KR20150087321A - 보툴리눔 신경독소 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법 - Google Patents

보툴리눔 신경독소 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경독소 활성을 결정하기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커로 분리된, (ⅰ) 전사인자 도메인 및 (ⅱ) 세포질 유지 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 융합 폴리펩티드 또는 숙주세포를 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하는 데 사용하기 위한 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 신경독소 활성을 결정하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 융합 폴리펩티드 또는 숙주세포를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

보툴리눔 신경독소 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법 {Means and methods for determination of Botulinum neurotoxin biological activity}
본 발명은 보툴리눔 신경독소 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.
클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 및 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani)는 매우 강한 독소 즉, 각각 보툴리눔 독소 (BoNTs) 및 파상풍 독소 (TeNT)를 생산한다. 이들 클로스트리듐 신경독소는 신경세포에 특이적으로 결합하며 신경전달물질 방출을 저해한다. 각각의 독소는 불활성의 미가공된 대략 150kDa 단쇄 단백질로 합성된다. 번역 후 가공 (posttranslational processing)은 이황화 결합의 형성, 및 세균성 단백질분해효소(들)에 의한 제한된 단백질분해 (손상)을 수반한다. 활성을 갖는 이중쇄 (dichain) 신경독소는 대략 50 kDa의 N-말단 경쇄 (N-terminal light chain) 및 이황화 결합에 의해 연결된 대략 100 kDa의 중쇄 (heavy chain)인 두 개의 사슬로 이루어진다. 신경독소는 구조적으로 세 개의 도메인 즉, 촉매활성을 갖는 (catalytic) 경쇄, 전좌 (translocation) 도메인 (N-말단 절반)을 포함하는 중쇄 및 수용체 결합 도메인 (C-말단 절반)으로 이루어진다. Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49를 참고할 것.
클로스트리듐 보툴리눔은 A부터 G로 지정되는 일곱 개의 항원학적으로 (antigenically) 구분되는 혈청형의 상기 BoNT를 분비한다. 클로스트리듐 테타니에 의해 분비된 관련된 TeNT와 함께 모든 혈청형은 SNARE 단백질 및 특히, SNAP-25를 절단함으로써 시냅스 엑소시토시스 (synaptic exocytosis)를 차단하는 Zn2 +-의존성 엔도프로테아제 (Zn2 +-dependent endoproteases)이다. 그 중에서도 BoNTs는 보툴리즘 (botulism) 및 파상풍 (tetanus)에서 나타나는 연약 근육 마비 (flaccid muscle paralysis)를 유발한다. Fischer 2007, PNAS 104, 10447를 참고할 것.
그 독성 효과에도 불구하고, BoNTs는 수많은 질병의 치료제로 사용되어 왔다. BoNT 혈청형 A (BoNT/A)는 1989년에 미국에서 사시 (strabism), 안검경련 (blepharospasm), 및 기타 장애의 치료를 위하여 인간에게 사용하는 것이 허용되었다. 이는 예를 들어, 상표명 BOTOX (Allergan Inc)와 상표명 DYSPORT (Ipsen Ltd)하에 단백질 제제로 상업적으로 구입가능하다. 치료적 응용을 위하여, 상기 복합체는 치료될 근육으로 직접적으로 주입된다. 생리학적 pH에서, 상기 독소는 상기 단백질 복합체로부터 분비되며 원하는 약리학적 효과가 나타난다. 복합화된 단백질이 없는 개선된 BoNT/A 제제는 상표명 XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH) 하에 구입가능하다.
이론적으로, BoNTs는 수의근력을 약화시키며, 따라서, 사시, 국소성 근긴장이상증 (focal dystonia), 및 경부 근긴장이상증 (cervical dystonia), 및 양성 본태성 안검경련 (benign essential blepharospasm)과 같은 질병의 치료를 위한 효과적인 치료제이다. 이들은 또한, 반축안면경련 (hemifacial spasm), 및 국소성 경직 (focal spasticity)을 완화시키며, 위장장애 (gastrointestinal disorders), 다한증 (hyperhidrosis), 및 미용주름 교정과 같은 광범위한 기타 징후 (indications)에 효과적인 것으로 나타났다. Jost 2007, Drugs 67, 669를 참고할 것.
생물학적 활성의 결정은 품질 관리 및 양적 목적을 위하여 안전 대책만큼이나 중요하다. WO 95/33850는 비-경쟁적 분석에 기반한 신경독소의 생물학적 활성을 정량하기 위한 방법을 개시한다. 이들 방법에 있어서, 상기 신경독소에 대한 절단 부위를 포함하는 기질이 고상 (solid phase)에 결합된다. 상기 신경독소의 첨가는 기질의 절단을 야기한다. 상기 절단 산물은 그 후 예를 들어, 효소와 짝을 이루는 특이적인 항체에 의하여 검출된다. 이러한 비-경쟁적 분석의 단점은 얻어진 테스트 결과가 불균일 (inhomogeneous)하며 따라서 신뢰할 수 없다는 점이다.
보툴리눔 신경독소의 생물학적 활성의 결정을 위하여 개발된 또 다른 분석은 예를 들어, "치사 시간 (time to death)"과 같은 중독 (intoxication) 후 동물의 생존 시간의 결정 (Lamanna C, Spero L, Schantz EJ: Dependence of time to death on molecular size of botulinum toxin. Infect. Immun. 1970, 1:423-4; Kondo H, Shimizu T, Kubonoya M, Izumi N, Takahashi M, Sakaguchi G: Titration of botulinum toxins for lethal toxicity by intravenous injection into mice. Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1984, 37:131-5; Boroff DA, Fleck U: Statistical analysis of a rapid in vivo method for the titration of the toxin of Clostridium botulinum. J. Bacteriol. 1966, 92:1580-1), 땀샘 (perspiratory glands)의 마비와 같은 살아있는 유기체의 기관 기능의 억제 (Ellies M: Experimental and clinical investigations on the inhibition of secretion of the major salivary glands with botulinum toxin A. Laryngorhinootologie 2003, 82:713-4; Monnier G, Tatu L, Parratte B, Cosson A, Michel F, Metton G: Sialorrhea, hyperhidrosis and botulinum toxin. Ann. Readapt. Med. Phys. 2003, 46:338-45), HDA와 같은 분리된 기관의 마비의 결정 (Gochel H, Wohlfarth K, Frevert J, Dengler R, Bigalke H: Botulinum A toxin therapy: neutralizing and nonneutralizing antibodies-therapeutic consequences. Exp. Neurol. 1997, 147:96-102; HUGHES R, WHALER BC. Influence of nerve-ending activity and of drugs on the rate of paralysis of rat diaphragm preparations by Cl. botulinum type A toxin. J. Physiol. 1962, 160:221-33), 일차 신경을 이용한 SNAP-25 절단 웨스턴 블롯 분석과 같은 세포 기반의 분석 (Pellett S, Tepp WH, Toth SI, Johnson EA: Comparison of the primary rat spinal cord cell (RSC) assay and the mouse bioassay for botulinum neurotoxin type A potency determination. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2010, 61:304-10) 및 신경독소의 생물학적 활성의 한 가지 면만을 결정하는 결합 분석 또는 SNAP-25 절단 분석과 같은 시험관 내 테스트 (Evans ER, Skipper PJ, Shone CC: An assay for botulinum toxin types A, B and F that requires both functional binding and catalytic activities within the neurotoxin. J. Appl. Microbiol. 2009, 107:1384-91; Habermann E: 125I-labeled neurotoxin from Clostridium botulinum A: preparation, binding to synaptosomes and ascent to the spinal cord. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1974, 281:47-56; Ekong TA, Feavers IM, Sesardic D: Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology 1997, 143:3337-47)를 포함한다.
따라서 현재까지 생쥐 LD50 분석은 신경독소의 생물학적 활성을 정량하고 이들의 치료적 잠재능 및/또는 독성을 평가하기 위한 유일하게 신뢰할만한 분석이다. 상기 분석은 또한 신경독소의 제조과정에서 품질관리를 위하여 채택된다. 생쥐 LD50 생물검정에 있어서, 신경독소 폴리펩티드를 함유하는 샘플의 치사 (lethal) 또는 아치사 (sub-lethal) 농도가 적어도 120 마리의 동물 내로 주입되어야만 한다. 72시간의 관찰기에 걸쳐 사망한 동물의 숫자로 상기 샘플 내의 신경독소 폴리펩티드 농도를 결정하는 것이 가능하다. 이러한 분석의 명백한 단점은 희생될 수많은 동물의 개체수 및 상기 테스트 과정의 상기 동물들에 대한 높은 수준의 스트레스 및 고통이다.
현재까지 제안된 시험관 내 분석은 무 세포 (cell free) 시스템 내에서 SNAP-25 절단을 결정하는 것 또는 일차 신경에 대한 신경독소 노출에 기초한다. 그러나, 이들 분석은 덜 신뢰할만하며 또는, 바람직한 신경독소의 모든 기능을 고려하지는 않는다. 따라서, 현재로서는 전술된 LD50 생물검정이 유일하게 신뢰할만한 분석이고, 이는 유럽 약전에서 BoNT/A에 대한 논문에 기술되어 있다. 그러나, 공지기술로 기술된 분석방법의 단점들을 회피하는 신경독소 활성 측정을 위한 신뢰할만한 분석의 개발에 대한 필요성이 대두 된다.
본 발명은 신경독소 활성을 결정하기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다. 특히, 이는 신경독소 절단 부위 (neurotoxin cleavage site)를 포함하는 링커로 분리된, (ⅰ) 전사인자 도메인 (transcription factor domain) 및 (ⅱ) 세포질 유지 도메인 (cytoplasmic retention domain)을 포함하는 융합 폴리펩티드 (fusion polypeptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (vector) 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 숙주세포가 본 발명으로 고려된다. 또한, 샘플 내 신경독소 활성을 결정하는 방법이 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 융합 폴리펩티드 또는 숙주 세포의 샘플 내 신경독소 활성을 결정하기 위한 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 융합 폴리펩티드 또는 숙주 세포를 포함하는 신경독소 활성 결정용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드는 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커로 분리된, (ⅰ) 전사인자 도메인 및 (ⅱ) 세포질 유지 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 세포질 유지 도메인은 막관통 단백질 또는 막관통 단백질의 막관통 스패닝 도메인일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 막관통 단백질은 혈장막 신경전달물질 트랜스포터, 이온 채널, G-단백질 결합 수용체 및 막 수용체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 세포질 유지 도메인은 막고정 단백질 또는 막고정 단백질의 막고정 도메인일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 막고정 단백질은 SNAP-25, 신탁신, 시냅토브레빈, 시냅토타그민, 소포 연관 막 단백질 (VAMPs), 시냅스 소포 당단백질 (SV2), 고 친화성 콜린 트랜스포터, 뉴렉신, 전압 개폐 칼슘 채널, 아세틸콜린에스테라아제 및 NOTCH로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 세포질 유지 도메인은 구상 단백질 및 세포골격 고정 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 전사인자 도메인은 DNA 결합 도메인을 포함하는 전사인자 및 트랜스활성인자 또는 사일렌서 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 전사인자는 테트라사이클린 의존성 트랜스활성인자 (tet-억제인자-VP 16), 스테로이드 호르몬 수용체, NOTCH, NFkB, p53, NFAT, MLL, E2A, HSF1, NF-IL6, STAT, R-SMAD, GAL4, 및 SP1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 벡터는 상기 다양한 구현 예에 따른 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 융합 폴리펩티드는 상기 다양한 구현 예에 따른 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 숙주세포는 상기 다양한 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터 또는 상기 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 숙주 세포는 일차 신경 세포, 신경아세포종 세포주, N1E-115 세포주, Neuro2a 세포주, SH-SY5Y 세포주, PC12 세포주, SiMa 세포주, MHH-NB-11 세포주, SK-N-BE(2) 세포주 및 유도 만능줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 융합 폴리펩티드의 절단에 따라 그 발현이 전사인자 도메인에 의하여 조절되는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위한 방법은 하기 단계: (a) 청구항 10의 융합 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포 및 상기 융합 폴리펩티드의 절단에 따라 그 발현이 상기 전사인자 도메인에 의하여 조절되는 리포터 유전자를 신경독소 활성을 포함하는 것으로 예상되는 샘플에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계;를 포함할 수 있으며, 상기 측정에 의하여 상기 샘플 내의 신경독소 활성이 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따른 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위한 방법에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 다양한 구현 예에 따른 숙주 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 용도는 상기 다양한 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터, 상기 융합 폴리펩티드 또는 상기 다양한 구현 예에 따른 숙주 세포를 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위하여 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 키트는 상기 다양한 구현 예에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터, 상기 융합 폴리펩티드 또는 상기 다양한 구현 예에 따른 숙주 세포 및 바람직하게는, 리포터 유전자 활성을 검출하기 위한 검출 제제를 포함할 수 있다.
