PT1869459E - Ensaios fret à base de corantes lipofílicos para a actividade da toxina de clostrídeo - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "ENSAIOS FRET À BASE DE CORANTES LIPOFILICOS PARA A ACTIVIDADE DA TOXINA DE CLOSTRÍDEO"

Todas as listagens de sequências do GeneBank citadas no presente pedido de invenção, conforme identificadas pelos seus números de acesso ao GeneBank, encontram-se disponíveis a partir do National Center for Biotechnological Information.

As propriedades miorrelaxantes das toxinas de clostrídeo (CoNT) têm sido utilizadas em diversas aplicações terapêuticas e cosméticas, veja-se, v.g., William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004). Por exemplo, as terapias com CoNT foram já propostas para o tratamento de distonia, veja-se, v.g., Kei Roger Aoki, et al., Method for treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, patente de invenção norte-americana n° 6 319 505 (20 de Nov. de 2001) ; dor, veja-se, v.g., Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, patente de invenção norte-americana n° 6 464 986 (15 de Out. de 2002); lesões musculares, veja-se, v.g., Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, patente de invenção norte-americana n° 6 423 319 (23 de Jul. de 2002); doenças cardiovasculares, veja-se, v.g., Gregory F. Brooks, Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxins, pedido de patente de invenção norte-americana n° 2003/0185860 (2 de Out. de 2003); perturbações neuropsiquiátricas, veja-se, v.g., Steven Donovan, Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders, 2 patente de invenção norte-americana publicada com o n° 2003/0211121 (13 de Nov. de 2003); dores lombares, veja-se, v.g., Kei Roger Aoki, et al., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, patente de invenção norte-americana publicada com o n° 2004/0037852 (26 de Fev. de 2004); bem como de outros distúrbios neuromusculares, veja-se, v.g., Kei Roger Aoki, et al., Multiple Botulinum Toxins for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions, patente de invenção norte-americana publicada com o n° 2001/0021695 (13 de Set. de 2001); Kei Roger Aoki, et al., Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, patente de invenção norte-americana publicada com o n° 2002/0010138 (24 de Jan. de 2002); Kei Roger Aoki, et al., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain, patente de invenção norte-americana publicada com o n° 2004/0013692 (22 de Jan. de 2004), as quais se consideram aqui incorporadas por referência. Foram ainda propostas outras utilizações para as CoNT enquanto neuromoduladores biofarmacêuticos para abranger diversos tratamentos que visam determinados distúrbios que não apresentam uma base neuromuscular. Por exemplo, os efeitos sobre o sistema nervoso autónomo permitiram desenvolver uma terapêutica com toxina botulínica de serotipo A (BoNT/A) para o tratamento de hiperidrose axilar ou suor, tendo os estudos indicado que a BoNT/A pode ser um tratamento eficaz para a dor e tensão miofascial, acidente vascular cerebral, lesão cerebral traumática, paralisia cerebral, distúrbios da motilidade gastrointestinal, incontinência urinária, cancro e enxaquecas. Por último, são já conhecidas as aplicações cosméticas e outras aplicações terapêuticas. De facto, 3 prevê-se uma expansão da utilização de CoNT em tratamentos terapêuticos e cosméticos em seres humanos para uma variedade cada vez maior de doenças e alimentos que possam beneficiar das propriedades miorrelaxantes destas toxinas.

No documento WO 2004/029576 encontram-se descritos substratos e métodos à base de células que utilizam um substrato com base em FRET, no qual os fluoróforos dadores e aceitadores estão ligados a cada um dos lados do local de clivagem da toxina de clostrideo.

Utilizando estes substratos, através do método à base de células descrito é possível detectar quantidades da ordem de nM da toxina de clostrideo. Tentativas adicionais de optimização não conseguiram melhorar quer a sensibilidade (CE50) quer a relação sinal/ruído. Concluiu-se assim que tal abordagem não permitia detectar quantidades na ordem de pM da toxina, necessárias para desenvolver um ensaio que permitisse determinar a actividade de BoNT/A num recipiente do produto formulado.

No documento US 2006/0063222 encontram-se descritos dois tipos de substratos da toxina de clostrideo. O primeiro tipo de substrato compreende um único fluoróforo, um local de clivagem do substrato da toxina de clostrideo e um grupo volumoso como uma molécula individual. O segundo tipo de substrato compreende um fluoróforo dador, um local de clivagem do substrato da toxina de clostrideo e um aceitador como uma molécula individual. Os substratos D2 deverão conter um fluoróforo e um grupo volumoso. O primeiro tipo de substrato e os métodos utilizando este substrato têm por base os princípios de polarização de fluorescência e não os princípios de transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET). No que diz 4 respeito ao segundo tipo de substrato, D2 não destrói a novidade dos substratos reivindicados no presente, uma vez que estes deverão conter dois fluoróforos. A crescente utilização clinica e terapêutica de toxinas de clostrideo faz com que a indústria farmacêutica necessite de utilizar ensaios precisos para a actividade da toxina de clostrideo, por exemplo, para garantir formulações farmacêuticas precisas e monitorizar os padrões de controlo da qualidade convencionais. Além disso, devido ao perigo potencial associado a quantidades pequenas de toxinas de clostrideo em produtos alimentares, a indústria alimentar necessita de ensaios para a toxina de clostrideo, por exemplo, para validar novos métodos de empacotamento de alimentos e para garantir a segurança dos alimentos. A presente invenção proporciona novos ensaios da toxina de clostrideo para a determinação da presença ou da actividade da toxina de clostrideo toxina, que são úteis em diversas indústrias, tais como, v.g., as indústrias farmacêutica e alimentar, e proporciona também as vantagens a eles associados.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS A fig. 1 mostra um esquema de um ensaio FRET com base num corante lipofílico que é baseado em linhas celulares que contêm um substrato da toxina de clostrideo e um corante lipofílico, os quais estão incorporados na membrana celular. A fig. IA mostra um cenário de ensaio, no qual o substrato de toxina de clostrideo compreende o fluoróforo dador e é detectada a presença de um substrato de toxina de clostrideo não clivado. Após a excitação, a proteína fluorescente dadora emite uma luz fluorescente a um 5 comprimento de onda característico. No entanto, uma vez que o substrato não clivado está localizado na membrana, a proximidade estreita entre a proteína fluorescente dadora e o corante aceitador lipofílico permite uma transferência de energia eficiente. A emissão da proteína fluorescente excita o corante lipofílico, o qual por sua vez emite luz fluorescente no seu comprimento de onda característico. A detecção das emissões do corante lipofílico é indicativa da FRET e da presença de um substrato de toxina de clostrídeo não clivado. A fig. lb mostra um cenário de ensaio em que o substrato de toxina de clostrídeo compreende o fluoróforo dador e em que se detecta a presença de substrato de toxina de clostrídeo clivado. Após a excitação, a proteína fluorescente dadora emite luz fluorescente a um comprimento de onda característico. No entanto, devido ao produto de clivagem da proteína fluorescente do substrato de toxina de clostrídeo ser libertado no citoplasma, a distância entre o a proteína fluorescente dadora e o corante lipofílico aceitador excede a distância máxima permitida para uma transferência de energia eficiente. Assim, as emissões a partir da proteína fluorescente não excitam o corante lipofílico e não ocorre a FRET. Uma diminuição das emissões do corante lipofílico constitui um indicador de uma diminuição da FRET, uma diminuição do substrato de toxina de clostrídeo não clivado e, inversamente, um aumento em substrato de toxina de clostrídeo clivado. A fig. lc mostra um cenário de ensaio em que o corante lipofílico compreende um fluoróforo dador, sendo detectada a presença de um substrato de toxina de clostrídeo não clivado. Após excitação, o corante dador lipofílico emite luz fluorescente a um comprimento de onda característico. No 6 entanto, uma vez que o substrato de toxina de clostrídeo não clivado está localizado na membrana, a proximidade estreita entre o corante dador lipofílico e a proteína fluorescente aceitadora permite uma transferência de energia eficaz. A emissão do corante lipofílico excita a proteína fluorescente, a qual, por sua vez, emite luz fluorescente no seu comprimento de onda característico. A detecção das emissões da proteína fluorescente constitui um indicador da FRET e da presença de um substrato de toxina de clostrídeo não clivado. A fig. ld mostra um cenário de ensaio em que o corante lipofílico compreende o fluoróforo dador e é detectada a presença de substrato de toxina de clostrídeo clivado. Após excitação, o dador corado lipofílico emite luz fluorescente a um comprimento de onda característico. No entanto, uma vez que o produto de clivagem da proteína fluorescente do substrato de toxina de clostrídeo é libertado no citoplasma, a distância entre o corante dador lipofílico e a proteína fluorescente aceitadora excede a distância máxima permitida para uma transferência de energia eficaz. Assim, as emissões a partir do corante lipofílico não excitam a proteína fluorescente e não tem lugar a FRET. Uma diminuição nas emissões de proteína fluorescente constitui um indicador de uma diminuição da FRET, uma diminuição em substrato de toxina de clostrídeo não clivado e, inversamente, um aumento em substrato de toxina de clostrídeo clivado. Abreviaturas: PF, proteína fluorescente; CORANTE, corante lipofílico. A fig. 2 mostra um esquema do paradigma corrente do mecanismo de intoxicação para o tétano e a actividade da toxina botulina nos neurónios central e periférico. Este 7 processo de intoxicação pode ser descrito como sendo constituído por quatro passos: 1) ligação ao receptor, em que a toxina de clostrídeo se liga a um sistema receptor de clostrídeo e tem início o processo de intoxicação; 2) internalização complexa, na qual, após a ligação da toxina, uma vesícula que contém um complexo toxina/sistema receptor é submetido a endocitose na célula; 3) translocação da cadeia leve, na qual se crê que ocorram múltiplos eventos, incluindo as alterações no pH interno da vesícula, a formação de um canal de poros que compreende o domínio HN da cadeia pesada da toxina de clostrídeo, a separação da cadeia leve da toxina de clostrídeo a partir da cadeia pesada, a activação enzimática da cadeia leve; e a libertação da cadeia leve activada e 4) modificação enzimática dirigida, na qual a cadeia leve activada da toxina de clostrídeo efectua a clivagem proteolítica dos seus substratos SNARE alvos, tais como, v.g., SNAP-25, VAMP ou sintaxina. A fig. 3 mostra um esquema de proteínas SNARE. A fig. 3a mostra a organização do domínio geral de SNAP-25, VAMP e sintaxina, ilustrando as localizações aproximadas das regiões a-helicais (caixas a branco), motivos SNARE (caixas marcadas com as designações Sl, S2, S3, S4, VI, V2, XI ou X2) e os domínios de ancoragem na membrana (caixas a branco designadas por MA) . A fig. 3b mostra a organização helicoidal de um motivo SNARE. A fig. 4 mostra um esquema da localização subcelular e dos locais de clivagem de SNAP-25, VAMP e Sintaxina. A VAMP está localizada na membrana da vesícula sináptica, ao passo que a SNAP-25 e a Sintaxina estão localizadas na membrana plasmática. A BoNT/A e a BoNT/E clivam a SNAP-25 junto do terminal carboxilo, libertando nove ou 26 resíduos, respectivamente. As BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G e TeNT actuam sobre a porção central conservada de VAMP (caixa a branco) e libertam a metade citosólica do terminal amino da VAMP no citosol. A BoNT/Cl cliva a SNAP-25 junto do terminal carboxilo, bem como efectua a clivagem de Sintaxina num único local próximo da superfície da membrana citosólica. A acção da BoNT/Cl provoca a libertação de uma porção grande do domínio citosólico de Sintaxina, ao passo que apenas uma pequena porção de SNAP-25 é libertada por proteólise selectiva da BoNT/Cl. A fig. 5 mostra um mapa plasmídico da construção de expressão pOBI 25/SNAP-25206_GFP de um mamífero que codifica um terminal carboxilo do péptido GFP ligado funcionalmente ao péptido SNAP-25 de SEQ ID NO: 1. As abreviaturas utilizadas são as seguintes: Pcmv, região promotora de citomegalovírus; HcBoNT/A, composição de ácido nucleico que codifica o péptido SNAP-25 de SEQ ID NO: 1; GFP, uma região que codifica um péptido da Proteína de Fluorescência Verde; BGH pA, um local de poliadenilação da hormona de crescimento de bovinos; Neomicina, uma região que codifica um péptido aminofosfotransferase que confere resistência à Neomicina; pUC ori, uma origem pUC de uma região de replicação de plasmídeos; Ampicilina, uma região que codifica um péptido β-lactamase que confere resistência à Ampicilina. A fig. 6 mostra células PC12 transfectadas com um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente verde isolada (GFP), transfectada com um plasmídeo que codifica um substrato de toxina de clostrídeo isolado (GFP-SNAP252oe) , ou co-transfectadas com um plasmídeo que 9 codifica um substrato de toxina de clostrideo isolado (GFP-SNAP252o6) e um plasmideo que codifica a cadeia leve de BoNT/A (BoNT/A-LC). As células que expressam a proteína fluorescente verde isolada (GFP) apresentaram uma fluorescência dispersa ao longo da célula, incluindo no núcleo. Foram tiradas fotografias confocais, estando o plano no meio da célula. As células que expressam o substrato de toxina de clostrideo isolado (GFP-SNAP252o6) apresentaram uma fluorescência na membrana de plasma do corpo celular e dos neuritos. As células que co-expressam o substrato de toxina de clostrideo e a BoNT/A de cadeia leve (GFP-SNAP-25206r BoNT/A-LC) exibem uma perda da localização da fluorescência da GFP na membrana plasmática. Em vez disso, a fluorescência da GFP acumula-se em algumas áreas do citoplasma. A fig. 7 mostra a análise por Western blot que identifica as células com uma elevada afinidade de captação para uma toxina de clostrideo. A fig. 7a mostra uma análise de Western blot utilizada para identificar células que sejam capazes de captar a BoNT/A. 0 blot mostra cinco linhas celulares tratadas com BoNT/A pura 1 nM de um dia para o outro, tendo sido carregadas quantidades iguais de proteína por pista e sondadas com um anticorpo que detecta o produto de clivagem de BoNT/A SNAP-25i97. A fig. 7b mostra a análise por Western blot utilizada para avaliar o tempo necessário para a captação de BoNT/A. Os blots mostram células neuro-2A ou células SH-SY5Y tratadas com BoNT/A pura 1 nM, para diferentes intervalos de tempo, com quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo que detecta o produto de clivagem de BoNT/A SNAP-25i97. A fig. 7c mostra a análise por Western 10 blot utilizada para avaliar o intervalo de concentrações necessário para a captação de BoNT/A. Os blots mostram células neuro-2A tratadas com um intervalo de concentrações de BoNT/A pura de um dia para o outro, utilizando quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo que detecta o produto de clivagem de BoNT/A SNAP-25197 . A fig. 8 mostra a análise por Western blot que identifica as células com uma elevada afinidade de captação para uma toxina de clostrídeo. A fig. 8a mostra uma análise de Western blot utilizada para identificar células que sejam capazes de captar a BoNT/E. O blot superior mostra células neuro-2A e células SH-SY5Y tratadas com 10 nM ou com 100 nM de BoNT/A de di-cadeia durante a noite, com quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta o substrato SNAP-252o6 não clivado e o produto de clivagem BoNT/E SNAP-25i8o· O blot inferior mostra diversas células tratadas com 20 nM de BoNT/E di-cadeia, com quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo para o substrato SNAP-252o6 não clivado e para o produto de clivagem de BoNT/E SNAP-25iso· A fig. 8b mostra a análise por Western blot utilizada para determinar o intervalo de tempo para a captação de BoNT/E. Os blots mostram células SH-SY5Y tratadas com 5 nM ou com 20 nM de BoNT/E de di-cadeia durante 4 horas ou durante 8 horas, com quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta o substrato SNAP-25206 não clivado e o produto de clivagem de BoNT/E SNAP-25i8o· A fig. 8c mostra 11 uma análise de Western blot utilizada para avaliar o intervalo de concentrações necessário para a captação de BoNT/E. Os blots mostram células SK-N-DZ tratadas com um intervalo de concentrações de BoNT/E de di-cadeia durante aproximadamente 6 horas, com quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta o substrato SNAP-252o6 não clivado e o produto de clivagem BoNT/E SNAP-25i80. A fig. 9 mostra uma análise de análise de Western blot para avaliar os efeitos dos tratamentos utilizados para aumentar a captação de uma toxina de clostrídeo. A fig. 9a mostra a análise de Western blot para avaliar os efeitos do tratamento com gangliósidos na captação de BoNT/A. Os blots mostram células neuro-2A não tratadas ou tratadas com 25 pg/mL de GTlb (- ou +) e expostas, durante a noite, a três concentrações diferentes de BoNT/A (12,5 pM, 25 pM ou 50 pM) , com quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo que detecta o produto de clivagem BoNT/A SNAP-25i97. A fig. 9b mostra a análise de Western blot para avaliar os efeitos de diferenciação celular na captação de BoNT/A. Os blots mostram as células neuro-2A ou as células SH-SY5Y tratadas com 2 nM de BoNT/A pura, durante a noite, as quais foram deixadas desenvolver em meio isento de soro ou em diversos reagentes de diferenciação (lonomicina, db-cAMP, ácido retinóico, neuraminidase ou N2) , com quantidades iguais de proteína carregada por pista e sondadas com um anticorpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta o substrato SNAP-25206 não clivado e o produto de clivagem BoNT/A SNAP-25i97. 12 A fig. 10 mostra a análise de Western blot para avaliar os efeitos dos tratamentos utilizados para aumentar a captação da toxina de clostrideo. A fig. 10a mostra uma análise de Western blot para avaliar os efeitos do tratamento com gangliósidos na captação de BoNT/E. O blot mostra as células neuro-2A tratadas com 25 pg/mL de GTlb, GQlb, GDla, GDlb ou GD3 e expostas, durante aproximadamente 5 horas, a BoNT/E de di-cadeia 14 nM, com quantidades iguais de proteina carregada por pista e sondadas com um anticorpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta o substrato SNAP-252o6 não clivado e o produto de clivagem BoNT/E SNAP-25i8o· A fig. 10b mostra a análise de Western blot para avaliar os efeitos da diferenciação celular na captação de BoNT/E. Os blots mostram células NI E-115, células SH-SY5Y, células SK-N-DZ ou células NG108-15 tratadas com BoNT/E de di-cadeia a 0 nM, 2 nM ou 2 0 nM, durante aproximadamente 6 horas, as quais foram deixadas desenvolver em meio isento de soro, com quantidades iguais de proteina carregada por pista e sondadas com um anticorpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta o substrato SNAP-252o6 não clivado e o produto de clivagem BoNT/E SNAP-25iso· A fig. 11 mostra a detecção da FRET numa linhagem celular de neuro-2A que expressam SNAP25206“GFP, que foram coradas com um dos seguintes corantes lipofílicos: 'Dil

Vibrant', DilCi8(3), DilC18-DS, SP-DilCi8, 5-5 ’ -Ph2DilC18 ou DiD. As placas foram expostas a laser 488 nm para a excitação do fluoróforo dador GFP. Recolheu-se a emissão com um filtro a 610 nm ± 30 nm para detectar a fluorescência encarnada dos diversos aceitadores corados lipofílicos. O aumento da fluorescência nas células que 13 expressam SNAP252o6_GFP em comparação com os controlos não transfectados foi devido à transferência de energia a partir de GFP para o aceitador corado lipofilico. A fig. 12 mostra o efeito do tratamento com BoNT/A na FRET entre SNAP25206_GFP e um corante lipofilico localizado na membrana de células neuro-2A. A fig. 12a mostra as placas em que as células foram expostas, de um dia para o outro, a BoNT/A 0 nM (controlo, sem toxina) ou a BoNT/A 5 nM, sendo depois carregadas durante duas horas com o corante lipofilico indicado: sem controlo com corante, Dil Vibrant, DilCi8(3), SP-DilCi8, 5-5'-Ph2DilCi8 ou DiD. As placas foram expostas a um laser de 488 nm num dispositivo 'Amersham Typhoon 9140 Imager' para excitar o fluoróforo dador GFP. As emissões foram recolhidas com um filtro a 610 nm ± 30, de tal modo que seja detectada a fluorescência vermelha dos diversos corantes lipofilicos. A fig. 12b mostra a fluorescência detectada em cada cavidade, a qual foi quantificada utilizando o programa informático 'Typhoon 9140' . A quantidade de emissão de fluorescência a 610 nm, após excitação a 488 nm, foi determinada em termos de volume. Para a normalização dos dados para cada combinação de corante, os valores de fluorescência a 610 nm não tratados foram representados sob a forma de percentagem da emissão de fluorescência a partir de células de controlo que continham o corante lipofilico, as quais não tinham sido tratadas com a toxina, sendo os valores lidos a 610 nm para a normalização dos dados para cada combinação de corante. A fig. 13 mostra o gráfico dose-resposta de células neuro-2A que expressam SNAP25206_GFP para o corante lipofilico DilCis (3), tratado com BoNT/A 1 nM. As células 14 foram expostas durante 6 horas a concentrações diferentes de DilCi8(3), as quais estavam compreendidas entre 0,5 μΜ e 10 μΜ, conforme indicado. Quantificou-se a fluorescência utilizando o programa informático 'Typhoon 9140', com uma excitação a 488 nm e uma emissão a 610 nm. As maiores diferenças entre o controlo e as células tratadas foram observadas a uma concentração de corante de 1,25 μΜ e 2,5 μΜ, carregado durante 6 horas. A fig. 14 mostra o gráfico dose-resposta de células SH-SY5Y que expressam SNAP25206_GFP para o corante lipofilico DilCis(3) e para o corante catiónico lipofílico octadecilrodamina. As células de controlo e as células que expressam SNAP25206_GFP foram expostas, até um máximo de 6 horas, a concentrações de (14a) DilCi8(3) ou (14b) octadecilrodamina. Após excitação a 488 nm, detectou-se emissão de fluorescência a 610 nm e quantificou-se utilizando o programa informático 'Typhoon 9140' . A fig. 15 mostra o gráfico dose-resposta de células neuro-2A diferenciadas que expressam SNAP25206_GFP, tratadas com BoNT/A com doses compreendidas entre 0,05 nM e 20 nM, tendo sido determinados num ensaio FRET com base no corante lipofilico. A fig. 15a mostra a perda de FRET, a qual é expressa, após exposição durante 16 horas a BoNT/A, sob a forma de percentagem de fluorescência, determinada a 610 nm, de células não tratadas com toxina coradas com

DilCi8(3) . A fig. 15b mostra a perda de FRET, a qual é expressa, após exposição durante 3 dias a BoNT/A, sob a forma de percentagem de fluorescência, determinada a 610 nm, de células não tratadas com toxina coradas com

DilC18(3) . 15 A fig. 16 mostra o gráfico dose-resposta de células SH-SY5Y diferenciadas que expressam SNAP25206-GFP, tratadas durante 24 horas com BoNT/E de di-cadeia com doses compreendidas entre 0,005 nM e 200, e determinada num ensaio FRET com base no corante lipofilico. A curva CE50 foi determinada utilizando o programa informático 'SigmaPlot/SigmaStat' . A fig. 17 mostra o gráfico dose-resposta de células neuro-2A que expressam SNAP252o6-GFP, tratadas de um dia para o outro com BoNT/A, utilizando placas de cultura de tecidos pretas e com o fundo transparente. A fig. 17a mostra o gráfico dose-resposta de células neuro-2A que expressam SNAP25206_GFP, tratadas de um dia para o outro com BoNT/A a doses compreendidas entre 0,002 nM e 10 nM, e determinadas num ensaio FRET com base no corante lipofilico. A fig. 17b mostra uma curva CE50 calculada com os dados obtidos a partir da fig. 17a, utilizando o programa informático 'SigmaPlot/SigmaStat'. A fig. 18 mostra o gráfico dose-resposta de células neuro-2A que expressam SNAP252o6~GFP, tratadas de um dia para o outro com BoNT/A, utilizando placas de cultura de tecidos pretas com o fundo transparente. A fig. 18a mostra o gráfico dose-resposta de células neuro-2A que expressam SNAP252o6_GFP, tratadas durante 3 dias com BoNT/A com doses compreendidas entre 0,002 nM e 10 nM, e determinadas no ensaio FRETY com base no corante lipofilico. A fig. 18b mostra a curva CE50 calculada com os dados obtidos a partir da fig. 18a, utilizando o programa informático 'SigmaPlot/SigmaStat' . 16

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona novos ensaios para determinar a presença ou a ausência de uma toxina de clostrídeo activa numa amostra e para determinar a actividade de uma toxina de clostrídeo, incluindo a toxina de botulina de todos os serotipos e a toxina do tétano. Os novos ensaios de transferência de energia de ressonância por fluorescência da invenção têm por base células nas quais um corante lipofílico ou outro aceitador está associado a uma membrana, por exemplo, associado com a membrana de plasma. As novas células e os novos ensaios com base em células da invenção fazem diminuir a necessidade de estudos de toxicidade em animais, servindo para analisar as múltiplas funções de toxinas, nomeadamente, a ligação e a captação celular de toxinas, as translocação para o citosol da célula e a actividade de protease. Conforme a seguir se descreve, as novas células e os novos métodos da invenção podem ser utilizados para analisar amostras impuras e não tratadas, bem como toxinas de di-cadeia altamente purificadas e produtos formulados de toxinas, sendo ainda sensíveis a formatos de ensaios automatizados de elevado rendimento.

Os ensaios de transferência de energia de ressonância por fluorescência com base em células, têm por base células, tais como células neuronais, que sejam capazes de absorver eficazmente a toxina de clostrídeo e que compreendem um substrato de toxina de clostrídeo que contém um dador ou um aceitador de FRET. 0 segundo componente do par de FRET, tal como um corante lipofílico, também está associado à membrana, em separado. A título exemplificativo, uma célula útil de acordo com a invenção 17 pode expressar um proteína de fusão SNAP25206_P^oteína fluorescente verde (GFP) (absorvância 488 nm, emissão 520 nm), que está localizada na membrana plasmática. A FRET tem lugar entre a GFP dadora de fluoróforos e o aceitador corado lipofílico localizado na membrana de plasma e que possui um espectro de absorvância que se sobrepõe ao espectro de emissão da GFP e um espectro de emissão que é desviado de um modo adequado do apresentado pela GFP. A transferência de energia entre a GFP e o aceitador corado lipofílico é observada, por exemplo, sob a forma de fluorescência encarnada, que representa a emissão a partir do corante lipofílico (veja-se a fig. la). Durante o tratamento com BoNT/A de células que expressam SNAP252o6_ GFP, as quais foram coradas com um aceitador corado lipofílico adequado, tal como DilCis(3), observa-se uma emissão encarnada a 610 nM. Após a clivagem do substrato SNAP2 52o6_GFP , a GFP é libertada para o citoplasma da célula. Durante a excitação da GFP dadora de fluoróforos com um laser, a GFP é excitada e emite luz a 520 nM. No entanto, uma vez que a transferência de energia não pode ter lugar entre a GFP citoplásmica e o corante lipofílico localizado na membrana plasmática, a FRET não ocorre, observando-se uma diminuição na emissão vermelha a 610 nM (veja-se a fig. lb).

Aspectos da presente invenção proporcionam uma célula isolada constituída por (a) um substrato de toxina de clostrídeo associado à membrana que compreende (i) um primeiro membro de um par de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET); (ii) uma sequência de reconhecimento de toxina de clostrídeo, incluindo um local de clivagem e (iii) um domínio dirigido à membrana, e (b) 18 um segundo membro associado à membrana do par de FRET, em que o segundo membro do par de FRET é um corante lipofílico e (c) um receptor que se liga à toxina de clostrídeo, em que a célula é capaz se ser intoxicada com a toxina de clostrídeo; em que o par de FRET compreende um aceitador que possui um espectro de absorvância que se sobrepões ao espectro de emissão de um fluoróforo dador; e em que, sob as condições adequadas, a transferência de energia de ressonância tem lugar é exibida entre o aceitador e o fluoróforo dador.

Outros aspectos da presente invenção proporcionam a célula neuronal respectiva.

Outros aspectos da presente invenção proporcionam um método para determinar a actividade da toxina de clostrídeo, o qual consiste em (a) fazer contactar uma célula, conforme descrita antes, com um amostra; (b) excitar o fluoróforo dador; (c) detectar a transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula contactada, comparativamente com uma célula de controlo submetida aos passos (b) - (c) , em que a diferença na transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula contactada em comparação com a célula de controlo constitui um indicador da actividade da toxina de clostrídeo.

Outros aspectos da presente invenção proporcionam o referido método para determinar a actividade de BoNT/A.

Outros aspectos da presente invenção proporcionam o referido método para determinar a actividade de BoNT/E.

As bactérias do género Clostridia são estritamente anaeróbicas em relação a bacilos formadores de esporos aero-tolerantes encontrados no solo, em sedimentos de água 19 doce e água salgada, em pós domésticos, na superfície de alimentos e em fezes, bem como na flora intestinal normal de seres humanos e animais. Embora a maior parte das espécies isoladas seja gram positivo, há algumas espécies gram negativas. Os membros deste género produzem exotoxinas sofisticadas, as quais se encontram entre as toxinas mais potentes do mundo. A exposição a estas toxinas no decurso de uma infecção com clostridia constitui a causa principal subjacente à patogénese da doença. A clostridia constitui a maior ameaça à saúde dos seres humanos e dos animais, sendo responsável por muitas doenças, incluindo botulismo, tétano, gangrena gasosa, colite pseudomembranosa e envenenamento alimentar. Por exemplo, as Clostridium argentinense, C. bifermentans, C. histolyticum, C. novyi, C. septicum, C. sporogenes e C. tertium são agentes etiológicos para a gangrena gasosa. A C. perfringens é responsável por doenças de origem alimentar, enterite necrosante, ao passo que a C. difficile é responsável por enterocolite pseudomembranosa. Tanto a C. baratii como a C. butyricum são agentes causadores de uma forma de botulismo de origem alimentar, intestinal e em feridas. No entanto, é interessante que apenas algumas espécies destas bactérias são patogénicas para os seres humanos, sendo a maior parte saprófitas. Assim, na maior parte dos casos, a Clostridia são patogéneos oportunistas que infectam o hospedeiro que tenha o estado de saúde comprometido.

De todas as Clostridia, a Clostridium botulinum e a Clostridium tetani produzem as toxinas biológicas mais potentes conhecidas e são os agentes causadores das síndromes neuroparalíticas, botulismo e tétano. Foram já identificados setes tipo distintos antigénicos de toxinas 20 de botulina (BoNT) durante a investigação de surtos de botulismo em seres humanos (BoNT/A, /B, /E e /F) , em animais (BoNT/Cl e /D) ou isolados no solo (BoNT/G) . As BoNT possuem uma identidade em aminoácidos de aproximadamente 35% entre si e partilham a mesma organização funcional de domínio e arquitectura estrutural global. As sequências de aminoácidos de oito tipos de toxina de clostrídeo foram obtidas a partir dos genes correspondentes (Niemann, "Molecular Biology of clostridial Neurotoxins", em Sourcebook of Bacterial Protein Toxins Alouf and Freer (Eds.), págs. 303-348 London: Academic Press 1991). É do conhecimento dos especialistas na matéria que para cada tipo de toxina de clostrídeo podem existir diversas estirpes que diferem em alguma parte na sua sequência de aminoácidos e também nos ácidos nucleicos que codificam essas proteínas. Embora todos os setes serotipo de BoNT apresentem uma estrutura e propriedades farmacológicas idênticas, cada um delas também apresentam características bacteriológicas heterogéneas. Pelo contrário, a toxina do tétano (TeNT) é produzida por um grupo uniforme de C. tetani. Há duas outras espécies de clostridia, a C. baratii e a C. butyricum, que também produzem toxinas semelhantes a BoNT/F e BoNT/E, respectivamente.

Cada uma das toxinas de clostridia (CoNT) é traduzida como um polipeptido de cadeia única com aproximadamente 150 kDa, que é subsequentemente clivada por cisão com uma espira dissulfureto por proteases de bactérias ou de tecidos. Este processamento pós-tradução dá origem a uma molécula com uma di-cadeia constituída por uma cadeia leve (LC) aproximadamente com 50 kDa e uma cadeia pesada (HC) 21 aproximadamente com 100 (HC), unidas por uma ligação dissulfureto individual e interacções não covalentes. Cada molécula de di-cadeia madura compreende três dominios funcionais distintos: 1) um domínio enzimático localizado na LC que inclui uma região metaloprotease que contém uma actividade endopeptidase dependente de zinco, que é dirigida particularmente para os componentes nucleares do aparelho de libertação de neurotransmissores; 2) um domínio de translocação contido ma metade do terminal amino da HC (Hn) , o qual facilita a libertação da toxina a partir das vesículas intracelulares no citoplasma da célula alvo; e 3) um domínio de ligação localizado na metade do terminal carboxilo da HC (Hc) , que determina a actividade de ligação e a especificidade de ligação da toxina ao complexo receptor localizado na superfície da célula alvo.

As actividades de ligação, de translocação e eznimática destes três domínios funcionais são todas necessárias para a toxicidade. Embora não se saiba minuciosamente todos os detalhes deste processo, o mecanismo de intoxicação celular global, no qual as CoNT penetram num neurónio e inibem a libertação do neurotransmissor é semelhantes, independentemente do tipo. Embora a requerente não pretenda ser limitada pela seguinte descrição, o mecanismo de intoxicação pode ser descrito como sendo constituído por quatro passos: 1) ligação ao receptor, 2) internalização do complexo, 3) translocação da cadeia leve e 4) modificação enzimática dirigida (veja-se a fig. 2) . O processo é iniciado quando o domínio Hc de uma CoNT se liga a um complexo de receptor específico de CoNT localizado na superfície da membrana plasmática de uma célula alvo. Crê-se que a especificidade de ligação de um 22 complexo receptor é alcançada, em parte, por meio de combinações especificas de gangliósidos e de receptores de proteínas gue parece compreenderem de forma distinta cada complexo receptor de toxina de clostrídeo. Uma vez ligado, os complexos CoNT/receptor são internalizados por endocitose e as vesículas internalizadas são separadas para vias intracelulares específicas. 0 passo de translocação parece ser iniciado pela acidificação do compartimento da vesícula. Este processo parece iniciar dois rearranjos estruturais importantes dependentes do pH, gue fazem aumentar a hidrofobicidade e promovem a activação enzimática da toxina. Uma vez activada, a endopeptidase de cadeia leve da toxina é libertada a partir da vesícula intracelular para o citosol, onde é dirigida especificamente a um dos três componentes nucleares conhecidos do aparelho de libertação de neurotransmissores. Três destas proteínas nucleares, proteína da membrana associada à vesícula (VAMP)/sinaptobrevina, proteína associada a sinaptossomal com 25 kDa (SNAP-25) e sintaxina, são necessárias para a ancoragem e fusão da vesícula sináptica no terminal nervoso, constituindo os membros da família das SNARE ( 'soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein-receptor') (veja-se a fig. 3). A proteólise selectiva de SNARE sinápticas contabiliza o número total de blocos de neurotransmissores libertados provocado pelas toxinas de clostrídeo in vivo. Os alvos proteicos SNARE das toxinas de clostrídeo são comuns à exocitose em diversos tipos não neuronais; nestas células, tais como nos neurónios, a actividade de peptidase de cadeia leve inibe a exocitose, veja-se, v.g., Yann Humeau et al.r How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block 23

Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sei. 552-558. (2002); M. Zouhair Atassi, Basic and Therapeutic Aspects of Botulinum and Tetanus Toxins, (Dirk W. Dressler & Joseph J. Jankovic eds., 2003); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003), as quais se consideram aqui incorporadas por referência. A TeNT e a BoNT/B, /D, /F e /G reconhecem especificamente a VAMP (também conhecida como sinaptobrevina), que é uma proteína integral da membrana da vesícula sináptica. A VAMP é clivada em ligações diferentes em função da toxina. A BoNT/A e /E reconhecem e clivam especificamente a SNAP-25, que é uma proteína da membrana pré-sináptica, em dois locais diferentes na porção do terminal carboxilo da proteína. A BoNT/Cl cliva a sintaxina, que é uma proteína da plasmalema do nervo, para além da SNAP-25. As três proteínas alvo das CoNT são conservadas a partir de leveduras para os seres humanos, embora os locais de clivagem e a susceptibilidade da toxina não sejam necessariamente conservadas, veja-se infra; ver também, v.g., Humeau, supra, (2000); Heiner Niemann et al., clostridial neurotoxins: new tools for dissecting exocytosis, 4(5) Trends Cell Biol. 179-185 (1994); e Rossella Pellizzari et al., Tetanus and botulinum neurotoxins: mechanism of action and therapeutic uses, 354(1381) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei.259-268 (1999).

Os alvos naturais das toxinas de clostrideo incluem VAMP, SNAP-25 e sintaxina. A VAMP está associada com a membrana da vesícula sináptica, ao passo que a SNAP-25 e a sintaxina estão associadas com a membrana plasmática (veja-se a fig. 4) . A BoNT/A e a BoNT/E clivam a SNAP-25 na região do terminal carboxilo, libertando um segmento com nove ou vinte e seis aminoácidos, respectivamente, e a BoNT/Cl também cliva a SNAP-25 junto ao terminal carboxilo. Os serotipos de botulina, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F e BoNT/G, e a toxina do tétano, actuam sobre a porção central conservada da VAMP, e libertam a porção do terminal amino da VAMP no citosol. A BoNT/Cl cliva a sintaxina num único local próximo da superfície citosólica da membrana. Assim, a proteólise de BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT provoca a libertação de uma grande porção do domínio citosólico da VAMP ou da sintaxina, ao passo que apenas uma pequena porção de SNAP-25 é libertada pela clivagem de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, veja-se, v.g., Humeau et al.r supra, (2000); Turton et al., supra, (2002); Lalli et al., supra (2 0 03) .

Drosophila A SNAP-25 que ocorre naturalmente, que é uma proteína com cerca de 20 6 resíduos à qual lhe falta um segmento transmembranar, está associada à superfície citosólica do plasmalema do nervo (veja-se a fig. 4). A SNAP-25 é necessária para o crescimento axonal durante o desenvolvimento e pode ser necessária para a plasticidade terminal do nervo no sistema nervoso maduro. A SNAP-25 foi já isolada a partir de diversas espécies de vertebrados e invertebrados, incluindo, v.g., espécies que pertencem ao género Homo, Macaca, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Carassius, Danio, Torpedo, Xenopus, Strongylocentrotus, 25

Hirudo, Loligo, Lymnaea e Caenorhabditis. Em seres humanos, há pelo menos duas isoformas que são diferencialmente expressas durante o desenvolvimento; a isoforma a é expressa constitutivamente durante o desenvolvimento fetal, ao passo que a isoforma b surge no nascimento e é predominante no estado adulto. Os análogos de SNAP-25, tais como SNAP-23, também são expressos fora do sistema nervoso, por exemplo, em células pancreáticas. A VAMP que ocorre naturalmente é uma proteína com cerca de 120 resíduos, dependendo o comprimento exacto das espécies e da isoforma. Conforme ilustrado na fig. 4, a VAMP contém um segmento curto no terminal carboxilo dentro do lúmen da vesícula, ao passo que a maior parte da molécula está exposta ao citosol. Os trinta resíduos do terminal amino enriquecidos em prolina são divergentes entre as espécies e as isoformas, ao passo que a porção central de VAMP (resíduos 30 a 96) , que é rica em resíduos carregados e hidrofílicos e inclui locais de clivagem conhecidos, é bastante conservada. A VAMP está co-localizada com a sinaptofisina nas membranas da vesícula sináptica. A VAMP foi já isolada a partir de diversas espécies de vertebrados e de invertebrados, incluindo, v.g., espécies pertencentes ao género Homo, Macaca, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Danio, Torpedo, Xenopus,

Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea, Aplysia e Caenorhabditis. Além disso, foram já identificadas múltiplas isoformas de VAMP, incluindo VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3/celubrevina, e foram já identificadas formas insensíveis à clivagem de toxinas em células não neuronais. A VAMP parece estar presente em todos os tecidos de vertebrados, embora a distribuição de VAMP-1 e VAMP-2 26 varie em tipos diferentes de células. A VAMP-1 de galinhas e ratos não é clivada pela TeNT ou pela BoNT/B. Estes ortólogos de VAMP-1 apresentam um resíduo valina em vez de glutamina que está presente na VAMP -1 de humanos e de murganhos, no local de clivagem de TeNT ou BoNT/B. A substituição não afecta a BoNT/D, /F ou / G, que clivam a VAMP-1 e VAMP-2 com taxas semelhantes. A sintaxina que ocorre naturalmente está localizada na superfície citosólica da plasmalema do nervo e é ancorada à membrana por meio de um segmento do terminal carboxilo, estando a maior parte da proteína exposta ao citosol (veja-se a fig. 4). A sintaxina está co-localizada com os canais de cálcio nas zonas activas da membrana pré-sináptica, nas quais tem lugar a libertação de neurotransmissores. Além disso, a sintaxina interactua com a sinaptotagmina, que é uma proteína da membrana SSV que forma uma ponte funcional entre o plasmalema e as vesículas. A sintaxina foi já isolada a partir de diversas espécies de vertebrados e invertebrados, incluindo, v.g., espécies pertencentes ao género Homo, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Danio, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea e Aplysia. Foram já identificadas três isoformas com comprimentos ligeiramente diferentes (285 e 288 resíduos) em células nervosas (isoformas ΙΑ, 1B1 e 1B2), sendo as isoformas 2, 3, 4 e 5 expressas em outros tecidos. As isoformas diferentes apresentam sensibilidades distintas face a BoNT/Cl, sendo as isoformas ΙΑ, 1B1, 1B2, 2 e 3 de sintaxina clivadas por esta toxina.

As composições e os métodos da presente memória descritiva proporcionam uma célula isolada que compreende, em parte, um substrato de toxina de clostrídeo. Por 27 definição, um substrato de toxina de clostrídeo é susceptível a clivagem pelo menos por uma toxina de clostrídeo sob condições adequadas para a actividade de protease da toxina de clostrídeo. A seguir, são aqui apresentados diversos substratos da toxina de clostrídeo. São descritos outros substratos da toxina de clostrídeo por, v.g., Lance E. Steward, et al., FRET Protease Assays for clostridial Toxins, patente de invenção norte-americana publicado com o n° 2003/0143651 (31 de Jul. de 2003); Lance E. Steward, et al., FRET Protease Assays for Botulinum Serotype A/E Toxins, patente de invenção norte-americana publicado com o n° 2003/0143650 (31 de Jul. de 2003); e Ester Fernandez-Salas, et al., Cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Assays for clostridial Toxins, patente de invenção norte-americana publicado com o n° 2004/0072270 (15 de Abr. De 2004) .

Os substratos da toxina de clostrídeo descritos na presente memória descritiva compreendem, em parte, uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo, incluindo um local de clivagem. Tal como aqui utilizado, a expressão "sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo" designa uma ligação císsil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficiente para ocorrer uma proteólise detectável na ligação cissil por meio de uma toxina de clostrídeo, sob condições adequadas para a actividade de protease da toxina de clostrídeo. A seguir, são aqui apresentadas diversas sequências de reconhecimento da toxina de clostrídeo.

De acordo com aspectos da presente invenção, como substratos de toxina de clostrídeo úteis refere-se péptidos e peptidomiméticos, bem como formas obtidas a partir 28 destes. Tal como aqui utilizado, o termo "peptidomimético" é utilizado num sentido amplo para designar uma molécula de tipo péptido que é clivada pela mesma toxina de clostrideo do que o substrato péptido, no qual é estruturalmente baseado. Tais peptidomiméticos incluem péptidos quimicamente modificados, moléculas do tipo péptido que contêm aminoácidos que ocorrem não naturalmente, e peptóides, que são moléculas de tipo péptido que têm origem na junção oligomérica de glicinas N-substituidas, e são clivadas pela mesma toxina de clostrideo do que o substrato peptidico, a partir do qual se obteve o peptidomimético, veja-se, v.g., Goodman & Ro, Peptidomimétics for Drug Design, págs. 803-861, na obra "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery", Vol. 1 (ed. M.E. Wolff; John Wiley & Sons 1995). São conhecidos na especialidade diversos peptidomiméticos, incluindo, por exemplo, moléculas do tipo péptido que contêm um aminoácido constrangido, um componente não peptidico que imita a estrutura secundária do péptido ou um isostere com uma ligação amida. Um peptidomimético que contém um aminoácido constrangido que não ocorre naturalmente pode incluir, por exemplo, um aminoácido α-metilado; um ácido carboxilico a,β-dialquil-glicina ou α-aminocicloalcano; um aminoácido Na-Ca cíclico; um aminoácido Na-metilado; um ácido carboxilico β- ou y-amino-cicloalcano; um aminoácido a,β-insaturado; um aminoácido de β,β-dimetilo ou β-metilo; um aminoácido de β-substituído-2,3-metano; um aminoácido NC5 ou Ca-Cõ cíclico; ou uma prolina substituída ou um outro mimético aminoácido. Além disso, um peptidomimético que imite a estrutura secundária de um péptido pode conter, por exemplo, um 29 mimético não peptídico à volta de β; um mimético à volta de γ; um mimético com uma estrutura helicoidal, cada um dos quais é bem conhecido na especialidade. Um peptido mimético também pode ser uma molécula do tipo péptido que contém, por exemplo, um isostere com uma ligação amida, tal como uma modificação tero-invertida; uma ligação amida reduzida; uma ligação metilenotio-éter ou metileno-sulfóxido; uma ligação metileno-éter; uma ligação etileno; uma ligação tioamida; uma ligação trans-olefina ou fluoro-olefina; um anel tetrazole 1,5-dissubstituido; uma ligação cetometileno ou fluorocetometileno ou outro isoster de amida. Será evidente para um especialista na matéria que estes e outros peptidomiméticos estão abrangidos pelo âmbito do termo "peptido mimético", conforme aqui utilizado.

De acordo com outras variantes, um substrato de toxina de clostrideo útil na invenção é um péptido ou um peptidomimético que possui um comprimento definido. Um substrato de toxina de clostrideo pode ser, por exemplo, um péptido ou um peptidomimético que possui pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350 ou pelo menos 500 resíduos. De acordo com outras variantes, um substrato de toxina de clostrideo possui no máximo 20 resíduos, no máximo 30 resíduos, no máximo 40 resíduos, no máximo 50 resíduos, no máximo 100 resíduos, no máximo 150 resíduos, no máximo 200 resíduos, no máximo 250 resíduos, no máximo 300 resíduos, no máximo 350 resíduos ou no máximo 400 resíduos.

De acordo com aspectos da invenção, são úteis diversas sequências de reconhecimento da toxina de clostrideo. São já conhecidas na especialidade locais de clivagem específicos e distintos para diferentes toxinas de 30 clostrídeo. A BoNT/A cliva uma ligação Gln-Arg; a BoNT/B e a TeNT clivam uma ligação Gln-Phe; a BoNT/Cl cliva uma ligação Lys-Ala ou Arg-Ala; a BoNT/D cliva uma ligação Lys-Leu; a BoNT/E cliva uma ligação Arg-Ile; a BoNT/F cliva uma ligação Gln-Lys e a BoNT/G cliva uma ligação Ala-Ala (veja-se o quadro 1) . De acordo com a nomenclatura convencional, a sequência à volta do local de clivagem da toxina de clostrídeo é designado por P5-P4-P3-P2-PI-P1' -P2' -P3' -P4' -P5' , em que P1-P1' representa a ligação císsil. Faz-se observar que um local Pi ou Pi', ou ambos, podem ser substituídos com um outro aminoácido ou com um mimético de aminoácido em vez do resíduo que ocorre naturalmente. A título exemplificativo, foram preparados substratos de BoNT/A em que a posição Pi (Gin) é modificada para ser um resíduo alanina, ácido 2-aminobutírico ou asparagina; estes substratos foram hidrolizados por BoNT/A na ligação Pi-Arg, veja-se, v.g., James J. Schmidt & Karen A Bostian, Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin, 16(1) J. Protein Chem. 19-26 (1997). Embora seja reconhecido que é possível introduzir substituições na posição Pi da ligação císsil, por exemplo, uma ligação císsil BoNT/A, é ainda reconhecido que a conservação do resíduo Pi' pode ser vantajosa, v.g., Vadakkanchery V. Vaidyanathan et al., Proteolysis of SNAP-25 isoforms by botulinum neurotoxin types A, C, and E: domains and amino acid residues controlling the formation of enzyme-substrate complexes and cleavage, 72(1) J Neurochem. 327-337 (1999). 31 QUADRO 1 Ligações clivadas em VAMP—2, SNAP—25 ou Sintaxina—1 humanas Toxina Alvo P4-P3-P2-P1-P1' -p2 ' -p3'-P4' SEQ ID NO: BoNT/A SNAP-25 Glu-Ala-Asn-Gln-Arg*-Ala-Thr-Lys 96 BoNT/B VAMP-2 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe*-Glu-Thr-Ser 97 BoNT/Cl Sintaxina-1 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala*-Val-Lys-Tyr 98 BoNT/Cl SNAP-25 Ala-Asn-Gln-Arg-Ala*-Thr-Lys-Met 99 BoNT/D VAMP-2 Arg-Asp-Gln-Lys-Leu*-Ser-Glu-Leu 100 BoNT/E SNAP-25 Gln-Ile-Asp-Arg-Ile*-Met-Glu-Lys 101 BoNT/F VAMP-2 Glu-Arg-Asp-Gln-Lys*-Leu-Ser-Glu 102 BoNT/G VAMP-2 Glu-Thr-Ser-Ala-Ala*-Lys-Leu-Lys 103 TeNT VAMP-2 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe*-Glu-Thr-Ser 104 * Ligação císsil apresentada a negrito

Assim, de acordo com uma variante, um substrato de toxina de clostrídeo associado a uma membrana compreende, em parte, uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo que compreende um local de clivagem. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo, na qual o resíduo Pi' não é modificado ou substituído em relação ao resíduo que ocorre naturalmente na proteína alvo clivada pela toxina de clostrídeo. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo, na qual o resíduo Pi é modificado ou substituído em relação ao resíduo que ocorre naturalmente na proteína alvo clivada pela toxina de clostrídeo; um tal substrato de toxina de clostrídeo mantém a susceptibilidade para a clivagem da ligação peptídica entre os resíduos Pi e Pi'. Há diversas sequências de reconhecimento da toxina de clostrídeo que são úteis nas células da invenção, incluindo, mas sem que 32 isso constitua qualquer limitação, sequências de reconhecimento da toxina de botulina, tais como sequências de reconhecimento de BoNT/A, sequências de reconhecimento de BoNT/B, sequências de reconhecimento de BoNT/Cl, sequências de reconhecimento de BoNT/D, sequências de reconhecimento de BoNT/E, sequências de reconhecimento de BoNT/F, sequências de reconhecimento de BoNT/G e sequências de reconhecimento de TeNT. Há diversas sequências de reconhecimento de BoNT/A que são bem conhecidas na especialidade e que são úteis na invenção, veja-se, v.g., Mark A. Breidenbach & Axel T. Brunger, Substrate recognition strategy for botulinum neurotoxin serotype A, 432(7019) Nature 925-929 (2004). Uma sequência de reconhecimento de BoNT/A pode ter, por exemplo, os residuos 46 a 206, os resíduos 134 a 206, os resíduos 137 a 206 ou os resíduos 146-206 de SNAP-25 humana, veja-se, v.g., Teresa A. Ekong et al., Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro, 143 (Pt 10) Microbiology 3337-3347 (1997); Clifford C. Shone et al., Toxin Assays, patente de invenção norte-americana n° 5 982 637 (5 de Out. de 1999); e Vaidyanathan et al., supra, (1999). Um sequência de reconhecimento de BoNT/A também pode incluir, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a sequência Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 105) ou um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 190 a 202 da SNAP-25 humana; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 106) ou a um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 187 a 201 da SNAP-25 humana; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met 33

(SEQ ID NO: 107) ou a um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 187 a 202 da SNAP-25 humana; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 108) ou a um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 187 a 203 da SNAP-25 humana; Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 109) ou a um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 186 a 202 da SNAP-25 humana ou Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 110) ou a um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 186 a 203 da SNAP-25 humana. Veja-se, por exemplo, James J. Schmidt & Karen A Bostian, Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin, 14(8) J. Protein Chem. 703-708 (1995); Schmidt & Bostian, supra, (1997); James J. Schmidt et al., Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the SI' binding subsite, 435(1) FEBS Lett. 61-64 (1998); e James J. Schmidt & Karen A

Bostian, Assay for the proteolytic activity of serotype a from clostridium botulinum, patente de invenção norte-americana n° 5 965 699 (12 de Out. de 1999).

Derivado acordo com aspectos da invenção, uma sequência de reconhecimento de BoNT/A útil pode corresponder a um segmento de uma proteína susceptível à clivagem pelo serotipo A da toxina de botulina ou pode ser substancialmente idêntica a um segmento de uma proteína susceptível a BoNT/A. Conforme ilustrado no quadro 2, são já conhecidas na especialidade diversas proteínas, que ocorrem naturalmente, sensíveis a clivagem com BoNT/A, incluindo, por exemplo, SNAP-25A e SNAP-25B humana, de 34 rato, de murganho, de Danio, de Carassius; e SNAP-25 de Torpedo. Assim, uma sequência de reconhecimento de BoNT/A pode corresponder, por exemplo, a um segmento de SNAP-25A ou SNAP-25B humana; SNAP-25A ou SNAP-25B bovina; SNAP-25A ou SNAP-25B de rato; SNAP-25A ou SNAP-25B de murganho; SNAP-25A ou SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A ou SNAP-25B de Danio·, SNAP-25A ou SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Torpedo·, SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea; SNAP-25 de Aplysia, a suas isoformas, ou a outra proteínas que ocorrem naturalmente sensíveis a clivagem com BoNT/A. Além do mais, uma comparação de sequências de aminoácidos SNAP-25 nativos clivadas por BoNT/A revela que tais sequências não são totalmente conservadas (veja-se o quadro 2), indicando tal facto que há diversas substituições e modificações de aminoácidos, relativamente à sequência de SNAP-25 susceptível a BoNT/A, que ocorre naturalmente, que podem ser toleradas numa sequência de reconhecimento de BoNT/A útil na invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/A semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo de SNAP-25 susceptível a BoNT/A, tal como a sequência de reconhecimento de BoNT/A contida nas proteínas SNAP-25 identificadas nos organismos a seguir indicados e apresentados no quadro 2. 35

Cepalópode Gast-rópode ÔNA*-35 «D tOÚKAESMESHIDEANg MS a NO AíXULKN § NO HD tNQKeeStHVRVDEW^ Γ\·Ε· Sí NO A*íFi8,«KQ | NO Hemátode * fHOKAOSHeWVESA^ R AKNi-iTK § Bt-NTA-

Clivagem proteolítica ocorre neste local (*); clivagem proteolítica não detectada neste local (-); clivagem proteolítica não determinada neste local (ND) a = clivagem ín vitro de SNAP-25 necessita de uma concentração 100 vezes superior de BoNT/C do que BoNT/A ou /E.

b = substituição de P182R ou K185DD (caixas) induz susceptibilidade face a BoNT/E c = resistência a BoNT/E, possivelmente devido à substituição de D189 ou E189 por V189, ver caixa

Quadro 2 - Clivagem de SNAP-25 e de proteínas associadas. Primata: SNAP-25A humana, resíduos 163- -206 de SEQ ID NO: 1; SNAP-25B humana, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 2; SNAP-23A humana, resíduos 169-211 de SEQ ID NO: 3; SNAP-23B humana, resíduos 116-158 de SEQ ID NO: 4; SNAP-25B de macaco, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 5; roedor: SNAP-25A de rato, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 6; SNAP-25B de 36 rato, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 7; SNAP-25B de murganho, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 8; SNAP-23 de rato, resíduos 168-210 de SEQ ID NO: 9; SNAP-23 de murganho, resíduos 168-210 de SEQ ID NO: 10; ave: SNAP-25B de galinha, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 11; peixe: SNAP-25A de peixe-dourado, resíduos 161-204 de SEQ ID NO: 12; SNAP-25B de peixe-dourado, resíduos 160-203 de SEQ ID NO: 13; SNAP-25A de peixe-zebra, resíduos 161-204 de SEQ ID NO: 14; SNAP-25B de peixe-zebra, resíduos 160-203 de SEQ ID NO: 15; SNAP-23 de peixe-zebra, resíduos 174-214 de SEQ ID NO: 16; Raia: SNAP-25 de tremelga-marmoreada, resíduos 170-210 de SEQ ID NO: 17; Anfíbio: SNAP-25A de sapo, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 18; SNAP-25B de sapo, resíduos 163-206 de SEQ ID NO: 19; SNAP-23 de sapo, resíduos 163-204 de SEQ ID NO: 20; SNAP-25 de ouriço-do-mar, resíduos 169-212 de SEQ ID NO: 21; insecto: SNAP-25 de mosca da fruta, resíduos 171-212 de SEQ ID NO: 22 212; SNAP-24 de mosca da fruta, resíduos 170-212 de SEQ ID NO: 23; anelídeo: SNAP-25 de sanguessuga, resíduos 170-212 de SEQ ID NO: 24; cefalópode: SNAP-25 de lula, resíduos 245-267 de SEQ ID NO: 25; gastrópode: SNAP-25 de caracol de água doce, resíduos 244-266 de SEQ ID NO: 26; nemátoda: SNAP-25 de nemátoda, resíduos 165-207 de SEQ ID NO: 27.

Um substrato de toxina de clostrídeo, tal como um substrato que contém uma sequência de reconhecimento de BoNT/A, pode ter uma ou diversas modificações, comparativamente com a sequência que ocorre naturalmente, que é clivada pela toxina de clostrídeo correspondente. A título exemplificativo, quando comparado com uma 17-mer correspondente aos resíduos 187 a 203 de SNAP-25 humana, uma substituição de Aspl93 com Asn no substrato BoNT/A 37 originou uma taxa relativa de proteólise de 0,23; a substituição de Glul94 com Gin originou uma taxa relativa de 2,08; a substituição de Alal95 com ácido 2-aminobutirico originou uma taxa relativa de 0,38 e uma substituição de Glnl97 com Asn, com ácido 2-aminobutitico ou com Ala originou uma taxa relativa de 0,66, 0,25 ou 0,19, respectivamente (ver o quadro 3) . Além do mais, a substituição de Alal99 com ácido 2-aminobutirico originou uma taxa relativa de 0,79; a substituição de Thr200 com Ser ou com ácido 2-aminobutirico originou uma taxa relativa de 0,26 ou 1,20, respectivamente; a substituição de Lys201 com Ala originou uma taxa relativa de 0,12 e a substituição de Met202 com Ala ou com norleucina originou uma taxa relativa de 0,38 ou 1,20, respectivamente, veja-se, v.g., Schmidt & Bostian, supra, (1997). Estes resultados indicam que é possível substituir diversos resíduos num substrato de toxina de clostrídeo, em comparação com a sequência susceptivel à toxina que ocorre naturalmente. No caso da BoNT/A, estes resultados indicam que os resíduos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, Glul94, Alai 95, Glnl97, Alal99, Thr200 e Met202, Leu203, Gly204, Ser205 e Gly206, bem como os resíduos mais distantes da ligação císsil Gln-Arg, podem ser substituídos ou conjugados num fluoróforo, grupo volumoso, dador ou fluoróforo aceitador num substrato de BoNT/A útil de acordo com a invenção. Um tal substrato de BoNT/A é proteolizado de um modo detectável na ligação císsil pela BoNT/A, sob condições adequadas para a actividade de protease da toxina de clostrídeo. Assim, se desejado, um substrato de BoNT/A pode incluir uma ou várias substituições, adições ou 38 delecções de aminoácidos, relativamente à sequência de SNAP-25 que ocorre naturalmente. QUADRO 3 Parâmetros cinéticos de substratos peptidicos sintéticos de BoNT/A Péptido Sequência3 SEQ ID NO: Taxa relativa13 LQ i—1 1 \—1 SNKTRIDEANQRATK 106 0, 03 [1-16] SNKTRIDEANQRATKM 107 1,17 [1-17] SNKTRIDEANQRATKML 108 1, 00 M16A SNKTRIDEANQRATKAL 111 0, 38 M16X SNKTRIDEANORATKXL 112 1,20 K15A SNKTRIDEANQRATAML 113 0, 12 T14S SNKTRIDEANQRASKML 114 0,26 T14B SNKTRIDEANQRABKML 115 1,20 A13B SNKTRIDEANQRBTKML 116 0, 79 Q11A S NK T RID EANARAT KML 117 0,19 Q11B SNKTRIDEANBRATKML 118 0, 25 Q11N SNKTRIDEANNRATKML 119 0, 66 N10A SNKTRIDEAAQRATKML 120 0, 06 A9B SNKTRIDEBNQRATKML 121 0, 38 E8Q SNKTRIDQANQRATKML 122 2, 08 D7N SNKTRINEANQRATKML 123 0, 23 a Abreviaturas não convencionais: B, ácido 2-aminobutírico, X, ácido 2-amino-hexanóico (norleucina) b Taxas de hidrólise inicial em relação ao péptido [1-17], As concentrações em propriedades foram de 1,0 mM.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula compreende, em parte, um substrato de BoNT/A associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par de FRET e uma sequência de reconhecimento de BoNT/A, incluindo um local de clivaqem. Tal como aqui utilizado, a expressão 39 "sequência de reconhecimento do serotipo A da toxina de botulina" é sinónima da expressão "sequência de reconhecimento de BoNT/A" e designa uma ligação cissil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação cissil por meio de uma BoNT/A, sob condições adequadas para a actividade de protease da toxina de clostrideo. Uma ligação cissil clivada por BoNT/A pode ser, por exemplo, Gln-Arg.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, um sequência de reconhecimento de BoNT/A que compreende a uma sequência de reconhecimento de BoNT/A que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, incluindo Gln-Arg. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/A que compreende a sequência de reconhecimento de BoNT/A, Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 96) . De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/A que compreende uma porção de SNAP-25, tal como, v.g., os resíduos 1 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 46 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 134 a 206 da SEQ ID NO: 1; os residuos 137 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 146 a 206 da SEQ ID NO: 1, ou um seu peptidomimético. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/A que compreende as SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 ou SEQ ID NO: 110, ou um seu peptidomimético. 40 São já conhecidas na especialidade diversas sequências de reconhecimento de BoNT/B ou podem ser definidas por métodos convencionais. Tais sequências de reconhecimento de BoNT/B podem incluir, por exemplo, uma sequência que corresponde a alguma parte ou à totalidade do núcleo hidrofilico de uma proteína VAMP, tal como a VAMP-1 humana ou a VAMP-2 humana. Uma sequência de reconhecimento de BoNT/B pode incluir, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os resíduos 33 a 94, os resíduos 45 a 94, os resíduos 55 a 94, os resíduos 60 a 94, os resíduos 65 a 94, os resíduos 60 a 88 ou os resíduos 65 a 88 da VAMP-2 humana (SEQ ID NO: 31) ou os resíduos 60 a 94 da VAMP-1-1 humana (SEQ ID NO:28) , VAMP-1-2 (SEQ ID NO: 29) e VAMP-1-3 (SEQ ID NO: 30), veja-se, e.g., Shone et al., Eur. J. Biochem. 217: 965-971 (1993); e Shone et al., supra, (5 de Out. de 1999). Uma sequência de reconhecimento de BoNT/B também pode incluir, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a sequência Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Leu-Lys (SEQ ID NO: 124) ou um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 60 a 94 da VAMP-2 humana, veja-se, e.g., James J. Schmidt & Robert G. Stafford, High Throughput Assays for the Proteolytic Activities of clostridial Neurotoxins, patente de invenção norte-americana n° 6 762 280 (13 de Jul. de 2004) e a sequência de reconhecimento de BoNT/B Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Cys-Lys (SEQ ID NO: 125), ou um seu peptidomimético, que corresponde aos resíduos 62 a 96 da VAMP-1 humana. 41

Uma sequência de reconhecimento BoNT/B útil de acordo com os aspectos da invenção pode corresponder a um segmento de uma proteína susceptível a clivagem pelo serotipo B da toxina de botulina ou que possa ser praticamente idêntica a uma segmento de uma proteína susceptível à BoNT/B. Conforme ilustrado no quadro 4, são já conhecidas diversas proteínas, que ocorrem naturalmente, sensíveis à clivagem por BoNT/B, as quais incluem, por exemplo, a VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3/celubrevina humana e de murganho; a VAMP-2 bovina; a VAMP-2 e VAMP-3 de rato; a VAMP-2 de galinha; a VAMP-1 de Torpedo·, a VAMP de Strongylocentrotus; a synA, synB, synC, synD e synE de Drosophila; a VAMP de Hirudo; e a tipo SNB1 de Caenorhabditis. Assim, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B pode corresponder, por exemplo, a um segmento de VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-2 ou VAMP-3 de rato; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de murganho; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de galinha; VAMP-2 ou VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 ou VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; synA, synB, synC, synD ou synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, suas isoformas, ou outras proteínas, que ocorram naturalmente, sensíveis à clivagem por BoNT/B. Além do mais, conforme ilustrado no quadro 4, uma comparação de sequências de aminoácidos de VAMP nativas clivadas por BoNT/B indica que tais sequências não estão totalmente conservadas, o que indica que há substituições e modificações de diversos aminoácidos, relativamente à sequência da VAMP que ocorre naturalmente, que podem ser toleradas num substrato de BoNT/B da invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de 42

BoNT/B semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo de VAMP-1 ou VAMP-2 susceptível à BoNT/B, tal como a sequência de reconhecimento de BoNT/B contida nas proteínas VAMP-1 e VAMP-2, identificadas nos organismos referidos antes e no quadro 4. 42Clivagem proteolítica ocorre neste local (*); clivagem proteolítica não detectada neste local (-); clivagem proteolítica não determinada neste local (ND)a = resistência da VAMP1 de rato a BoNT/C e a TeNT, possivelmente devido à substituição de Q189V, ver caixa

QUADRO 4 Clivagem de VAMP e de proteínas asssociadas [ Locais de clivagem Susceptibilidade à clivagem Organismo Isoforma BoNT/F V BsNT© V TeNT BaMttS V WfíHs f Primata VAMPM VAUP'»2 RvwoKvtçwxi K > UeLOORADALÚASASQ * fCSSA * AtCLKRKWVW βοΝΤϋ; 8oKnOt 8àNT/F;BôW/G;T*NT Primata ViftMPS fiwvDKvuewa • K • ISÊLDOBAOALOAaASO • FET5A • AKLKWYWW SoNT/S; 8o*fT% Primata WWP3 RVNVQKVLEflOQ • K • ISEUíOBAOALClA&ASO fStSÁ * AKiKTKTWW βοΝΤ/S; fi&NT©: BMfT/F;aoNT^TaNT Bovino VAMP2 * K · i.SELDDBAtVil,Cl*aASQ * FETSA * AKLKHKVWW fioNT/5; &>ΝΤΦ; fiôNT/F; 8©ΝΤ/φ TeNT Roedor UAMPim vm* FtVNVKArfÉPOO wmmxiçpm * K « ISELOORAftALÔASASS LSeLDONAOALOAMSã J • FESSA. fessa AKucmvww AKLKRKWfW toNTO; eormD; ftaNT/F: BoNT/G; TaMf Roedor VAMFâ VAWPÍ^fc aVNVOKVL£flOQ - K LSELDDftAbAUCMGASO * FETSA • AKLKHK.YWW ΒβΝΤ/Βς C<*mO; ôowr/F;eeNrAa;T«Mr Roedor VAMPS 8UNV0KVIERDG K LSeLODfUOALOAOASO * FETSA • AKLKflKYWW ÔaNTiBj SaNT^&oNTíOíTaNT Pássaro VAMPí RWvbkvt-KFSKS * K * LSaiJOfíAOALÚWSA^ F6SSA * AKUÍflKVWW ΒΰΝΤή>; &jpn/F; BeNT/O Pássaro VAMPi RMNWKVLBRDO • K ♦ lS£LONftA£>ALO«5ASO • FETSA • AKUOWYWW aóNim^ BfiMftD: BóNT/F: ββΝΤ/6; TpNT Pássaro vamps RVWVpKVtSROQ NO K NO LmSDBADALOAGASO ND FETSA NO AKUWYWW NP Anfíbio ftW«VCKVL6flO@ MO K ND issummim^Ágasq m FETSA NO AKtWMiWW NO Anfíbio VAMPS RVNTCWAeftOQ m K NO tB£LQOftAO«.OA<3IASO. m N& AKU««C<WW NO Peixe VAMPS . (WWVBKVSí W» m K ND issnoafW)*íOmA^t NO FESSÀ W> AKLKNKVWW ND Peixe VAWfi - RVNVWÍVLERDQ Np « NO LSELOOflAOAtOAGASt» m FETTfA Mt> AKUÍNttYWW «ç..................... Peixe «VNVaKVLSSM NO NO LmOORAÓAUMâASO m FETSA NO AKLKftKVWW NO Raia VAMP1 F»VHVE)KVt£ODQ * * * LSELDDFMQALOAQASÕ - FtESSA • aklkfkyww doNT/8; 6e»IT^ 8Mlr/F;Sotir/ã;T«Nr .Ouriço- VAWP RVMvaKvtsnoQ - 8 - ' LSVattJHAttALOOQASa FÇTNA * |Ja*FKVww 8e»T«; T»«T Insecto Syn-Al rwwekvleroq * K LsaeENAOQLeaeASO * FBODA ggeucmoww awTift setnao Sjn-βΐ. QoNT/F; TeNT Insecto Syn-A2 Syrv82 RVNvo^vteftoo • K • LSELBCRAOQL^OQASQ - §εαα* - ©OKflKOWW θοΚΤ/D; BoNT/F Insecto S)ff>C SyrvQ SyívS RrNVtEKVU-RCg - K ♦ UEÊLODRAOALQGGASG • FEQOA - goKJWfm. BoNT/9; BoNT/D; TeNT Anelídeo VAMP RVNVÕKVLEXDG • K • UtSUtôRADAUKOASQ • FÊASA - gSOXRKFWW 89tm& OeNT/O; QM«T/F; TaNT 'efalópode^VAMP BVNvaKyLatt# NO K NO gSEUXMWAtja^&ASQ ttú FEASA NO j^iKRKFWW NO Gastrópode VAMP «v«va(vu»t)0 NO K NO §$QLÔMAÇM.OAeASÓ NO FEASA NO g&KRKTWto NO Nemátode $NB! SNBM» KVNV^GfcTOO NO K 3. m tSOnORAOALQEeASO UfêUKtfMEVLONeASQ NO " FEK5A FQQ^I NO AirKRSVWV» BnwaKiftw BelíMfcTeNT 43

Quadro 4 - Clivagem de VAMP e de proteínas associadas.

Primata: VAMP-1-1 humana, resíduos 49 a 92 da SEQ ID NO: 28; VAMP-1-2 humana, resíduos 49 a 92 da SEQ ID NO: 29; VAMP-1-3 humana, resíduos 49 a 92 da SEQ ID NO: 30; VAMP-2 humana, resíduos 47 a 90 da SEQ ID NO: 31; VAMP-2 de macaco, resíduos 47 a 90 da SEQ ID NO: 32; VAMP- 3/celubrevina humana, resíduos 30 a 73 da SEQ ID NO: 33; Bovino: VAMP-2 de vaca, resíduos 47 a 90 da SEQ ID NO: 34;

Roedor: VAMP-1 de rato, resíduos 49 a 92 da SEQ ID NO: 35; VAMP-l-b de rato, resíduos 49 a 92 da SEQ ID NO: 36; VAMP-1 de murganho, resíduos 4 9 a 92 da SEQ ID NO: 37; VAMP-2 de rato, resíduos 47 a 90 da SEQ ID NO: 38; VAMP-2-b de rato, resíduos 47 a 90 da SEQ ID NO: 39; VAMP-2 de murganho, resíduos 47 a 90 da SEQ ID NO: 40; VAMP-3/celubrevina de rato, resíduos 34 a 77 da SEQ ID NO: 41; VAMP-3/celubrevina de murganho, resíduos 34 a 77 da SEQ ID NO: 42; ave: VAMP-1 de galinha, resíduos 190 a 233 da SEQ ID NO: 43; VAMP-2 de galinha, resíduos 47 a 88 da SEQ ID NO: 44; VAMP-

3/celubrevina de galinha, resíduos 34 a 77 da SEQ ID NO: 45; peixe: VAMP-1 de peixe-zebra, resíduos 50 a 93 da SEQ

ID NO: 46; VAMP-2 de peixe-zebra, resíduos 41 a 84 da SEQ

ID NO: 47; VAMP-3 de peixe-zebra, resíduos 33 a 60 da SEQ ID NO: 48; raia: VAMP-1 de tremelga-marmoreada, resíduos 51 a 94 da SEQ ID NO: 49; anfíbio: VAMP-2 de sapo, resíduos 45 a 88 da SEQ ID NO: 50; VAMP-3 de sapo, resíduos 32 a 75 da SEQ ID NO: 51; VAMP de ouriço-do-mar, resíduos 31 a 74 da SEQ ID NO: 52; insecto: SynAl de mosca da fruta, resíduos 40 a 83 da SEQ ID NO: 53; SynA2 de mosca da fruta, resíduos 63 a 106 da SEQ ID NO: 54; SynBl de mosca da fruta, resíduos 63 a 106 da SEQ ID NO: 55; SynB2 de mosca da fruta, resíduos 63 a 106 da SEQ ID NO: 56; SynC de mosca da 44 fruta, resíduos 57 a 100 da SEQ ID NO: 57; SynD de mosca da fruta, resíduos 66 a 109 da SEQ ID NO: 58; SynE de mosca da fruta, resíduos 57 a 100 da SEQ ID NO: 59; anelídeo: VAMP de sanguessuga, resíduos 45 a 88 da SEQ ID NO: 60; cefalópode: VAMP de lula, resíduos 56 a 99 da SEQ ID NO: 61; gastrópode: VAMP de caracol de água doce, resíduos 49 a 92 da SEQ ID NO: 62; VAMP de gastrópodes marinhos, resíduos 37 a 80 da SEQ ID NO: 63; nemátode: SNB1 de nemátode, resíduos 72 a 115 da SEQ ID NO: 64; tipo SNB de nemátodes, resíduos 82 a 115 da SEQ ID NO: 65.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula compreende, em parte, um substrato de BoNT/B associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par FRET e uma sequência de reconhecimento de BoNT/B, incluindo um local de clivagem. Tal como aqui utilizado, a expressão "sequência de reconhecimento do serotipo B da toxina de botulina" é sinónima da expressão "sequência de reconhecimento de BoNT/B" e designa uma ligação císsil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação císsil por meio de uma BoNT/A, sob condições adequadas. Uma ligação císsil clivada por BoNT/B pode ser, por exemplo, Gln-Phe.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que compreende pelo menos seus resíduos consecutivos de VAMP, incluindo Gln-Phe. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que compreende a sequência Gly-Ala-Ser-Gin-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 97). De acordo com 45 outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que compreende uma porção de VAMP-1-1, tal como, v.g., os resíduos 1 a 118 da SEQ ID NO: 28; os resíduos 62 a 96 da SEQ ID NO: 28, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que compreende uma porção de VAMP-1-2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 117 da SEQ ID NO: 29; os resíduos 62 a 96 da SEQ ID NO: 29, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que compreende uma porção de VAMP-1-3, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 30; os resíduos 62 a 96 da SEQ ID NO: 30, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que compreende uma porção de VAMP-2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 33 a 94 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 45 a 94 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 55 a 94 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 60 a 94 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 65 a 94 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 60 a 88 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 65 a 88 da SEQ ID NO: 31, ou um seu peptidomimético.

Faz-se observar que a sequência de reconhecimento de BoNT/Cl pode corresponder a um segmento de uma proteína susceptível à clivagem pelo serotipo Cl da toxina de botulina, ou pode ser praticamente idêntica a um segmento de uma proteína susceptível à BoNT/Cl. Conforme a seguir 46 ilustrado no quadro 5, são conhecidas na especialidade diversas proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptiveis a clivagem por BoNT/Cl, incluindo, por exemplo, Sintaxina IA humana, Sintaxina 1B1 e Sintaxina 1B2 humana e de murganho; Sintaxina IA e Sintaxina 1B2 bovina e de rato; Sintaxina 2 de rato e sintaxina 3 de rato; Sintaxina de Strongylocentrotus; Sintaxina IA de Drosophila; Sintaxina IA de Hirudo; Sintaxina IA de Loligo; Sintaxina 1 A de Aplysia. Assim, a sequência de reconhecimento de BoNT/Cl pode corresponder, por exemplo, a um segmento de Sintaxina IA, Sintaxina 1B1, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2-1, Sintaxina 2-2, Sintaxina 2-3 ou Sintaxina 3A humana; Sintaxina IA, Sintaxina 1B1 ou Sintaxina 1B2 bovina; Sintaxina IA, Sintaxina 1B1, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2 ou Sintaxina 3A de rato; Sintaxina IA, Sintaxina 1B1, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2, Sintaxina 3A, Sintaxina 3B ou Sintaxina 3C de murganho; Sintaxina IA ou Sintaxina 2 de galinha; Sintaxina IA ou Sintaxina 1B de Xenopus; Sintaxina IA, Sintaxina 1B ou Sintaxina 3 de Danio; Sintaxina IA ou Sintaxina 1B de Torpedo; Sintaxina IA ou Sintaxina 1B de Strongylocentrotus; Sintaxina IA ou Sintaxina 1B de Drosophila; Sintaxina IA ou Sintaxina 1B de Hirudo; Sintaxina IA ou Sintaxina 1B de Loligo; Sintaxina IA ou Sintaxina 1B de Lymnaea, suas isoformas, ou outras proteínas, que ocorram naturalmente, susceptiveis à clivagem com BoNT/Cl. Além do mais, a comparação entre sequências de aminoácidos nativas clivadas por BoNT/Cl indica que tais sequências não estão totalmente conservadas (ver o quadro 5), indicando que há substituições e modificações em diversos aminoácidos, relativamente a uma sequência de sintaxina, que ocorre naturalmente, 47 susceptível a BoNT/Cl, que podem ser toleradas num substrato de BoNT/Cl útil de acordo com a invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de uma outra isoforma, parálogo ou ortólogo de sintaxina susceptível à BoNT/Cl, tal como a sequência de reconhecimento de BoNT/Cl contida nas proteínas de sintaxina apresentadas na listagem subsequente e no quadro 5.

Quadro 5 - Clivagem de Sintaxina e de proteínas associadas. Primata: Sintaxina IA humana, resíduos 242 a 264 da SEQ ID NO: 66; Sintaxina 1B1 humana, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 67; Sintaxina 1B2 humana, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 68; Sintaxina 2-1 humana, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 69; Sintaxina 2-2 humana, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 70; Sintaxina 2-3 humana, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 71; Sintaxina 3 humana, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 72; bovino: Sintaxina IA de vaca, resíduos 242 a 264 da SEQ ID NO: 73; Sintaxina 1B2 de vaca, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 74; Roedor; Sintaxina IA de rato, resíduos 242 a 264 da SEQ ID NO: 75; Sintaxina 1B2 de rato, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 76; Sintaxina IA de murganho, resíduos 242 a 264 da SEQ ID NO: 77; Sintaxina 1B1 de murganho, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 78; Sintaxina 1B2 de murganho, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 79; Sintaxina 2 de rato, resíduos 243 a 265 da SEQ ID NO: 80; Sintaxina 2 de murganho, resíduos 242 a 264 da SEQ ID NO: 81; Sintaxina 3A de reato, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 82; Sintaxina 3A de murganho, resíduos 241 a 263 48 da SEQ ID NO: 83; Sintaxina 3B de murganho, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 84; Sintaxina 3C de murganho, resíduos 223 a 245 da SEQ ID NO: 85; ave: Sintaxina 1B de galinha, resíduos 235 a 257 da SEQ ID NO: 86; Sintaxina 2 de galinha, resíduos 240 a 262 da SEQ ID NO: 87; peixe: Sintaxina 1B de peixe-zebra, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 88; Sintaxina 3 de peixe-zebra, resíduos 239 a 261 da SEQ ID NO: 89; Sintaxina 1B de ouriço-do-mar, resíduos 241 a 263 da SEQ ID NO: 90; insecto: Sintaxina IA de mosca da fruta, resíduos 245 a 267 da SEQ ID NO: 91; anelídeos: Sintaxina IA de sanguessuga, resíduos 248 a 270 da SEQ ID NO: 92; cefalópode: Sintaxina IA de lula, resíduos 245 a 267 da SEQ ID NO: 93; gastrópode: Sintaxina IA de caracol de água doce, resíduos 244-266 da SEQ ID NO: 94; Sintaxina IA de gastrópode marinho, resíduos 244-266 da SEQ ID NO: 95.

