1A1)启动子、胱抑素SN(CST1)启动子、无齿E3泛素蛋白质连接酶同源物(DTL)启动子、具有序列相似性的家族111成员B(FAM111B)启动子、叉头框A1(FOXA1)启动子、驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)、层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)启动子、有丝分裂纺锤体定位(MISP)启动子、基质金属肽酶1(MMP1)启动子、基质金属肽酶12(MMP12)启动子、基质金属肽酶13(MMP13)启动子、间皮素(MSLN)启动子、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)启动子、磷脂酶A2组IID(PLA2G2D)启动子、G蛋白信号传导调节物13(RGS13)启动子、分泌性球蛋白家族2A成员1(SCGB2A1)启动子、拓扑异构酶IIα(TOP2A)启动子、泛素D(UBD)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)、USH1蛋白质网络组分harmonin(USH1C)、包含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)启动子、己糖激酶II型启动子、TRPM4启动子、溶基质素3启动子、表面活性蛋白质A启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂启动子、酪氨酸酶启动子、应激可诱导的grp78/BiP启动子、白介素-10启动子、α-B-晶体蛋白/热激蛋白27启动子、表皮生长因子受体启动子、粘蛋白样糖蛋白启动子、mts1启动子、NSE启动子、生长抑素受体启动子、c-erbB-3启动子、c-erbB-2启动子、c-erbB4启动子、甲状腺球蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、绒毛蛋白启动子、清蛋白启动子、糖蛋白A33启动子、B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1启动子、环氧合酶-2启动子、成纤维细胞生长因子启动子；人表皮生长因子受体2、人端粒酶反转录酶启动子；包含激酶结构域插入物的受体启动子；rad51重组酶启动子；TTF-1、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子、泛素缀合酶E2 T(UBE2T)启动子、检查点激酶1(CHEK1)启动子、上皮细胞转化2启动子(ECT2)、BCL2样12(BCL2L12)启动子、着丝粒蛋白I(CENPI)启动子、E2F转录因子1(E2F1)启动子、黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1(FLAD1)启动子、Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1G(PPM1G)启动子、泛素缀合酶E2 S(UBE2S)启动子、极光激酶A和ninein相互作用蛋白(AUNIP)启动子、细胞分裂周期6(CDC6)启动子、着丝粒蛋白L(CENPL)启动子、DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)启动子、DSN1同源物、MIS12动粒复合物组分(DSN1)启动子、脱氧胸苷酸激酶(DTYMK)启动子、神经突生长的G蛋白调节的诱导物1(GPRIN1)启动子、线粒体分裂调节物2(MTFR2)启动子、RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽A'(SNRPA1)启动子、ATP酶家族、包含AAA结构域的2(ATAD2)启动子、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶(BUB1)启动子、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)启动子、细胞分裂周期相关3(CDCA3)启动子、着丝粒蛋白O(CENPO)启动子、瓣状结构特异性核酸内切酶1(FEN1)启动子、叉头框M1(FOXM1)启动子、蛋白磷酸酶2A的细胞增殖调节抑制剂(KIAA1524)启动子、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)启动子、核转运蛋白亚基α2(KPNA2)启动子、MYB原癌基因样2(MYBL2)启动子、NIMA相关激酶2(NEK2)启动子、RAN结合蛋白1(RANBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽B和B1(SNRPB)启动子、SPC24/NDC80动粒复合物组分(SPC24)启动子、转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(TACC3)启动子、TBC1结构域家族成员31(TBC1D31)启动子、胸苷激酶1(TK1)启动子、锌指蛋白695(ZNF695)启动子、极光激酶A(AURKA)启动子、BLM RecQ样解旋酶(BLM)启动子、染色体17可读框53(C17orf53)启动子、色素框3(CBX30)启动子、周期蛋白B1(CCNB1)启动子、周期蛋白E1(CCNE1)启动子、周期蛋白F(CCNF)、细胞分裂周期20(CDC20)启动子、细胞分裂周期45(CDC45)启动子、细胞分裂周期相关5(CDCA5)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)启动子、钙粘着蛋白EGF LAG七重跨膜G型受体3(CELSR3)启动子、着丝粒蛋白A(CENPA)启动子、中心体蛋白72(CEP72)启动子、CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)启动子、胶原X型α1链(COL10A1)启动子、染色体分离1样(CSE1L)启动子、DBF4锌指启动子、GINS复合物亚基1(GINS1)启动子、G蛋白偶联受体19(GPR19)启动子、驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)启动子、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)启动子、驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)启动子、微型染色体维持10复制起始因子(MCM10)启动子、微型染色体维持复合物组分2(MCM2)启动子、微型染色体维持复合物组分7(MCM7)启动子、MRG结构域结合蛋白(MRGBP)启动子、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2、亚甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)启动子、非SMC凝缩蛋白I复合物亚基H(NCAPH)启动子、NDC80、动粒复合物组分(NDC80)启动子、nudix水解酶1(NUDT1)启动子、核糖核酸酶H2亚基A(RNASEH2A)启动子、RuvB样AAA ATP酶1(RUVBL1)启动子、血清学限定的乳癌抗原NY-BR-85(SGOL1)启动子、SHC结合和纺锤体相关1(SHCBP1)启动子、核小核糖核蛋白多肽G(SNRPG)启动子、永久性昼夜节律调节物启动子、甲状腺激素受体相互作用物13(TRIP13)启动子、营养蛋白相关蛋白(TROAP)启动子、泛素缀合酶E2 C(UBE2C)启动子、WD重复和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)启动子、α胎蛋白(AFP)启动子、其片段或其任何组合。