도 1은 활성인자-구축체를 구축하기 위한 기본으로 사용된 Clontech사에 의해 제공된 본래의 조절 플라스미드 (a); 루시페라아제-코딩 리포터 구축체 (b); 루시페라아제-리포터 구축체를 위한 시스템 조절 플라스미드 (c)를 나타낸다 (모두 Clontech사).
도 2는 pCMV-Tet3G-벡터 (도 1a)를 골격으로 갖는 활성인자-플라스미드 mST01 (서열번호: 9) 구축의 일례를 나타낸다. 시냅토타그민 (87개의 아미노산)의 N-말단 막고정 도메인 및 SNAP25의 112개의 C-말단 아미노산을 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 계획된 EcoRⅠ 및 XbaⅠ절단 부위를 통하여 클로닝된다. 상기 벡터의 주요 특징이 화살표로 강조표시되어 있고 또한 그 위치를 (염기쌍 (bp)으로) 나타내는 우측 표에 나타나 있다.
도 3은 활성인자 및 리포터 구축체의 안정적인 도입에 관한 대조구로서 게놈 PCR의 결과를 나타낸다. 루시페라아제에 관해 설계된 프라이머는 ~1kb의 산물을 생산하며, Tet-인자에 관한 프라이머는 ~0.5kb의 산물을 생산한다. 강조 표시된 레인은 안정적으로 도입된 두 플라스미드 클론을 나타낸다. 전체적으로, 상기 게놈 PCR의 결과에 기초하여 24개의 생성된 클론 중 10개가 루시페라아제 및 Tet-인자에 대하여 양성이었다.
도 4는 시냅토타그민-SNAP25 융합 단백질의 막고정 구축체를 보여주는 묘사된 예시의 작용 방법의 모식도를 나타낸다.
따라서, 본 발명이 기초하는 기술적 과제는 전술한 요구들을 충족시키는 수단 및 방법을 제공하는 것일 수 있다. 상기 기술적 과제는 특허청구범위에서 특성화되고 이하 여기서 기술된 구현 예들에 의하여 해결된다.
본 발명은 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커로 분리된, (ⅰ) 전사인자 도메인 및 (ⅱ) 세포질 유지 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
여기서 사용된 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 또는 이중쇄 DNA 분자뿐만 아니라, RNA분자를 의미한다. 상기 용어는 DNA, cDNA, hnRNA, mRNA뿐만 아니라, 모든 자연적으로 발생하거나 인공적으로 변형된 이러한 분자 종의 유도체를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 원형 분자의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 부가하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 5' 또는 3' UTR 서열과 같은 적절한 전사 및/또는 번역을 위하여 요구되는 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 유전자 코드의 퇴화 (degeneracy)의 관점에서, 최적화된 코돈이 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 사용될 수 있다. 이에 의해, 예를 들어 본 발명의 숙주세포 내에서 최적의 발현이 이루어질 수 있다. 다른 관점에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 또는 29에 나타난 핵산 서열을 포함한다. 또한, 하나의 관점에 있어서 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 31에 나타난 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
다른 관점에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하며, 이에 따라 여전히 다른 관점에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 갖는 융합 폴리펩티드를 야기할 수 있는 전술한 폴리뉴클레오티드의 변이체이다. 또한, 다른 구현 예에 있어서 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 또는 29 중 어느 하나에 나타난 바와 같은 핵산 서열과 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열 변이체, 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 31 중 어느 하나에 나타난 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 변이체를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이 상기 용어 "동일한"은 서열을 최고차 정합이 얻어지도록 상기 서열이 정렬되는 두 개의 핵산 서열 또는 아미노산 서열 간의 동일한 아미노산의 숫자를 결정함으로써 특징지을 수 있는 서열 상동성을 의미한다. 이는 예를 들어, BLASTP, BLASTN 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램으로 암호화된 공지된 기법 또는 방법을 이용하여 계산될 수 있다 (Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215, 403). 상기 퍼센트 서열 상동성 값은 일 구현 예에 있어서, 전체 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 걸쳐 계산된다. 다양한 알고리즘에 기초한 일련의 프로그램이 상이한 서열을 비교하기 위하여 통상의 기술자에게 이용가능하다. 이러한 의미에서, Needleman 및 Wunsch 또는 Smith 및 Waterman의 알고리즘이 특히 신뢰할 만한 결과를 산출한다. 서열 정렬을 수행하기 위하여, 프로그램 PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) 또는 GCG 소프트웨어 패킷 (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)의 일부인 프로그램 Gap 및 BestFit (Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48; 443; Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2, 482)를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 퍼센트 (%)로 전술된 서열 상동성 값이 달리 구체화되지 않는 한, 서열 정렬을 위한 표준 세팅으로 항상 사용될 하기 세팅: 갭 가중치 (Gap Weight): 50, 길이 가중치 (Length Weight): 3, 평균 일치 (Average Match): 10.000 및 평균 불일치 (Average Mismatch): 0.000으로 전체 서열 영역에 걸쳐 프로그램 GAP을 이용하여 결정된다. 일 구현 예에 있어서, 전술된 다양한 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의, 다른 구현 예에 있어서는 모든 본 발명의 각각의 융합 폴리펩티드의 생물학적 특질을 보유하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 상기 다양한 폴리펩티드는 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커로 분리된, (ⅰ) 전사인자 도메인 및 (ⅱ) 세포질 유지 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "전사 인자"는 진핵세포에서 전사를 개시하거나 조절하기 위하여 요구되는 단백질을 의미한다. 전사 인자는 특이적인 DNA서열에 결합하여, DNA로부터 mRNA로의 유전 정보의 흐름 즉, 전사를 조절하는 단백질이다. 전사 인자가 결합하는 DNA 서열은 전사인자-결합 위치 또는 반응 요소 (response element)라고 불린다. 여기서 사용된 바와 같이, "인헨서 (enhancer)"는 유전자의 전사를 증가시킬 수 있는 DNA의 짧은 영역인 반면, "사일렌서 (silencer)"는 억제인자 (repressors)로 명명된 전자 조절 인자에 결합할 수 있는 DNA서열이다. 전사인자는 특이적인 유전자에 RNA 중합효소의 도입을 활성인자 (activator)로서 촉진시키거나 억제인자로서 차단함으로써 단독으로 또는 다른 단백질과 함께 복합체의 형태로 이러한 기능을 수행한다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "도메인"은 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 진화하고, 기능하며 존재하는 단백질 서열 및 구조의 일부인 단백질 도메인을 나타낸다. 각각의 도메인은 밀집된 삼차원 구조를 형성하고, 종종 독립적으로 안정적이며 또한 폴딩된다. 전사인자를 포함하는 많은 단백질은 몇몇의 구조적 도메인으로 구성된다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "전사 인자 도메인"은 전사인자의 단백질 도메인의 전자인자를 포함한다. 전사인자는 구조적으로 모듈식이며 이에 한정되는 것은 아니나, DNA 결합 도메인, 트랜스활성인자 (transactivator) 도메인 또는 사일렌서 도메인 및 예를 들어, 리간드 결합 도메인과 같은 선택적인 신호 감지 도메인을 포함하는 몇몇의 도메인을 함유한다. DNA에 결합하는 전사인자의 부분이 DNA결합 도메인으로 불린다. DNA결합 도메인은 인헨서 또는 프로모터와 같은 특이적인 DNA서열에 부착한다. 전사인자는 정전기적 및 반데르발스힘의 조합을 이용하여 이들의 결합 위치와 상호작용한다. 이들 화학적 상호작용의 성질 때문에, 대부분의 전사인자는 서열 특이적인 방법으로 DNA에 결합한다. 그러나, 전사 인자 결합 위치의 모든 염기가 실제로 전사인자와 상호작용하는 것은 아닐 것이다. 또한, 이들 상호작용 중 일부는 다른 것들보다 더 약할 것이다. 따라서, 전사인자는 단지 하나의 서열에만 결합하는 것은 아니며, 각각 상이한 상호작용력을 갖는 밀접하게 연관된 서열의 서브세트에 결합할 수 있다. 상기 트랜스활성 도메인 즉, 트랜스활성인자 또는 사일렌서 도메인은 전사 공-제어인자 (co-regulators)와 같은 기타 단백질에 대한 결합위치를 함유한다. 트랜스활성인자 또는 사일렌서 도메인은 그들의 아미노산 조성을 따라 명명된다. 이들 아미노산은 그 활성을 위하여 필수적일 수도 있고 단지 상기 트랜스활성인자 또는 사일렌서 도메인 내에 가장 풍부한 것일 수도 있다. 전사인자는 예를 들어, DNA에 결합하여 RNA중합효소를 활성화시키거나 또는 억제시킴으로써 유전자 전사율을 조절하여 전사를 제어한다. 상기 트랜스활성 도메인은 유전자 전사율을 증가시키거나 유전자 전사율을 감소시킬 수 있다. 전자의 경우, 상기 트랜스활성 도메인은 트랜스활성인자 도메인으로 불리며, 후자의 경우, 상기 트랜스활성 도메인은 사일렌서 도메인으로 불린다. 상기 신호감지 도메인은 외부신호를 감지하고, 반응에 있어서, 이들 신호를 나머지 전사 복합체에 전달함으로써 유전자 발현을 증가 또는 감소제어하게 된다. 여기서 사용된 바와 같이, 전사인자는 예를 들어, 테트라사이클린 의존적 트랜스활성인자 (tet-repressor??P 16), 스테로이드 호르몬 수용체, NOTCH, NFκB, p53, NFAT, MLL, E2A, HSF1, NF-IL6, STAT, R-SMAD, GAL4, 또는 SP1일 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 몇몇 구현 예에 있어서 상기 전사인자는 핵 위치화 서열 (nuclear localization sequence)을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 핵 위치화 서열 또는 신호는 신호 서열 또는 신호 패치 (signal patches)일 수 있다. 핵 위치화 신호는 단백질을 세포의 핵으로 안내한다.