QUADRO 5 Clivagem de Sintaxina e proteínas associadas Organismo Isoforma Local de clivagem Sus cept ibi1idade à clivagem BONT/C1 ▼ Primata Sintaxina IA Sintaxina 1B1 Sintaxina 1B2 DYVERAVSDTKK * AVKYQSKARRK BoNT/Cl Primata Sintaxina 2-1 Sintaxina 2-2 Sintaxina 2-3 DYVEHAKEETKK ND AIKYQSKARRK ND Primata Sintaxina 3A DHVEKARDESKK ND AVKYQSQARKK ND Bovino Sintaxina IA Sintaxina 1B2 DYVERAVSDTKK AVKYQSKARRK BoNT/Cl Roedor Sintaxina IA Sintaxina 1B1 Sintaxina 1B2 DYVERAVSDTKK * AVKYQSKARRK BoNT/Cl Roedor Sintaxina 2 DYVEHAKEETKK AIKYQSKARRK BoNT/Cl Roedor Sintaxina 3A DHVEKARDETKg * AMKYQGQARKK BoNT/Cl Roedor Sintaxina 3C GFVERAVAD TKK ND AVKYQSEARRK ND ave Sintaxina 1B dyvepwfvtk|s| ND AVMYQCKSRRK ND 49 ave Sintaxina 2 DYVEHAKEETKK ND AVKYQSKARRK ND Peixe Sintaxina 1B DYVERAVSDTKK * AVKYQSQARKK BoNT/Cl Peixe Sintaxina 3 DHVEAARDETKK ND AVRYQSKARKK ND Ouriço-do- —mar Sintaxina 1B DYVRRQNDTKK * AVKYQSKARRK BoNT/Cl Insecto Sintaxina IA DYVQTATQDTKK * ALKYQKARRK BoNT/Cl Anelídeo Sintaxina IA DYVETAAADTKK * AMKYQSAARKK BoNT/Cl Cefalópode Sintaxina IA DYIETAKVDTKK * AVKYQSKARQK BoNT/Cl Gastrópode Sintaxina IA DYIETAKMDTKK * AVKYQSKARRK BoNT/Cl Clivagem proteolítica ocorre neste local ( *) ; clivagem proteolítica não detectada neste local (-) ; clivagem proteolítica não determinada neste local (ND)

Conforme ilustrado no quadro 2, são já conhecidas na especialidade diversas proteínas, que ocorrem naturalmente susceptíveis a clivaqem por BoNT/Cl, incluindo, por exemplo, SNAP-25A e SNAP-25B humana, de rato, de murganho, de Danio, de Carassius; e SNAP-25 de Drosophila. Assim, uma a sequência de reconhecimento de BoNT/Cl pode corresponder, por exemplo, a um segmento de SNAP-25A ou SNAP-25B humana; SNAP-25A ou SNAP-25B bovina; SNAP-25A ou SNAP-25B de rato; SNAP-25A ou SNAP-25B de murganho; SNAP-25A ou SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A ou SNAP-25B de Danio; SNAP-25A ou SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Torpedo; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-25 ou SNAP-24 de Drosophila; SNAP-25 de Hirudo; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea, suas isoformas, ou outras proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis à clivagem por BoNT/Cl. Conforme descrito antes a propósito das variantes de sequências de sintaxina que ocorrem naturalmente, a comparação de sequências de aminoácidos da SNAP-25 nativa clivada por BoNT/Cl revela uma variabilidade significativa de sequências (quadro 2), o que indica que há substituições e modificações de aminoácidos, relativamente a uma sequência de SNAP-25, que 50 ocorre naturalmente susceptível a BoNT/Cl, que podem ser toleradas num substrato de BoNT/Cl útil, de acordo com a invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo da SNAP-25 susceptível a BoNT/Cl, tal como a sequência de reconhecimento de BoNT/A contida nas proteínas SNAP-25 identificadas nos organismos apresentados antes e no quadro 2 .

Assim, numa variante, uma célula compreende, em parte, um substrato de BoNT/Cl associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par FRET e uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl, incluindo um local de clivagem. Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de reconhecimento do serotipo Cl da toxina de botulina" é sinónima da expressão "sequência de reconhecimento de BoNT/Cl" e designa uma ligação cissil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação cissil por meio de uma BoNT/Cl, sob condições adequadas. Uma ligação cissil clivada por BoNT/Cl pode ser, por exemplo, Lys-Ala ou Arg-Ala.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo codificado inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de sintaxina, incluindo Lys-Ala. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende a 51 sequência de reconhecimento de BoNT/Cl, Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 98). De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, incluindo Arg-Ala. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende a sequência de reconhecimento de BoNT/Cl Ala-

Asn-Gln- -Arg -Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 99). Ainda de acordo com outro aspecto desta variante , o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de Sintaxina, incluindo Lys-Ala, e uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, incluindo Arg-Ala.

De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de Sintaxina-1A, tal como, v.g., os resíduos 1 a 288 da SEQ ID NO: 66, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção da Sintaxin-lBl, tal como, v.g., os resíduos 1 a 288 da SEQ ID NO: 67, ou um seu peptidomimét ico. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de 52 reconhecimento de BoNT/Cl que compreendem uma porção de Sintaxina-1B2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 288 da SEQ ID NO: 68, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de Sintaxina 2-1, tal como, v.g., os resíduos 1 a 287 da SEQ ID NO: 69, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de Sintaxin-2-2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 288 da SEQ ID NO: 70, ou um seu pept idomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de Sintaxina-2-3, tal como, v.g., os resíduos 1 a 289 da SEQ ID NO: 71, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de Sintaxina-3A, tal como, v.g., os resíduos 1 a 289 da SEQ ID NO: 83, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de Sintaxina-3B, tal como, v.g., os resíduos 1 a 283 da SEQ ID NO: 84, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de Sintaxina-3C, tal 53 como, v.g., os resíduos 1 a 269 da SEQ ID NO: 85, ou um seu peptidomimético.

De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende uma porção de SNAP-25, tal como, v.g., os resíduos 1 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 93 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 134 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 137 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 146 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 137 a 202 da SEQ ID NO: 1, ou um seu peptidomimético. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que compreende as SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 ou SEQ ID NO: 110, ou um seu peptidomimético. São já conhecidas na especialidade diversas sequências de reconhecimento de BoNT/D ou podem ser definidas por métodos convencionais. A sequência de reconhecimento de BoNT/D pode incluir, por exemplo, os resíduos 27 a 116; os resíduos 37 a 116; os resíduos 1 a 86; os resíduos 1 a 76 ou os resíduos 1 a 69 da VAMP-2 de rato, ver, v.g., Shinji Yamasaki et al., Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinum neurotoxins and tetanus toxin, 269(17) J. Biol. Chem. 12764-12772 (1994). Assim, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D pode incluir, por exemplo, os resíduos 27 a 69 ou os resíduos 37 a 69 da VAMP-2 de rato. Uma sequência de reconhecimento de BoNT/D também pode incluir, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a sequência Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val- 54

Leu-Glu-Arg-Asp-Gin-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 126) ou um seu peptidomimético, a qual corresponde aos resíduos 37 a 75 da VAMP-2 humana, ver, v.g., Schmidt & Stafford, supra, (13 de Jul. de 2004) e a sequência de reconhecimento de BoNT/D Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 127), ou um seu peptidomimético, a qual corresponde aos resíduos 39 a 77 das isoformas de VAMP-1 humana, VAMP-1-1, VAMP-1-2 e VAMP-1-3. A sequência de reconhecimento de BoNT/D pode corresponder a um segmento de uma proteína que é susceptível a clivagem pelo serotipo D da toxina de botulina ou pode ser praticamente idêntica a um segmento de uma proteína susceptível a BoNT/D. Conforme ilustrado no quadro 4, são já conhecidas diversas proteína, que ocorrem naturalmente, susceptíveis à clivagem por BoNT/D, as quais incluem, por exemplo, VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3/celubrevina humana, de rato e de murganho; VAMP-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3 de galinha; VAMP-2 ou VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 ou VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de

Strongylocentrotus; synA, synB, synC, synD, synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de

Lymnaea; VAMP de Aplysia; e SNB1 de Caenorhabditis. Assim, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D pode corresponder, por exemplo, a um segmento de VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de murganho; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de galinha; VAMP-2 ou VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 ou VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de 55

Strongylocentrotus; synA, synB, synC, synD, synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, ou suas isoformas, ou outras proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis à clivagem por BoNT/D. Além do mais, conforme ilustrado antes no quadro 4, a comparação entre sequências de aminoácidos de VAMP nativas clivadas por BoNT/D demonstram uma variabilidade significativa de sequências, o que indica que há substituições e modificações de diversos aminoácidos, relativamente à sequência de VAMP, que ocorre naturalmente, susceptível a BoNT/D, que podem ser toleradas num substrato BoNT/D útil, de acordo com a invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo de VAMP-1 ou VAMP-2 susceptível a BoNT/D, tal como a sequência de reconhecimento de BoNT/B contida nas proteínas VAMP-1 e VAMP-2 identificadas nos organismos descritos antes e no quadro 4.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula compreende, em parte, um substrato de BoNT/D associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par FRET e uma sequência de reconhecimento de BoNT/D, incluindo um local de clivagem. A expressão "sequência de reconhecimento do serotipo D da toxina de botulina" é sinónima da expressão "sequência de reconhecimento de BoNT/D" e designa uma ligação císsil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação císsil por meio de uma BoNT/D, sob condições adequadas. Uma 56 ligação císsil clivada por BoNT/D pode ser, por exemplo, Lys-Leu.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que contém pelo menos seis resíduos consecutivos da VAMP, incluindo Lys-Leu. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que compreende a sequência de reconhecimento de BoNT/D Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (SEQ ID NO: 100) . De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de BoNT/D que compreende uma porção de VAMP-1-1, tal como, v.g., os resíduos 1 a 118 da SEQ ID NO: 28; os resíduos 39 a 77 da SEQ ID NO: 28, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que compreende uma porção de VAMP-1-2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 117 da SEQ ID NO: 29; os resíduos 39 a 77 da SEQ ID NO: 29, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que compreende uma porção de VAMP-1-3, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 30; os resíduos 39 a 77 da SEQ ID NO: 30, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que compreende uma porção de VAMP- 57 2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 1 a 86 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 1 a 76 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 1 a 69 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 27 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 37 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 27 a 68 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 37 a 69 da SEQ ID NO: 31, ou um seu peptidomimético. É do conhecimento de um especialista na matéria que uma sequência de reconhecimento de BoNT/E pode corresponder a um segmento de uma proteína que é susceptível à clivagem pelo serotipo E da toxina de botulina ou pode ser praticamente idêntica a um segmento de uma proteína susceptível a BoNT/E. Uma sequência de reconhecimento de BoNT/E pode conter, por exemplo, os resíduos 46 a 206, os resíduos 92 a 206, os resíduos 134 a 206, os resíduos 137 a 206; os resíduos 146 a 206 ou os resíduos 156 a 206 da SNAP-25 humana, veja-se, v.g., Vaidyanathan et al., supra, (1999); e Schmidt & Stafford, supra, (13 de Jul. de 2004) .

De acordo com aspectos da invenção, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E útil pode corresponder a um segmento de uma proteína que é susceptível à clivagem pelo serotipo E da toxina de botulina ou pode ser praticamente idêntica a um segmento de uma proteína susceptível a BoNT/E. Conforme ilustrado no quadro 2, são já conhecidas na especialidade diversas proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis à clivagem por BoNT/E, incluindo, por exemplo, SNAP-25A e SNAP-25B humana, de galinha, de Danio, de Carassius; SNAP-25A, SNAP-25B e SNAP-23 de rato e murganho; e SNAP-25 de Caenorhabditis. Assim, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E pode corresponder, por exemplo, a um segmento de SNAP-25A ou SNAP-25B humana; SNAP-25A ou SNAP-25B bovina; SNAP-25A, 58 SNAP-25B ou SNAP-23 de rato; SNAP-25A, SNAP-25B ou SNAP-23 de murganho; SNAP-25A ou SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A ou SNAP-25B de Danio; SNAP-25A ou SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-24 de Drosophila·, SNAP-25 de Hirudo; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea; SNAP-25 de Caenorhabditis, suas isoformas, ou outras proteínas que ocorrem naturalmente susceptíveis à clivagem por BoNT/Cl. Além disso, conforme ilustrado no quadro 2, a comparação de sequências de aminoácidos de SNAP-23 e SNAP-25 nativas clivadas por BoNT/E indica que tais sequências não estão totalmente conservadas, o que indica que há diversas substituições e modificações de aminoácidos, relativamente a uma sequência de SNAP-23 ou SNAP-25, que ocorre naturalmente, susceptível a BoNT/E, que podem ser toleradas num substrato útil na invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo da SNAP-25 susceptível a BoNT/E, tal como a sequência de reconhecimento de BoNT/E contida nas proteínas SNAP-25 identificadas nos organismos apresentados antes e no quadro 2.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula compreende, em parte, um substrato de BoNT/E associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par de FRET e uma sequência de reconhecimento de BoNT/E, incluindo um local de clivagem. Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de reconhecimento do serotipo E da toxina de botulina" é sinónima da expressão "sequência de reconhecimento de BoNT/E" e designa uma ligação císsil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não 59 adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação cissil por meio de uma BoNT/E, sob condições adequadas. Uma ligação cissil clivada por BoNT/E pode ser, por exemplo, Arg-Ile.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de BoNT/E que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/E que contém pelo menos seis resíduos consecutivos SNAP-25, incluindo Arg-Ile. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E que compreende a sequência de reconhecimento de BoNT/E Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (SEQ ID NO: 101) . De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E que compreende uma porção de SNAP-25, tal como, v.g., os resíduos 1 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 46 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 92 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 134 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 137 a 206 da SEQ ID NO: 1, os resíduos 146 a 206 da SEQ ID NO: 1; os resíduos 156 a 206 da SEQ ID NO: 1, ou um seu peptidomimético. São já conhecidas na especialidade diversas sequências de reconhecimento de BoNT/F ou podem ser definidas por métodos convencionais. Uma sequência de reconhecimento de BoNT/F pode incluir, por exemplo, os resíduos 27 a 116; os resíduos 37 a 116; os resíduos 1 a 86; os resíduos 1 a 76 ou os resíduos 1 a 6 9 de VAMP-2 de rato, veja-se, v.g., Yamasaki et al. , supra, (1994) . Uma sequência de reconhecimento de BoNT/F também pode incluir , por exemplo, 60 os resíduos 27 a 69 ou os resíduos 37 a 69 de VAMP-2 de rato. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo de VAMP susceptível a BoNT/F, tal como, v.g., VAMP-1 humana ou VAMP-2 humana. Uma sequência de reconhecimento de BoNT/F também pode incluir, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a sequência Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 126) ou um seu peptidomimético, a qual corresponde aos resíduos 37 a 75 de VAMP-2 humana, ver, v.g., Schmidt & Stafford, supra, (13 de Jul. de 2004) e a sequência de reconhecimento de BoNT/F Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 127) ou um seu peptidomimético, a qual corresponde aos resíduos 39 a 77 de VAMP-1 humana.

Uma sequência de reconhecimento de BoNT/F pode corresponder a um segmento de uma proteína que é susceptível à clivagem pelo serotipo F da toxina de botulina ou pode ser praticamente idêntica a um segmento de uma proteína susceptível à BoNT/F. Conforme ilustrado no quadro 4, são já conhecidas na especialidade diversas proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis a clivagem por BoNT/F, incluindo, por exemplo, VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3/celubrevina humana, de rato e de murganho; VAMP-2 bovina; VAMP-1 e VAMP-2 de galinha; VAMP-1 de Torpedo e sybA e synB de Drosophila. Assim, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F pode corresponder, por exemplo, a 61 um segmento de VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de murganho; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de galinha; VAMP-2 ou VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 ou VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; sybA e synB de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, suas isoformas, ou outras proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis a clivagem por BoNT/F. Assim, uma seguência de reconhecimento de BoNT/F pode corresponder, por exemplo, a um segmento de VAMP-1 ou VAMP-2 humana, VAMP-1 ou VAMP-2 de murganho, VAMP-1 ou VAMP-2 bovina, VAMP-1 ou VAMP-2 de rato, celubrevina de rato, VAMP-1 ou VAMP-2 de galinha, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Aplysia, syb de Drosophila, VAMP de sanguessuga, ou outra proteína, gue ocorre naturalmente, susceptível a clivagem por BoNT/F. Além disso, conforme ilustrado no quadro 4 anterior, a comparação de sequências de aminoácidos de VAMP nativas clivadas por BoNT/F indica que tais sequências não estão totalmente conservadas, o que indica que há diversas substituições e modificações de aminoácidos, relativamente à sequência VAMP, que ocorre naturalmente, susceptível a BoNT/F, que podem ser toleradas num substrato de BoNT/F útil na invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo de VAMP-1 ou VAMP-2 susceptível a BoNT/F, tal como a sequência de reconhecimento de BoNT/F contida nas VAMP-1 e VAMP-2, identificada nos organismos apresentados antes e no quadro 4. 62

Assim, de acordo com uma variante, uma célula compreende, em parte, um substrato BoNT/F associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par de FRET e uma sequência de reconhecimento de BoNT/F, incluindo um local de clivagem. Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de reconhecimento do serotipo F da toxina de botulina" é sinónima da expressão "sequência de reconhecimento de BoNT/F" e designa uma ligação cissil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação cissil por meio de uma BoNT/F, sob condições adequadas. Uma ligação cissil clivada por BoNT/F pode ser, por exemplo, Gln-Lys.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, incluindo Gln-Lys. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de BoNT/F que compreende a sequência de reconhecimento de BoNT/F Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (SEQ ID NO: 102). De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que compreende uma porção de VAMP-1-1, tal como, v.g., os resíduos 1 a 118 da SEQ ID NO: 28; os resíduos 39 a 77 da SEQ ID NO: 28, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que compreende uma porção de VAMP-1-2, tal como, v.g., os 63 resíduos 1 a 117 da SEQ ID NO: 29; os resíduos 39 a 77 da SEQ ID NO: 29, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que compreende uma porção de VAMP-1-3, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 30; os resíduos 39 a 77 da SEQ ID NO: 30, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que compreende uma porção de VAMP-2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 1 a 86 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 1 a 76 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 1 a 69 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 27 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 37 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 27 a 68 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 37 a 75 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 37 a 69 da SEQ ID NO: 31, ou um seu peptidomimético.

Uma sequência de reconhecimento de BoNT/G pode corresponder a um segmento de uma proteína que é susceptível a clivagem pelo serotipo G da toxina de botulina ou pode ser praticamente idêntica a um tal segmento susceptível a BoNT/G. Conforme ilustrado no quadro 4, são já conhecidas na especialidade diversas proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis a clivagem por BoNT/G, incluindo, por exemplo, VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3/celubrevina humana, de rato e de murganho; VAMP-2 bovina; VAMP-1 e VAMP-2 de galinha e VAMP-1 de Torpedo. Assim, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G pode corresponder, por exemplo, a uma segmento de VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato; 64 VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de murganho; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de galinha; VAMP-2 ou VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 ou VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; SNB1 de Caenorhabditis, suas isoformas, ou outra proteína que ocorre naturalmente, susceptível a clivagem por BoNT/G. Além do mais, conforme ilustrado no quadro 4 anterior, a comparação de sequências de aminoácidos de VAMP nativas clivadas por BoNT/G indica que tais sequências não estão totalmente conservadas, o que indica que há diversas substituições e modificações de aminoácidos, relativamente a uma sequência de VAMP, que ocorre naturalmente, susceptível a BoNT/G, que podem ser toleradas num substrato de BoNT/G útil na invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo de VAMP-1 ou VAMP-2 susceptível a BoNT/G, tal como, a sequência de reconhecimento de BoNT/G contida nas VAMP-1 e VAMP-2, identificadas nos organismos apresentados antes e no quadro 4.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula compreende, em parte, um substrato de BoNT/G associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par de FRET e uma sequência de reconhecimento de BoNT/G, incluindo um local de clivagem. Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de reconhecimento do serotipo G da toxina de botulina" é sinónima da expressão "sequência de reconhecimento de BoNT/G" e designa uma ligação císsil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação císsil por meio de uma BoNT/G, sob 65 condições adequadas. Uma ligação cissil clivada por BoNT/G pode ser, por exemplo, Ala-Ala.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, incluindo Ala-Ala. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que compreende a sequência de reconhecimento de BoNT/G Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 103) . De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que compreende uma porção de VAMP-1-1, tal como, v.g., os resíduos 1 a 118 da SEQ ID NO: 28, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que compreende uma porção de VAMP-1-2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 117 da SEQ ID NO:29, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de BoNT/G que compreende uma porção de VAMP-1-3, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 30, ou um seu peptidomimético. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que compreende uma porção de VAMP-2, tal como, v.g., os 6 6 resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 31, ou um seu peptidomimético. São já conhecidas na especialidade diversas sequências de reconhecimento de TeNT, ou podem ser definidas por métodos convencionais, incluindo sequências que correspondem à totalidade ou a alguma parte do núcleo de uma proteína VAMP, tal como a VAMP-1 humana ou a VAMP-2 humana. Uma sequência de reconhecimento de TeNT pode incluir, por exemplo, os resíduos 25 a 93 ou os resíduos 33 a 94 da VAMP-2 humana (SEQ ID NO: 31; F. Cornille et al., Solid-phase synthesis, conformational analysis and in vitro cleavage of synthetic human synaptobrevin II 1-93 by tetanus toxin L chain, 222(1) Eur. J. Biochem. 173-181 (1994); Patrick Foran et al., Differences in the protease activities of tetanus and botulinum B toxins revealed by the cleavage of vesicle-associated membrane protein and various sized fragments, 33(51) Biochemistry 15365-15374 (1994)); os resíduos 51 a 93 ou os resíduos 1 a 86 da VAMP-2 de rato, ver, v.g., Yamasaki et al., supra, (1994); ou os resíduos 33 a 94 da VAMP-1-1 humana (SEQ ID NO:28), os resíduos 33 a 94 da VAMP-1-2 humana (SEQ ID NO:29) e os resíduos 33 a 94 da VAMP-1-3 humana (SEQ ID NO: 30) . Uma sequência de reconhecimento de TeNT também pode incluir, por exemplo, os resíduos 25 a 86, os resíduos 33 a 86 ou os resíduos 51 a 86 da VAMP-2 humana (SEQ ID NO: 31) ou da VAMP-2 de rato (SEQ ID NO: 38) . Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de TeNT semelhante a partir de um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma ou espécie homóloga de VAMP susceptível a TeNT, tal como a VAMP-1 humana ou a VAMP de ouriço-do-mar ou de Aplysia. 67

Assim, uma sequência de reconhecimento de TeNT pode corresponder a um segmento de uma proteínas que é susceptível a clivagem pela toxina do tétano ou pode ser praticamente idêntica a um segmento de uma proteína susceptível a TeNT. Conforme ilustrado no quadro 4, são já conhecidas na especialidade diversas proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis a clivagem por TeNT, incluindo, por exemplo, VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3/celubrevina humana e de murganho; VAMP-2 bovina; VAMP-2 e VAMP-3 de rato; VAMP-2 de galinha; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD e synE de Drosophila; VAMP de Hirudo e de tipo SNB1 de Caenorhabditis. Assim, uma sequência de reconhecimento de TeNT pode corresponder, por exemplo, a uma segmento de VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-2 ou VAMP-3 de rato; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de murganho; VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de galinha; VAMP-2 ou VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 ou VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD ou synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 e de tipo SNB de Caenorhabditis, suas isoformas, ou outras proteínas, que ocorrem naturalmente, susceptíveis a clivagem por TeNT. Além do mais, a comparação de sequências de aminoácidos de VAMP nativas clivadas por TeNT indica que tais sequências não estão totalmente conservadas (quadro 4) . Tal conclusão indica que há diversas modificações e substituições de aminoácidos, relativamente a uma sequência de VAMP, que ocorre naturalmente, susceptível a TeNT, que podem ser toleradas num substrato de TeNT útil na invenção. Faz-se observar que é possível preparar, se desejado, uma sequência de reconhecimento de TeNT semelhante a partir de 68 um segmento correspondente (homólogo) de outra isoforma, parálogo ou ortólogo de VAMP-1 ou VAMP-2 susceptível a TeNT, tal como a sequência de reconhecimento de TeNT contida em VAMP-1 e VAMP-2, identificada nos organismos apresentados antes e no quadro 4.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula compreende, em parte, um substrato de TeNT associado à membrana que compreende um primeiro membro de um par de FRET e uma sequência de reconhecimento de TeNT, incluindo um local de clivagem. Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de reconhecimento da toxina de tétano" designa uma ligação cissil em conjunto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para a detecção da proteólise na ligação cissil por meio de uma toxina de tétano, sob condições adequadas. Uma ligação cissil clivada por TeNT pode ser, por exemplo, Gln-Phe.

De acordo com um aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de TeNT que compreende uma sequência de reconhecimento de TeNT que contém pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, incluindo Gln-Phe. De acordo com outro aspecto desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de TeNT que compreende a sequência de reconhecimento de TeNT Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 104) . De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, uma sequência de reconhecimento de TeNT que compreende uma porção de VAMP-1-1, tal como, v.g., os resíduos 1 a 118 da SEQ ID NO: 28 ou os resíduos 33 a 94 da SEQ ID NO: 28. De 69 acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de TeNT que compreende uma porção de VAMP-1-2, tal como, v.g., os resíduos 1 a 117 da SEQ ID NO: 29 ou os resíduos 33 a 94 da SEQ ID NO: 29. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de TeNT que compreende uma porção de VAMP-1-3, tal como, v.g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 30 ou os resíduos 33 a 94 da SEQ ID NO: 30. De acordo com outros aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo inclui, em parte, a sequência de reconhecimento de TeNT que compreende uma porção de VAMP-2, tal como, v. g., os resíduos 1 a 116 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 25 a 94 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 33 a 94 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 51 a 93 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 1 a 86 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 25 a 86 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 33 a 86 da SEQ ID NO: 31; os resíduos 51 a 86 da SEQ ID NO: 31, ou um seu peptidomimético. A SNAP-25, a VAMP e a sintaxina partilham um motivo curto, normalmente localizado nas regiões em que se prevê que adoptem uma conformação α-helicoidal, designada por motivo SNARE. Este motivo compreende normalmente um motivo com nove aminoácidos que satisfaz a fórmula geral Η-Θ-Θ-Χ-Η-Θ-Χ-Η-Ρ (veja-se a fig. 3b), em que o símbolo H representa um resíduo alifático, o símbolo Θ representa um resíduo carboxilato, o símbolo P representa um resíduo polar e o símbolo X representa um aminoácido qualquer, ver, v.g., Ornella Rossetto et al., SNARE motif and neurotoxins, 372(6505) Nature 415-416 (1994); Rossella Pellizzari et al., Structural determinants of the specificity for 70 synaptic vesicle-associated membrane protein/synaptobrevin of tetanus and botulinum type B and G neurotoxins, 271(34) J. Biol. Chem. 20353-20358 (1996); Rossella Pellizzari et al., The interaction of synaptic vesicle-associated membrane protein/synaptobrevin with botulinum neurotoxins D and F, 409(3) FEBS Lett. 339-342 (1997); e Philip Washbourne et al., Botulinum neurotoxin types A and E require the SNARE motif in SNAP-25 for proteolysis, 418(1-2) FEBS Lett. 1-5 (1997) . Este motivo está presente nas isoformas de SNAP-25, VAMP e sintaxina expressas em animais susceptiveis às toxinas. Pelo contrário, as proteínas SANP-25 de Drosophila e de levedura são resistentes a estas toxinas. Além disso, as isoformas de VAMP e de sintaxina não implicadas na exocitose contém alterações na sequência nestas regiões de motivo a-helicoidal.

Em proteínas susceptiveis a clivagem por toxina de clostrídeo estão presentes repetições múltiplas do motivo α-helicoidal: estão naturalmente presentes 4 cópias na SNAP-25, designadas por S1-S4; estão naturalmente presentes duas cópias na VAMP, designadas por VI e V2; e estão naturalmente presentes duas cópias na sintaxina, designadas por XI e X2, veja-se, v.g., Humeau et al., supra, (2000) . Além disso, os péptidos que corresponde, à sequência específica dos motivos α-helicoidal podem inibir a actividade da toxina in vitro e in vivo, podendo tais péptidos efectuar uma inter-inibição em toxinas diferentes. Além do mais, os anticorpos desenvolvidos contra tais péptidos podem inter-reagir com as três proteínas alvo, indicando que o motivo α-helicoidal está exposto na superfície da proteína e adopta uma configuração semelhante para cada uma das três proteínas alvo. É consistente com 71 estas conclusões, o facto de as toxinas específicas de SNAP-25, específicas de VAMP e específicas de sintaxina inter-inibirem-se, competindo pelo mesmo local de ligação, embora não efectuem a clivagem não específica de alvos. Estes resultados indicam que uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo pode incluir, se desejado, pelo menos um motivo α-helicoidal. Sabe-se que um motivo α-helicoidal não é necessário para a clivagem por uma toxina de clostrídeo, conforme evidenciado pelos substratos 16 mer e 17-mer para a BoNT/A que são conhecidos na especialidade, ver, v.g., Schmidt & Bostian, supra, (1997); Schmidt & Bostian, supra, (12 de Out. de 1999); e Schmidt & Stafford, supra, (13 de Jul. de 2004).

Embora seja possível encontrar múltiplos motivos a-helicoidais nas proteínas alvo, que ocorrem naturalmente, de SNAP-25, VAMP e sintaxina, uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo útil num substrato de toxina de clostrídeo pode possuir um único motivo a-helicoidal. De acordo com variantes particulares, um método da invenção tem por base uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo que inclui dois ou vários motivos a-helicoidais suplementares. Uma sequência de reconhecimento de BoNT/A ou de BoNT/E pode incluir, por exemplo, o motivo α-helicoidal S4, por si só ou combinado com um ou vários motivos α-helicoidais suplementares; uma sequência de reconhecimento de BoNT/B, de BoNT/G ou de TeNT pode incluir, por exemplo, o motivo α-helicoidal V2, por si só ou combinado com um ou vários motivos a-helicoidais suplementares; a sequência de reconhecimento de BoNT/Cl pode incluir, por exemplo, o motivo α-helicoidal S4, por si só ou combinado com um ou vários motivos a-helicoidais 72 suplementares, ou o motivo α-helicoidal X2, por si só ou combinado com um ou vários motivos a-helicoidais suplementares; e uma sequência de reconhecimento de BoNT/D ou de BoNT/F pode incluir, por exemplo, o motivo a-helicoidal VI, por si só ou combinado com um ou vários motivos α-helicoidais suplementares. Nos quadros 6, 7 e 8 são apresentados motivos SNARE representativos.

QUADRO 6 Motivos SNARE de SNAP-25 e de proteínas associadas Organismo Isoforma Motivo SI S2 S3 S4 Primata SNAP-25A SNAP-25B ADESLESTR VEESKDAGI LDEOGEOLD LDEQGEQLE MDENLEQVS Primata SNAP-23A SNAP-23B TDESLESTR AIESQDAGI LDEQKEQLN MEENLTQVG Roedor SNAP-25A SNAP-25B ADESLESTR VEESKDAGI LDEQGEQLD LDEQGEQLE MDENLEQVS Roedor SNAP-23 TDESLESTR AIESQDAGI LDEQGEQLN MEENLTQVG ave SNAP-25B ADESLESTR VEESKDAGI LDEQGEQLE MDENLEQVS Anfíbio SNAP-25A SNAP-25B ADESLESTR VEGSKDAGI LDEQGEQLD LDEQGLEQLE MDENLEQVG Anfíbio SNAP-23 ADESLESTR ALESQDAGI LDEQGEQLD MDENLVQVG Peixe SNAP-25A SNAP-25B ADESLESTR VEESKDAGI LDEQGEQLE MDENLEQVG MDENLEQVG Peixe SNAP-23 TDESLESTR AEESRETGV LDEQGEQLR MEENLDQVG Raia SNAP-25 TDESLESTR VEESKDAGI LDEQGEQLE MEENLDQVG Ouriço-do- -mar SNAP-25 TDESLESTR AEESKEAGI LDEQGEQLD MDENLTQVS Insecto SNAP-25 ADESLESTR CEESKEAGI LDDQGEQLD MEENMGQVN Insecto SNAP-24 ADESLESTR MDESKEAGI LDDQGEQLD MDENLGQVN 73 QUADRO 6 Motivos SNARE de SNAP-25 e de proteínas associadas Organismo Isoforma Motivo SI S2 S3 S4 Anelídeo SNAP-25 TDDSLESTR CEESKDAGI LDEQGEQLD MEQNMGEVS Cefalópode SNAP-25 TDDSLESTR CEESKEAGI LDEQGEQLD MENNMKEVS Gastrópode SNAP-25 TNESLESTR CEESKEAGI LDEQGEQLD MEQNIGEVA Nemátode SNAP-25 TDDSLESTR CEESKEAGI LDDQGEQLE MDENVQQVS Clivagem proteolítica ocorre neste local (*); clivagem proteolítica não detectada neste local (-) ; clivagem proteolítica não determinada neste local (ND)

Quadro 6 - Motivos SNARE de SNAP-25 e proteínas associadas. Primata: SNAP-25A humana, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 1; SNAP-25B humana, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 2; SNAP-23A humana, resíduos 17 a 25, 31 a 39, 45 a 53 e 152 a 160 da SEQ ID NO: 3; SNAP-23B humana, resíduos 17 a 25, 31 a 39, 45 a 53 e 152 a 160 da SEQ ID NO: 4; SNAP-25B de macaco, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 5; roedor: SNAP-25A de rato, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 6; SNAP-25B de rato, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 7; SNAP-25B de murganho, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 8; SNAP-23 de rato, resíduos 17 a 25, 31 a 39, 45 a 53 e 151 a 159 da SEQ ID NO: 9; SNAP-23 de murganho, resíduos 17 a 25, 31 a 39, 45 a 53 e 151 a 159 da SEQ ID NO: 10; ave: SNAP-25B de galinha, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 11; peixe: SNAP-25A de peixe-dourado, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 144-152 da SEQ ID NO: 12; SNAP-25B de peixe-dourado, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 143 a 151 da SEQ ID NO: 13; SNAP-25A de peixe-zebra, resíduos 22 74 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 144 a 152 da SEQ ID NO: 14; SNAP-25B de peixe-zebra, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 143 a 151 da SEQ ID NO: 15; SNAP-23 de peixe-zebra, resíduos 17 a 25, 31 a 39, 45 a 53 e 157 a 165 da SEQ ID NO: 16; raia: SNAP-25 de tremelga-marmoreada, resíduos 26 a 34, 40 a 48, 54 a 62 e 153 a 161 da SEQ ID NO: 17; anfíbio: SNAP-25A de sapo, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 18; SNAP-25B de sapo, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 19; SNAP-23 de sapo, resíduos 17 a 25, 31 a 39, 45 a 53 e 146 a 154 da SEQ ID NO: 20; SNAP-25 de ouriço-do-mar, resíduos 24 a 32, 38 a 46, 52 a 60 e 152 a 160 da SEQ ID NO: 21; insecto: SNAP-25 da mosca da fruta, resíduos 29 a 37, 43 a 51, 57 a 65 e 154 a 163 da SEQ ID NO: 22 212; SNAP-24 da mosca da fruta, resíduos 24 a 32, 38 a 46, 52 a 60 e 153 a 162 da SEQ ID NO: 23; anelídeo: SNAP-25 de sanguessuga, resíduos 30 a 38, 44 a 52, 58 a 66 e 153 a 161 da SEQ ID NO: 24; cefalópode: SNAP-25 de lula, resíduos 25 a 33, 39 a 47, 53 a 61 e 153-161 da SEQ ID NO: 25; gastrópode: SNAP-25 de caracol de água doce, resíduos 32 a 40, 46 a 54, 60 a 68 e 160 a 168 da SEQ ID NO: 2 6; nemátode: SNAP-25 de nemátode, resíduos 22 a 30, 36 a 44, 50 a 58 e 148-156 da SEQ ID NO: 27.

QUADRO 7 Motivos SNARE de VAMP e proteínas associadas Organismo Isoforma Motivo VI V2 Primata VAMP1-1 VAMP1-2 VAMP1-3 VEEVVDIIR LDDRADALQ Primata VAMP 2 VDEWDIMR LDDRADALQ Primata VAMP 3 VDEWDIMR LDDRADALQ 75

QUADRO 7 Motivos SNARE de VAMP e proteínas associadas Organismo Isoforma Motivo VI V2 Bovino VAMP 2 VDEVVDIMR LDDRADALQ Roedor VAMP 1 VAMP1/lb VEEVVDIIR VEEVVDIMR LDDRADALQ Roedor VAMP 2 VAMP2-b VDEVVDIMR LDDRADALQ Roedor VAMP 3 VDEVVDIMR LDDRADALQ ave VAMP 1 VEEVVDIMR LDDRADALQ ave VAMP 2 VDEVVDIMR LDDRADALQ ave VAMP 3 VDEVVDIMR LDDRADALQ Anfíbio VAMP 2 VDEVVDIMR LDDRADALQ Anfíbio VAMP 3 VDEVVDIMR LDDRADALQ Peixe VAMP 1 VDEVVDIMR LDDRADALQ Peixe VAMP 2 VDEVVDIMR LDDRADALQ Peixe VAMP 3 VDEVVDIMR LDDRADALQ Raia VAMP 1 VEEVVDIIR LDDRADALQ Ouriço-do-mar VAMP VDEVVDIMR LDDRADALQ Insecto Syn-Al Syn-Bl VDEVVGIMR LGERADQLE Insecto Syn-A2 Syn-B2 VDEVVGIMR LGERADQLE Syn-C Insecto Syn-D VDEVVDIMR LDDRADALQ Syn-E Anelídeo VAMP VDEVVGMMR LDGRADALQ Cefalópode VAMP VEEVVGIMR LDDRADALQ Gastrópode VAMP VDEVVGIMR LDDRAEALQ Nemátode SNB1 tipo SNB VDEVVGIMR VNEVIDVMR LDDRADALQ LDHRAEVLQ

Quadro 7 - Motivos SNARE de VAMP e de proteínas associadas. Primata: VAMP-1-1 humana, resíduos 40-48 e 56-64 da SEQ ID NO: 28; VAMP-1-2 humana, resíduos 40-48 e 56- 76 64 da SEQ ID NO: 29; VAMP-1-3 humana, resíduos 40-48 e 56-64 da SEQ ID NO: 30; VAMP-2 humana, resíduos 39-47 e 63-71 da SEQ ID NO: 31; VAMP-2 de macaco, resíduos 39-47 e 63-71 da SEQ ID NO: 32; VAMP-3/celubrevina humana, resíduos 22-30 e 46-54 da SEQ ID NO: 33; bovino: VAMP-2 de vaca, resíduos 39-47 e 63-71 da SEQ ID NO: 34; roedor: VAMP-1 de rato, resíduos 40-48 e 56-64 da SEQ ID NO: 35; VAMP-l-b de rato, resíduos 40-48 e 56-64 da SEQ ID NO: 36; VAMP-1 de murganho, resíduos 40-48 e 56-64 da SEQ ID NO: 37; VAMP-2 de rato, resíduos 39-47 e 63-71 da SEQ ID NO: 38; VAMP-2-b de rato, resíduos 39-47 e 63-71 da SEQ ID NO: 39; VAMP-2 de murganho, resíduos 39-47 e 63-71 da SEQ ID NO: 40; VAMP-3/celubrevina de rato, resíduos 26-34 e 50 a 58 da SEQ ID NO: 41; VAMP-3/celubrevina de murganho, resíduos 26-34 e 50 a 58 da SEQ ID NO: 42; ave: VAMP-1 de galinha, resíduos 182-190 e 198-206 da SEQ ID NO: 43; VAMP-2 de galinha, resíduos 37-45 e 61-69 da SEQ ID NO: 44; VAMP-3/celubrevina de galinha, resíduos 26-34 e 50 a 58 da SEQ ID NO: 45; peixe: VAMP-1 de peixe-zebra, resíduos 41-49 e 57-65 da SEQ ID NO: 46; VAMP-2 de peixe-zebra, resíduos 33-41 e 57-65 da SEQ ID NO: 47; VAMP-3 de peixe-zebra, resíduos 25-33 e 49-57 da SEQ ID NO: 48; raia: VAMP-1 de tremelga-marmoreada, resíduos 42-50 e 58-66 da SEQ ID NO: 49; anfíbio: VAMP-2 de sapo, resíduos 37-45 e 61-69 da SEQ ID NO: 50; VAMP-3 de sapo, resíduos 24-32 e 48-56 da SEQ ID NO: 51; VAMP de ouriço-do-mar, resíduos 23-31 e 39-47 da SEQ ID NO: 52; insecto: SynAl de mosca da fruta, resíduos 31-39 e 47-55 da SEQ ID NO: 53; SynA2 de mosca da fruta, resíduos 54-62 e 70-78 da SEQ ID NO: 54; SynBl de mosca da fruta, resíduos 54-62 e 70-78 da SEQ ID NO: 55; SynB2 de mosca da fruta, resíduos 54-62 e 70-78 da SEQ ID NO: 56; SynC de mosca da 77 fruta, resíduos 48-56 e 64-72 da SEQ ID NO: 57; SynD de mosca da fruta, resíduos 67-75 e 83-91 da SEQ ID NO: 58; SynE de mosca da fruta, resíduos 67-75 e 83-91 da SEQ ID NO: 59; anelídeo: VAMP de sanguessuga, resíduos 37-45 e 53-61 da SEQ ID NO: 60; cefalópode: VAMP de lula, resíduos 47-55 e 63-71 da SEQ ID NO: 61; gastrópode: VAMP de caracol de água doce, resíduos 40-48 e 56-64 da SEQ ID NO: 62; VAMP caracol marinho, resíduos 30-38 e 46-54 da SEQ ID NO: 63; nemátode: SNB1 verme nemátode, resíduos 34-42 e 50 a 58 da SEQ ID NO: 64; de tipo SNB de nemátode, resíduos 40-48 e 56-64 da SEQ ID NO: 65.

QUADRO 8 Motivos SNARE de sintaxina e de proteínas associadas Organismo Isoforma Motivo XI X2 Primata Sintaxina IA Sintaxina 1B1 Sintaxina 1B2 MDEFFEQVE MDEFFEQEE MDEFFEQVE LEDMLESGN LEDMLESGK LEDMLESGK Primata Sintaxina 2-1 Sintaxina 2-2 Sintaxina 2-3 MDDFFHQVE LEEMLESGK Primata Sintaxina 3A MDEFFSEIE LEEMLESGN Bovino Sintaxina IA Sintaxina 1B2 MDEFFEQVE LEDMLESGN LEDMLESGK Roedor Sintaxina IA Sintaxina 1B1 Sintaxina 1B2 MDEFFEQVE MAEFFEQVE MDEFFEQVE LEDMLESGN LEDMLESGK LEDMLESGK Roedor Sintaxina 2 MDGFFHQVE LEEMLESGK Roedor Sintaxina 3A Sintaxina 3B MDEFFSEIE LEEMLESGN Roedor Sintaxina 3C MDEFFSENF LEEMLESGN ave Sintaxina 1B MDEFFEQVE LEDMLESGK 78

QUADRO 8 Motivos SNARE de sintaxina e de proteínas associadas Organismo Isoforma Motivo XI X2 ave Sintaxina 2 MDDFFQQVE LEEMLESGN Peixe Sintaxina 1B MDEFFEQVE LEDMLESGK Peixe Sintaxina 3 MDEFFSQIE LEEMLEGGN Ouriço-do-mar Sintaxina 1B MEEFFEQVE LEDMLESGN Insecto Sintaxina IA MDDFFAQVE LEKMLEEGN Anelídeo Sintaxina IA MEEFFEQVN LEDMLESGN Cefalópode Sintaxina IA MEEFFEQVE LEDMLESGN Gastrópode Sintaxina IA MEEFFEQVD LEDMIESGN

Quadro δ - Motivos SNARE de sintaxina e de proteínas associadas. Primata: Sintaxina IA humana, resíduos 30-38 e 165-173 da SEQ ID NO: 66; Sintaxina 1B1 humana, resíduos 29- 37 e 164-172 da SEQ ID NO: 67; Sintaxina 1B2 humana,

resíduos 29-37 e 164-172 da SEQ ID NO: 68; Sintaxina 2-1 humana, resíduos 29-37 e 168-176 da SEQ ID NO: 69; Sintaxina 2-2 humana, resíduos 29-37 e 168-176 da SEQ ID NO: 70; Sintaxina 2-3 humana, resíduos 29-37 e 168-176 da SEQ ID NO: 71; Sintaxina 3 humana, resíduos 32-40 e 165-173 da SEQ ID NO: 72; bovino: Sintaxina IA de vaca, resíduos 30- 38 e 165-173 da SEQ ID NO: 73; Sintaxina 1B2 de vaca,

resíduos 29-37 e 164-172 da SEQ ID NO: 74; roedor: Sintaxina IA de rato, resíduos 30-38 e 165-173 da SEQ ID NO: 75; Sintaxina 1B2 de rato, resíduos 29-37 e 164-172 da SEQ ID NO: 76; Sintaxina IA de murganho, resíduos 30-38 e 165-173 da SEQ ID NO: 77; Sintaxina 1B1 de murganho, resíduos 29-37 e 164-172 da SEQ ID NO: 78; Sintaxina 1B2 de murganho, resíduos 29-37 e 164-172 da SEQ ID NO: 79; Sintaxina 2 de murganho, resíduos 31-39 e 170-178 da SEQ ID NO: 80; Sintaxina 2 de murganho, resíduos 30-38 e 169-177 79 da SEQ ID NO: 81; Sintaxina 3A de rato, resíduos 32-40 e 165-173 da SEQ ID NO: 82; Sintaxina 3A de murganho, resíduos 32-40 e 165-173 da SEQ ID NO: 83; Sintaxina 3B de murganho, resíduos 32-40 e 165-173 da SEQ ID NO: 84; Sintaxina 3C de murganho, resíduos 32-40 e 147-155 da SEQ ID NO: 85; ave: Sintaxina 1B de galinha, resíduos 29-37 e 157-165 da SEQ ID NO: 86; Sintaxina 2 de galinha, resíduos 28-36 e 167-175 da SEQ ID NO: 87; peixe: Sintaxina 1B de peixe-zebra, resíduos 29-37 e 164-172 da SEQ ID NO: 88; Sintaxina 3 de peixe zebra, resíduos 29-37 e 163-171 da SEQ ID NO: 89; Sintaxina 1B de ouriço-do-mar, resíduos 29-37 e 164-172 da SEQ ID NO: 90; insecto: Sintaxina IA de mosca da fruta, resíduos 33-41 e 168-176 da SEQ ID NO: 91; alenídeo: Sintaxina IA de sanguessuga, resíduos 36 a 44 e 171-179 da SEQ ID NO: 92; cefalópode: Sintaxina IA de lula, resíduos 33-41 e 168-176 da SEQ ID NO: 93; gastrópode: Sintaxina IA de caracol de água doce, resíduos 32-40 e 167-175 da SEQ ID NO: 94; Sintaxina IA de caracol marinho, resíduos 32-40 e 167-175 da SEQ ID NO: 95.

Tal como referido antes, o complexo SNARE é constituído por t-SNARE SNAP-25 em conjunto com outra t-SNARE, sintaxina 1 e uma v-SNARE VAMP/sinaptobrevina. Os membros da família das SNAP-25 das proteínas podem ser divididos em três domínios estruturais e um terminal amino α-hélice com aproximadamente 84 resíduos, uma espira inter-helicoidal com aproximadamente 36 aminoácidos e um terminal carboxi α-hélice com aproximadamente 86 resíduos, em função dos membros individuais. Conforme a seguir se descreve, todas estas três regiões podem ser utilizadas para encaminhar as SNAP-25 até à membrana de plasma, por si sós ou com uma qualquer combinação das três. 80

Crê-se que a espira inter-helicoidal de SNAP-25 é importante para conferir a especificidade de direcção desta proteína SNARE para a membrana. Por exemplo, num estudo, um domínio encaminhado à membrana, constituído pelos resíduos 85-120 de SNAP-25, foi capaz de localizar a membrana celular, Susana Gonzalo et al., SNAP-25 is targeted to the plasma membrane through a novel membrane-binding domain, 274(30) J. Biol. Chem.21313-21318 (1999). Esta região representa dois terços da espira inter-helicoidal que liga as α-hélices do terminal amino e do terminal carboxi de SNAP-25. Crê-se que a função deste domínio de encaminhamento seja independente das interacções proteína-proteína de SNARE, uma vez que a remoção das regiões de SNAP-25 que estão associadas à sintaxina ou à sinaptobrevina não interferiu com o encaminhamento adequado de SNAP-25 para a membrana. O alinhamento dos membros da família de SNAP-25 revelou dois motivos conservados presentes na região do espira inter-helicoidal que é responsável pelo encaminhamento até à membrana. O primeiro é uma região rica em cisteína que está presente no terminal amino no limite do domínio da espira inter-helicoidal de endereçamento para a membrana. Um ou vários dos resíduos cisteína presentes neste motivo são acilados com um material gordo por meio de uma ligação tioéster do palmitato. A reacção de palmitoilação deste motivo enriquecido em cisteína pode ser importante para a inserção na membrana, uma vez que a eliminação destes resíduos de cisteína dá origem a uma perda do endereçamento para a membrana de SNAP-25. O segundo é um motivo com cinco aminoácidos localizado no terminal carboxi no limite do domínio de espira inter- 81 helicoidal de endereçamento para a membrana (QPXR(V/I)). Crê-se que este motivo desempenha um papel critico na associação à membrana, veja-se, v.g., Gonzalo et al., supra, (1999); Philip Washboume et al., Cysteine resíduos of SNAP-25 are required for SNARE disassembly and exocytosis, but not for membrane targeting, 357(Pt 3) Biochem. J. 625-634 (2001).

Crê-se que as α-hélices dos vários membros complexos de SNARE estejam implicadas nas interacções proteína-proteína entre os membros. Por exemplo, uma solução de estrutura cristalina de complexo SNARE revela que a SNAP- 25, a sintaxina e a sinaptobrevina parecem favorecer uma associação em feixe heterotrimérica de quatro-hélices em paralelo, ver, v. g. , R. Bryan Sutton et ai., Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at CM A resolution, 395(6700) Nature 347-353 (1998). Esta análise indica um entrelaçado extensivo das a-hélices com a região do terminal amino do feixe que compreende as interacções entre a α-hélice do terminal amino de SNAP-25 com a sintaxina, diversas associações centrais entre os três membros e uma associação entre a sintaxina e a sinaptobrevina na posição do terminal carboxilo do feixe com de quatro hélices.

As interacções entre as α-hélices dos membros do complexo SNARE parecem ser uma outra forma de localizar a SNAP-25 na membrana. Por exemplo, a co-expressão de SNAP-25 com sintaxina proporciona o endereçamento da SNAP-25 até à membrana, na ausência de uma espira inter-helicoidal funcional, o que sugere que as interacções entre estas duas t-SNARE pode encaminhar os substratos de toxina de 82 clostrídeo até à membrana, ver, v.g., Washboume et al., supra, (2001) .

Os membros da família de sintaxina de proteínas podem ser divididos em vários domínios estruturais. A metade do terminal amino da proteína contém uma região Habc que compreende três domínios α-hélice localizados nos aminoácidos 30-60, 69-104 e 110-154. A metade do terminal carboxilo de sintaxina-1 contém uma α-hélice com aproximadamente 52 a 69 resíduos, em função dos membros individuais, e um domínio de ancoragem da membrana com aproximadamente 23 aminoácidos. Tal como a seguir se descreve, as regiões que compreendem o domínio de ancoragem da membrana de sintaxina podem ser utilizadas para encaminhas os substratos de toxina de clostrídeo até à membrana plasmática.

Os substratos de toxina de clostrídeo descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, um domínio de endereçamento para a membrana. Tal como aqui utilizada, a expressão "domínio de endereçamento para a membrana" é sinónima de "MTD" e designa um péptido de SNAP-25 ou de Sintaxina que encaminha um substrato de toxina de clostrídeo até à membrana celular. De acordo com os aspectos da invenção, é possível utilizar qualquer domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 ou de

Sintaxina, desde que o substrato de toxina de clostrídeo continue a ser clivável por uma toxina de clostrídeo. Como exemplos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, domínios de endereçamento para a membrana que ocorrem naturalmente presentes em SNAP-25, variantes de MTD de SNAP-25 que ocorrem naturalmente e variantes de MTD de SNAP-25 que não ocorrem naturalmente, tais como, v.g., 83 variantes de MTD de SNAP-25 MTD manipuladas geneticamente ou produzidas, v.g.r por mutagénese aleatória ou concebidas de forma racional ou peptidomiméticos de MTD de SNAP-25; e domínios de endereçamento para a membrana de presentes em Sintaxina, variantes de MTD de sintaxina que ocorrem naturalmente e variantes de MTD de sintaxina que não ocorrem naturalmente, tais como, v.g., variantes de MTD de sintaxina manipuladas geneticamente ou produzidas, v.g., por mutagénese aleatória ou concebidas de uma forma racional e peptidomiméticos de MTD de sintaxina.

Assim, de acordo os seus aspectos, a presente invenção proporciona uma célula isolada conforme descrita nas reivindicações anexas.

De acordo com outros aspectos, a presente invenção proporciona um método para determinar a actividade da toxina de clostrídeo conforme descrito nas reivindicações anexas.

Assim, de acordo com uma variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende uma região suficiente de SNAP-25 para encaminhar um substrato de toxina, conforme descrito na presente memória descritiva, até à membrana. De acordo com um aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende uma região suficiente da região inter-helicoidal de SNAP-25 para encaminhar um substrato de toxina, conforme descrito na presente memória descritiva, até à membrana. De acordo com um aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1. 84

Prevê-se que uma região de espira inter-helicoidal de SNAP-25, com um qualquer comprimento, possa compreender o dominio de endereçamento para a membrana, desde que a região da espira seja suficiente para encaminha o substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. Assim, de acordo com aspectos desta variante, esta pode incluir uma região de espira inter-helicoidal que compreende, v.g., pelo menos 35 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 30 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 25 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 20 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 15 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 10 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1 ou pelo menos 5 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1. Há outros aspectos desta variante que podem incluir uma região em espira inter-helicoidal que compreende, v.g., no máximo 35 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, no máximo 30 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, no máximo 25 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, no máximo 20 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, no máximo 15 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1, no máximo 10 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1 ou no máximo 5 residuos seleccionados entre os aminoácidos 85-120 da SEQ ID NO: 1. 85

De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos CGLCVCPCNK (SEQ ID NO: 128) . De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos CGLFICPCNK (SEQ ID NO: 129) . De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos CGLCSCPCNK (SEQ ID NO: 130) . De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos CGLCPCPCNK (SEQ ID NO: 131) . De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos CGIVCPWKK (SEQ ID NO: 132). De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos CGICVLPCNK (SEO ID NO: 133). De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos CGLCVLPWNK (SEQ ID NO: 134).

De acordo com outra variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos QPXRV (SEQ ID NO: 135), em que o símbolo X representa um aminoácido qualquer. De acordo com outro aspecto desta variante, o dominio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos OPXRI (SEQ ID NO: 136), em que o símbolo X representa um aminoácido qualquer. De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos QPARV (SEQ ID NO: 137). De acordo com outro aspecto desta variante, o dominio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos 86 QPQRV (SEQ ID NO: 138) . De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos QPGRV (SEQ ID NO: 139). De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos OPSRI (SEQ ID NO: 140) . De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos QPMRM (SEPA ID NO: 141) . De acordo com outro aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos OPRI (SEQ ID NO: 142).

De acordo com outra variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos da α-hélice do terminal amino de SNAP-25 suficientes para encaminhar o substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. De acordo com um aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1. Prevê-se que uma α-hélice do terminal amino de SNAP-25, com um qualquer comprimento, possa compreender o domínio de endereçamento para a membrana, desde que a região da espira seja suficiente para encaminhar um substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. Assim, há aspectos desta variante que podem incluir uma região α-hélice do terminal amino que compreende, v.g., pelo menos 80 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 75 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 70 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 65 resíduos seleccionados entre os 87 aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 60 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 55 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 50 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 45 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 40 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 35 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 30 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 25 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 20 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 15 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 10 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1 ou pelo menos 5 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1. Há outros aspectos desta variante que podem incluir uma região α-hélice do terminal amino que compreende, v.g., no máximo 80 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 75 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 70 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 65 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 60 residuos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 55 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 50 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 45 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 40 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 35 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 30 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 25 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 20 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 15 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1, no máximo 10 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1 ou no máximo 5 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 1-84 da SEQ ID NO: 1.

Ainda de acordo com outra variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende aminoácidos de α-hélice do terminal carboxilo de SNAP-25 suficientes +para encaminhar um substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. De acordo com um aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1. Prevê-se que a α-hélice do terminal carboxilo de SNAP-25, com um qualquer comprimento, possa compreender o domínio de endereçamento para a membrana, desde que a região da espira seja suficiente para encaminhar um substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. Assim, há aspectos desta variante que podem incluir uma região α-hélice do terminal carboxilo que compreende, v.g., pelo menos 80 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1; pelo menos 75 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 70 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 65 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, 89 pelo menos 60 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 55 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 50 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 45 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 40 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 35 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 30 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 25 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 20 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 15 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, pelo menos 10 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1 ou pelo menos 5 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1. Há outros aspectos desta variante que podem incluir uma região α-hélice do terminal carboxilo que compreende, v.g., no máximo 85 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1; no máximo 80 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121 -206 da SEQ ID NO: 1; no máximo 7 5 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 70 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121 -206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 65 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 60 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121 -206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 55 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 50 resíduos 90 seleccionados entre os aminoácidos 121-208 da SEQ ID NO: 1, no máximo 45 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 40 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-208 da SEQ ID NO: 1, no máximo 35 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 30 resíduos seleccionados entre OS aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 25 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 20 resíduos seleccionados entre OS aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 15 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1, no máximo 10 resíduos seleccionados entre OS aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1 ou no máximo 5 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 121-206 da SEQ ID NO: 1.

De acordo com outra variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende uma região suficiente de sintaxina para encaminhar um substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. De acordo com um aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende uma região suficiente do domínio de ancoragem da membrana de sintaxina para encaminhar um substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. De acordo com um aspecto desta variante, o domínio de endereçamento para a membrana compreende os aminoácidos 266-288 da SEQ ID NO: 66. Prevê-se que um domínio de ancoragem da membrana de

Sintaxina, com um qualquer comprimento, possa compreender o domínio de endereçamento para a membrana, desde que a região da espira seja suficiente para encaminhar o 91 substrato de toxina, descrito na presente memória descritiva, até à membrana. Assim, há aspectos desta variante que podem incluir uma região de espiara inter-helicoidal que compreende, v.g.r pelo menos 20 residuos seleccionados entre os aminoácidos 266-288 da SEQ ID NO: 66; pelo menos 15 residuos seleccionados entre os aminoácidos 266-288 da SEQ ID NO: 66 ou pelo menos 10 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 266-288 da SEQ ID NO: 66. Há outros aspectos desta variante que podem incluir um domínio de ancoragem da membrana que compreende, v.g.f no máximo 20 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 266-288 da SEQ ID NO: 66; no máximo 15 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 266-288 da SEQ ID NO: 66 ou no máximo 10 resíduos seleccionados entre os aminoácidos 266-88 da SEQ ID NO: 66.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-IA humana da SEQ ID NO: 66. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIIICCVILGIVIASTVGGIFA, que correspondem aos resíduos 266-288 da SEQ ID NO: 66. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-lBl humana da SEQ ID NO: 67. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IIIIICCVVLGVVLASSIGCTLGL, que correspondem aos resíduos 265-288 da SEQ ID NO: 67. De acordo com outro aspecto desta 92 variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o dominio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-1B2 humana da SEQ ID NO: 68. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o dominio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIIICCVVLGVVLASSIGGTLGL, que correspondem aos resíduos 265-288 da SEQ ID NO: 67. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-2-1 humana da SEQ ID NO: 69. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos LMFIIICVIVLLVILGIILATTLS, que correspondem aos resíduos 264-287 da SEQ ID NO: 69. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o dominio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-2-2 humana da SEQ ID NO: 70. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos WIIIAVSVVLWIIVLIIGLSVGK, que correspondem aos resíduos 264-288 da SEQ ID NO: 70. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-2-3 humana da SEQ ID NO: 71. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreendem, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos WIIIAVSVVLVAIIALIIGLSVGK, que correspondem aos resíduos 93 264-288 da SEQ ID NO: 71. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-3 humana da SEQ ID NO: 72. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos LIIIIVLVVVLLGILALIIGISVGLN, que correspondem aos resíduos 264-289 da SEQ ID NO: 72.

De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-1A de vaca da SEQ ID NO: 73. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIVICCVVLGIVIASTFGGIFG, que correspondem aos resíduos 266-288 da SEQ ID NO: 67.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-1A de rato da SEQ ID NO: 75. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIIICCVILGIIIASTIGGIFG, que correspondem aos resíduos 266-288 da SEQ ID NO: 75. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana de Sintaxina-1B2 de rato da SEQ ID NO: 76. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos 94 ΙΜΙIICCWLGVVLASSIGGTLGL, que correspondem aos resíduos 265-288 da SEQ ID NO: 76. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-2 de rato da SEQ ID NO: 80. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos WIIAAVWAVIAVLALIIGLSVGK, que correspondem aos resíduos 2 67-290 da SEQ ID NO: 80. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-2 de murganho da SEQ ID NO: 81. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos WIIAAVAVAVIAVLALIIGLSVGK, que correspondem aos resíduos 266-289 da SEQ ID NO: 81. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-3A de rato da SEQ ID NO: 82. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos LIIIIVIVVVLLGILALIIGISVGLK, que correspondem aos resíduos 264-289 da SEQ ID NO: 82. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-3A de murganho da SEQ ID NO: 83. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento 95 para a membrana que compreende os aminoácidos LIIIIVVVVVLLGILALIIGLSVGLK, que correspondem aos resíduos 264-289 da SEQ ID NO: 83. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-3B de murganho da SEQ ID NO: 84. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIMICCIILAIILASTIG, que correspondem aos resíduos 265-283 da SEQ ID NO: 84. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-3C de murganho da SEQ ID NO: 85. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIMICCIILAIILASTTOGIFA, que correspondem aos resíduos 247-269 da SEQ ID NO: 85.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-1A de galinha da SEQ ID NO: 86. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o dominio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIIIFVVVLGVVLSPVICGTLGL, que correspondem aos resíduos. 259-282 da SEQ ID NO: 86. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-2 de galinha da SEQ ID NO: 87. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de 96 toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos WIIIVSLVLIAVIGIIIGLSVGIR, que correspondem aos resíduos 263-288 da SEQ ID NO: 87.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-1A de peixe-zebra da SEQ ID NO: 88. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIIICCVILGVVLRSSIGGTLGF, que correspondem aos resíduos 265-288 da SEQ ID NO: 88. De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-3 de peixe-zebra da SEQ ID NO: 89. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IIIIVSVVLVILAIIALIVGISVGLKR, que correspondem aos resíduos 262-288 da SEQ ID NO: 89.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-IA de ouriço-do-mar da SEQ ID NO: 90. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos YIAICCGVALGILILVLIIVLA, que correspondem aos resíduos 264-286 da SEQ ID NO: 90.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrídeo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-1A de mosca da 97 fruta da SEQ ID NO: 91. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMILICLTVLGILAASYVSSYFM, que correspondem aos resíduos 269-291 da SEQ ID NO: 91.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-1A de sanguessuga da SEQ ID NO: 92. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IIILICVSVLILIVGGSLLGIFIP, que correspondem aos resíduos 272-295 da SEQ ID NO: 92.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-1A de lula da SEQ ID NO: 93. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IAILVCLVILVLVIVSTVGGVFGG, que correspondem aos resíduos 269-292 da SEQ ID NO: 93.

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-IA de caracol da SEQ ID NO: 94. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMIIICVCVLIIILVGILGGTFG, que correspondem aos resíduos 268-290 da SEQ ID NO: 94. 98

De acordo com um aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana da Sintaxina-1A de lesma marinha da SEQ ID NO: 95. De acordo com outro aspecto desta variante, um substrato de toxina de clostrideo compreende, em parte, o domínio de endereçamento para a membrana que compreende os aminoácidos IMILVCLAILIIILVGVIGGTLG, que correspondem aos resíduos 268-290 da SEQ ID NO: 95.

Os substratos de toxina de clostrideo descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, um primeiro membro de um par de FRET. Um tal primeiro membro de um par de FRET pode ser um dador ou um fluoróforo aceitador. Assim, o substrato de toxina de clostrideo citado inclui, em parte, um primeiro membro de um par de FRET, o qual é um dador ou um fluoróforo aceitador.

Um primeiro membro do par de FRET descrito na presente memória descritiva inclui proteínas fluorescentes. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína fluorescente" designa um péptido que absorve a energia luminosa num determinado comprimento de onda e emite energia luminosa num comprimento de onda diferente, abrangendo aqueles que emitem em diversos espectros, incluindo os espectros violeta, azul, azul esverdeado, verde, amarelo, cor-de-laranja e vermelho, ver o quadro 9. Prevê-se que as proteínas fluorescentes obtidas a partir de qualquer uma de diversas espécies possam ser úteis de acordo com aspectos da presente invenção, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, proteínas fluorescentes de Aequorea, proteínas fluorescentes de Anemonia, proteínas fluorescentes de Anthozoa, proteínas fluorescentes de Discosoma, proteínas fluorescentes de Entacmeae; proteínas 99 fluorescentes de Heteractis, proteínas fluorescentes de Montastrea, proteínas fluorescentes de Renilla, proteínas fluorescentes de Zoanthus e proteínas fluorescentes de outros organismos. As proteínas fluorescentes úteis na invenção compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, proteínas fluorescentes de tipo selvagem, variantes que ocorrem naturalmente e variantes geneticamente concebidas ou produzidas por, v.g., mutagénese aleatória ou concebidas racionalmente, e fragmentos activos de péptidos obtidos a partir de um organismo. De acordo com aspectos da invenção, como proteínas fluorescentes úteis refere-se, v.g., aquelas que tenham sido geneticamente modificadas para se atingir um desempenho superior, tais como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, comprimentos de onda derivado excitação ou emissão alterados; brilho potenciado, resistência ao pH, estabilidade ou velocidade de formação da proteína fluorescente; fotoactivação ou oligomerização ou fotolixiviação reduzida, ver, v.g., Brendan P. Cormack et al., FACS-optimized Mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP), patente de invenção norte-americana n° 5 804 387 (8 de Set. de 1998); Roger Y. Tsien & Roger Heim, Modified Green Fluorescent Proteins. patente de invenção norte-americana n° 6 800 733 (5 de Out. de 2004); Roger Y. Tsien et al., Long Wavelength Engineered Fluorescent Proteins, patente de invenção norte-americana n° 6 780 975 (24 de Ago. de 2004); e Roger Y. Tsien et al., Fluorescent Protein Sensors For Measuring the pH of a Biological Sample, patente de invenção norte-americana n° 6 627 449 (30 de Set. de 2003) . Faz-se observar que uma proteína fluorescente pode ser manipulada para se obter uma 100 expressão melhorada de proteína, convertendo os codões de tipo selvagem noutros codões que sejam utilizados de um modo mais eficiente nas células usadas para a expressão do substrato de toxina de clostrídeo, ver, v.g., Brian Seed e Jurgen Haas, High Levei Expression of Proteins, patente de invenção norte-americana n° 5 795 737 (18 de Ago. de 18, 1998).

Também se prevê que qualquer um de diversos fragmentos activos de proteína possa ser útil de acordo com aspectos da invenção, desde que tais fragmentos activos mantenham a aptidão para emitir energia luminosa num intervalo adequado para um funcionamento adequado, de acordo com aspectos da invenção, tais como, v.g. 420-460 nm para proteínas fluorescentes que emitam na zona do azul, 460-500 nm para proteínas fluorescentes que emitam na zona do azul esverdeado, 500-520 nm para proteínas fluorescentes que emitam na zona do verde, 520-550 nm para proteínas fluorescentes que emitam na zona do amarelo e 550-740 nm para proteínas fluorescentes que emitam na zona do vermelho. Assim, há aspectos desta variante que podem incluir fragmentos activos de proteínas fluorescentes que mantenham a aptidão para emitir energia luminosa num intervalo adequado para um funcionamento adequado de acordo com aspectos da invenção, os quais possuem um comprimento de, v.g., pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 60 aminoácidos, pelo menos 70 aminoácidos, pelo menos 80 aminoácidos, pelo menos 90 aminoácidos, pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 125 aminoácidos, pelo menos 150 aminoácidos, pelo menos 175 aminoácidos e pelo menos 200 aminoácidos. Há outros aspectos desta variante que podem incluir fragmentos activos de proteínas fluorescentes que 101 mantenham a aptidão para emitir energia luminosa num intervalo adequado para um funcionamento adequado de acordo com aspectos da presente invenção, os quais possuem um comprimento, e.g., no máximo de 50 aminoácidos, no máximo de 60 aminoácidos, no máximo de 70 aminoácidos, no máximo de 80 aminoácidos, no máximo de 90 aminoácidos, no máximo de 100 aminoácidos, no máximo de 125 aminoácidos, no máximo de 150 aminoácidos, no máximo de 175 aminoácidos e no máximo de 200 aminoácidos. QUADRO 9 Excitação e emissão máxima de proteínas fluorescentes exemplificativas Proteína fluorescente Excitação máxima (nm) Emissão máxima (nm) EBFP 380 440 ECFP 439 476 AmCyan 458 489 AcGFP 475 505 ZsGreen 493 505 Vitality® hrGFP 500 506 EGFP 484 510 Monster Green® 505 515 EYFP 512 529 ZsYellow 529 539 DsRed-Express 557 579 DsRed2 563 582 DsRed 558 583 AsRed2 576 592 HcRedl 588 618

Como exemplos não limitativos de proteínas fluorescentes que podem ser funcionalmente ligadas a um substrato de CoNT, descrito na memória descritiva, refere-se, v.g., fotoproteínas, tais como, v.g., aequorina; obelina; proteínas fluorescentes de Aequorea, tais como, 102 v.g., proteínas fluorescentes verdes (GFP, EGFP, ACGFP1), proteínas fluorescentes azuis esverdeadas (CFP, ECFP), proteínas fluorescentes azuis (BFP, EBFP), proteínas fluorescentes vermelhas (RFP), proteínas fluorescentes amarelas (YFP, EYFP), proteínas fluorescentes ultravioleta (GFPuv), as suas variantes com fluorescência aumentada, as suas variantes de destabilização de péptidos e semelhantes; proteínas fluorescentes de recifes de corais, tais como, v.g., proteínas fluorescentes vermelhas de Discosoma (DsRed, DsRedl, Dared2 e DsRed-Express), proteínas fluorescentes vermelhas de Anemonia (AsRed e AsRed2), proteínas fluorescentes vermelhas de Heteractis (HcRed, HcRedl), proteínas fluorescentes azuis esverdeadas de Anemonia (AmCyan, AmCyanl), proteínas fluorescentes verdes de Zoanthus (ZsGreen, ZsGreenl), proteínas fluorescentes amarelas de Zoanthus (ZsYellow, ZsYellowl), as suas variantes com fluorescência aumentada, as suas variantes de destabilização de péptidos e semelhantes; proteína fluorescente verde de Renilla reniformis (Vitality hrGFP), as suas variantes com fluorescência aumentada, as suas variantes de destabilização de péptidos e semelhantes; e as proteínas fluorescentes de Montastraea cavernosa, tais como, v.g., proteína fluorescente de Montastrea cavernosa (proteína fluorescente Monster Green®) , as suas variantes com fluorescência aumentada, as suas variantes de destabilização de péptidos e semelhantes. Um especialista na matéria irá compreender que estas proteínas fluorescentes e diversas outras podem ser úteis enquanto proteína fluorescente de acordo com aspectos da invenção, ver, v.g., Jennifer Lippincott-Schwartz & George H. Patterson, Development and Use of Fluorescent Protein 103

Markers in Living Cells, 300(5616) Science 87-91 (2003); e Jin Zhang et ai., 3(12) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 906-918 (2002). Será do conhecimento de um especialista na matéria que estas e muitas outras proteínas fluorescentes, incluindo espécies de ortólogos e parálogos das proteínas fluorescentes, que ocorrem naturalmente, descritas antes, bem como proteínas fluorescentes manipuladas podem ser úteis como proteínas fluorescentes de acordo com os aspectos da presente memória descritiva. Os substratos de CoNT descritos na presente memória descritiva que contêm, em parte, tais proteínas fluorescentes podem ser preparados e expressos utilizando métodos convencionais, ver, v.g., 'Living Colors® User Manual PT2040-1' (PRI1Y691), BD Biosciences-Clontech, (26 de Nov. de 2001); BD Living-Colors™ User Manual, Volume 11: Reef Coral Fluorescent Proteins, PT3404-1 (PR37085), BD Biosciences-Clontech, (17 de Jul. de 2003); Monster Green Florescent Protein pHMCFP Vector, TB320, Promega-Corp., (Maio de 2004); e Vitality hrGFP Mammalian Expression Vectors, Instruction Manual (rev. 064007g), Stratagene, Inc.. Os vectores de expressão adequados para a expressão de proteínas fluorescentes de bactérias, mamíferos e de outras proteínas fluorescentes são disponibilizados por diversas fontes comerciais, incluindo 'BD Biosciences Clontech' (Paio Alto, CA) ; 'Promega Corp.' (Madison, WI) e 'Stratagene, Inc.' (La Jolla, CA).

De acordo com uma variante, o primeiro membro do par de FRET é uma proteína fluorescente verde. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína fluorescente verde" é sinónimo do termo "GFP" e designa uma proteína que absorve a luz a um determinado comprimento de onda e emite picos de energia 104 luminosa num comprimento de onda situado no intervalo 500-520 nm. Como proteínas fluorescentes verdes úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a AcGFPl da SEQ ID NO: 143, variantes geneticamente manipuladas de AcGFPl e fragmentos activos de AcGFPl que mantenham a aptidão para emitir picos de energia luminosa no intervalo 500-520 nm, a ZsGreen da SEQ ID NO: 144, variantes geneticamente manipuladas de ZsGreen e fragmentos activos de ZsGreen que mantenham a aptidão para emitir picos de energia luminosa no intervalo 500-520 nm, a EGFP da SEQ ID NO: 145, variantes geneticamente modificadas de ECFP e fragmentos activos de ECFP que mantenham a aptidão para emitir picos de energia luminosa no intervalo 500-520 nm, a proteína fluorescente 'Monster Green' (MGFP) da SEQ ID NO: 146, variantes geneticamente manipuladas de MGFP e fragmentos activos de MGFP que mantenham a aptidão para emitir picos de energia luminosa no intervalo 500-520 nm, a Vitatity® hrGFP da SEQ ID NO: 147, variantes geneticamente manipuladas de hrGFP e fragmentos activos de hrGFP que mantenham a aptidão para emitir picos de energia luminosa no intervalo 500-520 nm, bem como GFP que ocorrem naturalmente, variantes de GFP que ocorrem naturalmente, variantes geneticamente manipuladas de GFP e fragmentos activos de GFP que mantenham a aptidão para emitir picos de energia luminosa no intervalo 500-520 nm. Como exemplos não limitativos refere-se as proteínas fluorescentes obtidas a partir de Renilla, tais como, v.g., a GFP dimérica de Renilla mulleri, que apresenta picos estreitos de excitação (498 nm) e de emissão (509 nm) , ver, v.g., Beau Peelle et ai., Characterization and use of green fluorescent proteins from Renilla mulleri and Ptilosarcus guemyi for the human 105 cell display of functional peptides, 20(6) J. Protein Chem. 507-519 (2001); e proteínas fluorescentes obtidas a partir de Aequorea, conforme descrito por, v.g., Roger Y. Tsien & Roger Heim, Modified Green Fluorescent Proteins, patentes de invenção norte-americanas nos 5 625 048 (29 de Abr. de 1997), 6 319 669 (20 de Nov. de 2001), 6 066 476 (23 de Maio de 2000) e 6 800 733 (5 de Out. de 2004) .

Assim, de acordo com aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma GFP que emita picos de luz no intervalo 500-520 nm e que possua, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a AcGFPl da SEQ ID NO: 143, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a AcGFPl da SEQ ID NO: 143, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a AcGFPl da SEQ ID NO: 143, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a AcGFPl da SEQ ID NO: 143, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a AcGFPl da SEQ ID NO: 143 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a AcGFPl da SEO ID NO: 143. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma GFP que emite luz no intervalo 500-520 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à AcGFPl da SEQ ID NO: 143.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma GFP que emite luz no intervalo de 500-520 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a ZsGreen da SEQ ID NO: 144, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a ZsGreen da SEQ ID NO: 144, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a ZsGreen da SEQ ID NO: 144, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a ZsGreen da SEQ ID 106 NO: 144, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a ZsGreen da SEQ ID NO: 144 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a ZsGreen da SEQ ID NO: 144. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma GFP que emite luz no intervalo de 500-520 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à ZsGreen da SEQ ID NO: 144.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma GFP que emite luz no intervalo 500-520 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a EGFP da SEQ ID NO: 145, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a EGFP da SEQ ID NO: 145, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a EGFP da SEQ ID NO: 145, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a EGFP da SEQ ID NO: 145, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a EGPP da SEQ ID NO: 145 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a EGFP da SEQ ID NO: 145. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma GFP que emite luz no intervalo 500-520 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à EGFP da SEQ ID NO: 145.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma GFP que emite luz no intervalo 500-520 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a MGFP da SEQ ID NO: 146, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a MGFP da SEQ ID NO: 146, pelo menos 80% de identidade de 107 aminoácidos com a MGFP da SEQ ID NO: 146, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a MGFP da SEQ ID NO: 146, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a MGFP da SEQ ID NO: 146 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a MGFP da SEQ ID NO: 146. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma GFP que emite luz no intervalo 500-520 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à MGFP da SEQ ID NO: 146.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma GFP que emite luz no intervalo 500-520 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a hr.GfP da SEQ ID NO: 147, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a hrGFP da SEQ ID NO: 147, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a hrGFP da SEQ ID NO: 147, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a hrGFP da SEQ ID NO: 147, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a hrGFP da SEQ ID NO: 147 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a hrGFP da SEQ ID NO: 147. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma GFP que emite luz no intervalo 500-520 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à hrGFP da SEQ ID NO: 147.

De acordo com outra variante, o primeiro membro do par de FRET é uma proteína fluorescente azul esverdeada. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína fluorescente azul esverdeada" é um sinónimo de "CFP" e designa uma proteína que absorve luz num determinado comprimento de onda e que 108 emite um pico de energia luminosa no intervalo 460-500 nm. Como proteínas fluorescentes azuis esverdeadas úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a ECFP da SEQ ID NO: 148, as variantes geneticamente manipuladas de ECFP e os seus fragmentos activos de ECFP que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 460-500 nm, a AmCyan da SEQ ID NO: 149, as variantes geneticamente manipuladas de AmCyan e os seus fragmentos activos de AmCyan que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 460-500 nm, bem como as proteínas fluorescentes azuis esverdeadas que ocorrem naturalmente, as variantes de CFP que ocorrem naturalmente, as variantes geneticamente manipuladas de CFP e seus fragmentos activos de CFP que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 460-500 nm. Como exemplos não limitativo refere-se a variante de CFP designada por "CGFP" contém uma substituição Thr203Tyr que modifica os comprimentos de onda de excitação e de emissão da ECFP da SEQ ID NO: 148 para um intervalo compreendida entre CFP e EGFP; e as proteínas fluorescentes obtidas a partir de Aeguorea conforme descrito por, v.g., Roger Y. Tsien & Roger Heim, Modified Green Fluorescent Proteins, patentes de invenção norte-americanas nos 5 625 048 (29 de Abr. de 1997), 6 319 669 (20 de Nov. de 2001), 6 066 476 (23 de Maio de 2000) e 6 800 733 (5 de Out. de 2004).

Assim, de acordo com aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma CFP que emite luz no intervalo 460-500 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a ECFP da SEQ ID NO: 148, pelo menos 7 5% de identidade de aminoácidos com a ECFP da 109 SEQ ID NO: 148, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a ECFP da SEQ ID NO: 148, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a ECFP da SEQ ID NO: 148, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a ECFP da SEQ ID NO: 148 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a ECFP da SEQ ID NO: 148. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma CFP que emite luz no intervalo 460-500 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à ECFP da SEQ ID NO: 148.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma CFP que emite luz no intervalo 460-500 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a AmCyan da SEQ ID NO: 149, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a AmCyan da SEQ ID NO: 149, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a AmCyan da SEQ ID NO: 149, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a AmCyan da SEQ ID NO: 149, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a AmCyan da SEQ ID NO: 149 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a AmCyan da SEQ ID NO: 149. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma CFP que emite luz no intervalo 460-500 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à AmCyan da SEQ ID NO: 149.

Ainda de acordo com outra variante, o primeiro membro do par de FRET é uma proteína fluorescente azul. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína fluorescente azul" é um sinónimo de "BFP" e designa uma proteína que absorve a luz 110 num determinado comprimento de onda e emite um pico de energia luminosa em comprimentos de onda compreendidos no intervalo 420-460 nm. Como proteínas fluorescentes azuis úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a EBFP da SEQ ID NO: 150, variantes geneticamente manipuladas de EBFP e seus fragmentos activos de EBFP que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 420-460 nm, bem como proteínas fluorescentes azuis que ocorrem naturalmente, as variantes de BFP que ocorrem naturalmente, as variantes geneticamente manipuladas de BFP e seus fragmentos activos de BFP que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 420-460 nm. Como exemplos não limitativo refere-se as proteínas fluorescentes obtidas a partir de Aequorea, conforme descrito por, v.g., Roger Y. Tsien & Roger Heim, Modified Green Fluorescent Proteins, patentes de invenção norte-americanas nos 5 625 048 (29 de Abr. de 1997), 6 319 669 (20 de Nov. de 2001), 6 066 476 (23 de Maio de 2000) e 6 800 733 (5 de Out. de 2004).

Assim, de acordo com aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma BFP que emite luz no intervalo 420-460 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a EBFP da SEQ ID NO: 150, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a EBFP da SEQ ID NO: 150, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a EBFP da SEQ ID NO: 150, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a EBFP da SEQ ID NO: 150, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a EBFP da SEQ ID NO: 150 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a EBFP da SEQ ID NO: 150. De acordo com outros aspectos desta 111 variante, o primeiro membro do par de FRET é uma BFP que emite luz no intervalo 420-460 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à EBFP da SEQ ID NO: 150.

Ainda de acordo com outra variante, o primeiro membro do par de FRET é uma proteína fluorescente amarela. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína fluorescente amarela" é sinónimo de "yfp" e designa uma proteína que absorve e designa uma proteína que absorve luz num determinado comprimento de onda e emite um pico de energia luminosa com um comprimento de onda no intervalo 520-550 nm. Como proteínas fluorescentes amarelas úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a EYFP da SEQ ID NO: 151, variantes geneticamente manipuladas de EYFP e seus fragmentos activos de EYFP que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 520-550 nm, a ZsYellow da SEQ ID NO: 152, variantes geneticamente manipuladas de ZsYellow e seus fragmentos activos de ZsYellow que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 520-550 nm, bem como YFP que ocorrem naturalmente, variantes de YFP que ocorrem naturalmente, variantes geneticamente manipuladas de YFP e seus fragmentos activos de YFP que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 520-550 nm. Como exemplos não limitativos refere-se as variante de YFP "Citina", que contêm substituições Val68Leu e Gln69Met na YFP da SEQ ID NO: 151, e "Vénus", que contêm substituições Phe46Leu, Metl53Thr, Vall63Ala e Serl75Gly na YFP da SEQ ID NO: 151, que são YFP extremamente brilhantes e de maturação 112 rápida, ver, v.g., Oliver Griesbeck et al., Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications, 276(31) J. Biol. Chem. 29188-29194 (2001); e Takeharu Nagai et al., A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications, 20(1) Nat. Biotechnol. 87-90 (2002); e proteínas fluorescentes obridas a partir de Aequorea, conforme descrito por, v.g., Roger Y. Tsien et al., Long Wavelength Engineered Fluorescent Proteins, patentes de invenção norte-americana nos 6 124 128 (26 de

Set. de 2000), 6 054 321 (25 de Abr. de 2000), 6 077 707 (20 de Jun. de 2000), 6 403 374 (11 de Jun. de 2002) e 6 780 975 (24 de Ago. de 2004).