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述生物标志物选自MRI报告物、PET报告物、SPECT报告物、光声报告物、生物发光报告物、荧光报告物、化学发光报告物、发光报告物、比色报告物、可量化的核酸生物标志物和其任何组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述可量化的核酸生物标志物是工程化的miRNA。
22.如权利要求20所述的方法，其中对所述生物标志物的检测确定所述患病细胞的位置。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物是通过非侵入性成像或其组合在所述受试者的身体样本中可检测的。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述生物标志物是利用基于血液的测定来检测。
25.如权利要求1中的任一项所述的方法，其中所述组合物还包含转染剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述转染剂是线型或支化的聚乙烯亚胺、纳米颗粒、亲脂性颗粒、固体纳米颗粒、肽、胶束、树枝状分子、聚合物组合物、水凝胶、合成的或天然衍生的外泌体、病毒样颗粒或其任何组合。
27.如权利要求1中的任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述药学上可接受的载剂选自水、花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素、含水的右旋糖、甘油溶液、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油单硬脂酸酯、氯化钠溶液、丙二醇、可可油或乙醇。
29.一种治疗患有或疑似患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物在所述受试者中诱导与所述疾病相关的患病细胞对治疗有效剂的表达优先于非患病细胞对所述治疗有效剂的表达，以至由所述患病细胞相比于所述非患病细胞表达的所述治疗有效剂的相对浓度大于1.0，所述治疗有效剂以至少10％的治疗功效治疗所述受试者，如通过所述患病细胞的细胞群的减少来确定。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述组合物包含载体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述组合物包含与编码治疗有效剂的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述治疗有效剂选自治疗有效的多肽、小活化RNA(saRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)或多肽和所述核酸的组合。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述治疗有效剂选自HSVtk、胞嘧啶脱氨酶、DT黄递酶、硝基还原酶、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷磷酸化酶、羧酸酯酶、叶酰基聚谷氨酰合成酶、羧肽酶A1、羧肽酶G2、细胞色素P-450。
34.一种组合物，其包含编码第一多肽或核酸生物标志物的第一核酸序列，以及编码第二多肽或第二核酸生物标志物的第二核酸序列，其中所述组合物被配置为当所述组合物在细胞中时：所述第二多肽或核酸生物标志物被表达的量反映所述第一核酸和所述第二核酸递送至所述细胞，并且所述第一多肽或核酸生物标志物在患病细胞相对于非患病细胞中被差异表达。
35.如权利要求34所述的组合物，其中：
(i)所述细胞诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达，其中所述表达的第一多肽或核酸是可检测的生物标志物或治疗剂；并且
(ii)所述细胞诱导所述第二核酸序列同等地在患病细胞和非患病细胞中表达并且所述第二核酸序列产生所述第二多肽或核酸生物标志物，所述第二多肽或核酸生物标志物不是所述可检测的生物标志物或所述治疗剂，以至所述第二多肽或核酸生物标志物的表达水平提供用于评估在所述细胞中所述核酸序列的相对水平的对照。
36.如权利要求35所述的组合物，其中在所述组合物中，包含编码所述第一多肽的所述第一核酸序列和编码所述第二多肽的所述第二核酸序列的所述序列在独立的基因构建体上。
37.如权利要求35所述的组合物，其中所述第一多肽是所述可检测的生物标志物和所述治疗剂。
38.如权利要求35中的任一项所述的组合物，其中所述细胞是患病细胞。
39.如权利要求35中的任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含载体，所述载体包含所述第一核酸和所述第二核酸。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述载体包含：
(a)与所述第一核酸序列可操作地连接的第一启动子，
其中所述启动子诱导所述第一核酸序列在患病细胞中的表达优先于所述第一核酸序列在非患病细胞中的表达；以及
(b)第二启动子序列，所述第二启动子序列诱导在患病细胞和非患病细胞中同等地表达并且与所述第二核酸可操作地连接。
41.如权利要求39所述的组合物，其中所述载体是非病毒载体。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述非病毒载体是微环载体。
43.如权利要求39所述的组合物，其中所述载体是纳米质粒载体。
44.如权利要求40所述的组合物，其中所述第一和第二多肽或核酸生物标志物是通过非侵入性成像或其组合在所述受试者的身体样本中可检测的。
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