여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "세포질 유지 도메인"은 상기 신경독소에 의하여 상기 융합 단백질을 절단하기 전에 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 융합 폴리펩티드의 세포질 위치화를 중재하는 단백질 도메인을 나타낸다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 세포질 유지 도메인은 예를 들어, 막관통 단백질 (transmembrane protein) 또는 상기 막관통 단백질의 막관통 스패닝 도메인 (transmembrane spanning domain)일 수 있다. 예를 들어, 상기 막관통 단백질은 혈장막 신경전달물질 트랜스포터 (plasmalemmal neurotransmitter transporters), 이온 채널, G-단백질 결합 수용체 (G-protein coupled receptors), 또는 막 수용체 (membrane receptors)일 수 있다. 상기 세포질 유지 도메인은 또한 막고정 (membrane-anchored) 단백질 또는 막고정 단백질의 막고정 도메인 (membrane anchor domain)일 수 있다. 이러한 막고정 단백질은 예를 들어, SNAP-25, 신탁신 (Syntaxin), 시냅토브레빈 (synaptobrevin), 시냅토타그민 (synaptotagmin), 소포 연관 막 단백질 (vesicle associated membrane proteins, VAMPs), 시냅스 소포 당단백질 (synaptic vesicle glycoproteins, SV2), 고 친화성 콜린 (choline) 트랜스포터, 뉴렉신 (Neurexins), 전압 개폐 칼슘 채널, 아세틸콜린에스테라아제 또는 NOTCH일 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 세포질 유지 도메인은 너무 커서 핵공을 관통할 수 없는 구상 (globular) 단백질 또는 세포골격 고정 단백질 (cytoskeleton anchor protein)일 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드의 발현 후, 상기 전자 인자 도메인은 상기 세포질 유지 도메인을 통해 예를 들어, 혈장 (plasma) 또는 소포막 (vesicle membrane)에 고정되며, 따라서 상기 핵으로 이동할 수 없다. 이와 같은 방법으로, 상기 전사인자에 의한 핵 내 리포터의 발현이 회피된다. 보툴리눔 신경독소의 신경독소 경쇄에 의한 본 발명의 융합 단백질의 링커 내의 절단만이 상기 전사인자를 방출시키며 이에 의해 상기 리포터 유전자의 발현이 개시된다.
여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "링커"는 신경독소 절단 부위를 포함하는 아미노산 서열의 짧은 분절인 폴리링커 (polylinker)를 나타낸다. 상응하는 DNA 서열에 의하여 코딩되는 적절한 링커 서열이 예를 들어, Schiavo G, Matteoli M, Montecucco C: Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol. Rev. 2000, 80:717-66에 기술되어 있다.
여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "신경독소 절단 부위"는 신경독소 폴리펩티드의 내재성 단백질분해효소에 의하여 인지 및 절단되는 절단 부위를 의미한다. 상기 신경독소 단백질분해효소에 의하여 인지되는 절단 부위는 공지기술로 잘 알려져 있다. 예를 들어, EP 1 926 744 B1를 참고할 것. 이론적으로, 신경독소 절단 부위는 상기 신경독소 폴리펩티드 단백질분해효소에 의하여 인지 및 절단되는, 기질에서 자연적으로 발생하는 절단 부위 또는 인공적으로 설계된 절단 부위일 수 있다. 상기 신경독소 절단 부위의 특성이 본 발명의 융합 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있는 신경독소의 종류를 좌우하는 것으로 이해될 것이다. 일 구현 예에 있어서, 여기서 언급된 신경독소 폴리펩티드는 모두 공지기술로 주지된 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/G, BoNT/F 또는 TeNT를 포함한다. 예를 들어, BoNT/A에 의하여 특이적으로 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위가 사용되는 경우, 단지 BoNT/A 단백질분해효소만이 본 발명의 융합 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있는 반면, BoNT/E에 의하여 특이적으로 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위가 사용되는 경우는 단지 BoNT/E 단백질분해효소만이 본 발명의 융합 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 융합 폴리펩티드의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경독소 절단 부위는 성숙된 BoNTs에 의하여 절단된다. 이는 또 다른 구현 예에 있어서, BoNTs의 돌연변이 단백질 (muteins)에 의하여, 다른 구현 예에 있어서, 상기 BoNT 단백질분해효소 활성을 나타내는 BoNT 경쇄를 포함하거나 이로 이루어지는 돌연변이 단백질에 의하여 절단된다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, BoNT/A 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/A에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 이러한 단백질은 인간 SNAP25A 또는 SNAP25B 또는 래트, 생쥐, 소, 다니오 (Danio), 붕어 (Carassius), 개구리 (Xenopus), 토르페도 (Torpedo), 성게 (Strongylocentrotus), 꼴뚜기 (Loligo), 우렁 (Lymnaea), 또는 군소 (Aplysia)로부터 유래된 이의 상동체 (homolog), 파라로그 (paralog) 또는 오소로그 (ortholog)이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, BoNT/B 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/B에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 이러한 단백질은 인간 또는 생쥐 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루-브레빈 (VAMP-3/cellu-brevin), 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 초파리 (Drosophila) sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 거머리 (Hirudo) VAMP, 개구리 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 (Danio) VAMP-1 또는 VAMP-2, 꼴뚜기 VAMP, 우렁 VAMP, 군소 VAMP 또는 선충 (Caenorhabditis) SNB1-유사체 또는 이들의 모든 오소로그, 파라로그 또는 상동체이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, BoNT/C1 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/C1에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 이러한 단백질은 인간 및 생쥐 신탁신 1A, 신탁신 1B1, 신탁신 2-1, 신탁신 2-2, 신탁신 2-3, 신탁신 3A 또는 신탁신 1B2, 소 또는 래트 신탁신 1A, 신탁신 1B1 또는 신탁신 1B2, 래트 신탁신 2 또는 래트 신탁신 3, 생쥐 신탁신 1A, 신탁신 1B1, 신탁신 1B2, 신탁신 2, 신탁신 3A, 신탁신 3B 또는 신탁신 3C, 닭 신탁신 1A 또는 신탁신 2; 개구리 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 다니오 신탁신 1A, 신탁신 1B 또는 신탁신 3, 토르페도 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 성게 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 초파리 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 거머리 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 꼴뚜기 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 우렁 신탁신 1A 또는 신탁신 1B 또는 이의 오소로그, 파라로그 또는 상동체이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, BoNT/D 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/D에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 이러한 단백질은 인간 또는 생쥐 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루-브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 거머리 VAMP, 개구리 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 꼴뚜기 VAMP, 우렁 VAMP, 군소 VAMP 또는 선충 SNB1-유사체 또는 이의 오소로그, 파라로그 또는 상동체이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, BoNT/E 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/E에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 이러한 단백질은 인간 SNAP-25A 또는 B 또는 이의 래트, 생쥐, 소, 다니오, 붕어, 개구리, 토르페도, 성게, 꼴뚜기, 우렁, 또는 군소의 상동체, 파라로그 또는 오소로그이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, BoNT/F 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 잘단 부위는 BoNT/F에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 인간 또는 생쥐 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루-브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 거머리 VAMP, 개구리 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 꼴뚜기 VAMP, 우렁 VAMP, 군소 VAMP 또는 선충 SNB1-유사체 또는 이의 오소로그, 파라로그 또는 상동체이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, BoNT/G 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 잘단 부위는 BoNT/G에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 인간 또는 생쥐 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루-브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 거머리 VAMP, 개구리 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 꼴뚜기 VAMP, 우렁 VAMP, 군소 VAMP 또는 선충 SNB1-유사체 또는 이의 오소로그, 파라로그 또는 상동체이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, TeNT 단백질분해효소에 의하여 인식되고 절단되는 신경독소 잘단 부위는 TeNT에 의한 절단에 민감한 단백질로부터 유래된다. 일 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 인간 또는 생쥐 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루-브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 거머리 VAMP, 개구리 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 꼴뚜기 VAMP, 우렁 VAMP, 군소 VAMP 또는 선충 SNB1-유사체 또는 이의 오소로그, 파라로그 또는 상동체이다. 상기 단백질로부터 유래된 적절한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 융합 폴리펩티드의 관점에서 상기 용어 "링커로 분리된"은 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커가 이하 더욱 자세히 기술된 바와 같이, 전사인자 도메인과 세포질 유지 도메인 사이에 위치함을 의미한다.
신경독소와 관련하여 여기에 사용된 용어 "생물학적으로 활성인"은 여기서 특정된 생물학적 활성을 본질적으로 나타내는 즉, (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도좀 막을 가로지른 시토졸 내로의 전좌 및/또는 (d) 시냅스 소포막 융합에 연관된 단백질의 내단백질분해 절단이 가능한 성숙한 신경독소를 의미한다. 바람직하게는 상기 생물학적으로 활성인 것은 신경독소의 단백질분해 활성이다.
전술된 용어의 정의 및 설명은 달리 언급되는 경우를 제외하고는 하기 서술된 내용에 기술된 모든 관점에서 준용되는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 수단 및 방법은 세포 내, 바람직하게는 여기서 더욱 정의된 바와 같이 신경세포 내에서 보툴리눔 신경독소에 의한 융합 폴리펩티드로부터 전자인자 도메인의 단백질분해 방출에 기초한다. 상기 전자인자 도메인은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 융합 폴리펩티드의 일 관점에서 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커를 통하여 세포질 유지 도메인에 융합될 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드의 발현 후에, 상기 전사인자 도메인은 일차적으로 상기 세포질에 고정된다. 이는 막관통 단백질 또는 막관통 단백질의 막관통 스패닝 (spanning) 도메인, 막고정 단백질 또는 막고정 단백질의 막고정 도메인, 또는 구형 단백질 또는 세포골격 고정 단백질 (cytoskeleton anchor protein)과 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 융합 폴리펩티드 내의 적절한 세포질 유지 신호를 이용함으로써 달성될 수 있다. 상기 세포질 유지 신호는 상기 전자인자 도메인이 상기 세포 핵으로 전좌되는 것을 방지한다. 보툴리눔 신경독소의 단백질분해 활성만이 상기 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커 내의 상기 융합 단백질의 절단에 의하여 상기 전사인자 도메인을 상기 융합 폴리펩티드로부터 방출시킨다. 이에 의해 상기 전사인자 도메인이 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제, 또는 서양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxidase)와 같은 리포터 단백질의 발현이 개시될 수 있는 핵으로 전좌 된다. 발현된 리포터 단백질의 존재 및/또는 양은 공지기술로 주지된 분석방법인 예를 들어, 효소 테스트에 의하여 분석될 수 있다 (Miraglia LJ, King FJ, Damoiseaux R: Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Comb. Chem. High Throughput Screen 2011, 14:648-57; Fan F, Wood KV: Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 2007, 5:127-36). 발현된 리포터의 양은 세포질 내의 신경독소 경쇄의 단백질분해 활성에 직접적으로 비례하며, 이에 따라 또한 보툴리눔 신경독소의 생물학적 활성에 비례한다. 정의된 생물학적 활성을 갖는 참조 보툴리눔 신경독소를 이용한 이러한 분석의 결과를 비교함으로써, 시료 내의 미지의 보툴리눔 신경독소의 생물학적 활성이 결정될 수 있다.