Assim, de acordo com aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma YFP que emite luz no intervalo 520-550 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a YFP da SEQ ID NO: 151, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a YFP da SEQ ID NO: 151, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a YFP da SEQ ID NO: 151, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a YFP da SEQ ID NO: 151, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a YFP da SEQ ID NO: 151 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a YFP da SEQ ID NO: 151. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma YFP que emite luz no intervalo 520-550 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à YFP da SEQ ID NO: 151.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma YFP que emite luz no 113 intervalo 520-550 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a ZsYellow da SEQ ID NO: 152, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a ZsYellow da SEQ ID NO: 152, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a ZsYellow da SEQ ID NO: 152, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a ZsYellow da SEQ ID NO: 152, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a ZsYellow da SEQ ID NO: 152 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a ZsYellow da SEQ ID NO: 152. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma YFP que emite luz no intervalo 520-550 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à ZsYellow da SEQ ID NO: 152.

Ainda de acordo com outra variante, o primeiro membro do par de FRET é uma proteína fluorescente vermelha. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína fluorescentes vermelha" é sinónimo de "RFP" e designa uma proteína que absorve luz num determinado comprimento de onda e emite um pico de energia luminosa com um comprimento de onda no intervalo 550-740 nm. Como proteínas fluorescentes vermelhas úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a OsRed de RFp de Discosoma striata da SEQ ID NO: 153, DsRedl da SEQ ID NO: 154, DsRed2 da SEQ ID NO: 155 e 'DsRed Express' da SEQ ID NO: 156, variantes geneticamente modificadas de DsRed, DsRedl, DsRed2 e 'DsRed Express' e seus fragmentos activos de DsRed, DsRedl, DsRed2 e 'DsRed Express' que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 550-740 nm; a RFP HcRed de Heteractis crispa da SEQ ID NO: 157, variantes geneticamente modificadas de 114

HcRed e fragmentos activos de HcRed que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 550-740 nm; a RFP AsRed de Anemonia sulcata da SEQ ID NO: 158, variantes geneticamente modificadas de AsRed e seus fragmentos activos de AsRed que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 550-740 nm, bem como RFP que ocorrem naturalmente, variantes de RFP que ocorrem naturalmente, variantes geneticamente manipuladas de RFP e seus fragmentos activos de RFP que mantenham a aptidão para emitir um pico de energia luminosa no intervalo 550-740 nm. Como exemplos não limitativos refere-se as proteínas fluorescentes de Entacmeae quadricolor, incluindo as proteínas fluorescentes vermelhas, tais como, v.g., eqFPôll, ver, v.g., Jõrg Wiedenmann et al., A far-red fluorescent protein with fast maturation and reduced oligomerization tendency from Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria), 99(18) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 11646-11651 (2002).

Assim, de acordo com aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a DsRed da SEQ ID NO: 153, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a DsRed da SEQ ID NO: 153, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a DsRed da SEQ ID NO: 153, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a DsRed da SEQ ID NO: 153, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a DsRed da SEQ ID NO: 153 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a DsRed da SEQ ID NO: 153. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que 115 possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à DsRed da SEQ ID NO: 153.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a DsRedl da SEQ ID NO: 154, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a WsRedt da SEQ ID NO: 154, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a DsRedl da SEQ ID NO: 154, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a DsRedl da SEQ ID NO: 154, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a DsRedl da SEQ ID NO: 154 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a DsRedl da SEQ ID NO: 154. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à DsRedl da SEQ ID NO: 154.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a DsRed2 da SEQ ID NO: 155, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a DsRed2 da SEQ ID NO: 155, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a DsRed2 da SEQ ID NO: 155, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a DsRed2 da SEQ ID NO: 155, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a DsRed2 da SEQ ID NO: 155 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a DsRed2 da SEQ ID NO: 155. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do 116 par de FRET é uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à DsRed2 da SEQ ID NO: 155.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a DsRed2 da SEQ ID NO: 156, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a DsRed Express da SEQ ID NO: 156, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a DsRed Express da SEQ ID NO: 156, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a DsRed Express da SEQ ID NO: 156, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a DsRed Express da SEQ ID NO: 156 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a DsRed Express da SEQ ID NO: 156. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à DsRed Express da SEQ ID NO: 156.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a AsRed da SEQ ID NO: 158, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a AsRed da SEQ ID NO: 158, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a AsRed da SEQ ID NO: 158, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a AsRed da SEQ ID NO: 158, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a AsRed da SEQ ID NO: 158 ou pelo menos 95% de identidade de 117 aminoácidos com a AsRed da SEQ ID NO: 158. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g.r no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à AsRed da SEQ ID NO: 158.

De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a HcRed da SEQ ID NO: 157, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a HcRed da SEQ ID NO: 157, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a HcRed da SEQ ID NO: 157, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a HcRed da SEQ ID NO: 157, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a HcRed da SEQ ID NO: 157 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a HcRed da SEQ ID NO: 157. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma RFP que emite luz no intervalo 550-740 nm e que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à HcRed da SEQ ID NO: 157.

Um primeiro membro do par de FRET descrito na presente memória descritiva compreende proteínas de ligação a fluoróforos que são subsequentemente marcadas com um fluoróforo. Uma proteína de ligação a fluoróforos estabelece uma ligação covalente, ou uma forte interacção não covalente, com o fluoróforo numa reacção química ou bioquímica selectiva. Como exemplos não limitativos de tais proteínas de ligação a fluoróforos e dos correspondentes fluoróforos refere-se o sistema tetracisteína bis-arsénico, 118 veja-se, v.g.r B. Albert Griffin et al., Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. 281(5374) Science 269-272 (1998); e B. Albert Griffin et ai., Fluorescent labeling of recombinant proteins in living cells with FlAsH, 327 Methods Enzymol. 565-578 (2000); o sistema alquilguanina-ADN-alquil-transferase (AGT), veja-se, v.g., Antje Keppler et al, A General Method for the Covalant Labelling of Fusion proteins with Small Molecules in vivo, 21(1) Nat. Biotech 86-89 (2003); Antje Keppler et al., Labeling of fusion proteins of 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase with small molecules in vivo and in vitro, 32 (4) Methods 437-444 (2004); e Antje Keppler et al., Labeling of Fusion Proteins with Synthetic Fluorophores in Live Cells, 101(27) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9955-9959 (2004); e o sistema de desalogenase. Além disso, exemplos não limitativos de proteínas de ligação a fluoróforos e dos correspondentes fluoróforos, bem como de reagentes, condições e metodologias bem caracterizados, estão disponíveis por vendedores comerciais, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, estojo de detecção de marcadores de tetracisteína em célula TC-FlAsH™ TC-ReAsH™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); sistema de marcação de proteínas multi fins proSNAP-tag™ (Covalys Biosciences AG, Suiça); e tecnologia de marcação interpermutável HaloTag™ (Promega Corp., Madison WI) . Estas metodologias constituem procedimentos de rotina que pertencem ao âmbito de uma especialista na matéria e dos ensinamentos aqui descritos. 119 QUADRO 10 Excitação e emissão máxima de fluoróforos exemplificativos para proteínas de ligação a fluoróforos Nome Corante Excitação máxima (nm) Emissão máxima (nm) Sistema tetracisteína bis-arsénico FIAsH corante de ligação em gancho de arsénico-fluoresceína 508 528 ReAsH corante de ligação em gancho de arsénico-resofurina 593 608 Sistema de marcação AGT-SNAP BG-430 para-benzil-guanina- dietilaminocoumarina 421 444 e 484 BG-DAF para-benzil-guanina-diacetuifluoresceína 500 524 BG-505 para-benzil-guanina-diómico DY-505-05 504 532 BG-488 para-benzil-guanina ATTO 488 506 526 BG-532 para-benzil-guanina ATTO 532 536 554 BG-547 para-benzil-guanina diómico DY-547 554 568 TMR-Star para-benzil-guanina- tetrametilrodamina 554 580 BG-600 para-benzil-guanina ATTO 600 606 626 BG-632 para-benzil-guanina diómico DY-632 636 656 BG-647 para-benzil-guanina diómico Dry-647 660 673 BG-732 para-benzil-guanina diómico DY-732 732 747 BG-747 para-benzil-guanina diómico DY-747 752 763 Sistema desalogenase/HaloTag™ Coumarina HaloTag derivado de coumarina 353 434 120

Excitação QUADRO 10 e emissão máxima de fluoróforos exemplificativos para proteínas de ligação a fluoróforos Nome Corante Excitação Emissão máxima (nm) máxima (nm) diAcFAM derivado de diacetil- 494 526 HaloTag fluoresceína não fluorescente TMR HaloTag derivado de tetrametil- 555 585 rodamina O sistema tetracisteína bis-arsénico compreende uma proteína de fusão que inclui a proteína relevante um hexapéptido de tetracisteína que compreende a sequência de aminoácido C-C-X-X-C-C (SEQ ID NO: 182) e um complexo de fluoróforo bis-arsénico com dois resíduos ditiol. Na reacção de marcação, o péptido de tetracisteína desloca os ditióis a partir dos resíduos de arsénico do fluoróforo. Esta interacção provoca o acoplamento forte do fluoróforo com a proteína de ligação ao fluoróforo e aumenta significativamente o sinal reduzindo a extinção do fluoróforo. Como exemplos não limitativos de fluoróforos bis-arsénico refere-se os derivados bi-arsénicos não fluorescentes de fluoresceína, tais como, v.g., FlAsH, e os derivados bi-arsénicos não fluorescentes de resorufina, tais como, v.g., ReAsH. O sistema AGT compreende uma proteína de fusão que inclui a proteína relevante e um polipeptido modificado de AGT com 22 kDa (SEQ ID NO: 183) e uma benzil-guanina modifica na posição para com um marcador fluorescente. Na reacção de marcação, a posição 06 da benzil-guanida para-substituída liga-se de um modo irreversível a uma cisteína reacção no centro activo de AGT. No quadro 10 estão 121 apresentados exemplos não limitativos de fluoróforos de benzil-guanina modificados. 0 sistema de desalogenase compreende uma proteina de fusão que inclui a proteina relevante e uma desalogenase modificada e um fluoróforo modificado que compreende um resíduo alquilo. Na reacção de marcação, o fluoróforo modificado inter-reage de um modo intenso com o local activo da desalogenase modificada. A desalogenase modificada é um polipeptido com 33 kDa (SEQ ID NO: 184) que compreende uma mutação no centro activo, que diminui significativamente a actividade catalítica da enzima, criando de forma eficaz uma interacção irreversível. No quadro 10 estão apresentados exemplos não limitativos de fluoróforos de benziguanida modificada.

Assim, de acordo com uma variante, o primeiro membro do par de FRET é uma proteína de ligação a fluoróforos que interage fortemente com um fluoróforo. De acordo com outra variante, o primeiro membro do par de FRET é um péptido de tetracisteína que interage fortemente com um fluoróforo. De acordo com um aspecto desta variante, o primeiro membro do par de FRET é um propriedades de tetracisteína que compreende a SEQ ID NO: 182, que interage fortemente com um fluoróforo. De acordo com outro aspecto desta variante, o primeiro membro do par de FRET é um péptido de tetracisteína que interage fortemente com derivados bi-arsénicos não fluorescentes de fluoresceína. De acordo com outro aspecto desta variante, o primeiro membro do par de FRET é um péptido de tetracisteína que interage fortemente com derivados bi-arsénicos não fluorescentes de resofurina.

Assim, de acordo com uma variante, o primeiro membro do par de FRET é um polipeptido de AGT que interage 122 fortemente com um fluoróforo. De acordo com um aspecto desta variante, o primeiro membro do par de FRET é um AGT que interage fortemente com um fluoróforo que compreende a SEQ ID NO: 183. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser um AGT que interage fortemente com um fluoróforo que possui, v.g., pelo menos 7 0% de identidade de aminoácidos com a AGT da SEQ ID NO: 183, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a AGT da SEQ ID NO: 183, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a AGT da SEQ ID NO: 183, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a AGT da SEQ ID NO: 183, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a AGT da SEQ ID NO: 183 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a AGT da SEQ ID NO: 183. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é um AGT que interage fortemente com um fluoróforo que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à AGT da SEQ ID NO: 183. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é um AGT que interage fortemente com um derivado de benzil-guanina para-substituido que compreende uma dietilaminocoumarina, uma diacetil-fluoresceina, um DY-505-05 diómico, um ATTO 488, um ATTO 532, um DY-547, uma tetrametilrodamina, um ATTO 600, um DY-632 diómico, um DY-647 diómico, um DY-732 diómico ou um DY-747 diómico.

Assim, de acordo com uma variante, o primeiro membro do par de FRET é um polipeptido desalogenase que interage fortemente com um fluoróforo. De acordo com um aspecto desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma 123 desalogenase que interage fortemente com um fluoróforo que compreende a SEQ ID NO: 184. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET pode ser uma desalogenase que interage fortemente com um fluoróforo que possui, v.g., pelo menos 70% de identidade de aminoácidos com a desalogenase da SEQ ID NO: 184, pelo menos 75% de identidade de aminoácidos com a desalogenase da SEQ ID NO: 184, pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a desalogenase da SEQ ID NO: 184, pelo menos 85% de identidade de aminoácidos com a desalogenase da SEQ ID NO: 184, pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a desalogenase da SEQ ID NO: 184 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a desalogenase da SEQ ID NO: 184. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma desalogenase que interage fortemente com um fluoróforo que possui, v.g., no máximo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos relativamente à desalogenase da SEQ ID NO: 184. De acordo com outros aspectos desta variante, o primeiro membro do par de FRET é uma desalogenase que interage fortemente com um derivado de coumarina, tal como coumarina HaloTag, um derivado de fluoresceina, tal como diAcFAM HaloTag, ou um derivado de tetrametil-rodamina, tal como TMR HaloTag.

As composições e os métodos da presente memória descritiva proporcionam uma célula que compreende, em parte, um segundo membro associado à membrana do par de FRET. Um tal segundo membro de um par de FRET pode ser um dador ou um fluoróforo aceitador. Assim, o par de FRET descrito compreende, em parte, um segundo membro do par de FRET que é um dador ou um fluoróforo aceitador. 124

Um segundo membro associado à membrana do par de FRET descrito na presente memória descritiva compreende corantes lipofilicos. Como corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, sondas anfifílicas que são moléculas que contêm um fluoróforo carregado que localiza a sonda na superfície da membrana e uma "cauda" alifática lipofílica que se insere na membrana, fixando assim a sonda à superfície da membrana. No quadro 11 estão apresentadas características de corantes lipofílicos representativos. Os métodos de marcação celular com corantes lipofilicos são bem conhecidos na especialidade, conforme descrito, v.g., em Wouterlood (Ed.), Neuroscience Protocols, páginas 1-20 Elsevier Science Publishers (1993) ; e Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6a Edição, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, 1996.

Como corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, corantes lipofilicos de carbocianina, incluindo corantes de carbocianinas de cadeia curta com caudas de alquilos curtos com menos de 7 átomos de carbono, de dialquilcarbocianinas de cadeia longa, que possuem pelo menos 12 átomos de carbono na sua cauda de alquilo, e de dialquilaminoestirilo. O corantes lipofílicos de carbocianina são corantes absorvedores de luz muito potentes, que apresentam uma difusão lateral que podem corar células inteiras e que são bem retidos pelas membranas celulares. Além disso, estes corantes apresentam uma fluorescência fraca em água, embora possuam sinais muito brilhantes com coeficientes de extinção elevados. Como sondas de carbocianina para membranas úteis refere-se 125 as octadecil(Cis)-indocarbocianinas, Dil e DiD, tiacarbocianinas (DiS), oxacarbocianines DiO. As DiO emitem uma fluorescência verde; as Dil, uma fluorescência cor-de-laranja-vermelho; e as DiD, um fluorescência vermelho distante. QUADRO 11 Excitação e emissão máxima de corantes lipofilicos exemplificativos N2 de cat. Corante Excitação máxima (nm) Emissão máxima (nm) DiO e análogos D3898 FAST DiO 484 499 D275 DiOCls (3) "DiO" 484 501 Dl 125 DiOC18 (3) 484 501 D7778 SP-DiOCis (3) 497 513 DiA e análogos D3883 4-Di-l6-ASP "DiA" 491 613 D3897 Óleo FAST DiA 492 612 D7758 FAST DiA 492 612 D291 4-Di-lO-ASP 492 612 DiS e Dil e análogos 8413 DiSBAC2 (3) 535 560 D282/D3911 DilC18 (3) "Dil" 549 565 D384 DilC16(3) 549 565 D383 Dí1Ci2 (3) 549 565 D3899 Óleo FAST Dil 549 564 D7756 FAST Dil 549 564 D3886 óleo A9-Dil 549 564 F6999 FM09Dil 553 570 C7000/C7001 CM-Dil CellTracker 553 570 D7776 DilC18 (3) -DS 555 570 D7777 SP-DilCi8 (3) 556 573 D77 66 Br2-DilC18 (3) 558 575 D7779 5,5' -Ph2-DilC18 (3) 576 599 DiD e análogos 126 QUADRO 11 Excitação e emissão máxima de corantes lipofílicos exemplificativos Nfi de cat. Corante Excitação máxima (nm) Emissão máxima (nm) D307 óleo DilC18(5) "DiD" 644 665 D7757 DilCig (5) "DiD" 644 663 D12730 DilCis (5) -DS 650 670 DiR e análogos D12731 DilCis (7) "DiR" 748 780 Moléculas diversas D202 DPH 300 452 T204 TMA-DPH 355 430 T53 2,6-TNS 318 443 D250 laurdan 364 497 B153 bis-ANS 395 500 Flf e análogos T3163 FM® 1-43 479 598 T3164 FM® 1-84 510 625 T7508 FM® 2-10 506 620 T3166 FM® 4-64 506 750 T23360 FM® 5-95 560 734 Tllll RH 414 500 635

Como corantes lipofílicos de carbocianina úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, octadecil-indocarbocianinas, tais como, v.g., DilCis (3), e oxacarbocianinas, tais como, v.g., DiOCis (3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) . As octadecil-indocarbocianinas e oxacarbocianinas são designadas respectivamente por DilCis (3) e DiOCis (3), em que os números em subscrito representam o número de átomos de carbono de cada cauda alquilo e o número entre parêntesis representa o número de átomos de carbono na ponte entre os sistemas de anéis indolina ou benzoxazole. 127

Como indocarbocianinas e oxacarbocianinas úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, análogos de Dil e DiO com caudas alquilo insaturadas, tais como A9-Dil, FAST DiO e FAST Dil (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); análogos de Dil e DiO com caudas alquilo curtas, tais como DilCi2(3), DilCi6(3) e DiOCi6(3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) ; carbocianinas excitáveis por luz com comprimentos de onda longos, tais como, v.g., DilCi8(5) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); carbocianinas excitáveis com luz infravermelha, tais como, v.g., DilCi8(7) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) ; e derivados sulfonados ou substituídos com fenilo de Dil e DiO. Como substituições úteis refere-se as realizadas nos sistemas de anel incolina ou benzoxazole; tais derivados preparados mantêm as caudas octadecilo idênticas às dos compostos Dil ou DiO e compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, derivados clorometilbenzamido-Dil, tais como 'CellTracker CM'-Dil (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) ; derivados difenil-Dil, tais como 5,5'-Ph2-DilCi8 (3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) ; e derivados sulfonilo aniónicos, tais como SP-DilCis(3) e SP-DiOCi8 (3) ; ou derivados sulfonato, tais como DilCi8(3)-DS e DilCi8(S)-DS (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) . Como tiacarbocianinas úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, DiSBAC2(3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Como outras carbocianinas úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, iodeto de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1' , 3, 3 ' -tetraetil-benzimidazolilcarbocianina (JC-1), iodeto de 3,3'-dimetil-naftoxacarbocianina (JC-9) e 3-cloro- 128 fenilhidrazona de carbonil-cianeto (CCCP) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) .

As características de diversos corantes lipofílicos de carbocianina estão apresentadas no quadro 11. As carbocianinas lipofílicas são bem conhecidas na especialidade e são apresentadas por, v.g., Wolf, "Probing the Lateral Organization and Dynamics of Membranes," Spectroscopic Membrane Probes, Vol. I, Loew, Ed. págs. 193-220 (1988) . Conforme é sabido, as propriedades espectrais das dialquilcarbocianinas são bastante independentes do comprimento das cadeias alquilo, sendo determinadas pelos heteroátomos nos sistemas de anel terminais e no comprimento da ponte de ligação.

Os corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção compreendem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, corantes lipofílicos de aminostirilo e corantes anfifílicos de estirilo. Como corantes de aminoestirilo refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, corantes de dialquilaminoestirilo, as quais se inserem nas membranas com as suas duas caudas alquilo e o seu fluoróforo orientado normalmente em paralelo com as cadeias acilo dos fosfolípidos. Como corantes lipofílicos de aminosestirilo refere-se 4-Di-lO-ASP-(D291) ; DiA, D3883 e FAST DiA (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

Os corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção compreendem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma sonda anfifílica que compreende derivados de uma rodamina, uma fluoresceína ou uma coumarina com uma "cauda" lipofílica. Como exemplos não limitativos de tais sondas anfifílicas refere-se octadecil-rodamina B; fluoresceínas, tais como, v.g., 5-dodecanoilamino- 129 fluoresceína, 5-hexadecanoí1-aminofluoresceína, 5-octa- decanoí1-aminofluoresceína e o éster octadecílico de fluoresceína; e 4-heptadecil-7-hidroxicoumarina.

Os corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção compreendem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um sonda anfifilica que compreende 1,6-difenil- 1.3.5- hexatrieno (DPH) ou derivados de DPH com uma "cauda" lipofilica. Como exemplos não limitativos de tais sondas anfifilicas refere-se 1, 6-difenil-l,3,5-hexatrieno (DPH), p-tolueno-sulfato de 1-(4-trimetil-amónio-fenil)-6-fenil- 1.3.5- hexatrieno (TMA-DPH), p-tolueno-sulfato de N-( (4-(6-fenil-1,3,5-hexatrienil)-fenil)-propil)-trimetil-amónio (TMAP-DPH), ácido dapoxil-sulfónico e ácido 3-(4-(6-fenil)- 1.3.5- hexatrienil)-fenilpropiónico (ácido DPH-propiónico).

Outros corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção compreende ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma sonda não polar que compreende uma molécula 'BODIPY' com uma "cauda" lipofilica. Como exemplos não limitativos de tais sondas não polares refere-se BODIPY 493/503, BODIPY 505/515, BODIPY 665/676, BODIPY FL C5-ceramida e éster metílico de 'CellTrace BODIPY TR'. Outros corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção compreendem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma sonda não polar que compreende um corante de fenoxazina "vermelho do Nilo", 1,3-bis-(1-pireno)-propano ou uma molécula de bimano-azida com uma "cauda" lipofilica.

Outros corantes lipofílicos úteis de acordo com a invenção compreende ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma sonda de membrana com desvios espectrais sensíveis ao ambiente e com uma "cauda" lipofilica. Como exemplos não limitativos de tais sondas de 130 membrana refere-se derivados de dapoxilo, tais como, v.g., ácido dapoxil-sulfónico; 6-propionil-2-dimetil- aminonaftaleno (prodan), 6-dodecanoí1-2-dimetilamino- naftaleno (laurdan), 6-acriloí1-2-dimetilaminonaftaleno (acrilodan), 6-bromoacetil-2-dimetilaminonaftaleno (badan); anilinonaftaleno-sulfonato (ANS) e seus derivados, tais como, v.g., ácido l-anilinonaftaleno-8-sulfónico (1,8-ANS), ácido 2-anilinonaftaleno-6-sulfónico (2,6-ANS), ácido 2-(p-toluidinil)-naftaleno-6-sulfónico (2,6-TNS), 4,4'-di- anilino-1,1'-binaftil-5,5'-dissulfónico (bis-ANS); 4-(di- cianovinil)-julolidina (DCVJ); e ácido 4-amino-4'-benzamidoestilbeno-2,2'-dissulfónico (MBDS ou BADS).

Como outros corantes lipofilicos úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, catiões lipofilicos, tais como octadecil-rodamina e corantes FM, tais como dibrometo de N-(3-trietil-amónio-propil)-4-(4-(dibutilamino)-estiril)-piridínio (FM® 1-43), dibrometo de N-(3-trietil-amónio-propil)-4-(4-(dipentilamino)-estiril)-piridínio (FM® 1-84), dibrometo de N- (3-trietil-amónio-propil)-4-(4-(dietilamino)-estiril)-piridínio (FM® 2-10), dibrometo de N-(3-trietil-amónio-propil) -4-(6-(4-(dietilamino)-fenil)-hexatrienil)-piridínio (FM® 4-64), dibrometo de N-(3-trimetil-amónio-propil)-4-(6-(4-(dietilamino)-fenil)-hexatrienil)-piridínio (FM® 5-95), dibrometo de N- (3-trietil-amónio-propil)-4-(4-(4-(dietilamino) -fenil)-butadienil)-piridínio (RH 414) e seus derivados (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) ; conjugados fosfolípidos fluorescentes, tais como NBD-PE (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), os quais podem ser emparelhados com aceitadores de rodamina, tais como rodamina-DHPE e DHPE vermelho do Texas; sondas planas de lípidos, as quais são 131 insolúveis em detergentes, microdomínios de esfingolipidos e de colesterol de membranas que formam conjuntos laterais na membrana plasmática e que são comercializados por 'Molecular Probes' sob a forma de estojos de 'Vybrant Lipid Raft Labeling'' ; corantes de resposta rápida e lenta para o potencial de membrana e sondas de membrana sensíveis ao ambiente. Será evidente para um especialista na matéria que estes e outros corantes lipofílicos bem conhecidos também são úteis de acordo com a invenção.

De acordo com uma variante, o segundo membro do par de FRET pode ser um DiO. Tal como aqui utilizado, o termo "DiO" designa um corante lipofílico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 425-500 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 500-520 nm. Como corantes DiO úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, FAST DiO e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 425-500 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 500-520 nm; DiOCi8(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 425-500 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 500-520 nm; DiOCi6(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 425-500 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 500-520 nm; e SP-DIOCis(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 425-500 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 500-520 nm. 132

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um DiA. Tal como aqui utilizado, o termo "DiA" designa um corante lipofilico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-500 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 600-620 nm. Como corantes DiA úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, 4-DÍ-16-ASP e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-500 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 600-620 nm; FAST DiA e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-500 nm e que emitem um pico de energia luminosa no intervalo 600-620 nm; e 4-Di-lO-ASP e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-500 nm e que emitem um pico de energia luminosa no intervalo 600-620 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um DiS. Tal como aqui utilizado, o termo "DiS" designa um corante lipofilico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 510-550 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 540-580 nm. Como corantes DiS úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, DiSBAC2(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 525-545 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 550-570 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um Dil. Tal como aqui utilizado, o termo 133 "Dil" designa um corante lipofílico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm. Como corantes Dil úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, DilCi8(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; DilCi6(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; DilCi2(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; FAST Dil e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-500 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; A9-Dil e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; FM® Dil e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; CellTracker CM-Di e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; DilCi8(3)-DS e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de 134 energia luminosa no intervalo 560-580 nm; SP-DilCi8(3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm; e Br2-DilCi8 (3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 500-560 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 560-580 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um 5,5 '-Ph2-DilCi8 (3) · Tal com aqui utilizado, o termo "5,5'-Ph2-DilCi8 (3)" designa um corante lipofílico análogo de Dil que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 520-590 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 590-620 nm. Como corantes de 5,5'-Ph2-DilCi8 (3) úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, 5,5'-Ph2-DilCi8 (3) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 520-590 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 590-620 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um DiD. Tal como aqui utilizado, o termo "DiD" designa um corante lipofilico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 575-660 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 660-680 nm. Como corantes DiD úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, DilCi8(5) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 575-660 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 660-680 nm; e DilCi8(5)-DS e seus análogos que 135 absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 575-660 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 660-680 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um DiR. Tal como aqui utilizado, o termo "DiR" designa um corante lipofilico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 725-770 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 770-790 nm. Como corantes DiR úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, DilCis(7) e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 725-770 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 770-790 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um derivado de uma rodamina, fluoresceina ou coumarina. Tais corantes úteis de acordo com a invenção compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, 4-heptadecil-7-hidroxicoumarina que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 360-380 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 440-460 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um DPH ou um derivado de DPH. Tal como aqui utilizado, o termo "DPH" designa um corante lipofilico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 340-370 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 420-460 nm. Como corantes DPH úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, DPH que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no 136 intervalo 340-360 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 4400-460 nm; e TMA-DPH que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 350-370 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 420-440 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um derivado de dapoxilo. Tal como aqui utilizado, o termo "derivado de dapoxilo" designa um corante lipofílico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 350-400 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 490-530 nm. Como corantes de derivados de dapoxilo úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, 6-propionil-2-dimetilaminonaftaleno (prodan) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 350-370 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 490-510 nm; 6-dodecanoí1-2-dimetilaminonaftaleno (laurdan) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 355-375 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 490-510 nm; 6-acriloí1-2-dimetilaminonaftaleno (acrilodan) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 380-400 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 490-510 nm; 6-bromoacetil-2-dimetilaminonaftaleno (badan) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 380-400 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 510-530 nm; e ácido dapoxil-sulfónico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no 137 intervalo 350-370 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 510-530 nm.

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser um sulfonato de anilinonaftaleno (ANS) e derivados de ANS. Tal como aqui utilizado, o termo "ANS" designa um corante lipofilico que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 310-405 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 410-510 nm. Como corantes de ANS úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, ácido l-anilinonaftaleno-8-sulfónico (1,8-ANS) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 360-380 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 470-490 nm, ácido 2-anilinonaftaleno-6-sulfónico (2,6-ANS) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 310-330 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 410-430 nm; ácido 2-(p-toluidinil)-naftaleno-6-sulfónico (2,6-TNS) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 310-330 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 430-450 nm; e ácido 4,4'-dianilino-1,1'-binaftil-5,5'-dissulfónico (bis-ANS) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 385-405 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 490-510 nm.

Ainda de acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET pode ser uma 4-(dicianovinil)-julolidina (DCVJ) que absorve picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 445-465 nm e emite um pico de energia luminosa no intervalo 480-500 nm. 138

De acordo com outra variante, o segundo membro do par FRET podem ser um corante FM. Como corantes FM úteis de acordo com a invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, FM® 1-43 e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-525 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 590-610 nm; FM® 1-84 e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-525 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 610-640 nm; FM® 2-10 e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-525 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 610-640 nm; RH 414 e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 400-525 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 610-640 nm; FM® 4-64 e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 425-575 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 730-770 nm; e FM® 5-95 e seus análogos que absorvem picos de energia luminosa com comprimentos de onda compreendidos no intervalo 425-575 nm e emitem um pico de energia luminosa no intervalo 720-740 nm.

Os substratos de toxina de clostrideo descritos na presente memória descritiva compreendem, em parte, um primeiro membro de um par de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) . Tal como aqui utilizado, o termo "par de transferência de energia de ressonância por fluorescência" é sinónimo de "par FRET" e significa um dador e um fluoróforo aceitador que apresenta 139 um espectro de absorvância que se sobrepõe ao espectro de emissão do fluoróforo dador. Faz-se observar que no caso de o primeiro membro do par FRET ser um fluoróforo dador, então o segundo membro do par irá ser um aceitador. De igual modo, no caso de o primeiro membro do par FRET ser um aceitador, então o segundo membro do par será um fluoróforo dador.

Tal como aqui utilizado, o termo "fluoróforo dador" designa uma molécula que, no caso de ser irradiada com luz com um determinado comprimento de onda, emite luz, também designada por fluorescência, num comprimento de onda diferente. 0 termo fluoróforo é sinónimo, na especialidade, do termo "fluorocromo". Tal como aqui utilizado, o termo "aceitador" designa uma molécula que podem absorver energia de um fluoróforo dador, abrangendo tal termo os fluoróforos bem com molécula não fluorescentes. Tal como aqui utilizado, o termo "absorver" é sinónimo do termo "excitar" e o termo "absorvância" é sinónimo do termo "excitação". Um aceitador útil de acordo com a invenção apresenta um espectro de absorvância que se sobrepõe ao espectro de emissão de um fluoróforo dador. De um modo geral, um aceitador útil de acordo com a invenção possui uma absorção bastante fraca num comprimento de onda adequado para a excitação do fluoróforo dador. Conforme a seguir se descreve, um aceitador apresenta um espectro de absorvância que se sobrepõe ao espectro de emissão do fluoróforo dador. 0 termo "sobrepor", tal como aqui utilizado em referência ao espectro de absorvância de um aceitador e ao espectro de emissão de um fluoróforo dador, designa um espectro de absorvância e um espectro de emissão que são parcial ou totalmente partilhados. Assim, num tal espectro sobreposto, 140 o valor mais elevado do intervalo do espectro de emissão do fluoróforo dador é superior ao valor mais baixo do intervalo do espectro de absorvância do aceitador.

Num substrato de toxina de clostrideo útil de acordo com a invenção, o dador fluoróforos e o aceitador são seleccionados de um modo tal que o fluoróforo dador e o aceitador exibam uma transferência de energia de ressonância quando o fluoróforo dador é excitado. Um par de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) compreende um fluoróforo dador e um aceitador em que a sobreposição entre o espectro de emissões do fluoróforo dador e o espectro de absorvância do aceitador seja suficiente para permitir a FRET. A presente invenção tem por base, em parte, a FRET, que é um processo físico pelo qual a energia é transferida de um modo não radioactivo a partir de um fluoróforo dador excitado para um aceitador, o qual pode ser outro fluoróforo, através de acoplamento intramolecular dipolo-dipolo de elevado alcance. A FRET depende do inverso da sexta potência da separação intramolecular do fluoróforo dador e do aceitador, e, para uma transferência eficaz, o fluoróforo dador e o aceitador estão bastante próximos, isto é, separados, por exemplo, por cerca de 10 A a cerca de 100 A. Uma transferência de energia eficaz depende das características espectrais do fluoróforo dador e do aceitador, bem como da sua orientação relativa. Para se conseguir uma transferência eficaz ao longo de 10 A a 100 A, o rendimento quântico do fluoróforo dador é geralmente pelo menos de 0,1 e o coeficiente de absorção do aceitador é normalmente pelo menos de 1000, ver, v.g., Clegg, 6 Curr. Opin. Biotech. 103-110 (1995); e Selvin, 7 Nat. Struct. 141

Biol. 730-734 (2000). Um factor que deverá ser considerado na selecção do par fluoróforo dador/aceitador é a eficiência da FRET entre o fluoróforo dador e o aceitador.

Tal com é conhecido na especialidade, a eficácia da FRET depende da distância de separação e da orientação do fluoróforo dador e do aceitador, conforme descrito pela equação de Fõrster, bem como do rendimento quântico de fluorescência do fluoróforo dador e da sobreposição energética com o aceitador. Em particular, a eficácia (E) da FRET pode ser determinada do modo seguinte: E = 1 - Fda/Fd = 1/ (1 + (R/R0) 6) , em que FDA e FD correspondem, respectivamente, às intensidades de fluorescência do fluoróforo dador na presença e na ausência do aceitador, e R corresponde À distância entre o dador de fluoróforo s e o aceitador. O raio de Fõrster (R0) corresponde à distância à qual a transferência de energia de ressonância é eficaz a 50%, isto é, 50% dos dadores de fluoróforos excitados são desactivados pela FRET, ver, v.g., Fõrster, 2 Ann. Physik 55-75 (1948) . O valor do raio de Fõrster depende do rendimento quântico do fluoróforo dador; do coeficiente de extinção do aceitador e da sobreposição entre o espectro de emissão do fluoróforo dador e do espectro de excitação do aceitador.

Ro = [ 8 , 8 x 1023 · k2 · n~4 · QYD · J(À)]1/6A, em que k2 = factor de orientação de dipolo (intervalo de 0 a 4; k2 = 2/3 para dadores e aceitadores orientados aleatoriamente) QYd = rendimento quântico de fluorescência do dador na ausência do aceitador n = índice de refracção 142 J(λ) = integral de sobreposição espectral = = Jea(^) *Fd(A) · X4dX cm3M_1, em que εΑ = coeficiente de excitação do aceitador

Fd = intensidade de emissão de fluorescência do dador como fracção da intensidade total integrada É possivel incluir num substrato de toxina de clostrideo útil de acordo com a invenção diversos dadores de fluoróforos e aceitadores em várias combinações. De um modo geral, um fluoróforo dador é seleccionado de tal modo que haja uma sobreposição espectral substancial entre o espectro de emissão do fluoróforo dador e o espectro de excitação do aceitador. Além disso, um fluoróforo dador pode ser seleccionado, por exemplo, para apresentar um valor máximo de excitação que seja próximo de uma frequência laser conveniente, tal como Hélio-Cádmio 442 nm ou árgon 488 nm, uma vez que a luz laser é utilizada como um meio conveniente e eficaz para excitar o fluoróforo dador. Assim, de acordo com uma variante, a distância entre o centro do fluoróforo dador e o centro do aceitador é aproximadamente igual a 10 Â. De acordo com outra variante, a distância entre o centro do fluoróforo dador e o centro do aceitador é aproximadamente igual a 50 Â. De acordo com outra variante, a distância entre o centro do fluoróforo dador e o centro do aceitador é aproximadamente igual a 100 Â. De acordo com aspectos desta variante, a distância entre o centro do fluoróforo dador e o centro do aceitador pode ser, v.g.f pelo menos 10 Á, pelo menos 20 A, pelo menos 30 Á, pelo menos 40 Á, pelo menos 50 Á, pelo menos 60 Â, pelo menos 70 Á, pelo menos 80 Á, pelo menos 90 Á ou pelo menos 100 Á. De acordo com outros aspectos desta variante, a distância entre o centro do fluoróforo dador e o centro do 143 aceitador pode ser, v.g., no máximo 10 Â, no máximo 20 Â, no máximo 30 Â, no máximo 40 Â, no máximo 50 Â, no máximo 60 Â, no máximo 70 Â, no máximo 80 Â, no máximo 90 Â ou no máximo 100 Á.

De acordo com outra variante, a eficácia da FRET entre o fluoróforo dador e o aceitador é aproximadamente de 10%. De acordo com outra variante, a eficácia da FRET entre o fluoróforo dador e o aceitador é aproximadamente de 50%. De acordo com outra variante, a eficácia da FRET entre o fluoróforo dador e o aceitador é aproximadamente de 100%. De acordo com aspectos desta variante, a eficácia da FRET entre o fluoróforo dador e o aceitador pode ser, v.g., pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100%. De acordo com outros aspectos desta variante, a eficácia da FRET entre o fluoróforo dador e o aceitador pode ser, v.g., no máximo 10%, no máximo 20%, no máximo 30%, no máximo 40%, no máximo 50%, no máximo 60%, no máximo 70%, no máximo 80%, no máximo 90% ou no máximo 100%.

De acordo com outra variante, o comprimento de onda máximo do espectro de emissão do aceitador é aproximadamente 10 nm superior ao comprimento de onda máximo do espectro de excitação do fluoróforo dador. De acordo com outra variante, o comprimento de onda máximo do espectro de emissão do aceitador é aproximadamente 50 nm superior ao comprimento de onda máximo do espectro de excitação do fluoróforo dador. De acordo com outra variante, o comprimento de onda máximo do espectro de emissão do aceitador é aproximadamente 100 nm superior ao comprimento de onda máximo do espectro de excitação do 144 fluoróforo dador. De acordo com aspectos desta variante, o comprimento de onda máximo do espectro de emissão do aceitador é superior ao comprimento de onda máximo do espectro de excitação do fluoróforo dador, v.g., pelo menos por 10 nm, pelo menos por 20 nm, pelo menos por 30 nm, pelo menos por 40 nm, pelo menos por 50 nm, pelo menos por 60 nm, pelo menos por 70 nm, pelo menos por 80 nm, pelo menos por 90 nm ou pelo menos por 100 nm. De acordo com outros aspectos desta variante, o comprimento de onda máximo do espectro de emissão do aceitador é superior ao comprimento de onda máximo do espectro de excitação do fluoróforo dador, v.g., no máximo por 10 nm, no máximo por 20 nm, no máximo por 30 nm, no máximo por 40 nm, no máximo por 50 nm, no máximo por 60 nm, no máximo por 70 nm, no máximo por 80 nm, no máximo por 90 nm ou no máximo por 100 nm.

De acordo com outra variante, a sobreposição de espectros entre o fluoróforo dador e o aceitador é aproximadamente de 10%. De acordo com outra variante, a sobreposição de espectros entre o fluoróforo dador e o aceitador é aproximadamente de 50%. De acordo com outra variante, a sobreposição de espectros entre o fluoróforo dador e o aceitador é aproximadamente de 80%. De acordo com aspectos desta variante, a sobreposição de espectros entre o fluoróforo dador e o aceitador pode ser, v.g., pelo menos de 10%, pelo menos de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 40%, pelo menos de 50%, pelo menos de 60%, pelo menos de 70% ou pelo menos de 80%. De acordo com outros aspectos desta variante, a sobreposição de espectros entre o fluoróforo dador e o aceitador pode ser, v.g., no máximo de 10%, no máximo de 20%, no máximo de 30%, no máximo de 40%, 145 no máximo de 50%, no máximo de 60%, no máximo de 70% ou no máximo de 80%.

De acordo com outra variante, a diferença entre o pico de energia luminosa emitido pelo fluoróforo dador e o pico de energia luminosa absorvida pelo aceitador pode ser, v.g., pelo menos de 25 nm, pelo menos de 50 nm, pelo menos de 75 nm ou pelo menos de 100 nm. De acordo com outra variante, a diferença entre o pico de energia luminosa emitido pelo fluoróforo dador e o pico de energia luminosa absorvida pelo aceitador pode ser, v.g., no máximo de 25 nm, no máximo de 50 nm, no máximo de 75 nm ou no máximo de 100 nm.

Como exemplos não limitativos de pares FRET refere-se, EBFP, ECFP, AmCyan ou 'HaloTag' Coumarina enquanto fluoróforo dador e DiOCi8(3), DiOCi6(3), SP-DiOCis (3), 4-Di-16-ASP, FAST DiA ou 4-Di-lO-ASP enquanto aceitador; DPH, TMA-DPH ou 2,6-TNA enquanto fluoróforo dador e ECFP, AmCyan, AcGFP ou AGT/BG-430 enquanto aceitador; AcGFP, ZsGreen, Vitality hrGFP, EGFP ou 'Monster Green' enquanto fluoróforo dador e DiSBAC2(3), DilCis (3), FM 1-84, FM 2-10 ou RH 414 enquanto aceitador, DPH, laurdan ou bis-ANS enquanto fluoróforo dador e AmCyan, AcGFP, ZsGreen, Vitality hrGFP, EGFP, 'Monster Green', tetracisteina/FlAsH, AGT/BG-DAF, AGT/BG-505, AGT/BG-488 ou HaloTag diAcFAM enquanto aceitador, Monster Green, EYFP, ZsYellow, tetracisteina/FlAsH, AGT/BG-DAF, AGTBG-505, AGT/BG-488 ou HaloTag diAcFAM enquanto fluoróforo dador e FM 1-84, DiSBAC2(3), Dí1C18 (3), DilCis (3), DilC12 (3), FAST Dil, DilCis (3)-DS ou SP-Dí1Ci8 (3) enquanto aceitador; FAST DiO, DiOCis (3), DiOC16 (3), SP-DiOCis (3), laurdan ou bis-ANS enquanto fluoróforo dador e Monster Green, EYFP, ZsYellow, 146 tetracisteína/FlAsH, AGT/BG-DAF, AGT/BG-505, AGT/BG-488 ou HaloTag diAcFAM enquanto aceitador, DsRed, Ds-Red2, Ds-Red Express, AGT/BG-547, AGT/TMR-Star ou HaloTag TMR enquanto fluoróforo dador e FM Dil, DilCis (3)-DS, SP-DilCis (3) ou Br2-DilCi8 (3) enquanto aceitador; DiSBAC2(3), DilCis (3), DilCie (3) , D1IC12 (3) ou FAST Dil enquanto fluoróforo dador e DsRed, Ds-Red2 ou Ds-Red Express enquanto aceitador; e DiSBAC2 (3) , DilCis (3), DÍ1C16 (3), DilC12 (3), FAST Dil, FM Dil, DilCis (3)-DS, SP-DilCis (3) ou Br2-DilCis (3) enquanto fluoróforo dador e AsRed2 ou HcRedl enquanto aceitador. No quadro 14 estão apresentadas outras combinações e pares FRET . Há aspectos da presente invenção que têm por base um substrato de toxina de clostrideo que contém um aceitador não fluorescente. Tal como aqui utilizado, o termo "aceitador não fluorescente" é sinónimo de "atenuador" e designa uma molécula que absorve a energia luminosa a um determinado comprimento de onda, incluindo, v.g., violeta, azul, azul esverdeado, verde, amarelo, cor-de-laranja e vermelho, mas apresenta uma aptidão reduzida para emitir energia luminosa ou não é mesmo capaz de emiti-la. Um aceitador não fluorescente pode ser útil, por exemplo, para eliminar a fluorescência de fundo que resulta da excitação directa do aceitador (não sensível). São já conhecidos na especialidade diversos aceitadores não fluorescentes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, dabcilo, dabsilo, verde malaquite, QSY 7, QSY 9, QSY 21, OSY 35, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 e BHQ-10. Estes atenuadores podem ser ligados a um substrato de toxina de clostrideo utilizando métodos químicos de conjugação convencionais conhecidos na especialidade. 0 dabcilo e 147 dabsilo absorvem picos de energia luminosa no intervalo de 400 a 525 nm e podem ser úteis em aplicações de FRET como um aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., BFP, CFP, GFP e YFP. O QSY 35 absorve picos de energia luminosa no intervalo de 425 a 525 nm e pode ser útil em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., BFP, CFP, GFP e YFP. O BHQ-0 absorve picos de energia luminosa no intervalo de 430 a 520 nm e pode ser útil em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., BFP, CFP, GFP e YFP. O BHQ-1 absorve picos de energia luminosa no intervalo de 480 a 580 nm e pode ser útil em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., CFP, GFP, YFP e RFP. O QSY 7 e QSY 9 absorve picos de energia luminosa no intervalo de 500 a 600 nm e podem ser úteis em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., GFP, YFP e RFP. O BHQ-2 absorve picos de energia luminosa no intervalo de 559 a 650 nm e pode ser útil em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., YFP e 148 RFP. 0 verde de malaquite absorve picos de energia luminosa no intervalo de 575 a 675 nm e pode ser útil em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., YFP e RFP. 0 QSY 21 absorve picos de energia luminosa no intervalo de 575 a 725 nm e pode ser útil em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., YFP e RFP. 0 BHQ-3 absorve picos de energia luminosa no intervalo de 620 a 730 nm e pode ser útil em aplicações de FRET como aceitador de transferência de energia para dadores de fluoróforos que emitam energia luminosa dentro deste intervalo de comprimentos de onda, tais como, v.g., RFP .

Assim, de acordo com uma variante, um aceitador não fluorescente podem ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 400 a 525 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é dabcilo. De acordo com outro aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é dabsilo. De acordo com outra variante, um aceitador não fluorescente pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 425 a 525 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é QSY 35. De acordo com outra variante, um aceitador não fluorescentes pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 430 a 520 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é BHQ-0. 149

Ainda de acordo com outra variante, um aceitador não fluorescente pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 480 a 580 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é BHQ-1. Ainda de acordo com outra variante, um aceitador não fluorescente pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 500 a 600 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é QSY 7. De acordo com outro aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é QSY 9.

De acordo com outra variante, um aceitador não fluorescente pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 559 a 650 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é BHQ-2. Ainda de acordo com outra variante, um aceitador não fluorescente pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 575 a 675 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é o verde de malaquite. Ainda de acordo com outra variante, um aceitador não fluorescente pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 575 a 725 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é QSY 21. Ainda de acordo com outra variante um aceitador não fluorescente pode ser uma molécula que absorve picos de energia luminosa no intervalo de 620 a 730 nm. De acordo com um aspecto desta variante, o aceitador não fluorescente é BHQ-3.

Faz-se observar que um substrato de toxina de clostrideo útil de acordo com a invenção pode compreende, facultativamente, um ou vários componentes suplementares. Como exemplo não limitativo, é possível incluir uma 150 sequência espaçadora flexível, tal como GGGGS (SEQ ID NO: 159) num substrato de toxina de clostrídeo útil de acordo com a invenção. Um substrato de toxina de clostrídeo útil pode incluir, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um ou vários das moléculas sequintes: marcadores de liqação a epítopos, tais como, v.g., FLAG, Express™, hemaglutinina do vírus de Influenza humano (HA), proteína p62c~Myc humana (c-MYC) , glicoproteína do vírus de estomatite vesicular (VSV-G), precursor de glicoproteína D do vírus do Herpes simplex (HSV) , V5 e AU1; ligadores de afinidade, tais como, v.g., poli-histidina (HIS), propriedades de ligação a estreptavidina (strep) e biotina ou uma sequência de biocintilação; regiões de ligação a péptidos, tais como, v.g., o domínio de ligação a glutationa de glutationa-S-transferase, o domínio de ligação a calmodulina da proteína de ligação a calmodulina e o domínio de ligação a maltose da proteína de ligação a maltose; região articulada de imunoglobulina; um ligador de N-hidroxissuccinimida; um curva em gancho de um péptido ou de um peptidomimético; ou uma sequência hidrofílica ou um outro componente ou sequência que, por exemplo, promova a solubilidade ou a estabilidade do substrato de toxina de clostrídeo. Como exemplos não limitativos de metodologias específicas para a selecção, preparação e utilização de um propriedades de ligação adequado refere-se as descritas nas obras, v.g., Epitope Tagging, págs. 17.90-17.93 (Sambrook and Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3a ed. 2001); Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1998); e Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow & 151

David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998), as quais se consideram aqui incorporadas por referência. Além disso, exemplos não limitativos de péptidos de ligação, bem como de reagentes, condições e metodologias bem caracterizadas são facilmente disponibilizadas por fabricantes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, BD Biosciences-Clontech, Paio Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valência, CA; e Stratagene, La Jolla, CA. Estas metodologias constituem procedimentos de rotina que fazem parte do conhecimento de um especialista na matéria, ou podem ser aprendidas a partir dos ensinamentos aqui apresentados.

As composições e os métodos da presente memória descritiva proporcionam uma célula isolada, em parte, que é capaz de provocar uma intoxicação com uma toxina de clostrideo. Tal como aqui utilizado, o termo "célula" designa qualquer célula eucariótica que expresse, ou que possa ser manipulada para expressar, pelo menos um receptor que se ligue a uma toxina de clostrideo. 0 termo célula compreende células de diversos organismos, tais como, v.g., células de murino, rato, suínas, bovinas, equinas, de primatas ou humanas; de diversos tipos de células, tais como, v.g., neurais ou não neurais; e podem ser isoladas a partir de ou como parte de uma população, um tecido ou um organismo de células heterogéneas. Faz-se observar que as células úteis de acordo com aspectos da invenção podem incluir, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células primárias; células de cultura; células estabelecidas; células normais; células transformadas; células tumorais; células infectadas; células 152 proliferativas e diferenciadas terminalmente; e células transfectadas de um modo estável ou transiente, incluindo células transfectadas de um modo estável ou transiente. Faz-se ainda observar que as células úteis de acordo com aspectos da invenção podem encontrar-se em qualquer estado, tal como proliferativo ou inactivo; intacto ou permeabilizado, tal como através de transfecção quimicamente mediada, tal como, v.g., mediada com fosfato de cálcio, mediada com dietilaminoetil-dextrano (DEAE), mediada com lipidos, mediada com polietilenoimina (PEI) e mediada com polibreno; transfecção fisicamente mediada, tal como, v.g., canhão de partículas, microinjecção e electroporação; e transfecção mediada com virus, tal como, v.g., transfecção mediada com retrovirus. Faz-se ainda observar que as células úteis de acordo com aspectos da invenção podem incluir as células que expressam um substrato de toxina de clostrideo sob o controlo de um elemento constitutivo, especifico de tecidos, especifico de células ou um elemento promotor indutivel, elemento potenciador ou ambos. Faz-se ainda observar que as células úteis de acordo com aspectos da invenção podem ou não expressar uma ou várias proteínas endógenas alvo da toxina de clostrideo, tais como, v.g., SNAP-25, VAMP e sintaxina.

As composições de células descritas na presente memória descritiva são capazes de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo. Tal como aqui utilizado, o termo "célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo" designa uma célula que pode activar o mecanismo celular global, pelo qual uma toxina de clostrideo cliva proteoliticamente um substrato e compreende a ligação de uma toxina de clostrideo a um receptor de afinidade elevada 153 ou reduzida, a internalização do complexo toxina/receptor, a translocação da cadeia leve da toxina de clostrideo para o citoplasma e a modificação enzimática dirigida de um substrato de toxina de clostrideo. Por definição, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo deverá expressar um ou vários receptores endógenos de afinidade elevada ou reduzida de toxina de clostrideo para um ou vários serotipos de toxina de clostrideo; expressar um ou vários receptores exógenos de afinidade elevada ou reduzida de toxina de clostrideo para um ou vários serotipos de toxina de clostrideo; ou expressar uma combinação de receptores endógenos de afinidade elevada ou reduzida de toxina de clostrideo e de receptores exógenos de afinidade elevada ou reduzida de toxina de clostrideo para um ou vários serotipos de toxina de clostrideo para um ou vários serotipos de toxina de clostrideo.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula que expresse um receptor de toxina de clostrideo. De acordo com aspectos desta variante, o receptor de toxina de clostrideo pode ser um receptor de afinidade reduzida de toxina de clostrideo, um receptor de afinidade elevada de toxina de clostrideo, um receptor endógeno de toxina de clostrideo, um receptor exógeno de toxina de clostrideo ou uma sua qualquer combinação. De acordo com outros aspectos desta variante, o receptor de toxina de clostrideo por ser um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G ou um receptor de TeNT. 154

De acordo com outra variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula que expresse múltiplos receptores de toxina de clostrideo. De acordo com aspectos desta variante, os múltiplos receptores de toxina de clostrideo podem compreender receptores de toxina de clostrideo de afinidade reduzida, receptores de toxina de clostrideo de afinidade elevada, receptores endógenos de toxina de clostrideo, receptores exógenos de toxina de clostrideo ou uma sua qualquer combinação. De acordo com aspectos desta variante, os múltiplos receptores de toxina de clostrideo podem compreender, v.g., dois ou mais receptores de toxina de clostrideo, três ou mais receptores de toxina de clostrideo, quatro ou mais receptores de toxina de clostrideo, cinco ou mais receptores de toxina de clostrideo, seis ou mais receptores de toxina de clostrideo, sete ou mais receptores de toxina de clostrideo e oito ou mais receptores de toxina de clostrideo. De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode expressar dois ou mais dos receptores seguintes: um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G ou um receptor de TeNT. De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode expressar três ou mais dos receptores seguintes: um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G ou um receptor de TeNT. De acordo com outros aspectos desta 155 variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode expressar quatro ou mais dos receptores seguintes: um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G ou um receptor de TeNT. De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode expressar cinco ou mais dos receptores seguintes: um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G ou um receptor de TeNT. De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode expressar seis ou mais dos receptores seguintes: um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G ou um receptor de TeNT. De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode expressar sete ou mais dos receptores seguintes: um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G ou um receptor de TeNT.

As células que expressam um ou vários receptores de toxina de clostrideo endógenos ou exógenos podem ser identificadas por métodos convencionais, incluindo ensaios directos e indirectos de captação da toxina. Os ensaios que determinam as propriedades de ligação ou de captação da toxina de clostrideo podem ser utilizados para avaliar se a 156 célula está a expressar um receptor de toxina de clostrídeo. Tais ensaios incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, ensaios de interligação utilizando toxinas de clostrídeo marcadas, tais como, v.g., [125I] BoNT/A, [1251 ] BoNT/B, [125I] BoNT/Cl , [1251 ] BoNT/D, [125I] BoNT/E, [125I ] BoNT/F, [1251] BoNT/G e [125I] TeNT, ver, v. g. , Noriko Yokosawa et al., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); Noriko Yokosawa et al., Binding of botulinum type Cl, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29(2) Toxicon 261-264 (1991); e Tei-ichi Nishiki et al., Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes, 269(14) J. Biol. Chem. 10498-10503 (1994). Como outros ensaios não limitativos refere-se ensaios imunocitoquimicos que detectam a ligação da toxina, utilizando anticorpos marcados ou não marcados, ver, v.g., Atsushi Nishikawa et al., The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells, 319(2) Biochem. Biophys. Res. Commun. 327-333 (2004), e ensaios de imunoprecipitação, ver, v.g., Yukako Fujinaga et al., Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes, 150(Pt 5) Microbiology 1529-1538 (2004), que detectam as ligações à toxina, utilizando anticorpos marcados ou não marcados. Como anticorpos úteis para estes ensaios refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, anticorpos seleccionados contra uma toxina de clostrídeo, tal como, v.g., BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, 157

BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, anticorpos seleccionados contra um receptor de CoNT, tais como, v.g., FGFR3 ou sinaptotagmina, e/ou anticorpos seleccionados contra um gangliósido, tais como, v.g., GDI a, GDlb, GD3, GQlb ou GTlb. No caso do anticorpo ser marcado, então a ligação da molécula pode ser detectada por diversas metodologias, incluindo 'Western blotting', observação microscópica directa da localização celular do anticorpo, determinação da ligação entre o anticorpo e a célula ou o substrato e subsequente passo de lavagem ou electroforese, utilizando técnicas do conhecimento dos especialistas na matéria. No caso de o anticorpo ser não marcado, então é possível utilizar um anticorpo secundário marcado para a detecção indirecta da ligação à molécula, sendo a detecção realizada de um modo idêntico ao descrito para um anticorpo marcado. Faz-se observar que estes ensaios e ensaios semelhantes que determinam as propriedades ou características de captação da toxina de clostrídeo podem ser úteis para a selecção de neurónios ou de outras células úteis de acordo com aspectos da invenção.

Os ensaios que monitorizam a libertação de uma molécula após exposição a uma toxina de clostrídeo também podem ser utilizados para determinar se a célula está a expressar um receptor de toxina de clostrídeo. Nestes ensaios, a inibição da libertação da molécula irá ocorrer nas células que expressam um receptor de toxina de clostrídeo, após tratamento com a toxina de clostrídeo. Há ensaios bem conhecidos que incluem métodos que determinam a inibição da libertação de catecolamina radiomarcada a partir de neurónios, tais como, v.g., libertação de [3H] — noradrenalina ou de [3H]-dopamina, ver, v.g., A. Fassio et 158 al., Evidence for calcium-dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxin and botulinum toxin type F, 90(3) Neuroscience 893-902 (1999); e Sara Stigliani et al., The sensitivity of catecholamine release to botulinum toxin Cl and E suggests selective targeting of vesicles set into the readily releasable pool, 85(2) J. Neurochem. 409-421 (2003), ou determina a libertação de catecolamina, utilizando um procedimento fluorométrico, ver, v.g., Anton de Paiva et al., A role for the interchain disulfide or its participating thiols in the internalization of botulinum neurotoxin A revealed by a toxin derivative that binds to ecto-acceptors and inhibits transmitter release intracellularly, 268(28) J. Biol. Chem. 20838-20844 (1993); Gary W. Lawrence et ai., Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 25-kDa synaptosomal-associated protein (SNAP-25) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B, 236(3) Eur. J. Biochem. 877-886 (1996); e Patrick Foran et al., Botulinum neurotoxin Cl cleaves both syntaxin and SNAP-25 in intact and permeabilized chromaffin cells: correlation with its blockade of catecholamine release, 35(8) Biochemistry 2630-2636 (1996). Como outros exemplos não limitativos refere-se os ensaios que medem a inibição da libertação de hormona a partir de células endócrinas, tais como, v.g., células pituitárias anteriores ou células do ovário. Faz-se observar que estes ensaios e ensaios semelhantes para a libertação da molécula podem ser úteis para a selecção de um neurónio ou de outras células úteis de acordo com aspectos da invenção.

Os ensaios que detectam a clivagem de um substrato de toxina de clostrideo, após exposição a uma toxina de 159 clostrideo, também podem ser úteis para determinar se uma célula está a expressar um receptor de toxina de clostrideo. Nestes ensaios, a criação de um produto de clivagem de um substrato de toxina de clostrideo será detectada em células que expressam um receptor de toxina de clostrideo, após tratamento com uma toxina de clostrideo. Exemplos não limitativos de procedimentos de Western blotting específicos, bem como de reagentes, condições e metodologias bem caracterizadas são disponibilizados pelos fabricantes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL; Promega Corporation, Madison, WI, e

Stratagene, Inc., La Jolla, CA. Faz-se observar que estes ensaios e ensaios semelhantes para a clivagem de um substrato de toxina de clostrideo podem ser úteis para a selecção de um neurónio ou de outras células úteis de acordo com aspectos da invenção.

Como exemplos não limitativos, é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/A SNAP-25, para testar a captação de BoNT/A; é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP-25, para testar a captação de BoNT/Cl e é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/E SNAP-25, para testar a captação de BoNT/E. Como exemplos de anticorpos anti-SNAP-25 úteis para estes ensaios refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, anti-soro pAb anti-SNAP25i97 160 policlonal de coelho, anti-SNAP25197 n° 1 (Allergan, Inc., Irvine, CA) , anticorpo SMI-81 anti-SNAP-25 monoclonal de coelho (Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) , mouse monoclonal anticorpo Cl 71.1 anti-SNAP-25 monoclonal de murganho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anticorpo Cl 71.2 anti-SNAP-25 monoclonal de murganho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anticorpo SP12 anti-SNAP-25 monoclonal de murganho (Abcam, Cambridge, MA), anti-soro anti-SNAP-25 policlonal de coelho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha) e anti-soro anti-SNAP-25 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, MA).

Como exemplos não limitativos suplementares, é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/B VAMP, para testar a captação de BoNT/B; é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/D VAMP, para testar a captação de BoNT/D; é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/F VAMP, para testar a captação de BoNT/F; é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/G VAMP, para testar a captação de BoNT/G e é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente TENT. Como exemplos de anticorpos anti-VAMP úteis para estes ensaios refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, anticorpo Cl 10.1 anti-VAMP-1 monoclonal de murganho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha) , anticorpo SP10 anti-VAMP-1 monoclonal de murganho (Abcam, Cambridge, MA) , 161 anticorpo SP11 anti-VAMP-1 monoclonal de murganho (Abcam, Cambridge, MA), anti-soro anti-VAMP-1 policlonal de coelho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anti-soro anti-VAMP-1 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, MA) , anticorpo Cl 69.1 anti-VAMP-2 monoclonal de murganho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anti-soro anti-VAMP-2 policlonal de coelho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anti-soro anti-VAMP-2 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, MA), anticorpo Cl 10.3 anti-VAMP-3 monoclonal de murganho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anti-soro anti-VAMP-3 policlonal de coelho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha) e anti-soro anti-VAMP-3 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, MA).

Como outro exemplo não limitativo, é possível utilizar uma análise de western blot, utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o produto de clivagem de BoNT/Cl sintaxina, para testar a captação de BoNT/Cl. Como exemplos de anticorpos anti-sintaxina úteis para estes ensaios refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, anticorpo Cl 78.2 anti-sintaxina-1 monoclonal de murganho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anticorpo Cl 78.3 anti-sintaxina-ΙΑ monoclonal de murganho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anti-soro anti-Sintaxina-lA policlonal de coelho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anti-soro anti-Sintaxina-ΙΒ policlonal de coelho (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), anti-soro anti-Sintaxina policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, MA), anti-soro anti-Sintaxina-2 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, MA) e anti-soro anti-Sintaxina-3 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, MA). 162

Prevê-se que um receptor de toxina de clostrídeo exógeno possa compreender, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma molécula de ácido nucleico, tal como, v.g.r ADN e ARN, que codifique um receptor de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva e uma molécula de péptido ou um peptidomimético que compreende um receptor de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva. Também se prevê que um receptor de toxina de clostrídeo exógeno possa ser expresso de um modo estável ou transiente numa célula útil de acordo com aspectos da invenção. Assim, há aspectos desta variante que compreendem uma célula que contém transientemente uma molécula de ácido nucleico, tal como, v.g., ADN e ARN, que codifica um receptor de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva e uma célula que contém transientemente uma molécula de péptido ou um peptidomimético que compreende o receptor de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva. Outros aspectos desta variante compreendem uma células que contém, de um modo estável, uma molécula de ácido nucleico, tal como, v.g., ADN e ARN, que codifica um receptor de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva e uma célula que contém, de um modo estável, uma molécula de péptido ou um peptidomimético que compreende o receptor de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva.

As moléculas de ácidos nucleicos mantidas de um modo estável podem ser extracromossómicas e replicar-se de forma autónoma ou podem ser integradas no material cromossómico da célula e replicarem-se de uma forma não autónoma. 163

Faz-se observar que a selecção da célula depende, em parte, da toxina de clostrídeo que se pretende testar. Como exemplo não limitativo, para testar a actividade de BoNT/A, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para BoNT/A. Como um outro exemplo, para testar a actividade de BoNT/B, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para BoNT/B. Como um outro exemplo, para testar a actividade de BoNT/Cl, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para BoNT/Cl. Como um outro exemplo, para testar a actividade de BoNT/D, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para BoNT/D. Como um outro exemplo, para testar a actividade de BoNT/E, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para BoNT/E. Como um outro exemplo, para testar a actividade de BoNT/F, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para BoNT/F. Como um outro exemplo, para testar a actividade de BoNT/G, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para BoNT/G. Como um outro exemplo, para testar a actividade de TeNT, é possível seleccionar uma célula que expresse ou que possa ser manipulada para 164 expressar um receptor com afinidade reduzida ou elevada para TeNT.

Tal como descrito antes, faz-se observar que uma célula útil de acordo com a invenção expressa receptores de toxina de clostrideo endógenos ou exógenos e com afinidade reduzida ou elevada para um ou várias toxinas de clostrideo. De um modo geral, tal célula também inibe a exocitose durante a exposição à toxina de clostrideo, por exemplo, com um CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM. De acordo com variantes particulares, a invenção proporciona um neurónio que contém um substrato de BoNT/A que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a BoNT/A. De acordo com outras variantes, a invenção proporciona um neurónio que contém um substrato de BoNT/B que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a BoNT/B. De acordo com outras variantes, a invenção proporciona um neurónio que contém um substrato de BoNT/Cl que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 165 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a BoNT/Cl. Ainda de acordo com outras variantes, a invenção proporciona um neurónio que contém um substrato de BoNT/D que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a BoNT/D. De acordo com outras variantes, a invenção proporciona um neurónio que contém um substrato de BoNT/E que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a BoNT/E. De acordo com outras variantes, a invenção proporciona um neurónio que contém um substrato de BoNT/F que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a BoNT/F. De acordo com outras variantes, a invenção proporciona um neurónio que contém um substrato de BoNT/G que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a BoNT/G. De acordo com outras variantes, a invenção proporciona um neurónio que contém um 166 substrato de TeNT que exibe uma inibição de exocitose com um valor CI50 inferior a 500 nM, inferior a 100 mM, inferior a 50 nM, inferior a 5 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,005 nM, inferior a 0,0005 nM, inferior a 0,00005 nM ou inferior a 0,000005 nM, durante a exposição a TeNT. Faz-se observar que o mesmo neurónio pode expressar dois ou mais receptores para serotipos diferentes de toxina de clostrideo, com um valor de CI50 igual ou diferente para cada serotipo de toxina individual.

As células úteis de acordo com aspectos da invenção compreendem células neuronais ou não neuronais. Como células neuronais úteis de acordo com aspectos da invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células neuronais primárias; células neuronais imortalizadas ou estabelecidas; células neuronais transformadas; células de tumores neuronais; células neuronais transfectadas estável e transientemente, incluindo ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células neuronais de mamíferos, de murinos, de ratos, de primatas e de seres humanos. Como exemplos não limitativos de células neuronais úteis de acordo com aspectos da presente invenção refere-se, v.g., células neuronais periféricas, tais como, v.g., neurónios motores e neurónios sensoriais; e células neuronais do SNC, tais como, v.g., neurónios da medula espinal do tipo neurónios da medula espinal embriónicos, neurónios dos gânglios da raiz dorsal (DRG), neurónios do córtex cerebral, neurónios do cerebelo, neurónios do hipocampo e neurónios motores. As células neuronais úteis de acordo com a invenção incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as aqui 167 descritas a seguir ou apresentadas no quadro 13. Tais células neuronais podem ser, por exemplo, neurónios do sistema nervoso central (SNC); células de neuroblastomas; neurónios motores, neurónios do hipocampo ou neurónios do cerebelo, podendo ser ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células neuro-2A, SH-SY5Y, NG108-15, N1E-115 ou SK-N-DZ. Será evidente para os especialistas na matéria que estes neurónios primários e estabelecidos, e outros neurónios suplementares, podem ser úteis nas células e nos métodos de acordo com a invenção.

Como neurónios úteis de acordo com aspectos da invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, culturas primárias, tais como culturas primárias de neurónios dos gânglios da raiz dorsal (DRG) embriónicos. Como exemplo refere-se as culturas primárias de neurónios DRG embriónicos de rato descritas por Mary J. Welch et al., Sensitivity of embryonic rat dorsal root ganglia neurons to Clostridium botulinum neurotoxins, 38(2) Toxicon 245 258 (2000); e as culturas primárias e neurónios da medula espinal fetal, por exemplo, culturas primárias de neurónios da medula espinal de murinos descritas por Elaine A. Neale et al., Botulinum neurotoxin A blocks synaptic vesicle exocytosis but not endocytosis at the nerve terminal, 147(6) J. Cell Biol. 1249-1260 (1999), e John A. Chaddock et al., Inhibition of vesicular secretion in both neuronal and non-neuronal cells by a retargeted endopeptidase derivative of Clostridium botulinum neurotoxin type A, 68(5) Infect. Immun. 2587-2593 (2000) . Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode ser um neurónio. De acordo com aspectos desta variante, um neurónio pode ser um 168 neurónio obtido a partir de, v.g., uma cultura primária, uma cultura primária de gânglios da raiz dorsal embriónica ou uma cultura primária de medula espinal fetal. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrideo de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem compreender uma célula neuronal primária, tal como, v.g., neurónios de gânglios da raiz dorsal (DRG) embriónicos de rato ou neurónios da medula espinal fetal de murinos, que inclua um substrato de toxina de clostrideo que compreende uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A ou uma sequência de reconhecimento de BoNT/E; uma célula neuronal primária, tal como, v.g., neurónios de gânglios da raiz dorsal (DRG) embriónicos de rato ou neurónios da medula espinal fetal de murinos, que inclua um substrato de toxina de clostrideo que compreende uma sequência de reconhecimento de VAMP; tal como , v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/B ou uma sequência de reconhecimento de TeNT; e uma célula neuronal primária, tal como, v.g., neurónios de gânglios da raiz dorsal (DRG) embriónicos de rato ou neurónios da medula espinal fetal de murinos, que inclua um substrato de toxina de clostrideo que compreende uma sequência de reconhecimento de Sintaxina; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl.

As linhagens celulares neuronais úteis de acordo com aspectos da invenção incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, linhagens celulares de neuroblastomas, linhagens celulares híbridas neuronais, linhagens celulares da medula espinal, linhagens celulares do sistema nervoso central, linhagens celulares do córtex cerebral, linhagens 169 celulares dos gânglios da raiz dorsal, linhagens celulares do hipocampo e linhagens celulares de feocromacitoma.

As linhagens celulares de neuroblastomas, tais como, v.g.f linhagens celulares de neuroblastoma de murinos, de ratos, de primatas ou de seres humanos, podem ser úteis de acordo com aspectos da invenção. Como linhagens celulares de neuroblastoma úteis de acordo com aspectos da invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, BE (2)-C (ATCC CRL-2268; ECACC 95011817), BE(2)-M17 (ATCC CRL-2267; ECACC 95011816), C1300 (ECACC 93120817), CHP-212 (ATCC CRL-2273), CHP-126 (DSMZ ACC 304), IMR 32 (ATCC CRL-127; ECACC 86041809; DSMZ ACC 165), KELLY (ECACC 92110411; DSMZ ACC 355), LA-N-2, ver, v.g., Robert C. Seeger et al., Morphology, growth, chromosomal pattern and fibrinolytic activity of two new human neuroblastoma cell lines, 37 (5) Câncer Res. 1364-1371 (1977); e G. J. West et al.,

Adrenergic, cholinergic, and inactive human neuroblastoma cell lines with the action-potential Na+ ionophore, 37 (5) Câncer Res. 1372-1376 (1977), MC-IXC (ATCC CRL-2270), MHH- NB-11 (DSMZ ACC 157), N18Tg2 (DSMZ ACC 103), N1E-115 (ATCC CCL-22 63; ECACC 88112303), N4TG3 (DSMZ ACC 101), Neuro-2A (ATCC CCL-131; ECACC 89121404; DSMZ-ACC 148), NB41A3 (ATCC CCL-147; ECACC 89121405), NS20Y (DSMZ ACC 94), SH-SY5Y (ATCC CRL-22 6 6; ECACC 94030304; DSMZ ACC 209), SIMA (DSMZ ACC 164), SK-N-DZ (ATCC CRL-2149; ECACC 94092305), SK-N-F1 (ATCC CRL-2142, ECACC 94092304), SK-N-MC (ATCC HTB-10, DSMZ ACC 203) e SK-N-SH (ATCC HTB-11, ECACC 86012802). Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula de neuroblastoma. De acordo com aspectos desta variante, uma célula de neuroblastoma pode ser, v.g., BE(2)-C, BE(2)-M17, 170 C1300, CHP-212, CHP-126, IMR 32, KELLY, LA-N-2, MC-IXC, MHH-NB-11, N18Tg2, N1E-115, N4TG3, Neuro-2A, NB41A3, NS20Y, SH-SY5Y, SIMA, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-MC e SK-N-SH. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrídeo de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem compreender uma célula de neuroblastoma, tal como, v.g., células SH-SYSY, que incluam um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A ou uma sequência de reconhecimento de BoNT/E; células neuro-2a, que incluam um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A; e células N1E-115 ou células SK-N-DZ, que incluam um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/E.

As linhas celulares neuronais híbridas, tais como, v.g., as linhagens celulares neuronais híbridas de murinos, de ratos, de primatas e de seres humanos, podem ser úteis de acordo com aspectos da invenção. Tais linhagens celulares híbridas incluem híbridos neuroblastoma/glioma, tais como, v.g., N18 (ECACC 88112301), NG108-15 (ATCC HB-12317, ECACC 88112302) e NG115-401 L (ECACC 87032003); híbridos neuroblastoma/neurónios motores, tais como, v.g., NSC-19 e NSC-34, que expressam características de neurónios motores, apresentam um fenótipo de tipo neurónio multipolar, expressam níveis elevados de colina-acetiltransferase (CHAT), geram potenciais de acção, expressam proteínas de neurofilamentos com tripleto e 171 sintetizam, armazenas e libertam acetilcolina, ver, v.g., N. R. Cashman et al., Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons, 194 (3) Dev. Dyn. 209-221 (1992); e Christopher J. Eggett et al., Development and characterisation of a glutamate-sensitive motor neuronal cell line, 74(5) J. Neurochem. 1895-1902 (2000); híbridos de neuroblastoma/neurónios de gânglios de raiz dorsal, tais como, v.g., Fll, ver, v.g., Doros Platika et al., Neuronal traits of clonal cell lines derived by fusion of dorsal root ganglia neurons with neuroblastoma cells, 82(10) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 3499-3503 (1985), ND-C (ECACC 92090913), ND-E (ECACC 92090915), ND-U1 (ECACC 92090916), ND3 (ECACC 92090901), ND7/23 (ECACC 92090903), ND8/34 (ECACC 92090904), ND8/47, ND15 (ECACC 92090907), ND2 7 (ECACC 92090912); híbridos neuroblastoma/neurónios do hipocampo, tais como, v.g., HN-33, ver, v.g., Henry J. Lee et al., Neuronal properties and trophic activities of immortalized hippocampal cells from embryonic and young adult mice. 10(6) J. Neurosci. 1779-1787 (1990) . Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrídeo podem ser um neurónio híbrido. De acordo com aspectos desta variante, um neurónio híbrido pode ser, v.g., um híbrido neuroblastoma/glioma, um híbrido neuroblastoma/neurónio motor, um híbrido neuroblastoma/neurónio dos gânglios da raiz e um híbrido neuroblastoma/neurónio do hipocampo. De acordo com outros aspectos desta variante, um híbrido neuroblastoma/glioma pode ser, v.g., N18, NG108-15 e NG115-4 01L. De acordo com outros aspectos desta variante, um híbrido neuroblastoma/neurónio motor pode ser, v.g., NSC-19 e NSC-32. De acordo com outros aspectos desta variante, um 172 híbrido neuroblastoma/neurónio dos gânglios da raiz dorsal pode ser, v.g., ND8-47. De acordo com outros aspectos desta variante, um híbrido neuroblastoma/neurónio dos gânglios da raiz pode ser, v.g., Fll, ND-C, ND-E, ND-U1, ND3, ND7/23, ND8/34, ND8/47, ND15 e ND27. De acordo com outros aspectos desta variante, um híbrido neuroblastoma/neurónio do hipocampo pode ser, v.g., HN-33. A linhagem celular NG108-15 é um híbrido de células de neuroblastoma de murganho rato e de glioma de rato que se liga ao BoNT/Cl em concentrações subnanomolares com um valor CI50 de 0,2 nM (0,18 ng de complexo por microlitro) , atingindo a saturação a 6 nM, ver, v.g., Noriko Yokosawa et al., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); e Noriko Yokosawa et al., Binding of botulinum type Cl, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29(2) Toxicon 261-264 (1991). Com base nos dados de ligação, a linhagem celular NG108-15 podem conter receptores de afinidade reduzida e elevada para BoNT/Cl. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade de toxina de clostrídeo toxina de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem incluir um célula neuronal híbrida, tal como, v.g., células NG108-15, que incluam um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl ou uma sequência de reconhecimento de BoNT/E; e células NG108-15, que incluam um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento 173 de Sintaxina; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl.

As linhagens celulares de medula espinal, tais como, v.g., as linhagens celulares de medula espinal de murinos, ratos, primatas ou seres humanos podem ser úteis de acordo com aspectos da invenção e incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, TE 189.T (ATCC CRL-7947) e M4b, ver, v.g., Ana M. Cardenas et al., Establishment and characterization of immortalized neuronal cell lines derived from the spinal cord of normal and trisomy 16 fetal mice, an animal model of Down syndrome, 68(1) J. Neurosci. Res. 46-58 (2002) . Como exemplo, é possível gerar uma linhagem celular de medula espinal humana a partir de precursores de células embriónicas de medula espinal humana (embriões do primeiro trimestre) que estão imortalizadas com um onco-gene v-myc repressivo de tetraciclina, conforme descrito por Ronghao U et al., Motoneuron differentiation of immortalized human spinal cord cell lines, 59 (3) J. Neurosci. Res. 342-352 (2000). Tais células podem ser expandidas indefinidamente em condições de crescimento proliferativo, antes da sua rápida diferenciação (4 a 7 dias) em neurónios funcionais que expressam os marcadores fenotípicos neuronais, tais como colina-acetiltransferase. Como outro exemplo, é possível preparar uma linhagem de medula espinal de murinos por imortalização de uma cultura de medula espinal embriónica, utilizando um meio de transformação. Tal linhagem celular de medula espinal pode ser, por exemplo, a linhagem M4b de murino e pode expressar marcadores neuronais, tais como NSE, sinaptofisina, MAP 2 e colina-acetiltransferase, e pode libertar acetilcolina mediante estimulação adequada, ver, v.g., Cardenas et al., 174 supra, (2002) . Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula de medula espinal. De acordo com aspectos desta variante, uma célula de medula espinal pode ser, , v.g., THE 189.T e M4b.

As linhagens celulares do sistema nervoso central (SNC), tais como, v.g., linhagens celulares do SNC de murinos, ratos, primatas e humanos, podem ser úteis de acordo com aspectos da invenção. Uma linhagem celular do SNC útil pode ser, por exemplo, uma linhagem celular do SNC humano imortalizada com um oncogene v-myc repressor de tetraciclinas, conforme descrito por Dinah W. Sah et al., Bipotent progenitor cell lines from the human CNS, 15(6) Nat. Biotechnol. 574-580 (1997) . Durante a repressão do oncogene, as células são diferenciadas em neurónios. Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrideo podem ser uma célula do SBC.

As linhagens celulares do córtex cerebral, tais como, v.g., as linhagens celulares do córtex cerebral de murinos, ratos, primatas e humanos, podem ser úteis de acordo com aspectos da invenção e incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, CNh, ver, v.g., Ana M. Cardenas et al., Calcium signals in cell lines derived from the cerebral córtex of normal and trisomy 16 mice, 10(2) Neuroreport 363-369 (1999), HCN-la (ATCC CRL-10442) and HCN-2 (ATCC CRL-10742). Como exemplo, é possível imortalizar culturas primárias de córtex de murino a partir de embriões com 12 a 16 dias, por exemplo, por meio de cultura de células em meio condicionado a partir de linhagens celulares da tiróide de ratos que induzem a transformação in vitro. As 175 células imortalizadas podem ser diferenciadas em neurónios que expressem marcadores neuronais, utilizando o meio adequado; estas células diferenciadas expressam colina-acetiltransferase e segregam acetilcolina e glutamato em resposta a despolarização e a estimulação com nicotina, ver, v.g., David D. Allen et al., Impaired cholinergic function in cell lines derived from the cerebral córtex of normal and trisomy 16 mice, 12(9) Eur. J. Neurosci. 3259-3264 (2000). Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula do córtex cerebral. De acordo com aspectos desta variante, uma célula do córtex cerebral pode ser, v.g., CNh, HCN-la e HCN-2.

As linhagens celulares de gânglios da raiz dorsal, tais como, v.g., as linhagens celulares de gânglios da raiz dorsal de murinos, ratos, primatas e humanos, podem ser úteis de acordo com aspectos da invenção e incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, G4b, ver, v.g., David D. Allen et al., A dorsal root ganglia cell line derived from trisomy 16 fetal mice, a model for Down syndrome, 13(4) Neuroreport 491-496 (2002). As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal embriónicas podem ser imortalizadas com meios condicionados de transformação, tal como descrito antes. Durante a diferenciação, a linhagem celular exibe traços neuronais e a falta de marcadores gliais, por imuno-histoquimica. A libertação de neurotransmissores, tais como acetilcolina, pode ser induzida em resposta a potássio e nicotina, ver, v.g.,

Allen et al., supra, (2002) . Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula de gânglios da 176 raiz dorsal. De acordo com aspectos desta variante, uma célula de gânglios da raiz dorsal pode ser, v.g., G4b.

As linhagens celulares do hipocampo, tais como, v.g., as linhagens celulares do hipocampo de murinos, ratos, primatas e humanos, podem ser úteis de acordo com aspectos da invenção e incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, HT-4, ver, v.g., K. Frederiksen et al., Immortalization of precursor cells from the mammalian CNS, 1(6) Neuron 439-448 (1988); e HT-22, ver, v.g., John B.

Davis e Pamela Maher, Protein kinase C activation inhibits glutamate-induced cytotoxicity in a neuronal cell line, 652(1) Brain Res. 169-173 (1994). Como exemplo não limitativo, a linhagem celular HT-22 do hipocampo de murino pode ser útil de acordo com a invenção. Como outro exemplo não limitativo, a linhagem celular HN33 imortalizada do hipocampo pode ser útil de acordo com a invenção. Esta linhagem celular do hipocampo foi obtida a partir da fusão de neurónios primários do hipocampo de murganhos, 21 dias após o nascimento, com a linhagem celular N18TG2 de neuroblastoma, e, após diferenciação, partilha propriedades da membrana com neurónios adultos do hipocampo numa cultura primária, ver, v.g., Henry J. Lee et al., Neuronal Properties and Trophic Activities of Immortalized

Hippocampal Cells from Embryonic and Young Adult Mice, 19(6) J. Neurosci. 1779-1787 (1990); e Henry J. Lee et al., Immortalized young adult neurons from the septal region: generation and characterization, 52(1-2) Brain Res. Dev Brain Res. 219-228 (1990). Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula do hipocampo. De 177 acordo com aspectos desta variante, uma célula do hipocampo podem ser, v.g., HT-4, HT-22 e HN33.

De acordo com aspectos da invenção, há diversas células não neuronais que são úteis. Como células não neuronais úteis de acordo com aspectos da invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células não neuronais primárias; células não neuronais imortalizadas ou estabelecidas; células não neuronais transformadas; células tumorais não neuronais; células não neuronais transfectadas estável e transientemente, incluindo ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células não neuronais de mamíferos, murinos, ratos, primatas e humanos. As células não neuronais úteis de acordo com aspectos da invenção incluem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, quaisquer umas das células primárias ou estabelecidas seguintes: células da pituitária anterior; células adrenais, tais como, v.g., células cromafins da medula adrenal; células pancreáticas, tais como, v.g., células acinares pancreátcas, células β pancreáticas e células insulinoma HIT ou INS-1; células do ovário, tais como, v.g., células do ovário produtoras de esteróide; células do rim, tais como, v.g., células HEK-293 (ATCC CRL 1573) e células do dueto colector medular interno (IMCD); células do estômago, tais como, v.g., células enterocromafins; células sanguíneas, tais como, v.g., euritrócitos, leucócitos, plaquetas, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos; células epiteliais, tais como, v.g., as da membrana apical do plasma; fibroblastos; células da tiróide; condrócitos; células musculares; hepatócitos; células glandulares, tais como, v.g., células pituitárias, células adrenais, células cromafins; e células 178 implicadas na translocação do transporte de glicose (GLUT4). Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula não neuronal. De acordo com aspectos desta variante, uma célula não neuronal pode ser uma linhagem celular não neuronal célula primária ou estabelecida proveniente de, v.g., células da pituitária anterior, células adrenais, células pancreáticas, células do ovário, células do rim, células do estômago, células sanguíneas, células epiteliais, fibroblastos, células da tiróide, condrócitos, células musculares, hepatócitos e células glandulares. De acordo com um aspecto desta variante, uma linhagem celular do rim podem ser, v.g., HEK-293.

Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrideo de acordo com o método descrito na presente memória descritiva podem compreender uma célula não neuronal primária ou estabelecida, tal como, v.g., células cromafins ou células acinares pancreáticas, que inclui um substrato de toxina de clostrideo que compreende uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A ou uma sequência de reconhecimento de BoNT/E; uma célula neuronal primária, tal como, v.g., células cromafins ou células acinares pancreáticas, que inclui um substrato de toxina de clostrideo que compreende uma sequência de reconhecimento de VAMP; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/B ou uma sequência de reconhecimento de TeNT; e uma célula neuronal primária, tal como, v.g., células cromafins ou células acinares pancreáticas, que inclui um substrato de toxina de clostrideo que compreende 179 uma sequência de reconhecimento de Sintaxina; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl.

Tal como descrito antes, as células úteis de acordo com a invenção incluem células neuronais e não neuronais que expressam niveis reduzidos ou indetectáveis do receptor endógeno mas que foram transfectadas com, ou de um outro modo qualquer manipuladas para expressar, uma ou várias moléculas de ácido nucleico exógeno que codifica um ou vários receptores de toxina de clostrideo. A selecção do receptor de toxina de clostrideo depende da toxina de clostrideo que se pretende testar. Como exemplo não limitativo, uma célula neuronal ou não neuronal pode ser manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifique o receptor do factor 2 de crescimento de fibroblastos (FGFR3), o qual actua como um receptor de BoNT/A, ver, v.g., pedido de patente de invenção PCT n° 2005/006421. Como outro exemplo não limitativo, uma célula neuronal ou não neuronal pode ser manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifique uma isoforma de glicoproteína 2 da vesícula sináptica (SV2), que actua como um receptor de BoNT/A, ver, v.g., Min Dong et ai., SV2 Is the Protein Receptor for Botulinum Neurotoxin A, Science (2006); S. Mahrhold et ai., The Synaptic Vesicle Protein 2C Mediates the Uptake of Botulinum Neurotoxin A into Phrenic Nerves, 580 (8) FEBS Lett. 2011-2014 (2006) . Além disso, uma célula neuronal ou não neuronal pode ser manipulada estável ou transientemente para expressar múltiplas moléculas de ácido nucleico exógeno que codifiquem a FGFR3 e a isoforma SV2. Como outro exemplo não limitativo, uma célula neuronal ou não neuronal 180 pode ser manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifique a sinaptotagmina I, que actua como um receptor de BoNT/B e como um receptor de BoNT/G, ver, v.g., Min Dong et al., Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells, 162(7) J. Cell Biol. 1293-1303 (2003); e Andreas Rummel et al., Synaptotagmins I and II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G, 279(29) J. Biol. Chem. 30865-30870 (2004). Como outro exemplo não limitativo, uma célula neuronal ou não neuronal pode ser manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifique a sinaptotagmina II, que actua como um receptor de BoNT/B e como um receptor de receptor BoNT/G, ver, v.g., Min Dong et al., supra, (2003); e Andreas Rummel et al., supra, (2004).

Assim, de acordo com uma variante, uma célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uma FGFR3. De acordo com aspectos desta variante, um célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica a FGFR3 da SEQ ID NO: 173, a FGFR3 da SEQ ID NO: 174 ou a FGFR3 da SEQ ID NO: 175. De acordo com outra variante, uma célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uma SV2. De acordo com aspectos desta variante, a célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica a SV2 da SEQ ID NO: 17 6, a 181 SV2 da SEQ ID NO: 177, a SV2 da SEQ ID NO: 178 ou a SV2 da SEQ ID NO: 179.

De acordo com outra variante, uma célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uma FGFR3 e uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uma SV2. De acordo com aspectos desta variante, a célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica a FGFR3 da SEQ ID NO: 173, a FGFR3 da SEQ ID NO: 174 ou a FGFR3 da SEQ ID NO: 175 e uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica a SV2 da SEQ ID NO: 176, a SV2 da SEQ ID NO: 177, a SV2 da SEQ ID NO: 178 ou a SV2 da SEQ ID NO: 179.

De acordo com outra variante, a célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uma sinaptotagmina I. De acordo com aspectos desta variante, a célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica a sinaptotagmina da SEQ ID NO: 180.

De acordo com outra variante, a célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uma sinaptotagmina II. De acordo com aspectos desta variante, a célula neuronal ou não neuronal é manipulada estável ou transientemente para expressar uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica a sinaptotagmina da SEQ ID NO: 181. 182

As células úteis de acordo com aspectos da presente invenção incluem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células transformadas, células tumorais ou outras células que sobre-expressem um ou vários receptores de toxina de clostrideo exógenos ou que expressem um ou vários receptores de toxina de clostrideo endógenos. Faz-se observar que o receptor sobre-expresso pode ser uma forma de tipo selvagem do receptor ou pode incluir uma ou vários modificações de aminoácidos, comparativamente com o receptor de tipo selvagem, desde que o processo de intoxicação com toxina de clostrideo possa ainda ocorrer. Como exemplo não limitativo, células úteis para determinar a actividade de BoNT/A compreendem aquelas que expressam ou que sobre-expressam uma forma do receptor do factor 3 de crescimento de fibroblastos (FGFR3). Como outro exemplo não limitativo, as células úteis para determinar a actividade de BoNT/B compreendem aqueles que expressam ou sobre-expressam uma forma de sinaptotagmina I. Como outro exemplo não limitativo, as células úteis para determinar a actividade de BoNT/B compreendem aqueles que expressam ou sobre-expressam uma forma de sinaptotagmina II. Como outro exemplo não limitativo, as células úteis para determinar a actividade de BoNT/G compreendem aqueles que expressam ou sobre-expressam uma forma de sinaptotagmina I. Como outro exemplo não limitativo, as células úteis para determinar a actividade de BoNT/G compreendem aqueles que expressam ou sobre-expressam uma forma de II.

As células que expressam ou sobre-expressam uma forma do receptor do factor 3 de crescimento de fibroblastos compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células de mieloma, células de carcinoma da bexiga, células 183 de carcinoma da próstata, células de carcinoma da tiróide e células de carcinoma cervical, que ocorrem naturalmente e manipuladas geneticamente, bem como primárias ou estabelecidas. Tais células úteis de acordo com aspectos da invenção compreendem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, linhagens celulares de mieloma humano, incluindo H929 (ATCC CRL-9068; ECACC 95050415; DSMZ ACC 163), JIM-3, ver, v.g.r H. Barker et al., págs. 155-158 (J. Radl & B. van Camp eds., EURAGE Monoclonal Gammopathies III: Clinicai Significance and Basic Mechanisms, 1991), KMS-11, ver, v.g., Masayoshi Namba et al., Establishment of five human myeloma cell lines, 25(8) In Vitro Cell Dev. Biol. 723-729 (1989), KMS-18, ver, v.g., Naozo Nakazawa et al., Interphase detection of t(4;14) (pl6.3;q32.3) by in situ hybridization and FGFR3 over-expression in plasma cell malignancies, 117(2) Câncer Genet. Cytogenet. 89-96 (2000), LB278, ver, v.g., D. Ronchetti et al., Characterization of the t (4;14) (pl6.3;q32) in the KMS-18 multiple myeloma cell line, 15(5 ) Leukemia 864-865 (2001) , LB375, ver, v. g., Ronchetti et al., supra, (2001), LB1017, ver, v. g., Ronchetti et al., supra, (2001), LB2100, ver, v. g. , Ronchetti et al., supra, (2001), LP-1 (DSMZ ACC 41), OPM-2 (DSMZ ACC 50), PCL1, ver, v.g., Ronchetti et al. , supra, (2001), UTMC-2, ver, v.g., Shuji Ozaki et al., Characterization of a novel interleukin-6 autocrine-dependent human plasma cell line, 8(12) Leukemia 2207-2213 (1994), que sobre-expressam o FGFR3 devido à translocação cromossómica t(4;14)(ql6.3;q32.3) e outras células de mieloma múltiplo com uma translocação t(4:14); células de leucemia, incluindo células de leucemia mielóide crónica (CML), tais como células CD34+ BCR-ABL+; e células de 184 carcinoma da bexiga, incluindo células de carcinoma urotelial primárias e outras. É evidente para um especialista na matéria que estas e outras células que sobre-expressem ou que expressem uma forma do receptor do factor 4 de crescimento de fibroblastos podem ser úteis para determinar a actividade de BoNT/A de acordo com um método da invenção.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrideo pode ser uma célula que expresse um receptor de toxina de clostrideo endógeno. De acordo com aspectos desta variante, um receptor de toxina de clostrideo endógeno expresso por uma célula é um receptor para, v.g., BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G e TeNT. De acordo com outros aspectos desta variante, um receptor de toxina de clostrideo endógeno é, v.g., FGFR3, sinaptotagmina 1 ou sinaptotagmina II. De acordo com outro aspecto desta variante, uma células que expresse um receptor de toxina de clostrideo endógeno pode ser proveniente de, v.g., uma linhagem celular de mieloma primário, uma linhagem celular de mieloma estabelecido, uma linhagem celular de carcinoma da bexiga primário; uma linhagem celular de carcinoma da bexiga estabelecido, uma linhagem celular de carcinoma cervical primário e uma linhagem celular de carcinoma cervical estabelecido. De acordo com outra variante, a célula que expressa o FGFR3 pode ser, v.g., uma célula que contém uma translocação cromossómica t(4;14) (ql6.3;q32.3) . De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula que expresse o FGFR3 pode ser, v.g., H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 e UTMC-2. De acordo com outros aspectos desta variante, uma 185 células que expresse o FGFR3 pode ser, v.g., H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 e UTMC-2. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrídeo de acordo com o método descrito na presente memória descritiva podem incluir uma células de mieloma estabelecida, tal como, v.g., KMS-11 ou H929, que inclua um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A; uma célula de carcinoma da bexiga primária ou estabelecida que inclua um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A; e uma célula de carcinoma cervical primária ou estabelecida que inclua um substrato de toxina de clostrídeo que compreenda uma sequência de reconhecimento de SNAP-25; tal como, v.g., uma sequência de reconhecimento de BoNT/A.

Assim, tais células úteis de acordo com aspectos da invenção compreendem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, linhagens celulares transfectadas de um modo estável que expressem um receptor de toxina de clostrídeo, incluindo, v.g., B9, ver, v.g., Elizabeth E. Plowright et al., Ectopic expression of fibroblast growth factor receptor 3 promotes myeloma cell proliferation and prevents apoptosis, 95(3) Blood 992-998 (2000); TC, ver, v.g., Hiroyuki Onose et al., Over-expression of fibroblast growth factor receptor 3 in a human thyroid carcinoma cell line results in overgrowth of the confluent cultures, 140(2) Eur. J. Endocrinol. 169-173 (1999); L6, ver, v.g., M. Kana et al., Signal transduction pathway of human 186 fibroblast growth factor receptor 3. Identification of a novel 66-kDa phosphoprotein, 272(10) J. Biol. Chem. 6621-6628 (1997); e CFK2, ver, v.g., Janet E. Henderson et ai., Expression of FGFR3 with the G380R achondroplasia mutation inhibits proliferation and maturation of CFK2 chondrocytic cells, 15(1) J. Bone Miner. Res. 155-165 (2000). É evidente para um especialista na matéria que estas e outras células que sobre-expressem ou que expressem uma forma activada do receptor do factor 3 de crescimento de fibroblastos podem ser úteis de acordo com o método da invenção. Assim, de acordo com uma variante, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrídeo pode ser uma célula que expresse de um modo estável um receptor de toxina de clostrídeo endógeno. De acordo com aspectos desta variante, um receptor de toxina de clostrídeo endógeno expresso de um modo estável por uma células é um receptor para, v.g., BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G e TeNT. De acordo com outros aspectos desta variante, um receptor de toxina de clostrídeo endógeno é, v.g., o FGFR3. De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula que expressa o FGFR3 pode ser, v.g., B9, TC, L6 e CFK2. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrídeo de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem incluir uma célula B9 que expresse de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; uma célula B9 que contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; uma célula TC que expresse de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um 187 substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; uma célula TC que contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; uma célula L6 que expresse de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; uma célula L6 que contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; uma célula CFK2 que expresse de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; e uma célula CFK2 que contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A.

As composições de célula descritas na presente memória descritiva compreendem, em parte, um substrato de toxina de clostrídeo. Prevê-se que qualquer substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva possa ser utilizado. Assim, há aspectos desta variante que incluem moléculas de ácido nucleico, tais como, v.g., ADN e ARN, que codifiquem um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva e uma molécula de péptido ou um peptidomimético que compreendem um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva. Há outros aspectos desta variante que compreendem, em parte, uma sequência de reconhecimento da toxina, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/A, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/B, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/Cl, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/D, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/E, uma sequência de reconhecimento da toxina BONT/F, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/G e uma sequência de reconhecimento da toxina TeNT. Há outros aspectos desta variante que compreendem, em parte, um domínio de endereçamento para a membrana, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os dominios de endereçamento para a membrana presentes em SNAP-25 que ocorre naturalmente, variantes de SNAP-25 MTD que ocorrem naturalmente e variantes de SNAP-25 MTD que não ocorrem naturalmente e peptidomiméticos de SNAP-25 MTD; e dominios de endereçamento para a membrana presentes na sintaxina que ocorre naturalmente, nas variantes de sintaxina MTD que ocorrem naturalmente e variantes de sintaxina MTD que não ocorrem naturalmente variantes e peptidomiméticos de sintaxina MTD. Outros aspectos desta variante compreendem, em parte, um primeiro membro de um par FRET, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, proteínas fluorescentes de tipo selvagem, variantes que ocorrem naturalmente, variantes geneticamente manipuladas e fragmentos activos de péptidos obtidos a partir de proteínas fluorescentes de Aequorea, proteínas fluorescentes de Anemonia, proteínas fluorescentes de Anthozoa, proteínas fluorescentes de Discosoma, proteínas fluorescentes de Entacmeae, proteínas fluorescentes de Heteractis, proteínas fluorescentes de Montastrea, proteínas fluorescentes de Renilla, proteínas fluorescentes de Zoanthus. Como exemplos não limitativos de proteínas fluorescentes refere-se, v.g., EBFP, ECFP, AmCyan, AcGFP, ZsGreen, Vitality® hrGFP, EGFP, Monster Green® hMGFP, EYFP, ZsYellow, DsRed-Express, DsRed2, DsRed, AsRed2 e HcRedl. 189

Outros aspectos desta variante compreendem, em parte, um segundo membro de um par FRET, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um corante de carbocianina de cadeia longa, um corante de aminoestirilo, um corante de estirilo anfifilico, um catião lipofílico, uma sonda de membrana com desvios espectrais sensíveis ao ambiente ou um corante FM. Como exemplos não limitativos de corantes lipofílicos refere-se corantes de dialquilcarbocianina de cadeia longa, tais como, v.g.r Dil Vibrant, DilCi8(3), DilCie (3)-DS, SP-Dí1Ci8 (3) , 5-5 '-Ph2-DilC18 (3) e DiD, octadecil-rodamina B, 5-dodecanoí1-aminofluoresceina, 5-hexadecanoí1-aminofluoresceína, 5-octadecanoí1-aminofluoresceina, 4-heptadecil-7-hidroxi-coumarina, DPH, TMA-DPH, TMAP-DPH, ácido propiónico de DPH, BODIPY 493/503, BODIPY 505/515, BODIPY 665/676, BODIPY FL C5-ceramida, éster metílico de CellTrace BODIPY TR, um corante de fenoxazina vermelho do Nilo, um 1,3-bis-(1-pireno)-propano, bimano-azida, prodan, laurdan, acrilodan, badan, 1,8-ANS, 2,6-ANS, 2,6-TNS, bis-ANS, DCVJ, MBDS.

As composições de células descritas na presente memória descritiva compreendem, em parte, uma célula que contém, transientemente, um substrato de toxina de clostrídeo. Tal como aqui utilizado, o termo "contendo transientemente" designa um substrato de toxina de clostrídeo que é introduzido temporariamente numa célula para efectuar os ensaios descritos na presente memória descritiva. Por definição, para se realizar os ensaios descritos na presente memória descritiva pelo menos 50% das células que compreendem a população celular deverão conter um substrato de toxina de clostrídeo. Tal como aqui utilizado, o termo "população celular" designa o número 190 total de células utilizado num método que introduz transientemente um substrato de toxina de clostrídeo para um determinado ensaio. Como exemplo não limitativo, para uma população celular de l,5xl05 células, pelo menos 7,5xl04 células deverão conter um substrato de toxina de clostrídeo, que não ocorre naturalmente, após transdução, utilizando, v.g., um método adenoviral ou um método lentiviral. Como outro exemplo não limitativo, para uma população celular de l,5xl05 células, pelo menos 7,5xl04 células deverão conter um substrato de toxina de clostrídeo, após transfecção, utilizando, v.g., um método de transfecção de proteínas. Assim, uma célula que contém transientemente um substrato de toxina de clostrídeo descrita na memória descritiva podem compreender uma células que contém um substrato, v.g., com um máximo de cerca de um dia, com um máximo de cerca de dois dias, com um máximo de cerca de três dias, com um máximo de cerca de quatro dias, com um máximo de cerca de cinco dias , com um máximo de cerca de seis dias, com um máximo de cerca de sete dias , com um máximo de cerca de oito dias, com um máximo de cerca de nove dias e com um máximo de cerca de dez dias, e em que a população celular que contém um substrato de toxina de clostrídeo compreende, v.g., pelo menos 50% das células da população celular das células da população celular, pelo menos 60% das células da população celular, pelo menos 70% das células da população celular, pelo menos 80% das células da população celular e pelo menos 90% das células da população celular.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula que contém transientemente uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrídeo associado à 191 membrana. De acordo com aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo associado à membrana codificado pela molécula de ácido nucleico pode ser, v.g., um substrato de BoNT/A, um substrato de BoNT/B, um substrato de BoNT/Cl, um substrato de BoNT/D, um substrato de BoNT/E, um substrato de BoNT/F, um substrato de BoNT/G ou um substrato de TeNT. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrideo de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem compreender células SH-SY5Y, tais como, v.g., células SH-SY5Y diferenciadas e células SH-SY5Y que expressam transientemente uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E; células NG108-15, tais como, v.g., células NG108-15 diferenciadas e células NG108-15 que expressam transientemente uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrideo, tais como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E; células neuro-2A, tais como, v.g., células neuro-2A diferenciadas e células neuro-2A que expressam transientemente uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrideo, tais como, v.g., um substrato de BoNT/A; células N1E-115, tais como, v.g., células N1E-115 diferenciadas e células N1E-115 que expressam transientemente uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrideo, tais como, v.g., um substrato de BoNT/E; e células SK-N-DZ, tais como, v.g., células SK-N-DZ diferenciadas e células SK-N-DZ que expressam transientemente uma molécula de ácido nucleico 192 que codifica um substrato de toxina de clostrideo, tais como, v.g., um substrato de BoNT/E.

De acordo com outra variante, uma célula contém transientemente um substrato de toxina de clostrideo associado à membrana. De acordo com aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo que pode ser localizado na membrana de plasma pode ser, v.g., um substrato de BoNT/A, um substrato de BoNT/B, um substrato de BoNT/Cl, um substrato de BoNT/D, um substrato de BoNT/E, um substrato de BoNT/F, um substrato de BoNT/G ou um substrato de TeNT. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrideo de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem compreender células SH-SY5Y, tais como, v.g., células SH-SY5Y diferenciadas e células SH-SY5Y que contêm transientemente um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E: células NG108-15, tais como, v.g., células NG108-15 diferenciadas e células NG108-15 que contêm transientemente um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E; células Neuro-2A, tais como, v.g., células Neuro-2A diferenciadas e células Neuro-2A que contêm transientemente um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; células N1E-115, tais como, v.g., células N1E-115 diferenciadas e células N1E-115 que contêm transientemente um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/E; e células SK-N-DZ, tais como, v.g., células SK-N-DZ diferenciadas e células SK-N-DZ que contêm transientemente 193 um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g.r um substrato de BoNT/E.

As composições de células descritas na presente memória descritiva compreendem, em parte, uma célula que contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrídeo. Tal como aqui utilizado, o termo "contém de um modo estável" designa um substrato de toxina de clostrídeo que é introduzido numa célula e mantido durante períodos longos de tempo para realizar os ensaios de fluorescência da presente invenção. Moléculas de ácido nucleico mantidas de um modo estável compreendem moléculas de ácido nucleico mantidas de um modo estável que são extra-cromossómicas e que se replicam autonomamente e moléculas de ácido nucleico mantidas de um modo estável que são integradas no material cromossómico da célula e que se replica de um modo não autónomo. Assim, uma célula que contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrídeo descrito na memória descritiva pode compreender uma célula que contém um substrato durante, v.g., pelo menos dez dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos 40 dias, pelo menos 50 dias, pelo menos 60 dias, pelo menos 70 dias, pelo menos 80 dias, pelo menos 90 dias e pelo menos 100 dias. Outros aspectos de uma célula que contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrídeo descrito na memória descritiva pode compreender uma célula que contém permanentemente um substrato de toxina de clostrídeo.

Assim, de acordo com uma variante, uma célula contém de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrídeo associado à membrana. De acordo com aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrídeo associado à membrana 194

codificado pela molécula de ácido nucleico pode ser, v.g., um substrato de BoNT/A, um substrato de BoNT/B, um substrato de BoNT/Cl, um substrato de BoNT/D, um substrato de BoNT/E, um substrato de BoNT/F, um substrato de BoNT/G ou um substrato de TeNT. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrídeo de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem incluir células SH-SY5Y, tais como, v.g., células SH-SY5Y diferenciadas e células SH-SY5Y que expressem de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E; células NG108-15, tais como, v.g., células NG108-15 diferenciadas e células NG108-15 que expressem de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E; células Neuro-2A, tais como, v.g., células Neuro-2A diferenciadas e células Neuro-2A que expressem de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; células KMS-11, tais como, v.g., células KMS-11 diferenciadas e células KMS-11 que expressem de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; células N1E-115, tais como, v.g., células N1E-115 diferenciadas e células N1E-115 que expressem de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/E; e células SK-N-DZ, tais como, v.g., células SK-N-DZ diferenciadas e células SK-N-DZ 195 que expressem de um modo estável uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/E.

De acordo com outra variante, uma célula contém de um modo estável um substrato de toxina de clostrideo associado à membrana. De acordo com aspectos desta variante, o substrato de toxina de clostrideo associado à membrana pode ser, v.g., um substrato de BoNT/A, um substrato de BoNT/B, um substrato de BoNT/Cl, um substrato de BoNT/C, um substrato de BoNT/E, um substrato de BoNT/F, um substrato de BoNT/G ou um substrato de TeNT. Como exemplos não limitativos, as células úteis para determinar a actividade da toxina de clostrideo de acordo com um método descrito na presente memória descritiva podem compreender células SH-SY5Y, tais como, v.g., células SH-SY5Y diferenciadas e células SH-SY5Y que contêm de um modo estável um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E; células NG108-15, tais como, v.g., células NG108-15 diferenciadas e células NG108-15 que contêm de um modo estável um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A ou um substrato de BoNT/E; células Neuro-2A, tais como, v.g., células Neuro-2A diferenciadas e células Neuro-2A que contêm de um modo estável um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; células KMS-11, tais como, v.g., células KMS-11 diferenciadas e células KMS-11 que contêm de um modo estável um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/A; células N1E-115, tais como, v.g., células N1E-115 diferenciadas e células N1E-115 que contêm de um modo estável um substrato de toxina de clostrideo, tal como, 196 v.g., um substrato de BoNT/E; e células SK-N-DZ, tais como, v.g., células SK-N-DZ diferenciadas e células SK-N-DZ que contêm de um modo estável um substrato de toxina de clostrideo, tal como, v.g., um substrato de BoNT/E.

Tal como referido antes, uma molécula de ácido nucleico pode ser utilizada para expressar um substrato de toxina de clostrideo descrito na presente memória descritiva. Prevê-se que possam ser utilizados todos os métodos para a introdução de uma molécula de ácido nucleico numa célula. Como métodos úteis para a introdução de uma molécula de ácido nucleico numa célula refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os métodos mediados com fosfato de cálcio, mediados com DEAE-dextrano, mediados com lipidos, mediados com polibreno, mediados com polilisina, mediados com virus, micro-injecção, fusão de protoblastos, biolisticos, electroporação e conjugação com um anticorpo, gramacidina S, invólucros virais artificiais ou outros veículos intracelulares, tais como TAT., ver, v.g., Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian cells, págs. 16.1-16:62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001); Alessia Colosimo et al., Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells; 29(2) Biotechniques 314-318, 320-322, 324 (2000); Philip Washboume & A. Kimberley McAllister, Techniques for gene transfer into neurons, 12(5) Curr. Opin. Neurobiol. 566-573 (2002); e Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, págs. 9.16.4-9.16.11 (2000). É evidente para um especialista na matéria que a selecção de um método específico para a introdução de uma molécula de ácido nucleico numa célula irá depender, em parte, do facto da célula conter, 197 transientemente, o substrato de toxina de clostrideo ou da célula conter, de um modo estável, o substrato de toxina de clostrideo.

De acordo com um aspecto desta variante, utiliza-se um método quimicamente mediado, designado por transfecção, para introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrideo na célula. Mos métodos quimicamente mediados de transfecção o reagente quimico forma um complexo com o ácido nucleico que facilita a sua absorção pelas células. Tais reagentes químicos incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, fosfato de cálcio, ver, v.g.r Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); dietilaminoetil(DEAE)-dextrano, lípidos, polímeros catiónicos do tipo polimérico do tipo polietilenoimina (PEI), polilisina e polibreno, ver, v.g., Chun Zhang et al., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004). Tais sistemas de transporte quimicamente mediados podem ser preparados por métodos convencionais, os quais estão comercialmente disponíveis, ver, v.g., estojo de transfecção CellPhect (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); estojo de transfecção para mamíferos, fosfato de cálcio e DEAE-dextrano, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); reagente de transfecção Lipofectamine™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); estojo de transfecção ExGen 500 (Fermentas, Inc., Hanover, MD), e estojos de transfecção SuperFect Effectene (Qiagen, Inc., Valência, CA).

De acordo com outro aspecto desta variante, utiliza-se um método fisicamente mediado para introduzir uma molécula 198 de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrídeo numa célula. Como reagentes fisicos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, electroporação, biolístico e micro-injecção. As técnicas biolisticas e de micro-injecção perfuram a parede celular para introduzir a molécula de ácido nucleico na célula, ver, v.g., Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); e John 0'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004). A electroporação, também designada por electro-permeabilização, utiliza impulsos eléctricos curtos de alta voltagem para criar poros temporários na membrana através da qual a molécula de ácido nucleicos penetra, podendo ser utilizado eficazmente para transfecções estáveis e transientes para todos os tipos de células, ver, v.g., M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); e Oliver Greschet al. , New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004) .

De acordo com outro aspecto desta variante, utiliza-se um método mediado por vírus, designado por transdução, para introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrídeo numa célula. Em métodos mediados por vírus de transdução transiente, o processo pelo qual as partículas virais infectam e se replicam na célula hospedeira foi manipulado para assim se utilizar este mecanismo para introduzir uma molécula de ácido 199 nucleico na célula. Foram já desenvolvidos métodos mediados por vírus para diversos vírus, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, retrovírus, adenovírus, adenovírus associados, vírus do herpes simplex, picornavírus, alfavírus e baculovírus, ver, v.g., Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004) ; e Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al., Adenovírus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated virai vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovírus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al. Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Buli. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); e A. Huser & C. Hofmann, Baculovírus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003) . 200

Os adenovírus, os quais são vírus de ADN de dupla cadeia e sem invólucro, são muitas vezes seleccionados para a transdução de células de mamíferos, uma vez que os adenovírus suportam moléculas de ácido nucleico relativamente grandes com cerca de 36 kD, são produzidos são produzidos com um elevado título e podem infectar eficazmente diversas células, divisíveis ou não divisíveis, ver, v.g., Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); e Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovírus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001) . A transdução utilizando um sistema com base adrenoviral não suporta uma expressão prolongada de proteínas, uma vez que a molécula de ácido nucleico e transportada de um epissoma no núcleo da célula, em vez de ser integrada no cromossoma da célula hospedeira. Os sistemas de vectores adenovirais e os protocolos específicos da sua utilização encontram-se descritos em, v.g., sistema de expressão adenoviral ViraPower™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) e no manual de instruções 25-0543, versão A do sistema de expressão adenoviral ViraPower™, Invitrogen, Inc. (15 de Jul. de 2002); e sistema de vectores adenovirais AdEasy™ (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) e no manual de instruções 064004f do sistema de vectores adenovirais AdEasy™, Stratagene, Inc.. O transporte de moléculas de ácido nucleico também pode utilizar ADN de retrovírus de cadeia simples, tais como, v.g., onco-retrovírus e lentivírus. A transdução mediada por retrovírus produz muitas vezes eficácias de transdução próximas de 100%, pode controlar facilmente o 201 número de cópias pró-virais variando a multiplicidade de infecção (MOI) e pode ser utilizada para a transdução transiente ou estável de células, ver, v.g., Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol, 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Félix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animais, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); e Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004) . As partículas retrovirais consistem num genoma de ARN empacotado numa cápside proteica, envolvida por um invólucro lipídico. O retrovírus infecta uma célula hospedeira, injectando o seu ARN no citoplasma em conjunto com a enzima de transcriptase inversa. A matriz de ARN é então transcrita inversamente num ADNc linear de cadeia dupla que se replica por meio da integração no genoma da célula hospedeira. As partículas virais espalham-se verticalmente (a partir da célula parente para células filhas através do pró-vírus) e também horizontalmente (a partir de célula para célula por meio de virões). Esta estratégia de replicação permite que a expressão persista durante um período longo, uma vez que as moléculas de ácido nucleico relevantes são integradas de um modo estável num cromossoma da célula hospedeira, permitindo assim a expressão durante períodos longos da proteína. Por exemplo, estudos animais demonstraram que vectores lentivirais injectados em diversos tecidos produziram uma expressão contínua de proteínas durante um 202 período superior a 1 ano, ver, v.g.. Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272 (5259) Science 263-267 (1996). Os sistemas de vectores obtidos a partir de onco-retrovírus, tais como, v.g., o vírus de leucemia de murino de Moloney (MoMLV), são amplamente utilizados e infectam diversos tipos diferentes de células não divisíveis. Os lentivirus também podem infectar vários tipos diferentes de células, incluindo células divisíveis e não divisíveis e possuem proteínas complexas de invólucro, o que permite um encaminhamento celular bastante específico.

Os sistemas de vectores retrovirais e os protocolos específicos para a sua utilização encontram-se descritos por, v.g., Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters, Patente de invenção norte-americana n° 5 464 758 (7 de Nov. de 1995) e Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression, patente de invenção norte-americana n° 5 814 618 (29 de Sep. de 1998), David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same, patente de invenção norte-americana n° 5 514 578 (7 de Maio de 1996) e David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, patente de invenção norte-americana n° 6 245 531 (12 de Jun. de 2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations, patente de invenção norte-americana n° 5 364 791 (15 de Nov. de 1994), Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for 203 gene therapy, patente de invenção norte-americana n° 5 874 534 (23 de Fev. de 1999) e Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, patente de invenção norte-americana n° 5 935 934 (10 de Ago. de 1999). Além do mais, tais sistemas de transporte virai podem ser preparados por métodos convencionais, os quais se encontram comercialmente disponíveis, ver, v.g., BD™ Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Paio Alto, CA) e BD™ Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems, manual do utilizador, PT3001-1. BD Biosciences Clonetech, (14 de Mar. de 2003), GeneSwitch™ System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) e GeneSwitch™ System A Mifepristone-Regulated Expression System for Mammalian Cells, versão D, 25-0313, Invitrogen, Inc. (4 de Nov. de 2002); ViraPower™ Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) e ViraPower™ Lentiviral Expression System, manual de instruções 25-0501 versão E, Invitrogen, Inc. (8 de Dez. de 2003) ; e Complete Control®7 Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) e Complete Control® Retroviral Inducible Mammalian Expression System, manual de instruções, 064005e.

Conforme referido antes, um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva pode ser introduzido numa célula. Prevê-se que seja possível utilizar quaisquer métodos, utilizando um agente transportador, para introduzir um substrato de toxina de clostrídeo numa população celular. Tal como aqui utilizado, o termo "agente transportador" designa qualquer molécula que permita ou potencie a internalização de ligar covalentemente, ligar não covalentemente ou associar de um 204 qualquer outro modo um substrato de toxina de clostrídeo a uma célula. Assim, o termo "agente transportador" compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequenas, moléculas de ácido nucleico, lipossomas, lípidos, vírus, retrovírus e células que, mas sem que isso constitua qualquer limitação, transportem um substrato ligado covalentemente ou não covalentemente até à membrana celular, citoplasma celular ou núcleo. Faz-se ainda observar que o termo "agente transportador" compreende moléculas que são internalizadas por qualquer mecanismo, incluindo agentes transportadores que actuam através de endocitose mediada por receptores e aqueles que são independentes da endocitose mediada por receptores.

Também se prevê que qualquer um ou todos os métodos úteis para a introdução de um substrato de toxina de clostrídeo com um agente transportador numa população celular podem ser úteis, desde que tal método introduza um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva pelo menos em 50% das células de uma determinada população celular. Assim, há aspectos desta variante que podem compreender uma população celular em que, v.g.f pelo menos 90% de uma determinada população celular contém um substrato de toxina de clostrídeo, pelo menos 80% de uma determinada população celular contém um substrato de toxina de clostrídeo, pelo menos 70% de uma determinada população celular contém um substrato de toxina de clostrídeo, pelo menos 60% de uma determinada população celular contém um substrato de toxina de clostrídeo, pelo menos 50% de uma determinada população celular contém um substrato de toxina de clostrídeo. 205

Também se prevê que qualquer um ou todos os métodos úteis para a introdução de um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva ligado a um agente transportador possam ser úteis, incluindo os métodos que ligam covalentemente o agente transportador ao substrato e os métodos que ligam não covalentemente o agente transportador ao substrato. Os métodos de ligação covalente que ligam um agente transportador a um substrato de toxina de clostrídeo podem incluir conjugação química e proteínas de fusão geneticamente produzidas. De acordo com um método não limitativo, um polinucleótido, tal como, v.g., um plasmídeo ou um oligonucleótido, é ligado a um substrato de toxina de clostrídeo por meio de química de conjugação e é introduzido numa célula, utilizando um método útil para a introdução de uma molécula de ácido nucleico numa população celular, conforme descrito na presente memória descritiva. De acordo com outro método não limitativo, um lípido, tal como, v.g., um lipossoma catiónico, é ligado a um substrato de toxina de clostrídeo por meio de química de conjugação e é introduzido numa célula, utilizando um método útil para a introdução de uma molécula de ácido nucleico numa população celular, conforme descrito na presente memória descritiva. Ainda de acordo com outro método não limitativo, um péptido, é ligado a um substrato de toxina de clostrídeo por meio de química de conjugação e é introduzido numa célula, utilizando um método de transporte de proteínas a seguir descrito. Ainda de acordo com outro método não limitativo, um péptido é ligado a um substrato de toxina de clostrídeo através da produção de uma molécula de ácido nucleico que codifica o agente transportador do péptido e o substrato possui uma 206 proteína de fusão funcionalmente ligada, sendo esta proteína de fusão introduzida na células utilizando um método de transporte de proteínas a seguir descrito.

De acordo com um aspecto da presente invenção, um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva pode ser introduzido numa célula utilizando um agente transportador peptidico para produzir uma células que contém transientemente um substrato de toxina de clostrídeo capaz de ser transportado para o plasma. Prevê-se que diversos agentes transportadores de péptidos possam ser ligados covalentemente a um substrato de toxina de clostrídeo, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o fragmento activo de dos péptidos de transdução de proteínas; o fragmento activo de péptidos capazes de penetrar em células; fosfopéptidos; o fragmento activo de péptidos de translocação de membrana; o fragmento activo de proteínas segregadas; o fragmento activo de péptidos de sinal de localização nuclear; péptidos predominantemente hidrofóbicos; péptidos predominantemente α-helicoidais, tais como, v.g., péptidos anfipáticos-helicoidais; péptidos predominantemente básicos, tais como, v.g., péptidos anfipáticos básicos; péptidos que contêm D-aminoácidos; péptidos curtos, tais como, v.g., KDEL; péptidos desnaturados ligados a um substrato de toxina de clostrídeo desnaturado ou enrugado, conforme descrito por, v.g., Steven F. Dowdy, Methods for Transducing Fusion Molecules, patente de invenção PCT publicada com o n° WO 99/55899 (11 de Nov. de 1999) ; e Steven F. Dowdy, Novel Transduction Molecules and Methods for Using the Same, patente de invenção PCT publicada com o n° WO 00/62067 (19 de Oct. de 2000); e muitos outros 207 péptidos, peptidomiméticos desnaturados ou enrugados, modificados ou não modificados, que ocorrem naturalmente ou sintéticos, ou seus análogos.

De acordo com aspectos da presente invenção, prevê-se que possam ser úteis quaisquer ou todos os comprimentos de péptidos de um agente transportador. Assim, de acordo com aspectos desta variante, um agente transportador útil para a introdução de um substrato de toxina de clostrideo descrito na presente memória descritiva numa célula pode ser um péptido ou um peptidomimético que possui um comprimento inferior a 10 resíduos, um comprimento inferior a 20 resíduos, um comprimento inferior a 30 resíduos, um comprimento inferior a 40 resíduos ou um comprimento inferior a 50 resíduos.

Como exemplos não limitativos, os agentes transportadores adequados para a introdução de um substrato de toxina de clostrideo descrito na presente memória descritiva numa célula compreendem polilisina; factor neurotrófico ciliar (CNTF) ou um seu fragmento activo; caveolina ou um seu fragmento activo; interleucina 1 (IL-1) ou um seu fragmento activo; tiorredoxina ou um seu fragmento activo; péptidos obtidos a partir do homeodomínio ou um seu fragmento activo, tais como, v.g., Antennapedia (Antp) ou um seu fragmento activo, penetratina 1 (SEO ID NO: 160), Engrailed 1 (Enl) ou um seu fragmento activo, Engrailed 2 (En2) ou um seu fragmento activo, Hoxb-4 ou um seu fragmento activo, Hoxa-5 ou um seu fragmento activo, Hoxc-8 ou um seu fragmento activo, e Knotted-1 (KN1) ou um seu fragmento activo; factor 1 do crescimento de fibroblastos (FGF-1) ou um seu fragmento activo; factor de crescimento de fibroblastos de Kaposi (kFGF) ou um seu 208 fragmento activo, tal como, v.g., AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 169); integrina 3 humana ou um seu fragmento activo, tal como, v.g., uma sequência de sinal hidrofóbica; uma sequência de localização nuclear (NLS) ou um seu fragmento activo, tal como, v.g., TPPKKKRKVEDP (SEO ID NO: 170); FGF-2 ou um seu fragmento activo; transportano ou um seu fragmento activo, tal como; v.g., GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 171); lactoferrina ou um seu fragmento activo; VP22 ou um seu fragmento activo; transactivador de tipo I do VIH (HIV TAT) ou um seu fragmento activo, tal como, v.g., (YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 168); ou uma proteína de choque térmico, tal como HSP70 ou um seu fragmento activo. Estes e outros agentes transportadores são bem conhecidos na especialidade e encontram-se descritos por, v.g., Steven R. Schwarze e Steven F. Dowdy, In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA, 21(2) Trends Pharmacol. Sei. 45-48 (2000); Dara J. Dunican e Patrick Doherty, Designing cell-permeant phosphopeptides to modulate intracellular signaling pathways, 60(1) Biopolymers 45-60 (2001); K. G.

Ford et al., Protein transduction: an alternative to genetic intervention? 8(1) Gene Ther. 1-4 (2001); Alain

Prochiantz, Messenger proteins: homeoproteins, TAT e and others, 12(4) Curr. Opin. Cell Biol. 400-406 (2000); J. J. Schwartz e S. Zhang, Peptide-mediated cellular delivery, 2(2) Curr. Opin. Mol. Ther. 162-167 (2000); e Steven F.

Dowdy, Protein Transduction System and Methods of Use Thereof, patente de invenção PCT publicada com o n° WO 00/34308 (15 de Jun. de 2000) . 209

De acordo com uma variante, um agente transportador pode ser uma homeoproteína ou um seu fragmento activo, tal como, v.g., um homeodomínio ou um seu fragmento activo. As homeoproteínas são proteínas hélice-volta-hélice que contêm um domínio de ligação ao ADN com cerca de 60 resíduos, designado por homeodomínio. Há diversas homeoproteínas, homeodomínios e seus fragmentos activos que podem ser agentes de transporte úteis de acordo com a invenção, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, Antennapedia, Engrailedl (Enl), Engrailed2 (En2), Hoxa-5, Hoxc-8, Hoxb-4 e Knotted-1 (KN1) . Como exemplo, o Enl e o Enl foram já expressos em células COS-7, nas quais foram, em primeiro lugar, segregadas e depois internalizadas por outras células, ver, v.g., Prochiantz, supra, (2000). Os agentes transportadores que utilizam péptidos obtidos a partir de homeodomínios e os métodos para a utilização de tais agentes encontram-se descritos por, v.g., Gérard Chassaing & Alain Prochiantz, Peptides which can be Used as Vectors for the Intracellular Addresing of Active Molecuels, patente de invenção norte-americana n° 6 080 724 (27 de Jun. de 2000). QUADRO 12 Péptidos obtidos a partir de penetratina úteis como agentes transportadores Péptido Sequência SEQ ID NO: 43-58 ROIKIWFONRRMKWKK 160 58-43 KKWKMRRNOFWIKIQR 161 43-58 RQIKIWF QNRRMKWKK 162 Pro5 0 RQIKIWFPNRRMKWKK 163 3Pro RQPKIWFPNRRMPWKK 164 210 QUADRO 12 Péptidos obtidos a partir de penetratina transportadores úteis como agentes Péptido Sequência SEQ ID NO: Met-Arg RQIKIWFQNMRRKWKK 165 7Arg RQIRIWFQNRRMRWRR 166 W/R RRWRRWWRRWWRRWRR 167

De acordo com um aspecto desta variante, uma composição de substrato da invenção compreende um agente transportador que é uma proteína de homeodomínio, Antennapedia, ou um seu fragmento activo. A Antennapedia é um membro da família homeoproteínas Drosophila de importante desenvolvimento, que realizam translocações à volta da membrana neuronal. A terceira hélice do homeodomínio de Antennapedia, o péptido com 16 resíduos "penetratina-1" (SEQ ID NO: 160), é internalizado em células vivas. A internalização ocorre tanto a 37°C como a 4°C, o que indica que o transporte não é mediado por um receptor nem é dependente de energia. Como agentes transportadores suplementares refere-se péptidos e peptidomiméticos associados, em termos de sequência, à penetratina-1, tal como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um dos péptidos apresentados no quadro 12 ou um outro péptido ou peptidomimético obtido a partir de penetratina, incluindo um péptido ou um peptidomimético retroinvertido ou D-aminoácido, ou um péptido ou peptidomimético associado mas não α-helicoidal, ver, v.g., Chassaing & Prochiantz, supra, (2000) . De acordo com uma variante, um tal péptido obtido a partir de penetratina 211 mantém os resíduos triptofano, fenilalanina e glutamina da penetratina-1 (SEQ ID NO: 160).

De acordo com outra variante, uma composição de substrato da invenção compreende um agente transportador que é uma proteína trans-activadora do VIH (TAT) ou um seu fragmento activo. Tal agente transportador pode incluir, por exemplo, um sequência idêntica ou semelhantes aos resíduos 47-57 ou 47-59 de HIV TAT, ver, v.g., Alan Frankel et al., Fusion Protein Comprising TAT-derived Transport Moiert, patente de invenção norte-americana n° 5 674 980 (7 de Out. de 1995); Alan Frankel et al., TAT-derived

Transport Polypeptide Conjugates, patente de invenção norte-americana n° 5 747 641 (5 de Maio de 1998); e Alan

Frankel et al., TAT-derived Transport Polypeptides and Fusion Proteins, patente de invenção norte-americana n° 5 804 604 (8 de Set. de 1998) . Como exemplo, as proteínas de

fusão que incluem os resíduos 47-57 de HIV TAT (Y GRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 168) atravessam a membrana plasmática, por exemplo, de células humanas e de murino in vitro e in vivo, ver, v.g., Schwartz e Zhang, supra, (2000); diversas proteínas com 15 a 120 KDa têm demonstrado reter a actividade biológica quando fundidas com um agente transportador de HIV TAT. Um agente transportador de HIV TAT pode ser carregado positivamente e pode actuar, por exemplo, de um modo independente de energia, receptor, transportador e endocitose para transportar um substrato de toxina de clostrideo ligado covalentemente, por exemplo, a 90% a 100% das células alvo. Os agentes transportadores que utilizam péptidos obtidos a partir de TAT e os métodos para a utilização de tais agentes encontram-se descritos por, 212 v.g.f Frankel et al., supra, (1995); Frankel et al., supra, (1998); e Frankel et al., supra, (1998).

De acordo com outra variante, uma composição de substrato da invenção também pode compreender como agente transportador uma proteina do vírus do herpes simplex VP22 ou um seu fragmento activo. De acordo com um aspecto desta variante, uma composição de substrato da invenção compreende uma proteína de HSV de tipo 1 (HSV-1) VP22 ou um seu fragmento activo. A HSV VP22, que é um factor de transcrição nuclear, pode atravessar a membrana de plasma através de endocitose não clássica e pode penetrar nas células independentemente das junções GAP e dos contactos físicos. Como proteína de fusão de diversos tipos diferentes de proteínas, a HSV VP22 pode ser absorvida por diferentes tipos de células, incluindo células diferenciadas terminalmente e pode transportar um substrato de toxina de clostrídeo ligado até, por exemplo, 90% a 100% de células em cultura. Os agentes transportadores que utilizam péptidos obtidos a partir de TAT e os métodos para a utilização de tais agentes encontram-se descritos por, v.g., Peter F. J. 0'Hare & Gillian D. Elliott, Transport Proteins and Their Uses, patente de invenção PCT publicada com o n° WO 97/05265 (13 de Fev. de 1997); Peter F. J. O'Hare & Gillian D. Elliott, Fusion Proteins for Intracellular and Intercellular Transport and Their Uses, patente de invenção PCT publicada com o n° WO 98/32866 (30 de Jul. de 1998); Peter F. J. 0'Hare et al., Use of Transport Proteins, patente de invenção norte-americana n° 6 734 167 (11 de Maio de 2004).

De acordo com outra variante, um agente transportador útil de acordo com a invenção corresponde a uma sequência 213 de sinal hidrofóbica ou é obtido a partir desta. Um tal agente transportador pode ser, por exemplo, o factor de crescimento de fibroblastos de Kaposi (kFGF) ou um seu fragmento activo, tal como AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 169) ; integrina β3 humana ou um seu fragmento activo; ou outro agente transportador hidrofóbico, tal como, um dos descritos por, v.g., Dunican & Doherty, supra, (2001). Os agentes transportadores que utilizam péptidos obtidos a partir de sequências de sinal hidrofóbicas e os métodos para a sua utilização encontram-se descritos por, v.g., Yao-Zhong Lin & Jack J. Hawiger, Method for importing biologically active molecules into cells, patente de invenção norte-americana n° 5 807 746 (15 de Set. de 1998); Yao-Zhong Lin & Jack J. Hawiger, Method for importing biologically active molecules into cells, patente de invenção norte-americana n° 6 043 339 (28 de Mar. de 2000); Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, patente de invenção norte-americana n° 6 248 558 (19 de Jun. de 2001); Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, patente de invenção norte-americana n° 6 432 680 (13 de Ago. de 2002); Jack J. Hawiger et al., Method for importing biologically active molecules into cells, patente de invenção norte-americana n° 6 495 518 (17 de Dez. de 2002); e Yao-Zhong Lin et al.,

Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, patente de invenção norte-americana n° 6 780 843 (24 de Ago. de 2004).

De acordo com outra variante, um agente transportador útil na invenção também pode ser uma sequência sintética 214 que partilhe uma ou mais caracterí sticas de um agente transportador que ocorre naturalmente, tal como, v.g., um domínio de transdução de proteínas (PTD). Tal agente transportador inclui, mas sem que isso constitua qualquer limitação, oligómeros de L- e D-arginina, por exemplo, 9-meros de L- ou D-arginina e peptóides associados, ver, v.g., Jonathan B. Rothbard & Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, patente de invenção norte-americana n° 6 306 993 (23 de Out. de 2001); e Jonathan B. Rothbard & Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, patente de invenção norte-americana n° 6 495 663 (17 de Dez. de 2002) . Tais agentes transportadores incluem ainda péptidos e peptidomiméticos básicos; péptidos e peptidomiméticos α-helicoidais básicos; e péptidos e peptidomiméticos com um alinhamento optimizado de arginina ou um carácter α-helicoidal optimizado, comparativamente com um domínio de transdução de proteínas que ocorre naturalmente, tal como os resíduos 47-57 de HIV TAT, ver, v.g., Rothbard & Wender, supra, (2001); e Rothbard & Wender, supra, (2002) . É evidente para um especialista na matéria que estes e outros agentes transportadores, que ocorrem naturalmente ou sintéticos, podem ser úteis nas composições de substrato de acordo com a invenção.

De acordo com outra variante, um conjugado de proteína constituído por um anticorpo dirigido ao receptor na membrana de plasma e um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva podem ser introduzidos numa célula. OS agentes transportadores que utilizam anticorpos e os métodos de utilização de tais 215 agentes encontram-se descritos por, v.g., Pamela B. Davis et al., Fusion proteins for protein delivery, patente de invenção norte-americana n° 6 287 817 (11 de Set. de 2001) .

Um agente transportador útil de acordo com a invenção também pode ser um agente que activa ou aumenta a captação celular de um substrato de toxina de clostrideo associado de um modo não covalente. De acordo com uma variante, um tal agente transportador é um péptido que contém dois domínios independentes: um domínio hidrofóbico e um domínio hidrofílico. De acordo com outra variante, um tal agente transportador é um péptido MPG, o qual é um péptido obtido a partir da sequência de localização nuclear (NLS) do atg T largo SV40 e do domínio de fusão de péptido de HIV-1 gp41, ver, v.g., Virginie Escriou et al., NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus, 55(2) Adv. Drug Deliv. Rev. 295-306 (2003). De acordo com outra variante, um tal agente transportador é um péptido MPG que possui a sequência de aminoácidos GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SEQ ID NO: 172) . De acordo com uma outra variante, um tal agente transportador é um péptido anfipático, tal como Pep-1. Estes agentes transportadores e agentes associados que podem actuar na ausência de uma ligação covalente e os métodos de utilização de tais agentes encontram-se descritos por, v.g., Gilles Divita et al., Peptide-mediated Transfection Agents and Methods of Use, patente de invenção norte-americana n° 6 841 535 (11 de Jan. de 2005); Philip L Felgner e Olivier Zelphati, Intracellular Protein Delivery Compositions and Methods of Use, patente de invenção norte-americana publicada com o n° 2003/0008813; e Michael Karas Intracellular Delivery of Small Molecules, Proteins and Nucleic Acids, patente de invenção norte-americana 216 publicada com o n° 2004/0209797 (21 de Out. de 2004) . Tais agentes transportadores de péptidos podem ser preparados e utilizados de acordo com métodos convencionais e encontram-se comercialmente disponíveis, ver, v.g. Chaiot™ Reagent (Active Motif, Carisbad, CA) ; BioPORTER® Reagent (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego. CA), BioTrek™ 'Protein Delivery Reagent' (Stratagene, La Jolla, CA) , e Pro-Ject™ 'Protein Transfection Reagent' (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL).

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona construções de expressão que permitem a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva. Tais construções de expressão compreendem uma grelha de leitura aberta que codifica um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva, ligada funcionalmente a sequências de controlo a partir de um vector de expressão útil para expressar o substrato de toxina de clostrídeo numa célula. 0 termo "ligado funcionalmente", tal como aqui utilizado, designa um qualquer dos diversos métodos de clonagem que permitem a ligação de uma molécula de ácido nucleico descrita na presente memória descritiva num vector de expressão, de um modo tal que um péptido codificado pela composição é expresso quando introduzido na célula. Podem ser necessárias técnicas de biologia molecular bem conhecidas para preparar uma construção de expressão descrita na presente memória descritiva, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, procedimentos envolvendo reacções de amplificação de enzimas de restrição por reacção de cadeia de polimerase (PCR), electroforese em 217 gel de agarose, ligação de ácidos nucleicos, transformação bacteriana, purificação de ácidos nucleicos, sequenciação de ácidos nucleicos, os quais são procedimentos habituais que são do conhecimento dos especialistas na matéria ou dos ensinamentos aqui descritos. Exemplos não limitativos de protocolos específicos necessários para a preparação de uma construção de expressão encontram-se descritos na obra, v.g., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); e CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004), os quais se consideram aqui incorporados por referência. Estes protocolos são procedimentos habituais conhecidos pelos especialistas na matéria ou a partir dos ensinamentos aqui apresentados. É possível utilizar diversos vectores de expressão para expressar uma grelha de leitura aberta que codifica um substrato de toxina de clostrídeo, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, vectores de expressão virai, vectores de expressão procariótica e vectores de expressão eucariótica, incluindo vectores de expressão de leveduras, de insectos e de mamíferos, sendo geralmente equivalentes aos vectores de expressão aqui descritos nos exemplos 4-6 e 8-14. Exemplos não limitativos de vectores de expressão e também reagentes e condições conhecidos para a preparação e utilização de uma construção de expressão são disponibilizados por fabricantes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, BD Biosciences-Clontech, Paio Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valência, CA; e Stratagene, La Jolla, CA. A selecção, a preparação e a 218 utilização de um vector de expressão adequado são procedimentos habituais conhecidos pelos especialistas na matéria ou a partir dos ensinamentos aqui apresentados.

Prevê-se que há diversos sistemas de expressão que podem ser úteis para as composições de construções de expressão descritos na presente memória descritiva. Um sistema de expressão compreende sistemas baseados em células e sistemas de expressão isentos de células. Como sistemas baseados em células refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, sistemas de expressão virai, sistemas de expressão procariótica, sistemas de expressão de leveduras, sistemas de expressão de baculovírus, sistemas de expressão de insectos e sistemas de expressão de mamíferos. Como sistemas isentos de células refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, extractos de gérmen de trigo, extractos de reticulócitos de coelho e extractos de E. coli. A expressão utilizando um sistema de expressão pode incluir diversas características, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, expressão indutível, expressão não indutível, expressão constitutiva, expressão mediada por vírus, expressão integrada estável e expressão transiente. Os sistemas de expressão que incluem vectores, reagentes, condições e células bem caracterizados encontram-se facilmente disponíveis a partir de fabricantes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Paio Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valência, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; e Stratagene, La Jolla, CA. Exemplos não limitativos sobre a selecção e utilização de sistemas heterólogos de expressão 219 adequados encontram-se descritos nas obras, v.g., PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins e B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); e Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001), os quais se consideram aqui incorporados por referência. Estes protocolos e procedimentos convencionais são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e a partir dos ensinamentos aqui apresentados.

Uma construção de expressão que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um substrato de toxina de clostrideo descrito na presente memória descritiva podem ser funcionalmente ligada a diversos elementos reguladores que podem modular de um modo positivo ou negativo, directa ou indirectamente, a expressão de uma molécula de ácido nucleico, tal como, v.g., promotores e potenciadores constitutivos, específicos de tecidos, indutíveis ou sintéticos. Como exemplos não limitativos de elementos reguladores constitutivos refere-se, v.g., o citomegalovírus (CMV), a timidina-cinase do vírus do herpes simplex (HSV TK) , vírus de símios 40 (SV40), repetição do terminal longo 5' (LTR), factor-ΐα de alongamento (EF-Ια) e elementos reguladores de polibiquitina (UbC). Como exemplos não limitativos de elementos reguladores indutíveis úteis de acordo com aspectos da presente invenção refere-se, v.g., elementos reguladores indutíveis químicos, tais como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, regulados por álcoois, regulados por tetracielina, regulados por esteróides, regulados por metais regulados por patogénese; 220 e elementos reguladores indutíveis físicos, tais como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, regulados por temperatura ou regulados por luz. Tais elementos reguladores indutíveis podem ser preparados e utilizados por métodos convencionais e encontram-se comercialmente disponíveis, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, elementos indutíveis de tetraciclina e elementos repressivos de tetraciclina, tais como, v.g., Tet-On™ e Tet-Off™ (BD Biosciences-Clontech, Paio Alto, CA) e T-REx™ (expressão regulada por tetraciclina) e sistemas Flp-In™ T-REx™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); elementos reguladores indutíveis de ecdisona, tais como, v.g., o 'Complete Control® Inducible Mammalian Expression System' (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); elementos reguladores indutíveis de isopropil-p-D-galactopiranósido (IPTG), tais como, v.g., o 'LacSwitch® 11 Inducible Mammalian Expression System' (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); e elementos reguladores indutíveis de esteróides, tais como, v.g., o sistema indutível de receptor de progesterona quimérica, GeneSwitch™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). É evidente para um especialista na matéria que estes e diversos outros sistemas reguladores constitutivos e indutíveis são disponibilizados comercialmente ou são bem conhecidos na especialidade e podem ser úteis na invenção para controlar a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifique um substrato de toxina de clostrídeo.

De acordo com uma variante, uma molécula de ácido nucleico que codifica o substrato de toxina de clostrídeo pode estar facultativamente ligada a um elemento regulador, tal como um elemento regulador constitutivo. 221

De acordo com outra variante, uma molécula de ácido nucleico que codifica o substrato de toxina de clostrideo pode estar facultativamente ligada a um elemento regulador, tal como um elemento regulador indutivel. De acordo com um aspecto desta variante, a expressão da molécula de ácido nucleico é induzida utilizando, v.g., uma tetraciclina indutivel, uma ecdisona indutivel ou um esteróide indutivel.

De acordo com outros aspectos, a invenção proporciona métodos para determinar a actividade toxina de clostrideo, os quais consistem em (a) fazer contactar com uma amostra uma célula que compreende (1) um substrato de toxina de clostrideo associado à membrana que compreende (i) um primeiro membro de um par de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET); e (ii) uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo, incluindo um local de clivagem; e (2) um segundo membro do par FRET associado à membrana, em que a célula é capaz de provocar uma intoxicação com toxina de clostrideo; em que o par FRET contém um aceitador que possui um espectro de absorvância que se sobrepõe ao espectro de emissão de um fluoróforo dador; e em que, sob condições adequadas, a transferência de energia de ressonância por fluorescência é exibida entre o primeiro e o segundo membros do par FRET; (b) excitar o fluoróforo dador; e (c) determinar a transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula contacta, relativamente a uma célula de controlo, em que a diferença na transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula contactada, quando comparada com a célula de controlo, constitui uma indicação da actividade da toxina de clostrideo. 222 É ainda aqui proporcionado um método para determinar a actividade de BoNT/A, o qual consiste em (a) fazer contactar com uma amostra uma célula neuronal que compreende (1) uma molécula de ácido nucleico, estavelmente expressa, que codifica um substrato de BoNT/A associado à membrana que compreende (i) uma proteína fluorescente; e (ii) uma sequência de reconhecimento de BoNT/A, incluindo um local de clivaqem; e (2) um corante lipofílico associado à membrana que possui um que possui um espectro de absorvância que se sobrepõe ao espectro de emissão da proteína fluorescente; em que a célula neuronal é capaz de provocar uma intoxicação com BoNT/A; e em que, sob as condições adequadas, a transferência de energia de ressonância por fluorescência é exibida entre a proteína fluorescente e o corante lipofílico; (b) excitar a proteína fluorescente; e (c) determinar a transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula neuronal contactada, relativamente a uma célula de controlo, em que a diferença na transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula contactada, quando comparada com a célula de controlo, constitui uma indicação da actividade de BoNT/A. De acordo com uma variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/A utiliza-se uma célula neuronal que é uma célula Neuro-2A. De acordo com outra variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/A utiliza-se um substrato de BoNT/A que contém, em parte, uma proteína fluorescente verde. De acordo com outra variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/utiliza-se um substrato de BoNT/A que compreende, em parte, uma sequência de reconhecimento de 223

BoNT/A que inclui os resíduos 1 a 206 da SEQ ID NO: 90. De acordo com outra variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/A utiliza-se DilCis(3) como corante lipofílico. A presente invenção proporciona ainda um método para determinar a actividade de BoNT/E, o qual consiste em (a) fazer contactar com uma amostra uma célula neuronal que compreende (1) uma molécula de ácido nucleico, estavelmente expressa, que codifica um substrato de BoNT/E associado à membrana que compreende (i) uma proteína fluorescente; e (ii) uma sequência de reconhecimento de BoNT/E, incluindo um local de clivagem; e (2) um corante lipofílico associado à membrana que possui um que possui um espectro de absorvância que se sobrepõe ao espectro de emissão da proteína fluorescente; em que a célula neuronal é capaz de provocar uma intoxicação com BoNT/E; e em que, sob as condições adequadas, a transferência de energia de ressonância por fluorescência é exibida entre a proteína fluorescente e o corante lipofílico; (b) excitar a proteína fluorescente; e (c) determinar a transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula neuronal contactada, relativamente a uma célula de controlo, em que a diferença na transferência de energia de ressonância por fluorescência da célula contactada, quando comparada com a célula de controlo, constitui uma indicação da actividade de BoNT/E. De acordo com uma variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/E utiliza-se uma célula neuronal que é uma célula SK-N-DZ. De acordo com outra variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/E utiliza-se uma célula neuronal que é uma célula SH-SYSY. De acordo com 224 outra variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/E utiliza-se um substrato de BoNT/E que contém, em parte, uma proteína fluorescente verde. De acordo com outra variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/E utiliza-se um substrato de BoNT/E que contém, em parte, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E que inclui os resíduos 1 a 206 da SEQ ID NO: 90. De acordo com outra variante, para a prática de um método da invenção para determinar a actividade de BoNT/E utiliza-se DilCis(3) como corante lipofilico.

Os métodos descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, um substrato de toxina de clostrídeo. Prevê-se que todos os substratos de toxina de clostrídeo descritos na presente memória descritiva possam ser utilizados para a prática dos presentes métodos. Assim, aspectos desta variante incluem moléculas de ácido nucleicos, tais como, v.g., ADN e ARN, que codificam um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva e uma molécula de péptido ou peptidomimético de um substrato de toxina de clostrídeo descrito na presente memória descritiva. Outros aspectos desta variante incluem, em parte, uma sequência de reconhecimento da t oxina de clostrídeo, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/A, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/B, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/Cl, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/D, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/E, uma sequência de reconhecimento da toxina BoNT/F, uma sequência de 225 reconhecimento da toxina BoNT/G e uma sequência de reconhecimento da toxina TeNT. Outros aspectos desta variante incluem, em parte, um domínio de endereçamento para a membrana, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os domínios de endereçamento para a membrana, que ocorrem naturalmente, presentes em SNAP-25, variantes SNAP-25 MTD que ocorrem naturalmente e variantes SNAP-25 MTD que nao ocorrem naturalmente, e peptidomiméticos de SNAP-25 MTD; e domínios de endereçamento para a membrana que ocorrem naturalmente presentes em sintaxina, em variantes de sintaxina MTD que ocorrem naturalmente e em variantes de sintaxina MTD que não ocorrem naturalmente e peptidomiméticos de sintaxina MTD.

Os métodos descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, um primeiro membro de um par FRET, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, proteínas fluorescentes de tipo selvaqem, variantes que ocorrem naturalmente, variantes qeneticamente manipuladas, fragmentos activos de péptidos obtidos a partir de proteínas fluorescentes de Aequorea, proteínas fluorescentes de Anemonia, proteínas fluorescentes de Anthozoa, proteínas fluorescentes de Discosoma, proteínas fluorescentes de Entacmeae, proteínas fluorescentes de Heteractis, proteínas fluorescentes de Montastrea, proteínas fluorescentes de Renilla, proteínas fluorescentes de Zoanthus e proteínas de ligação a fluoróforos. Como exemplos não limitativos de proteínas fluorescentes refere-se, v.g., EBFP, ECFP, AmCyan, AcGFP, ZsGreen, Vitality® hrGFP, EGFP, Monster Green® hMGFP, EYFP, ZsYellow, DsRed-Express, DsRed2, DsRed, AsRed2 e HcRedl. Como exemplos não 226 limitativos de proteínas fluorescentes refere-se, v.g., um péptido de tetracisteína, uma AGT e uma desalogenase.

Os métodos descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, um segundo membro de um par FRET que compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um corante de carbocianina de cadeia longa, um corante aminoestirilo, um corante estirilo anfifílico, um catião lipofílico ou um corante FM. Há diversos corantes lipofilicos que são úteis na presente invenção, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, FAST DiO, DiOCisO), DÍOCi5(3), SP-DiOCi8 (3) , 4-DÍ-16-ASP, 4-Di-lO-ASP, FAST DiA, DilC18 (3) , DilC16(3), DilCi2(3), FAST Dil, A9-Dil, FM® Dil, CellTracker CM-Dil, DilCis (3)-DS, SP-DilC18 (3) , Br2-DilCis (3) , 5,5' -Ph2-DilC18 (3) , DilCis (5), DilCis (5)-DS, DilCis (7), FM® 1-43, FM® 1-84, FM® 2-10, FM® 4-64, FM® 5-95, RH 414, DiSBAC2 (3) , JC-1, CCCP, octadecil-rodamina B; 5-dodecanoí1-aminofluoresceína, 5-hexadecanoí1-amino-fluoresceína, 5-octadecanoíl-aminofluoresceína e o éster octadecílico de fluoresceína, 4-heptadecil-7-hidroxicoumarina, DPH, TMA-DPH, TMAP-DPH, ácido propiónico de, BODIPY 493/503, BODIPY 505/515, BODIPY 665/676, BODIPY FL C5-ceramida, éster metílico de CellTrace BODIPY TR, corante fenoxazina vermelho do Nilo, 1,3-bis-(1-pireno)-propano, ácido dapoxil-sulfónico, prodan, laurdan, acrilodan, badan, 1,8-ANS, 2,6-ANS, 2,6-TNS, bis-ANS, DCVJ e MBDS.

Os métodos descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, uma célula capaz de provocar intoxicação com toxina de clostrídeo. Prevê-se que todas as células descritas na presente memória descritiva possam ser utilizadas para a prática dos presentes métodos. Assim, há 227 aspectos desta variante que incluem células, tais como, v.g., células que expressam um ou vários receptores de toxina de clostrideo, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um receptor de toxina de clostrideo de afinidade reduzida, um receptor de toxina de clostrideo de afinidade elevada, um receptor de toxina de clostrideo endógeno, um receptor de toxina de clostrideo exógeno, um receptor de BoNT/A, um receptor de BoNT/B, um receptor de BoNT/Cl, um receptor de BoNT/D, um receptor de BoNT/E, um receptor de BoNT/F, um receptor de BoNT/G e um receptor de TeNT. Outros aspectos desta variante incluem células, tais como, v.g., células neuronais que compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células neuronais primárias; células neuronais imortalizadas ou estabelecidas; células neuronais transformadas; células tumorais neuronais; células neuronais transfectadas estável e transientemente que expressam um receptor de toxina de clostrideo, as quais incluem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células neuronais de mamíferos, de murinos, de ratos, de primatas e de humanos. Outros aspectos desta variante incluem células, tais como as obtidas a partir de, v.g., linhagens celulares neuronais incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, linhagens celulares de neuroblastoma, linhagens celulares neuronais híbridas, linhagens celulares da medula espinal, linhagens celulares do sistema nervoso central, linhagens celulares do córtex cerebral, linhagens celulares de gânglios da raiz dorsal, linhagens celulares do hipocampo e linhagens celulares de feocromocitoma. Como exemplos não limitativos de linhagens celulares neuronais refere-se, v.g., as linhagens celulares de neuroblastoma BE(2)-C, 228 BE (2)-Ml7, C1300, CHP-212, CHP-126, IMR 32, KELLY, LA-N-2, MC-IXC, MHH-NB-11, N18Tg2, N1E-115, N4TG3, Neuro-2A, NB41A3, NS20Y, SH-SYSY, SIMA, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-MC e SK-N-SH; as linhagens celulares híbridas neuroblastoma/ /glioma N18, NG108-15 e NG115-401L; as linhagens celulares híbridas neuroblastoma/neurónio motor NSC-19 e NSC-32; as linhagens celulares híbridas neuroblastoma/neurónio de gânglios de raiz Fll, ND-C, ND-E, ND-U1, ND3, ND7/23, ND8/34, ND8/47, ND15 e ND27; as linhagens celulares híbridas de neuroblastoma/neurónio do hipocampo HN-33; as linhagens celulares da medula espinal TE 189.T e M4b; as linhagens celulares do córtex cerebral CNh, HCN-la e HCN-2; as linhagens celulares de gânglios da raiz dorsal G4b; as linhagens celulares do hipocampo HT-4, HT-22 e HN33; as linhagens celulares que expressam FGFR3 H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 e UTMC-2. De acordo com outros aspectos desta variante, uma célula que expressa FGFR3 pode ser, v.g., H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 UTMC-2, B9, TC, L6 e CFK2. Há outros aspectos desta variante que incluem célula, tais como, v.g., células não neuronais, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células não neuronais primárias; células não neuronais imortalizadas ou estabelecidas; células não neuronais transformadas; células tumorais não neuronais; células não neuronais transfectadas estável e transientemente que expressam um receptor de toxina de clostrídeo, as quais incluem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células não neuronais de mamíferos, de murinos, de ratos, de primatas e de humanos. Há outros aspectos desta variante que incluem células, tais 229 como, v.g., células não neuronais úteis em aspectos da invenção que compreendem ainda, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células da pituitária anterior; células adrenais, células pancreáticas, células do ovário, células do rim, tais como, v.g. , HEK293, células do estômago, células sanguíneas, células epiteliais, fibroblastos, células da tiróide, condrócitos, células musculares, hepatócitos, células glandulares e células implicadas na translocação dos transportadores de glicose (GLUT4). e de baculovirais

Os métodos descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, uma amostra. Tal como aqui utilizado, o termo "amostra" designa qualquer material biológico que contenha, ou que tenha potencial para conter, uma toxina de clostrideo activa. De acordo com um método descrito na presente memória descritiva é possivel testar diversas amostras, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, toxina de clostrideo purificada, parcialmente purificada ou não purificada; toxina recombinante com cadeia simples ou di-cadeia com uma sequência que ocorre, ou não, naturalmente; toxina de clostrideo recombinante com uma especificidade de protease modificada; toxina de clostrideo recombinante com uma especificidade celular alterada; toxina quimérica que contém elementos estruturais de múltiplas espécies ou subtipos de toxina de clostrideo; toxina de clostrideo a granel; um produto formulado de toxina de clostrideo, incluindo, v.g., produtos formulados de BoNT/A e BoNT/E; e alimentos; células ou lisados celulares impuros, fraccionados ou parcialmente purificados, por exemplo, manipulados para incluir um ácido nucleico recombinante que codifica uma toxina de clostrideo; lisados bacterianos, 230 leveduras; alimentos crus, cozinhados, parcialmente cozinhados ou processados; bebidas; rações para animais; amostras de solos; amostras de água; sedimentos de lagos; loções; cosméticos e formulações clínicas. Faz-se observar que o termo amostra compreende amostras de tecidos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, amostras de tecidos de mamíferos, amostras de tecido de gado, tal como amostras de tecido de ovelha, vaca, e porco; amostras de tecidos de primatas e amostras de tecidos de seres humanos. Tais amostras compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, amostras intestinais, tais como amostras intestinais de crianças e amostras de tecidos obtidas a partir de feridas. Como exemplos não limitativos, um método da invenção pode ser útil para determinar a presença ou a actividade de uma toxina de clostrideo em amostras de alimentos ou de bebidas; para testar uma amostra obtida a partir de um ser humano ou de um animal, por exemplo, exposto à toxina de clostrideo ou que apresente um ou vários sintomas de uma toxina de clostrideo; para monitorizar a actividade durante a produção e a purificação da toxina de clostrideo; ou para testar produtos formulados de toxina de clostrideo, tais como produtos farmacêuticos ou cosméticos.

De acordo com diversos métodos da invenção, a transferência de energia de ressonância da célula contactada é determinada por comparação com uma célula de controlo. Tal como aqui utilizado, o termo "célula de controlo" designa uma célula do mesmo tipo ou de um tipo semelhante ao da célula contactada, a qual é desenvolvida utilizando as mesmas condições, embora não tenha contactado com qualquer amostra ou tenha contactado com uma amostra 231 negativa definida ou com uma amostra positiva definida. É evidente para um especialista na matéria que há diversas células de controlo que são úteis nos métodos da invenção e que uma célula de controlo pode ser uma célula de controlo positivo ou uma célula de controlo negativo. Uma célula de controlo pode ser, por exemplo, uma célula de controlo negativo tal como uma célula idêntica ou semelhante que contém o mesmo, ou semelhante, substrato de toxina de clostrideo que se faz contactar com uma amostra negativa definida semelhante, da qual se sabe que não possui a toxina de clostrideo activa, ou a qual não foi contactada com qualquer amostra. Uma célula de controlo também pode ser, por exemplo, uma célula de controlo positivo, tal como uma célula que contém um ou ambos os produtos de clivagem que são obtidos a partir da proteólise do substrato de toxina de clostrideo no local de clivagem ou na célula que contém o mesmo substrato, ou um idêntico, em contacto com uma amostra positiva definida, que se sabe que inclui a toxina de clostrideo activa.

Os métodos descritos na presente memória descritiva incluem, em parte, determinar a actividade da toxina de clostrideo a partir de uma amostra, determinando a transferência de energia de ressonância por fluorescência de uma célula em contacto com uma amostra, comparativamente com a célula de controlo. Há diversos meios que podem ser úteis nos métodos da invenção para determinar a transferência de energia de ressonância por fluorescência de uma célula em contacto com uma amostra, relativamente a uma célula de controlo. De acordo com uma variante, determina-se a transferência de energia de ressonância por fluorescência por meio da detecção a intensidade 232 fluorescentes do aceitador da células contactada, em que uma diminuição na intensidade de fluorescência do aceitador da células contactada, comparativamente com a célula de controlo, constitui um indicador da actividade da toxina de clostrideo. De acordo com outra variante, a transferência de energia de ressonância por fluorescência é determinada por meio da detecção da intensidade de fluorescência do dador da células contactada, em que u aumento de intensidade da fluorescência do dador da célula contactada, comparativamente com a célula de controlo, constitui um indicador da actividade da toxina de clostrideo. Ainda de acordo com outra variante, a transferência de energia de ressonância por fluorescência é determinada por meio a detecção de um valor máximo emissão do aceitador e de um valor máximo de emissão do fluoróforo dador da célula contactada, em que o desvio no valor máximo de emissão desde um valor próximo do máximo e emissão do aceitador até um valor próximo do máximo de emissão do fluoróforo dador constitui um indicador da actividade da toxina de clostrideo. Ainda de acordo com outra variante, a transferência de energia de ressonância por fluorescência é determinada por meio da detecção da proporção entre as amplitudes de fluorescência perto do máximo de emissão do aceitador e as amplitudes de fluorescência perto do máximo de emissão do fluoróforo dador, em que uma diminuição na proporção na célula contactada, comparativamente com a células de controlo, constitui um indicador da actividade da toxina de clostrideo. Ainda de acordo com outra variante, a transferência de energia de ressonância por fluorescência é determinada por meio da detecção do período de vida do estado excitado do fluoróforo dador na célula 233 contactada, em que um aumento do período de vida do estado excitado do fluoróforo dador na célula contactada, comparativamente com a células de controlo, constitui um indicador de actividade da toxina de clostrídeo. A transferência de energia de ressonância por fluorescência e, assim, a actividade de toxina de clostrídeo, pode ser detectado por diversos meios, por exemplo, por meio da detecção de um aumento da intensidade de fluorescência do dador; uma diminuição de intensidade de fluorescência do aceitador; um desvio no valor máximo de emissão desde um valor próximo do máximo de emissão do aceitador até um valor próximo do máximo de emissão do fluoróforo dador; um aumento na proporção entre as amplitudes de fluorescência de um valor próximo do máximo de emissão do dador e as amplitudes de fluorescência de um valor próximo do máximo de emissão do aceitador de fluoróforo s; uma diminuição na proporção entre as amplitudes de fluorescência de um valor próximo do máximo de emissão do aceitador e as amplitudes de fluorescência de um valor próximo do máximo de emissão do dador de fluoróforo s; um aumento do tempo de vida do estado excitado do fluoróforo dador; ou uma diminuição do tempo de vida do estado excitado do fluoróforo aceitador. De acordo com aspectos desta variante, um aumento da intensidade de fluorescência do dador pode ser, v.g., pelo menos de duas vezes, pelo menos de três vezes, pelo menos de quatro vezes, pelo menos de cinco vezes, pelo menos de dez vezes, pelo menos de vinte vezes ou mais, relativamente à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo 234 comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. De acordo com outros aspectos desta variante, um aumento na intensidade de fluorescência do dador pode ser, v.g., no máximo de duas vezes, no máximo de três vezes, no máximo de quatro vezes, no máximo de cinco vezes, no máximo de dez vezes, no máximo de vinte vezes em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula, detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula, não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma células de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, uma diminuição na intensidade de fluorescência do aceitador pode ser, v.g., pelo menos de duas vezes, pelo menos de três vezes, pelo menos de quatro vezes, pelo menos de cinco vezes, pelo menos de dez vezes, pelo menos de vinte vezes ou mais, relativamente à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula, detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, uma diminuição na intensidade de fluorescência do aceitador pode ser, v.g., no máximo de duas vezes, no máximo de três vezes, no máximo de quatro vezes, no máximo de cinco vezes, no máximo de dez vezes, no máximo de vinte vezes em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo 235 comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo.