유리하게도, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 융합 폴리펩티드는 세포 배양 시스템 내에서 주어진 신경독소 폴리펩티드의 단백질분해효소 활성을 결정할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 의하여 고비용이며 윤리적으로 불필요한 동물실험을 피하거나 줄일 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 융합 폴리펩티드는 자동화된 대용량 탐색 분석에 적용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 융합 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 신경아세포종 (neuroblastoma) 세포주와 같은 세포주에서의 분석을 확립하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 다른 세포 기반의 신경독소 분석에서 요구되는 것과 같은 일차 신경의 사용을 피할 수 있게 된다. 일차 신경의 준비가 번거롭고 비효율적이므로 이는 본 발명의 방법 및 수단의 또 다른 장점이다. 또한, 여기서 기술된 수단 및 방법을 이용함으로써, 보툴리눔 신경독소의 생물학적 활성을 결정하기 위한 세포 기반의 분석의 민감도 및 유동률 (flow rate)이 상당히 증가될 수 있었다. 따라서, 본 발명은 보툴리눔 신경독소의 생물학적 활성을 테스트하기 위한 개선된 분석방법을 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일 관점에서, 상기 세포질 유지 도메인은 막관통 단백질 또는 막관통 단백질의 막관통 스패닝 도메인이다. 적절한 세포질 유지 도메인을 사용함으로써, 본 발명의 융합 단백질은 상기 신경독소 경쇄가 생물학적으로 활성인 세포의 구획 내 즉, 세포질로 운반되거나 또는 여기에 보유된다. 환언하면, 신경독소 절단에 의한 활성화 전에 상기 융합 폴리펩티드의 발현 후에, 상기 전사인자 도메인이 상기 세포질에 고정된다. 이와 같은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 관점에서, 이러한 세포질 유지 도메인은 막관통 단백질 또는 막관통 단백질의 막관통 스패닝 도메인이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 다른 구현 예에 있어서, 상기 막관통 단백질은 혈장막 신경전달물질 트랜스포터, 이온 채널, G-단백질 결합 수용체 및 막 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 다른 구현 예에 있어서, 상기 세포질 유지 도메인은 막고정 단백질 또는 막고정 단백질의 막고정 도메인이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일 구현 예에 있어서, 상기 막고정 단백질은 SNAP-25, 신탁신, 시냅토브레빈, 시냅토타그민, 소포 연관 막 단백질 (VAMPs), 시냅스 소포 당단백질 (SV2), 고 친화성 콜린 트랜스포터, 뉴렉신, 전압 개폐 칼슘 채널, 아세틸콜린에스테라아제 및 NOTCH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이하, 각각의 단백질의 상응하는 접근 번호가 나타나 있다: 인간 SNAP-25 P60880, 인간 신탁신-1A Q16623, 신탁신-1B P61266, 신탁신-2 P32856, 신탁신-3 Q13277, 신탁신-4 Q12846, 신탁신-5 Q13190, 신탁신-6 O43752, 신탁신-7 O15400, 신탁신-8 Q9UNK0, 신탁신-10 O60499, 신탁신-11 O75558, 신탁신-12 Q86Y82, 신탁신-16 O14662, 신탁신-17 P56962, 신탁신-18 Q9P2W9, 신탁신-19 Q8N4C7; 인간 시냅토브레빈-1 P23763, 시냅토브레빈-2 P63027, 시냅토브레빈-3 Q15836; 인간 시냅토타그민: 시냅토타그민-1 P21579, 시냅토타그민-2 Q8N9I0, 시냅토타그민-3 Q9BQG1, 시냅토타그민-4 Q9H2B2, 시냅토타그민-5 O00445, 시냅토타그민-6 Q5T7P8, 시냅토타그민-8 Q8NBV8, 시냅토타그민-9 Q86SS6, 시냅토타그민-10 Q6XYQ8, 시냅토타그민-11 Q9BT88, 시냅토타그민-12 Q8IV01, 시냅토타그민-13 Q7L8C5, 시냅토타그민-14 Q8NB59, 시냅토타그민-15 Q9BQS2, 시냅토타그민-16 Q17RD7, 시냅토타그민-17 Q9BSW7, 인간 소포 연관 막단백질 (VAMPs): 소포 연관 막단백질 1 P23763, 소포 연관 막단백질 2 P63027, 소포 연관 막단백질 3 Q15836, 소포 연관 막단백질 4 O75379, 소포 연관 막단백질 5 O95183, 소포 연관 막단백질 7 P51809, 소포 연관 막단백질 8 Q9BV40; 시냅스 소포 당단백질 (SV2): 시냅스 소포 당단백질 2A Q7L0J3, 시냅스 소포 당단백질 2B Q7L1I2, 시냅스 소포 당단백질 2C Q496J9; 인간 고친화성 콜린 트랜스포터 Q9GZV3; 인간 뉴렉신: 뉴렉신-1-알파 Q9ULB1, 뉴렉신-1-베타 P58400, 뉴렉신-2-알파 Q9P2S2, 뉴렉신-2-베타 P58401, 뉴렉신-3-알파 Q9Y4C0, 뉴렉신-3-베타 Q9HDB5; 인간 전압 개폐 칼슘 채널: 전압-의존성 칼슘 채널 서브유닛 알파-2/델타-1 P54289, 전압-의존성 칼슘 채널 서브유닛 Q9NY47, 전압-의존성 칼슘 채널 서브유닛 Q8IZS8, 전압-의존성 칼슘 채널 서브유닛 Q7Z3S7, 전압-의존성 P/Q-타입 칼슘 채널 서브유닛 O00555, 전압-의존성 N-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q00975, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q13936, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q01668, 전압-의존성 R-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q15878, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 O60840, 전압-의존성 T-타입 칼슘 채널 서브유닛 O43497, 전압-의존성 T-타입 칼슘 채널 서브유닛 O95180, 전압-의존성 T-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q9P0X4, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q13698, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q02641, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 Q08289, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 P54284, 전압-의존성 L-타입 칼슘 채널 서브유닛 O00305, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-1 서브유닛 Q06432, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-2 서브유닛 Q9Y698, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-3 서브유닛 O60359, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-4 서브유닛 Q9UBN1, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-5 서브유닛 Q9UF02, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-6 서브유닛 Q9BXT2, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-7 서브유닛 P62955, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-8 서브유닛 Q8WXS5, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-유사체 서브유닛 Q8WXS4, 전압 개폐 칼슘 채널 알파 1F 서브유닛 F5CIQ9, 나트륨 누수 채널 비선택적 단백질 Q8IZF0, 전압 개폐 칼슘 채널 베타 2 서브유닛 Q5QJ99, 전압 개폐 칼슘 채널 베타 2 서브유닛 Q5QJA0, 전압 개폐 L-타입 칼슘 채널 Cav1.2 Q5V9X8, 전압 개폐 L-타입 칼슘 채널 Cav1.2 Q5V9X9, 전압 개폐 칼슘 채널 베타 2 서브유닛 Q6TME0, 전압 개폐 칼슘 채널 베타 2 서브유닛 Q6TME1, 전압 개폐 칼슘 채널 베타 2 서브유닛 Q6TME2, 전압 개폐 칼슘 채널 베타 2 서브유닛 Q6TME3, 전압 개폐 칼슘 채널 베타 1 서브유닛 Q6TME4, 전압 개폐 칼슘 채널 알파 1 서브유닛 Q71UT1, 전압 개폐 칼슘 채널 알파 1E 서브유닛 Q9UN68; 인간 아세틸콜린에스테라아제 P22303; 및 인간 NOTCH: 신경성 위치 노치 상동체 단백질 (Neurogenic locus notch homolog protein) 1 P46531, 신경성 위치 노치 상동체 단백질 2 Q04721, 신경성 위치 노치 상동체 단백질 3 Q9UM47, 신경성 위치 노치 상동체 단백질 4 Q99466.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 이러한 구현 예에 있어서, 전-시냅스 막에 또는 그 안에 위치되는 단백질을 선택하는 것이 유리하다. 기본적으로 막고정 또는 막단백질과의 상호작용에 사용될 수 있는 모든 단백질이 예를 들어, 원형질막 또는 소포막과 같은 상기 막에 위치될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 단백질은 바람직하게는 상기 신경독소 경쇄가 그 생물학적 활성을 발휘하는 구획 즉, 예를 들어 신경 세포와 같은 세포의 세포질 내에 존재한다. 상기 생물학적 활성은 상기 신경독소 수용체에의 결합, 상기 신경독소 경쇄의 표적 세포의 시토졸 내로의 전좌 및 상기 신경독소의 경쇄에 의해 매개되는 신경독소의 단백질분해 활성으로 구성된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 세포질 유지 도메인은 구셩 단백질 또는 세포골격 고정 단백질로부터 선택된다. 이와 같은 구현 예에 있어서, 상기 전사인자는 상기 융합 폴리펩티드가 상기 핵의 핵공을 통과하는 것을 방지하기에 충분히 큰 거대한 구형 단백질 또는 세포골격 고정 단백질에 융합된다. 이와 같은 방법으로, 상기 핵의 핵공을 통한 (전사 활성 도메인을 포함하는) 융합 단백질의 이동이 회피될 수 있다. 구형 단백질 또는 세포골격 고정 단백질은 단독으로 또는 다른 단백질 또는 엑스포틴 (exportin) 결합 도메인 또는 IκB 결합 도메인과 같은 단백질 도메인에 융합되어 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명은 "x"가 모든 자연적으로 발생하는 아미노산을 의미하는 류신-풍부 핵 배출 신호 (leucine-rich nuclear export signal, NES): (LxxxLxxLxL; 서열번호: 32)에 대하여 예시화 되었다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 전사인자 도메인은 DNA 결합 도메인 및 트랜스활성인자 또는 사일렌서 도메인을 포함하는 전사인자를 포함한다. 다른 구현 예에 있어서, 상기 전사인자는 상기 DNA 결합 도메인 및 트랜스활성인자 또는 사일렌서 도메인과 더불어, 핵 위치화 서열을 포함한다. 몇몇 구현 예에 있어서, 예를 들어, 상기 사일렌서 또는 억제인자 (예를 들어, REST)는 상기 절단 부위가 사일렌서/억제인자와 트랜스활성인자 도메인에 끼어들 수 있도록 상기 트랜스활성인자 도메인에 반대로 위치될 수 있다. 이에 의해 상기 리포터의 기본적인 발현에 있어서 추가적인 감소가 야기된다. 상기 핵 위치화 신호는 단백질은 상기 세포의 핵으로 안내한다. 여기에 사용된 바와 같이 상기 전사인자는 상기 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것으로 즉, 상기 전사인자는 리포터 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 전사인자는 테트라사이클린 의존성 트랜스활성인자 (tet-억제인자-VP 16), 스테로이드 호르몬 수용체, NOTCH, NFκB, p53, NFAT, MLL, E2A, HSF1, NF-IL6, STAT, R-SMAD, GAL4, 및 SP1으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 테트라사이클린 의존성 트랜스활성인자에 대한 아미노산 서열이 예를 들어 서열번호 33 또는 34로 나타나 있다:
"SRLDKSKVINSALELLNGVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALPIEMLDRHHTHSCPLEGESWQDFLRNNAKSYRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEEQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLKQAIELFDRQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG" (서열번호: 33)
"SRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGSAYSRARTKNNYGSTIEGLLDLPDDDAPEEAGLAAPRLSFLPAGHTRRLSTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGG" (서열번호: 34).