De acordo com outros aspectos desta variante, um desvio na emissão máxima desde próximo da emissão máxima do aceitador até próximo da emissão máxima do fluoróforo dador pode ser, v.g., pelo menos de duas vezes, pelo menos de três vezes, pelo menos de quatro vezes, pelo menos de cinco vezes, pelo menos de dez vezes, pelo menos de vinte vezes ou mais, relativamente à intensidade de fluorescência no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, um desvio na emissão máxima desde próximo da emissão máxima do aceitador até próximo da emissão máxima do fluoróforo dador pode ser, v.g., no máximo de duas vezes, no máximo de três vezes, no máximo de quatro vezes, no máximo de cinco vezes, no máximo de dez vezes, no máximo de vinte vezes em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo.

Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, uma diminuição na proporção entre as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do aceitador e as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do fluoróforo dador pode ser, v.g., pelo menos de duas vezes, 236 pelo menos de três vezes, pelo menos de quatro vezes, pelo menos de cinco vezes, pelo menos de dez vezes, pelo menos de vinte vezes ou mais, relativamente à intensidade de fluorescência no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g.r uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, uma diminuição na proporção entre as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do aceitador e as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do fluoróforo dador pode ser, v.g., no máximo de duas vezes, no máximo de três vezes, no máximo de quatro vezes, no máximo de cinco vezes, no máximo de dez vezes, no máximo de vinte vezes em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, um aumento na proporção entre as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do dador e as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do fluoróforo aceitador pode ser, v.g., pelo menos de duas vezes, pelo menos de três vezes, pelo menos de quatro vezes, pelo menos de cinco vezes, pelo menos de dez vezes, pelo menos de vinte vezes ou mais, relativamente à intensidade de fluorescência no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo 237 comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, um aumento na proporção entre as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do dador e as amplitudes de fluorescência junto à emissão máxima do fluoróforo aceitador pode ser, v.g., no máximo de duas vezes, no máximo de três vezes, no máximo de quatro vezes, no máximo de cinco vezes, no máximo de dez vezes, no máximo de vinte vezes em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante que não é colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo.

Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, um aumento do período de vida do estado excitado do fluoróforo dador pode ser, v.g., pelo menos de duas vezes, pelo menos de três vezes, pelo menos de quatro vezes, pelo menos de cinco vezes, pelo menos de dez vezes, pelo menos de vinte vezes ou mais, relativamente à intensidade de fluorescência no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colcada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, um aumento do período de vida do estado excitado do fluoróforo dador pode ser, v.g., no máximo de duas vezes, no máximo de três vezes, no máximo de quatro vezes, no máximo de cinco vezes, no máximo de dez vezes, no máximo de vinte vezes em relação à intensidade de 238 fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, uma diminuição do período de vida do estado excitado do fluoróforo aceitador pode ser, v.g., pelo menos de duas vezes, pelo menos de três vezes, pelo menos de quatro vezes, pelo menos de cinco vezes, pelo menos de dez vezes, pelo menos de vinte vezes ou mais, relativamente à intensidade de fluorescência no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo. Ainda de acordo com outros aspectos desta variante, uma diminuição do período de vida do estado excitado do fluoróforo aceitador pode ser, v.g., no máximo de duas vezes, no máximo de três vezes, no máximo de quatro vezes, no máximo de cinco vezes, no máximo de dez vezes, no máximo de vinte vezes em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e da mesma célula detectada num momento diferente, ou em relação à intensidade de fluorescência, no mesmo comprimento de onda e de uma célula semelhante não colocada em contacto com a amostra, tal como, v.g., uma célula de controlo.

Sabe-se que alterações na quantidade absoluta de substrato de toxina de clostrídeo na célula, na intensidade de excitação e na turvação ou outras absorvâncias de fundo no comprimento de onda de excitação afectam as intensidades 239 de fluorescência do dador e do fluoróforo aceitador praticamente em paralelo. Assim, faz-se observar que o rácio de intensidades de emissão é independente da quantidade absoluta de substrato, da intensidade de excitação e da turvação ou de outras absorvâncias de fundo, podendo esse rácio ser um indicador da actividade da toxina de clostrideo. De iqual modo, é evidente para um especialista na matéria que o período de vida do estado de excitação de um fluoróforo dador é independente da quantidade absoluta de substrato, da intensidade de excitação e da turvação ou de outras absorvâncias de fundo, e pode ser útil num método de acordo com a invenção. Faz-se observar que as intensidades de fluorescência e os períodos de vida do estado de excitação relevantes são detectados num comprimento de onda ou num intervalo de comprimentos de onda adequados. Como exemplo, no caso de se detectar intensidade de fluorescência do dador, então o comprimento de onda adequado é no valor de emissão máxima do fluoróforo dador ou num valor próximo deste, ou então é num intervalo de comprimentos de onda que compreende o valor de emissão máxima do fluoróforo dador ou num intervalo próximo deste. pelo menos em dois instantes

De acordo com uma variante, a actividade da toxina de clostrideo a partir de uma amostra é determinada por meio da detecção da intensidade de fluorescência. A detecção da intensidade de fluorescência pode ser realizada em ensaios de "tempo fixo" ou em ensaios de tempo contínuo, sendo possível efectuar as comparações utilizando valores de tempo diferentes obtidos a partir da mesma célula contactada ou em relação a uma célula de controlo. Assim, um aspecto desta variante inclui a detecção da intensidade de fluorescência, v.g., 240 diferentes, pelo menos em três instantes diferentes, pelo menos em quatro instantes diferentes, pelo menos em cinco instantes diferentes, pelo menos em dez instantes diferentes e pelo menos em 20 instantes diferentes. Outros aspectos desta variante incluem a detecção da intensidade de fluorescência em intervalos de tempo com uma diferença, v.g., não superior a 1 minuto entre si, não superior a 5 minutos entre si, não superior a 10 minutes entre si, não superior a 15 minutos entre si, não superior a 30 minutos entre si e não superior a 30 minutes entre si. Outros aspectos desta variante incluem a detecção da intensidade de fluorescência em intervalos de tempo com uma diferença, v.g., não inferior a 15 minutos entre si, não inferior a 30 minutos entre si, não inferior a 45 minutos entre si, não inferior a 60 minutos entre si, não inferior a 90 minutos entre si e não inferior a 120 minutos entre si. Há ainda outros aspectos desta variante que incluem a detecção da intensidade de fluorescência de um modo continuo ao longo do tempo, v.g., no máximo durante cerca de 5 minutos, no máximo durante cerca de 10 minutos, no máximo durante cerca de 15 minutos, no máximo durante cerca de 30 minutos, no máximo durante cerca de 45 minutos, no máximo durante cerca de 60 minutos, no máximo durante cerca de 90 minutos e no máximo durante cerca de 120 minutos. Há ainda outros aspectos desta variante que incluem a detecção da intensidade de fluorescência de um modo continuo ao longo do tempo durante, v.g., pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 90 minutos e pelo menos cerca de 120 minutos. 241

Faz-se observar que a intensidade de fluorescência pode ser detectada a partir de um instante individual ou a partir de vários instantes. Prevê-se que a comparação entre a intensidade de fluorescência detectada a partir da célula de contacto possa ser efectuada utilizando os valores obtidos a partir do mesmo instante, de instantes semelhantes ou a partir de instantes diferentes. Assim, um aspecto desta variante inclui as detecção da intensidade de fluorescência a partir da célula contactada e da célula de controlo, v.g.r pelo menos num instante diferente, pelo menos em dois instantes diferentes, pelos menos em três instantes diferentes, pelos menos em quatro instantes diferentes, pelos menos em cinco instantes diferentes, pelos menos em dez instantes diferentes e pelos menos em 20 instantes diferentes. Há outros aspectos desta variante que podem incluir a comparação entre a intensidade de fluorescência, detectada a partir da célula contactada, obtida a partir de um único instante e a intensidade de fluorescência, detectada a partir da célula de controlo, obtida, v.g., no mesmo instante, num instante semelhante, num instante posterior ao instante obtido para a célula contactada, no instante anterior ao instante obtido para a célula contactada, em diversos instantes posteriores ao instante obtido para a célula contactada, em diversos instantes anteriores ao instante obtido para a célula contactada e em diversos instantes posteriores e anteriores ao instante obtido para a célula contactada. Outros aspectos desta variante podem incluir uma comparação entre a intensidade de fluorescência, detectada a partir da célula contactada, obtido a partir de diversos instantes e a intensidade de fluorescência, detectada a partir da 242 célula de controlo, obtido, v.g., a partir de um único instante, no mesmo instante, num instante semelhante, num instante posterior ao instante obtido para a célula contactada, num instante anterior aos instante obtidos para a célula contactada, em diversos instantes posteriores aos instantes obtidos para a célula contactada, em diversos instantes anteriores aos instantes obtidos para a célula contactada e em diversos instantes posteriores e anteriores aos instantes obtidos para a célula contactada.

De acordo com outra variante, determina-se a actividade da toxina de clostrideo a partir de uma amostra por detecção do desvio na emissão máxima. A detecção do desvio na emissão máximo pode ser efectuada num ensaio de tempo fixo ou num ensaio de tempo continuo, em que as comparações podem ser efectuadas utilizando instantes diferentes recolhidos a partir da mesma célula contactada em relação a uma célula de controlo.

Assim, um aspecto desta variante compreende a detecção do desvio na emissão máxima, v.g., pelo menos em dois instantes diferentes, pelo menos em três instantes diferentes, pelo menos em quatro instantes diferentes, pelo menos em cinco instantes diferentes, pelo menos em dez instantes diferentes e pelo menos em 20 instantes diferentes. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do desvio na emissão máxima ao longo de intervalos de tempo, v. g ♦ t não superiores a 1 minuto entre si, nao superiores a 5 minutos entre si r não superiores a 10 minutos entre si, não superiores a 15 minutos entre si, não superiores a 30 minutos entre si e não superiores a 30 minutos entre si. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do desvio na emissão máxima ao longo de intervalos 243 de tempo, v.g., não inferiores a 15 minutos entre si, não inferiores a 30 minutos entre si, não inferiores a 45 minutos entre si, não inferiores a 60 minutos entre si, não inferiores a 90 minutos entre si e não inferiores a 120 minutos entre si. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do desvio na emissão máxima durante um tempo continuo, v.g., no máximo de cerca de 5 minutos, no máximo de cerca de 10 minutos, no máximo de cerca de 15 minutos, no máximo de cerca de 30 minutos, no máximo de cerca de 45 minutos, no máximo de cerca de 60 minutos, no máximo de cerca de 90 minutos e no máximo de cerca de 120 minutos. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do desvio na emissão máxima durante um tempo continuo, v.g., pelo menos de cerca de 15 minutos, pelo menos de cerca de 30 minutos, pelo menos de cerca de 45 minutos, pelo menos de cerca de 60 minutos, pelo menos de cerca de 90 minutos e pelo menos de cerca de 120 minutos. Faz-se observar que o desvio na emissão máxima não é normalmente um desvio completo mas apenas uma parte da intensidade de emissão irá ser desviada para um valor próximo da emissão máxima do fluoróforo dador.

Faz-se observar que o desvio na emissão máxima pode ser detectado num único instante ou em diversos instantes. Prevê-se que a comparação entre o desvio na emissão máxima detectado a partir da célula contactada e o desvio na emissão máxima detectada a partir da célula de controlo possa ser efectuada utilizando os valores obtidos para o mesmo instante, para instantes semelhantes ou para instantes diferentes. Assim, um aspecto desta variante inclui a detecção do desvio na emissão máxima a partir da uma célula contactada e da células de controlo, v.g., pelo 244 menos num instante diferente, pelo menos em dois instantes diferentes, pelo menos em três instantes diferentes, pelo menos em quatro instantes diferentes, pelo menos em cinco instantes diferentes, pelo menos em dez instantes diferentes e pelo menos em 20 instantes diferentes. Outros aspectos desta variante podem incluir uma comparação entre o desvio na emissão máxima detectado a partir da célula contactada num único instante e o desvio na emissão máxima detectada a partir da célula de controlo obtido, v.g., no mesmo instante, num instante semelhante, num instante posterior ao instante obtido para a célula contactada, num instante anterior ao instante obtido para a célula contactada, em vários instantes posteriores ao instante obtido para a célula contactada, em vários instantes anteriores ao instante obtido para a célula contactada e em vários instantes posteriores e anteriores ao instante obtido para a célula contactada. Outros aspectos desta variante podem incluir uma comparação entre o desvio na emissão máxima detectada a partir de uma célula contacta obtido a partir de diversos instantes e o desvio na emissão máxima detectado a partir de uma célula de controlo obtido, v.g., a partir de um único instante, nos mesmos instantes, em instantes semelhantes, num instante posterior aos instantes obtidos a partir da célula contactada, num instante anterior aos instantes obtidos a partir de uma célula contactada, em diversos instantes posteriores aos instantes obtidos a partir de uma células contactada, em diversos instantes anteriores aos instantes obtidos a partir de uma células contactada e em diversos instantes posteriores e anteriores aos instantes obtidos a partir de uma células contactada. 245

De acordo com outra variante, determina-se a actividade da toxina a partir de uma amostra por detecção do rácio entre as amplitudes fluorescentes. A detecção do rácio entre amplitudes fluorescentes pode ser efectuada em ensaios de tempo fixo ou em ensaios contínuos ao longo do tempo e as comparações podem ser efectuadas utilizando instantes diferentes obtidos a partir da mesma célula contactada ou em relação a uma célula de controlo. Assim, um aspecto desta variante inclui a detecção do rácio de amplitudes fluorescentes, v.g., pelo menos em dois instantes diferentes, pelo menos em três instantes diferentes, pelo menos em quatro instantes diferentes, pelo menos em cinco instantes diferentes, pelo menos em dez instantes diferentes e pelo menos em 20 instantes diferentes. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do rácio de amplitudes fluorescentes ao longo de intervalos de tempo, v.g., não superiores a 1 minuto entre si, não superiores a 5 minutos entre si, não superiores a 10 minutos entre si, não superiores a 15 minutos entre si, não superiores a 30 minutos entre si e não superiores a 30 minutos entre si. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do rácio de amplitudes fluorescentes ao longo de intervalos de tempo, v.g., não inferiores a 15 minutos entre si, não inferiores a 30 minutos entre si, não inferiores a 45 minutos entre si, não inferiores a 60 minutos entre si, não inferiores a 90 minutos entre si e não inferiores a 120 minutos entre si. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do rácio de amplitudes fluorescentes continuamente ao longo do tempo durante, v.g., no máximo de cerca de 5 minutos, no máximo de cerca de 10 minutos, no máximo de cerca de 15 minutos, no máximo 246 de cerca de 30 minutos, no máximo de cerca de 45 minutos, no máximo de cerca de 60 minutos, no máximo de cerca de 90 minutos e no máximo de cerca de 120 minutos. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do rácio de amplitudes fluorescentes continuamente ao longo do tempo durante, v.g., pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 90 minutos e pelo menos cerca de 120 minutos.

Faz-se observar que o rádio de amplitudes fluorescentes pode ser detectado a partir de um instante único ou a partir de diversos instantes. Prevê-se que uma comparação entre o rácio de amplitudes fluorescentes detectado a partir de uma célula contactada e o rácio de amplitudes fluorescentes detectado a partir de uma célula de controlo possa ser efectuado utilizando valores obtidos a partir do mesmo instante, de um instante semelhante ou de instantes diferentes. Assim um aspecto desta variante inclui a detecção do rácio de amplitudes fluorescentes a partir da célula contactada e da célula de controlo, v.g., pelo menos num instante diferente, pelo menos em dois instantes diferentes, pelo menos em três instantes diferentes, pelo menos em quatro instantes diferentes, pelo menos em cinco instantes diferentes, pelo menos em dez instantes diferentes e pelo menos em 20 instantes diferentes. Outros aspectos desta variante podem incluir uma comparação entre o rácio de amplitudes fluorescentes detectadas a partir da célula contactada obtido num instante único e o rácio de amplitudes fluorescentes detectadas a partir da célula de controlo obtido, v.g., no mesmo instante, num instante semelhante, num instante 247 posterior ao instante obtido a partir da célula contactada, num instante anterior ao instante obtido a partir da célula contactada, em instantes posteriores ao instante obtido a partir da célula contactada, em instantes anteriores ao instante obtido a partir da célula contactada e em instantes posteriores e anteriores ao instante obtido a partir da célula contactada. Outros aspectos desta variante podem incluir uma comparação entre o rácio de amplitudes fluorescentes detectadas a partir da célula contactada obtido em diversos instantes e o rácio de amplitudes fluorescentes detectadas a partir da célula de controlo obtido, v.g., num único instante, nos mesmos instantes, em instantes semelhantes, num instante posterior aos instantes obtidos a partir da célula contactada, num instante anterior aos instantes obtidos a partir da célula contactada, em instantes posteriores aos instantes obtidos a partir da célula contactada, em instantes anteriores aos instantes obtidos a partir da célula contactada e em instantes posteriores e anteriores aos instantes obtidos a partir da célula contactada.

De acordo com outra variante, determina-se a actividade da toxina de clostrideo a partir de uma amostra por detecção do período de vida do estado excitado do fluoróforo. A detecção do período de vida do estado excitado do fluoróforo pode ser efectuada num ensaio de tempo fico ou num ensaio de tempo contínuo e as comparações podem ser efectuadas utilizando instantes diferentes obtidos a partir da mesma célula contactada ou em relação a uma célula de controlo. Assim, um aspecto desta variante inclui a detecção do período de vida do estado excitado do fluoróforo, v.g., pelo menos em dois instantes diferentes, 248 pelo menos em três instantes diferentes, pelo menos em quatro instantes diferentes, pelo menos em cinco instantes diferentes, pelo menos em dez instantes diferentes e pelo menos em 20 instantes diferentes. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do periodo de vida do estado excitado do fluoróforo ao longo de intervalos de tempo, v.g., não superiores a 1 minuto entre si, não superiores a 5 minutos entre si, não superiores a 10 minutos entre si, não superiores a 15 minutos entre si, não superiores a 30 minutos entre si e não superiores a 30 minutos entre si. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do periodo de vida do estado excitado do fluoróforo ao longo de intervalos de tempo, v.g., não inferiores a 15 minutos entre si, não inferiores a 30 minutos entre si, não inferiores a 45 minutos entre si, não inferiores a 60 minutos entre si, não inferiores a 90 minutos entre si e não inferiores a 120 minutos entre si. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do periodo de vida do estado excitado do fluoróforo durante, v.g., no máximo cerca de 5 minutos, no máximo cerca de 10 minutos, no máximo cerca de 15 minutos, no máximo cerca de 30 minutos, no máximo cerca de 45 minutos, no máximo cerca de 60 minutos, no máximo cerca de 90 minutos e no máximo cerca de 120 minutos. Outros aspectos desta variante incluem a detecção do período de vida do estado excitado do fluoróforo continuamente ao longo do tempo durante, v.g., pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 90 minutos e pelo menos de cerca de 120 minutos. 249

Faz-se observar que o período de vida do estado excitado do fluoróforo pode ser detectado a partir de um único instante ou a partir de diversos instantes. Prevê-se que uma comparação entre o período de vida do estado excitado do fluoróforo detectado a partir da célula contactada e o período de vida do estado excitado do fluoróforo detectado a partir de uma célula de controlo possa ser efectuada utilizando os valores obtidos para o mesmo instante, para instantes semelhantes ou para instantes diferentes. Assim, um aspecto desta variante compreende a detecção do período de vida do estado excitado do fluoróforo a partir da célula contactada e da célula de controlo, v.g., pelo menos num instante diferente, pelo menos em dois instantes diferentes, pelo menos em três instantes diferentes, pelo menos em quatro instantes diferentes, pelo menos em cinco instantes diferentes, pelo menos em dez instantes diferentes e pelo menos em 20 instantes diferentes. Outros aspectos desta variante podem incluir uma comparação entre o período de vida do estado excitado do fluoróforo detectado a partir da célula contactada obtida a partir de um único instante e o período de vida do estado excitado do fluoróforo detectado a partir da célula de controlo obtido, v.g., no mesmo instante, num instante semelhante, num instante posterior ao instante obtido a partir da célula contactada, num instante anterior ao instante obtido a partir da célula contactada, em instantes posteriores ao instante obtido a partir da célula contactada, em instantes anteriores ao instante obtido a partir da célula contactada e em instantes posteriores e anteriores ao instante obtido a partir da célula contactada. Outros aspectos desta variante podem incluir 250 uma comparação entre o período de vida do estado excitado do fluoróforo detectado a partir da célula contactada obtida a partir de diversos instantes e o período de vida do estado excitado do fluoróforo detectado a partir da célula de controlo obtido, v.g., num único instante, nos mesmos instantes, em instantes semelhantes, num instante posterior aos instantes obtidos a partir da célula contactada, num instante anterior aos instantes obtidos a partir da célula contactada, em instantes posteriores aos instantes obtidos a partir da célula contactada, em instantes anteriores aos instantes obtidos a partir da célula contactada e em instantes posteriores e anteriores aos instantes obtidos a partir da célula contactada.

Tipicamente, a fluorescência de uma célula contactada é determinada utilizando um fluorimetro. De um modo geral, a radiação de excitação a partir de uma fonte de excitação que possui um primeiro comprimento de onda atravessa as ópticas de excitação. As ópticas de excitação fazem com a radiação de excitação excite o substrato na célula. Como resposta, a proteína fluorescente no substrato emite radiação que possui um comprimento de onda que é diferente do comprimento de onda de excitação. As ópticas colectoras recolhem então a emissão; se desejado, o dispositivo inclui um controlador de temperatura para manter a célula a uma temperatura específica enquanto é pesquisada. Se desejado, um passo translação multi-eixo move a placa de microtitulação que contém diversas amostras para garantir a exposição de diferentes cavidades. Faz-se observar que o passo de translação multi-eixo, o controlador de temperatura, as características de autofocagem e os componentes electrónicos associados à recolha de imagens e 251 de dados podem ser geridos por meio de um computador digital adequado. Os aspectos da invenção implicam a excitação de um fluoróforo dador dentro de uma célula. É evidente para um especialista na matéria que um fluoróforo dador é geralmente excitado no comprimento de onda óptimo de absorção (comprimento de onda de excitação), ou num comprimento de onda próximo deste, do fluoróforo dador. A título exemplificativo, no caso do fluoróforo dador ser uma fluoresceína, então o dador pode ser excitado, por exemplo, no comprimento de onda óptimo de absorção de 488 nm, ou num valor próximo deste.

Para a detecção da intensidade de fluorescência do dador, a excitação é efectuada no comprimento de onda de absorção do fluoróforo dador e monitoriza-se a emissão do fluoróforo dador. 0 comprimento de onda de emissão do fluoróforo dador é normalmente seleccionado de um modo tal que se verifique pouca ou nenhuma contribuição de fluorescência do aceitador. A presença do aceitador extingue a fluorescência do dador. A eficácia de transferência de energia, E, é calculada a partir de E = 1 - IDa/ Ida em que IDa e ID representam as intensidades do dador na presença e na ausência do aceitador. São ambas normalizadas para a mesma concentração de fluoróforo dador. Se desejado, é possível efectuar medições ao longo do tempo, para as quais a concentração de fluoróforo dador não é necessária, utilizando E = 1 - {TDA}/TD, em que {TDA} e {TD} representam a amplitude dos períodos de vida médios do fluoróforo dador na presença e na ausência do aceitador.

Para a detecção da intensidade de fluorescência do aceitador, a excitação é efectuada no comprimento de onda de absorção do fluoróforo dador e a emissão do fluoróforo 252 aceitador é monitorizada. 0 comprimento de onda de emissão do fluoróforo aceitador é normalmente seleccionado de um modo tal que se verifique pouca ou nenhuma contribuição de fluorescência do dador. A presença do aceitador extingue a fluorescência do dador. A eficácia de transferência de energia, E, é calculada a partir de E = 1 - IDA/ID, em que IDA e ID representam as intensidades do aceitador na presença e na ausência do dador. São ambas normalizadas para a mesma concentração de fluoróforo aceitador. Se desejado, é possivel efectuar medições ao longo do tempo, para as quais a concentração de fluoróforo aceitador não é necessária, utilizando E = 1 - {TDA}/TD, em que {TDa} e {TD} representam a amplitude dos períodos de vida médios do fluoróforo aceitador na presença e na ausência do aceitador.

Faz-se ainda observar que os métodos da invenção podem ser automatizados e podem ser configurados num formato de produtividade elevada ou de produtividade ultra-elevada utilizando, mas sem que isso constitua qualquer limitação, placas com 96 cavidades, 384 cavidades ou 1536 cavidades. Como exemplo não limitativo, a emissão de fluorescência pode ser detectada utilizando o leitor de microplacas 'SpectraMax M5' (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), um monocromador dual, um leitor de microplacas com detecção múltipla com um intervalo de comprimentos de onda de 250 a 850 nm e uma capacidade de leitura de microplacas 6-384. Como outro exemplo não limitativo, a emissão de fluorescência pode ser detectada utilizando o sistema 'Typhoon 9410' (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Este sistema, concebido para ensaios com microplacas, é capaz de provocar uma excitação fluorescente a 488 nm, 532 nm ou 633 253 nm e possui um sistema óptico semiconfocal com uma câmara carregada acoplada (OCD) para iluminar a capturar a imagem de toda a placa. 0 leitor 'FPM-2' de placas com 96 cavidades (Folley Consulting and Research, Round Lake, IL) também pode ser útil para a detecção da emissão fluorescente em métodos da invenção. É evidente para um especialista na matéria que estes e outros sistemas automatizados com uma compatibilidade espectroscópica adequada, tais como o leitor de tinas 'ECLIPSE' (Varian-Cary; Walnut Creek, CA) e os sistemas espectrofluorométricos FLIPR® e Gemini XPS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Prevê-se que é possível utilizar diversas condições adequadas para determinar a actividade de toxina de clostrídeo numa amostra nos métodos descritos na presente memória descritiva. De acordo com aspectos desta variante, é possível utilizar condições adequadas para determinar a actividade da toxina de clostrídeo desde que, v.g., pelo menos 10% do substrato seja clivado, pelo menos 2 0% do substrato seja clivado, pelo menos 30% do substrato seja clivado, pelo menos 40% do substrato seja clivado, pelo menos 50% do substrato seja clivado, pelo menos 60% do substrato seja clivado, pelo menos 70% do substrato seja clivado, pelo menos 80% do substrato seja clivado ou pelo menos 90% do substrato seja clivado. De acordo com outros aspectos desta variante, é possível utilizar condições adequadas para determinar a actividade da toxina de clostrídeo desde que, v.g., no máximo 10% do substrato seja clivado, no máximo 20% do substrato seja clivado, no máximo 30% do substrato seja clivado, no máximo 40% do substrato seja clivado, no máximo 50% do substrato seja clivado, no 254 máximo 60% do substrato seja clivado, no máximo 70% do substrato seja clivado, no máximo 80% do substrato seja clivado ou no máximo 90% do substrato seja clivado. De acordo com outro aspecto desta variante, é possível utilizar condições adequadas para determinar a actividade da toxina de clostrídeo desde que 100% do substrato seja clivado. De acordo com outro aspecto desta variante, sejam utilizadas condições adequadas para determinar a actividade da toxina de clostrídeo de um modo tal que o ensaio seja linear. De acordo com outro aspecto desta variante, são utilizadas condições adequadas para determinar a actividade da toxina de clostrídeo de um modo tal que o ensaio é não linear.

As toxinas de clostrídeo são metaloproteases de zinco e é possível incluir, se desejado, uma fonte de zinco, tal como cloreto de zinco ou acetato de zinco, tipicamente com uma concentração compreendida entre 1 μΜ e 500 μΜ, por exemplo, entre 5 μΜ e 10 μΜ, como parte das condições adequadas para determinar a actividade da toxina de clostrídeo. É evidente para um especialista na matéria que os quelantes de zinco, tais como o EDTA, estão normalmente excluídos do tampão para se determinar a presença ou a actividade de uma toxina de clostrídeo. A concentração de toxina de clostrídeo purificada ou parcialmente purificada que se pretende testar num método da invenção está normalmente compreendida entre cerca de 0,0001 ng/mL e 500 pg/mL de toxina, por exemplo, entre cerca de 0, 0001 ng/mL e 50 pg/mL de toxina, entre 0,001 ng/m e 500 pg/mL de toxina, entre 0,001 ng/mL e 50 pg/mL de toxina, entre 0,0001 e 5000 ng/mL de toxina, entre 0,001 ng/mL e 5000 ng/mL, entre 0,01 ng/ml e 5000 ng/mL, entre 255 0,1 ng/mL e 5000 ng/mL, entre 0,1 ng/mL e 500 ng/mL, entre 0,1 ng/mL e 50 ng/mL, entre 1 ng/mL e 5000 ng/mL, entre 1 ng/ml e 500 ng/mL, entre 1 ng/mL e 50 ng/mL, entre 10 ng/mL e 5000 ng/mL, entre 10 ng/mL e 500 ng/mL, entre 50 ng/mL e 5000 ng/mL, entre 50 ng/mL e 500 ng/mL ou entre 100 ng/mL e 5000 ng/mL de toxina, a qual pode ser, por exemplo, uma toxina recombinante purificada de cadeia simples ou de cadeia dupla ou um produto formulado de toxina de clostrideo que contém albumina do soro humano e excipientes. De acordo com aspectos desta variante, a concentração de toxina de clostrideo purificada ou parcialmente purificada testada dá origem a uma clivagem, v.g.r pelo menos de 10% do substrato total presente, pelo menos de 20% do substrato total presente, pelo menos de 30% do substrato total presente, pelo menos de 40% do substrato total presente, pelo menos de 50% do substrato total presente, pelo menos de 60% do substrato total presente, pelo menos de 70% do substrato total presente, pelo menos de 80% do substrato total presente ou pelo menos de 90% do substrato total presente. De acordo com outros aspectos desta variante, a concentração de toxina de clostrideo purificada ou parcialmente purificada testada dá origem a uma clivagem, v.g., no máximo de 10% do substrato total presente, no máximo de 20% do substrato total presente, no máximo de 30% do substrato total presente, no máximo de 40% do substrato total presente, no máximo de 50% do substrato total presente, no máximo de 60% do substrato total presente, no máximo de 70% do substrato total presente, no máximo de 80% do substrato total presente ou no máximo de 90% do substrato total presente. De acordo com outro aspecto desta variante, a concentração de toxina de 256 clostrídeo purificada ou parcialmente purificada testada dá origem a uma clivagem de 100% do substrato total presente.

A concentração de toxina de clostrídeo purificada ou parcialmente purificada testada num método da invenção pode estar compreendida, por exemplo, entre cerca de 0,1 pM e 500 μΜ, entre 0,1 pM e 100 μΜ, entre 0,1 pM e 10 μΜ, 0,1 pM e 1 μΜ, entre 0,1 pM e 500 nM, entre 0,1 pM e 100 nM, entre

0,1 pM e 10 nM, entre 0,1 pM e 1 nM, entre 0,1 pM e 500 pM, entre 0,1 pM e 100 pM, entre 0,1 pM e 50 pM, entre 0,1 pM e 10 pM, entre 1 pM e 500 μΜ, entre 1 pM e 100 μΜ, entre 1 pM e 10 μΜ, entre 1 pM e 1 μΜ, entre 1 pM e 500 nM, entre 1 pM e 100 nM, entre 1 pM e 10 nM, entre 1 pM e 1 nM, entre 1 pM e 500 pM, entre 1 pM e 100 pM, entre 1 pM e 50 pM, entre 1

pM e 10 pM, entre 10 pM e 500 μΜ, entre 10 pM e 100 μΜ, entre 10 pM e 10 μΜ, entre 10 pM e 10 μΜ, entre 10 pM e 500 nM, entre 10 pM e 100 nM, entre 10 pM e 10 nM, entre 10 pM e 1 nM, entre 10 μΜ e 500 pM, entre 10 pM e 100 pM, entre 10 pM e 50 pM, entre 100 pM e 500 μΜ, entre 100 pM e 100 μΜ, entre 100 pM e 10 μΜ, entre 100 pM e 1 μΜ, entre 100 pM e 500 nM, entre 100 pM e 100 nM, entre 100 pM e 10 nM, entre 100 pM e 1 nM, entre 100 pM e 500 pMl nM e 500 μΜ, entre 1 nM e 100 μΜ, entre 1 nM e 10 μΜ, entre 1 nM e 1 μΜ, entre 1 nM e 500 nM, entre 1 nM e 100 nM, entre 1 nM e 50 nM, entre 1 nM e 10 nM, entre 3 nM e 100 nM de toxina, a qual pode ser, por exemplo, uma toxina nativa ou recombinante purificada de cadeia leve ou de cadeia dupla ou um produto formulado de toxina de clostrídeo que contém albumina do soro humano e excipientes. É evidente para um especialista na matéria que a concentração de toxina de clostrídeo purificada ou parcialmente purificada irá depender do serotipo da toxina testada, bem como da pureza 257 ou da sequência recombinante da toxina, da presença de componentes inibitórios e das condições de ensaio. Faz-se ainda observar que as amostras purificadas, parcialmente purificadas ou impuras, podem ser diluídas até uma concentração conveniente para o ensaio da actividade da toxina de clostrídeo contra uma curva padrão. De igual modo, faz-se observar que uma amostra pode ser diluída, se desejado, de um modo tal que o ensaio seja linear. De acordo com aspectos desta variante, a concentração de toxina de clostrídeo purificada ou parcialmente purificada testada dá origem à clivagem, v.g., pelo menos de 10% do substrato total presente, pelo menos de 20% do substrato total presente, pelo menos de 30% do substrato total presente, pelo menos de 40% do substrato total presente, pelo menos de 50% do substrato total presente, pelo menos de 60% do substrato total presente, pelo menos de 70% do substrato total presente, pelo menos de 80% do substrato total presente ou pelo menos de 90% do substrato total presente. De acordo com outros aspectos desta variante, a concentração de toxina de clostrídeo purificada ou parcialmente purificada testada dá origem à clivagem, v.g., no máximo de 10% do substrato total presente, no máximo de 20% do substrato total presente, no máximo de 30% do substrato total presente, no máximo de 40% do substrato total presente, no máximo de 50% do substrato total presente, no máximo de 60% do substrato total presente, no máximo de 70% do substrato total presente, no máximo de 80% do substrato total presente ou no máximo de 90% do substrato total presente. De acordo com outro aspecto desta variante, a concentração de toxina de clostrídeo purificada 258 ou parcialmente purificada testada dá origem à clivagem de 100% do substrato total presente.

Ainda de acordo com outra variante, prevê-se que possam ser utilizadas todas as temperaturas que permitam a realização do ensaio de actividade de clostrideos nos métodos descritos na presente memória descritiva. As temperaturas de ensaio podem ser alteradas por um especialista na matéria conforme adequado e dependem normalmente, em parte, da concentração, da pureza e da actividade da toxina de clostrideo, da amostra que se pretende testar, do tempo de ensaio ou de conveniência do especialista na matéria. Assim, a temperatura de ensaio não deverá ser tão baixa que provoque o congelamento da solução e não deverá ser tão alta que provoque a desnaturação da toxina de clostrideo, o substrato de toxina de clostrideo descrito na presente memória descritiva. De acordo com um aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a uma temperatura superior a 0°C mas inferior a 40°C. De acordo com outro aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a uma temperatura compreendida entre cerca de 4°C e cerca de 37 °C. Ainda de acordo com outro aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a uma temperatura compreendida entre cerca de 2°C e 10 °C. Ainda de acordo com outro aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a cerca de 4°C. Ainda de acordo com outro aspecto, o ensaio é efectuado a uma temperatura compreendida entre cerca de 10°C e cerca de 18°C. Ainda de acordo com outro aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a cerca de 16°C. Ainda de acordo com outro aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a uma temperatura compreendida entre cerca de 18°C e cerca de 32°C. Ainda de acordo com outro aspecto desta variante, o 259 ensaio é efectuado a cerca de 20°C. De acordo com outro aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a uma temperatura compreendida entre cerca de 32°C e cerca de 40°C. De acordo com outro aspecto desta variante, o ensaio é efectuado a cerca de 37°C. De acordo com aspectos desta variante, a quantidade de substrato de toxina de clostrideo clivado neste intervalo de temperaturas é, v.g., pelo menos de 10% do substrato total presente, pelo menos de 20% do substrato total presente, pelo menos de 30% do substrato total presente, pelo menos de 40% do substrato total presente, pelo menos de 50% do substrato total presente, pelo menos de 60% do substrato total presente, pelo menos de 70% do substrato total presente, pelo menos de 80% do substrato total presente ou pelo menos de 90% do substrato total presente. De acordo com outros aspectos desta variante, a quantidade de substrato de toxina de clostrideo clivado neste intervalo de temperaturas é, v.g., no máximo 10% do substrato total presente, no máximo 20% do substrato total presente, no máximo 30% do substrato total presente, no máximo 40% do substrato total presente, no máximo 50% do substrato total presente, no máximo 60% do substrato total presente, no máximo 70% do substrato total presente, no máximo 80% do substrato total presente ou no máximo 90% do substrato total presente. De acordo com outro aspecto desta variante, a quantidade de substrato de toxina de clostrideo clivado neste intervalo de temperaturas é de 100%.

Ainda de acordo com outra variante, prevê-se que possam ser utilizados todos os tempos suficientes para a detecção da presença de produtos de clivagem do substrato de toxina de clostrideo nos métodos descritos na presente memória descritiva. Os tempos de ensaio podem ser 260 modificados pelo especialista na matéria conforme adequado e dependem normalmente, em parte, da concentração, da pureza e da actividade da toxina de clostrideo, da amostra que se pretende testar, da temperatura de incubação ou da conveniência do especialista na matéria. Os tempos de ensaio variam normalmente, mas sem que isso constitua qualquer limitação, no intervalo de tempo compreendido entre cerca 15 minutos e cerca de 4 horas, entre 30 minutos e 8 horas, entre 1 hora e 12 horas, entre 2 horas e 24 horas, entre 4 horas e 48 horas e entre 6 horas e 72 horas. De acordo com aspectos desta variante, a quantidade de substrato de toxina de clostrideo clivado durante um tempo de ensaio é, v.g., pelo menos de 10% do substrato total presente, pelo menos de 20% do substrato total presente, pelo menos de 30% do substrato total presente, pelo menos de 40% do substrato total presente, pelo menos de 50% do substrato total presente, pelo menos de 60% do substrato total presente, pelo menos de 70% do substrato total presente, pelo menos de 80% do substrato total presente ou pelo menos de 90% do substrato total presente. De acordo com outros aspectos desta variante, a quantidade de substrato de toxina de clostrideo clivado durante o tempo de ensaio é, v.g., no máximo 10% do substrato total presente, no máximo 20% do substrato total presente, no máximo 30% do substrato total presente, no máximo 40% do substrato total presente, no máximo 50% do substrato total presente, no máximo 60% do substrato total presente, no máximo 70% do substrato total presente, no máximo 80% do substrato total presente ou no máximo 90% do substrato total presente. De acordo com outro aspecto desta variante, a quantidade de substrato de toxina de clostrideo clivado 261 durante o tempo de ensaio é de 100%. Faz-se observar que os ensaios podem ser terminados, se desejado, antes de se excitar a proteína fluorescente. Há aspectos da presente invenção que também podem ser descritos do modo seguinte. 1. Célula isolada que compreende: a) um substrato de toxina de clostrídeo, associado à membrana, em que o referido substrato compreende i) um primeiro componente de um par de transferência de energia de ressonância da fluorescência (FRET); ii) uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo que inclui um local de clivagem da toxina de clostrídeo; e iii) um domínio de endereçamento membranar; b) um segundo componente, associado à membrana, de um par de FRET, em que o segundo componente do par de FRET é um corante lipofílico; e c) um receptor que se liga a uma toxina de clostrídeo; em que a célula é sensível a intoxicação com toxina de clostrídeo; em que o par de FRET compreende um aceitador que possui um espectro de absorvência que se sobrepõe ao espectro de emissão de um fluoróforo dador; e em que a transferência de energia de ressonância, em condições adequadas, ocorre entre o aceitador e o fluoróforo dador. 2. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula contém transitoriamente o substrato de toxina de clostrídeo. 262 3. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula contém estavelmente o substrato de toxina de clostrideo. 4. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que 0 substrato de toxina de clostrideo é expresso a partir de uma molécula de ácido nucleico • 5. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula neuronal. 6. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula não neuronal • 7. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que 0 primeiro componente do par de FRET é uma proteína fluorescente ou uma proteína que se liga a um fluoróforo. 8. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que 0 primeiro componente do par de FRET é o aceitador e o segundo componente do par de FRET é o fluoróforo dador. 9. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro componente do par de FRET é o fluoróforo dador e o segundo componente do par de FRET é o aceitador. 10 Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/A que contém um local de clivagem de BoNT/A, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que contém um local de clivagem de BoNT/B, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que contém um local de clivagem de BoNT/Cl, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que contém um local de clivagem de BoNT/D, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E que contém um local de clivagem de BoNT/E, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que contém um local de clivagem de BoNT/F, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que 263 contém um local de clivagem de BoNT/G ou uma sequência de reconhecimento de TeNT que contém um local de clivagem de TeNT. 11. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo compreende pelo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, em que os seis residuos consecutivos possuem Gln-Arg. 12. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis residuos consecutivos possuem Gln-Phe. 13. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, em que os seis resíduos consecutivos possuem Arg-Ala. 14. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo compreende pelo menos seis residuos consecutivos de Sintaxina, em que os seis resíduos consecutivos possuem Lys-Ala. 15. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis resíduos consecutivos possuem Lys-Leu. 16. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, em que os seis resíduos consecutivos possuem Arg-Ile. 17. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo 264 compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis resíduos consecutivos possuem Gln-Lys. 18. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis resíduos consecutivos possuem Ala-Ala. 19. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor é um receptor endógeno da toxina de clostrídeo. 20. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor é um receptor exógeno de toxina de clostrídeo. 21. Processo para determinar a actividade da toxina de clostrídeo, o qual compreende os passos seguintes: a) fazer contactar com uma amostra uma célula de acordo com a reivindicação 1; b) excitar o referido fluoróforo dador; c) detectar a transferência da energia de ressonância da fluorescência da referida célula contactada; e d) comparar a transferência de energia de ressonância detectada a partir da célula contactada com a transferência de energia de ressonância detectada a partir de uma célula de referência sujeita aos passos (b)-(c); em que a existência de uma diferença entre a transferência de energia de ressonância da fluorescência da célula contactada, comparativamente com a célula de referência, é um indicador da actividade da toxina de clostrídeo. 22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a amostra é um lisado celular impuro, uma toxina de clostrídeo a granel, uma toxina de clostrídeo parcialmente purificada, uma toxina de clostrídeo purificada ou um produto formulado com toxina de clostrídeo. 265 23. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a amostra compreende um produto formulado de toxina de clostrideo. 24. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produto formulado de toxina de clostrideo é um produto formulado de BoNT/A. 25. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a amostra é um alimento crú, um alimento parcialmente cozinhado ou processado, um alimento cozinhado ou processado, uma bebida, um alimento animal, uma amostra de solo, uma amostra de água ou sedimentos de um reservatório.

EXEMPLOS

Os exemplos subsequentes, não limitativos, são apresentados apenas com fins ilustrativos, com o intuito de facilitar uma compreensão mais completa das variantes descritas, e não se pretende com eles, de forma alguma, limitar quaisquer variantes descritas na presente invenção.

EXEMPLO I

Construção de substratos de toxina de clostrideo 1. Construção de substratos de BoNT/A, BoNT/Cl e BoNT/E SNAP-25

la. Construção de pQBl25/SNAP-25206~GFP

Para se construir pQBI-25/GFP-SNAP-25206/· fez-se digerir uma construção de pGEX/SNAP-25206 com BamHI e EcoRI para excisar um fragmento contendo toda a grelha de leitura aberta de SNAP-25206 · 0 fragmento de restrição resultante 266 foi purificado recorrendo ao estojo de extracção em gel 'QIAquick'(QIAGEN, Inc., Valência, CA) e depois foi subclonado, recorrendo a um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-2SC3 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA), digerido com BamHI e EcoRI, para se obter pQBI-25/GFP-SNAP-25206 · A mistura de ligação foi transformada recorrendo a células quimicamente competentes TOPIO de E. coli (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), praticando um processo de choque térmico, e depois foi aplicada sobre placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com uma concentração de ampicilina igual a 100 pg/mL, as quais foram colocadas numa incubadora 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. Efectuou-se a análise das colónias resistentes à ampicilina, praticando um procedimento com uma minipreparação plasmidica de lise alcalina, tendo as construções de expressão elegíveis sido pesquisadas por mapeamento com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação do fragmento de inserção correcto. As culturas que continham a desejada construção de expressão foram utilizadas para inocular balões separadores de 1 L contendo 200 mL de meio de Luria-Bertani com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, que foram colocados numa incubadora a 37 °C com agitação a 250 r.p.m., de um dia para o outro. Isolou-se o ADN plasmídico purificado, correspondente a uma construção de expressão, praticando o método ''Maxi-prep'' da QIAGEN (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e fez-se a sua sequenciação para se verificar que se havia feito a construção de expressão correcta (serviço contratado a Sequetech Corp., Mountain View, CA). Esta estratégia de clonagem produziu uma construção de expressão pQBI-25 que codifica um GFP-SNAP-252o6· 267

Para se construir pQBI-25/SNAP-25206_GFP, faz-se a amplificação de um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende SNAP-25206, a partir de ADN de pQBI-25/GFP-SNAP25206, recorrendo a um processo de reacção em cadeia com polimerase, e efectua-se a subclonagem num vector pCR2.1 recorrendo ao processo de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). A construção resultante pCR2.l/SNAP-25206 é digerida com BamEI e FcoRI para se excisar um fragmento que contém toda a grelha de leitura aberta de SNAP-25206 · Purificou-se o fragmento de restrição resultante, utilizando o estojo de extracção em gel 'QIAquick' (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e efectuou-se a sua subclonagem utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4 num vector pQBI-25A2 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA), e fez-se digerir com BamHI e FcoRI para se obter pQBI-25/SNAP-25206-GFP. A mistura de ligação foi transformada com células quimicamente competentes TOPIO de E. coli (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um processo de choque térmico, tendo sido distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais foram colocadas numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. Efectuou-se a análise das colónias resistentes à ampicilina, praticando um procedimento de minipreparação plasmidica de lise alcalina e efectuou-se uma pesquisa das construções de expressão elegíveis, recorrendo ao mapeamento com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação do fragmento de inserção correcto. As culturas que continham a desejada construção de expressão foram utilizadas para inocular balões separadores de 1 L que continham 200 mL de 268 meio de Luria-Bertani com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, tendo sido colocados numa incubadora a 37°C com agitação a 250 r.p.m., de um dia para o outro, para desenvolvimento. Isolou-se ADN plasmidico purificado, correspondente a uma construção de expressão, praticando o processo 'Maxi-prep' da QIAGEN (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e fez-se a sua sequenciação para se verificar que havia sido feita a construção de expressão correcta (serviço contratado a Sequetech Corp., Mountain View, CA) . Esta estratégia de clonagem produziu uma construção de expressão pQBI-25 que codifica um SNAP-25206-GFP (ver a figura 5) .

lJb. Construção de pQBl25/SNAP-25134~GFP

Para se construir pQBI-25/SNAP-25206_GFP, faz-se a amplificação de um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende SNAP-252o6/ a partir de ADN de pQBI-25/GFP-SNAP25206f recorrendo a um processo de reacção em cadeia com polimerase, e efectua-se a subclonagem num vector pCR2.1, recorrendo ao processo de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . A construção resultante pCR2.l/SNAP-25206 é digerida com BamRI e EcoRI para se excisar um fragmento que contém toda a grelha de leitura aberta de SNAP-252o6· Purificou-se o fragmento de restrição resultante, utilizando o estojo de extracção em gel 'QIAquick' (QIAGEN, Inc., Valência, CA), e efectuou-se a sua subclonagem, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4 num vector pQBI-25A2 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA), e fez-se digerir com Bamtil e EcoRI para se obter pQBI-25/SNAP-25206“GFP. A mistura de ligação foi transformada com células quimicamente competentes TOPIO de E. coli (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um 269 processo de choque térmico, tendo sido distribuidas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais foram colocadas numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. Efectuou-se a análise das colónias resistentes à ampicilina, praticando um procedimento de minipreparação plasmídica de lise alcalina e efectuou-se uma pesquisa das construções de expressão elegíveis, recorrendo ao mapeamento com endonucleases de restrição para se determinar a presença e orientação do fragmento de inserção correcto. As culturas que continham a desejada construção de expressão foram utilizadas para inocular balões separadores de 1 L que continham 200 mL de meio de Luria-Bertani com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, tendo sido colocados numa incubadora a 37°C com agitação a 250 r.p.m., de um dia para o outro, para desenvolvimento. Isolou-se ADN plasmídico purificado, correspondente a uma construção de expressão, praticando o processo 'Maxi-prep' da QIAGEN (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e fez-se a sua sequenciação para se verificar que havia sido feita a construção de expressão correcta (serviço contratado a Sequetech Corp., Mountain View, CA) . Esta estratégia de clonagem produziu uma construção de expressão pQBI-25 que codifica um SNAP-25206-GFP (ver a figura 5) . lc. Localização subcelular do substrato de SNAP-25-GFP e produtos de clivagem

Com a finalidade de se determinar se um substrato de BoNT/A consegue associar-se à membrana celular, estudou-se a possibilidade de uma célula, em que há expressão de um plasmídeo que codifica um substrato de SNAP-25-GFP, ser 270 capaz de localizar o substrato na membrana celular. Para se obter transitoriamente a expressão de um substrato de SNAP-25-GFP numa linhagem de células, utilizou-se um conjunto de células PC12, com uma concentração conveniente, que foram aplicadas em cavidades de placas de 6 cavidades, próprias para culturas de tecidos, recobertas com poli-D-lisina/laminina, contendo 3 mL de um meio adequado (ver o Quadro 13), que foram colocadas numa incubadora a 37°C, para desenvolvimento, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células atingirem a densidade pretendida (ver o Quadro 13) . Prepara-se 500 pL de uma solução de transfecção adicionando 250 pL de meio de soro reduzido ΌΡΤΙ-ΜΕΜ', contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA) , com incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a uma quantidade de 250 pL de meio de soro reduzido 'OPTI-MEM' contendo 10 pg de uma construção de pQBI-25/GFP-SNAP-25206 ou 10 pg de uma construção OBI-25/SNAP-25206_GFP. Este produto de transfecção ficou a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Os meios foram substituídos por meios renovados, não enriquecidos, tendo sido acrescentados às células 500 pL de solução de transfecção. As células ficaram depois a incubar numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante um periodo aproximado de 6 a 18 horas. Os meios de transfecção foram substituídos por 3 mL de meios renovados, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 48 horas, as células foram fixadas com paraformaldeído e observadas no microscópio confocal, conforme descrito, v.g.r por Ester Fernandez-Salas et al., na obra 'Plasma 271 membrane localization signals in the light chain of botulinum neurotoxin', 101(9) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 3208-3213 (2004). Ambos os substratos GFP-SNAP2522o6 e SNAP252o6_GFP se concentram na membrana plasmática (ver FIG. 6) .

Para se determinar se um substrato de BoNT/A localizado numa membrana celular pode ser susceptivel à clivagem de BoNT/A, estudou-se a possibilidade de a exposição de BoNT/A a uma célula, contendo um substrato de SNAP-25-GFP localizado na membrana, tinha como resultado a clivagem do substrato. As células PC12 foram transfectadas transitoriamente com pQBI-25-SNAP25206_GFPa, que é uma construção plasmidica que codifica um substrato de SNAP25206_GFP, e com pcDNA3.1-LC/A, que é uma construção plasmidica que codifica a cadeia leve de BoNT/A, conforme descrito na alínea lb do Exemplo I. A observação de células vivas, decorridas 24 a 48 horas após a transfecção, utilizando um microscópio de fluorescência invertido, indicou que nas células PC12 tem lugar a co-expressão de SNAP2 5206“GFP e que a cadeia leve de BoNT/A originou uma modificação da intensidade fluorescente, comparativamente com as células de referência em que tem lugar apenas a expressão do substrato SNAP25206-GFP. A alteração da intensidade fluorescente resultou de um nível reduzido de fluorescência emitida pelas células, e também de uma alteração na localização subcelular da fluorescência de GFP; a fluorescência nas células em que tem lugar a co-expressão do substrato e também da enzima foi observada no citoplasma com acumulação em algumas áreas ou estruturas citoplásmicas (ver a figura 6). Esta acumulação citoplásmica parece representar o produto de clivagem que 272 contém o fragmento de clivagem de 9 aminoácidos proveniente de SNAP-25 fundido com GFP. Estes resultados indicam que há um padrão de fluorescência distinto e também um grau diferente de fluorescência em células que contêm o substrato SNAP252o6-GFP não clivado, comparativamente com células que contêm os produtos de clivagem deste substrato (SNAP25i97 e o fragmento restante de 9 resíduos proveniente de SNAP-25 fundido com GFP).

ld. Construção de pQB!67/SNAP-252o6~GFP

Para construir pQBI-67/SNAP-25206-GFP, amplifica-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende o substrato de SNAP-252o6_GFP, a partir de ADN de pQBI-25/SNAP25206_GFP, recorrendo ao método de reacção e cadeia com polimerase, e faz-se a sua subclonagem num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a incluírem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.l/SNAP-25206-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica o péptido SNAP-25206-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). Esta inserção é subclonada, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-67 que é digerido com as endonucleases de restrição adequadas para proporcionar pQBI-67/SNAP-25206-GFP. A mistura de ligação é transformada com células quimicamente competentes de E. coli BL21 (DE3) 273 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), praticando um processo de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas depois numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. Faz-se o isolamento das construções elegíveis, praticando um procedimento com uma minipreparação plasmídica para lise alcalina, e faz-se a sua análise por mapeamento de digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem produz uma construção de expressão em mamíferos que codifica o SNAP-25206~GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pQBI-67 .

2. Construção de substratos de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G e TeNT VAMP

2a. Construção de pQBl25/VAMP-l-GFP

Para se fazer um substrato de VAMP-1, adequado para os métodos descritos na presente memória descritiva, faz-se uma construção pQBI-25/VAMP-l-GFP, praticando um procedimento de reacção em cadeia com polimerase para junção, por sobreposição, das extremidades (SOE-PCR); ver, v.g., R. M. Horton et ai., "Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989)"; e R. M.

Horton, "PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 274

(1995)". Um fragmento de ácido nucleico, que compreende uma região que codifica os aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1), irá ser funcionalmente ligado, por SOE-PCR , a uma sequência de VAMP-1 que compreende uma região que codifica os aminoácidos 49-92 de SEQ ID NO: 2 8 e irá ser subclonado num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para estas reacções, são concebidos de modo a

conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.1/VAMP-l é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica os aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1) e os aminoácidos 49-92 de VAMP-1 (SEQ ID NO: 28) ; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA) . O fragmento de restrição resultante irá ser purificado utilizando o estojo de extracção em gel 'QIAquick' (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e irá ser subclonado, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Irvine, CA), para se obter pQBI-25/VAMP-l-GFP. Esta estratégia de clonagem proporcionou uma construção de expressão pQBI-25 que codifica um domínio de endereçamento membranar SNAP-25 que compreende os aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1), que é uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo que compreende os aminoácidos 49-92 de VAMP-1 (SEQ ID NO: 28) e um GFP, todos eles funcionalmente ligados e adequados para detectar a actividade proveniente de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT 275 A localização subcelular dos substratos de VAMP-l-GFP e os seus produtos de clivagem irão ser analisados praticando procedimentos essencialmente idênticos aos anteriormente descritos na alínea lc do Exemplo I, com a excepção de a construção pQBI-25/VAMP-l-GFP, anteriormente descrita na alínea 2a do Exemplo I, ser utilizada em vez das construções de expressão que codificam SNAP-252o6_GFP. Além disso, irá ser utilizada uma construção de expressão adequada que codifica a cadeia leve de uma toxina adequada de clostrídeo, v.g.r irá ser utilizada a cadeia leve de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, em vez da construção pcDNA3.1-LC/A.

2b. Construção de pQBl25/VAMP-2-GFP

Para se fazer um substrato de VAMP-2, adequado aos métodos descritos na presente memória descritiva, far-se-á uma construção pQBI-25/VAMP-2-GFP, praticando um procedimento de SOE-PCR. Um fragmento de ácido nucleico, que compreende uma região que codifica os aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1), irá ser funcionalmente ligado, por SOE-PCR, a uma sequência de VAMP-2 que compreende uma região que codifica os aminoácidos 47-90 de SEQ ID NO: 31 e irá ser subclonado num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para estas reacções, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.l/VAMP-2 é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica os aminoácidos 276

85-120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1) e os aminoácidos 47-90 de VAMP-2 (SEQ ID NO: 31); e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA). O fragmento de restrição resultante irá ser purificado utilizando o estojo de extracção em gel 'QIAquick' (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e irá ser subclonado, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, a um vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Irvine, CA) para se obter pQBI-25/VAMP-2-GFP. Esta estratégia de clonagem proporcionou uma construção de expressão pQBI-25 que codifica um domínio de endereçamento membranar SNAP-25 que compreende os aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1) , que é uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo que compreende os aminoácidos 47-90 de VAMP-2 (SEQ ID NO: 31) e um GFP, todos eles funcionalmente ligados e adequados para detectar a actividade proveniente de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT A localização subcelular dos substratos de VAMP-2-GFP e os seus produtos de clivagem irão ser analisados praticando procedimentos essencialmente idênticos aos anteriormente descritos na alínea lc do Exemplo I, com a excepção de a construção pQBI-25/VAMP-2-GFP, anteriormente descrita na alínea 2b do Exemplo I, ser utilizada em vez das construções de expressão que codificam SNAP-252o6-GFP. Além disso, irá ser utilizada uma construção de expressão adequada que codifica a cadeia leve de uma toxina adequada de clostrídeo, v.g., irá ser utilizada a cadeia leve de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, em vez da construção pcDNA3.1-LC/A. 277

2c. Construção de pQBl25/VAMP-3-GFP

Para se fazer um substrato de VAMP-3, adequado aos métodos descritos na presente memória descritiva, far-se-á uma construção pQBI-25/VAMP-3-GFP, praticando um procedimento de SOE-PCR. Um fragmento de ácido nucleico que compreende uma região que codifica os aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1) irá ser funcionalmente ligado, por SOE-PCR, a uma sequência de VAMP-3 que compreende uma região que codifica os aminoácidos 34-77 de SEQ ID NO: 33, e irá ser subclonado num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotidicos directo e inverso, utilizados para estas reacções, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.l/VAMP-3 é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica os aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1) e os aminoácidos 34-77 de VAMP-3 (SEQ ID NO: 33) ; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA) . O fragmento de restrição resultante irá ser purificado utilizando o estojo de extracção em gel 'QIAquick' (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e irá ser subclonado, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Irvine, CA) para se obter pQBI-25/VAMP-3-GFP. Esta estratégia de clonagem proporcionou uma construção de expressão pQBI-25 que codifica um domínio de endereçamento membranar SNAP-25 que compreende os aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1), que é uma sequência de reconhecimento da toxina de 278

clostrídeo que compreende os aminoácidos 34-77 de VAMP-3 (SEQ ID NO: 33) e um GFP, todos eles funcionalmente ligados e adequados para detectar a actividade proveniente de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT A localização subcelular dos substratos de VAMP-3-GFP e os seus produtos de clivagem irão ser analisados praticando procedimentos essencialmente idênticos aos anteriormente descritos na alínea lc do Exemplo I, com a excepção de a construção pQBI-25/VAMP-3-GFP, anteriormente descrita na alínea 2c do Exemplo I, ser utilizada em vez das construções de expressão que codificam SNAP-252o6_GFP. Além disso, irá ser utilizada uma construção de expressão adequada que codifica a cadeia leve de uma toxina adequada de clostrídeo, v.g., irá ser utilizada a cadeia leve de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, em vez da construção pcDNA3.1-LC/A.

2d. Construção de pGBI 67/VAMP-l-GFP

Para se construir pQBI-67/VAMP-l-GFP, amplifica-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende o substrato de VAMP-l-GFP, conforme descrito na alínea 2a do Exemplo I, a partir de ADN de pQB1-25/VAMP-l-GFP, recorrendo ao método de reacção e cadeia com polimerase, e faz-se a sua subclonagem num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a incluírem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.1/VAMP-l-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a 279 inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica o péptido VAMP-l-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). Esta inserção é subclonada, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-67 que é digerido com as endonucleases de restrição adequadas para proporcionar pQBI-67/VAMP-l-GFP. A mistura de ligação é transformada com células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um processo de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas depois numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. Faz-se o isolamento das construções elegíveis praticando um procedimento com uma minipreparação plasmídica para lise alcalina e faz-se a sua análise por mapeamento de digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem produz uma construção de expressão em mamíferos que codifica o VAMP-l-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pQBI-67.

2e. Construção de pQBl67/VAMP-2-GFP

Para se construir pQBI-67/VAMP-2-GFP, amplifica-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende o substrato de VAMP-2-GFP, conforme descrito na alínea 2b do Exemplo I, a partir de ADN de pQBI-25/VAMP-2-GFP, recorrendo ao método de reacção 280 e cadeia com polimerase, e faz-se a sua subclonagem num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a incluírem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.1/VAMP-2-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica o péptido VAMP-2-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). Esta inserção é subclonada, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-67 que é digerido com as endonucleases de restrição adequadas para proporcionar pQBI-67/VAMP-2-GFP. A mistura de ligação é transformada com células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um processo de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas depois numa incubadora a 37 "C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. Faz-se o isolamento das construções elegíveis praticando um procedimento com uma minipreparação plasmídica para lise alcalina e faz-se a sua análise por mapeamento de digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem produz uma construção de expressão em mamíferos 281 que codifica o VAMP-2-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pQBI-67.

2f. Construção de pQBl67/ VAMP-3-GFP

Para se construir pQBI-67/VAMP-3-GFP, amplifica-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende o substrato de VAMP-3-GFP, conforme descrito na alínea 2c do Exemplo I, a partir de ADN de pQBI-25/VAMP-3-GFP, recorrendo ao método de reacção e cadeia com polimerase, e faz-se a sua subclonagem num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a incluírem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.1/VAMP-3-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica o péptido VAMP-3-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA) . Esta inserção é subclonada, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-67 que é digerido com as endonucleases de restrição adequadas para proporcionar pQBI-67/VAMP-3-GFP. A mistura de ligação é transformada com células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um processo de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas depois numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As 282 bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. Faz-se o isolamento das construções elegíveis praticando um procedimento com uma minipreparação plasmídica para lise alcalina e faz-se a sua análise por mapeamento de digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem produz uma construção de expressão em mamíferos que codifica o VAMP-3-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pQBI-67. 3. Construção de substratos de BoNT/Cl Sintaxina

3a. Construção de pQBl25/Sintaxina-l-GFP

Para se fazer um substrato de Sintaxina-1 adequado aos métodos descritos na presente memória descritiva, far-se-á uma construção a pQBI-25/Sintaxina-l-GFP, praticando um procedimento de SOE-PCR. Um fragmento de ácido nucleico que compreende uma região que codifica os aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1) irá ser funcionalmente ligado, por SOE-PCR, a uma sequência de Sintaxina-1 que compreende uma região que codifica os aminoácidos 242-264 de SEQ ID NO: 66 e irá ser subclonado num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotidicos directo e inverso, utilizados para estas reacções, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.1/Sintaxina-l é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica os aminoácidos 85-120 283 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1) e os aminoácidos 242-264 de Sintaxina-1 (SEQ ID NO: 66); e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector a pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA). 0 fragmento de restrição resultante irá ser purificado utilizando o estojo de extracção em gel 'QIAquick' (QIAGEN, Inc., Valência, CA) e irá ser subclonado, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Irvine, CA) para se obter pQBI-25/Sintaxina-l-GFP. Esta estratégia de clonagem proporcionou uma construção de expressão pQBI-25 que codifica um domínio de endereçamento membranar SNAP-25 que compreende os aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 1), que é uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrídeo que compreende os aminoácidos 242-264 de Sintaxina-1 (SEQ ID NO: 66) e um GFP, todos eles funcionalmente ligados e adequados para detectar a actividade proveniente de BoNT/Cl. A localização subcelular dos substratos de Sintaxina-1-GFP e os seus produtos de clivagem irão ser analisados praticando procedimentos essencialmente idênticos aos anteriormente descritos na alínea lc do Exemplo I, com a excepção de a construção pQBI-25/Sintaxina-l-GFP, anteriormente descrita na alínea 2c do Exemplo I, ser utilizada em vez das construções de expressão que codificam SNAP-252o6~GFP. Além disso, irá ser utilizada uma construção de expressão adequada que codifica a cadeia leve de uma toxina adequada de clostrídeo, v.g.f irá ser utilizada a cadeia leve de BoNT/Cl em vez da construção pcDNA3.1-LC/A. 284

3b. Construção de pQBl67/Sintaxina-l-GFP

Para construir pQBI-67/Sintaxina-l-GFP, amplifica-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende o substrato de Sintaxina-l-GFP, conforme descrito na alínea 3a do Exemplo I, a partir de ADN de pQBI-25/Sintaxina-l-GFP, recorrendo ao método de reacção e cadeia com polimerase, e faz-se a sua subclonagem num vector pCR2.1, recorrendo ao método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a incluírem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos subsequentes de subclonagem. A construção resultante pCR2.1/Sintaxina-l-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica o péptido Sintaxina-l-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pQBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). Esta inserção é subclonada, utilizando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pQBI-67 que é digerido com as endonucleases de restrição adequadas para proporcionar pQBI-67/Sintaxina-l-GFP. A mistura de ligação é transformada com células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), praticando um processo de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas depois numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. Faz-se o isolamento das construções elegíveis 285 praticando um procedimento com uma minipreparação plasmidica para lise alcalina e faz-se a sua análise por mapeamento de digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem produz uma construção de expressão em mamíferos que codifica o Sintaxina-l-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pQBI-67.

EXEMPLO II

Identificação de linhagens de células com incorporação de elevada afinidade para os CoNT

Eventualmente, é de prever sensibilidades distintas a cada um dos serotipos de CoNT, com base nos sistemas receptores individuais, para cada toxina e serotipo de toxina diferentes e suas diferentes expressões em linhagens celulares diferentes. A presença de um sistema receptor de elevada afinidade numa célula para o CoNT pode ser caracterizada por meio de dois atributos: uma incorporação rápida da neurotoxina pela célula e uma diminuta concentração da neurotoxina necessária para a intoxicação da célula. Para se identificar uma linhagem celular com um sistema receptor de elevada afinidade para um CoNT, foram testadas linhagens celulares, recorrendo a um ou dois ensaios diferentes de clivagem in vitro, um deles para se determinar a quantidade de toxina necessária para a intoxicação, e o outro para se determinar o intervalo de tempo necessário para que a célula incorpore a neurotoxina. 286

1. Identificação de linhagens celulares com incorporação de elevada afinidade para BoNT/A la. Ensaio para se determinar a concentração de BoNT/A necessária para a intoxicação da célula

Para se avaliar a quantidade de BoNT/A necessária para intoxicar uma célula, pesquisou-se um painel de linhagens celulares de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a concentração de toxina necessária para clivar SNAP-25 expresso endogenamente (ver quadro 13). Fez-se uma aplicação de células de cada linhagem, com uma densidade adequada desse inoculo, em cavidades individuais de placas de 6 cavidades de cultura de tecidos, recobertas com poli-D-lisina/laminina, contendo 3 mL de um meio adequado (ver o quadro 13) e depois ficaram a desenvolver-se numa incubadora a 37 °C em atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. Adicionou-se BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI) , em diferentes concentrações (0 nM, 1 nM, 5 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM), ao meio de cultura que continha as células, durante aproximadamente 8 horas ou aproximadamente 16 horas. As células foram recolhidas depois em tubos de 15 mL, lavadas uma vez com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois foram transferidas para tubos de microcentrifugação de 1,5 mL. Efectuou-se a lise celular em 0,5 mL de tampão de lise contendo N- (2-hidroxietil) piperazina-iV- (2-ácido etano-sulfónico) (HEPES) 50 raM, pH 6,8, cloreto de sódio 150 mM, cloreto de magnésio 1,5 mM, etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N,N, Ν', N' -ácido tetracético (EGTA) 1 mM, 10% de glicerol e 1% (v/v) de

Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol), com rotação 287 durante 1 hora a 4°C. As células desmembradas por citólise foram centrifugadas a 5000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para eliminação de resíduos e depois os sobrenadantes foram transferidos para tubos siliconizados limpos. Efectuou-se a medição das concentrações das proteínas pelo método de Bradford e com elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostra 1 x SDS com uma concentração de 1 mg/mL ou superior.

Quadro 13 Condições de Cultura para as Linhagens de Células Linhagem celular Meios de cultura completos Condições de passagem Densidade do inoculo (células/mm2) SK-N-DZ 90% DMEM, A Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:4 efectuada em cada 2-3 dias 4,25 x 103 SK-N-F1 90% DMEM, A Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:4 efectuada duas vezes por semana 4,25 x 103 SK-N-SH F12 de Ham, DMEM, ou EMEM, B Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:20 efectuada em cada 4-7 dias 4,25 x 103

Quadro 13 Condições de Cultura para as Linhagens de Células Linhagem celular Meios de cultura completos Condições de passagem Densidade do inoculo (células/mm2) SH-SY5Y EMEM e F12 de Ham 1:1, C Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:6 efectuada em cada 2-3 dias 4,25 x 103 SK-N-BE (2) EMEM e F12 de Ham 1:1, D Tratamento com tripsina/EDTA, redução em cada 3 dias 4,25 x 103 BE(2)-C EMEM e F12 de Ham 1:1, D Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:4 efectuada em cada 2-3 dias 4,25 x 103 BE(2)-Ml7 EMEM e F12 de Ham 1:1, D Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:20 efectuada em cada 4-7 dias 4,25 x 103 Neuro-2a EMEM, E Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 C1300 RPMI, 1640, B Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 289

Quadro 13 Condições de Cultura para as Linhagens de Células Linhagem celular Meios de cultura completos Condições de passagem Densidade do inoculo (células/mm2) NB4 1A3 FIO de Ham, F Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 N1E-115 DMEM, G Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 NG108-15 DMEM, B Redução da diluição à razão de 1:4 efectuada em cada 1,2 dias 4,25 x 103 HCN-1A DMEM, H Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 HCN-2 DMEM, H Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 TE 189.T DMEM, H Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 290Quadro 13Condições de Cultura para as Linhagens de Células

Linhagem Meios de Condições de passagem Densidade do celular cultura completos inoculo (células/mm2) ND8/34 DMEM, B Tratamento com tripsina/EDTA, redução da diluição à razão de 1:3 efectuada em cada 3 dias 4,25 x 103 A. contém bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L,

aminoácidos não essenciais (NEAA) 0,1 mM, glutamina 4 mM e 10% de soro de vitelo fetal (FCS) B. contém glutamina 2 mM e 10% de FCS C. contém bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, NEAA 0,1 mM, glutamina 4 mM, 1% de piruvato de sódio, 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) e 10% de FCS D. contém NEAA 0,1 mM, glutamina 4 mM e 10% de FCS E. contém bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, NEAA 0,1 mM, glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM e 10% de FCS F. contém glutamina 2 mM, 15% de soro de cavalo e 2,5% de FCS G. contém glicose na concentração de 4,5 g/L e 10% de FCS H. contém glicose 4 mM e 10% de FCS O meio de congelação é constituído por 95% de meio de cultura e 5% de DMSO

Para se detectar a presença de um substrato de BoNT/A clivado, manteve-se as amostras em ebulição durante 5 minutos, tendo sido separadas aliquotas de 40 pL por electroforese em gel de poliacrilamida com MOPS, utilizando geles de poliacrilamida de pré-moldagem 'NuPAGE® Novex 4-12°C Bis-Tris' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) em condições desnaturantes e redutoras. Os péptidos separados foram 291 transferidos do gel para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), por Western blot, utilizando um aparelho electroforético de transferência de células em ambiente semi-anidro 'Trans-Blot® SD' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As membranas de PVDF foram bloqueadas por incubação, à temperatura ambiente, durante 2 horas, numa solução que continha soluto salino tamponado com Tris 25 mM (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol/ácido clorídrico 25 mM (Tris-HC1) (pH 7,4), cloreto de sódio 137 mM, cloreto de potássio 2,7 mM), 0,1% de TWEEN-20®, polioxietileno (20)-monolaureato de sorbitano, 2% de albumina do soro de bovino e 5% de leite em pó desnatado. As membranas bloqueadas ficaram a incubar a 4°C, de um dia para outro, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20® (soluto salino tamponado com Tris 25 mM, 0,1% de TWEEN-20®, polioxietileno (20)-monolaureato de sorbitano), contendo uma diluição a 1:5 000 de pAb policlonal anti-soro anti-SNAP25 de coelho, anti-SNAP25197 #1, que é um anticorpo policlonal especifico para o produto de clivagem SNAP25i97 e que não desenvolve reacções secundárias com o SNAP25206 de comprimento completo (Allergan, Inc., gerado, ao abrigo de um contrato com 'Zymed Laboratories Inc.', South San Francisco, CA) . Os blots sondados com anticorpo primário foram lavados três vezes, durante 15 minutos de cada vez, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20®. As membranas lavadas ficaram a incubar à temperatura ambiente durante 2 horas em solução salina tamponada com Tris, contendo TWEEN-20®' contendo uma diluição a 1:20 000 do anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de coelho, acadeias leve e pesada (IgG, H+L) anticorpo conjugado com peroxidase de 292 rábano como anticorpo secundário (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) .Os blots sondados com o anticorpo secundário foram lavados três vezes, durante 15 minutos de cada vez, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20®. A detecção do sinal do produto marcado resultante da clivagem de BoNT/A SNAP25i97 foi visualizada utilizando o sistema de detecção para Western Blots 'ECL Plus™' (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) , tendo sido obtida uma imagem da membrana e tendo sido feita uma quantificação do produto de clivagem com o transformador de imagem 'Typhoon 9410' a trabalhar em modo variável e utilizando uma aplicação informática para análise de imagens (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . A escolha do número de pixel (100 a 200 pixel) e os valores de regulação PMT para a tensão eléctrica (350 a 600, normalmente 400) foram definidos para cada um dos blots. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97 nas linhas de células SH-SY5Y, NG108-15, N1E-115, Neuro-2A e SK-N-BE(2) decorrido pelo menos um período de 8 horas de incubação, pelo menos com BoNT/A 5 nM, indicando isso a aptidão de BoNT/A para intoxicar estas linhas de células (ver a figura 7a). A linha de células do neuroblastoma de murganho 'Neuro-2A' foi ainda analisada com concentrações menores de BoNT/A para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o SNAP-25 expresso endogenamente. As células ficaram a desenvolver-se em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo I. Acrescentou-se BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI), em concentrações diferentes (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 293 nM e 20 ηΜ) , ao meio de cultura que continha as células, quer durante um período aproximadamente igual a 8 horas quer durante um período aproximadamente igual a 16 horas. As células tratadas com a toxina foram colhidas e desmembradas por citólise conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Determinou-se a presença do produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97 recorrendo ao método de análise por Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97' na linhagem de células Neuro-2A ao fim de um período de incubação pelo menos igual a 8 horas, utilizando pelo menos BoNT/A 0,5 nM, indicando isso a aptidão de BoNT/A para intoxicar estas linhagens de células (ver a figura 7c).

IJb. Ensaio para determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore BoNT/A

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore BoNT/A, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a duração de exposição à toxina necessária para clivar SNAP-25 expresso endogenamente. O desenvolvimento das células de cada linhagem foi feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la 294 do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97 por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97 nas linhagens celulares Neuro-2A, SH-SY5Y e NG108-15 após um período de incubação não inferior a 8 horas com BoNT/A 1 nM, indicando isso a aptidão destas linhagens de células para incorporem rapidamente BoNT/A (ver a figura 7b).

2. Identificação das linhagens de células com uma incorporação de elevada afinidade para BoNT/B 2a. Ensaio para se determinar a concentração de BoNT/B necessária para a intoxicação das células

Com a finalidade de se avaliar a quantidade de BoNT/B necessária para intoxicar uma linhagem de células, irá ser pesquisado um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente (ver o quadro 13) . 0 desenvolvimento das células terá lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Será acrescentado BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM e 100 nM) aos meios de cultura que contêm as células, quer durante um período aproximado de 8 horas quer durante um período aproximado de 16 horas. As células irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. 295

Para se detectar a presença de um substrato de BoNT/B clivado, serão feitas análises de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II, com a excepção de as membranas de PVDF bloqueadas virem a ser incubadas numa solução de anticorpos primários contendo um dos anticorpos a seguir indicados, com a finalidade de se detectar um produto de clivagem de BoNT/B VAMP, em vez do pAb policlonal antissérico anti-SNAP25 de coelho, designado por pAb anti-SNAP25197 #1: 1) uma diluição a 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-1 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); 2) uma diluição 1:20 000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-2 de murganho, clone Cl 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); ou 3) uma diluição a 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-3 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha). Além disso, utilizar-se-á uma solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) , em vez de anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP. A detecção de um produto de clivagem de BoNT/B VAMP numa linha de células, ao fim de um período não inferior a 8 horas de incubação, pelo menos com BoNT/B 20 nM, irá indicar a aptidão de BoNT/B para intoxicar estas linhagens de células. 296

2b. Ensaio para se determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore BoNT/B

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore BoNT/B, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a duração de exposição à toxina, necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente. 0 desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea 2a do Exemplo II. Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 2a do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/B VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 2a do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/B VAMP nas linhagens celulares após um período de incubação não inferior a 8 horas com BoNT/B 1 nM, indicando isso a aptidão destas linhas de células para incorporem rapidamente BoNT/B. 3. Identificação de linhagens de células com incorporação de elevada afinidade para BoNT/Cl 3a. Ensaio para determinar a concentração de BoNT/Cl necessária para a intoxicação das células 297

Com a finalidade de se avaliar a quantidade de BoNT/Cl necessária para intoxicar uma linhagem de células, irá ser pesquisado um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o SNAP-25 expresso endogenamente ou a Sintaxina expressa endogenamente (ver o quadro 13) . 0 desenvolvimento das células terá lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Será acrescentado BoNT/Cl (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 2 0 nM e 100 nM) aos meios de cultura contendo células, quer durante um período aproximado de 8 horas quer durante um período aproximado de 16 horas. As células irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II.

Para se detectar a presença de um substrato de BoNT/Cl clivado, serão feitas análises de trasnferência Western, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II, com a excepção seguinte: 1) as membranas de PVDF bloqueadas irão ser incubadas numa solução de anticorpos primários contendo uma diluição a 1:50 000 de anticorpo monoclonal anti-SNAP-25 de murganho (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD), em vez do anticorpo policlonal anti-sérico anti-SNAP25 de coelho, pAb anti-SNAP25197 #1 e numa solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L) , anticorpo conjugado com peroxidase de rábano (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), em vez de anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP, com a 298 finalidade de se detectar um produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP25i88; 2) as membranas de PVDF bloqueadas irão ser incubadas numa solução de anticorpos primários contendo uma diluição a 1:5000 de anticorpo monoclonal de murganho anti-Sintaxina-1, clone Cl 78.2 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha), em vez do anticorpo antissérico policlonal de coelho anti-SNAP25, pAb anti-SNAP25197 #1 e uma solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano(HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) , em vez de anticorpos policlonais anti-IgG de coelho-HRP, com a finalidade de se detectar um produto de clivagem de BoNT/Cl Sintaxina. A detecção de um produto de clivagem de SNAP25i98 numa linhagem de células ao fim de um período não inferior a 8 horas de incubação com BoNT/Cl com uma concentração pelo menos 20 nM irá indicar a aptidão de BoNT/Cl para intoxicar estas linhagens de células. A detecção de um produto de clivagem de Sintaxina numa linhagem de células ao fim de um período de incubação não inferior a 8 horas com BoNT/Cl com uma concentração pelo menos 20 nM irá indicar a aptidão de BoNT/Cl para intoxicar estas linhagens de células. 3b. Ensaio para se determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore BoNT/Cl

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore BoNT/Cl, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a duração de exposição à toxina necessária para clivar o SNAP-25 expresso endogenamente ou 299 a Sintaxina expressa endogenamente. 0 desenvolvimento das células irá ser feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II. Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de BoNT/Cl (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP25i98 e de um produto de clivagem de BoNT/Cl Sintaxina por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II. A detecção de um produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP25i98 numa linhagem de células, ao fim de um período de incubação não inferior a 8 horas com BoNT/Cl 1 nM, irá indicar a existência de uma linhagem celular gue consegue incorporar rapidamente BoNT/Cl. A detecção de um produto de clivagem de BoNT/Cl Sintaxina numa linhagem de células, ao fim de um período de incubação não inferior a 8 horas com BoNT/Cl 1 nM irá indicar a existência de uma linhagem de células que consegue incorporar rapidamente BoNT/Cl.

4. Identificação de linhagens de células com incorporação de elevada afinidade para BoNT/D 4a. Ensaio para se determinar a concentração de BoNT/D necessária para a intoxicação das células

Com a finalidade de se avaliar a quantidade de BoNT/D necessária para intoxicar uma linhagem de células irá ser pesquisado um painel de linhagens de células de mamíferos, 300 de origem neuronal, para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente (ver o quadro 13) . O desenvolvimento das células terá lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Será acrescentado BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM e 100 nM) aos meios de cultura contendo células, quer durante um período aproximado de 8 horas quer durante um período aproximado de 16 horas. As células irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II.

Para se detectar a presença de um substrato de BoNT/D clivado, serão feitas análises de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II, com a excepção de as membranas de PVDF bloqueadas virem a ser incubadas numa solução de anticorpos primários contendo um dos anticorpos a seguir indicados, com a finalidade de se detectar um produto de clivagem de BoNT/D VAMP, em vez do pAb policlonal antissérico anti-SNAP25 de coelho, designado por pAb antÍ-SNAP25197 #1: 1) uma diluição a 1 : 1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-1 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); 2) uma diluição 1:20 000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-2 de murganho, clone Cl 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); ou 3) uma diluição a 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-3 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha). Além disso, utilizar-se-á uma solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de 301 murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano(HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) em vez de anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP. A detecção de um produto de clivagem de BoNT/D VAMP numa linhagem de células, ao fim de um período não inferior a 8 horas de incubação, pelo menos com BoNT/D 20 nM, irá indicar a aptidão de BoNT/D para intoxicar estas linhagens de células.