상기 tet-억제인자의 아미노산 서열이 접근번호 P04483로 나타나 있다. VP16의 아미노산 서열이 접근번호 P06492로 나타나 있다. 스테로이드 호르몬 또는 기타 핵 수용체에 대한 해당 접근번호는 다음과 같다: 안드로겐 수용체 P10275, 에스트로겐 수용체 P03372, 글루코코르티코이드 수용체 P04150, 미네랄로코르티코이드 수용체 P08235, 프로게스테론 수용체 P06401, 프로락틴 수용체 P16471, 레티노산 수용체 알파 P10276, 레티노산 수용체 감마 P13631, 레티노산 수용체 RXR-알파 P19793, 스테로이드 호르몬 수용체 ERR1 P11474, 스테로이드 호르몬 수용체 ERR2 O95718, 갑상선 호르몬 수용체 알파 P10827, 갑상선 호르몬 수용체 베타 P10828. NOTCH 단백질에 대한 해당 접근번호는 다음과 같다: 신경성 위치 노치 상동체 단백질 1 P46531, 신경성 위치 노치 상동체 단백질 2 Q04721, 신경성 위치 노치 상동체 단백질 3 Q9UM47, 신경성 위치 노치 상동체 단백질 4 Q99466. NFκB에 대한 해당 접근번호는 Q04206이며; p53에 대하여는 P04637; NFAT: 활성화된 T-세포의 핵인자 (Nuclear factor of activated T-cells) 1 O95644, 활성화된 T-세포의 핵인자 2 Q13469, 활성화된 T-세포의 핵인자 3 Q12968, 활성화된 T-세포의 핵인자 4 Q14934, 활성화된 T-세포의 핵인자 5 O94916; E2A (전사인자 E2-알파)에 대하여 P15923; HSF1에 대하여 Q00613; NF-IL6에 대하여 P17676; STAT: STAT1_HUMAN에 대하여 P42224, STAT2_HUMAN P52630, STAT3_HUMAN P40763, STAT4_HUMAN Q14765, STA5A_HUMAN P42229, STA5B_HUMAN P51692, STAT6_HUMAN P42226; R-SMAD: 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 (Mothers against decapentaplegic homolog) 1에 대하여 Q15797, 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 2 Q15796, 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 3 P84022, 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 4 Q13485, 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 5 Q99717, 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 6 O43541, 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 7 O15105, 열다섯 개의 성충 디스크를 갖는 상동체에 대한 모체 9 O15198; GAL4 및 SP1에 대하여 P08047.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일 구현 예에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
상기 용어 "벡터"는 바람직하게는 파지 (phage), 플라스미드, 바이러스성 또는 레트로바이러스성 벡터뿐만 아니라 세균 또는 효모 인공 염색체와 같은 인공 염색체를 포함한다. 또한, 상기 용어는 표적 구축체의 유전체 DNA내로의 무작위 또는 위치-지정 삽입에 대한 표적 구축체에 관한 것이기도 하다. 이러한 표적 구축체는 바람직하게는, 하기 자세히 기술된 바와 같이 상동성 (homologous) 또는 비상동성 (heterologous) 재조합을 위하여 충분한 길이의 DNA를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 일 구현 예에 있어서, 숙주 내에서의 증식 및/또는 선택을 위한 선택 마커를 더욱 포함한다. 상기 벡터는 관련 기술분야에 주지된 다양한 기법에 의하여 숙주 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 칼슘 포스페이트 침전물 또는 염화 류비듐 침전물과 같은 침전물 또는 전하를 띈 지질 또는 풀러린 (fullerens)과 같은 탄소-기반의 클러스터를 갖는 복합체 내에 도입될 수 있다. 선택적으로, 플라스미드 벡터는 열충격 또는 전기천공 기법에 의하여 도입될 수 있다. 상기 벡터가 바이러스인 경우, 이는 숙주 세포로 도입되기 전에 시험관 내에서 적절한 패키징 세포주를 이용하여 패키징될 수 있다. 레트로바이러스성 벡터는 복제가능하거나 또는 복제 결함일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스성 증식은 일반적으로 단지 상보적인 숙주/세포 내에서만 일어날 것이다. 또한, 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 벡터 내에서 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 발현을 가능하게 하는 발현 조절 서열 또는 이의 분리된 분획에 작동적으로 연결된다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 폴리뉴클레오티드의 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 숙주 세포 내에서 발현을 담당하는 조절 인자는 공지기술로 주지되어 있다. 일 구현 예에 있어서, 이들은 전사의 개시를 담당하는 조절 서열 및/또는 전사의 종결 및 상기 전사체의 안정화를 담당하는 폴리-A-신호를 포함한다. 추가적인 조절 인자로는 전사 인헨서 및 번역 인헨서가 포함될 수 있다. 원핵 숙주 세포 내에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 인자로는 예를 들어, 대장균 (E. coli) 내의 lac-, trp- 또는 tac- 프로모터가 포함되며, 진핵 숙주 세포 내에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 인자는 효모 내의 AOX1- 또는 GAL1- 프로모터 또는 포유동물 및 다른 동물 세포 내의 CMV-, SV40-, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인헨서, SV40-인헨서 또는 글로빈 인트론이다. 본 발명에 포함되는 다른 발현 시스템은 폴리헤드린 (polyhedrin) 프로모터 기반 시스템과 같은 곤충 세포 내의 발현을 허용할 것이다.
또한, 유도 발현 조절 서열이 본 발명에 포함되는 발현 벡터에 사용될 수 있다. 유도 발현 시스템 및 적절한 발현 조절 서열은 공지기술로 주지되어 있다. 예를 들어, 전사 트랜스활성을 위한 테트라사이클린-반응성 조절 시스템이 Zhu Z, Zheng T, Lee CG, Homer RJ, Elias JA: Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems: advances and application in transgenic animal modeling. Semin. Cell Dev. Biol. 2002, 13:121-8; 또는 Shockett P, Schatz D: Inducible gene expression using an autoregulatory, tetracycline-controlled system. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2002, Chapter 16: Unit 16.14에 기술되어 있다. 이러한 유도 벡터는 tet 또는 lac 작동인자 (operator) 서열 또는 열충격 또는 공지기술로 개시된 기타 환경적 요인에 의해 유도될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 두 개의 일반적으로 사용되는 유도 발현 시스템은 Tet-Off 및 Tet-On이다. Bujard and Gossen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12): 5547-51를 참고할 것. 이들은 억제인자보다는 전사 활성인자 단백질 (트랜스활성인자)를 만들기 위하여 Tet 억제인자 및VP16 활성 도메인의 융합으로 구성된다. 유전자 발현은 Tet-Off 또는 Tet-On 단백질의 유도 프로모터 내에 위치하는 테트라사이클린 반응 인자 (TREs)에 결합함으로써 활성화된다. 상기 차이는 이들 각각의 더욱 안정적인 테트라사이클린 유사체인 독시사이클린 (doxycycline, Dox)에 대한 반응과 관련된다: Tet-Off는 Dox의 부존재하에서 발현을 활성화시키는 반면, Tet-On은 Dox의 존재하에서 활성화시킨다. 적절한 벡터를 상업적으로 구입가능하다. 예를 들어, Clontech사에 의해 출시된 Tet-On 3G 벡터가 엄격하게 조절되며 반응성이 높고 상기 배양 배지에 독시사이클린을 첨가함으로써 작동되는 테트라사이클린 (Tet)-유도 포유동물 발현 시스템을 구축하기 위하여 사용될 수 있다. pCMV-Tet3G 벡터는 유도인자인 독시사이클린의 존재하에서는 높은 활성을 나타내며 부존재하에서는 특히 낮은 활성을 나타내는 테트라사이클린-조절 트랜스활성인자인 Tet-On 3G를 발현한다. Tet-On 3G은 돌연변이 Tet 억제인자 (TetR)의 아미노산 1-207를 단순 헤르페스 바이러스 VP16 단백질로부터 유래된 세 개의 최소 "F" 타입 전사 활성 도메인을 형성하는 39개의 아미노산에 융합시킴으로써 얻어진다. Tet-On 3G의 구성적 발현이 인간 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 급초기 프로모터 (immediate early promoter) (PCMV IE)에 의하여 유도된다. 또한, EF1알파 버젼은 그 내부에서 CMV 프로모터가 사일렌싱되는 세포주를 위하여 사용가능하다. 더욱 자세한 정보를 위하여 Clontech사의 카탈로그 번호 631163 및 여기에 인용된 참고문헌을 참고할 것. 전사 개시에 관여하는 인자 외에도, 이러한 조절 인자는 또한 SV40-폴리-A 부위 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 하류인 tk-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함한다. 이러한 관점에서, 적절한 발현 벡터가 Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3, pcDNA3.1 (Invitrogen) 또는 pSPORT1 (Invitrogen) 또는 배큘로바이러스-유래 벡터와 같이 공지기술로 알려져 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터 및 유전자 운반 또는 표적 벡터이다. 레트로바이러스, 우두바이러스 (vaccinia virus), 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 소유두종바이러스 (bovine papilloma virus)와 같은 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적 세포 집단 내로 운반하기 위하여 사용될 수 있다. 통상의 기술자에게 주지된 방법이 재조합 바이러스성 벡터를 구축하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)에 기술된 기법을 참고할 것.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "융합 폴리펩티드"는 (ⅰ) 전사인자 도메인 및 (ⅱ) 세포질 유지 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 전사인자 도메인 및 상기 세포질 유지 도메인은 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커로 분리되어 있다. 상기 링커에서의 단백질분해 절단은 상기 링커가 (적어도) 한번 절단되는 방식으로 상기 신경독소 절단 부위에서 일어난다. 상기 링커는 하나 이상의 신경독소 절단 부위(들)을 포함할 수 있다. 융합 폴리펩티드 또는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 관점에서 상기 용어 "링커로 분리된"은 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커가 상기 전사인자 도메인과 상기 세포질 유지 도메인 사이에 위치함을 의미한다. 따라서, 상기 융합 폴리펩티드 내에서 도메인 배열은 N-말단으로부터 C-말단으로 전사인자 도메인-링커-세포질 유지 도메인 또는 N-말단으로부터 C-말단으로 세포질 유지 도메인-링커-전사인자 도메인일 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "융합 폴리펩티드"는 본질적으로 다른 숙주세포 폴리펩티드가 포함되지 않은 분리된 또는 본질적으로 정제된 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현 예에 있어서, 상기 용어는 본 발명의 융합 폴리펩티드 및 다른 단백질을 추가적으로 포함하는 폴리펩티드 제제를 포함한다. 또한, 일 구현 예에 있어서, 상기 용어는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변형은 인공적인 변형이거나 자연적으로 발생하는 변형일 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드는 전술된 생물학적 특징을 갖는다. 또한 일 구현 예에 있어서, 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 31에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드가 포함된다. 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 통상의 기술자에게 주지된 화학적 합성 또는 재조합 분자생물학 기법에 의하여 제조될 수 있다. 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 제조하는 이러한 방법은 (a) 여기에 더욱 자세히 기술된 본 발명의 숙주세포를 배양하는 단계 및 (b) 상기 숙주세포로부터 본 발명의 융합 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함한다. 이러한 방법의 일 구현 예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 숙주세포 용해물로부터 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 예비 겔 전기영동을 포함하는 전형적인 정제기법에 의하여 수득될 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드의 일 구현 예에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 정제 태그를 포함한다.