4b. Ensaio para se determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore BoNT/D

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore BoNT/D, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a duração de exposição à toxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente. O desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea 4a do Exemplo II. Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 4a do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/D VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 4a do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/D VAMP nas linhagens celulares após um período de incubação não 302 inferior a 8 horas com BoNT/D 1 nM, indicando isso a aptidão destas linhagens de células para incorporem rapidamente BoNT/D.

5. Identificação de linhagens de células com incorporação de elevada afinidade para BoNT/E 5a. Ensaio para se determinar a concentração de BoNT/E necessária para a intoxicação das células

Com a finalidade de se avaliar a quantidade de BoNT/E necessária para intoxicar uma linhagem de células, irá ser pesquisado um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o SNAP-25 expresso endogenamente (ver o quadro 13) . A partir de cada linhagem celular foram obtidas células com uma densidade adequada que foram aplicadas em cada uma das cavidades de placas de cultura de tecidos de 6 cavidades, contendo 3 mL de um meio conveniente (ver o quadro 13) , recobertas com poli-D-lisina/laminina, que ficaram a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 24 horas. Acrescentou-se BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 2 nM ou 20 nM) aos meios de cultura que continham as células, quer durante aproximadamente 6 horas quer durante aproximadamente 16 horas. As células foram recolhidas em tubos de 15 mL, lavadas uma vez com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4, e depois foram transferidas para tubos de microcentrifugação de 1,5 mL. Fez-se o desmembramento das células por citólise em 0,5 mL de tampão de citólise 303 contendo N- (2-hidroxietil) piperazina-iV'-(ácido 2-etano sulfónico) (HEPES) 50 mM, a pH 6,8, cloreto de sódio 150 mM, cloreto de magnésio 1,5 mM, etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N, N, Ν', N' -ácido tetracético (EGTA) 1 mM, 10% de glicerol e 1% (v/v) de Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol), com rotação durante 1 hora a 4°C. As células desmembradas por citólise foram centrifugadas a 5000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para eliminar os resíduos e depois os sobrenadantes foram transferidos para tubos siliconizados limpos. Efectuou-se a medição das concentrações proteínicas pelo processo de Bradford e com elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostragem 1 x SDS com uma concentração de 1 mg/mL ou superior.

Para se detectar a presença de um substrato de BoNT/E clivado efectuou-se a análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II, com excepção das membranas de PVDF bloqueadas terem ficado a incubar numa solução de anticorpos primários contendo uma diluição a 1:50 000 de anticorpo monoclonal anti-SNAP-25 de murganho (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) em vez do anticorpo policlonal antissérico de coelho anti-SNAP25, pAb anti-SNAP25197 #1 e numa solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano(HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) em vez do anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP, para se detectar um produto de clivagem de BoNT/E SNAP25i80. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/E SNAP25iso nas linhagens de células Neuro-2A, SH-SY5Y, N1E-115, SK-N—BE(2), NG108-15, SK-N-DZ e BE(2)-C ao fim de 304 um período de incubação não inferior a 6 horas, com BoNT/E pelo menos 20 nM, o que indica a aptidão de BoNT/E para intoxicar estas linhagens de células (ver a figura 8a).

Analisou-se também a linhagem de células do neuroblastoma humano SK-N-DZ, com concentrações menores de BoNT/E para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o SNAP-25 expresso endogenamente. O desenvolvimento das células decorreu em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito na alínea 5a do Exemplo II. Acrescentou-se BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 2 nM e 5 nM) aos meios de cultura que continham as células, durante aproximadamente 6 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 5a do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivaqem de BoNT/E SNAP25iso por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 5a do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/E SNAP25iso na linhagem de células SK-N-DZ ao fim de um período de incubação não inferior a 6 horas com BoNT/E numa concentração não inferior a 0,1 nM, indicando isto a aptidão de BoNT/E para intoxicar estas linhagens de células (ver a figura 8c) .

5b. Ensaio para se determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore BoNT/E

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore BoNT/E, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, 305 para se determinar a duração de exposição à toxina necessária para clivar SNAP-25 expressa endogenamente (ver o quadro 13). 0 desenvolvimento das células de cada linhagem foi feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea 5a do Exemplo II. Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alinea 5a do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/E SNAP25i8o por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 5a do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/E SNAP25i8o nas linhagens celulares Neuro-2A, SH-SY5Y e NG108-15 após um período de incubação não inferior a 6 horas com BoNT/E 1 nM, indicando isso a aptidão destas linhagens de células para incorporem rapidamente BoNT/E (ver a figura 8b).

6. Identificação das linhagens de células com incorporação de elevada afinidade para BoNT/F 6a. Ensaio para se determinar a concentração de BoNT/F necessária para a intoxicação das células

Com a finalidade de se avaliar a quantidade de BoNT/F necessária para intoxicar uma linhagem de células irá ser pesquisado um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente (ver o quadro 13) . O desenvolvimento das 306 células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Será acrescentado BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM e 100 nM) aos meios de cultura que contém as células, quer durante um período aproximado de 8 horas quer durante um período aproximado de 16 horas. As células irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II.

Para se detectar a presença de um substrato de BoNT/F clivado, serão feitas análises de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II, com a excepção de as membranas de PVDF bloqueadas virem a ser incubadas numa solução de anticorpos primários contendo um dos anticorpos a seguir indicados, com a finalidade de se detectar um produto de clivagem de BoNT/F VAMP, em vez do pAb policlonal antissérico anti-SNAP25 de coelho, designado por pAb anti-SNAP25197 #1: 1) uma diluição a 1 : 1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-1 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); 2) uma diluição 1:20 000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-2 de murganho, clone Cl 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); ou 3) uma diluição a 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-3 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha). Além disso, utilizar-se-á uma solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano(HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) em vez de anticorpo 307 policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP. A detecção de um produto de clivagem de BoNT/F VAMP numa linhagem de células, ao fim de um periodo não inferior a 8 horas de incubação, com BoNT/F pelo menos 20 nM, irá indicar a aptidão de BoNT/F para intoxicar estas linhagens de células.

6b. Ensaio para se determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore BoNT/F

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore BoNT/F, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a duração de exposição à toxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente. O desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea 6a do Exemplo II. Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 6a do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/F VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 6a do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/F VAMP nas linhagens celulares após um período de incubação não inferior a 8 horas com BoNT/F 1 nM, indicando isso a aptidão destas linhagens de células para incorporem rapidamente BoNT/F. 308

7. Identificação de linhagens de células com incorporação de elevada afinidade para BoNT/G 7a. Ensaio para se determinar a concentração de BoNT/G necessária para a intoxicação das células

Com a finalidade de se avaliar a quantidade de BoNT/G necessária para intoxicar uma linhagem de células irá ser pesquisado um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente (ver o quadro 13) . O desenvolvimento das células terá lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Será acrescentado BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM e 100 nM) aos meios de cultura que contêm as células, quer durante um período aproximado de 8 horas quer durante um período aproximado de 16 horas. As células irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II.

Para se detectar a presença de um substrato de BoNT/G clivado, serão feitas análises de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II, com a excepção de as membranas de PVDF bloqueadas virem a ser incubadas numa solução de anticorpos primários contendo um dos anticorpos a seguir indicados, com a finalidade de se detectar um produto de clivagem de BoNT/G VAMP, em vez do pAb policlonal antissérico anti-SNAP25 de coelho, designado por pAb anti-SNAP25197 #1: 1) uma diluição a 1 : 1000 de 309 anticorpo monoclonal anti-VAMP-1 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); 2) uma diluição 1:20 000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-2 de murganho, clone Cl 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); ou 3) uma diluição a 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-3 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha). Além disso, utilizar-se-á uma solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano(HRP; Pierce

Biotechnology, Inc., Rockford, IL) em vez de anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP. A detecção de um produto de clivagem de BoNT/G VAMP numa linhagem de células, ao fim de um período não inferior a 8 horas de incubação, com BoNT/G pelo menos 20 nM irá indicar a aptidão de BoNT/G para intoxicar estas linhagens de células.

7b. Ensaio para se determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore BoNT/G

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore BoNT/G, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a duração de exposição à toxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente. O desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea 7a do Exemplo II.

Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura 310 durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 7a do Exemplo II. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/G VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 7a do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de BoNT/G VAMP nas linhagens celulares após um período de incubação não inferior a 8 horas com BoNT/G 1 nM, indicando isso a aptidão destas linhagens de células para incorporem rapidamente BoNT/G.

8. Identificação de linhagens de células com incorporação de elevada afinidade para TeNT 8a. Ensaio para se determinar a concentração de TeNT necessária para a intoxicação das células

Com a finalidade de se avaliar a quantidade de TeNT necessária para intoxicar uma linhagem de células irá ser pesquisado um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a concentração de neurotoxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente (ver o quadro 13) . O desenvolvimento das células terá lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Será acrescentado TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM e 100 nM) aos meios de cultura que contêm as células, quer durante um período aproximado de 8 horas quer durante um período 311 aproximado de 16 horas. As células irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II.

Para se detectar a presença de um substrato de TeNT clivado, serão feitas análises de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II, com a excepção de as membranas de PVDF bloqueadas virem a ser incubadas numa solução de anticorpos primários contendo um dos anticorpos a seguir indicados, com a finalidade de se detectar um produto de clivagem de TeNT VAMP, em vez do pAb policlonal antisérico anti-SNAP25 de coelho, designado por pAb anti-SNAP25197 #1: 1) uma diluição a 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-1 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); 2) uma diluição 1:20 000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-2 de murganho, clone Cl 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha); ou 3) uma diluição a 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-VAMP-3 de murganho, clone Cl 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha). Além disso, utilizar-se-á uma solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano(HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) em vez de anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP. A detecção de um produto de clivagem de TeNT VAMP numa linhagem de células, ao fim de um período não inferior a 8 horas de incubação, com TeNT pelo menos 20 nM irá indicar a aptidão de TeNT para intoxicar estas linhagens de células. 312

8b. Ensaio para se determinar o tempo necessário para que uma célula incorpore TeNT

Para se avaliar o tempo necessário para que uma linhagem celular incorpore TeNT, pesquisou-se um painel de linhagens de células de mamíferos, de origem neuronal, para se determinar a duração de exposição à toxina necessária para clivar o VAMP expresso endogenamente. 0 desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, conforme descrito anteriormente na alínea 8a do Exemplo II.

Acrescentou-se aproximadamente 1 nM de TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) ao meio de cultura durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas ou 16 horas. As células tratadas com toxina foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 8a do Exemplo II.

Determinou-se a presença de um produto de clivagem de TeNT VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 8a do Exemplo II. Detectou-se um produto de clivagem de TeNT VAMP nas linhagens celulares após um período de incubação não inferior a 8 horas com TeNT 1 nM, indicando isso a aptidão destas linhagens de células para incorporem rapidamente TeNT.

EXEMPLO III

Tratamentos para aumentar, numa célula, a incorporação de toxina de clostrideo

Os gangliósidos são uma parte do sistema receptor para as toxinas de clostrideo e presume-se que participam na ligação de uma toxina ao seu sistema receptor. Embora a 313 ligação da toxina não esteja rigorosamente dependente da presença de gangliósidos, presume-se que seja necessária a presença de gangliósidos específicos para que haja uma ligação de elevada afinidade. Em particular, verificou-se que os CoNT interactuam in vitro e in vivo com os polissialogangliósidos, em especial com os das séries Glb (GDla, GDlb, GD3, GQlb ou GTlb), ver, v.g., Jane L. Halpern & Elaine A. Neale, Neurospecific binding, internalization, and retrograde axonal transport, 195 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 221-241 (1995). De igual modo, o estado diferenciado de uma célula poderia influenciar a expressão ou o nível de expressão de componentes importantes de um sistema receptor de toxinas de clostrídeo, tal como, v.g., um receptor da superfície celular. Por exemplo, as células Neuro-2A e SH-SY5Y podem ser diferenciadas para adquirirem um fenótipo de tipo neuronal que possa facilitar a incorporação de toxinas. Para se determinar se poderíamos aumentar a incorporação de uma toxina de clostrídeo numa célula particular, efectuámos as seguintes experiências: 1) verificar se o tratamento que aumenta o teor em gangliósidos na membrana celular faz com que a célula aumente a incorporação de uma toxina de clostrídeo; e 2) verificar se as modificações do estado de diferenciação de uma célula podem fazer com que haja um aumento de incorporação de uma toxina de clostrídeo pela célula. 1. Identificação dos tratamentos que fazem aumentar a incorporação de BoNT/A por uma célula la. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/A por uma célula 314

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de BoNT/A para intoxicar uma célula, efectuou-se um tratamento prévio de uma linhagem de células Neuro-2A com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguiriam aumentar a incorporação de BoNT/A por tais células. As células Neuro-2A foram distribuídas por placas, com uma densidade conveniente, em cada uma das cavidades de placas de cultura de tecidos de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, contendo 3 mL de um meio conveniente (ver o quadro 13), tendo o seu desenvolvimento decorrido a 37°C numa incubadora sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas aproximadamente 24 horas, substitui-se o meio por outros meios isentos de soro e acrescentou-se a cada uma das cavidades, na concentração de 25 pg/mL, cada um dos seguintes gangliósidos: GDla, GDlb, GD3, GQlb ou GTlb (AXXORA, LLC, San Diego, CA) . Após um período de incubação a 37 °C, de um dia para o outro, as células tratadas com os gangliósidos foram lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4, tendo depois ficado a incubar a 37°C com meios contendo 1% de soro em que havia concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) de BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI), durante aproximadamente 8 horas ou aproximadamente 16 horas. Efectuou-se a colheita das células para dentro de tubos de 15 mL, tendo sido lavadas uma vez com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4, e depois foram transferidas para tubos de microcentrifugação de 1,5 mL. Efectuou-se o desmembramento das células por citólise em 0,5 mL de tampão de citólise contendo N- (2-hidroxietil) piperazina-Af-(2-ácido etano-sulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 315 6,8, cloreto de sódio 150 mM, cloreto de magnésio 1,5 mM, etilenoglicol-bis(β-éter aminoetilico)-N,N, Ν', N' -ácido tetracético (EGTA) 1 mM, 10% de glicerol e 1% (v/v) de Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol), com rotação durante 1 hora a 4°C. As células desmembradas por citólise foram centrifugadas a 5000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para se eliminar os detritos e efectuou-se a transferência dos sobrenadantes para tubos siliconizados limpos. Efectuou-se a medição das concentrações das proteínas pelo método de Bradford e com elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostragem 1 x SDS com uma concentração de 1 mg/mL ou superior. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97 por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo II. Detectou-se um aumento no produto de clivagem de BoNT/A SNAP2 5i97 na linhagem de células Neuro-2A tratadas com o gangliósido GTlb, o que indica que o tratamento com GTlb consegue aumentar a incorporação de BoNT/A pelas células da linhagem Neuro-2A (ver a figura 9a). lb. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/A por uma célula

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de BoNT/A para intoxicar uma célula, efectuou-se o tratamento de células Neuro-2A e SH-SY5Y em diferentes condições de desenvolvimento ou com diversos reagentes de diferenciação para se determinar se a diferenciação destas células poderia ter como resultado um aumento da incorporação de BoNT/A por tais células. As células foram aplicadas, com uma densidade conveniente, em 316 cada uma das cavidades de placas de cultura de tecidos de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina contendo 3 mL de um meio adequado (ver o quadro 13) e ficaram a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas aproximadamente 24 horas, substituiu-se o meio por meios de cultura isentos de soro ou por meios contendo 10% de soro e acrescentou-se a cada uma das cavidades um dos seguintes reagentes de diferenciação: 0,2 unidade de Neuraminidase de tipo V (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em água contendo 0,2% de ALBUMAX II (Invitrogen, Inc., Carlsbad, °CA); ácido todo trans-retinóico 20 μΜ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); sal sódico de 3': 5'-monofosfato cíclico de N6, 2'-O-dibutiriladenosina 1 mM (db-cAMP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); sal cálcico de lonomicina 1 μΜ (Molecular Probes, Eugene, OR) em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); ou suplemento lx N-2 (Invitrogen, Inc., 17502-048, Carlsbad, CA). Decorrido um período de três dias de incubação a 37 °C, as células dos meios isentos de soro e as células tratadas com os reagentes foram lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois ficaram a incubar a 37°C, quer com os meios isentos de soro que continham toxina Pure A (BTX-540) na concentração de 2 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências nas condições de desenvolvimento), quer com os meios com 10% de soro contendo a toxina Pure A (BTX-540) na concentração de 2 nM (Metabiologics, Inc.. Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências com reagentes de diferenciação). Efectuou-se a colheita das células por tratamento com 317 tripsina, tendo sido colhidas em tubos de 15 mL para depois serem lavadas uma vez com 1 mL de soluto salino tamponado de fosfato a pH 7,4, sendo posteriormente transferidas para tubos de microcentrifugação de 1,5 mL. Efectuou-se o desmembramento das células em 0,5 mL de tampão de citólise contendo N- (2-hidroxietil) piperazina-Af-(2-ácido etano-sulfónico) (HEPES) 50 mM, a pH 6,8, cloreto de sódio 150 mM, cloreto de magnésio 1,5 mM, etilenoglicol-bis(β-éter aminoet ilico) -N, N, Ν', N' -ácido tetracético (EGTA) 1 mM, 10% de glicerol e 1% (v/v) de Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol) , com rotação durante 1 a 2 horas a 4°C. As células desmembradas por citólise foram centrifugadas a 5000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para se eliminar os detritos e depois os sobrenadantes foram transferidos para tubos siliconizados limpos de 1,5 mL. Efectuou-se a medição das concentrações das proteínas pelo processo de Bradford e com elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostragem 1 x SDS com uma concentração de 1 mg/mL ou superior. Determinou-se a presença de um produto de clivagem BoNT/A SNAP2 5i97 por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo I, com a excepção de as membranas de PVDF bloqueadas terem ficado a incubar numa solução de anticorpos primários contendo uma diluição a 1:50 000 de anticorpo monoclonal anti-SNAP-25 de murganho (SMI-81; Sternberger Monoclonals, LulheNille, MD) em vez do anticorpo policlonal antissérico anti-SNAP25 de coelho, pAb anti-SNAP25197 #1 e numa solução de anticorpos secundários contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano(HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) em 318 vez do anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de coelho-HRP, para se detectar quer o produto não clivado SNAP-25, quer o produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97. Detectou-se um aumento de produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97 nas células Neuro-2A e SH-SY5Y diferenciadas em condições isentas de soro, comparativamente com os meios com 10% de soro, indicando isso que as condições dos meios isentos de soro conseguem aumentar a incorporação de BoNT/A pelas células Neuro-2A e SH-SY5Y (ver a figura 9b) . De igual modo, detectou-se um aumento de produto de clivagem de BoNT/A SNAP25i97 nas células Neuro-2A tratadas com ácido todo trans-retinóico, indicando isso que a diferenciação induzida pelo ácido retinóico nas células Neuro-2A consegue aumentar a incorporação de BoNT/A por estas células (ver a figura 9b). 2. Identificação dos tratamentos que aumentaram a incorporação de BoNT/B por uma célula 2a. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/B por uma célula

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de BoNT/B para intoxicar uma célula, far-se-á o tratamento prévio de células adequadas de mamíferos com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguem aumentar a incorporação de BoNT/B por tais células. O desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, sendo tratadas com gangliósidos conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. As células tratadas com os gangliósidos irão ficar a incubar 319 com BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) em meios contendo 1% de soro, durante aproximadamente 8 horas ou durante aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/B VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 2a do Exemplo II. O aumento de produto de clivagem de BoNT/B VAMP, detectado na linhagem de células tratadas com um gangliósido, irá indicar que o tratamento com esse gangliósido consegue aumentar a incorporação de BoNT/B por tais células. 2b. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/B por uma célula

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de BoNT/B para intoxicar uma célula, efectuar-se-á o tratamento de células adequadas de mamíferos em diferentes condições de desenvolvimento ou com diversos reagentes de diferenciação para se determinar se a diferenciação destas células pode ter como resultado o aumento da incorporação de BoNT/B por tais células. O desenvolvimento das células irá ser feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, utilizando quer meios isentos de soro quer meios com 10% de soro tratados com reagentes de diferenciação, conforme descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. Decorrido um período de três dias de incubação a 37 °C, as células dos meios isentos de soro e as células tratadas com os 320 reagentes irão ser lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois irão ficar a incubar a 37 °C quer com meios isentos de soro contendo BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências nas condições de desenvolvimento) , quer com meios com 10% de soro contendo BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências com os reagentes de diferenciação). As células foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/B VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 2a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/B VAMP, detectado nas células desenvolvidas nos meios isentos de soro, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/B por tais células. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/B VAMP, detectado em células tratadas com um reagente de diferenciação, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/B por tais células. 3. Identificação dos tratamentos que aumentam a incorporação de BoNT/Cl por uma célula 3a. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/Cl por uma célula

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de BoNT/Cl para intoxicar uma célula, far-se-á o tratamento prévio de células adequadas 321 de mamíferos com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguem aumentar a incorporação de BoNT/Cl por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, sendo tratadas com gangliósidos, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. As células tratadas com os gangliósidos irão ficar a incubar com BoNT/Cl (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) em meios contendo 1% de soro, durante aproximadamente 8 horas ou durante aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP25i97 por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/Cl Sintaxina por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP25i8cu detectado na linhagem de células tratadas com um gangliósido, irá indicar que o tratamento com esse gangliósido consegue aumentar a incorporação de BoNT/Cl por tais células. Um aumento de clivagem de BoNT/Cl Sintaxina, detectado na linhagem de células com um gangliósido, irá indicar que o tratamento com esse gangliósido consegue aumentar a incorporação de BoNT/Cl por tais células 3b. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/Cl por ima célula 322

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de BoNT/Cl para intoxicar uma célula, efectuar-se-á o tratamento de células adequadas de mamíferos em diferentes condições de desenvolvimento ou com diversos reagentes de diferenciação para se determinar se a diferenciação destas células pode ter como resultado o aumento da incorporação de BoNT/Cl por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ser feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, utilizando quer meios isentos de soro quer meios com 10% de soro tratados com reagentes de diferenciação, conforme descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. Decorrido um período de três dias de incubação a 37 °C, as células dos meios isentos de soro e as células tratadas com os reagentes irão ser lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois irão ficar a incubar a 37°C, quer com meios isentos de soro contendo BoNT/Cl (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências nas condições de desenvolvimento) , quer com meios com 10% de soro contendo BoNT/Cl (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências com os reagentes de diferenciação). As células foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP25iso por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II. A presença de um produto de clivagem de BoNT/Cl Sintaxina irá ser determinada por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/Cl 323 SNAP25i8o»· detectado nas células desenvolvidas nos meios isentos de soro, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/Cl por tais células. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/Cl SNAP25i80/· detectado em células tratadas com um reagente de diferenciação, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/Cl por tais células. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/Cl Sintaxina, detectado em células desenvolvidas em meios isentos de soro irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/Cl por tais células. Um aumento em produto de clivagem BoNT/Cl Sintaxina, detectado em células tratadas com um reagente de diferenciação, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/Cl por tais células. 4. Identificação de tratamentos que aumentam a incorporação de BoNT/D por uma célula 4a. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/D por uma célula

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de BoNT/D para intoxicar uma célula, far-se-á o tratamento prévio de células adequadas de mamíferos com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguem aumentar a incorporação de BoNT/D por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, sendo tratadas com gangliósidos conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. As 324 células tratadas com os gangliósidos irão ficar a incubar com BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) em meios contendo 1% de soro, durante aproximadamente 8 horas ou durante aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/D VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 4a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/D VAMP detectado na linhagem de células tratadas com um gangliósido irá indicar gue o tratamento com esse gangliósido consegue aumentar a incorporação de BoNT/D por tais células. 4b. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/D por uma célula

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de BoNT/D para intoxicar uma célula, efectuar-se-á o tratamento de células adequadas de mamíferos em diferentes condições de desenvolvimento ou com diversos reagentes de diferenciação para se determinar se a diferenciação destas células pode ter como resultado o aumento da incorporação de BoNT/D por tais células. O desenvolvimento das células irá ser feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, utilizando quer meios isentos de soro quer meios com 10% de soro tratados com reagentes de diferenciação conforme descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. Decorrido um período de três dias de incubação a 37 °C, as células dos 325 meios isentos de soro e as células tratadas com os reagentes irão ser lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois irão ficar a incubar a 37°C, quer com meios isentos de soro contendo BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências nas condições de desenvolvimento) , quer com meios com 10% de soro contendo BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências com os reagentes de diferenciação). As células foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/D VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 4a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/D VAMP, detectado em células desenvolvidas em meios isentos de soro, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/D por tais células. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/D VAMP, detectado em células tratadas com um reagente de diferenciação, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/D por tais células. 5. Identificação de tratamentos que aumentam a incorporação de BoNT/E por uma célula 5a. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/E por uma célula

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de BoNT/E para intoxicar uma 326 célula, efectuou-se um tratamento prévio de uma linhagem de células Neuro-2A com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguiriam aumentar a incorporação de BoNT/E por tais células. 0 desenvolvimento das células Neuro-2A decorreu em placas de 6 cavidades recobertas de poli-D-lisina/laminina, tendo sido tratadas com gangliósidos, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. As células tratadas com os gangliósidos irão ficar a incubar com BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) em meios contendo 1% de soro, durante aproximadamente 8 horas ou durante aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea 5a do Exemplo III. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/E SNAP25iso por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 5a do Exemplo II. Detectou-se um aumento em produto de clivagem de BoNT/E SNAP25i8o nas linhagens de células Neuro-2A tratadas com os gangliósidos GD3, GDlb e GDla, indicando isso que o tratamento com GD3, o tratamento com GDlb ou o tratamento com GDla consegue aumentar a incorporação de BoNT/E pelas células Neuro-2A (ver a figura 10a). 5b. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/E por uma célula

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de BoNT/E para intoxicar uma célula, efectuou-se o tratamento de células SH-SY5Y em diferentes condições de desenvolvimento para se determinar se a 327 diferenciação destas células poderia ter como resultado o aumento de incorporação de BoNT/E por tais células. 0 desenvolvimento das células SH-SY5Y decorreu em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, utilizando meios isentos de soro, conforme já descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. As células dos meios isentos de soro ficaram a incubar com BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações de 5 nM e 20 nM durante aproximadamente 30 minutos, durante aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 8 horas e aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina foram colhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. Determinou-se a presença de um produto de clivagem de BoNT/E SNAP25i8o por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 5a do Exemplo II. Detectou-se um aumento em produto de clivagem de BoNT/E SNAP25iso em células SH-SY5Y diferenciadas em condições isentas de soro depois de decorridas apenas 4 horas a seguir à exposição à toxina, com um sinal máximo evidente observado decorridas pelo menos 8 horas após o tratamento BoNT/E, comparativamente com os meios contendo 10% de soro, indicando isso que as condições dos meios isentos de soro conseguem aumentar a incorporação de BoNT/E pelas células SH-SY5Y (ver a figura 10b) . 6. Identificação de tratamentos que aumentam a incorporação de BoNT/F por uma célula 6a. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/F por uma célula 328

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de BoNT/F para intoxicar uma célula, far-se-á o tratamento prévio de células adequadas de mamíferos com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguem aumentar a incorporação de BoNT/F por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, sendo tratadas com gangliósidos conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. As células tratadas com os gangliósidos irão ficar a incubar com BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) em meios contendo 1% de soro, durante aproximadamente 8 horas ou durante aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/F VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 6a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/F VAMP, detectado na linhagem de células tratadas com um gangliósido, irá indicar que o tratamento com esse gangliósido consegue aumentar a incorporação de BoNT/F por tais células. 6b. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/F por uma célula

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de BoNT/F para intoxicar uma célula, efectuar-se-á o tratamento de células adequadas de mamíferos em diferentes condições de desenvolvimento ou com 329 diversos reagentes de diferenciação para se determinar se a diferenciação destas células pode ter como resultado o aumento da incorporação de BoNT/F por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ser feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, utilizando quer meios isentos de soro quer meios com 10% de soro tratados com reagentes de diferenciação, conforme descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. Decorrido um período de três dias de incubação a 37 °C, as células dos meios isentos de soro e as células tratadas com os reagentes irão ser lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois irão ficar a incubar a 37 °C quer com meios isentos de soro contendo BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências nas condições de desenvolvimento) , quer com meios com 10% de soro contendo BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências com os reagentes de diferenciação). As células foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/F VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 6a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/F VAMP, detectado em células desenvolvidas em meios isentos de soro, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/F por tais células. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/F VAMP, detectado em células tratadas com um reagente de diferenciação, irá indicar que o tratamento com esse 330 reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/F por tais células. 7. Identificação de tratamentos que aumentam a incorporação de BoNT/G por uma célula 7 a. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/G por uma célula

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de BoNT/G para intoxicar uma célula, far-se-á o tratamento prévio de células adequadas de mamíferos com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguem aumentar a incorporação de BoNT/G por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, sendo tratadas com gangliósidos conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. As células tratadas com os gangliósidos irão ficar a incubar com BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) em meios contendo 1% de soro, durante aproximadamente 8 horas ou durante aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/G VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 7a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/G VAMP, detectado na linhagem de células tratadas com um gangliósido, irá indicar que o tratamento com esse gangliósido consegue aumentar a incorporação de BoNT/G por tais células. 331 7b. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de BoNT/G por uma célula

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de BoNT/G para intoxicar uma célula, efectuar-se-á o tratamento de células adequadas de mamíferos em diferentes condições de desenvolvimento ou com diversos reagentes de diferenciação para se determinar se a diferenciação destas células pode ter como resultado o aumento da incorporação de BoNT/G por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ser feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, utilizando quer meios isentos de soro quer meios com 10% de soro tratados com reagentes de diferenciação, conforme descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. Decorrido um período de três dias de incubação a 37 °C, as células dos meios isentos de soro e as células tratadas com os reagentes irão ser lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois irão ficar a incubar a 37 °C quer com meios isentos de soro contendo BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências nas condições de desenvolvimento) , quer com meios com 10% de soro contendo BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências com os reagentes de diferenciação). As células foram recolhidas e desmembradas por citólise conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de BoNT/G VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 7a 332 do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/G VAMP, detectado em células desenvolvidas em meios isentos de soro, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/G por tais células. Um aumento em produto de clivagem de BoNT/G VAMP, detectado em células tratadas com um reagente de diferenciação, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de BoNT/G por tais células. 8. Identificação de tratamentos que aumentam a incorporação de TeNT por uma célula 8a. Tratamento com gangliósidos para aumentar a incorporação de elevada afinidade de TeNT por uma célula

Para se avaliar o efeito do tratamento com gangliósidos sobre a aptidão de TeNT para intoxicar uma célula, far-se-á o tratamento prévio de células adequadas de mamíferos com diferentes gangliósidos para se determinar se estes radicais açúcar conseguem aumentar a incorporação de TeNT por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ter lugar em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, sendo tratadas com gangliósidos conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo III. As células tratadas com os gangliósidos irão ficar a incubar com TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) em concentrações diferentes (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) em meios contendo 1% de soro, durante aproximadamente 8 horas ou durante aproximadamente 16 horas. As células tratadas com toxina irão ser recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo 333 III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de TeNT VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 8a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de TeNT VAMP, detectado na linhagem de células tratadas com um gangliósido, irá indicar que o tratamento com esse gangliósido consegue aumentar a incorporação de TeNT por tais células. 7b. Tratamento com reagentes de diferenciação para aumentar a incorporação de elevada afinidade de TeNT por uma célula

Para se avaliar o efeito da diferenciação celular sobre a aptidão de TeNT para intoxicar uma célula, efectuar-se-á o tratamento de células adequadas de mamíferos em diferentes condições de desenvolvimento ou com diversos reagentes de diferenciação para se determinar se a diferenciação destas células pode ter como resultado o aumento da incorporação de TeNT por tais células. 0 desenvolvimento das células irá ser feito em placas de 6 cavidades recobertas com poli-D-lisina/laminina, utilizando quer meios isentos de soro quer meios com 10% de soro tratados com reagentes de diferenciação conforme descrito anteriormente na alínea lb do Exemplo III. Decorrido um período de três dias de incubação a 37 "C, as células dos meios isentos de soro e as células tratadas com os reagentes irão ser lavadas três vezes com 1 mL de soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 e depois irão ficar a incubar a 37°C, quer com meios isentos de soro contendo TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (nas experiências nas condições de desenvolvimento) , quer com meios com 10% de soro contendo TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante 334 aproximadamente 18 horas (nas experiências com os reagentes de diferenciação). As células foram recolhidas e desmembradas por citólise, conforme descrito anteriormente na alinea la do Exemplo III. Determinar-se-á a presença de um produto de clivagem de TeNT VAMP por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alinea 8a do Exemplo II. Um aumento em produto de clivagem de TeNT VAMP, detectado em células desenvolvidas em meios isentos de soro, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de TeNT por tais células. Um aumento em produto de clivagem de TeNT VAMP, detectado em células tratadas com um reagente de diferenciação, irá indicar que o tratamento com esse reagente consegue aumentar a incorporação de TeNT por tais células.

EXEMPLO IV

Geração de células que contêm transioriamente um substrato de toxina de clostrídeo 1. Geração de células que contêm um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25, por transdução adenoviral

la. Construção de pAd-DEST/SNAP-252o6~GFP

Para se fazer uma construção de pAd-DEST/SNAP-25206-GFP, utiliza-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende SNAP-252o6-GFP que é amplificado a partir de ADN de pQBI-25/SNAP25206_GFP (ver a alinea 1 a do Exemplo I), utilizando um método de reacção em cadeia com polimerase, e faz-se a sua subclonagem num vector pCR2.1 utilizando o método de clonagem 'TOPO® TA' 335 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotidicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição, úteis para os passos de subclonagem subseguentes. A construção resultante pCR2.1/SNAP-25206_GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém toda a grelha de leitura aberta que codifica o péptido SNAP-252o6~GFP; e 2) permitem que esta inserção seja funcionalmente ligada a um vector pAd-DEST (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Esta inserção é subclonada, recorrendo a um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pAd-DEST que é digerido com endonucleases de restrição adequadas para se obter pAd-DEST/SNAP-25206_ GFP. A mistura de ligação é transformada com células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), praticando um método de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, e depois são colocadas numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. Faz-se o isolamento das construções elegíveis praticando um procedimento de minipreparação plasmídica de lise alcalina e efectua-se a análise por meio de mapeamento por digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem proporciona uma construção de expressão de mamíferos que codifica o SNAP-25206-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pAd-DEST. 336

lb. Produção de uma provisão adenoviral que contém pAd-DEST/SNAP-25-GFP

Para se produzir uma provisão adenoviral contendo uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25-GFP, tal como, v.g., pAd-DEST/SNAP-25206-GFP, distribui-se por placas cerca de 5xl05 células 293Α em placas de cultura tecidual de 35 mm contendo 3 mL de Meio de Eagle Completo Modificado por Dulbecco (DMEM) , enriquecido com 10% de soro fetal de bovino (FBS), uma solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução lx MEM de aminoácidos não essenciais (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), sendo o seu desenvolvimento feito numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Decorrido um dia após a

transfecção, substitui-se os meios completos de DMEM enriquecidos, por 2 mL de meio de soro reduzido OPTI-MEM. Prepara-se uma quantidade de 500 pL de uma solução de transfecção adicionando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA), incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg da construção de expressão linearizada que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-2 5-GFP, tal como, v.g., pAd-DEST/SNAP-25206_GFP. Para se linearizar uma construção de pAd-DEST/SNAP-25-GFP, faz-se digerir 5 pg de uma construção pAd-DEST/SNAP-25-GFP com Pad (New England Biolabs, Beverly, MA). O plasmideo linearizado é purificado recorrendo a um procedimento com o estojo QIAguick (QIAGEN. Inc., Valência, CA) e depois 337

prepara-se nova suspensão em tampão TE. Este produto de transfecção fica a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Depois acrescenta-se os 500 pL de solução de transfecção a células 293A e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 16 horas. Substitui-se os meios de transfecção com 3 mL de meio DMEM enriquecido, completo e renovado, e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. Efectua-se a tripsinização das células e transfere-se os conteúdos de cada cavidade para uma placa estéril de cultura de tecidos de 10 cm contendo 10 mL de meio DMEM completo e enriquecido. Substitui-se os meios esgotados por meio DMEM completo, renovado e enriquecido, em cada 2 ou 3 dias até serem observadas regiões visiveis de efeito citopático (tipicamente ao fim de 7-10 dias). Efectua-se a reposição dos meios de cultura esgotados com meio DMEM completo, enriquecido e recente e permite-se que as infecções prossigam até ser observado um efeito citopático aproximadamente igual a 80% (tipicamente ao fim de 10-13 dias após a transfecção). As células que contêm os adenovirus são colhidas fazendo a remoção dessas células utilizando os meios de cultura e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL. As células colhidas são desmembradas por citólise praticando um ciclo de congelação-descongelação que consiste em mantê-las a -80°C durante 30 minutos e depois a 37°C durante 15 minutos. O produto da citólise é centrifugado (5 000 x g a 20 °C durante 15 minutos) para agregar os detritos celulares. O 338 sobrenadante clarificado que contém as partículas adenovirais é transferido para frascos de 2 mL para frio, em aliquotas de 1 mL, e prevê-se que deva conter aproximadamente entre lxlO7 e 108 ufp de partículas adenovirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até serem necessárias.

lc. Amplificação de uma provisão adenoviral contendo pAd-DEST/SNAP-25-GFP

Para se amplificar a provisão adenoviral que contém a construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25-GFP, tal como, v.g., pAd-DEST/SNAP-252o6-GFP, faz-se uma aplicação de cerca de 3xl06 células 293A numa placa de cultura tecidual de 100 mm contendo 10 mL de Meio de Eagle Completo Modificado por Dulbecco (DMEM) , enriquecido com 10% de soro fetal de bovino (FBS), uma solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução lx MEM de aminoácidos não essenciais (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), sendo o seu desenvolvimento feito numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 80-90% da confluência (6-16 horas). Faz-se então a inoculação das células de 100 pL de provisão adenoviral e depois ficam a incubar durante aproximadamente 48-72 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até que as células se juntam todas e ficam a flutuar ou ligeiramente acopladas à placa de cultura. As células que contêm os adenovírus são colhidas fazendo a remoção dessas células utilizando os meios de cultura e raspando as células para fora da placa de cultura. As 339 células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL. As células colhidas são desmembradas por citólise praticando três ciclos de congelação-descongelação, consistindo cada um deles em mantê-las a -80°C durante 30 minutos e depois a 37°C durante 15 minutos. O produto da citólise é centrifugado (5 000 x g a 20 °C durante 15 minutos) para agregar os detritos celulares. 0 sobrenadante clarificado que contém as partículas adenovirais é transferido para frascos de 2 mL, para frio, em aliquotas de 1 mL e prevê-se que deva conter aproximadamente entre lxlO8 e 109 ufp de partículas adenovirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até serem necessárias.

ld. Transdução de células com uma provisão adenoviral que contém pAd-DEST/SNAP-25-GFP

Para se fazer a transdução de células com a provisão adenoviral que contém uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25-GFP, tal como, v.g., pAd-DEST/SNAP-25206_GFP, faz-se uma aplicação de cerca de l,5xl05 células SH-SY5Y numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios completos EMEM e F12 de Ham a 1:1 (EMEM:F12) , enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS) , glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1% de piruvato de sódio (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, uma solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução lx MEM de aminoácidos não essenciais (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , sendo o seu desenvolvimento feito numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células 340 alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Efectua-se a inoculação das células com aproximadamente 4 pL de provisão adenoviral (aproximadamente 5xl08 ufp/mL) e mantém-se tudo a incubar durante aproximadamente 24 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Substitui-se os meios de transdução por 3 mL de meios EMEM:F12 enriquecidos, renovados e completos, e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. As células transduzidas podem ser utilizadas para se realizar um ensaio de análise de actividade de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, utilizando um substrato de SNAP-25-GFP. 2. Geração de células contendo um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E por transdução lentiviral

2a. Construção de pLent±6Ubc/V5-SNAP-25206-GFP

Para se fazer uma construção de pLenti6Ubc/V5-SNAP-25206-GFP, utiliza-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl OU BoNT/E SNAP-25-GFP, que é amplificado, v.g., a partir de ADN de pQBI-25/SNAP25206~GFP (ver a alínea 1 a do Exemplo I), praticando um método de reacção em cadeia com polimerase e fazendo a subclonagem num vector pCR2.1, utilizando o método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição, úteis para os passos de subclonagem 341 subsequentes. A construção resultante pCR2.1/SNAP-252oó-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém a totalidade da grelha de leitura aberta que codifica o péptido SNAP-25206~GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pLenti6Ubc/V5 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Esta inserção é subclonada, praticando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pLenti6Ubc/V5 que é digerido com endonucleases de restrição adequadas para se obter pLenti6Ubc/V5-SNAP-25206_GFP. A mistura de ligação é transformada em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um método de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas numa incubadora a 37 "C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. As construções elegíveis são isoladas praticando um procedimento de minipreparação plasmídica de lise alcalina e analisadas por mapeamento com digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem proporciona uma construção de expressão em mamíferos que codifica o SNAP-25206_GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pLenti6Ubc/V5, um péptido V5 do terminal amino. 342

2b. Produção de uma provisão lentiviral que contém pLenti6Ubc/ V5-SNAP-25-GFP

Para se produzir uma provisão lentiviral contendo uma construção pLenti6Ubc/V5-SNAP-25-GFP, prepara-se 3,0 mL de uma solução de transfecção acrescentando 1,5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 36 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA), incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 1,5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 3 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25, tal como, v.g., pLenti6Ubc/V5-SNAP-25206_ GFP, e 9 pg de mistura de acondicionamento 'ViraPower™' . Após um periodo aproximado de 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, acrescenta-se os complexos de ADN-lípidos a uma placa de cultura de tecidos de 10 cm contendo 5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM. Acrescenta-se então 5 mL de uma suspensão celular contendo aproximadamente 6xl06 células 293A aos meios complexos de ADN-lipidos e espera-se pelo seu desenvolvimento numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, de um dia para o outro. Os meios de transfecção são substituídos por 10 mL de Meios de Eagle Completos Modificados por Dulbecco (DMEM), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais em meio lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), e espera-se pelo desenvolvimento numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 24-48 horas. As células que contêm os 343 lentivirus são colhidas fazendo a sua remoção, utilizando meios de cultura e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL e faz-se a centrifugação (5 000 x g a 20 °C durante 15 minutos) para juntar os residuos celulares. O sobrenadante clarificado contendo as partículas lentivirais é transferido para frascos de frio de 2 mL, em aliquotas de 1 mL, devendo conter aproximadamente entre 5xl05 e 2xl07 ufp/mL de partículas lentivirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até virem a ser necessárias.

2c. Transdução de células com uma provisão lentiviral contendo um pLenti6Ubc/V5-SNAP-25-GFP

Para se fazer a transdução de células com a provisão lentiviral contendo pLenti6Ubc/V5-SNAP-25-GFP, faz-se uma aplicação de cerca de l,5xl05 células SH-SY5Y numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios completos EMEM e F12 de Ham na razão de 1:1 (EMEM:F12), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS) , glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , 1% de piruvato de sódio (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , com desenvolvimento numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). As células são inoculadas com a provisão lentiviral contendo uma construção de expressão que codifica um substrato de 344

BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25, tal como, v.g., pLenti6Ubc/V5-SNAP-25206_GFP (ver o número 1 do Exemplo I), utilizando uma multiplicidade adequada de inoculo de infecção, ficando tudo a incubar durante aproximadamente 16-24 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Os meios de transdução são substituídos por 3 mL de meios EMEM:F12 completos, enriquecidos e renovados, e as células ficam a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24-48 horas. As células transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, utilizando um substrato de SNAP-25-GFP. 3. Geração de células contendo um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, por transformação proteinica 3a. Expressão de um substrato de SNAP-25-GFP utilizando uma linhagem de células bacterianas

Para a expressão de um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25-GFP utilizando bactérias, introduz-se uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25-GFP, tal como, v.g., pQBI-67/SNAP-25206_GFP, conforme descrito anteriormente na alínea ld do Exemplo I, em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , recorrendo a um protocolo de transformação por choque térmico. 0 produto de reacção do choque térmico é depois aplicado sobre placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL e depois coloca-se tudo numa incubadora a 37°C 345 de um dia para o outro, para desenvolvimento. Utiliza-se uma única colónia de células de E. coli transformadas, resistentes à ampicilina, contendo pQBI-67/SNAP-25206_GFP, para inocular um tubo de ensaio de 15 mL contendo 3,0 mL de meios de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL, a qual é colocado depois numa incubadora a 37°C com agitação a 250 r.p.m., de um dia para o outro, para desenvolvimento. A cultura iniciadora resultante, obtida de um dia para o outro, vai servir para inocular um balão separador de 1,0 L contendo 100 mL de meios de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL, com uma diluição de 1:1000. Esta cultura fica a desenvolver-se numa incubadora a 32 °C com agitação a 250 r.p.m. durante aproximadamente 6,5 horas, até ser alcançada a fase logarítmica média (valor D06oo entre cerca de 0,6-0,8). A expressão da proteína é depois induzida acrescentando isopropil-p-D-tiogalactopiranosido 1 mM (IPTG) e coloca-se a cultura numa incubadora a 32°C com agitação a 250 r.p.m. para que tenha lugar a expressão, de um dia para o outro. Efectua-se a colheita das células por centrifugação (4 000 r.p.m. a 4°C durante 20-30 minutos) para juntar as células. Deita-se fora o sobrenadante e utiliza-se a massa de células imediatamente nos passos subsequentes, ou então guarda-se a massa de células a -80°C, até vir a ser necessária. 3b. Expressão de um substrato de SNAP-25-GFP utilizando uma linhagem de células de mamíferos

Para a expressão de um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25-GFP utilizando uma linhagem de células de mamíferos, faz-se uma aplicação de cerca de l,5xl05 células 346 SH-SY5Y numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios completos EMEM e F12 de Ham à razão de 1:1 (EMEM:F12), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , 1% de piruvato de sódio (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , com desenvolvimento numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Prepara-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA), sujeito a incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25-GFP, tal como, v.g., pQBI-25/SNAP25206_GFP (ver a alínea la do Exemplo I). Este produto de transfecção fica a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Substitui-se os meios EMEM:F12 completos e enriquecidos por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e acrescenta-se 500 pL de solução de transfecção às células SH-SY5Y e depois mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 16 horas. Os meios de transfecção são substituídos por 3 mL de meios EMEM:F12 completos, enriquecidos e renovados e as células são colocadas a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante 347 aproximadamente 48 horas. Efectua-se a colheita das células lavando-as uma vez com 3,0 mL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4 e removendo as células lavadas mediante a adição de 500 yL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4 e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas são transferidas para um tubo de ensaio de 1,5 mL e são reunidas por microcentrifugação (10 000 x g a 4°C durante 5 minutos) . Deita-se fora o sobrenadante e utiliza-se a massa de células imediatamente para os passos subsequentes ou então guarda-se essa massa de células a -80°C, até vir a ser necessária.

3c. Purificação de um substrato de SNAP-25-GFP

Para se purificar um substrato de SNAP-25-GFP, com uma massa de células em que tenha lugar a expressão da construção que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25, tal como, v.g., quer uma construção pQBI-67/SNAP-25206-GFP, quer uma construção pQBI-25/SNAP-25206~ GFP, prepara-se nova suspensão em 10 mL de tampão Tris-EDTA (Tris-HCl 10 mM a pH 8,0; EDTA 1 mM a pH 8,0), contendo lisozimas na concentração de 1 mg/mL e depois efectua-se o desmembramento celular por citólise recorrendo a três ciclos de congelação-descongelação, sendo cada um deles constituído por uma temperatura de -80°C durante 5 minutos e depois 37°C durante 5 minutos. Submete-se o lisado celular a centrifugação (5 000 x g a 4°C durante 15 minutos) para reunir os resíduos celulares e depois transfere-se o sobrenadante para um tubo novo contendo um volume igual de tampão de ligação à coluna (sulfato de amónio 4 M). Prepara-se uma coluna de cromatografia por 348 interacção hidrofóbica (HIC) utilizando 20 mL de um suporte 'Econo-Pac' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que é acondicionado com 2,5-5,0 mL de resina metilica para HIC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), a qual é depois equilibrada fazendo a lavagem com tampão de equilíbrio da coluna correspondente a 5 volumes de coluna (sulfato de amónio 2 M) . 0 lisado clarificado é aplicado lentamente à coluna equilibrada por escoamento gravimétrico (aproximadamente 0,25-0,3 mL/minuto). A seguir lava-se a coluna com tampão de lavagem de coluna correspondente a 5 volumes de coluna (sulfato de amónio 1,3 M) . Efectua-se a eluição do substrato de SNAP-25206_GFP com 20-30 mL de tampão de eluição de coluna (tampão TE 10 mM) e recolhe-se em aproximadamente doze fracções de 1 mL. A evolução da amostra de substrato de SNAP-252o6-GFP através da coluna e também das correspondentes fracções de eluição que contêm a amostra é monitorizada recorrendo a uma luz ultravioleta proveniente de um transiluminador manual. Determina-se a quantidade de substrato de SNAP-252o6_GFP existente em cada fracção de eluição por meio do ensaio com o corante de Bradford. De acordo com este procedimento, combina-se uma aliquota de 20 pL, proveniente de cada fracção de 1,0 mL, com 200 pL de reagente proteínico da 'Bio-Rad' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) , dilui-se de 1 para 4 com água desionizada e destilada e depois mede-se a intensidade do sinal colorimétrico, utilizando um espectrofotómetro. Considera-se que as cinco fracções com o sinal mais forte compreendem o pico de eluição e juntam-se todas. Determina-se a produção total de proteína estimando a concentração da proteína total existente nas fracções de eluição reunidas que contêm o pico máximo, utilizando γ-globulina de bovino 349 como padrão (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ajusta-se a quantidade de substrato de SNAP-252o6_GFP para uma concentração de proteínas aproximadamente igual a 100 ng/mL.

3d. Transformação proteínica de um substrato de SNAP-25-GFP

Para se transformar um substrato de SNAP-25-GFP numa linhagem de células de mamíferos, faz-se uma aplicação de cerca de l,5xl05 células SH-SY5Y numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios completos EMEM e F12 de Ham à razão de 1:1 (EMEM:F12), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , 1% de piruvato de sódio (Invitrogen,

Inc, Carlsbad, CA), bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), com desenvolvimento numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Prepara-se 200 pL de uma solução de transfecção de proteínas acrescentando 100 pL de água destilada contendo 6 pL de agente transportador de proteínas 'Chariot™' (Active Motif, Carlsbad, CA) a 100 pL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, contendo 1 pg de um substrato de SNAP25-GFP, tal como, v.g.r SNAP252o6_GFP, e mantém-se esta solução a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Após a incubação, as células são lavadas uma vez por enxaguamento com 3,0 mL de um soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4. Acrescenta-se às células lavadas os 200 pL de solução de 350 transfecção de proteínas, seguindo-se o tratamento com 400 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e depois a células ficam a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 1 hora. Acrescenta-se às células 1 mL de EMEM:F12 enriquecido, completo e recente, e mantém-se tudo a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 1-2 horas, as células transformadas podem ser então utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E. 4. Geração de células contendo um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP por transdução adenoviral

4a. Construção de pAd—DEST/VAMP—GFP

Para se fazer uma construção pAd-DEST/VAMP-GFP que codifique um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP utiliza-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende um substrato de VAMP-GFP, que é amplificado, v.g., a partir de ADN de pQBI-25/VAMP-l-GFP, ADN de pOBI-25/VAMP-2-GFP ou ADN de pQBI-25/VAMP-3-GFP (ver as alíneas 2a, 2b e 2c do Exemplo I), praticando um método de reacção em cadeia com polimerase e fazendo a subclonagem num vector pCR2.1, utilizando o método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos de subclonagem subsequentes. 351 A construção resultante pCR2.1/VAMP-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém a totalidade da grelha de leitura aberta que codifica o péptido VAMP-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pAd-DEST (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Esta inserção é subclonada, praticando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pAd-DEST que é digerido com endonucleases de restrição adequadas para se obter pAd-DEST/VAMP-GFP. A mistura de ligação é transformada em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um método de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas numa incubadora a 37°C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. As construções elegíveis são isoladas praticando um procedimento de minipreparação plasmídica de lise alcalina e analisadas por mapeamento com digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem proporciona uma construção de expressão em mamíferos que codifica o VAMP-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pAd-DEST.

4b. Produção de uma provisão adenoviral contendo pAd-DEST/VAMP-GFP

Para se produzir uma provisão adenoviral contendo uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, 352 v.g.f pAd-DEST/VAMP-GFP, faz-se uma aplicação de cerca de 5xl05 células 293A numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de Meios de Eagle Completos Modificados por Dulbecco (DMEM), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , e deixa-se desenvolver numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Um dia após a transfecção, substitui-se os meios de DMEM completos e enriquecidos, por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM. Prepara-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA) , com incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de construção de expressão linearizada que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G OU TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pAd-DEST/VAMP-GFP. Para se linearizar uma construção de pAd-DEST/VAMP-GFP, faz-se digerir 5 pg de uma construção de pAd-DEST/VAMP-GFP com Pacl (New England Biolabs, Beverly, MA). O plasmídeo linearizado é purificado praticando um procedimento com o estojo 'QIAquick' (QIAGEN. Inc., Valência, CA) e recoloca-se em suspensão em tampão TE. Este produto de transfecção fica a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Depois acrescenta-se os 500 pL de solução de transfecção às células 293A e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido 353 de carbono durante aproximadamente 16 horas. Substitui-se os meios de transfecção por 3 mL de meio DMEM completo e enriquecido e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. Efectua-se a tripsinização das células e transfere-se o conteúdo de cada cavidade para uma placa de cultura de tecidos estéril de 10 cm contendo 10 mL de meio DMEM completo e enriquecido. Substitui-se os meios consumidos por meio DMEM enriquecido, completo e renovado, em cada 2 ou 3 dias, até serem observadas regiões visíveis de efeito citopático (tipicamente ao fim de 7-10 dias) . Recarrega-se os meios de cultura consumidos com meio DMEM enriquecido, completo e renovado e deixa-se prosseguir as infecções até se observar aproximadamente 80% de efeito citopático (tipicamente ao fim de 10-13 dias após a transfecção). Efectua-se a colheita das células que contêm os adenovírus removendo-as, utilizando os meios de cultura, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL. As células colhidas são desmembradas por citólise recorrendo a um ciclo de congelação-descongelação constituído por uma temperatura de -80°C durante 30 minutos e depois 37°C durante 15 minutos. Efectua-se a centrifugação do lisado celular (5 000 x g a 20°C durante 15 minutos) para juntar os resíduos celulares. O sobrenadante clarificado que contém as partículas adenovirais é transferido para frascos de frio de 2 mL em aliquotas de 1 mL que devem conter aproximadamente entre lxlO7 e 108 ufp de partículas adenovirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até virem a ser necessárias. 354

4c. Amplificação de uma provisão adenoviral contendo pAd-DEST/ VAMP-GFP

Para se amplificar a provisão adenoviral que contém uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G OU TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g.r pAd-DEST/VAMP-GFP, faz-se uma aplicação de cerca de 3xl06 células 293A numa placa de cultura de tecidos de 100 mm contendo 10 mL de meios de Eagle Completos Modificados por Dulbecco (DMEM), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS) , uma solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc,

Carlsbad, CA), e espera-se pelo desenvolvimento numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 80-90% da confluência (6-16 horas). As células são inoculadas com 100 pL de provisão adenoviral e são colocadas a incubar durante aproximadamente 48-72 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até estarem desenvolvidas e flutuarem ou ficarem ligeiramente acopladas à placa de cultura. Efectua-se a colheitas de células que contêm o adenovirus removendo-as, com utilização dos meios de cultura, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL. As células colhidas são desmembradas por citólise praticando três ciclos de congelação-descongelação, sendo cada um deles constituído por uma temperatura de -80 °C durante 30 minutos e depois 37°C durante 15 minutos. Efectua-se a centrifugação do lisado celular (5 000 x g a 20°C durante 15 minutos) para reunir os resíduos celulares. 355

Transfere-se o sobrenadante clarificado, que contém as partículas adenovirais, para frascos de frio de 2 mL em aliquotas de 1 mL que devem conter aproximadamente entre lxlO8 e 109 ufp de partículas adenovirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até virem a ser necessárias.

4d. Transdução de células com uma provisão adenoviral que contém pAd—DEST/VAMP-GFP

Para se efectuar a transdução de células com a provisão adenoviral que contém uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pAd-DEST/VAMP-GFP, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre lxlO5 e lxlO5) de células adequadas numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios de cultura completos e enriquecidos e espera-se que se desenvolvam numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até que as células atinjam uma densidade adequada para a transdução. As células são inoculadas aproximadamente com 4 pL de provisão adenoviral (aproximadamente 5xl08 ufp/mL) e depois ficam a incubar durante aproximadamente 24 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Os meios de transdução são substituídos por meios completos e enriquecidos, renovados e as células ficam a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. As células transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, utilizando um substrato VAMP-GFP. 356 5. Geração de células que contêm um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT por transdução lentiviral

5a. Construção de pLent±6Ubc/V5-VAMP-GFP

Para se fazer uma construção pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP que codifique um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP utiliza-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, que é amplificado, v.g., a partir de ADN de pQBI-25/VAMP-l-GFP, ADN de pOBI-25/VAMP-2-GFP ou ADN de pQBI-25/VAMP-3-GFP (ver as alíneas 2a, 2b e 2c do Exemplo I) , praticando um método de reacção em cadeia com polimerase e fazendo a subclonagem num vector pCR2.1, utilizando o método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotidicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos de subclonagem subsequentes. A construção resultante pCR2.1/VAMP-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém a totalidade da grelha de leitura aberta que codifica o péptido VAMP-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pLenti6Ubc/V5 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Esta inserção é subclonada, praticando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pLenti6Ubc/V5 que é digerido com endonucleases de restrição adequadas para se obter pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP. A mistura de ligação é transformada em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), praticando um método de 357 choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. As construções elegíveis são isoladas praticando um procedimento de minipreparação plasmídica de lise alcalina e analisadas por mapeamento com digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem proporciona uma construção de expressão em mamíferos que codifica o VAMP-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pLenti6Ubc/V5, um péptido V5 do terminal amino.

5b. Produção de uma provisão lentiviral contendo pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP

Para se obter uma provisão lentiviral contendo uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, prepara-se 3,0 mL de uma solução de transfecção acrescentando 1,5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 36 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA), incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 1,5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 3 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP, e 9 pg de mistura de acondicionamento 'ViraPower™' . Após um período aproximado de 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, 358 acrescenta-se os complexos de ADN-lípidos a uma placa de cultura de tecidos de 10 cm contendo 5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM. Acrescenta-se então 5 mL de uma suspensão celular contendo aproximadamente 6xl06 células 293A aos meios complexos de ADN-lípidos e espera-se pelo seu desenvolvimento numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, de um dia para o outro. Os meios de transfecção são substituídos por 10 mL de meios de Eagle Completos Modificados por Dulbecco (DMEM), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais em meio lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), e espera-se pelo desenvolvimento numa incubadora a 37 "C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 24-48 horas. As células que contêm os lentivirus são colhidas fazendo a sua remoção, utilizando meios de cultura, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL e faz-se a centrifugação (5 000 x g a 20"C durante 15 minutos) para juntar os resíduos celulares. O sobrenadante clarificado, contendo as partículas lentivirais, é transferido para frascos de frio de 2 mL, em aliquotas de 1 mL, devendo conter aproximadamente entre 5xl05 e 2xl07 ufp/mL de partículas lentivirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até virem a ser necessárias. 359

5c. Transdução de células com uma provisão lentiviral contendo um pLentl6Ubc/V5-VAMP-GFP

Para se efectuar a transdução de células com a provisão lentiviral contendo uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre l,5xl05 e l,5xl06), de células convenientes, numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios de cultura completos e enriquecidos e depois espera-se que as células se desenvolvam numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até que as células atinjam uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). As células são inoculadas com a provisão lentiviral que contém uma construção de expressão que codifica o substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP, utilizando uma multiplicidade adequada de agente infeccioso e depois ficam a incubar durante aproximadamente 16-24 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Substitui-se os meios de transdução por 3 mL de meios completos, enriquecidos e renovados e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24-48 horas. As células transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, utilizando um substrato VAMP-GFP. 360 6. Geração de células que contêm um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, por transformação proteínica 6a. Expressão de um substrato de VAMP-GFP utilizando uma linhagem de células bacterianas

Para a expressão de um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP utilizando bactérias, introduz-se uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G OU TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pQBI-67/VAMP-l-GFP, pQBI-67/VAMP-2-GFP ou pQBI-67/VAMP-3-GFP, conforme descrito anteriormente nas alíneas 2d, 2e e 2f do Exemplo I, em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , recorrendo a um protocolo de transformação por choque térmico. O produto de reacção do choque térmico é depois aplicado sobre placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL e depois coloca-se tudo numa incubadora a 37 °C de um dia para o outro, para desenvolvimento. Utiliza-se uma única colónia de células de E. coli transformadas, resistente à ampicilina, contendo pQBI-67/VAMP-GFP, para inocular um tubo de ensaio de 15 mL contendo 3,0 mL de meios de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL, o qual é colocado depois numa incubadora a 37°C com agitação a 250 r.p.m., de um dia para o outro, para desenvolvimento. A cultura iniciadora resultante, obtida de um dia para o outro, vai servir para inocular um balão separador de 1,0 L contendo 100 mL de meios de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL, com uma diluição 361 de 1:1000. Esta cultura fica a desenvolver-se numa incubadora a 32°C com agitação a 250 r.p.m. durante aproximadamente 6,5 horas até ser alcançada a fase logarítmica média (valor D06oo entre cerca de 0,6-0,8). A expressão da proteína é depois induzida acrescentando isopropil-p-D-tiogalactopiranosido 1 mM (IPTG) e coloca-se a cultura numa incubadora a 32°C com agitação a 250 r.p.m. para que tenha lugar a expressão, de um dia para o outro. Efectua-se a colheita das células por centrifugação (4 000 r.p.m. a 4°C durante 20-30 minutos) para juntar as células. Deita-se fora o sobrenadante e utiliza-se a massa de células imediatamente nos passos subsequentes, ou então guarda-se a massa de células a -80°C, até vir a ser necessária. 6b. Expressão de um substrato de VAMP-GFP utilizando ima linhagem de células de mamíferos

Para a expressão de um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, utilizando uma linhagem de células de mamíferos, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre Ι,ΟχΙΟ5 e 1,0x10®), de células convenientes numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios de cultura completos e enriquecidos, desenvolvendo-se as células numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Prepara-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA) , sujeito a incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI- 362 MEM contendo 5 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pQBI-25/VAMP-l-GFP, pQBI-25/VAMP-2-GFP ou pQBI-25/VAMP-3-GFP (ver as alíneas 2a, 2b e 2c do Exemplo I) . Este produto de transfecção fica a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Substitui-se os meios completos e enriquecidos por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e acrescenta-se 500 pL de solução de transfecção às células e depois mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 16 horas. Os meios de transfecção são substituídos por 3 mL de meios EMEM:F12 completos, enriquecidos e renovados e as células são colocadas a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 48 horas. Efectua-se a colheita das células lavando-as uma vez com 3,0 mL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4 e removendo as células lavadas, mediante a adição de 500 pL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas são transferidas para um tubo de ensaio de 1,5 mL e são reunidas por microcentrifugação (10 000 x g a 4°C durante 5 minutos) . Deita-se fora o sobrenadante e utiliza-se a massa de células imediatamente para os passos subsequentes ou então guarda-se essa massa de células a -80°C, até vir a ser necessária.

6c. Purificação de um substrato de VAMP-GFP

Para se purificar um substrato de VAMP-GFP, com uma massa de células em que tenha lugar a expressão da 363 construção que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., quer uma construção pQBI-67/VAMP-l-GFP quer uma construção pQBI-25/VAMP-l-GFP, prepara-se nova suspensão em 10 mL de tampão Tris-EDTA (Tris-HCl 10 mM a pH 8,0; EDTA 1 mM a pH 8,0), contendo lisozimas na concentração de 1 mg/mL e depois efectua-se o desmembramento celular por citólise recorrendo a três ciclos de congelação-descongelação, cada um deles constituído por uma temperatura de -80°C durante 5 minutos e depois 37°C durante 5 minutos. Submete-se o lisado celular a centrifugação (5 000 x g a 4°C durante 15 minutos) para reunir os resíduos celulares e depois transfere-se o sobrenadante para um tubo limpo contendo um volume igual de tampão de ligação à coluna (sulfato de amónio 4 M). Prepara-se uma coluna de cromatografia por interacção hidrofóbica (HIC), utilizando 20 mL de um suporte 'Econo-Pac' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que é acondicionado com 2,5-5,0 mL de resina metílica para HIC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) , a qual é depois equilibrada fazendo a lavagem com tampão de equilíbrio da coluna correspondente a 5 volumes de coluna (sulfato de amónio 2 M) . O lisado clarificado é aplicado lentamente à coluna equilibrada, por escoamento gravimétrico (aproximadamente 0,25-0,3 mL/minuto). A seguir lava-se a coluna com tampão de lavagem de coluna correspondente a 5 volumes de coluna (sulfato de amónio 1,3 M) . Efectua-se a eluição do substrato de VAMP-GFP com 20-30 mL de tampão de eluição de coluna (tampão TE 10 mM) e recolhe-se em aproximadamente doze fracções de 1 mL. A evolução da amostra de substrato de VAMP-GFP através da coluna e também das correspondentes fracções de eluição que contêm a 364 amostra é monitorizada recorrendo a uma luz ultravioleta proveniente de um transiluminador manual. Determina-se a quantidade de substrato de VAMP-GFP existente em cada fracção de eluição por meio do ensaio com o corante de Bradford. De acordo com este procedimento, combina-se uma aliquota de 20 pL proveniente de cada fracção de 1,0 mL com 200 pL de reagente proteinico da 'Bio-Rad' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), dilui-se de 1 para 4 com água desionizada e destilada e depois mede-se a intensidade do sinal colorimétrico utilizando um espectrofotómetro. Considera-se que as cinco fracções com o sinal mais forte compreendem o pico de eluição e juntam-se todas. Determina-se a produção total de proteína estimando a concentração da proteína total existente nas fracções de eluição reunidas que contêm o pico máximo, utilizando γ-globulina de bovino como padrão (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ajusta-se a quantidade de substrato de VAMP-GFP para uma concentração de proteínas aproximadamente igual a 100 ng/mL.

6d. Transformação proteínica de um substrato de VAMP-GFP

Para se transformar um substrato de VAMP-GFP numa linhagem de células de mamíferos, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre Ι,ΟχΙΟ5 e Ι,ΟχΙΟ6), de células convenientes numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios de cultura completos e enriquecidos e depois espera -se que as células se desenvolvam numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Prepara-se 200 pL de uma solução de transfecção de proteínas acrescentando 100 pL de água destilada contendo 6 365 pL de agente transportador de proteínas 'Chariot™' (Active Motif, Carlsbad, CA) a 100 pL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, contendo 1 pg de um substrato de VAMP-GFP, e mantém-se esta solução a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Após a incubação, as células são lavadas uma vez por enxaguamento com 3,0 mL de um soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4. Acrescenta-se às células lavadas os 200 pL de solução de transfecção de proteínas, seguindo-se o tratamento com 400 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e depois a células ficam a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 1 hora. Acrescenta-se às células 1 mL de meio de cultura enriguecido, completo e recente, e mantém-se tudo a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 1-2 horas, as células transformadas podem ser então utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT utilizando um substrato de VAMP-GFP. 7. Geração de células que contêm um substrato de BoNT/Cl Sintaxina por transdução adenoviral

7a. Construção de pAd-DEST/Sintaxina-GFP

Para se fazer uma construção pAd-DEST/Sintaxina-GFP que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, amplifica-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende a Sintaxina-GFP, a partir de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl-GFP, tal como, v.g., ADN de pQBI- 366 25/Sintaxina-GFP (ver a alínea 3a do Exemplo I), praticando um método de reacção em cadeia com polimerase e fazendo a subclonagem num vector pCR2.1, utilizando o método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos de subclonagem subsequentes. A construção resultante pCR2 . 1/Sintaxina-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém a totalidade da grelha de leitura aberta que codifica 0 péptido Sintaxina-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pAd-DEST (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Esta inserção é subclonada, praticando um procedimento com ligase de ADN de T4, num vector pAd-DEST que é digerido com endonucleases de restrição adequadas para se obter pAd-DEST/Sintaxina-GFP. A mistura de ligação é transformada em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um método de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. As construções elegíveis são isoladas praticando um procedimento de minipreparação plasmídica de lise alcalina e analisadas por mapeamento com digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem proporciona uma 367 construção de expressão em mamíferos que codifica o Sintaxina-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pAd-DEST.

7b. Produção de uma provisão adenoviral contendo pAd-DEST/Sintaxina-GFP

Para se produzir uma provisão adenoviral contendo uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, faz-se uma aplicação de cerca de 5xl05 células 293A numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios de Eagle Completos Modificados por Dulbecco (DMEM), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), e deixa-se desenvolver numa incubadora a 37"C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Um dia após a transfecção, substitui-se os meios de DMEM completos e enriquecidos, por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM. Prepara-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA) , com incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de construção de expressão linearizada que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g.r pAd-DEST/Sintaxina-GFP. Para se linearizar uma construção de pAd-DEST/Sintaxina-GFP, faz-se digerir 5 pg de uma construção de pAd-DEST/Sintaxina-GFP com Pad (New England Biolabs, Beverly, MA) . O plasmídeo 368 linearizado é purificado praticando o procedimento com o estojo 'QIAquick' (QIAGEN. Inc., Valência, CA) e recoloca-se em suspensão em tampão TE. Este produto de transfecção fica a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Depois acrescenta-se os 500 pL de solução de transfecção às células 293A e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 16 horas. Substitui-se os meios de transfecção por 3 mL de meio DMEM completo e enriquecido e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. Efectua-se a tripsinização das células e transfere-se o conteúdo de cada cavidade para uma placa estéril de cultura de tecidos de 10 cm contendo 10 mL de meio DMEM completo e enriquecido. Substitui-se os meios consumidos por meio DMEM enriquecido, completo e renovado, em cada 2 ou 3 dias, até serem observadas reqiões visíveis de efeito citopático (tipicamente ao fim de 7-10 dias). Recarrega-se os meios de cultura consumidos com meio DMEM enriquecido, completo e renovado e deixa-se prosseguir as infecçóes até se observar aproximadamente 80% de efeito citopático (tipicamente ao fim de 10-13 dias após a transfecção). Efectua-se a colheita das células que contêm os adenovírus removendo-as, utilizando os meios de cultura, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL. As células colhidas são desmembradas por citólise recorrendo a um ciclo de congelação-descongelação constituído por uma temperatura de -80°C durante 30 minutos e depois 37°C durante 15 minutos. Efectua-se a centrifugação do lisado celular (5 000 x g a 369 20°C durante 15 minutos) para juntar os resíduos celulares. O sobrenadante clarificado que contém as partículas adenovirais é transferido para frascos de frio de 2 mL em aliquotas de 1 mL que devem conter aproximadamente entre lxlO7 e 108 ufp de partículas adenovirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até virem a ser necessárias.

7c. Amplificação de uma provisão adenoviral contendo pAd-DEST/Sintaxina-GFP

Para se amplificar a provisão adenoviral que contém uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g., pAd-DEST/Sintaxina-GFP, faz-se uma aplicação de cerca de 3xl08 células 293A numa placa de cultura de tecidos de 100 mm contendo 10 mL de meios de Eagle Completos Modificados por Dulbecco (DMEM), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS) , uma solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), e espera-se pelo desenvolvimento numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 80-90% da confluência (6-16 horas). As células são inoculadas com 100 pL de provisão adenoviral e são colocadas a incubar durante aproximadamente 48-72 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até estarem desenvolvidas e flutuarem ou ficarem ligeiramente acopladas à placa de cultura. Efectua-se a colheitas de células que contêm o adenovírus removendo-as, com utilização dos meios de cultura, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos 370 para um tubo de 15 mL. As células colhidas são desmembradas por citólise praticando três ciclos de congelação-descongelação, sendo cada um deles constituído por uma temperatura de -80°C durante 30 minutos e depois 37°C durante 15 minutos. Efectua-se a centrifugação do lisado celular (5 000 x g a 20 °C durante 15 minutos) para reunir os resíduos celulares. Transfere-se o sobrenadante clarificado, que contém as partículas adenovirais, para frascos de frio de 2 mL em aliquotas de 1 mL que devem conter aproximadamente entre lxlO8 e 109 ufp de partículas adenovirais. As aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até virem a ser necessárias.

7d. Transdução de células com uma provisão adenoviral que contém pAd-DEST/Sintaxina-GFP

Para se efectuar a transdução de células com a provisão adenoviral que contém uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g.r pAd-DEST/Sintaxina-GFP, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre lxlO5 e lxlO6) de células adequadas numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios de cultura completos e enriquecidos e espera-se que se desenvolvam numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até que as células atinjam uma densidade adequada para a transdução. As células são inoculadas aproximadamente com 4 pL de provisão adenoviral (aproximadamente 5xl08 ufp/mL) e depois ficam a incubar durante aproximadamente 24 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Os meios de transdução são substituídos por 3 mL de meios completos e enriquecidos, renovados e as 371 células ficam a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. As células transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/Cl, utilizando um substrato Sintaxina-GFP. 8. Geração de células contendo um substrato de BoNT/Cl por transdução lentiviral

8a. Construção de pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP

Para se fazer uma construção pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP que codifique um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP utiliza-se um fragmento de ácido nucleico que codifica a região de aminoácidos que compreende um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, que é amplificado, v.g., a partir de ADN de pQBI-25/Sintaxina-l-GFP (ver a alínea 3a do Exemplo I) , praticando um método de reacção em cadeia com polimerase e fazendo a subclonagem num vector pCR2.1, utilizando o método de clonagem 'TOPO® TA' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Os iniciadores oligonucleotídicos directo e inverso, utilizados para esta reacção, são concebidos de modo a conterem locais únicos de enzimas de restrição úteis para os passos de subclonagem subsequentes. A construção resultante pCR2.1/Sintaxina-GFP é digerida com enzimas de restrição que: 1) excisam a inserção que contém a totalidade da grelha de leitura aberta que codifica o péptido Sintaxina-GFP; e 2) habilitam esta inserção a ficar funcionalmente ligada a um vector pLenti6Ubc/V5 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Esta inserção é subclonada, praticando um procedimento com ligase de ADN de 372 Τ4, num vector pLenti6Ubc/V5 que é digerido com endonucleases de restrição adequadas para se obter pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP. A mistura de ligação é transformada em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , praticando um método de choque térmico, sendo distribuídas por placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) com ampicilina na concentração de 100 pg/mL, as quais são colocadas numa incubadora a 37 °C, de um dia para o outro, para desenvolvimento. As bactérias que contêm as construções de expressão são identificadas como sendo colónias resistentes à ampicilina. As construções elegíveis são isoladas praticando um procedimento de minipreparação plasmídica de lise alcalina e analisadas por mapeamento com digestão com endonucleases de restrição para se determinar a presença e a orientação da inserção. Esta estratégia de clonagem proporciona uma construção de expressão em mamíferos que codifica o Sintaxina-GFP funcionalmente ligado aos elementos de expressão do vector pLenti6Ubc/V5, um péptido V5 do terminal amino.

8b. Produção de uma provisão lentiviral contendo pLenti6Ubc/ V5-Sintaxina-GFP

Para se obter uma provisão lentiviral contendo uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, prepara-se 3,0 mL de uma solução de transfecção acrescentando 1,5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 36 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA), incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 1,5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 3 pg de uma construção de expressão que 373 codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g.r pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP, e 9 pg de mistura de acondicionamento 'ViraPower Apos um período aproximado de 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, acrescenta-se os complexos de ADN-lípidos a uma placa de cultura de tecidos de 10 cm contendo 5 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM. Acrescenta-se então 5 mL de uma suspensão celular contendo aproximadamente 6xl05 células 293A aos meios complexos de ADN-lípidos e espera-se pelo seu desenvolvimento numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, de um dia para o outro. Os meios de transfecção são substituídos por 10 mL de meios de Eagle Completos Modificados por Dulbecco (DMEM), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais em meio lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , e espera-se pelo desenvolvimento numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 24-48 horas. As células que contêm os lentivirus são colhidas fazendo a sua remoção, utilizando meios de cultura, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas e os meios são transferidos para um tubo de 15 mL e faz-se a centrifugação (5 000 x g a 20"C durante 15 minutos) para juntar os resíduos celulares. O sobrenadante clarificado contendo as partículas lentivirais é transferido para frascos de frio de 2 mL, em aliquotas de 1 mL, devendo conter aproximadamente entre 5xl05 e 2xl07 ufp/mL de partículas lentivirais. As 374 aliquotas podem ser guardadas a -80°C, até virem a ser necessárias.

8c. Transdução de células com uma provisão lentiviral contendo um pLent±6Ubc/V5-Sintaxina-GFP

Para se efectuar a transdução de células com a provisão lentiviral contendo uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre l,5xl05 e l,5xl06), de células convenientes, numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios de cultura completos e enriquecidos e depois espera-se que as células se desenvolvam numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até que as células atinjam uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). As células são inoculadas com a provisão lentiviral que contém uma construção de expressão que codifica o substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g., pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP, utilizando uma multiplicidade adequada de agente infeccioso e depois ficam a incubar durante aproximadamente 16-24 horas numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Substitui-se os meios de transdução por 3 mL de meios completos, enriquecidos e renovados e mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24-48 horas. As células transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/Cl, utilizando um substrato de Sintaxina-GFP. 375 9. Geração de células que contêm um substrato de BoNT/Cl por transformação proteínica 9a. Expressão de um substrato de Sintaxina-GFP utilizando uma linhagem de células bacterianas

Para a expressão de um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP utilizando bactérias, introduz-se uma construção de expressão que codifique um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g., pQBI-67/Sintaxina-l-GFP, conforme descrito anteriormente na alínea 3b do Exemplo I, em células quimicamente competentes BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), recorrendo a um protocolo de transformação por choque térmico. 0 produto de reacção do choque térmico é depois aplicado sobre placas de ágar contendo 1,5% de meio de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL e depois coloca-se tudo numa incubadora a 37°C de um dia para o outro, para desenvolvimento. Utiliza-se uma única colónia de células de E. coli transformadas, resistentes à ampicilina, contendo pQBI-67/Sintaxina-GFP, para inocular um tubo de ensaio de 15 mL contendo 3,0 mL de meios de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL, o qual é colocado depois numa incubadora a 37°C com agitação a 250 r.p.m., de um dia para o outro, para desenvolvimento. A cultura iniciadora resultante, obtida de um dia para o outro, vai servir para inocular um balão separador de 1,0 L contendo 100 mL de meios de Luria-Bertani (pH 7,0) contendo ampicilina na concentração de 100 pg/mL, com uma diluição de 1:1000. Esta cultura fica a desenvolver-se numa incubadora a 32°C com agitação a 250 r.p.m. durante aproximadamente 6,5 horas até ser alcançada a fase 376 logarítmica média (valor D06oo entre cerca de 0,6-0,8). A expressão da proteína é depois induzida acrescentando isopropil-p-D-tiogalactopiranosido 1 mM (IPTG) e coloca-se a cultura numa incubadora a 32°C com agitação a 250 r.p.m. para que tenha lugar a expressão, de um dia para o outro. Efectua-se a colheita das células por centrifugação (4 000 r.p.m. a 4°C durante 20-30 minutos) para juntar as células. Deita-se fora o sobrenadante e utiliza-se a massa de células imediatamente nos passos subsequentes, ou então guarda-se a massa de células a -80°C, até vir a ser necessária. 9b. Expressão de um substrato de Sintaxina-GFP utilizando uma linhagem de células de mamíferos

Para a expressão de um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, utilizando uma linhagem de células de mamíferos, fez-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre 1,OxlO5 e Ι,ΟχΙΟ6), de células convenientes numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios completos e enriquecidos, desenvolvendo-se numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Prepara-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA) , sujeito a incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g., pQBI-25/Sintaxina-l-GFP (ver a alínea 3a do Exemplo I) . Este produto de transfecção fica a 377 incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Substitui-se os meios completos e enriquecidos por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e acrescenta-se 500 pL de solução de transfecção às células e depois mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C, sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 16 horas. Os meios de transfecção são substituídos por 3 mL de meios completos, enriquecidos e renovados e as células são colocadas a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 48 horas. Efectua-se a colheita das células lavando-as uma vez com 3, 0 mL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4 e removendo as células lavadas, mediante a adição de 500 pL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, e raspando as células para fora da placa de cultura. As células removidas são transferidas para um tubo de ensaio de 1,5 mL e são reunidas por microcentrifugação (10 000 x g a 4°C durante 5 minutos). Deita-se fora o sobrenadante e utiliza-se a massa de células imediatamente para os passos subsequentes ou então guarda-se essa massa de células a -80°C até vir a ser necessária.

9c. Purificação de um substrato de Sintaxina-GFP

Para se purificar um substrato de Sintaxina-GFP, com uma massa de células em que tem lugar a expressão de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g., quer uma construção pQBI-67/Sintaxina-l-GFP, quer uma construção pQBI-25/Sintaxina-l-GFP, prepara-se nova suspensão em 10 mL de tampão Tris-EDTA (Tris-HCl 10 mM a pH 8,0; EDTA 1 mM a pH 378 8,0), contendo lisozimas na concentração de 1 mg/mL e depois efectua-se o desmembramento celular por citólise, recorrendo a três ciclos de congelação-descongelação, sendo cada um deles constituído por uma temperatura de -80 °C durante 5 minutos e depois 37°C durante 5 minutos. Submete-se o lisado celular a centrifugação (5 000 x g a 4°C durante 15 minutos) para reunir os residuos celulares e depois transfere-se o sobrenadante para um tubo limpo contendo um volume igual de tampão de ligação à coluna (sulfato de amónio 4 M) . Prepara-se uma coluna de cromatografia por interacção hidrofóbica (HIC) utilizando 20 mL de um suporte 'Econo-Pac' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que é acondicionado com 2,5-5,0 mL de resina metilica para HIC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) , a qual é depois equilibrada fazendo a lavagem com tampão de equilíbrio da coluna correspondente a 5 volumes de coluna (sulfato de amónio 2 M) . O lisado clarificado é aplicado lentamente à coluna equilibrada, por escoamento gravimétrico (aproximadamente 0,25-0,3 mL/minuto). A seguir lava-se a coluna com tampão de lavagem de coluna correspondente a 5 volumes de coluna (sulfato de amónio 1,3 M) . Efectua-se a eluição do substrato de Sintaxina-GFP com 20-30 mL de tampão de eluição de coluna (tampão TE 10 mM) e recolhe-se em aproximadamente doze fracções de 1 mL. A evolução da amostra de substrato de Sintaxina-GFP através da coluna e também das correspondentes fracções de eluição que contêm a amostra é monitorizada recorrendo a uma luz ultravioleta proveniente de um transiluminador manual. Determina-se a quantidade de substrato de Sintaxina-GFP existente em cada fracção de eluição por meio do ensaio com o corante de Bradford. De acordo com este procedimento, 379 combina-se uma aliquota de 20 pL, proveniente de cada fracção de 1,0 mL, com 200 pL de reagente proteinico da 'Bio-Rad' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), dilui-se de 1 para 4 com água desionizada e destilada e depois mede-se a intensidade do sinal colorimétrico, utilizando um espectrofotómetro. Considera-se que as cinco fracções com o sinal mais forte compreendem o pico de eluição e juntam-se todas. Determina-se a produção total de proteína estimando a concentração da proteína total existente nas fracções de eluição reunidas que contêm o pico máximo, utilizando γ-globulina de bovino como padrão (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . Ajusta-se a quantidade de substrato de Sintaxina-GFP para uma concentração de proteínas aproximadamente igual a 100 ng/mL.

9d. Transformação proteínica de um substrato de Sintaxina-GFP

Para se transformar um substrato de Sintaxina-GFP, numa linhagem de células de mamíferos, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre Ι,ΟχΙΟ5 e Ι,ΟχΙΟ6), de células convenientes numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios completos e enriquecidos, desenvolvendo-se as células numa incubadora a 37 "C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Prepara-se 200 pL de uma solução de transfecção de proteínas acrescentando 100 pL de água destilada contendo 6 pL de agente transportador de proteínas 'Chariot™' (Active Motif, Carlsbad, CA) a 100 pL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, contendo 1 pg de um substrato de Sintaxina-GFP, e mantém-se 380 esta solução a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Após a incubação, as células são lavadas uma vez por enxaguamento com 3,0 mL de um soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4. Acrescenta-se às células lavadas os 200 pL de solução de transfecção de proteínas, seguindo-se o tratamento com 400 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e depois a células ficam a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 1 hora. Acrescenta-se às células 1 mL de meio de cultura enriquecido, completo e recente, e mantém-se tudo a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 1-2 horas, as células transformadas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/Cl, utilizando o substrato de Sintaxina-GFP.

EXEMPLO V

Geração de células que contêm estavelmente vim substrato de toxina de clostrideo

1. Geração de células que contêm estavelmente vim substrato de BoNT/A, BoNT/Cl OU BoNT/E la. Células Neuro-2A estavelmente transformadas utilizando um procedimento de transposição recombinante

Para se gerar uma linhagem celular estavelmente integrada em que tem lugar a expressão de um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25, utilizando um procedimento recombinante, fez-se uma aplicação de 381

aproximadamente l,5xl05 células Neuro-2A numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meio EMEM completo, enriquecido com 10% de FBS, glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , bicarbonato de sódio na concentração de 1, 5 g/L e uma solução de aminoácidos não essenciais 1 x MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37 "C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células atingirem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL. Preparou-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen,

Carlsbad, CA), com incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, tal como, v.g., pQBI-25/SNAP25206_GFP (ver o número 1 do Exemplo I) . O produto desta transfecção ficou a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Substituiu-se os meios EMEM enriquecidos e completos por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e acrescentou-se os 500 pL da solução de transfecção às células Neuro-2A e depois as células ficaram a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 16 horas. Os meios de transfecção foram substituídos por 3 mL de meio EMEM enriquecido, completo e renovado e as células ficaram a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 48 horas. Os meios foram substituídos por 3 mL de meio EMEM completo e renovado, 382 contendo, G418 na concentração aproximada de 5 pg/mL, 10% de FBS, glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) . As células ficaram a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 4 semanas, tendo os meios esgotados sido substituídos por meio EMEM enriquecido, completo e renovado, selectivo para G418, em cada 4 a 5 dias. Logo que as colónias de Neuro-2A resistentes a G418 ficaram estabelecidas, com os clones resistentes efectuou-se nova aplicação em novas placas de cultura de 35 mL que continham meio EMEM enriquecido, completo e renovado, selectivo para G418, até que estas células alcançaram uma densidade entre 6 e 20xl05 células/mL.

Para se testar a expressão de SNAP-252o6_GFP a partir de linhagens de células Neuro-2A isoladas que integravam estavelmente a construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, tal como, v.g., pQBI-25/SNAP25206_GFP (ver a alínea la do Exemplo I) , utilizando aproximadamente l,5xl0s células Neuro-2A provenientes de cada linhagem de células, fez-se uma aplicação numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meio EMEM enriquecido, completo e selectivo para G418, ficando a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Os meios foram substituídos por 3 mL de meio EMEM enriquecido, completo e 383 renovado, selectivo para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 48 horas, efectuou-se a colheita das células, lavando-as uma vez com 3,0 mL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, e depois foram desmembradas por citólise com um tampão contendo 2-amino-2-hidroximetil-l,3-propanodiol/ácido clorídrico 62,6 mM (Tris-HCl) a pH 6,8 e 2% de lauril-sulfato de sódio (SDS). As células desmembradas por citólise foram centrifugadas a 5 000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para eliminação dos resíduos e depois transferiu-se os sobrenadantes para tubos siliconizados limpos. Efectuou-se a medição das concentrações das proteínas pelo método de Bradford e com elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostragem 1 x SDS com uma concentração de 1 mg/mL ou superior.

Para se detectar a presença do substrato de SNAP-25-GFP, as amostras foram fervidas durante 5 minutos e foram separadas aliquotas de 40 pL por electroforese em gel de poliacrilamida MOPS, utilizando os geles de poliacrilamida pré-moldados 'NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), em condições desnaturantes e redutoras. Os péptidos separados foram transferidos do gel para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), pelo método de Western blot, utilizando um aparelho para a transferência electroforética de células semi-anidro 'Trans-Blot® SD' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . As membranas de PVDF foram bloqueadas por incubação à temperatura ambiente durante 2 horas, numa solução que continha soluto salino tamponado com Tris 25 mM (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol/ácido clorídrico 25 384 mM (Tris-HCl) (pH 7,4), cloreto de sódio 137 mM, cloreto de potássio 2,7 mM) , 0,1% de TWEEN-20®, polioxietileno (20) — monolaureato de sorbitano, 2% de albumina do soro de bovino e 5% de leite em pó desnatado. As membranas bloqueadas ficaram a incubar a 4°C, de um dia para outro, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20® (soluto salino tamponado com Tris 25 mM, 0,1% de TWEEN-20®, polioxietileno (20)-monolaureato de sorbitano) contendo uma diluição a 1:50 000 de anticorpo monoclonal anti-SNAP-25 de murganho (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD). Os blots sondados com os anticorpos primários foram lavados três vezes, durante 15 minutos de cada vez, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20®. As membranas lavadas ficaram a incubar à temperatura ambiente durante 2 horas em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20® e contendo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, anticorpo de cadeia leve e pesada (IgG, H+L) conjugado com peroxidase de rábano (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), enquanto anticorpo secundário. Os blots sondados com o anticorpo secundário foram lavados três vezes, durante 15 minutos de cada vez, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20®. 0 sinal de detecção do substrato de SNAP-252o6_GFP marcado foi visualizado utilizando o sistema de detecção de Western Blot 'ECL Plus™' (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) , e depois obteve-se uma imagem da membrana e quantificou-se o substrato com um aparelho de análise de imagens a trabalhar em modo variável 'Typhoon 9410' e utilizando uma aplicação informática de análise de imagens (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A escolha do tamanho dos pixel (100 a 200 385 pixel) e a regulações de tensão PMT (350 a 600, normalmente 400) dependeram de cada blot individual. Foram identificadas X linhas de células Neuro-2A isoladas que integraram estavelmente e que expressaram o substrato SNAP-25206-GFP de SEQ ID N° 1.

Para se determinar a localização subcelular do substrato de SNAP-25-GFP a partir de linhagens de células Neuro-2A isoladas que integravam estavelmente uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, tal como, v.g., pQBI-25/SNAP25206-GFP (ver a alinea la do Exemplo I), fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células Neuro-2A, provenientes de cada linhagem celular, numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meio EMEM enriquecido, completo e selectivo para G418, tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37 °C sob um atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas) . Os meios foram substituídos por 3 mL de meio EMEM enriquecido, completo e renovado, selectivo para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 24-48 horas, efectuou-se a observação de células vivas utilizando um microscópio de fluorescência invertida. Foram detectadas X linhagens de células Neuro-2A isoladas, com localização da fluorescência de GFP na membrana celular, indicando isso que o SNAP252o6_GFP expresso nestas linhagens de células Neuro-2A isoladas estava correctamente endereçado para a membrana celular. As células estavelmente transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um 386 ensaio de análise de actividade de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E. lb. Células SH-SY5Y estavelmente transduzidas utilizando um procedimento lentiviral

Para se gerar uma linhagem de células estavelmente integradas que expressam um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25, utilizando um procedimento lentiviral, faz-se uma aplicação de l,5xl05 células SH-SY5Y numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios completos EMEM e F12 de Ham à razão de 1:1 (EMEM:F12) , enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sódio 1% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células atingirem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). As células são inoculadas com a provisão lentiviral que contém uma construção de expressão que codifica o substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, tal como, v.g., pLenti6Ubc/V5-SNAP25206-GFP, conforme descrito anteriormente na alínea 2b do Exemplo IV, utilizando uma multiplicidade conveniente de agente infeccioso, e depois fica tudo a incubar durante aproximadamente 16-24 horas numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Os meios de transdução são substituídos por 3 mL de meio EMEM:F12 enriquecido, completo e renovado contendo uma quantidade 387 adequada de blasticidina. Mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 2 semanas, tendo os meios consumidos sido substituídos por meio EMEM:F12 enriquecido, completo e renovado, selectivo para a blasticidina, em cada 3 a 4 dias. Logo que ficam estabelecidas colónias de SH-SY5Y resistentes à blasticidina, os clones resistentes são reaplicados em novas placas de cultura de 35 mm contendo meio EMEM:F12 enriquecido, completo e renovado, selectivo para a blasticidina, até as células atingirem uma densidade entre 6 e 20xl05 células/mL. A presença do substrato de SNAP-25-GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinada por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo V. A localização subcelular do substrato de SNAP-2 52o6_GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinada por microscopia de fluorescência, conforme descrito anteriormente na alínea la do Exemplo V. As células estavelmente transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E. lc. Células SK-N-DZ estavelmente transduzidas utilizando um procedimento de transposição recombinante

Para se gerar uma linhagem de células estavelmente integradas em que tem lugar a expressão de um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E SNAP-25, utilizando um procedimento recombinante, fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células SK-N-DZ numa placa de cultura de tecidos de 35 mm que continha 3 mL de meio DMEM 388 completo enriquecido com 10% de FBS, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), tendo o desenvolvimento decorrido numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL. Preparou-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA) , com incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, tal como, v.g., pQBI-25/SNAP25206_GFP (ver a alínea la do Exemplo I). Manteve-se este produto de transfecção a incubar à temperatura durante aproximadamente 20 minutos. O meio DMEM enriquecido e completo foi substituído por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e acrescentou-se os 500 pL de solução de transfecção às células SK-N-DZ, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 16 horas. Os meios de transfecção foram substituídos por 3 mL de meio DMEM enriquecido, completo e renovado, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 48 horas. Os meios foram substituídos por 3 mL de DMEM completo e renovado, contendo aproximadamente G418 na concentração de 5 pg/mL, 10% de FBS, solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). As 389 células ficaram a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante 4 semanas, tendo os meios esgotados sido substituídos por DMEM enriquecido, completo e renovado, selectivo para G418, em cada 3 a 4 dias. Depois de colónias de SK-N-DZ resistentes a G418 estarem estabelecidas, com os clones resistentes fez-se nova aplicação em novas placas de cultura de 35 mm que continham DMEM completo, enriquecido com G418 na concentração aproximada de 5 pg/mL, 10% de FBS, solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), até tais células alcançarem uma densidade entre 6 e 20xl05 células/mL.

Para se testar a expressão de SNAP-25-GFP, a partir de linhagens de células SK-N-DZ que integraram estavelmente uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl OU BoNT/E, tal como, v.g., pQBI-25/SNAP252o6_GFP (ver a alínea la do Exemplo I), fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células SK-N-DZ, provenientes de cada linhagem celular, numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de DMEM enriquecido e completo, selectivo para G418, tendo o seu desenvolvimento decorrido numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas) . Os meios foram substituídos por 3 mL de meio DMEM enriquecido, completo e renovado, selectivo para G418 e depois as células ficaram a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 48 horas, efectuou-se a colheita das células, lavando-as uma vez com 3, 0 mL de soluto salino tamponado 390 com fosfato 100 mM a pH 7,4, e depois foram desmembradas por citólise com um tampão contendo 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol/ácido clorídrico 62,6 mM (Tris-HCl) a pH 6,8 e 2% de lauril-sulfato de sódio (SDS) . Efectuou-se a centrifugação das células desmembradas a 5 000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para se eliminar os resíduos e fez-se a transferência dos sobrenadantes para tubos siliconizados limpos. Efectuou-se a medição das concentrações das proteínas pelo método de Bradford e com elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostragem 1 x SDS com uma concentração de 1 mg/mL ou superior.

Para se detectar a presença do substrato de SNAP-252o6_ GFP, as amostras foram fervidas durante 5 minutos e foram separadas aliquotas de 40 pL por electroforese em gel de poliacrilamida MOPS, utilizando os geles de poliacrilamida pré-moldados 'NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris' (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), em condições desnaturantes e redutoras. Os péptidos separados foram transferidos do gel para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), pelo método de Western blot, utilizando um aparelho para a transferência electroforética de células semi-anidro 'Trans-Blot® SD' (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . As membranas de PVDF foram bloqueadas por incubação à temperatura ambiente durante 2 horas numa solução que continha soluto salino tamponado com Tris 25 mM (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol/ácido clorídrico 25 mM (Tris-HCl) (pH 7,4), cloreto de sódio 137 mM, cloreto de potássio 2,7 mM) , 0,1% de TWEEN-20®, polioxietileno (20) — monolaureato de sorbitano, 2% de albumina do soro de bovino e 5% de leite em pó desnatado. As membranas bloqueadas ficaram a incubar a 4°C, de um dia para outro, em solução 391 391 GFP de SEQ ID NO 1. salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20® (soluto salino tamponado com Tris 25 mM, 0,1% de TWEEN-20®, polioxietileno (20)-monolaureato de sorbitano) contendo uma diluição a 1:50 000 de anticorpo monoclonal anti-SNAP-25 de murganho (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD). Os blots sondados com anticorpos primários foram lavadas três vezes, durante 15 minutos de cada vez, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20®. As membranas lavadas ficaram a incubar à temperatura ambiente durante 2 horas em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20® e possuindo uma diluição a 1:20 000 de anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina G de murganho, cadeias leve e pesada (IgG, H+L), anticorpo conjugado com peroxidase de rábano (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) , enquanto anticorpo secundário. Os blots sondados com o anticorpo secundário foram lavados três vezes, durante 15 minutos de cada vez, em solução salina tamponada com Tris contendo TWEEN-20®. O sinal de detecção do substrato de SNAP-25206_GFP marcado foi visualizado utilizando o sistema de detecção de Western Blot 'ECL Plus™' (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), e depois obteve-se uma imagem da membrana e quantificou-se o substrato com um aparelho de análise de imagens a trabalhar em modo variável 'Typhoon 9410' e utilizando uma aplicação informática de análise de imagens (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . A escolha do tamanho dos pixel (100 a 200 pixel) e as regulações de tensão PMT (350 a 600, normalmente 400) dependeram de cada blot individual. Foram identificadas X linhagens de células SK-N-DZ isoladas que integraram estavelmente e que expressaram o substrato SNAP-252o6_ 392

Para se determinar a localização subcelular do substrato de SNAP-25206_GFP a partir de linhagens de células SK-N-DZ isoladas que integravam estavelmente uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, tal como, v.g., pQBI-25/SNAP25206_GFP (ver a alinea la do Exemplo I), fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células SK-N-DZ, provenientes de cada linhagem celular, numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meio EMEM enriquecido, completo e selectivo para G418, tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob um atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Os meios foram substituídos por 3 mL de meio EMEM enriquecido, completo e renovado, selectivo para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 24-48 horas, efectuou-se a observação de células vivas, utilizando um microscópio de fluorescência invertida. Foram detectadas X linhagens de células SK-N-DZ isoladas, com localização da fluorescência de GFP na membrana celular, indicando isso que o SNAP25206-GFP expresso nestas linhagens de células SK-N-DZ isoladas estava correctamente endereçado para a membrana celular. As células estavelmente transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E. ld. Células SK-N-DZ estavelmente transduzidas utilizando um procedimento lentiviral

Para se gerar uma linhagem de células estavelmente integradas que expressam um substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou 393

BoNT/E SNAP-25, utilizando um procedimento lentiviral, faz-se uma aplicação de l,5xl05 células SK-N-DZ numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meio completo DMEM, enriquecido com 10% de FBS, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução de aminoácidos não essenciais lx MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) , tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células atingirem uma densidade de cerca de 5xl0s células/mL (6-16 horas). As células são inoculadas com a provisão lentiviral que contém uma construção de expressão que codifica o substrato de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, tal como, v.g., pLenti6Ubc/V5-SNAP25206_GFP, conforme descrito anteriormente na alínea 2b do Exemplo IV, utilizando uma multiplicidade conveniente de agente infeccioso e depois fica tudo a incubar durante aproximadamente 16-24 horas numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Os meios de transdução são substituídos por 3 mL de meio EMEM: F12 enriquecido, completo e renovado contendo uma quantidade adequada de blasticidina. Mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 2 semanas, tendo os meios consumidos sido substituídos por meio EMEM:F12 enriquecido, completo e renovado, selectivo para a blasticidina, em cada 3 a 4 dias. Logo que são estabelecidas colónias de SH-SY5Y resistentes à blasticidina, os clones resistentes são reaplicados em novas placas de cultura de 35 mm contendo meio EMEM:F12 enriquecido, completo e renovado, selectivo para a 394 blasticidina, até as células atingirem uma densidade entre 6 e 20xl05 células/mL. A presença do substrato de SNAP-25-GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinada por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alinea la do Exemplo V. A localização subcelular do substrato de SNAP-252o6-GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinada por microscopia de fluorescência, conforme descrito anteriormente na alinea la do Exemplo V. As células estavelmente transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/A, BoNT/Cl ou BoNT/E, utilizando um substrato de SNAP-25-GFP.

2. Geração de células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT 2a. Células estavelmente transformadas praticando um procedimento de transposição recombinante

Para se gerar uma linhagem de células estavelmente integradas em que tem lugar a expressão de um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP, utilizando um procedimento recombinante, fez-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre lxlO5 e lxlO6 células), de células apropriadas numa placa de cultura de tecidos de 35 mm que continha 3 mL de meios de cultura enriquecidos e completos, tendo o desenvolvimento decorrido numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade adequada para transfecção. Preparou-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' 395 (Invitrogen, Carlsbad, CA), com incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP, tal como, v.g., pQBI-25/VAMP-1-GFP, pQBI-2 5/VAMP-2-GFP ou pQBI-25/VAMP-3-GFP (ver as alíneas 2a, 2b ou 2c do Exemplo I). Manteve-se este produto de transfecção a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. O meio DMEM enriquecido e completo foi substituído por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e acrescentou-se os 500 pL de solução de transfecção às células, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 "C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 16 horas. Os meios de transfecção foram substituídos por 3 mL de meios de cultura enriquecidos, completos e renovados, contendo G418 na concentração aproximada de 5 pg/mL. Manteve-se as células a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 4 semanas, tendo os meios esgotados sido substituídos por meios enriquecidos, completos e renovados, selectivos para G418, em cada 4 a 5 dias. Depois de as colónias resistentes a G418 estarem estabelecidas, com os clones resistentes fez-se nova aplicação em novas placas de cultura de tecidos de 35 mm contendo meios de cultura completos e renovados, enriquecidos com G418 na concentração aproximada de 5 pg/mL, até tais células alcançarem uma densidade entre 6 e 20xl05 células/mL.

Para se testar a expressão de um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, a partir de linhagens de células isoladas que integraram estavelmente 396 uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pQBI-25/VAMP-l-GFP, pQBI-25/VAMP-2-GFP ou pQBI-25/VAMP-3-GFP (ver as alíneas 2a, 2b ou 2c do Exemplo I) , fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células, provenientes de cada linhagem celular, numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de DMEM enriquecido e completo, selectivo para G418, tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37"C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células atingirem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Efectuou-se a substituição dos meios por 3 mL de meios de cultura enriquecidos, completos e renovados, selectivos para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 48 horas, efectuou-se a colheita das células, lavando-as uma vez com 3,0 mL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, e depois foram desmembradas por citólise com um tampão contendo 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol/ácido clorídrico 62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8, e 2% de lauril-sulfato de sódio (SDS). As células desmembradas por citólise foram centrifugadas a 5 000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para se eliminar os resíduos e efectuou-se a transferência dos sobrenadantes para tubos siliconizados limpos. Efectuou-se a medição das concentrações de proteínas pelo método de Bradford e com elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostragem 1 x SDS, com uma concentração de 1 mg/mL ou superior.

Para se detectar a presença de substrato VAMP-GFP, efectuou-se a separação das amostras por electroforese em gel de poliacrilamida 'MOPS', tendo sido feitas as análises 397 pelos processos de Western blot, conforme descrito anteriormente nas alíneas 2a, 4a, 6a, 7a e 8a do Exemplo II, para se identificar as linhagens de células que haviam integrado estavelmente e expressado o substrato de VAMP-GFP .

Para se determinar a localização subcelular do substrato de VAMP-GFP, a partir de linhagens de células isoladas que integraram estavelmente uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP-GFP, tal como, v.g., pQBI-25/VAMP-l-GFP, pQBI-25/VAMP-2-GFP ou pQBI-25/VAMP-3-GFP (ver as alíneas 2a, 2b ou 2c do Exemplo I) , fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células, provenientes de cada uma das linhagens celulares, numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios de cultura enriquecidos e completos, selectivos para G418, tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob um atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas) . Efectuou-se a substituição dos meios por 3 mL de meios de cultura enriquecidos, completos e renovados, selectivos para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 24-48 horas, foi feita uma observação das células vivas, utilizando um microscópio de fluorescência invertida, com a finalidade de se identificar linhagens de células isoladas que exibem fluorescência de GFP localizada na membrana celular, indicando isso que o substrato VAMP-GFP expresso nestas linhagens de células isoladas está correctamente endereçado para a membrana celular. As células estavelmente transduzidas podem ser 398 utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, utilizando um substrato de VAMP-GFP. 2b. Células estavelmente transduzidas praticando um procedimento lentiviral

Para se gerar uma linhagem de células estavelmente integradas que expressam um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT VAMP, praticando um procedimento lentiviral, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre lxlO5 e lxlO6 células), de células convenientes numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios de cultura enriquecidos e completos, ficando a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade adequada para transdução. As células são depois inoculadas com a provisão lentiviral, conforme descrito anteriormente na alínea 5b do Exemplo IV, utilizando uma multiplicidade conveniente de agente infeccioso e depois ficam a incubar durante aproximadamente 16-24 horas numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Os meios de transdução são substituídos por 3 mL de meios enriquecidos, completos e renovados contendo uma quantidade adequada de blasticidina. Mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 2 semanas, sendo os meios esgotados substituídos por meios enriquecidos, completos e renovados, selectivos para a blasticidina, em cada 3 a 4 dias. Depois de as colónias resistentes à blasticidina estarem estabelecidas, com os clones 399 resistentes faz-se nova aplicação em novas placas de cultura de 35 mm contendo meios enriquecidos, completos e renovados, selectivos para a blasticidina, até tais células atingirem uma densidade compreendida entre 6 e 20xl05 células/mL. A presença do substrato de VAMP-GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinadas por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 2a do Exemplo IV. A localização subcelular do substrato de VAMP-GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinada por microscopia de fluorescência, conforme descrito anteriormente na alínea 2a do Exemplo V. As células estavelmente transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, utilizando um substrato de VAMP-GFP. 3. Geração de células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/Cl Sintaxina 3a. Células estavelmente transformadas utilizando um procedimento de transposição recombinante

Para se gerar uma linhagem de células estavelmente integradas em que tem lugar a expressão de um substrato de BoNT/Cl Sintaxina, utilizando um procedimento recombinante, fez-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre lxlO5 e lxlO6 células), de células apropriadas numa placa de cultura de tecidos de 35 mm que continha 3 mL de meios de cultura enriquecidos e completos, tendo o desenvolvimento decorrido numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células 400 alcançarem uma densidade adequada para transfecção. Preparou-se 500 pL de uma solução de transfecção acrescentando 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 15 pL de 'LipofectAmine 2000' (Invitrogen, Carlsbad, CA), com incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 pL de meio sérico reduzido OPTI-MEM contendo 5 pg de uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina, tal como, v.g., pQBI-25/Sintaxina-l-GFP (ver a alinea 3a do Exemplo I). Manteve-se este produto de transfecção a incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. O meio enriquecido e completo foi substituído por 2 mL de meio sérico reduzido OPTI-MEM e acrescentou-se os 500 pL de solução de transfecção às células, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 16 horas. Os meios de transfecção foram substituídos por 3 mL de meios de cultura enriquecidos, completos e renovados e as células ficaram a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 48 horas. Os meios de transfecção foram substituídos por 3 mL de meios de cultura enriquecidos, completos e renovados, contendo G418 na concentração aproximada de 5 pg/mL. Manteve-se as células a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 4 semanas, tendo os meios esgotados sido substituídos por meios enriquecidos, completos e renovados, selectivos para G418, em cada 4 a 5 dias. Depois de as colónias resistentes a G418 estarem estabelecidas, com os clones resistentes fez-se nova aplicação em novas placas de cultura de tecidos de 35 mm 401 contendo meios de cultura completos e renovados, enriquecidos com G418 na concentração aproximada de 5 pg/mL, até tais células alcançarem uma densidade entre 6 e 20xl05 células/mL.

Para se testar a expressão de um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, a partir de linhagens de células isoladas que integraram estavelmente uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g., pQBI-25/Sintaxina-l-GFP (ver a alínea 3a do Exemplo I), fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células, provenientes de cada linhagem celular, numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meio enriquecido e completo, selectivo para G418, tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células atingirem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas). Efectuou-se a substituição dos meios por 3 mL de meios de cultura enriquecidos, completos e renovados, selectivos para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 48 horas, efectuou-se a colheita das células, lavando-as uma vez com 3,0 mL de soluto salino tamponado com fosfato 100 mM a pH 7,4, e depois foram desmembradas por citólise com um tampão contendo 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol/ácido clorídrico 62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8, e 2% de lauril-sulfato de sódio (SDS). As células desmembradas por citólise foram centrifugadas a 5 000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C para se eliminar os resíduos e efectuou-se a transferência dos sobrenadantes para tubos siliconizados limpos. Efectuou-se a medição das concentrações de proteínas pelo método de Bradford e com 402 elas preparou-se nova suspensão em tampão de amostragem 1 x SDS, com uma concentração de 1 mg/mL ou superior.

Para se detectar a presença de substrato de Sintaxina-GFP, efectuou-se a separação das amostras por electroforese em gel de poliacrilamida MOPS, tendo sido feitas as análises pelos processos de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo II, para se identificar as linhagens de células que haviam integrado estavelmente e expressado o substrato de Sintaxina-GFP.

Para se determinar a localização subcelular do substrato de Sintaxina-GFP, a partir de linhagens de células isoladas que integraram estavelmente uma construção de expressão que codifica um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, tal como, v.g., pQBI-25/Sintaxina-l-GFP (ver a alínea 3a do Exemplo I), fez-se uma aplicação de aproximadamente l,5xl05 células, provenientes de cada uma das linhagens celulares, numa placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 3 mL de meios de cultura enriquecidos e completos, selectivos para G418, tendo ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37 °C sob um atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade de cerca de 5xl05 células/mL (6-16 horas) . Efectuou-se a substituição dos meios por 3 mL de meios de cultura enriquecidos, completos e renovados, selectivos para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Decorridas 24-48 horas, foi feita uma observação das células vivas, utilizando um microscópio de fluorescência invertida, com a finalidade de se identificar linhagens de células isoladas que exibem fluorescência de GFP localizada na membrana celular, indicando isso que o 403 substrato Sintaxina-GFP expresso nestas linhagens de células isoladas está correctamente endereçado para a membrana celular. As células estavelmente transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/Cl, utilizando um substrato de Sintaxina-GFP. 3b. Células estavelmente transduzidas praticando um procedimento lentiviral

Para se gerar uma linhagem de células estavelmente integradas que expressam um substrato de BoNT/Cl Sintaxina, praticando um procedimento lentiviral, faz-se uma aplicação, com uma densidade adequada (entre lxlO5 e lxlO6 células), de células convenientes numa placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo 3 mL de meios de cultura enriquecidos e completos, ficando a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, até as células alcançarem uma densidade adequada para transdução. As células são depois inoculadas com a provisão lentiviral, conforme descrito anteriormente na alínea 8b do Exemplo IV, utilizando uma multiplicidade conveniente de agente infeccioso e depois ficam a incubar durante aproximadamente 16-24 horas numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Os meios de transdução são substituídos por 3 mL de meios enriquecidos, completos e renovados contendo uma quantidade adequada de blasticidina. Mantém-se as células a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 2 semanas, sendo os meios esgotados substituídos por meios enriquecidos, completos e renovados, selectivos para a 404 blast icidina, em cada 3 a 4 dias. Depois de as colónias resistentes à blasticidina estarem estabelecidas, com os clones resistentes faz-se nova aplicação em novas placas de cultura de 35 mm contendo meios enriquecidos, completos e renovados, selectivos para a blasticidina, até tais células atingirem uma densidade compreendida entre 6 e 20xl01 2 3 4 5 células/mL. A presença do substrato de Sintaxina-GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinadas por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo V. A localização subcelular do substrato de Sintaxina-GFP nas linhagens de células isoladas irá ser determinada por microscopia de fluorescência, conforme descrito anteriormente na alínea 3a do Exemplo V. As células estavelmente transduzidas podem ser utilizadas para se efectuar um ensaio de análise de actividade de BoNT/Cl, utilizando um substrato de Sintaxina-GFP.

EXEMPLO VI

Condições de Optimização para os ensaios de FRET à base de corantes lipofílicos 1

Identificação de corantes lipofílicos adequados para ensaios de FRET à base de corantes lipofílicos 2

Para se determinar a conveniência de um corante 3 lipofílico enquanto segundo componente de um par de FRET, 4 examinou-se, em primeiro lugar, o espectro de absorvência 5 de diversos corantes lipofílicos, para sobreposição espectral do espectro de emissões do primeiro componente de um par de FRET. Os corantes elegíveis foram seleccionados 405 com base numa sobreposição espectral conveniente (ver o Quadro 14).

Para se avaliar a conveniência de corantes lipofílicos seleccionados como segundos componentes de um par de FRET, submete-se a ensaios para FRET os pares de FRET elegíveis. A título de exemplo não limitativo, efectuou-se o tratamento prévio de uma linhagem de células Neuro-2A que continham estavelmente um substrato de SNAP-252o6-GFP, com diferentes corantes lipofílicos para se determinar se poderia ocorrer FRET. Fez-se uma aplicação de aproximadamente 2,5xl05 células Neuro-2A em cada cavidade de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades contendo 2 mL de meio EMEM enriquecido e completo, selectivo para G418, tendo as células ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, de um dia para o outro, para permitir a fixação das células. Os meios foram substituídos por 3 mL de meio EMEM isento de soro, renovado, selectivo para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células ficaram a incubar durante 2 horas nos meios isentos de soro contendo 0,1 μΜ, 1,0 μΜ e 10 μΜ de cada um dos corantes lipofílicos seguintes: Dil Vibrant, DilCi8(3), DilCis (3)-DS, SP-DilCis, 5-5' -Ph2-DilCi8 e DiD (ver o quadro 14) . Os diversos corantes foram seleccionados de tal modo que não fossem excitados por raios laser de 488 nm (espectros de absorção ~550 - 590 nm) e pudessem necessitar de uma transferência de energia proveniente de SNAP25206“GFP para que houvesse fluorescência. O rastreio das células foi feito utilizando um aparelho 'Typhoon 9140' 406 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) regulado para os parâmetros seguintes: excitação laser regulada para 488 nm, com as emissões detectadas utilizando um filtro de captação regulado para 610 nm ± 30 nm, com o plano focal do laser 3 mm acima do vidro. As células Neuro-2A que expressam SNAP252o6-GFP revelam um aumento de fluorescência vermelha nas células expostas a diversos corantes, em concentrações variando entre 1 μΜ e 10 μΜ, durante 2 horas. Por exemplo, foi observada fluorescência nas células que expressam SNAP252o6_GFP corado, contendo 1,0 μΜ de Dil Vibrant, 1,0 μΜ de Dí1Cis(3) ou 1,0 μΜ de DilCi8(3)-DS (FIG. 11). No entanto, não houve nenhuma fluorescência, para este comprimento de onda, que tivesse sido detectada nas células de referência às quais lhe faltava SNAP25206_GFP (não transfectadas) tratadas com 1,0 μΜ de Dil Vibrant, 1,0 μΜ de DilCisO) ou 1,0 μΜ de DilCi8(3)-DS (FIG. 11). Estes resultados indicam que o aumento de fluorescência vermelha nas células que expressam SNAP25206_GFP se ficou a dever à transferência de energia de GFP excitado para o corante membranar e subsequente emissão pelo corante.

Para se avaliar a conveniência de uma proteína fluorescente seleccionada como segundo componente de um par de FRET, são testados para FRET pares de FRET elegíveis. A título de exemplo não limitativo, efectuou-se o tratamento prévio de uma linhagem de células Neuro-2A que continham estavelmente um substrato de SNAP-25206_GFP, com diferentes corantes lipofílicos para se determinar se poderia ocorrer FRET. Fez-se uma aplicação de aproximadamente 2,5xl05 células Neuro-2A em cada cavidade de uma placa de cultura de tecidos de 2 4 cavidades contendo 2 mL de meio EMEM enriquecido e completo, selectivo para G418, tendo as 407 células ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, de um dia para o outro, para permitir a fixação das células. Os meios irão ser substituídos por 3 mL de meio EMEM isento de soro, renovado, selectivo para G418, e as células irão ser incubadas numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente três dias, para indução da diferenciação. As células ficaram a incubar durante 2 horas nos meios isentos de soro contendo 0,1 μΜ, 1,0 μΜ e 10 μΜ de cada um dos corantes lipofílicos seguintes: 4-DÍ-16-ASP, 4-Di-lO-ASP, FAST DiA (ver o quadro 14) . A proteína fluorescente irá ser seleccionada de tal modo que não seja excitada por um laser de 493 nm (espectros de absorção ~500 - 600 nm) e venha a necessitar de transferência de energia proveniente dos corantes lipofílicos para que haja fluorescência. O rastreio das células foi feito utilizando um aparelho 'Typhoon 9140' (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) regulado para os parâmetros seguintes: excitação laser regulada para 492 nm, sendo as emissões detectadas utilizando um filtro de captação regulado para 618 nm ± 30 nm, com o plano focal do laser 3 mm acima do vidro. As células Neuro-2A que contêm um par de FRET adequado, o corante lipofílico SNAP25206“ HcRedl, irão manifestar um aumento de fluorescência vermelha devido à transferência de energia do corante lipofílico excitado para o SNAP25206~HcRedl.

Para se determinar se a actividade de uma toxina de clostrídeo poderia ser medida utilizando o ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, em que o primeiro componente de FRET é uma proteína fluorescente e o segundo componente é um corante lipofílico, deixou-se desenvolver células 408

Neuro-2A que continham estavelmente um substrato de SNAP2 52o6_GFP , uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, tendo sido diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 1 do Exemplo VI. As células diferenciadas foram depois expostas a 5 nM de BoNT/A durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/A ficaram depois a incubar durante 2 horas com um dos corantes lipofílicos seguintes: Dil Vibrant, DilCis(3), SP-DilCis, 5-5'-Ph2-DilCi8 e DiD. As células foram excitadas com uma emissão de laser de 488 nm, tendo as emissões sido capturadas a 610 nm ± 30 nm. Nas células coradas com

Dil18(3), houve um aumento do sinal de fluorescência a 610 nm, após o tratamento com BoNT/A, comparativamente com as células de referência não tratadas (ver a figura 12a) . Estes dados indicam que a actividade de BoNT/A pode ser detectada utilizando o ensaio de FRET. A fluorescência detectada em cada ensaio foi quantificada utilizando a aplicação informática 'TYPHOON 9140 IMAGE QUANT TL A' (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Esta aplicação informática atribui um valor numérico a cada cavidade que contenha células, com base na quantidade (volume) de fluorescência emitida. A quantidade de fluorescência foi depois expressa em termos de percentagem de células de referência não tratadas, para compensar a fluorescência espontânea dos corantes (figuras 12b). Houve uma diminuição de 30% em FRET nas células tratadas com BoNT/A comparativamente com células de referência não tratadas, utilizando o marcador DilCis(3) lipofilico.

Para se determinar se a actividade de uma toxina de clostrideo poderia ser medida utilizando o ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, em que o primeiro componente 409 de FRET é uma proteína fluorescente e o segundo componente é um corante lipofílico, deixou-se desenvolver células Neuro-2A que continham estavelmente um substrato de SNAP252o6~HcRedl, uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, tendo sido diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 1 do Exemplo VI. As células diferenciadas foram depois expostas a 5 nM de BoNT/A durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/A ficaram depois a incubar durante 2 horas com um dos corantes lipofílicos seguintes: 4-DÍ-16-ASP, 4-Di-lO-ASP, FAST DiA. As células são excitadas com uma emissão de laser de 492 nm, tendo as emissões sido capturadas a 618 nm ± 30 nm. A fluorescência detectada em cada ensaio foi quantificada utilizando a aplicação informática 'TYPHOON 9140 IMAGE QUANT TL A' (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Esta aplicação informática atribui um valor numérico a cada cavidade que contenha células, com base na quantidade (volume) de fluorescência emitida. A quantidade de fluorescência foi depois expressa em termos de percentagem de células de referência não tratadas, para compensar a fluorescência espontânea da proteína fluorescente. As células que manifestaram uma diminuição do sinal fluorescente a 618 nm, após o tratamento com BoNT/A, comparativamente com as células de referência não tratadas, servem para indicar que a actividade de BoNT/A pode ser detectada recorrendo ao ensaio FRET. 410

Quadro 14 Sobreposição Máxima de Excitação e Emissão de Pares de FRET Exemplificativos Dador Aceitador Espectro de Emissão (nm) Exemplos Espectro de Absorvência (nm) Exemplos BFP (420-460) Tag (425-495) EBFP, BG-430, HaloTag Coumarina DiO (425-500) DiA (400-500) Tag (410-430) FAST DiO, DiOCls (3) , DiOCi6(3), SP-DiOC18 (3) , 4-DÍ-16-ASP, 4-Di-lO-ASP, FAST DiA, FM® 1-43, BG-430 CFP (460-500) Tag (425-495) ECFP, AmCyan, BG- 430 DiO (425-500) DiA (400-500) FM (400-525)/ (425-575) Tag (485-520) FAST DiO, DiOC18(3) , DiOC16 (3) , SP-DiOC18 (3) , 4-DÍ-16-ASP, 4-Di-lO-ASP, FAST DiA, FM® 1-43, FM® 1-84, FM® 2-10, FM® 4-64, FM® 5-95, RH 414, FlAsH, BG-505, BG-488, BG-432, HaloTag diAcFAM 411

Quadro 14 Sobreposição Máxima de Excitação e Emissão de Pares de FRET Exemplificativos Dador Aceitador Espectro de Emissão (nm) Exemplos Espectro de Absorvência (nm) Exemplos GFP (500-520) Tag (515-540) AcGFP, ZsGreen, Vitality® hfGFP, EGFP, Monster Green, FIAsH, BG-DAF, BG-488, HaloTag diAcFAM Dil (500-560) FM (400-525)/ (425-575) Tag (525-565) DilC18(3) , DilC16 (3) , DÍIC12 (3) , FAST Dil, Δ9—Dil, FM®Dil, CellTracker CM-Dil, DilCi8(3)-DS SP-Dí1C18 (3) , Br2-DilCis (3) , FM® 1-43, FM®1-84, FM® 2-10, FM® 4-64, FM® 5-95, RH 414, BG-532, BG-547, TMR-Star YFP (520-550) Tag (515-540) Tag (520-565) EYFP, ZsYellow, FIAsH, BG-DAF, BG-488, HaloTag diAcFAM, BG-505, BG-532 Dil (500-560) FM (400-525)/ (425-575) Tag (525-565) DilC18(3), DilC18(3), DilC12(3), FAST Dil, A9-Dil, FM® Dil, CellTracker CM-Dil, DilC18 (3) -DS, SP-DilC18 (3) , Br2-DilCi8 (3) , FM® 1- 43, FM® 1-84, FM® 2- 10, FM® 4-64, FM® 5-95, RH 414, BG-532, BG-547, TMR-Star, HaloTag TMR 412

Quadro 14 Sobreposição Máxima de Excitação e Emissão de Pares de FRET Exemplificativos Dador Aceitador Espectro de Emissão (nm) Exemplos Espectro de Absorvência (nm) Exenqplos RFP (550-740) Tag (560-770) DsRed, DsRed2, DsRed- Express, AsRed2, HcRedl, ReAsH, BG-547, TMR-Star, BG-600, BG-632, BG-647, BG-732, BG-747, HaloTag TMR DiD (575-660) DiR (625-770) Tag (580-760) 5, 5 ' -Ph2-DilC18 (3) , DilCis (5) , DilCis (5) -DS, DilC18 (7) , ReAsH, BG-600, BG-632, BG-647, BG-732, BG-747 DPH (420-460) ANS (410-510) DCVJ (480-500) DPH, TMA-DPH, 1,8-ANS, 2,6-ANS, 2,6-TNS, bis-ANS, DCVJ GFP (425-505) YFP (450-525) RFP (475-575) Atenuadores* AcGFP, ZsGreen, Vitality® hfGFP, EGFP, MonsterGreen, EYFP, ZsYellow, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRedl Dabcilo, Dabsilo, BHQ-0, BHQ-1, QSY 7/QSY 9 DiO (500-520) Dapoxilo (490— 530) FAST DiO, DiOCis (3) , DiOC18 (3) , SP-DiOCie (3), Prodan, Laurdan, Acrilodan, Badan, ácido dapoxil-sulfónico GFP (425-505) YFP (450-525) RFP (475-575) Atenuadores* AcGFP, ZsGreen, Vitality® hfGFP, EGFP, Monster Green, EYFP, ZsYellow, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRedl, Dabcilo, Dabsilo, BHQ-0, BHQ-1, QSY 7/QSY 9 413

Quadro 14 Sobreposição Máxima de Excitação e Emissão de Pares de FRET Exempl i f i cat ivos Dador Aceitador Espectro de Emissão (nm) Exemplos Espectro de Absorvência (nm) Exemplos Dil (560-580) DilC16(3) , DilC16(3) , DÍIC12 (3) , FAST Dil, A9-Dil, FM® Dil, CellTracker CM-Dil, DilCis (3)-DS, SP-DilC18(3), Br2-DilC18 (3) RFP (475-575) RFP (500-600) Atenuadores* DsRed, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRedl, BHQ-1, QSY 7/QSY 9, BHQ-2, QSY 21, BHQ-3 DiA (590-620) FM (590-610) 5, 5 ' -Ph2-DilCi8 (3) , 4-Di-l6-ASP, 4-Di-10-ASP, FAST DiA, FM® 1-43 RFP (475-575) RFP (500-600) Atenuadores* DsRed, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRedl, BHQ-1, QSY 7/QSY 9, BHQ-2, QSY 21, BHQ-3 * 0 espectro de absorvência dos atenuadores varia: Dabcilo (400-525), Dabsilo (400-525), BHQ-0 (430-520), BHQ-1 (480-580), OSY 7/QSY 9 (500-600), BHQ-2 (559-650), QSY 21 (575-725), BHQ-3 (620-730).

Utilizando os procedimentos descritos anteriormente, é possível testar linhagens de células que contêm estavelmente um substrato de VAMP-GFP ou um substrato de Sintaxina-GFP, descritos na presente memória descritiva, com diferentes corantes lipofílicos para se identificar corantes que suscitem uma resposta de FRET adequada, útil para a prática dos aspectos da presente invenção. De igual modo, os substratos de toxina de clostrídeo funcionalmente ligados a uma proteína fluorescente diferente, tal como, v.g., uma BFP, uma CFP, uma YFP ou uma RFP podem ser testados com diferentes corantes lipofílicos para se 414 identificar os corantes que suscitem uma resposta de FRET útil para a prática dos aspectos da presente invenção (ver o quadro 14) . Além disso, os procedimentos anteriormente descritos permitem testar diversos corantes lipofílicos, enquanto fluoróforos dadores adequados, em conjunto com proteínas fluorescentes, enquanto aceitadores (ver o quadro 14) . 2. Optimização das condições dos corantes lipofílicos para ensaios de FRET à base de corantes lipofílicos

Faz-se a avaliação de diferentes concentrações dos corantes lipofílicos e de diferentes períodos de carregamento dos corantes com a finalidade de se determinar condições de FRET optimizadas para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos.

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofílicos, para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, para determinação da actividade de BoNT/A, deixou-se desenvolver células Neuro-2A que continham estavelmente um substrato de SNAP-252o6-GFP, uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, tendo sido diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 1 do exemplo VI. As células diferenciadas foram depois expostas a 1 nM de BoNT/A durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/A ficaram então a incubar com 0 μΜ, 0,5 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ, 5,0 μΜ ou 10 μΜ de DilCi8(3) e determinou-se a FRET utilizando a aplicação lógica 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm, ao fim de 2 horas, 4 horas, 6 horas e 8 horas. A maior diferença entre células Neuro-2A tratadas com BoNT/A e células Neuro-2A não tratadas ocorreu quando as células 415 fiaram a incubar com DilCig(3) num intervalo de concentrações entre 1,25 μΜ -2,5 μΜ, durante aproximadamente 4 a 6 horas (Figura 13). Será praticado um procedimento semelhante para optimizar condições, utilizando um corante lipofílico como fluoróforo dador e um substrato de BoNT/A como aceitador.

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofilicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos, para determinação da actividade de BoNT/B, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/B VAMP-GFP ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, v.g., conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo V. Os meios foram substituídos por 2 mL de meios isentos de soro, renovados e selectivos para os antibióticos, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células diferenciadas foram depois expostas a 1 nM de BoNT/B durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/B irão ficar então a incubar com 0 μΜ, 0,5 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ, 5,0 μΜ ou 10 μΜ de um corante lipofílico adequado, v.g., conforme identificado anteriormente no número 1 do Exemplo VI, e determina-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm ao fim de 2 horas, 4 horas, 6 horas e 8 horas. A maior diferença na resposta de FRET entre células tratadas com BoNT/B e células não tratadas irá identificar as concentrações de corantes convenientes e os períodos de carregamento dos corantes, úteis para a prática dos aspectos da presente invenção. 416

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofilicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos, para determinação da actividade de BoNT/Cl, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/Cl SNAP-GFP ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, v.g., conforme descrito anteriormente no número 1 do Exemplo V. Os meios foram substituídos por 2 mL de meios isentos de soro, renovados e selectivos para os antibióticos, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células diferenciadas foram depois expostas a 1 nM de BoNT/Cl durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/Cl irão ficar então a incubar com 0 μΜ, 0,5 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ, 5,0 μΜ ou 10 μΜ de um corante lipofílico adequado, v.g., conforme identificado anteriormente no número 1 do Exemplo VI, e determina-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm ao fim de 2 horas, 4 horas, 6 horas e 8 horas. A maior diferença na resposta de FRET entre células tratadas com BoNT/Cl e células não tratadas irá identificar as concentrações de corantes convenientes e os períodos de carregamento dos corantes, úteis para a prática dos aspectos da presente invenção.

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofilicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos, para determinação da actividade de BoNT/D, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/D VAMP-GFP ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, v.g., conforme descrito 417 anteriormente no número 2 do Exemplo V. Os meios foram substituídos por 2 mL de meios isentos de soro, renovados e selectivos para os antibióticos, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células diferenciadas foram depois expostas a 1 nM de BoNT/D durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/D irão ficar então a incubar com 0 μΜ, 0,5 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ, 5,0 μΜ ou 10 μΜ de um corante lipofílico adequado, v.g., conforme identificado anteriormente no número 1 do Exemplo VI, e determina-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm ao fim de 2 horas, 4 horas, 6 horas e 8 horas. A maior diferença na resposta de FRET entre células tratadas com BoNT/D e células não tratadas irá identificar as concentrações de corantes convenientes e os períodos de carregamento dos corantes, úteis para a prática dos aspectos da presente invenção.

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofílicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, para determinação da actividade de BoNT/E, fez-se uma aplicação de aproximadamente 2,5xl05 células SH-SY5Y que continham estavelmente um substrato de SNAP-25206-GFP em cada uma das cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades contendo 2 mL de meios EMEM e F12 de Ham na proporção de 1:1, selectivos para G418 (EMEM:F12), enriquecidos com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1% de piruvato de sódio (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), bicarbonato de sódio na concentração de 1,5 g/L, uma 418 solução de lx penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) e uma solução lx MEM de aminoácidos não essenciais (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), tendo as células ficado a desenvolver-se numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, de um dia para o outro, para permitir a fixação das células. Efectuou-se a substituição dos meios por 3 mL de EMEM:F12 isento de soro, renovado, selectivo para G418, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células diferenciadas foram depois expostas a 100 nM de BoNT/E durante aproximadamente 18-24 horas. As células tratadas com BoNT/E ficaram depois a incubar com 0 μΜ, 0,25 μΜ, 0,5 μΜ, 1,0 μΜ, 2,5 μΜ ou 5,0 μΜ de DÍ1C18 (3) ou com octadecil-rodamina B e determinou-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm ao fim de 2 horas, 4 horas e 6 horas. A maior entre as células SH-SY5Y tratadas com BoNT/E e as células SH-SY5Y não tratadas ocorreu quando as células estiveram a incubar com 0,5 μΜ de DÍ1C18 (3) durante aproximadamente 4 a 6 horas (figuras 14a).

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofilicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos, para determinação da actividade de BoNT/F, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/F VAMP-GFP ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, v.g., conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo V. Os meios foram substituídos por 2 mL de meios isentos de soro, renovados e selectivos para os antibióticos, tendo as células ficado a 419 incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células diferenciadas foram depois expostas a 1 nM de BoNT/F durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/F irão ficar então a incubar com 0 μΜ, 0,5 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ, 5,0 μΜ ou 10 μΜ de um corante lipofilico adequado, v.g.r conforme identificado anteriormente no número 1 do Exemplo VI, e determina-se FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm ao fim de 2 horas, 4 horas, 6 horas e 8 horas. A maior diferença na resposta de FRET entre células tratadas com BoNT/F e células não tratadas irá identificar as concentrações de corantes convenientes e os períodos de carregamento dos corantes, úteis para a prática dos aspectos da presente invenção.

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofilicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, para determinação da actividade de BoNT/G, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/G VAMP-GFP ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, v.g., conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo V. Os meios foram substituídos por 2 mL de meios isentos de soro, renovados e selectivos para os antibióticos, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células diferenciadas foram depois expostas a 1 nM de BoNT/G durante 16 horas. As células tratadas com BoNT/G irão ficar então a incubar com 0 μΜ, 0,5 μΜ, 1,2 5 μΜ, 2,5 μΜ, 5,0 μΜ ou 10 μΜ de um 420 corante lipofílico adequado, v.g., conforme identificado anteriormente no número 1 do Exemplo VI, e determina-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm ao fim de 2 horas, 4 horas, 6 horas e 8 horas. A maior diferença na resposta de FRET entre células tratadas com BoNT/G e células não tratadas irá identificar as concentrações de corantes convenientes e os períodos de carregamento dos corantes, úteis para a prática dos aspectos da presente invenção.

Para se determinar melhores condições para os corantes lipofílicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, para determinação da actividade de BoNT/F, as células que contêm estavelmente um substrato de TeNT VAMP-GFP ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades, v.g., conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo V. Os meios foram substituídos por 2 mL de meios isentos de soro, renovados e selectivos para os antibióticos, tendo as células ficado a incubar numa incubadora a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante aproximadamente 3 dias, para indução da diferenciação. As células diferenciadas foram depois expostas a 1 nM de TeNT durante 16 horas. As células tratadas com TeNT irão ficar então a incubar com 0 μΜ, 0,5 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ, 5,0 μΜ ou 10 μΜ de um corante lipofílico adequado, v.g., conforme identificado anteriormente no número 1 do Exemplo VI, e determina-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm ao fim de 2 horas, 4 horas, 6 horas e 8 horas. A maior diferença na resposta de FRET entre células tratadas com 421

TeNT e células não tratadas irá identificar as concentrações de corantes convenientes e os períodos de carregamento dos corantes, úteis para a prática dos aspectos da presente invenção.

Os procedimentos descritos anteriormente podem ser utilizados para optimizar as condições dos corantes lipofílicos para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para se avaliar a actividade da toxina de clostrídeo, utilizando corantes lipofílicos como fluoróforos dadores em conjunto com proteínas fluorescentes, enquanto aceitadores, utilizando, v.g., as condições descritas anteriormente no número 1 do Exemplo VI. 3. Optimização das condições da toxina de clostrideo para ensaios de FRET à base de corantes lipofílicos.

Fez-se a avaliação de diferentes concentrações de toxina de clostrídeo e de diferentes períodos de tratamento com toxina de clostrídeo com a finalidade de se determinar as melhores condições de FRET para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos.

Para se determinar as melhores condições de BoNT/A para um ensaio FRET à base de corantes lipofílicos, foram utilizadas células Neuro-2A que contêm estavelmente um substrato de SNAP-25206-GFP, as quais ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e que foram diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 1 do Exemplo VCI. As células diferenciadas foram depois expostas a diversos valores de concentrações de BoNT/A (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM e 20 nM) e ficaram a incubar durante diversos 422 períodos distintos (15 minutos, 1 hora, 16 horas e 3 dias). As células tratadas com BoNT/A ficaram a incubar com 1,25 μΜ de DilCi8(3) durante 6 horas e determinou-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Observou-se uma resposta à dose em células tratadas durante 16 horas e durante 3 dias. No caso dos tratamentos de 16 horas, detectou-se um sinal positivo com BoNT/A (150 KDa) em concentrações da ordem de 0,5 nM (FIG. 15a). Os tratamentos de três dias produziram sinais positivos para concentrações de BoNT/A da ordem de 0,05 nM (FIG. 15b).

Para se determinar melhores condições de BoNT/B para um ensaio FRET à base de corantes lipofílicos, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/B VAMP-GFP irão ser desenvolvidas uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e irão ser diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo VI. As células diferenciadas irão ser depois expostas a diversos valores de concentrações de BoNT/B (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM e 2 0 nM) e irão ser incubadas ao longo de diversos períodos distintos (15 minutos, 1 hora, 16 horas e 3 dias). As células tratadas com BoNT/B irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um período conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e determinar-se-á a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Irá ser gerada uma resposta à dose e irá ser determinada a concentração adequada de BoNT/B e o período de tratamento.

Para se determinar melhores condições de BoNT/Cl para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, as 423 células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/Cl SNAP-GFP irão ser desenvolvidas uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e irão ser diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 1 do Exemplo VI. As células diferenciadas irão ser depois expostas a diversos valores de concentrações de BoNT/Cl (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM e 2 0 nM) e irão ser incubadas ao longo de diversos períodos distintos (15 minutos, 1 hora, 16 horas e 3 dias) . As células tratadas com BoNT/Cl irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um período conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e determinar-se-á a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Irá ser gerada uma resposta à dose e irá ser determinada a concentração adequada de BoNT/Cl e o período de tratamento.

Para se determinar melhores condições de BoNT/D para um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/D VAMP-GFP irão ser desenvolvidas uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e irão ser diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo VI. As células diferenciadas irão ser depois expostas a diversos valores de concentrações de BoNT/D (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM e 20 nM) e irão ser incubadas ao longo de diversos períodos distintos (15 minutos, 1 hora, 16 horas e 3 dias) . As células tratadas com BoNT/D irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um período conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e determinar-se-á a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação de 488 424 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Irá ser gerada uma resposta à dose e irá ser determinada a concentração adequada de BoNT/D e o período de tratamento.

Para se determinar melhores condições de BoNT/E para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, foram utilizadas células SH-SY5Y contendo estavelmente um substrato de SNAP-25208_GFP que ficaram a desenvolver-se uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e que foram diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 1 do Exemplo VI. As células diferenciadas irão ser depois expostas a diversos valores de concentrações de BoNT/E (0 nM, 0,0 5 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 2,0 nM 5,0 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM e 200 nM) e ficaram a incubar durante aproximadamente 18-24 horas. As células tratadas com BoNT/E ficaram a incubar com 0,5 μΜ de DiLCis(3) durante 6 horas e determinou-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Observou-se uma resposta à dose nas células tratadas durante 24 horas e detectou-se um sinal positivo com concentrações de BoNT/E (150 KDa) da ordem de 0,05 nm (FIG. 16).

Para se determinar melhores condições de BoNT/F para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/F VAMP-GFP irão ser desenvolvidas uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e irão ser diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo VI. As células diferenciadas irão ser depois expostas a diversos valores de concentrações de BoNT/F (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM e 20 nM) e irão ser incubadas ao longo de diversos períodos distintos (15 minutos, 1 hora, 425 16 horas e 3 dias) . As células tratadas com BoNT/F irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um período conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e determinar-se-á a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Irá ser gerada uma resposta à dose e irá ser determinada a concentração adequada de BoNT/F e o período de tratamento.

Para se determinar melhores condições de BoNT/G para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, as células que contêm estavelmente um substrato de BoNT/G VAMP-GFP irão ser desenvolvidas uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e irão ser diferenciadas conforme descrito anteriormente no número 2 do Exemplo VI. As células diferenciadas irão ser depois expostas a diversos valores de concentrações de BoNT/G (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM e 2 0 nM) e irão ser incubadas ao longo de diversos períodos distintos (15 minutos, 1 hora, 16 horas e 3 dias) . As células tratadas com BoNT/G irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um período conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e determinar-se-á a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Irá ser gerada uma resposta à dose e irá ser determinada a concentração adequada de BoNT/G e o período de tratamento.

Para se determinar melhores condições de TeNT para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, as células que contêm estavelmente um substrato de TeNT VAMP-GFP irão ser desenvolvidas uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e irão ser diferenciadas conforme descrito 426 anteriormente no número 2 do Exemplo VI. As células diferenciadas irão ser depois expostas a diversos valores de concentrações de TeNT (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM e 20 nM) e irão ser incubadas ao longo de diversos períodos distintos (15 minutos, 1 hora, 16 horas e 3 dias). As células tratadas com TeNT irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um período conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e determinar-se-á a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140', com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. Irá ser gerada uma resposta à dose e irá ser determinada a concentração adequada de TeNT e o período de tratamento.

Os procedimentos descritos anteriormente podem ser utilizados para melhorar as condições das toxinas de clostrídeo para o ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos em que os corantes lipofílicos servem de fluoróforos dadores, em conjunto com proteínas fluorescentes que são aceitadores, utilizando, v.g., as condições descritas anteriormente no número 1 do Exemplo VI. 4. Condições de optimização das placas de cultura para ensaios de FRET à base de corantes lipofílicos

Para se determinar melhores condições de FRET para um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos, fez-se uma avaliação em placas escuras de cultura de tecidos com fundos transparentes. Foram utilizadas células Neuro-2a que contêm estavelmente um substrato de SNAP-25206-GFP que ficaram a desenvolver-se em placas de culturas de tecidos de 24 cavidades e que foram diferenciadas conforme descrito 427 anteriormente no número 1 do Exemplo VI, com a excepção de terem sido utilizadas placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes em vez de placas de plástico transparentes de 24 cavidades para cultura de tecidos. As células diferenciadas foram então expostas a diversas concentrações de BoNT/A (0 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 2,0 nM, 5,0 nM e 10 nM) e ficaram a incubar quer durante cerca de 16 horas quer durante 3 dias. As células tratadas com BoNT/A ficaram a incubar com 1,25 μΜ de DilCi8(3) durante 6 horas e determinou-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. A utilização de placas escuras de cultura de tecidos reduziu a variabilidade, de ensaio para ensaio, dai resultando uma limpidez cada vez maior. Para os tratamentos de 16 horas detectou-se um sinal positivo com concentrações de BoNT/A (150 KDa) da ordem de 0,005 nM (ver FIG. 17a), o que corresponde a um aumento de sensibilidade de aproximadamente 100 vezes comparativamente com os resultados obtidos com as placas de plástico transparentes de cultura de tecidos (comparar a figura 15a com a figura 17a) . Para os tratamentos de 3 dias detectou-se um sinal positivo com concentrações de BoNT/A (150 KDa) da ordem de 0,002 nM (FIG. 18a), o que corresponde a um aumento geral de sensibilidade do ensaio, que foi detectado para todas as concentrações utilizadas comparativamente com o tratamento de 16 horas (comparar a figura 17a com a figura 18a).

Os procedimentos descritos anteriormente podem ser utilizados para melhorar as condições de FRET para um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos, em que os 428 corantes lipofílicos são fluoróforos dadores, em conjunto com proteínas fluorescentes que são aceitadores, utilizando, v.g., as condições descritas anteriormente no número 1 do Exemplo VI.

EXEMPLO VII

Ensaios de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade do clostrídeo

1. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A la. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A num produto BOTOlf

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para se determinara a actividade de BoNT/A utilizando um produto formulado com neurotoxina de botulino, tal como, v.g., o produto BOTOX®, foram utilizadas células diferenciadas Neuro-2A que expressam estavelmente um substrato de BoNT/A SNAP25206-GFP que se desenvolveram e diferenciaram em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, conforme descrito anteriormente na alínea ld do Exemplo VI. Obteve-se uma curva padrão tratando células diferenciadas Neuro-2A com concentrações de 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de agente 'Pure A' (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado. Em simultâneo, fez-se o tratamento de cavidades separadas da mesma placa, com três frascos separados de BOTOX® 429 dissolvido em 1 mL de meios EMEM completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 5,5 pM. As células de três cavidades replicadas foram tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão dos frascos de BOTOX®. As células tratadas com BoNT/A ficaram a incubar com 1,25 μΜ DilCi8(3) durante 6 horas e determinou-se a FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de Pure A e de cada amostra de BOTOX® foram calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (mediu-se a fluorescência a 610 nm ± 30 nm das células tratadas sem toxina). A concentração de BOTOX®, calculada experimentalmente, para cada frasco, foi extrapolada a partir da curva de concentração de Pure A, utilizando um valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. Os valores médios calculados para os três frascos foram 6,3 pM, 9,0 pM e 17,7 pM, sendo a média calculada para cada um dos três frascos de BOTOX® igual a 11,0 pM. Estes resultados demonstram que a actividade da toxina de clostrídeo, tal como, v.g., a actividade de BoNT/A, proveniente de produtos formulados, tais como BOTOX®, pode ser detectada recorrendo a um ensaio de FRET em que um corante lipofílico incorporado na membrana actua como aceitador de FRET. lb. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A numa amostra alimentar

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A, utilizando uma amostra alimentar, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, são utilizadas células 430

Neuro-2A diferenciadas que expressam estavelmente um substrato de BoNT/A SNAP-22o6_GFP, as quais irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, conforme descrito anteriormente na alínea ld do Exemplo VI. Irá ser obtida uma curva padrão tratando células Neuro-2A com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de Pure A (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com tais concentrações feitas em triplicado. Em simultâneo, efectuar-se-á o tratamento de cavidades separadas da mesmo placa com a amostra de alimentos processados, proveniente de frascos de BOTOX®, diluída em 1 mL de meios EMEM completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com BoNT/A irão ficar a incubar com 1,25 μΜ de DilCi8(3) durante 6 horas e o ensaio de FRET irá ser efectuado utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação de 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de Pure A e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem do produto de referência não tratado (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm em células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/A existente na amostra de alimentos processados irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de Pure A, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas.

2. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ilicos para determinação da actividade de BoNT/B 431

2a. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/B num produto formulado de BoNT/B

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/B utilizando um produto formulado de neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto formulado de BoNT/B, são utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/B VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 2 do Exemplo IV e no número 2 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com BoNT/B formulado e dissolvido em 1 mL de meios de cultura completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 0,0055 nM. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão do frasco de BoNT/B formulado. As células tratadas com BoNT/B irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á uma determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/B e de cada amostra de BoNT/B 432 formulado irão ser calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/B formulado, para cada frasco, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/B, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 2b. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/B numa amostra de alimento

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/B utilizando uma amostra de alimentos, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, serão utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/B VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e a diferenciar-se em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 2 do Exemplo IV e no número 2 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra de alimentos processados proveniente de frascos de BoNT/B formulado diluído em 1 mL de meios de cultura completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com 433

BoNT/B irão ficar a incubar com um corante lipofilico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g.f conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á a determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/B e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem da preparação da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/B existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/B, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 3. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ilicos para determinação da actividade de BoNT/Cl 3a. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ilicos para determinação da actividade de BoNT/Cl num produto formulado de BoNT/Cl

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos para determinação da actividade de BoNT/Cl utilizando um produto formulado de neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto formulado de BoNT/Cl, são utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/Cl SNAP-252o6_GFP ou um substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP, que irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na 434 especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 3 do Exemplo IV e no número 3 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de BoNT/Cl (Metabiologics, Inc.,

Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado numa placa de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com BoNT/Cl formulado e dissolvido em 1 mL de meios de cultura completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 0,0055 nM. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão do frasco de BoNT/Cl formulado. As células tratadas com BoNT/Cl irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á uma determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/Cl e de cada amostra de BoNT/Cl formulado irão ser calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de

BoNT/Cl formulado, para cada frasco, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/Cl, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 435 3b. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/Cl numa amostra de alimento

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/Cl utilizando uma amostra de alimentos, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, serão utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/Cl Sintaxina-GFP que irão ficar a desenvolver-se e a diferenciar-se em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 3 do Exemplo IV e no número 3 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de BoNT/Cl (Metabiologics, Inc., Madison, WI) , sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado numa placa de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra de alimentos processados proveniente de frascos de BoNT/Cl formulado diluído em 1 mL de meios de cultura completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com BoNT/Cl irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á a determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/Cl e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem da 436 preparação da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina) . A concentração obtida experimentalmente de BoNT/Cl existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/Cl, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas.

4. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/D

4a. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ílicos para determinação da actividade de BoNT/D mm produto formulado de BoNT/D

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos para determinação da actividade de BoNT/D utilizando um produto formulado de neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto formulado de BoNT/D, são utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/D VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 4 do Exemplo IV e no número 4 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado numa placa de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com BoNT/D formulado e dissolvido 437 em 1 mL de meios de cultura completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 0,0055 nM. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão do frasco de BoNT/D formulado. As células tratadas com BoNT/D irão ficar a incubar com um corante lipofilico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á uma determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/D e de cada amostra de BoNT/D formulado irão ser calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/D formulado, para cada frasco, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/D, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 4Jb. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/D numa amostra de alimento

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/D utilizando uma amostra de alimentos, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, serão utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/D VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e a diferenciar-se em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na 438

especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 4 do Exemplo IV e no número 4 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado numa placa de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra de alimentos processados proveniente de frascos de BoNT/D formulado diluido em 1 mL de meios de cultura completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com BoNT/D irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á a determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/D e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem da preparação da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina) . A concentração obtida experimentalmente de BoNT/D existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/D, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 439

5. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ílicos para determinação da actividade de BoNT/E

5a. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ílicos para determinação da actividade de BoNT/E num produto formulado de BoNT/E

Para se efectuar um ensaio de actividade de BoNT/E utilizando um produto formulado de neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto formulado de BoNT/E, irão ser utilizadas células SK-N-DZ diferenciadas que expressam o substrato de BoNT/E SNAP-252o6_GFP que irão ser desenvolvidas e diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 5 do Exemplo IV e no número 5 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células SK-N-DZ com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) , sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado em placas de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com BoNT/E formulado e dissolvido em 1 mL de meios DMEM completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 0,0055 nM. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão do frasco de BoNT/E formulado. As células tratadas com BoNT/E irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á uma determinação de FRET utilizando a 440 aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/B e de cada amostra de BoNT/E formulado irão ser calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/E formulado, para cada frasco, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/E, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 5b. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/E numa amostra de alimento

Para se efectuar um ensaio de actividade de BoNT/E utilizando uma amostra de alimentos, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, irão ser utilizadas células SK-N-DZ diferenciadas que expressam um substrato de BoNT/E SNAP252o6-GFP que irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 5 do Exemplo IV e no número 5 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células SK-D-DZ com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) , sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado em placas de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra de alimentos processados proveniente de frascos de BoNT/E formulado diluído em 1 mL 441 de meios DMEM completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com BoNT/E irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á a determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/E e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem da preparação da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/E existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/E, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas.

6. Ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos para determinação da actividade de BoNT/F

6a. Ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos para determinação da actividade de BoNT/F mm produto formulado de BoNT/F

Para se efectuar um ensaio de actividade de BoNT/F utilizando um produto formulado com neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto formulado de BoNT/F, são utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/F VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos 442 conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 6 do Exemplo IV e no número 6 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado numa placa de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com BoNT/F formulado e dissolvido em 1 mL de meios de cultura completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 0,0055 nM. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão do frasco de BoNT/F formulado. As células tratadas com BoNT/F irão ficar a incubar com um corante lipofilico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á uma determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/F e de cada amostra de BoNT/F formulado irão ser calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/F formulado, para cada frasco, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/F, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 443 6b. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/F numa amostra de alimento

Para se efectuar um ensaio de actividade de BoNT/F utilizando uma amostra de alimentos, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, serão utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/F VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e a diferenciar-se em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 6 do Exemplo IV e no número 6 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado num pato de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra de alimentos processados proveniente de frascos de BoNT/F formulado diluido em 1 mL de meios de cultura completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com BoNT/F irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á a determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/F e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem da preparação da referência não tratada (fluorescência medida 444 a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina) . A concentração obtida experimentalmente de BoNT/F existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/F, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas.

7. Ensaio de FRET à base de corantes lipofilicos para determinação da actividade de BoNT/G

7a. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ilicos para determinação da actividade de BoNT/G num produto formulado de BoNT/G

Para se efectuar um ensaio de actividade de BoNT/G utilizando um produto formulado com neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto formulado de BoNT/G, são utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/G VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 7 do Exemplo IV e no número 7 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado numa placa de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com BoNT/G formulado e dissolvido em 1 mL de meios de cultura completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 0,0055 nM. As 445 células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão do frasco de BoNT/G formulado. As células tratadas com BoNT/G irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á uma determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/G e de cada amostra de BoNT/G formulado irão ser calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). A concentração obtida experimentalmente de BoNT/G formulado, para cada frasco, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/G, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 7b. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/G numa amostra de alimento

Para se efectuar um ensaio de actividade de BoNT/G utilizando uma amostra de alimentos, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, serão utilizadas células que expressam o substrato de BoNT/G VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e a diferenciar-se em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 7 do Exemplo IV e no número 7 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão 446 tratando as células com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado num pato de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra de alimentos processados proveniente de frascos de BoNT/G formulado diluído em 1 mL de meios de cultura completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com BoNT/G irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á a determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de BoNT/G e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem da preparação da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina) . A concentração obtida experimentalmente de BoNT/G existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de BoNT/G, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas.

8. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ilicos para determinação da actividade de TeNT

8a. Ensaio de FRET à base de corantes lipof ilicos para determinação da actividade de TeNT mm produto formulado de TeNT 447

Para se efectuar um ensaio de actividade de TeNT utilizando um produto formulado com neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto formulado de TeNT, são utilizadas células que expressam o substrato de TeNT VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e serão diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 8 do Exemplo IV e no número 8 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado numa placa de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com TeNT formulado e dissolvido em 1 mL de meios de cultura completos até se obter uma concentração final aproximadamente igual a 0,0055 nM. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão do frasco de TeNT formulado. As células tratadas com TeNT irão ficar a incubar com um corante lipofilico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á uma determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de TeNT e de cada amostra de TeNT formulado irão ser calculadas em percentagem da composição da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina) . A concentração obtida experimentalmente de TeNT formulado, 448 para cada frasco, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de TeNT, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 8b. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de TeNT numa amostra de alimento

Para se efectuar um ensaio de actividade de TeNT utilizando uma amostra de alimentos, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, serão utilizadas células que expressam o substrato de TeNT VAMP-GFP que irão ficar a desenvolver-se e a diferenciar-se em placas escuras de cultura de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, utilizando processos conhecidos na especialidade, por exemplo, utilizando um dos processos descritos anteriormente no número 8 do Exemplo IV e no número 8 do Exemplo V. Irá ser obtida uma curva padrão tratando as células com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) , sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado num pato de 24 cavidades. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra de alimentos processados proveniente de frascos de TeNT formulado diluído em 1 mL de meios de cultura completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com TeNT irão ficar a incubar com um corante lipofílico adequado durante um intervalo de tempo conveniente, v.g., conforme descrito no número 2 do Exemplo VI e efectuar-se-á a determinação de FRET utilizando a aplicação informática 'Typhoon 9140' com excitação a 488 nm e captação da emissão a 610 nm ± 30 nm. As emissões de cada 449 concentração de TeNT e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas em percentagem da preparação da referência não tratada (fluorescência medida a 610 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina) . A concentração obtida experimentalmente de TeNT existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de TeNT, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. 9. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para a actividade da toxina de clostrideo utilizando corantes lipofílicos como fluoróforos dadores

Os procedimentos descritos anteriormente nas alíneas 1-8 do Exemplo VIII podem ser utilizados para analisar produtos formulados com toxina de clostrideo e composições alimentares utilizando um ensaio FRET à base de corantes lipofílicos que servem de fluoróforos dadores em conjunto com proteínas fluorescentes que são aceitadores, utilizando, v.g., as condições descritas anteriormente no número 1 do Exemplo VI. 9a. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A num produto BOTOX®

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A utilizando um produto formulado com neurotoxina de botulino, tal como, v.g., um produto BOTOX®, são utilizadas células diferenciadas Neuro-2A que expressam estavelmente um substrato de BoNT/A SNAP252o6_GFP, desenvolvidas e diferenciadas em placas escuras de cultura de tecidos de 24 450

cavidades com fundos transparentes, conforme descrito anteriormente na alinea ld do Exemplo VI. Obteve-se uma curva padrão tratando células diferenciadas Neuro-2A com 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM ou 0,05 nM de agente Pure A (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI) , sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado. Em simultâneo, cavidades separadas da mesma placa foram tratadas com três frascos separados de BOTOX® dissolvido em 1 mL de meios EMEM completos, até se obter uma concentração final de aproximadamente 5,5 pM. As células de três cavidades replicadas foram tratadas com os conteúdos de cada nova suspensão de frascos de BOTOX®. As células tratadas com BoNT/A ficaram a incubar com 5 μΜ de DPH durante 6 horas e determinou-se o FRET utilizando a aplicação informática 'Spectra Max M5' com excitação de 350 nm e captação da emissão a 515 nm ± 30 nm. As emissões para cada concentração de Pure A e para cada amostra de BOTOX® foram calculadas em percentagem da composição de referência não tratada (fluorescência medida a 515 nm ± 30 nm de células tratadas sem toxina). O valor da concentração de BOTOX® obtido experimentalmente, para cada frasco, foi extrapolado a partir da concentração da Pure A, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas. Os valores médios calculados para os três frascos foram 6,3 pM, 9,0 pM e 17,7 pM, sendo a média calculada para cada um dos três frascos de BOTOX® igual a 11,0 pM. Estes resultados demonstram que a actividade da toxina de clostrídeo, tal como, v.g., a actividade de BoNT/A, proveniente de produtos formulados tais como BOTOX®, pode ser detectada recorrendo a um ensaio de FRET 451 em que um corante lipofílico incorporado na membrana actua como aceitador de FRET. 9b. Ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A numa amostra alimentar

Para se efectuar um ensaio de FRET à base de corantes lipofílicos para determinação da actividade de BoNT/A, utilizando uma amostra alimentar, tal como, v.g., uma amostra de alimentos processados, irão utilizadas células Neuro-2A diferenciadas que expressam estavelmente um substrato de BoNT/A SNAP-22o6_GFP, que irão ser

desenvolvidas e diferenciadas em placas escuras de culturas de tecidos de 24 cavidades com fundos transparentes, conforme descrito anteriormente na alínea ld do Exemplo VI. Irá ser obtida uma curva padrão tratando células Neuro-2A com 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 nM de Pure A (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI), sendo as experiências com cada uma das concentrações feitas em triplicado. Em simultâneo, as cavidades separadas da mesma placa irão ser tratadas com uma amostra alimentar processada, proveniente de frascos de BOTOX®, diluída em 1 mL de meios EMEM completos. As células de três cavidades replicadas irão ser tratadas com os conteúdos de cada amostra diluída. As células tratadas com BoNT/A irão ficar a incubar com 5 μΜ de DPH durante 6 horas e determinar-se-á o FRET utilizando a aplicação informática 'Spectra Max M5' com excitação a 350 nm e captação da emissão a 515 nm ± 30 nm. As emissões de cada concentração de Pure A e de cada amostra de alimentos processados irão ser calculadas como percentagem da composição de referência não tratada (fluorescência medida a 515 nm ± 30 nm em células tratadas 452 sem toxina). A concentração de BoNT/A obtida experimentalmente, existente na amostra de alimentos processados, irá ser extrapolada a partir da curva de concentração de Pure A, utilizando o valor calculado a partir de uma média de três cavidades replicadas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Ferneez-Salas, Ester Steward, Lance E.