상기 용어 "정제 태그"는 이를 포함하는 폴리펩티드의 정제를 허용하는 아미노산 서열을 의미한다. 일 구현 예에 있어서, 이는 각각의 아미노산, 펩티드 서열 또는 상기 정제 기질과 물리적으로 또는 화학적으로 상호작용할 수 있는 삼차원 펩티드 구조에 의하여 구현될 수 있다. 적절한 태그로는 친화도 태그 및 에피토프 태그가 포함된다. 이러한 의미에서, 세파로오스 또는 아가로오스와 같은 적절한 기질에 박혀있는 니켈 또는 코발트와 같은 금속이온과 물리-화학적으로 상호작용할 수 있는 히스티딘과 같은 특정 아미노산이 정제에 사용될 정의된 기질을 갖는 복합체를 형성할 수 있다는 것이 주지되어 있다. 다른 펩티드 서열 또는 삼차원 구조체가 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질 (MBP) 또는 글루타티온-S-전이효소 (GST)에서 발견될 수 있다. 다른 구현 예에 있어서, 단백질-단백질 상호작용 기반의 정제 기질/정제 태그 시스템이 기술분야에 주지된 스트렙타비딘/비오틴 시스템과 같이 사용될 수 있다. 다른 구현 예에 있어서, 상기 태그는 형광과 같이 정제를 가능케 하는 것을 함유하는 폴리펩티드에 물리-화학적 특성을 부여할 수 있다. 이러한 관점에서 적절한 태그로는 녹색 형광 단백질 (GFP), 청색 형광 단백질 (BFP) 등과 같은 주지된 형광 단백질이 포함된다. 몇몇 기질에 내재적인 친화도를 갖는 이들 태그와 더불어, 에피토프 태그가 다른 구현 예에 적용될 수 있다. 이러한 에피토프 태그는 항체에 의해 특이적으로 인식될 수 있는 펩티드 에피토프를 구성하는 짧은 아미노산 신장체로 구성된다. 에피토프 태그는 또한 기술분야에 주지되어 있으며 FLAG 태그, MYC-태그, 또는 HA-태그를 포함한다. 따라서, 상기 정제 태그는 His-태그, Myc-태그, FLAG-태그, strep-태그, MBP-태그, NusA 태그, GST-태그, 스트렙타비딘 및 아비딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "숙주세포"는 원핵 및 진핵 숙주 세포, 바람직하게는 분리된 원핵 및 진핵 숙주세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 진핵 숙주세포이다. 여기서 사용된 바와 같이 진핵 숙주세포는 본 발명의 융합 폴리펩티드의 생산에 적합한 동물 세포주의 세포이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 상기 숙주세포의 게놈 내로 안정적으로 도입되거나 상기 숙주세포에 의하여 일시적으로 발현될 수 있다. 따라서, 여기서 사용된 바와 같이 숙주세포는 일 구현 예에 있어서, 일차 세포 또는 세포주로서 효모 세포, 인간 세포를 포함하는 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 신경세포 또는 세포주 또는 신경아세포종 세포 또는 세포주이다.
본 발명의 숙주세포의 일 구현 예에 있어서, 상기 숙주세포는 일차 신경세포, 신경아세포종 세포주, 세포주 N1E-115, 세포주 Neuro2a, 세포주 SH-SY5Y, 세포주 PC12, 세포주 SiMa, 세포주 MHH-NB-11, 세포주 SK-N-BE(2) 및 유도 만능줄기세포 (iPS), 바람직하게는 인간 만능줄기세포 (hiPS)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 신경아세포종 세포주는 하기 ATCC 또는 DSMZ 번호: 세포주 N1E-115 CRL-2263, 세포주 Neuro2a CCL-131, 세포주 SH-SY5Y CRL-2266, 세포주 PC12 CRL-1721, 세포주 SiMa ACC 164 (DSMZ), 세포주 MHH-NB-11 ACC 157 (DSMZ) 및 세포주 SK-N-BE(2) CRL-2271 하에 ATCC 또는 DSMZ로부터 얻어진다. 세포주 SiMa의 특이적인 클론이 WO 2010/105234에 더욱 기술되어 있다. iPS 세포를 생성시키는 방법이 예를 들어, Yu et al., Science. 2009 May 8; 324(5928): 797-801. Epub 2009, WO 2011/056971 and WO 2011/025852에 기술되어 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, iPS는 예를 들어, WO 2012/135621 및 U.S. 특허출원 US 2010/0279403 및 US 2010/0216181에 기술된 방법과 같은 적절한 방법을 이용하여 뉴런으로 분화된다.
본 발명의 숙주세포의 또 다른 구현 예에 있어서, 숙주세포는 그 발현이 상기 융합 폴리펩티드의 절단에 따라 상기 전사인자 도메인에 의하여 조절되는 리포터 유전자를 포함한다. 이러한 구현 예에 있어서, 상기 숙주세포는 리포터 유전자를 포함한다. 상기 리포터 유전자는 상기 숙주세포의 게놈 내로 안정적으로 도입되거나 상기 숙주세포에 의하여 일시적으로 발현될 수 있다. 상기 리포터 유전자의 발현은 본 발명의 융합 폴리펩티드의 신경독소에 의하여 링커 내에서 절단된 후에만 상기 전사인자 도메인에 의하여 조절된다. 리포터 유전자 분석은 공지기술로 잘 기술되어 있다 (Miraglia LJ, King FJ, Damoiseaux R: Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Comb. Chem. High Throughput Screen 2011, 14:648-57; Fan F, Wood KV: Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 2007, 5:127-36). 리포터 유전자로는 예를 들어, 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제, 서양고추냉이 과산화효소 또는 형광단백질 (GFP, YFP, RFP, CFP 등)이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계:
(a) 본 발명의 융합 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포 및 상기 융합 폴리펩티드의 절단에 따라 그 발현이 상기 전사인자 도메인에 의하여 조절되는 리포터 유전자를 신경독소 활성을 포함하는 것으로 예상되는 샘플에 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계;를 포함하는 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
여기서 기술된 리포터 유전자 분석방법은 BoNT/A와 같은 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성의 결정을 촉진 및 개선 시킨다. 이러한 분석을 위하여, 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드, 융합 폴리펩티드, 벡터 및 숙주세포가 이용될 수 있다. 연속적으로, 활성인자 구축체 및 리포터 유전자 구축체가 여기서 기술된 숙주세포 내로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 중독 및 SNAP-25와 같은 신경독소 폴리펩티드 기질의 절단 후에, 상기 활성인자 구축체에 포함된 트랜스활성인자 (tTA)가 상기 Tet 시스템으로부터 방출된다. 상기 리포터 유전자 내의 조절인자에 상기 트랜스활성인자가 결합하면, 루시페라아제와 같은 리포터 유전자 발현이 활성화된다. 코딩된 루시페라아제 효소의 활성은 상업적으로 구입가능한 키트를 이용하여 몇 시간 만에 검출가능하다. 산화환원반응에서 상기 루시페라아제에 의하여 매개되는 발광은 샘플 내의 신경독소 폴리펩티드의 양에 상응한다. 알려진 신경독소 폴리펩티드 농도를 갖는 표준 곡선이 참고용으로 병행하여 사용된다. 추가적인 참고용으로, 루시페라아제에 의한 신호를 각각의 경우마다 상이할 수 있는 샘플 내의 세포숫자에 대응시키기 위하여 단백질 측정이 수행될 수 있다. 이러한 방법은 기술분야에서 주지된 통상적인 방법이며 전술된 본 발명의 활성 분석과 병행하여 수행될 수 있다. 숙주세포로는 예를 들어, SIMA 세포주 (인간 신경아세포종)와 같이, 여기서 기술된 세포가 사용될 수 있다. 하기 실시 예에 나타난 바와 같이, 본 발명에 있어서 활성인자 구축체 mST01 (시냅토타그민-SNAP-25-tTA) (서열번호: 9) 및 리포터 유전자 구축체 pTRE-Luc (루시페라아제 리포터) (Clontech)를 포함하는 서브-클론된 SIMA 세포주 (SIMA 번호 3B4)로부터 SIMA 세포주의 다양한 클론이 생성되었다. 여기서 기술된 바와 같이 리포터 유전자 분석에 사용될 수 있는 리포터 유전자는 공지기술로 주지되어 있으며, 예를 들어, 접근번호 P08659, Q27758, H1AD96, A3KC01, A3KC00, A3KBZ9, A3KBZ8, A3KBZ7, A3KBZ6, A3KBZ5, D5MS63, Q2TNU5, Q5UFR2, Q2VL10, Q6SVE0, B5A991, Q27688, A1Z0H9, Q207B1, Q5USC8, G9M6I8, Q6SVE2, Q9GPF9, 또는 Q6SVE1로 나타난 서열을 포함한다.
활성인자 구축체 mST01 (시냅토타그민-SNAP-25-tTA) (서열번호: 9) 및 리포터 유전자 구축체 pTRE-Luc (루시페라아제 리포터 (Clontech)를 포함하는 전술된 클론은 상기 활성인자 및 리포터 구축체를 상기 게놈 내로 안정적으로 운반한다. 또한, 모 SIMA 세포 즉, 서브-클론되지 않은 배아 조직으로부터 유래된 인간 다능성 세포 및 상업적으로 구입가능한 P19 세포주 (쥐 배아 암종)가 본 발명의 전술된 구축체로 일시적인 형질감염 또는 안정적인 형질감염 모두의 형질감염을 위하여 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질감염 (transfection)은 안정적인 형질감염이다. 따라서, 전술된 바와 같이 생성된 신규한 이중-형질전환 세포주는 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성의 측정을 위한 개선된 분석을 가능케 한다. 그 결과, 상기 신경독소 폴리펩티드 활성의 결정을 위한 분석의 민감도가 증가될 수 있다. 또한, 본 발명의 분석법은 기술분야에 개시된 분석법과 비교하여 시간 및 비용이 절약된다. 본 발명의 상기 분석법은 예를 들어 성인의 이틀 작업시간이 요구되는 고된 방법인 웨스턴 블롯팅과 같이 기술분야에서 개시된 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하기 위한 방법에 대한 대체수단을 제공한다.
본 발명의 방법은 자동화에 의하여 보조될 수 있다. 특히, 일 구현 예에 있어서, 상기 단계 a) 및/또는 b)가 화합물을 혼합하고 상기 리포터 유전자 활성을 측정하기 위하여 로봇 장치 및 자동화된 판독시스템에 의하여 보조될 수 있다. 적절한 시스템은 공지 기술로 알려져 있으며 결정될 반응의 유형에 의존한다. 또한, 상기 방법은 샘플 제조 및 본 발명의 융합 폴리펩티드의 생성과 관련한 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "접촉시키는"은 화합물의 물리적 및/또는 화학적 상호작용이 가능하도록 적어도 두 개의 상이한 화합물을 물리적으로 가까이 두는 것을 의미한다. 전술된 방법으로, 본 발명의 융합 폴리펩티드와 그 발현이 상기 융합 폴리펩티드의 절단에 따라 상기 전사인자 도메인에 의하여 조절되는 리포터 유전자를 포함하는 숙주세포가 신경독소 활성을 포함하는 것으로 여겨지는 샘플과 접촉된다. 상기 접촉은 상기 샘플에 포함된 신경독소 폴리펩티드에 의하여 본 발명의 융합 폴리펩티드의 링커 내의 신경독소 절단 부위의 절단을 허용하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서 이루어질 수 있다. 일 구현 예에 있어서, 여기서 사용된 바와 같이 접촉은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 함유하는 본 발명의 숙주세포 내에서 이루어진다. 따라서, 일 구현 예에 있어서 상기 폴리펩티드는 숙주세포, 일 구현 예에 있어서는 본 발명의 숙주세포에 포함된다. 상기 시간 및 조건은 상기 샘플에 포함된 신경독소 폴리펩티드의 양과 상기 숙주세포에 의한 상기 신경독소 폴리펩티드의 흡수에 의존적일 것이다. 통상의 기술자에게 숙주세포, 샘플의 종류, 및 결정될 신경독소의 종류에 따라 적용될 필요가 있는 조건이 무엇인지가 잘 알려져 있다. 이러한 관점에서, 접촉은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 포함하는 세포 시스템 내에서 일어난다. 상기 세포 시스템은 상기 시스템을 상기 샘플과 접촉시킴에 따라 상기 신경독소의 활성을 측정하는 것을 가능케 하며, 이에 따라 상기 샘플 내의 신경독소 단백질분해효소 활성을 결정하는 것을 가능케 한다. 상기 용어 "샘플"은 신경독소 폴리펩티드를 포함하는 것으로 여겨지는 샘플을 의미한다. 일 구현 예에 있어서, 상기 샘플은 수용액이다. 이러한 샘플은 생물학적 샘플이거나 또는 인공적으로 생성된 수용액 샘플일 수 있다. 일 구현 예에 있어서, 이러한 용액은 품질관리 및/또는 활성 결정/구체화 목적 또는 안전 관리에 대한 신경독소 제조 과정에서 서로 상이한 단계에서 얻어진다. 상기 샘플 내에 존재하는 신경독소는 적어도 신경독소 단백질분해효소 활성을 나타낼 것이라고 여겨진다. 일 구현 예에 있어서, 상기 신경독소는 완전히 생물학적으로 활성이다. 일 구현 예에 있어서, 상기 완전히 생물학적으로 활성인 신경독소는 상기 세포를 집어넣고 본 발명의 융합 폴리펩티드에 기초한 판독을 활성화시키기 위하여 요구된다. 따라서, 만약 본 발명의 방법에 의하여 분석될 샘플과 숙주세포가 접촉되는 경우라면, 이러한 완전히 생물학적으로 활성인 신경독소가 적용될 것이다. 다른 구현 예에 있어서, 본 발명의 방법에 적용될 샘플은 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 단백질분해효소 활성을 단지 나타내는 이의 단편을 포함한다. 일 구현 예에 있어서, 이러한 신경독소 폴리펩티드 또는 단편은 단백질 분해적으로 활성인 경쇄를 포함하거나 또는 실질적으로 이로 이루어진 신경독소 폴리펩티드의 돌연변이 단백질이다.
일 구현 예에 있어서, 상기 리포터 유전자 활성은 리포터 유전자 기질의 효소적 전환 (enzymatic conversion)을 측정함으로써 결정된다. 일 구현 예에 있어서 상기 후자는 전환 반응 동안 방출되는 빛의 강도를 검출함으로써 측정될 수 있다. 리포터 유전자에 의하여 촉매되는 전환 반응 동안 일어나는 발광을 측정하는 적절한 시스템은 기술분야에 주지되어 있으며 상업적으로 구입가능하다. 또한, 상기 리포터 유전자에 사용될 수 있는 적절한 기질도 주지되어 있으며 상업적으로 구입가능하다.
샘플 내의 신경독소 폴리펩티드는 정량적으로 또는 정성적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 정성적 결정을 위하여 신경독소 폴리펩티드의 존재 또는 부존재가 결정된다. 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 정량적 검출을 위하여 상기 신경독소 폴리펩티드의 양이 결정된다. 일 구현 예에 있어서, 상기 정량적 결정은 절대량 또는 상대량 즉, 상이한 샘플에서 밝혀진 양이 서로에 대하여 비교될 수 있도록 규준화된 양의 결정을 포함한다. 일 구현 예에 있어서, 이는 미리 결정된 양의 상기 신경독소 폴리펩티드를 갖는 조정 샘플을 본 발명의 방법에 적용함으로써 구축되는 조정 곡선과 테스트 샘플에 대하여 측정된 리포터 유전자 활성을 비교함으로써 구현될 수 있다.
본 발명의 방법의 일 구현 예에 있어서, 상기 숙주세포는 여기서 정의된 숙주세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 융합 폴리펩티드 또는 숙주세포를 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위하여 사용하는 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 융합 폴리펩티드 또는 숙주세포 및 바람직하게는, 리포터 유전자 활성을 검출하기 위한 검출 제제를 포함하는 신경독소 활성을 결정하기 위한 키트에 관한 것이다.
여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "키트"는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 준비되어 있는 방식으로 분리된 또는 공통된 바이얼 내에 제공되는 본 발명의 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및/또는 숙주세포를 포함하는 수단의 집합체를 의미한다. 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 예를 들어, 정의된 생물학적 활성을 갖는 신경독소 폴리펩티드를 포함하는 조정 표준 용액 및/또는 상기 리포터 유전자에 의하여 전환된 리포터 유전자 또는 기질에 대한 검출 제제와 같은 상기 리포터 유전자 활성을 측정하기 위한 수단과 같은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 추가적인 수단을 포함한다. 또한, 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침서를 포함한다. 이들 지침서는 매뉴얼로 제공되거나 또는 본 발명의 방법의 하나 이상의 단계를 통제할 수 있는 데이터 저장 매체 상의 컴퓨터로 수행될 수 있는 알고리즘의 형태일 수 있다. 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 구체적으로 전술된 본 발명의 방법을 수행하기 위하여 사용될 수 있다.
여기에 인용된 모든 참조들은 상기 전체 개시 내용 및 여기에 구체적으로 언급된 개시 내용에 관하여 참조로 포함된다.
도면
도 1은 활성인자-구축체를 구축하기 위한 기본으로 사용된 Clontech사에 의해 제공된 본래의 조절 플라스미드 (a); 루시페라아제-코딩 리포터 구축체 (b); 루시페라아제-리포터 구축체를 위한 시스템 조절 플라스미드 (c)를 나타낸다 (모두 Clontech사).
도 2는 pCMV-Tet3G-벡터 (도 1a)를 골격으로 갖는 활성인자-플라스미드 mST01 (서열번호: 9) 구축의 일례를 나타낸다. 시냅토타그민 (87개의 아미노산)의 N-말단 막고정 도메인 및 SNAP25의 112개의 C-말단 아미노산을 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 계획된 EcoRⅠ 및 XbaⅠ절단 부위를 통하여 클로닝된다. 상기 벡터의 주요 특징이 화살표로 강조표시되어 있고 또한 그 위치를 (염기쌍 (bp)으로) 나타내는 우측 표에 나타나 있다.
도 3은 활성인자 및 리포터 구축체의 안정적인 도입에 관한 대조구로서 게놈 PCR의 결과를 나타낸다. 루시페라아제에 관해 설계된 프라이머는 ~1kb의 산물을 생산하며, Tet-인자에 관한 프라이머는 ~0.5kb의 산물을 생산한다. 강조 표시된 레인은 안정적으로 도입된 두 플라스미드 클론을 나타낸다. 전체적으로, 상기 게놈 PCR의 결과에 기초하여 24개의 생성된 클론 중 10개가 루시페라아제 및 Tet-인자에 대하여 양성이었다.
도 4는 시냅토타그민-SNAP25 융합 단백질의 막고정 구축체를 보여주는 묘사된 예시의 작용 방법의 모식도를 나타낸다.
약어 및 기호:
SYT: 시냅토타그민 (Synaptotagmin);
tetR: 테트라사이클린 억제인자 (Tetracycline-Repressor);
VP16: 단순 포진 VP16 단백질의 전사활성 도메인;
CMV: 거대세포 바이러스 (Cytomegalie virus) 프로모터;
검은색 사각형: 독시사이클린 (Doxycycline).
상기 융합 단백질은 구성적으로 (constitutively) 발현되며 바람직하게는 신경 분화 세포의 말단 가지의 막에 연결된다. 각각의 링커 도메인 내에서 BoNT의 절단에 따라, TetR-인자 및 VP16로 구성된 복합체가 상기 핵 내로 운반된다. 항생제 독시사이클린이 존재하는 경우, 상기 TetR-인자/VP16의 Tet-프로모터 및 이에 따라 그 조절된 리포터 유전자 루시페라아제에의 결합을 허용하는 구조적 변화가 야기된다. 루시페라아제의 유도된 발현에 따라, 상업적으로 구입가능한 분석 키트를 이용하여 그 효소적 활성을 검출하고 정량하는 것은 기능적 판독이다. 이는 또한 모든 막고정 구축체에 적용될 수 있다. 시토졸 활성인자 구축체에 있어서, 위치화는 상기 세포 내에서 바람직한 도메인에 국한되지 않는다. TetR-인자의 핵 내로의 기본적인 운반 기작 및 상기 리포터의 연속적인 발현/검출의 활성화는 지속적이다.
실시 예
이하, 제한적이지 않고 단지 본 발명을 상세히 기술하는 것일 뿐 그 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 아니 되는 하기 실시 예에 의하여 본 발명이 기술될 것이다.
제한 희석을 이용하여 서브클로닝함으로써 모 SiMa 세포주 (DSMZ, 접근 번호: ACC-164)로부터 유래된 서브-클론된 SiMa 세포주 (SIMA 번호 3B4)가 Xfect 형질감염 제제 및 판매자 (Clontech Laboratories, Inc., Cat. No.: 631317)에 의하여 제공된 수반된 산물을 이용하여 안정적으로 형질감염되었다. 형질감염 세포가 90% 컨플루언시 (confluency)를 나타내었을 때, 6-웰 플레이트에서 형질감염을 수행하였다. 상기 각각의 폴리뉴클레오티드-DNA가 웰 당 2㎍으로 사용되었다. 루시페라아제-리포터-구축체로 형질감염시키는 경우, 상기 DNA는 히그로마이신 (Hygromycin)에 대하여 0.1㎍ 선형 선별 마커 (20:1 비율)를 수반하였다. 4시간 후에, 형질감염 기질을 함유하는 배지를 정상적인 성장 배지로 대체하였다.
이러한 배지 교체 24시간 후에, 동일한 제제의 두 개의 6-웰이 채워지고 PDL-코팅된 페트리 접시 (Φ14.5㎝) 상에 놓였으며, 단일 콜로니가 형성될 때까지 항생제 선별 (G418: 400㎍/㎖; 히그로마이신: 150㎍/㎖)이 수행되기 전에, (밀도가 70 내지 80% 컨플루언시에 이를 때까지) 최소 48시간 동안 성장시켰다. 이들 단일 콜로니를 선택하여 확장시키고 관심 있는 각각의 구축체의 안정적인 게놈 도입에 관하여 테스트하였다. 선별기간 후에 항생제 농도를 G418: 200㎍/㎖ 및 히그로마이신: 100㎍/㎖로 낮추었다.
Tet-인자 (전방: AGCTGGGAGTTGAGCAGCCTAC (서열번호: 35); 후방: GGTGCCGAGATGCACTTTAGCC (서열번호: 36)) 및 루시페라아제 리포터 (전방: GAAGAGATACGCCCTGGTTC (서열번호: 37); 후방: CGGGAGGTAGATGAGATGTG (서열번호: 38))에 대한 특이적인 프라이머를 이용하고 Phusion 고 신뢰도 키트 (NEB)를 적용하여 연속적인 아가로오스 겔 전기영동에 의한 프로토콜 및 분석에 따른 게놈 PCR (Lyse 및 Go PCR 제제를 이용하여, Thermo Scientific 프로토콜에 따라 세포를 용해시킴).
두 개의 구축체의 삽입에 대하여 양성적으로 테스트된 후에, 세포를 확장시키고 액체 질소 탱크 내에 세포 은행 저장물을 생성시켰다. 실험용 세포를 사용하기 전에, 저장물의 재-해동 후 안정적인 삽입에 관한 테스트를 수행하였다.
우선, 구축체 mST01 (시냅토타그민-SNAP-25-tTA) (서열번호: 9)를 형질감염시켰으며, 가능한 유전적 변이가 적은 클론 배경 (clonal background)에 이르도록 단일 세포 서브클로닝을 수행하였다. 이들 안정적인 클론을 리포터 유전자 구축체 pTRE-Luc (루시페라아제 리포터)로 두 번째 형질감염시켰고, 연속적인 단일 세포 클로닝을 반복하였다 (도 3). 각각의 GOI를 갖지 않으며 전술된 특성에 있어서 어떠한 손상도 나타내지 않은 공 (empty) 벡터 (활성인자 대조구 플라스미드로서 pCMV-Tet3G 및 리포터 대조구 플라스미드로서 pTRE3G)를 이용하여, 형질감염적이고, 생존가능하며 기능적인 대조구를 제조하였다 (도 1a, c) (Clontech).
도입 안정성을 나타낸 후, Tet-인자의 발현 분석 및 신경독소에 의한 BoNT 링커-도메인의 절단이 평가되었다. 이러한 실험에 있어서, 이중 형질감염된 클론이 PDL-코팅된 96-웰 플레이트 상에 도포되었고, WO 2010/105234에 개시된 절차에 따라 신경 표현형으로 분화되었다. 24-72 시간 동안 세포 배양에서 1×10-10M 내지 10×10-14M 범위의 최종 농도를 갖는 연속 농도를 이용하여 BoNT/A로의 중독이 수행되었다. 0.2% 인간 혈청 알부민으로 보충된 DPBS 내에서 BoNT의 저장물 연속 희석이 수행되었으며, 대응적이고 직접적으로 상기 세포 배양 배지 내로 적용되었다. 중독 후에, Tet-억제인자 단백질의 방출이 검출되고 본래의 폴리펩티드 서열과 구분가능할 것이다. Tet-온 (Tet-on) 시스템으로서 독시사이클린에 대한 시간 및 투여량 반응 수준이 기본으로 사용되었을 뿐만 아니라, 루시페라아제 리포터의 발현 수준이 BoNT에 대한 시간 및 투여량-반응에서 더욱 분석되었다. 상업적으로 이용가능한 루시페라아제-분석-키트를 이용함으로써 기능적 판독이 수행되었다. 이 경우, 두 개의 상이한 키트가 적용될 수 있으며, 주로 순수한 기능적 판독을 위하여는 순수 루시페라아제 분석 시스템 (One-Glo, Promega)을 사용하고, 완전한 분석 적용을 위해서는 세포 생존능 평가 (One-Glo+Tox, Promega)와 조합으로 루시페라아제 분석 시스템을 사용가능하다. 이러한 다중 접근은 동일한 샘플 내의 규준화 및 기능적 데이터를 가능하게 하며, 따라서 상기 분석의 확립을 위한 확고한 기초를 마련할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Merz Pharma GmbH & Co. KGaA <120> Means and methods for determination of Botulinum neurotoxin biological activity <130> MP10485PC <160> 38 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3258 <212> DNA <213> artificial <220> <223> SV2-SNAP25-tTA (2)(pcDNA3.1) <400> 1 gctagcgcca ccatggaaga ctcttacaag gataggactt cactgatgaa gggtgccaag 60 gacattgcca gagaggtgaa gaaacaaaca gtaaagaagg tgaatcaagc tgtggaccga 120 gcccaggatg aatacaccca gaggtcctac agtcggttcc aagatgaaga agatgatgat 180 gactactacc cggctggaga aacctataat ggtgaggcca acgatgacga aggctcaagt 240 gaagccactg aggggcatga tgaagatgat gagatctatg agggggagta tcagggcatc 300 cccagtatga accaagcgaa ggacagcatc gtgtcagtgg ggcagcccaa gggcgatgag 360 tacaaggacc gacgggagct ggaatcagaa aggagagctg acgaggaaga gttagcccag 420 cagtatgagc tgataatcca agaatgcggt catggtcgtt ttcagtgggc ccttttcttc 480 gtcctgggca tggctcttat ggcagacggt gtagaggtgt ttgtcgttgg cttcgtgtta 540 cccagtgctg agacagacct ctgcatccca aattcaggat ctggatggct aggcagcata 600 gtgtacctcg ggatgatggt gggggcgttc ttctggggag gactggcaga 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gacgactttg accttgatat gctgcctgct gacgctcttg acgattttga ccttgacatg 3240 ctccccgggt aactcgag 3258 <210> 2 <211> 1079 <212> PRT <213> artificial <220> <223> SV2-SNAP25-tTA (2)(pcDNA3.1) <400> 2 Met Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Arg Thr Ser Leu Met Lys Gly Ala Lys 1 5 10 15 Asp Ile Ala Arg Glu Val Lys Lys Gln Thr Val Lys Lys Val Asn Gln 20 25 30 Ala Val Asp Arg Ala Gln Asp Glu Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr Ser Arg 35 40 45 Phe Gln Asp Glu Glu Asp Asp Asp Asp Tyr Tyr Pro Ala Gly Glu Thr 50 55 60 Tyr Asn Gly Glu Ala Asn Asp Asp Glu Gly Ser Ser Glu Ala Thr Glu 65 70 75 80 Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Gly Ile 85 90 95 Pro Ser Met Asn Gln Ala Lys Asp Ser Ile Val Ser Val Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Gly Asp Glu Tyr Lys Asp Arg Arg Glu Leu Glu Ser Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Asp Glu Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Leu Ile Ile Gln Glu 130 135 140 Cys Gly His Gly Arg Phe Gln Trp Ala Leu Phe Phe Val Leu Gly Met 145 150 155 160 Ala Leu Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu 165 170 175 Pro Ser Ala Glu Thr Asp Leu Cys Ile Pro Asn Ser Gly Ser Gly Trp 180 185 190 Leu Gly Ser Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Phe Trp 195 200 205 Gly Gly Leu Ala Asp Lys Val Gly Arg Lys Gln Ser Leu Leu Ile Cys 210 215 220 Met Ser Val Asn Gly Phe Phe Ala Phe Leu Ser Ser Phe Val Gln Gly 225 230 235 240 Tyr Gly Phe Phe Leu Phe Cys Arg Leu Leu Ser Gly Phe Gly Ile Gly 245 250 255 Gly Ala Ile Pro Thr Val Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Val Leu Ala Arg 260 265 270 Glu Lys Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile 275 280 285 Gly Gly Ile Tyr Ala Ser Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr 290 295 300 Gly Trp Ser Phe Ser Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg 305 310 315 320 Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Cys Val Ser Ser Val Val Ala 325 330 335 Leu Thr Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Glu Val Gly Lys 340 345 350 His Asp Glu Ala Trp Met Ile Leu Lys Leu Ile His Asp Thr Asn Met 355 360 365 Arg Ala Arg Gly Gln Pro Glu Lys Val Phe Thr Val Asn Lys Ile Lys 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gcctcttcat cgggaatgcg cgcgaccttc agcatcgccg gcatgtcccc 2220 ctggcggacg ggaagtatcc agctcgacca agctt 2255 <210> 30 <211> 696 <212> PRT <213> artificial <220> <223> tTA-SNAP25-GFP(pCMV-Tet3G) <400> 30 Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu 1 5 10 15 Leu Asn Gly Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln 20 25 30 Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys 35 40 45 Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ile Glu Met Leu Asp Arg His His 50 55 60 Thr His Ser Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg 65 70 75 80 Asn Asn Ala Lys Ser Tyr Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly 85 90 95 Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr 100 105 110 Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu 115 120 125 Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys 130 135 140 Val Leu Glu Glu Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr 145 150 155 160 Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Lys Gln Ala Ile Glu Leu 165 170 175 Phe Asp Arg Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu 180 185 190 Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro 195 200 205 Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala 210 215 220 Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp 225 230 235 240 Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Val 245 250 255 Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala Ile 260 265 270 Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn Glu 275 280 285 Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu Arg 290 295 300 His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln 305 310 315 320 Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp 325 330 335 Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly Ala Ser Lys 340 345 350 Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp 355 360 365 Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 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Ala Asp 580 585 590 Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg Arg Ala Asp Gln Leu Ala 595 600 605 Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met Leu Gln Leu Val Glu Glu 610 615 620 Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val Met Leu Asp Glu Gln Gly 625 630 635 640 Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln Ile Asn Lys Asp 645 650 655 Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp Leu Gly Lys Phe Cys Gly 660 665 670 Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys Ser Ser Asp Ala Tyr Lys 675 680 685 Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp 690 695 <210> 31 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> SNAP110-pTET-tTAK <400> 31 Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val 1 5 10 15 Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala 20 25 30 Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn 35 40 45 Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu 50 55 60 Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg 65 70 75 80 Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile 85 90 95 Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly Ser Arg 100 105 110 Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu Leu Asn Glu 115 120 125 Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln Lys Leu Gly 130 135 140 Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys Arg Ala Leu 145 150 155 160 Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His Thr His Phe 165 170 175 Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg Asn Asn Ala 180 185 190 Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly Ala Lys Val 195 200 205 His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr Leu Glu Asn 210 215 220 Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu Asn Ala Leu 225 230 235 240 Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys Val Leu Glu 245 250 255 Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr Pro Thr Thr 260 265 270 Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu Phe Asp His 275 280 285 Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu Ile Ile Cys 290 295 300 Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Arg 305 310 315 320 Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly Leu Leu Asp 325 330 335 Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala Ala Pro Arg 340 345 350 Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser Thr Ala Pro 355 360 365 Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp 370 375 380 Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 385 390 395 400 Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser 405 410 415 Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met 420 425 430 Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly 435 440 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> leucine-rich nuclear export signal (NES) <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid 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Claims (17)

  1. 신경독소 절단 부위를 포함하는 링커로 분리된, (ⅰ) 전사인자 도메인 및 (ⅱ) 세포질 유지 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포질 유지 도메인은 막관통 단백질 또는 막관통 단백질의 막관통 스패닝 도메인인 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 막관통 단백질은 혈장막 신경전달물질 트랜스포터, 이온 채널, G-단백질 결합 수용체 및 막 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포질 유지 도메인은 막고정 단백질 또는 막고정 단백질의 막고정 도메인인 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 막고정 단백질은 SNAP-25, 신탁신, 시냅토브레빈, 시냅토타그민, 소포 연관 막 단백질 (VAMPs), 시냅스 소포 당단백질 (SV2), 고 친화성 콜린 트랜스포터, 뉴렉신, 전압 개폐 칼슘 채널, 아세틸콜린에스테라아제 및 NOTCH로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포질 유지 도메인은 구상 단백질 및 세포골격 고정 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전사인자 도메인은 DNA 결합 도메인을 포함하는 전사인자 및 트랜스활성인자 또는 사일렌서 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 전사인자는 테트라사이클린 의존성 트랜스활성인자 (tet-억제인자-VP 16), 스테로이드 호르몬 수용체, NOTCH, NFkB, p53, NFAT, MLL, E2A, HSF1, NF-IL6, STAT, R-SMAD, GAL4, 및 SP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 융합 폴리펩티드.
  11. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 청구항 9의 벡터 또는 청구항 10의 융합 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 숙주 세포는 일차 신경 세포, 신경아세포종 세포주, N1E-115 세포주, Neuro2a 세포주, SH-SY5Y 세포주, PC12 세포주, SiMa 세포주, MHH-NB-11 세포주, SK-N-BE(2) 세포주 및 유도 만능줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서,
    상기 숙주 세포는 상기 융합 폴리펩티드의 절단에 따라 그 발현이 전사인자 도메인에 의하여 조절되는 리포터 유전자를 포함하는 숙주 세포.
  14. 하기 단계:
    (a) 청구항 10의 융합 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포 및 상기 융합 폴리펩티드의 절단에 따라 그 발현이 상기 전사인자 도메인에 의하여 조절되는 리포터 유전자를 신경독소 활성을 포함하는 것으로 예상되는 샘플에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계;를 포함하며,
    상기 측정에 의하여 상기 샘플 내의 신경독소 활성이 결정되는 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위한 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 숙주 세포는 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항의 숙주 세포인 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위한 방법.
  16. 샘플 내의 신경독소 활성을 결정하기 위한 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 청구항 9의 벡터, 청구항 10의 융합 폴리펩티드 또는 청구항 11 또는 13의 숙주 세포의 용도.
  17. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 청구항 9의 벡터, 청구항 10의 융합 폴리펩티드 또는 청구항 11 또는 13의 숙주 세포 및 바람직하게는, 리포터 유전자 활성을 검출하기 위한 검출 제제를 포함하는 신경독소 활성을 결정하기 위한 키트.
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