Aoki, Kei Roger <120> Ensaios FRET à base de corantes lipofilicos para a actividade da toxina clostridial <130> 17796 (BOT) <150> 60/668 942 <151> 2005-04-05 <160> 184 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0

<210> 1 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25A de Homo sapiens (humano) <4 0 0> 1 453 feefc Ma 1 i Ma Asp Met Arg Asa Glu Leu Glu Glu Hat Glu Arg 1 5 19 15 Arg Ma Asp gin Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Aaíg Mêfc 29 35 39 Leu Gin Leu Vai Glu Glu Ser Lys Asp Ma Gly Ile Arg fiar Leu Vai 35 40 45 net Lata Asp Glu Gin Gly Glu Glft Leu Asp Arg V&l Glu Glu Gly Met 50 55 . $9 &£» His Ile Asa Gin Asp «efc Lys Glu Ma Glu Ly» Asa Leu Lys Asp SS 79 75 99 Leu Gly Lys Cys cys Gly Leu Piita Xle -Cys Fra Cys Asa Lys Leu Lys 85 50 85 Ser Ser Mp Ala íiyr Lys Lys Ala Trp Gly Asa Asa Glu Asp Gly vai íoo 185 110 Vai Ala Ser Gla fro Ala Arg Vai Vai Asp Glu Arg Glu Glu Hat Ala U5 139 135 Ile Ser Gly G ly 'Fhe IU Arg Arg Vai fhr Asa Asp Ma Arg Glu Ma 139 .135 . 149 Glu Mst Asp Glu Asn Leu Glu Gin V&l Ser Gly Ue lia Gly Asa Leu 145 150 155 189 Arg His mt Ma Leu Asp He& Gly Asa Glu lie Asp ffcr Glu Asa Arg 165 179 175 Gin lie Asp Arg Ile mt Gin Lys Ma Asp Ser Asa Lys fftir Arg lie 189 185 190 Aap Glu Ala Asa Gin Arg Ala $fctr lys Met Leu Gly Ser Gly 185 209 395 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25B de Homo sapiens (humano) <400> 2 Mefc Ma Glu Asp Ma Asp Met Arg A«sn Glu Leu Glu Glu mt Glu Arg 1 5 10 1:5 fctefc Arg Ma Asp Glu lsu Ala Asp Glu*8er Leu Glu Ser fíur Arg Arg 454 20 25 30 Leu Gin Leu ¥al Glu Glu Ser Lya Asp Ala Gly Ile.Arg «fcr Leu Vai 3S 40 45 Ma|»· Leu ASP Glu Glft Gly Glu ma Leu Glu Arg Ile mu Glu Gly Ket 50 65 «0 Mp 0M Ile Aen Lys Aep Met Lye Glu Ala Glu Lys Asa Leu 1¾¾ Asp €5 70 75 80 Leu Gly Lys ftbe Cys Gly Leu Cys VWL Cys Fro Cys Asa Lys Leu Lys 85 00 SS Ser Ser ASP Me fyr Lys I#S Ma **-_____ Sly Asn Asa Gin Aap Gly Vai 100 10$ uo Vai Ma Ser Gla m M« Arg Wal Val Asp-Giu ârg Glu Gla Mit Ma 115 120 125 lie Ser Gly Gly Phe Ile Aarg Arg vai Asa Aflp Ma Argr Glu Asa ISO 135 140 Glu Met Asp Glu Asa hm Glu Gin vai Ser Gly ile Ile my Asa Leu 145 150 155 160 **# Bis Met Ma Leu Asp **et Gly Asa Glu Ile A»P Thr Gin Asa Arg 165 170 175 Gla Ile Aap Arg He Met Glu Lys Ma Asp ser AS» Lys ttw Arg lie 180 185 ISO Asp Glu Me Asa Gin AT0 Ma Usar Lye &efc Leu Gly Ser Gly 115 200 205

<210> 3 <211> 211 <212> PRT <213> SNAP-23A de Homo sapiens (humano) <400> 3 455

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<210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> SNAP-23B de Homo sapiens (humano) <400> 4 456

Hefc A*p Am Leu fer Sm Glu Glu Ue Glu Gin Arg Ala HÍ0 Gin ile 1 S 10 15 Tlir Λ®Ρ Glu Oer Leu Glu Ser $br Arg Arg tlm. Leu Gly Leu Ala tU 20 2$ 30 βία Bm Gl» Asp Ala Giy He Lys *?hr lie TKr iíet Leu Asp Glu Gin 35 40 45 í»ya Gle Gin Leu Asa Arg 11« Glu Glu Gly Leu Asp Gin Ue Ase Lys m S5 00 Asp itet Arg Glu f&r Glu Lys l&r Leu T3ar Glu Leu As» Lys Cys Oys· 45 70 7i 89 ôly Leu Cys vai Cys Pr© Cys As» Ser tu Thr As» Asp Ma Arg C&» 85 90 35 Asp Glu mt Glu Glu Aea Leu «31» vai Gly Ser ile Leu Gly As» 190 105 no Leu Lys Asp Met Ala Leu As» Giy As» Glu lis ftsp Ma Gin Asa 115 120 125 Pr© GX» Lye Arg lie Tftr Ásp Lys Ma Asp •Fíir As» Arg Ãsp’ Arg 130 135 140 Xle Asp lie Ale Am Ala Arg Ala Lys Lys Leu lie Asp Ser 14$ 150 155

<210> 5 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25B de Macaca mulatta (macaco Rhesus) <400> 5 457

Met Ala Glu Aep Ale ASp Ket Arg Asa Glu Leu Glu Glu Met Gin Arg 1 5 10 15 AT0 Ala Asp G in Leu Ale Asp Glu Ser Leu Glu Ser fhr Arg Arg Mtet 20 25 30 L«U Gl» Leu vai Glu Glu Ser Lye Asp Ala Gly 11« Arg Ttur Leu Vai 35 40 45 mt Leu Asp Glu Gin Gly Gltt Gin Leu Glu Arg Xle Glu Glu «ar Ust 50 55 60 MSP Gla xie Asm Lys Asp Mefc Lys Glu Ala Glu Lys .Am Leu Xter Asp 65 70 75 80 Leu Gly Lyg Fhe Cys Gly Leu Cys Vai Cy» Fro Cys Asa Lys Leu Lys 8$ - 90 55 Ser Ser Asp Ale.Tyr Lys Lye Ale $rp Gly Am Asn Gin Am Gly Vai 100 105 110 Vai Me Ser Gin Pm Me Arg Vai Vai Asp Glu Arg Glu Gin Èfefc Ma 115 120 125 Ht H Ser eiy Gly ffes Xle Axg Arg Vel X&r lâa tep Ala Arg Glu Aen 130 135 140 Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Glu Vai Ser Gly Xle Xle Gly Ae» Leu 145 150 155 150 Hle mt Ale Leu ASp Met Gly As» Glu Xle Asp Thr Gl» Asa Arg 165 170 175 Gla lie mp Arg ila Met Glu Ly® Ala ASP Ser Asa Lys fhs Arg Xle 180 1Ó5 190 Asp Glu Me Asa Gin &rg Ale ífhr Ly® Met Leu Gly -Ser Gly 195 200 205

<210> 6 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25A de Rattus norvegicus (rato) <400> 6 458

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<210> 7 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25B de Rattus norvegicus (rato) <400> 7 459

Mst Ala 61u A«*» Ala ΑβΡ Mefc Arg Asa GlU Leu Glu Glu Môt Gla Arg 1 5 10 15 Arg Ala Asp ela Lee Ala Asp 61a ser Leu siu Ser 7&r Arg Arg Met 20 25 30 LSU 61a LAI yai 0la 6la Ser Lye Asp Ala Sly Ile Arg Thr Leu vai 35 40 45 Met Leu Aap Glu 61a Gly 61u 61a Leu Glu Arg Ilê Glu Glu Gly Met 50 55 60 AflP Gla lie Asa Lys Asp Síefc Lys 61a JAl^a Glu Lya Asa Leu Thr ASp €5 70 25 80 Lai 01y Ly» Pbe Oy» Gly Leu Cye Vai Cys Pro cy» Asn lys Leu Lys 85 80 35 * Sfir Ser Afip Ala Lys Lye Ala Trp 61y Asa Asa Gla ASp Gly Val 100 105 110 Vai Ala Ser Gin Fro Ala Arg Vai Vai Asp Glu Arg Glu Gla mt Ala US 120 125 - 11« ser 01y Gly Fh« 11« Arg Arg Val TAr Asa Asp Ala Arg Glu Asa 130 13S 140 Glu Hat Asp 01a Asa Leu Glu 61a val Ger Gly 11« lia Gly Asm Leu 145 150 155 150 JUCf His Mrifc Ala Leu ftsp Met Gly Asa Glu Ile Asp 17*r Gla Asa Arg 165 120 175 Gin ne Aap axg Ile Mst Glu Lys Ma ASP Ser Asa Lys ftr Arg Ile 180 185 150 A®p Glu Ala Asa 01a Arg Ala Thr tye Met Leu Gly Ser Gly m 200 205

<210> 8 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-2SB de Mus musculus (murganho) <400> 8 460 «et 1 Ala Gl» 3^ Ma Asp 5 «et Arg Asn Glu 10 Leu Glu Glu mt Gla 15 ATg Arg Ala Asp βίο Leu Ala Asp Glu Sex 25 Leu Glu Ser Thr Arg Arg 30 «et Leu Gla Leu 35 mi Glu Glu Ser Lys 40 ASP Ala Gly He Arg 45 ®hr Leu Val mt Leu 50 Asp eia ei» Gly Glu 55 Gla Leu Glu Arg Ile 60 Glu Gl» Gly «et Asp 65 Gla Ile Asa Lya Asp 70 «et Lys Glu Ala Glu Lys 75 Aen Leu Thr Asp 80 Le» Gly Lye Pfce Cy s eiy 85 Leu Cye vai eys 50 Pro Cys Asa Lys Leu 85 Lys Ser Ser Asp Ala 100 Tyr Lys Lys Ala TTp 105 Gly Asa Asa Gla Asp Gly 110 val Vai Ma Ser 115 ela Fro Ala Mg Vai 130 Vai Asp Glu Arg Glu 125 Gla «et Ala Ile Sair 130 Gly Pbe 11« Arg 135 Axg vai í&r Asa Asp 140 Ala Arg Glu Asa Glu 145 Met Asp eia Asa Leu 150 Glu Glu Vai Ser Gly Ile 155 lie Gly Asa Leu 160 Arg Bis «et Ala Leu Asp 165 «et Gly Asa GlU 170 Ile ASP Thr Gla Asa 175 Arg <31 n Ile *«P Are 180 ile «et Glu Lys Ma 185 Asp Ser Asa Lys T&r Arg 190 ile Asp Glu Ala 155 Asa Gin Arg Ma Thr 200 Lys «et Leu Gly Ser 205 Gly

<210> 9 <211> 210 <212> PRT <213> SNAP-23 de Rattus norvegicus (rato) <400> 9 461

Aep Asp 'Leu, Ser. Pro Glu Glu 11a Glu Leu Arg Ala His Gin Val 1 5 10 15 ThX Asp Glu ser Leu Glu ser Ttor Arg Arg Xle Leu Gly Leu Ala Xle 20 25 30 Glu Ser Glu Asp Ala Gly lie Lye Tfcr Xle ffcr Leu Aap Glu Gin 35 40 45 Gly Glu Glu Leu Αβά Arg lie Glu Glu Gly S$et Asp Glu Xle Aen Lys 50 55 60 mp mt Mg Glu Ma Glu Lys Thr* Leu Thr Glu Leu Asa Lys Cys Cys 65 ?õ n 80 Qly Leu eys Vai Cya Pro Cya Asn Arg Thr Lye Asa Phe Glu Ser Gly as 80 35 l&M Asa iw· Ala Thr f£p ®iy Aap Gly Gly Asp S«r Ser Pro Ser 100 105 110 Asu Vâl vai ser Lye Gin -Pro Ser Arg Xle Thr Am Gly Glu jpto Gin 11S 120 125 Gin Thr sfcr Gly Ala Ala Ser <3ly Gly Tyr Xle Lyg Arg Xle «fcr Asn 130 135 140 Asp Arg Glu ASp Glu Het Glu Glu Asa Leu Thr Gin vai Gly Ser 245 150 155 i€0 He Leu Gly Asa Leu Lys Asa Het: Ala Leu Asp Mât Gly As» Glu Xle 105 120 X?5 Asp Ma Glu Asa Glu Gin xle Glu Lya Xle Thr GlU Lys Ala ASP Thr ISO 285 ISO Asa Lye Asa Mf Xle Aep Xle Ala As» ΙΐΐΤ Arg Ma Lys Lys Leu Xle 185 300 205 Asp Ser 210 -

<210 > 10 <211> 210 <212> PRT <213> SNAP-23 de Mus musculus (murganho) <4 0 0> 10 462 462 «et ASp Leu Ser ftro Olu Olu Vai 01» Leu Arg Ala Bis >01» Vai 1 5 10 15 I$sr Asp Olu l er Leu Olu Ser Thr Arg Arg Ile Leu Oly Leu Al a lie 20 25 30 01» Ser @1» Asp Ala Oly 11® Lys Ile Uir «et Leu Asp Olu 01» 35 40 45 Gly Olu 01» Leu Asa Arg 11® Olu Olu Oly Met Asp 01» Ile As» Lys 50 55 fO Aep Met Arg Olu Ala Olu Lys ^Str Leu Tter Glu Leu AS» Lys Cys Cys 65 ?o - 75 80 Oly Leu Cys lie oys Pro Cys Asn Arg Thr Lys Asa Phe Olu Ser Oly 85 50 35 Lys As» tyr Lys Ala Ihr Trp Oly Asp Oly Oly Aep As» Ser Pr© Ser 100 105 110 Asa Vai Vai Ser Lys 01» Pr© Ser Arg Ile ffer Asn Oly 01» Pr© 01» 415 120 125 01» Th¥ oly Ala Ala Ser Oly Oly Ile Lys Arg Ile Bir As» 110 135 140 Asp Ala Arg Olu Asp Olu mt Olu Olu Aan Leu fhr Gin vai oiy fier 145 150 155 180 ile Lau «v Asn Leu Lya As» Met Ala Leu Asp Met oiy As» Olu Ile 185 170 175 Asp jln 01» As» Gin 01» Ile 01» Lys ile ®hr Olu Lys Ala Asp T&r 180 181 ISO Mn Lya Aen Arg Ile Aep Ile Ala As» flfcr Arg Ala Lys Lys Leu Ile 105 200 205 Asp Ser 210 <210> 11 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25B de Gallus gallus (galinha) <400> 11

As» Olu Leu Olu Olu mt •61» Arg 10 15 Ser Leu Olu Ser Thr Arg Arg Met 25 30 ASp Ala 6iy Ile Arg flsr Leu vai 4S Leu Olu Arg Ile Olu Olu Oly Met

Met Ala Gl» Asp Ala Aep Met Arg 1 S

Arg Ala hsp 61» i*m Ala Asp Olu 20

Leu 01» Leu Vai Olu Olu §&r Lys 35 40 «et Leu Asp 01» Oln Oly Olu 01» 463 50 55 60 A©p n« as» Lys Asp set Ly© Glu Ala Glu Lys Asa hm fhr Asp 65 70 75 80 Leu Gly fite Cys 85 0iy Leu Cys Vai cys to pre Cys Asa Lya Leu Lys 55 Ser Ser Asp Ala fyr Lys Lya Ala frp Gly Asa Am Gla Asp Gly Vai * 100 105 110 mt Ala Ser sia PTP Ma Ãrg Vàl Vai A&P Glu Arg Glu 01a mt Ala 115 120 125 Xle Ser Gly 0iy pfae 11 a Arg Arg Vai IThr Asa Aap Ma Arg Gly Asa 130 135 140 Glu Met Asp Glu Asa Leu Gly 01a Vai Ser Gly 155 lie xle Gly Asa Leu 145 150 160 Arg Bis Het Ala Leu Asp Set 01y Asa Glu 11« A&p Tbr Gin Asa Arg 165 170, 175 Gin He Aep Arg' 11a Met Glv Lys Ala Asp Ser Asn Lys fhr Arg Ha 110 185 190 Asp Glu Ala Asa 01a Arg Ala Ί&Χ Lys Met Leu Gly Ser Gly 195 200 205

<210> 12 <211> 204 <212> PRT <213> SNAP-25A de Carassius auratus (peixe-dourado) <400> 12 4 64

Het Ala Glu Aap Ala Agp mt Ar© &en Glu Leu Ser Aap Mel Gin Gin 1 5 10 15 Ar© Alá hsp 61» Lá» Alá A«p Glu Ser Leu Glu Ser Thr Ar§ Ar© mt 20 25 30 Leu Gla Leu V&l Glu Glu Ser Lya Aep Ala Gly 11« Ar© saur Leu Vai 35 40 45 ' Het Leu Aap Glu Gin Gly Glu ©in Leu Glu Arg 11« Glu Glu Gly mt §0 55 €0 Aap Gin lie Atm Lye Asp mt Lya Asp Ma Glu Lys Asn Leu Asn Aap 65 70 75 80 Leu Gly Lyá Pim Cye Gly Leu Cys .Ser Gy» Pro Cys Asn Lya Met Lya 85 90 95 Ser Gly Gly Ser Ly» Ma Trp Gly Asn Asn Gin Aep 6ly Vai Vai Ala 100 105 110 ser Gin Pro Ala Ar© Vai Vai Aap Glu Ar© Glu Gin Met Ala 11« Ser 115 120 125 Gly Gly Phe He Ar© Arg Vai Thr Asp A»p Ala Arg Glu Asn Glu Met 130 135 140 Asp Glu Αβη Leu ©Itt Gin Vai Gly Gly lie lia Gly Asm Leu Ar© HlS 145 150 155 180 Ket Alá Leu Asp ifefc Gly Asn Glu lia hm? 3?far Gin Asn Ar© Gin Zle 16S 170 175 ABp Ar© He mt ©lu Lys Ala A«p Ser Asm Lya ®sr Arg 11« Asp Glu 180 185 190 Ala ASU Gin Ar© Ala Thr Lys mt Leu Gly Ser Gly 155 300

<210> 13 <211> 203 <212> PRT <213> SNAP-25B de Carassius auratus (peixe-dourado) <4 0 0> 13 465 JStXft jRsp Glu Ala A*P Met Arg Asa Glu Leu Hir ASp Met Glu Ala t 5 10 15 Arg Asp «la hm Gly Asp Glu Ser Leu GlU. •Ser Tfer Arg Arg Met 20 25 30 LSU G1& Leu Vai Glu Slu Ser Lys Asp Ala Gly lie Arg Tbx Leu Vai 35 40 45 Met Leu &ep Glu Slê Sly Glu eia Leu Slu Arg Ile Glu Glu Gly Hei 50 55 *0 Asp Gla lie Asa Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asa Leu Thr Asp 65 70 75 00 L®U Gly Am Leu Cy» Giy L«U cys Pr© Cys Pro cys ASP Lys Leu Lye 35 56 »5 Gly Gly Gly Gla ser Típ Gly as» Asa GlU Asp Gly Vai vai Ser ser 100 105 110 GI n Pro Ala Arg vai vai Asp Glu Arg Glu Glu Met Ala Ile •Ser Gly 115 120 125 Gly Phe Ile Arg Arg Vai Thr ASP Ala Arg' Glu ASP Glu Met Asp 130 135 140 Asa Leu Glu Glu vai Gly Ser 11« Xie Gly As» Leu Arg Kis Met 145 150 155 150 Ala Leu Aep Met Gly Asm Glu Xle Asp I3sr Glu. As» Arg GlU Ile Aap 165 170 175 Mg xie Mafc Asp Met Ala ASP Ser ASn Lye Thr Arg lie ASP Glu- Ala 100 18S - 190 Asa Gl» Arg Ala *Fhy Lys Met Leu Gly Ser Gly 1»5 300

<210> 14 <211> 204 <212> PRT <213> SNAP-25A de Danio rerio (peixe-zebra) <4 0 0> 14 4 6 6

Mt Mi Glu ABp ser Asp mt Arg Asn Glu L«U Ma Asp mt Glu Glu 1 5 10 15 Arg Ma Asp Gin Leu Ma ASP Glu Ser Leu Glu Ser fiar Arg Arg ®tet 10 25 30 Las1 Gin Leu Vai Glu 0S.U Ser Lys Asp Ma Gly XI# Arg Thr te vai 11 40 45 Met Leu Asp Gin Gin Gly Glu Gin Leu Glu Arg £1# Glu Glu Gly Hat 50 55 60 Asp Gin Ile Asa Ly® Asp Mèt Lys AJtp Ala Glu Lye Aaa Leu Aan Asp 6S 70 75 80 Mu Gly Lys Pke (^s Gly L«U Cye Ser Cys Pr© Cys Aan Ly« M»t Lye 85 SO 9S Ser Gly Ala g«r Lys Ala Trp Gly Asa Am Glu Asp Gly vai V&l Ma 100 105 no Ser Gin Pr© Ma Arg Vai Vai Asp Glu Arg Glu Gin Hat Ma 11« Ser 115 120 125 Gly Gly P&e 11« Arg Arg mi Bir Asp Asp Ma Arg Glu Am Glu Ktet 110 115 140 Asp Glu Leu Glu Gin vai Gly Gly lie n« ©ly Asa Leu Arg Sla 145 150 155 160 mt Ma Mn Asp «et Gly Am Glu £1« Asp Thr Gin Am Arg Gin 11« 165 170 175 Glu A*p Arg n® Hat GlU Lye Ala Asp Ser Asa Aya ®ar Arg Xla ASP ISO 185 150 Ala, Mn Gl» Arg Ala *br fcye Met Leu Gly Ser Gly 1$5 200

<210> 15 <211> 203 <212> PRT <213> SNAP-25B de Danio rerio (peixe-zebra) <400> 15 467

Mefc Ala Asp o1« Ser Aap tfet Arg As» Glu Lm Am ksp mt Gla Ala 1 5 10 15 Aitg Ala Asp Gin LeU Gly Asp Gin Ser Leu Glu Sm fhr &rg Arg MéO 2$ 25 30 Leu Gla Leu Vai Glu Glu Ser Lys tep Ala. Gly íle Arg flir Léu Vai 35. 40 45 Mat Leu Asp Gin Gin Giy Gin Gin Lm Glu Arg lie Gin Gin Gly ííet se 55 «0 Asp Gin Xle Ara Lys Asp Met Lys Gin Ala Glu Lyar Asn' Leu Thr Asp §5 70 75 80 hm Gly Asn Lm Cys Gly Leu Cy® Pm* Cy® Prn €ya An» Lya Leu Lys @5 50 55 Gly Gly oty Gin Ser ϊχρ Gly Am Am Gin Asp Gly Vai Vai Ser Sm 10« 105 110 Gin Pro Ala Arg Vai Vai Aep Gin Arg Glu Gla Mfefc Ala Xie Ser Gly 113 130 125 Gly Fhe Xle Arg Arg Vai Tfer Am A,ep Ala Arg Glu Am Glu Ket Aep 130 135 140 Gin Am Lm Gin Gin vai Gly Ser Xle Xle Gly At» Léu Arg Hie fcet 145 150 155 ISO Ala Leu Asp Met Gly Asa Glu 11« Asp l&r Gla Am &rg Gin 11« Asp lis 170 I7S m r*♦ H ! Môfc ASp fetet Ala Asp Ser As» Ly® Thr Arg Ile Asp Glu Ala 180 185 150 Am @1» Aacp Ala fhr Lya Mefc Lm Gly Ser Gly 155 200 s

<210> 16 <211> 214 <212> PRT <213> SNAP-23 de Danio rerio (peixe-zebra) <4 Ο 0> 16 468 iíefc Ala Asp Met líir vai Glu Asp 11« l?hr Met Arg Ma Asn Glu vai 1 5 10 Λ 15 * TShr Αβρ Qlu Ser Leu GlU Ser ffihr Arg Arg Met Leu Gin Met Ma Glu 20 25 30 Glu ser Arg Glu fte Gly ml Lys Thr Met Φ&Τ Mefe Leu Asp Glu Gin 35 40 45 Gly Glu Gin Leu Arg Arg vai hm Gin Gly «et &sp Gin. Ile Asm Gla 50 55 « 60 Aep mt Arg Gin Ala Glu Lys AStt Le» yfcsr Asp Leu ser Lys ey» Cys m 7Õ 75 80 Gly I»«u Gys vai Cye Pr© Cys Glu Arg Val TAr Ser Ile Glu Mia Asp 85 90 95 Gly Arg Tyr Lys Arg ®fcr Trp Gly Gly Ser Asp Asa Ser Ser fbr 100 105 UO Glu Gly Lya Glu Gly Gly vai ml 'Ser Ser Gin Prp Thr Ala vai Arg 115 120 125 Aem Gly Gin Ala vai Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ma Ser Gly Pr© Tyt 130 135 140 11a lys hm 11« ítwr Asa hm Ala Mg Glu Asp Glu Hefc Glu Glu Asa 1« 150 155 1€0 Leu Aap Gin vai Gly Ser lie He Gly Asn Leu Lys Asn Leu Ala Leu 155 170 175 hep Mefc Gly hm Glu Ile Αβρ W Gin Aan Lyn TUr ile hm Arg Ile 180 185 • 190 T&x Asp Lys Ma Asp Hat Asn Lys Ala Arg Ile Asp Glu Ma Asa Gin 155 200 205 Arg Ala Asa. Lye Leu Leu aio

<210> 17 <211> 210 <212> PRT <213> SNAP-25 de Torpedo marmorata (tremelga-marmoreada) <4 0 0> 17 469 mt 1 Glu Asa Ser VAX K Glu Am Ser mt Aap Pro Arg Ser Glu Glu Glu -1* A- Gl» mt Gin Arg Gye Ma ASP Gla ile IV Hur A»p Glu Ser Leu Jt3 Glu -Ser 20 25 30 Thr Arg Arg mt Leu Gin Leu VAI Glu Glu 4ter Lya Asp Ala Gly ile 35 40 45 - Arg 2&r Lea Vai Hat Leu Αβρ Glu Gltt Gly GlU Gla Leu Glu Arg ile 50. 55 m Glu Glu Gly mt Aap Gin Ile Ama <£ys Asp mt Lye Glu Ala Glu Lys 65 70 75 50 Asa Leu Set Aisp Leu Gly Lya Cys cy» Gly Leu çy» Ser Gye pru Cye 35 90 95 A»R Lye Leu Ly» Am Ph» Glu Ala Gly Gly Ala fyr ty» Lya Vai $rp 100 205 110 Gly Am Aea. Glu Aap Gly ¥al val Ala Ser Glu fre Ala Arg Vai Hat 115 120 125 Asp Aep Arg Glu Gla mt Ala mt Ser Gly Gly fyr Oe Arg .Arg He 130 135 240 Thr Asp Aep Ala Arg Glu Am GiU mt Glu Glu Aan Leu Aep Gin Vai 145 150 135 ISO Gly Ser Ile lie Gly Asa Leu Arg Hie mt Ala Leu Anp mt Ser As» , 165 170 175 Glu xu Gly Ser Gla Am Ala Gin Ile Asp Arg lie Vai vai Lya Gly 130 235 130 A»P mt A#U Ay» Ala w ile Asp Glu Ala Aau W» Kle Ala «Mf tm ' MS 200 305 mt Leu „ 210

<210> 18 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25A de Xenopus laevis (rã de unhas africana) <4 0 0> 18 470 «efc Ala ASp Mp Ma Asp Hat ΑΓ0 Asn Glu Leu Glu Glu Het Glu Arg 1 5 10 15 Arg Ma Asp Gin Leu Ma Asp 6Xu Ser Leu Glu Ser Thr Arp Asg Hat 20 25 30 Leu Gin fyr vai 61¾ GXy Ser Lys ASP Ala GXy XXe ftrg Thr Leu Vai 35 40 45 Met Leu Asp Glu 61¾ GXy Glu Gin Leu Asp Aarg Vai Glu Glu GXy Het 50 55 m Abr Hla 11® Asm Glu Asp Met &ys Glu AXa Glu Lye Asa Leu Lys Asp 65 70 75 00 Leu oiy Lys Cye Cya Gly Leu Fhe Ila Cye Pm Cye Asa Lys Leu Lys , 85 90 OS Ser Ser GXy Ma lyr Asa Lye Ma Trp GXy Asn &sn Gin ASP Gly Vai 100 105 110 vai Ala Ser Gin Pm Ala Arg Vai Vai Asp Glu Arg Glu Glu «et Ala 1X5 120 12$ ile Ser Gly Gly Phe Vai Arg Arg vai Thr Asa Asp Ala Arg Glu Thr 130 135 140 Glu Met Asp Glu Asa Leu Glu Glu Vai Gly Gly He 11a Gly Asa Leu 145 150 155 1G0 Arg His «et Ala Leu Asp Met Gl y Asn Glu lie ASP Thr Gin Asa Arg 165 170 175 Glu lie Asp Arg Ile mt Glu Lys Ala Asp Ser Asa Lys Ala Arg xie ISO 18S 190 ASp Glu Ala Asa Lys His Ala Thr Lys Mst Leu Gly Ser Gly

os zm 20S

<210> 19 <211> 206 <212> PRT <213> SNAP-25B de Xenopus laevis (rã de unhas africana) <4 0 0> 19 471 471 «et Ala Aap &es Ala Asp «et Arg Aen Glu Leu Glu Glu «et Glu ATS 1 5 16 25 Arg Ala Asp Gin Leu Ala Aap Glu Ser Leu Glu Ser Tkr Ari Arg Met 20 25 30 Leu Gin Tyr vai Glu Gly Ser Lye Asp Ala Gly Xle Arg «MT Leu Vai 35 40 45 H«fe Leu A»p Glu Glu Gly Glu GlU Leu Glu &rg Xle Glu GlU Gly Hat 50 55 60 Glu Glu Xle Asn Lye Asp «et Lye Glu Ma Glu Lye Aen Leu Tíir Asp <S 70 75 80 Leu Gly Lys ftte Cye GQ.Y Leu cys Vfel Gys Pr© Cye Am Lye Leu Lye 35 90 95 Ser Ser Aep Ala. Tyr Lys Lys Ma frp Gly Asn Am Glu Aep Gly Vai - - 100 205 110 Vai Ala Ser Gin Fro Ala Arg Vai Vai Asp Glu Arg Glu Gin Met Ala 115 120 125 Xle Ser Giy siy Fhe Vai Arg Arg Vai Thr &m Aep Ala Arg Glu Thr 130 135 140 Glu «et À$p Glu Am Leu Glu Glu Vai Gly Gly Xle Xle Gly Am Leu 145 ISO 155 ISO Arg HÍS mt Ala Leu Asp «et Gly Am GlU ile Asp fhr Gin Am Arg 165 270 175 Ola Xle Aep Arg Xle *iefe Glu Lys Ala Asp Ser Am Lya Ala Arg Xle 100 185 290 Asp Glu Ala Asa lye Eia Ala Thr Lye «et Leu Gly Ser Gly 195 200 205 <210> 20 <211> 204 <212> PRT <213> SNAP-23 de Xenopus laevis (rã de unhas africana) <400> 20

Glu Glu Xle Gi» Leu Lye Ala Asn Gla Vai 16 15 Ser Thr* Arg Mg Met Lati Asn Leu Ala Leu 35 30 Xle Lye «ir Ile ®hr «et Leu Ãap Glu Gin 40 41 Xle Glu Glu Gly Met Asp Gin Xle Αβά Lys

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Glu Asa fyr Lys Lys Ala frp Gly ser Lys Aep Asa Asp Ger 100 105 110. V&i Ser Lys ©la Fro Gly Gl» fiar As» Gly Gla Leu Ser Gly 115 120' 125 03.» Ser Gly Fro lyr lie Lys Arg lie Thr as» Aop asp Arg 110 115 140

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(Ha ile Gly Mg 11« As» Ql» Lys Ala Glu Thr Asa Lys Thr ISO 185 ISO

Asp Glu Ma As» Thr Lys Ma Lys Lys Leu He Giu 115 200

Cys <ys 80 Thr Gly 95 Asp Vai Ma Gly

As» Leu 160 AS» Gl»

Arg He <210> 21 <211> 212 <212> PRT <213> SNAP-25 de mar) <400> 21

Strongylocentrotus purpuratus (ouriço-do- 473

Het Glu Asp Gin Asu Asp Het Asn mt Arg Ser Glu Lm Glu Glu Ile λ 5 10 15 Gin Het Gin Ser Asn Het Gin Thr Asp Glu Ser Leu Glu Ser Tfer Arg 20 25 30 Arg Met Leu Gin Hat Ala Gin Gin Ser Gin hsp Het Gly Ile Lys Thr 35 40 45 Leu Vai Met Leu Aep Gin Gin Gly Glu Gin Leu ftSp Arg lie Glu Glu so ss 60 Gly Met Asp Gin 21a Am Thr Asp Hat Arg Glu Ala Glu Lys Asn Leu 65 70 75 00 Thr Gly Leu Gin Lys Cys cys Gly Ile Cys Vai cye Pro Txp Lys Lys 85 88 55 Leu Gly Asa iPfee Gin Lys Gly Asp Asp Lys Lys Thr Trp Lys Gly 100 105 110 to Α«)0 &®p Gly Lya Vai Asa Ser Hie Gin Pre Mst Arg Het Glu Asp 125 220 125 Asp Arg fm Gly cys Gly Gly Asn Ala Ser Het Ile Thr Arg xle Thr 230 135 148 ASp Ma Arg Gin Asp Gin Het Asp Glu Am Leu ffer Gin Val 'Ser 145 150 155 168 Ser lie Vai <ay Asn Leu Arg Hie Hat Ala xis ASp HSt Gin Ser Glu 155 - 170 275 11« Gly Ala Gin Asn S«r Gin Vai Gly Arg Ile Thr Ser Lys Ala Glu 180 185 150 Ser As» Glu Gly Arg Ile Jusn Ser Ala Asp Lys Arg Ala Lys Asn Xle 155 280 205 Leu teff Asn Lys 210

<210> 22 <211> 212 <212> PRT <213> SNAP-25 de Drosophila melanogaster (mosca da fruta) <400> 22 474

Met firo Ala Asp &re Ser Glu GlU Vai Ala Pro Gin Vai Pro Lys Xtir X 5 10 - 15 Glu Leu Slu Slu Leu Gin Xle Asn Ale Gin Gly vai Ala Asp Glu Ser 25 30 Leu Glu Ser ffar Arg Arg Met Leu Ala Leu £y» -Glu Glu Ser Lys Glu 55 40 - 45 Ala Gly Xle Arg Thr Leu Vai Ale Leu Asp Asp Gin Gly Glu Gin Leu 50 55 , 60 Asp Arg XI· Glu Glu Gly Met Asp Gin Ile Asn Ala Asp Met Arg Glu 65 70 * 75 80 Ala Slu Lye Asn Leu Ser Gly Het Glu Lys Cys cys Gly He Gys Vai m m 95 Leu Pre cys Asn im Ser Gin Ser ífce Lys Glu Aap Asp Gly fhr ΐϊρ 100 105 110 Lys Gly Asa Asp Asp eiy Lys val Vai Asn Asn G in Gre Gin Arg Vai 115 120 125 . Met Asp asp Arg Ano. Gly Hat Mefc Ala Gin Ale Gly Tyr Ile Gly Arg 130 135 140 Jle 3br Asn ASp Ale Arg Glu Asp Glu Met Glu Glu Asn Me t Gly Gin 145 150 155 160 Vai Asa ffcr Met lie Gly Asn Leu Arg Asn Met Ma Leu Asp Met Gly 155 170 175 Ser (Slu Leu Slu Asn Gin Asn Arg Gin Xle Asp .Arg Xle Asn Arg Lys ISO 185 180 Gly giu Ser As» -Glu Ala Arg Xle Ala mi Alá Asn Gin Arg Ale His 19S 200 205 Gin Leu Leu Lye 210

<210> 23 <211> 212 <212> PRT <213> SNAP-24 de Drosophila melanogaster (mosca da fruta) <400> 23 475 475 mt Ala Ala vai 01« hm Ma Glu pro hm TLr Glu Leu Gla Glu Leu 1 5 10 15 01« fíie l$s Ser Gly SM Vai M& Afip Glu ser Leu Glu Ser ífhr Arg ao 25 30 Arg Met Leu Ma Leu Mefc Afip Glu Ser Lyp •Glu Ala Gly 11« Arg $hr 35 40 45 Leu Vai Ma Leu A«|? Asp Gla Gly Glu Gla Leu Afip Arg Ile Glu Glu §0 55 80 Gly «et 19 Arg Xl« Afia Ma Afip «et Arg Glu Ala Glu Lys Afia Leu «s 70 75 @0 Ser Gly «st si« Lys Gys Cy» siy Ile cye Vai Leu Fro Txp Lyfi Lys m 50 95 Vai a®b ii« Ly® A»p Asp Gly Glu Ser Ala Lys Ala Afi» Aep Asp 100 105 110 Siy Lys 11« Vai Ma Ser G!» Pro Gin Arg Vai Ile Afip Glu Arg Glu 115 120 125 Arg Gly Gly «et Gly Ala Pro Pro Gla fiar Gly vyr Vai Ma Mg He 130 135 140 íSr Aga Asp Ala Arg Glu Asp GlU Met Afip Glu Afia Leu Gly Glu Vai 145 ISO 155 180 Afia Ser Met Leu Gly Aaa Leu Arg Aon «et Ala Leu AfiP Met Gly Ser 185 170 175 Glu leu <31« hem Gin Aaa Ly» -01« vai Asp Arg ile Afia Ma Lys Gly ISO 185 130 AfiP Ala Ate JtSB 11« Arg «et A«p Gly Vai Aaa Lyfi Arg Ma Aaa Ma ias ma 2« 5 hm Leu Lye Ser aio

<210> 24 <211> 212 <212> PRT medicinalis (sanguessuga) <213> SNAP-25 de Hirudo <400> 24 476

Met Mn Lye ASp lie Lys Pro Lys Pro Ala Asa Gly Arg Asp Ser Fro 1 5 10 15 1fcr Asp Leu Gin Glu lie Gin Leu Gin Met Asn Ala lie 7$*r ASP A«p 20 25 30 Ser Leu Glu Ser $fer Arg Arg Hat Leu Ala Met cy» Glu Glu Ser Lys 35 40 45 Asp Ala Gly Ile Arg Tfcr Leu vai mt Leu Asp Glu Gin Gly Glu Gin 50 55 60 ' Leu Asp Arg Ile Glu Glu Gly mt ASp Gin Ile Asn Gin ASp Met Arg $5 70 75 80 £p Ala Glu Lys Asn Leu Glu Gly Met Glu Lys Cys Cys Gly Leu Gsrs 8.5 80 85 Ile Leu Pro frp Lys Arg Hir lys Asn Plua Asp Lys Gly Ala Glu Trp 100 105 110 Am Lys Gly Asp Glu Gly Lys Vai Asn *?lir Asp Oly Pro Arg Leu Vai 115 130 135 Vai Gly Asp Gly Asa Met Gly Pro Ser Gly Gly Phe lie Utr Lys Ile 130 . 135 140 Tfcr Asn Asp Ala Arg Glu Glu Glu Met Glu Gin Asn Met Gly Glu Vai 145 150 155 1*0 Ser Asa Met lie Ser Asa Leu Arg Asn Met Ala Vai Asp Met Gly Ser 165 170 175 Glu Ile Asp Ser Gin Asa Arg Gin Vai Asp Arg Ile Asn Asa Lye Met ISO 185 180 siar Ser Asn Gl» Leíí Arg Ha Ser Asp Ala Asn Lys Arg Ala Ser Lys 185 200 205 Leu Leu Lys Glu ,, 210

<210> 25 <211> 212 <212> PRT <213> SNAP-25 de Loligo pealei (lula) <400> 25 477 mt Ser Ala Asa Gly Glu Vai Glu Vai Pro Lys Thr Glu Leu GlU Glu % 5 10 IS Xle βία Sãa Gin Cye Asa Gla Vai Asp Asp Ser Leu •Gly Ser fAr 20 25 30 Arg Arg Met Leu Asa Mèt €y® Glu Qlu Ser Lys Glu Ala Gly Xle Arg 35 40 45 Thr Leu Vai mt Leu Asp Glu Gla Gly Glu Gla Leu Asp Arg Xle Glu 50 55 60 Glu Gly Leu Asp Glu 11« Asa Gla Asp Í4et Lye Asp Ala Gla Lys Asa 65 ?Q 75 00 Leu Gly Gly mt Glu Lys Cye Cy» Gly Leu eys vai Leu Pro frp Lys @5 30 95 Arg Gly Lys Ser Ebe Glu Lys Ser Gly A»p Tyx Ala Asa ®tar Trp Lys 100 105 110 Lys Asp h&p Asp Gly Pro fhr Asa Thx Asa Gly Pro Arg Vai ibr VU1 115 im 125 Gly Aep Gin Asa Gly Met Gly Pr© Ser Ser Gly tfyr Vai «hr Arg Ile 130 135 140 fhr Asa Asp Ala &rg Glu Asp Asp Hat QlU Asa &sa Ifefc Lys Glu Vai 145 150 115 ISO Ser s&c Hat lie Gly &aa Leu Arg Asa Met Ala Ile ASP Met Gly Asa 165 170 175 Glu Ile Gly Ser Gla Asa Arg @la Vai Asp Arg xle Gla Gla Lys Ala ISO 105 ISO Glu ser Asn Glu Ser Arg Ile Asp Qlu Ala Asa Lys Lys Ala Tfcr Lys '101 ... 200 205 Leu Leu Lys Asa <- JI0

<210> 26 <211> 220 <212> PRT <213> SNAP-25 de Lymnaea stagnalis (caracol de água doce) <400> 26 478

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<210> 27 <211> 207 <212> PRT <213> SNAP-25 de Caenorhabd.itis elegans (nemátode) <400> 27 479

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<210> 34 <211> 116 <212> PRT <213> VAMP-2 de Bos taurus (vaca) <400> 34

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<210> 52 <211> 104 <212> PRT <213> VAMP de Strongylocentrotus purpuratus (ouriço-do-mar) <400> 52 496 496 Ma Pro Ser ftnn Lya Arg Leu 10 15 Vai Vai ssp Xle tfet Mg Vai 33 Gin Ala Leu Ser Vai Leu Aap 45 Ala Ser Gin PIm Gin Thr Asn

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<210> 55 <211> 132 <212> PRT <213> SynBl de Drosophila melanogaster (mosca da fruta) <400> 55 498

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<210> 58 <211> 221 <212> PRT <213> SynD de Drosophila melanogaster (mosca da fruta) <400> 58 500

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<210> 59 <211> 192 <212> PRT <213> SynE de Drosophila melanogaster (mosca da fruta) <400> 59 501 mt oiy I*ys Lye Asp Lys Asa Oiti *01» Ala Áap Ala Má Bro Ala i 5 ’ 10 15 Gly Asp Ma Pr» Prõ lusii Ala Oly Ma Pro Ma Gly Glu oiy Oly Asp 20 25 30 Gly Glu Ile Vai Oly Oly Pxá Me Aan PTC Olá Glu Ila Ma Má Olá 35 40 45 lye Aro Cf) Leu ,01a Ola Ola CE Ma Gin Vai Asp Olu mi vai Aep Xle Mefc Ar§ thx mm Vai Oiti 3.3 Lye vai !*eu Olu Arg ASP Ser Lys IfSU ser €5 , n 75 80 $lti Leu Asp Aep Arg Ma Aap Ma Leu Gin Olá Oly Ma Ser Olá Phe 85 58 95 Qlu Glá <3la Ala Oly í^e Leu Ly® Arg Lys pise •Prp Leu Gin Asn Leu 100 105 110 Lye Mefc Mefc XI· Ile mt Oly Vai Xle Oly Leu Vai Vai Vál Oly Ile 115 120 125 lie Ma A»a X*ye Leu Oly Lati ile Oly Gly Glu Gin S*o Pro Olá syr 130 135 140 ola Tyr Pre Ola fyr Met 01a Pr© Pro Pr» Par© Pro Pro Olá Olu 145 ISO 155 150 Pzo Má Oly Oly Ola Ser Ser L«U Vai Asp Ma Ala Gly Ala Gly Aep 185 in 175 «t >» fj oly Ma 61y oiy Ser Ala Gly Ma Oly Aep Hle oiy Gly Vai ISO 155 130

<210> 60 <211> 169 <212> PRT <213> VAMP de Hirudo medicinalis (sanguessuga) <400> 60 502

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<210> 61 <211> 125 <212> PRT <213> VAMP de Loligo pealei (lula) <400> 61

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<210> 62 <211> 145 <212> PRT <213> VAMP de Lymnaea stagnalis (caracol de água doce) <400> 62

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<210> 63 <211> 180 <212> PRT <213> VAMP de Aplysia californica (lesma-do-mar) <400> 63 504 mt Ser Ala Gly Rito Gly Gly f!T© 01» Gly Gly Jtet Gin >?ro Pr© Aarg 1 5 10 15 Glu Gin Ser Ly» Arg Leu Gin 01» ft*r Gla Ale Gin Vai A»P GIu Vai 20 25 30 Gin Vel Asp Ile Aarg Vai As» Vai Gl» tm Vai Leu Asp Arg Asp 35 m 45 Lys Ile Ser Gin Deu Arg Ma Gl» Ale Leu Gl» Ala «** Me 50 $4 $0 Ser Gl» Phe Glu Alâ Ser Ala Gly Lye Leu Ly» Arg hys Tyr f»p frp 6S 70 7S * 80 Lye Aen Vys Lys mt Mefc Leu Ile Leu Gly Ala ile Ile Gly Vai Ile - 8S • 30 35 Vai Me Ile Ile Ile Vai ®rp Vai Vai Tbr Ser Gin Asp Ser Giy Gly 100 10$ 110 _ Asp Aep Ser Gly Ser Lys Har Fr© Ala Tfcr Ala Gly Thx Ser Fr© Ly« 11S 110 125 Px© Vai Glu,Ser Gly Vai Gin Gly Gly Gly Gly Arg Gin Gin Arg Fr© 130 135 140 Me Ser Gin Leu Vai GI« Arg Arg As» Vai Leu Arg Arg fibr Glu Asp 14$ 150 155 140 HiS Ile Giy Cys Arg Fr© His ll© Mis Ser Phs Ile Mia Ile Phe Met 165 170 175 Ile cye VAI A 188

<210> 64 <211> 109 <212> PRT <213> SNB1 de Caenorhabditis elegans (nemátode) <400> 64 505

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<210> 6 6 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-1A de Homo sapiens (humano) 506 <400> 66

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<210> 67 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-lBl de Homo sapiens (humano) 507 <400> 67

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<212> PRT <213> Sintaxina-1B2 de Homo sapiens (humano) 508 <400> 68

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<210> 69 <211> 287 <212> PRT <213> Sintaxina-2-1 de Homo sapiens (humano) 509 <400> 69

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<210> 70 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-2-2 de Homo sapiens (humano) <400> 70 510 mt Arg Asp Arg Leu Pr© Asp Leu fiar Ala €ys Arg Lys Asn ASp Aâp 1 Gly Asp Ar Vai S Vai vai Vai Glu 10 Lye Asp 25 His Hat Asp 15 Asp fite 20 « 30 Ffae His Gin vai Glu Glu He Mg Asn ser Ile Áap Lys ile ffcuf Gin 35 40 45 Tyr Vai Gin Glu Vai Lys Lys Asa His Ser Xle Xle Leu Ser Ala Pr© 50 55 * «0 as» Prosiu Gly Lys Xle Ϊ&Β GlU Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Glu 65 70 75 00 lie Lys Lys .ftor Ala Asa tm Ile Arg Ala Lys Leu Lys Ala xle Glu 65 ► 50 85 Gin Ser Phe Asp Glu Aap Glu Ser Gly Asn Arg vhr Ser Vai Asp Leu 100 105 110 Arg Xis Arg Arg Hhx Glu fíls Ser Vai Leu Ser Arg Lys Pite Vai Glu 115 120 125 Ai a Met Ala Glu fyr Asa Glu Ala Gin Tbr Leu «se Arg Glu Arg Ser 130 135 140 Lys Gly Arg Xle Gin Arg Gin Leu Glu Xle ybx Gly Arg fStr fhr UB 150 155 ' 160 Asp Asp Glu Leu Glu Glu mt Leu Glu Ser Gly Lys Pm Ser Xle Pfee 165 170 175 Ar Ser Aap lia 11a Ser Asp Ser Gin Xle fhr Arg Gin Ala Leu Asn ISO 185. 150 GlU Xle Gin Ser Arg His Lys Asp Xle Hat Ly« Leu Glu Thr Ser Xle 195 200 205 Arg Glu Leu His Glu Met His Met Asp Hat Ala Hat Pite Vai Glu fhr 210 215 220 Gin Gly Glu Met lie Asa Asa Xle Glu Arg Asn VAI Met Asn Ala fhr 225 230 235 240 Aap Tyr Vai Gin Ma Ala Lys Glu Glu T&r Lys Lya Ala Xle Lys fyr 245 250 255 Gin Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Trp Xle Xle ile Ala vai Ser vai 260 270 Vai Leu Vai Ala lie Ile Ala Leu Xle Xle Gly Leu Ser Vai Gly Lys 215 200 205

<210> 71 <211> 299 <212> PRT <213> Sintaxina2-2-3 de Homo sapiens (humano) 511 <4Ο0> 71 mt Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys Arg Lys Asn Asp Asp % 5 10 15 Gly Asp Thr Vai Vai vai Vai Glu Ly® Asp His Fbe mt Asp Asp Phe 10 25 30 Pha HÍS dia Vai Glu Glu lie Arg As» Ser Ile Asp LYB 11« Thr Gin 35 40 45 Tyr Vai Crt Glu Glu Vai Lys Lys Asa His Ser Ile Ile 60 Asp Leu Ser Ala Pro Asa 3V PíU Glu Gly Lye j?«el Ile Lys glu Glu Leu Glu Leu Asn Lys Glu 65 70 75 80 Ile Lys Lys Thr Ala mm Lys lie Al& Ala Lys Leu Lys Ala lie Glu 85 i 90 55 Gin Ser Fhe Asp Gin Asp glu Ser Giy Asa Arg Thr Ser vai Asp Leu 100 105 110 Arg lie Arg Arg Thr glu hís Ser val Leu Ser Arg Lys mm val Glu 115 120 125 Ala «et Ala Glu Tyr Asn Glu Ala gin Thr Leu fhe Arg Glu Arg -Ser 130 135 140 Lys Gly Arg Ile m» Arg gin Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr 145 ISO 155 1*0 ASP Asp Glu Leu Glu glu «et Leu Glu Ser Gly Lys Bro Ser ile Phe 16 S 170 175 Thr Ser Asp ile Xle Ser Asp Ser Gla Ile Thr Arg Gin Ala Leu Asa ISO 185 130 glu ile Glu Ser Arg His Lys Asp Ile «et Lys Leu Glu Thr Ser Ile 155 200 2 OS Arg Glu Leu His Glu tmt Fhe «et‘Asp «et Ala «et Phe val Glu Thr 210 215 220 * Glu Gly Glu Met Ile &s» ASXL Ile Glu Arg Asa Val Met Asa Ala Thr 225 230 235 240 Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala Ile Lys Tyr 245 250 255 Gin Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Trp Ile Ile ile Ala Val Ser Val 260 265 270 Val Leu vai val Tyr Arg Leu Fhe Gly Leu ser Leu glu Tyr Val Val 275 230 - 285 Arg Ser Ala Ala Ser Leu Pro Gly Trp Gly Asa 290 295 <210> 72 <211> 289 512

<212> PRT <213> Sintaxina-3 de Homo sapiens (humano) <400> 72

Met tm Asp A*S Leu Glu Glu Leu Lya Ala Lya Gin Leu T&r Gin Aap 1 5 10 15 Aep Asp Thr ASp Ala Vai Glu Ile Ala 11« Asp Asa Thr Ala Ffee Met 20 25 • 30 Asp Glu Ph& Phe Ser Glu Ile Glu Glu flur Arg Leu Asa lie Aap Lys 35 40 45 xie Ser GlU Elá Vai Glu Glu Ala Lys Lys LSU TV* Ser ile 11« Leu 50 55 50 Ser Ala Pró lie Fro Glu Fr© Lys ffcar Lys K fl?W íwfp Asp Leu Glu Gin Leu 65 70 75 80 Thr fiar GlU lie Lys Lya Arg Ala Asa Mn val Arg Asa Lys Leu Lys @5 90 * 95 Ser Met Glu Lya lis lis Glu Glu Asp Glu Val Arg Cíaw Qaae* Ala Asp 100 . 105 110 Leu Arg Ile An hym Ser Gin lie Ser Vai Leu Ser Arg Lya Phe Val 115 120 125 · " Glu Vai mt ffer Lys Tyr Asa Glu Ala Gin Val Aap Fh« Arg Glu Arg 130 135 140 Ser Gly An II® Gin Arg Gin L«U Glu Ile Thr Gly Lya Lys Ίΐη? 145 150 155 100 Tkr Aep Glu Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Asa Pro Ala 11« 155 170 175 m» ftnr ser Gly lie ile Asp Ser Gin 11« ser Lya Gin Ala Leu Sm ISO 185 150 * Glu 11a Glu Gly Arg His Lys Aep lie val An Leu Glu Ser Ser He 195 200 205 Lys Glu Leu Ri» a»p mt Phe Met km 11« Ala Met Leu val Glu Asa 310 215 220 Gin Gly Glu W&t Leu Asp hm Ile Glu Leu Asa Val Met Mis Tfcr Val 225 230 235 240 Asp Mis val GiU Lys Ala Arg Asp Glu Ser Lys Lys Ala vai Lys Eyr 245 250 255 Gin Ser GlB Ala Arg Lys Lys Leu Ile 11« 11a 11« val hm Val Val 260 255 27® Vai Leu Leu Gly Xle Leu Ala Leu 11« Gly Leu Ser val Gly Leu 275 2®0 295· 513 <210> 73 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-1A de Bos taurus (vaca) <400> 73 Mefc Ly» Asp Arg Tbr 61« 61« Leu i . 5 ASp ASP Asp Val Thr vai fiar Vai 20 m& ?h© 61« 111 61« Vai 61« 61« Ile Afí 61« ASn Vai 61« 61« vai Lys Afcg 50 55 Pto Asa Fro Asp 61« Lys Thr Lys S5 70 Asp Ile Lys I*ya Ifer ee Ala Asa Ly» 61« 61« ser 11« V? 61« 61« 61« Glu 100 hm Arg 11* Arg Lys Tfctr 61« His 115 120 61« mi mt Ser 62« TJfx Asa Ala 130 135. Cys Lye Ôly Arg xl© 61« Arg Gin 145 150 T&r Ser 61« 61« Leu 61« Asp Met ies Ph© Ala Ser Gly Ile Ila mt Asp ISO Ser 61« n« 61« Thr Arg Bis Ser m 200 XX© Ãxg 61« i»e« Kls ASp «et Phe 210 215 Ser 61« 6ly 61« M©& 11© Asp Arg 225 230 Vai Asp Tyr Vai Glu Arg Ala Vai 245 Tyr 61« Ser i»ys Ala Arg Arg Lys 2 60 Vai Vai Leu Gly He Vai Ile Ala 275 280

Arg TAr 10 Ala Lys Aap Ser Asp 15 A»p ASg 25 Arg Asp Arg Pb© Bet 30 AS-P 61« Arg 6ly Phe Ile Asp 45 Lys 11© 5er Lys Ris ser Al4 80 .11© Leu Ala Ser Glu 61« Leu 75 Glu 61« Leu Het “Ser 80 Vai Arg m Ser Ly» Leu Lys S«r 55 11© Gly 105 Leu A»Ii Arg Ser Ser 110 Ala Asp Ser Tfcaf Leu Ser Arg 125 Lys Phe Val Tftr 61« Ser Asp 140 Tyr Arg Glu Arg Leu 61« Ile 155 Hir Gly Arg 7&r Thr 250 Leu 62« 170 Ser Gly Asn Pr© Ala 175 lie Ser 185 Ser Ile Ser Ly» 61« 150 Ala Leu 61« Ile XI© Lys Leu 205 61« Asa Ser Hat ASp Het Ala 220 Met Leu val 62« 11© 61« Tyr 235 Asa vai Glu His Ser 240 Ser Asp 250 fíir Lys Lys Ala Val 255 Lys Lys 285 Ile Ket lie Vai ile 270 Gys cys Ser Tfer F&© 61y Gly 285 Ile Phe Gly 514

<210> 74 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-1B2 de Bos taurus (vaca) <400> 74 *set hy~B hm Arv Thr Gin Glu Leu Arg Ser Ala Lys Asp Ser Asp Asp 1 5 28 15 Glu Glu Glu Vai vai kís VUl Asp Arg Aep His Phe Met ASp Glu F&e 2Q 25 30 Fhe Glu Sla Vai Glu Glu Ile Arg Gly Cys He Glu Lye Leu Ser Glu 35 40 45 ûp Vai Glu Gl» Vai lm Lya Gin His Ser Ala H« Leu Ala Ala soro so 55 - «0 Am Pr© Mp 01a Lys Tfer Ly® Gin Glu Leu Glu Asp,Leu Thr Thr Asp S5 70 75 80 Ile Lys Lys Thr Al a Aan Lys Vai Arg Ser Lya Leu. Lys Ala He Glu 85 SO 05 Gin Ser He Glu Gin Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu 100 105 110 Arg 11« Arg I»ys Thr Gin Hls Sèr Thr Leu Ser Arg Lys Phe ml Glu Π5 120 125 val Mel fhr Glu Tyr Aen Ala l&r Gin Ser Lys TV* Arg Asp Arg cys 130 135 140 Lys Aep Arg 11« Gin Arg Gin Leu Glu Xla Thr Gly Arg Thr Thr Tfer 145 250 255 ISO Am Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly lys Leu Ala Ile Pfee 165 170 175 Tlfar Asp Asp H« Lys Met Asp Ser Gin Met Tfer Lys Gin Ala Leu Aen ISO 185 ISO Glu 21« Glu Tfer Arg Hl» Glu 11« Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile 155 280 205 Arg Glu Leu Hls Asp Met Fhe val Asp mt Ala Met Leu Vai Glu Ser '310 325 220 ‘ Gin Gly Glu Met 11« Aap Ar«f lie Glu Tyr Asn Vai Glu His Ser Vai 225 230 235 240 Asp Tyr vai Glu Arg-Ala vai Ser Asp ®br Lys Lye Ala Vai Lys fyr ' 245 * 150 255 Gin Ser &ys Ala Arg Arg Lys Lys He Met He lie He •Cys cys Vai 280 2€S 370 vai Leu Gly vai Vai Leu Ala Ser Ser He Gly Gly *tar Leu Gly Leu 275 380 285 515

<210> 75 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-1A de Rattus norvegicus (rato) <400> 75

Met Lys Asp Arg ^$r Glu Glu Leu Arg Tfar. Ala 1 I I Asp Asp 1 5 < 10 15 Asp Asp Asp Vai Vai Thr Vai Asp Arg ASP Arg Phe Met Asp Glu 20 25 30 mm Phe Glu Gin Vai GlU Glu Ile Arg Gly Pfce He Asp Lys Ile Ala 35 40 45 Glu Asa Vai Glu Glu Vai Lys Arg Lye His Ser Ala Ile Leu Ala Ser 50 55 60 Pr© Asa Fr© *sp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser 65 70 75 S0 Asp He Lys Lys Thr Ala Asa Lys Vai Arg Ser Lys Leu Lys Ser ile 85 30 35 Glu Gin Ser 11® Glu Gin Glu Glu Gly Leu Ae» Arg Ser Ser Ma Asp 200 105 110 Leu Arg lie Arg Lys Gin His -Ser te Leu Ser Arg Lys Fhe vai 115 120 125 Glu Vai Hat fer Glu Tyr Aan Ala Tfcr Gin Ser Asp Tyr Arg Glu Arg 130 1:35 140 Cys Ly« Gly Arg íle Glu Arg Gin Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr 145 ISO 155 160 Ser Glu Glu Leu Glu Asp Mefc Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile 165 170 175 Pbe Ale Ser Giy Ile He set Asp Ser Ser Ile Ser LyB Gin Ala Leu 180 185 130 Ser Glu Ile Glu Thr Arg Sis4 $ar Gltt Ile ile Lys Leu Glu &sn Ser 135 200 205 He Arg Glu Leu Sis Asp Met Phe Met Asp mt Ala Met Leu Vai Gltt 210 215 220 * Ser eia siy Glu Met He Asp Arg Ile Glu Tyr Àsa Vai Glu «is Ala 225 '230 235 240 Vai ASP fyr Vai Glu Arg Ala Vai Ser Asp Thr Lys Lys Ala . Vai Lys 245 250 255 Tyr Gin Ser Lys Ala Arg Arg Lys lys Ile mt Ile Ile Ile Cys oys 260 265 270 Vai Ile Leu Gly ile Ile lie Ala Ser Thr tu Gly Gly Ile : FM* Gly 275 280 285 516

<210> 76 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-1B2 de Rattus norvegicus (rato) <4 0 0> 7 6

Mat 4 Ly® A®p Arg Tfar Gin Giu Leu arg Ser f n ala Ly® Asp Ser Asp 15 a®p Λ Glu Glu Glu vai Λ· vai mis val Asp arg Asp Hie Wb& Met asp Glu 2he 23 25 . 30 Fhe Giu 01 a vai G In Giu 12« Arg Gly Cy® 21« Glu Ly» Leu Ser Glu M 40 45 . Asp Vai Glu Gin Vai Lys Lys Gin Bis Ser Ala 21« leu ala Ala Pro m 55 €0 Asa frô Asp Glu :Lye Thr Lys Gin Glu Leu Glu Asp leu Thr Ala Asp 65 70 , 75 80 ile lys Ly® Thr Ala asm Lys val arg ser lys Leu Ly® Ma He Glu 85 30 8$ Gla Ser n« Glíi GX& Giu Glu Gly leu Asn Arg Ser Ser Ma Asp Leu 100 105 120 Arg 11« Axg Lys Thr Gin Bis Sar Thr Leu Ser Arg Lys Phe val Glu u$ 120 12$ Val Met Thr Giu Tyr Asn Ala Thr Gin Ser Ly® Tyr Arg Asp Arg €y® 130 13$ 140 Lys Asp Arg 11« 0ΪΆ Arg Giu L«U Glu 11« Thr Gly Arg Thr Thr Thr 14$ 150 1SS 160 Asn Glu Glu L«U Glu Asp wet hm. Glu Ser «Y Lys Leu Ma Ile Phe 165 170 175 Tfcr Asp Asp Ue Ly» mt Asp Ser Glu Het Thr Lys Glu Alá Leu Asa 100 18$ 130 Gltt 11« Glu Thr Arg kís hm Glu 11« Ile Lys leu Glu Thr Ser n« 135 200 205 Arg Glu Leu Kl® Asp M«t Phe val asp mt Ala Met Leu Val Glu Ser 210 21$ V 220 Gin Gly 01» Met 11« Asp Arg fie Glu τ&ε Asa Val Glu Hi® Ser Vai 22$ 230 23$ 240 A«p ?&£ Vai 01a arg Ala Val "Ser asp Thr Ly® lys Ala Val Lys Tyr - 24$ 250 255 Gin Ser Ly® Ma arg arg fcy* Lys Ile mt ne ile lie Gy® cys Val 200 265 270 Vai Leu Gly v«l Val Leu Ala Ser Ser 11« Gly Gly Thr Leu Gly Leu 275 280 285 517

<210> 77 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-1A de Mus musculus (murganho) <400> 77

Ket Lys Asp Mg Thr Glu Glu LéU Arg Thr Ala Lys.Asp Ser Asp Asp 1 5 10 15 ASP Asp Asp mi Thr Vai Thr Vai Asp Arg A&p Mg ®h* l|et Asp Glu 20 25 30 Phe Phe Glu Gin Vai Glu Glu Ué Arg Gly Bfae Ué Asp Lye 11« Ma 35 40 4$ Glu Asn Vai Glu Glu Vai Lye Mg Lys Me Ser Ma lie Leu Ala Ser §0 55 50 Pre Asn Bro Mp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu het ser 65 70 75 80 Asp 11« Lys Lya ffer Ma As» Lys val Arg Ser Lys Leu Lye Sor Ile 85 $0 85 Glu Glu Ser Xle Glu Glu Glu Glu Gly L«u Asa Arg Ser Ser Atip1 100 105 110 Leu Arg ile Arg Lya Thr Glu ,HÍS Ser Thr Lôll Ser Arg Lys Pfae Vai UI 120 125 Gltt Vai Mat Ser Glu Tyr Asa Ala Thr Glu Ser Asp Tyr Arg Glu Arg 130 13 S 140 Cys Lys Gly Arg Ile Glu. Arg Glu Leu Glu Ué Thr Gly Arg Thr Thr n$ 150 155 ‘ 160 Thr Ser Glu Glu Leu Glu ASP Kefc Leu Glu Ser Gly Asu Bro Ala Xlé 165 170 175 phe Ala Ser -Gly Ué Ué mi Asp Ser- Ser lie ier Lys Glu Ala Leu ISO 185 280 ¥ ser Glu ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile 11« Ly® Leu Glu Thr Ser 155 200 205 lie Arg Glu Leu lis Asp MEét Fhé Mefc Asp mt Ma mt Leu vai Glu 210 215 220 Ser Gla Gly Glu Met 11« Asp Arg 11« Glu Tyr Asa Vai Glu Ui® Ala 225 230. 235 * 240 Vai asp Tyr Vai GlU Arg Ma Vai Ser Asp Thr Lys Lys Ala Vai Lys 245 250 255 Tyr Glu Ser Ly» Ala Arg Arg Lye Lys Ue Mefc Ue n« 12« Gya Cys 260 285 270 Vai Ile Léu Gly 11« 11® Ile Ala Ser ftur 11« Gly Gly Ile Pbe Gly 275 280 285 518

<210> 78 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-lBl de Mus musculus (murganho) <400> 78

Met Ly» Glu Trp T&r Glu Glu ArgArg Sar Ala Ly» Asp Ser Asp Asp 1 5 10 15 1 1 3lu val Vai Hia Vai Asp ftrg Ala His Phe Met Ma Glu Phe 20 25 30 1 i Gin vai Glu Gin Me Ar9 GlyCys Ma Glu Lys Leu Ser Glu 35 40 45 Asp Vai cn Giy Ar* Vai Gly Gly Gin cc His Ser Ma Ma Leu Ala Ala Lys Fro Aep Glu Lys f&r Lys Gin Glu Leu Glu ©11 Asp Leu ífcr Ala Asp 65 70 75 80 Me Lys íy» Ttur Aid Asn Lys Vai Arg Ser Lys Leu Lys Ala lie'Glu 85 50 , & Gin Gly rie Glu Gla Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser ser Ala Asp Leu 100 105 110 Arg Tyr Arg ffcr S&r Gin His Ser $tor Vai Ser Arg As» PAe Vai Glu 115 120 125 mi Hat Thr Glu *yr Asa Ma Thr Lys Ser Lys fyr A»g Asp ArgGys 130 135 140 Lys Asp Arg Leu. Gin Arg Gin Leu Glu Me T&r Gly Arg *hr fhr fhr 143 130 155 * 150 As» Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Lys Leu Ala Xle Pite 105 1 170 175 Tfer Asp ASp Xle Lys Met Asp Ser Gin Met fhr Lys Gin Ala Arg Asn 180 185 150 Glu lie Glu fhr Arg His Aen Glu Me Me Lys Leu Glu fbr Ser Me 133 200 205 Arg Glu Leu His Asp MSt Fh© Vai Asp Met Ala Met Leu Vai Glu Ser 210 . 215 220 Gin Gly Glu Met Me ASP Arg Me Glu fyr Ass vai Glu Bis Ger vai 225 . 230 235 240 Asp fyr Vai Glu te$ Ala Vai Ser ASP Thr Lys Lys Ala Vai Lys Tyr 243 230 •255 Gin ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys lie Met Me Me Me Cys l^ys Vai 260 253 270 Vai Leu Gly Vai mi Leu Ma Ser Ser Me Gly Gly t*hr Leu Gly Leu „273 280 285 ’ 519

<210> 79 <211> 288 <212> PRT <213> Sintaxina-1B2 de Mus musculus (murganho) <400> 79

Het Lys hsp àrg Thr Gin Glu Leu Arg Ser Ala Lys Asp Ser Asp Asp 1 5 10 25 Glu Glu Glu Val Val Hie Val Asp Arg Asp Hie Phô Hat Asp GlU Fite 20 25 30 Phe Glu Gin Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Me Glu Lys Leu Ser Glu 35 40 45 Asp Val Glu Gin Val hjm Lya Gin Kis Ser Ma Ile Leu Ala Ma Fr© 50 55 60 Am Pr© Asp Glu Lys T&r Lys Gin Glu hm Glu Afip L«u Thr Ma A$p 65 70 75 80 lie Lya tys Thr Ala Am Lys vai Arg Ser Lys Léu Lys Ma Ile Glu 15 00 35 Gla Ser lie Glu Glu Glu Glu Gly Leu Asa Arg Ser ser Ma Asp Leu 200 105 MO Arg lia Arg Lys fhr Gin «ia Ser Thr Leu Ser Arg Lys Shè Val Glu 115 120 125 Val Hat Thr Glu Tyr Asn Ala Thr Gin Ser Lys ®yr Arg Asp Arg Cys 130 135 140 Lys Asp Arg lia Gin Arg Gin Leu Glu Ile Thr Gly Arg fhr Thr Thr 145 250 155 ISO Am G lu GlU hm Glu Mlp mt Leu Glu Ser Gly Lys Leu Ma ile Phe 255 170 175 Thr Asp Asp 11a lys Het Asp Ser Gin Mete Thr Lys Gin Ma Leu Asa 180 135 IfÕ Glu Ile Glu 7&r Arg HÍS Asn Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile 135 200 • 201 Arg Glu Leu Bis Asp Mee FM val Asp Mete Ma Hat Lm Val Glu Ser 210 213 220 01» Siy Glu fíet Ile ASp Arg Ile Glu Tyr Am Val Glu Mia Ser Val 225 230 235 240 Asp fyr Val Glu Arg Ala Val -ser Asp ffer Lys Lys Ma val Lys Tyr 241 250 255 Qln Ser £ys Ma àrg Mg Ly® Lys 11« Hat Ile Ile lie €ys Cys Val 200 205 270 Val hm Gly val Val leu Ala Bar Ser Ile Gly Gly Thr Leu Gly hm 275 280 385 520

<210> 80 <211> 290 <212> PRT <213> Sintaxina-2 de Rattus norvegicus (rato) <400> 80

Met Arg mp t*g Leu Pr© Aep Leu Tbr Ala Cys Arg Lye Ser Asp A*sp % 5 10 15 1 1 Aen Ala Vai Ile ile Thr Vai Glu Lys Asp Hi» Pt« Met Asp 20 25 30 Ala Phè Ph& His Gin Vâl GlU Glu ile Arg Ser Ser ile Ala Arg ile 35 40 45 Ala Gin His Vai Glu Aep Vai Lye Lys Asa His Ser ile lie Leu Ser 50 55 60 Ala Pro Asa Pr© Gin Gly Lye Ile Lys Glu GlU Leii Glu Aeg Leu Asm 65 70 75 80 Lys Glu 11® Lye Lys Tíir Aia Asn Arg Ile Arg Gly Lys Leu Lys Ala ' 85 90 95 Ile Glu Gin Ser Cys Aep Gin Asp Glu Asa Gly Asn Arg Ttsr Ser vai 100 105 110 Asp Leu Arg H© Arg Arg Thx Gin His Ser Vai Leu Ser Arg Lys Phe 115 120 125 Vai ASp vai Met ΤΪΜΓ Glu Tyr Asm Gin Ala Gla ile Leu Pkm Arg Glu 120 135 140 Arg Ser Lys G1 y Arg Ile Gin Arg Gin Leu Glu Ile i&r Gly Arg T&r 115 150 * 155 ' im TIir T&r A«p Glu Gin Leu Gin Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pr© ser 165 170 17S 11« Phe Ile Ser Asp 11« Ile ser Asp Ser Gin ile Har Arg Glm Ala ISO 185 190 Leu Asa Gin Ile Gin Ser Arg Hís Lys Asp ne Met Lys Leu Gin T&r 195 200 205 Ser Ile &rg Qlii Leu His Gin Met phe Met Asp Met Ala Met Phe vai 210 215 220 Gin Thr Gin Gly Gin Met vai Asm Asn Ile Glu Arg Asm Vai val Asn 225 230 235 240 Ser Vai ASp syr Vai Gin 8ia Ala Lye Glu Glu Tísr Lys tye Ala 11« 245 250 355 Lye Tyr Gin Ser1 Lys Ala Arg Arg Lye Ly® Trp Ile Ile Ala Ala Val 260 265 270 Val Vai Ala vai He Ala Vai Leu Ala Leu Ile Ile Gly Leu Ser val 275 280 285

Gly Lye 290 521

<210> 81 <211> 289 <212> PRT <213> Sintaxina-2 de Mus musculus (murganho) <400 > 81 Het Arg ASp Arg Fre Asp Lm Thr Ala Cys Arg T&r Ass App ASp X 5 10 15 Gly ASP fhr Ala Vai vai !k mi Glu Lys Asp «is Fha Het Am Gly 20 25 30 tlie Phe «ia Gin Vai Glu Glu xie Arg Ser Ser XI® Ala Arg lie Ala 35 40 45 eia «is Vai eia kBp Vai Lys Asa Hit Ser Xle lie Leu Ger Ala se « 55 m fro km Pro Glu Gly Lys ile Lys Glu Glu Leu Glu As£> Leu Asn Lys €5 to 75 80 Glu 11® Lys Lys Ttur Ala Asn Arg Π© Arg 90 Gly lys Leu Lys Ser Xle BS 55 giu eia Ser Cys Asp Glu Aep Glu Asn Gly Am Arg Xhr Ser vai fm ioo 105 110 Leu Arg lie Arg Arg Tire Glu His Ser Vai Leu Ser Arg Lys Piie Val 115 120 135 Asp Vai «et ,Thr Glu Tyr Asii Glu Ala Glu Xle Leu $km Arg Glu Arg 130 135 140 Ser Itf* Gly Arg xi« Glu Arg Gin Leu Glu XI® Thr Gly Arg ihr Thr 145 ISO 155 ISO Thr Am Aap Glu Leu Glu Glu Het Leu Glu Sor Gly Lys Pro Ser Xle 165 - 170 175 ffce lie Ser Aep Χία 11® Ser Asg "Ser Glu XI® Tfcr Mg Glu Ala Leu 130 135 ISO Ana Glu XI® Glu Sor Arg «ia Lys ASP Ile Het lys Leu Glu mm 'Ser 19S 200 205 ' %ln Arg Glu Leu His Glu Het Phs Mfât Am Het Ala Het ffae vai Glu aio 215 220 Tkr ela eiy GlU Wet vai Am ASti .11 e Glu Arg Am vai v&l Aan 'Ser 225 230 235 240 Vai ASp Tyr Vai Glu Ria Ala Lys Glu Glu Tfer Lys Lys Ala Ile Lys 245 250 255 fyr Gla Ser Lyi Ala Arg Arg Lys Lys Trp Xle Xle Ala Ala Vai Ala , 260 205 270 Vai Ala vai 11® Ala Vai Leu Ala Leu m® 11® Gly Leu Ser Vai Gly 215 230 2Θ5

Lys 522 <210> 82 <211> 289 <212> PRT <213> Sintaxina -3A de Rattus norvegicus (rato) <4 0 0> 82 Met Lys Asp Arg- Leu Glu Glu Leu 1¾¾ Ala Lys Glu Leu 1 5 10 Aap Asp Mar Aap Glu Vai Glu He Ala Ila asp Asn Thr 20 - 25

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Lys 523

<210> 83 <211> 289 <212> PRT <213> Sintaxina-3A de Mus musculus (murganho) <400> 83

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Lys 524

<210> 84 <211> 283 <212> PRT <213> Sintaxina-3B de Mus musculus (murganho) <400> 84

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<212> PRT <213> Sintaxina-1B de Gallus gallus (galinha) <400> 8 6

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<212> PRT <213> Sintaxina-2 de Gallus gallus (galinha) <400> 87 mt w» Aãp Arg Leu Ma Asp Leu Ala Glu Cys Lys Gly Asn Glu Ãsp l $ 10 15 Gly Glu Tfcir vai 11a val Glu Lys Aep His Pha Met As»p Asp •IPhe ffce 20 25 30 Glu Glu Vai Glu Glu 11« Arg Asn Asn Xle Tiur Lys Xle Ala Gin. Asn .35 40 45 ; val Glu Glu val Lye Glu xis Ser Xle Xle Leu Ser Ala taro Asn so, GlU 55 g m Pre Gly Arg Thr lya GlU Glu Leu Glu GlU Leu Asn Glu Glu. Xle es 70 75 08 Lys Ly® tfhr Ala Asn Lys Xle Arg Ala Arg Leu Lys Ala xle Glu Gin @5 90 95 Ser Vai Aap Glu Ser Glu ASB Hs Asn Arg Thr Ser Val Asn val Arg 100 105 110 Xle Arg Lys TSsr mn Hie Ser Val Leu Ala Kis Ly» PAe Val Glu vai 115 lio 125 Met Thr Glu fyar Asn Glu 3&X Gin Thr Leu lha Arg Glu Arg Ser Lys 130 ’ 135 140 Gly Axg Xle Glu Arg Glu Leu Glu Xle Tktr Gly Lys ffer Thr Thr Asp 145 150 155 ISO Glu Glu Leu Glu Glu mt Leu Glu S«r Gly Asn Pre Ser Xle Ph« Thr . If§ 170 175 ser Asp Xle n« Ser Asp Ser Gin 11« ffer Arg Gin Ma Leu Asn Glu 100 105 150 xle Glu Ser Arg Ma Lys Asp 11« Met Lys Leu Glu Ser Ser Xle Arg 195 200 205 Glu Leu Hia Glu &et: Phe mt Asp mt Ma mt Phe Val Glu Thr Gin 310 215 220 Gly Glu Met lie Anu Aan 11« Glu Lys Asa vai Met Asn Ala Thr Aap aas 330 235 248 «yjp Vai Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ma Vai Lys xyar Gin 245 250 255 S«T Sy» Ma Arg Arg Lys mt Trp Xle Xle Xle Xle Val Ser Leu vai ISO 255 1 270 Leu xle Ma Vai Xle Gly lie Xle Xle Gly Leu Ser Val Gly Xle Arg 27S 280 285 <210> 88 <211> 288 528 <212> PRT <213> Sintaxina-1B de Danio rerio (peixe-zebra) <400> 88 Hefc Ϊhsp i Arg Tfir •C Glii Gl» Leu JL Αβρ Glu Gl» Vai w vai His Vai Asp 20 Fhe Cia Cl» Vai Glu Glu 21a A*g 35 40 Asp Vai Glu Gl» Vai Lye ty» Gin $0 55 As» Pro ASp Glu Lys TAr i#s Gin 65 70 íle Lys Lys Thr Ala As» Lys Vai 85 Gin Ser Ile Glu Gl» GlU Gl» Gly 100 Arg Ile Arg Lys Thr Cln HÍ8 Ser 115 120 Vai Mefc fhr Glu fyr Asn ffer Thr 130 135 Lys ASp Arg Ila Gl» Arg Gin Leu 143 150 Asa Glu Glu Leu Glu hm mt Leu 1«5 Thr Asp Asp na Lys mt Asp Ser 180 Cia Ile Glu Tbr Arg His Thr Glu 135 200 Arg Glu Leu Kie Asp «et Vai 210 213 Gi» dy Glu Met 11a Asp Arg Ile 225 230 Asp *syr Vai Cia Arg Ala Vai Ser 24$ Gin Ser Cl» Ala Arg Lys Ly» Lys 250 21® Leu Gly Vai Vai Leu Arg Ser 275 280 <210> 89 A*g Sar Ala Lys Aep Ser Aep hsp 10 IS Arg ASP His PA» Met ASP GlU ί&β 25 30 Gly cys ne Glu Lye Leu Ser Glu 45 Hl» Ser Ala lie,Leu Ale Ala JPre ^0 Glu Leu Glu Aep Leu Thr Ala Asp 75 80 ‘ Arg Ser Lys Leu Lys Ala Ile Glu 30 35 Leu Aim Arg Ser Ser Ala Asp Leu 103 110 Thr Leu Ser Mg Lys ^ΐιίϊ Phm Vai Glu Gla ser Lys fyr JL'«ÍmP Arg Αβρ Arg Cy» 140 Giu n® TAr Gly Arg Thr Thr Thr 155 ISO Glu Ser Gly Lys Leu Ala Ile $h& 170 175 Gin Met Thr Lys Gin Ala Leu ACM 135 ISO Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser lie ' 205 Asp Met Ala Met Leu Vai Glu Ser 220 Glu Tyr Asa Vai Glu His Ser Vai 235 240 ftep vhr Lye Lys Ala Vai Lys Tyr 250 255 Ile Met lie Ile 11a Cye Vai 265 270 Ser ile Gly Gly Tfer Leu Gly the <211> 288 285 529 <212> PRT <213> Sintaxina-3 de Danio rerio (peixe-zebra) <400> 89 mt 1 Lys Asp Arg Leu Glu s Gin Leu J* Glu Asp Vai Glu Ile Ala Vai Asp 20 Phe Ser GÍU xle Glu Asp Xle Arg 35 40 A&n vai fift Ala Glu VAI Lys Lys « Leu H*r 2V Ser ASP Glu Lys *Hbr Glu Asp 55 70 Xle Lys Lys Met Ala Aan Am Ala as Arg Asn Leu Glu ®br Glu Glu vai 100 Xle Arg Lys Ser Gin His Ala vai 115 120 Hat Xfcr Lys Tyr Asa Glu Ala Gin 130 135 Gly Arg Xle Gin Arg Gin Leu Glu 145 150 Glu Glu Leu Glu Glu Hat Leu Glu 155 Ala Gly Xle Vai Asp ser -Gly Xle

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<212> PRT <213> Sintaxina-1B de Strongylocentrotus purpuratus (ouriço-do-mar) <400> 90 «St Arg Asp Arg Leu Gly Ser Leu Lys Arg As» Glu Glu Asp Asp Val 1 5 ,10 2S Gly Gla sér Arg Giy 81a VAI Glu Ser Glu Lys Piie Met Glu Glu Pile 20 25 30 Píie Glu Gin vai Glu Glu Val Arg ASO Asa ile Asp Lys Ile Ser Lys ' 3S 40 45 Asa Vai Aep CA Glu ml Lys im EC Lys Me Ser Asp ile 50 Leu Ser Ala 1¾¾ 5V Gin Ala Asp Glu Lys Val Ly» Asp Glu Leu Glu Glu Leu Met Ger Asp 65 70 75 80 Ile Lys Lys Thr Ala Aeu Lys val Arg VAI Lys Leu Lys «et «et Tyr 85 50 95 Glu Ser Ile Glu Arg1 Arg Arg val Leu Arg Arg fiar Gin Thr Asp Val 100 205 110 Arg lie Arg Lye fhr Glu eis Ser Thr leu Ger.Arg Lys Phe Val Glu 115 120 125 Vai mt Tfcr Asp Tyr Asa Ser Tbr Gla «ir Asp Tyr Arg Glu Arg Cys 13¾ ‘ 135 140 Lys Gly Arg lie Gin Arg Gin Leu Glu Ile fhr Gly Ly» Ser Thr Tkr 145 150 15$ 160 Asp Ala Glu Leu Glu Aap «et Leu Glu Ser Gly Asa Pro Ala Ile Phe 165 170 17$ Thr Ser Gly ile Ile «et Asp Thr Gin G lu Ala Lys Gin f%tr Leu Arg 180 185 190 Asp lie Glu Ala Arg Ela Am -Asp Ile ile Lys Leu Glu Ser Gear Ile in 200 205 Arg Glu Leu His Asp «et 8fce «et Aap Met Ala «et Leu Val Glu Ser 31¾ 215 220 Gin Gly Glu mt Ile Asp Arg lie Glu Tyr A@n val Glu Gla Ser val 225 230 235 240 Aip Tyr val Arg Arg Gla km Asp Thr Ly» Lys Ala Val Lys fyr Gla 345 2S0 25$ Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys s&e Vyt lie Ale lie Cys Cys Gly Val 260 < 28:5 270 Ala Leu Gly lie Leu lie hm vai Leu ile Ile Val Leu Ala 275 280 28$ <210> 91 <211> 291 531

<212> PRT <213> Sintaxina-1A de Drosophila melanogaster (mosca da fruta) <400> 91

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<210> 92 <211> 295 <212> PRT <213> Sintaxina-1A de Hirudo medicinalis (sanguessuga) <400> 92 «et Thx Lys Asp Arg Leu Ala Ala Leu Lys Ala Ala Glu Ser Asp Asp 1 i 15 15 Asp Asp Glu Pro 61y Glu His Met Pre Met Thr Met Asa Vai Aap 20 25 50 Qly Lys Phe Met Glu Glu Fhe Phe GlU Glu Vai Asn Glu lie Arg Glu 35 46 45 Met Ue As© Lys Ile Ala vai Asp vai &sp Glu Vai Lys Lys Lys 8is * 50 55 m Ser Ala Xle Leu Ser Ala Pro Glu Thr Asp Asp Lys Thr Lys Glu Glu €5 ?e 75 85 Leu Glu ASp Leu Met Ala Glu lie Ly» Lys Ar Ala Asu Lys Vai Arg 85 56 $5 Gly Lys Leu Lys Vai Leu Glu Glu Lys Ik Glu Glu Glu Glu Glu fto

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<210> 93 <211> 292 <212> PRT

Loligo pealei (lula) <213> Sintaxina-1A de <400> 93

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Glu Thr Ser He Arg Glu Leu His Asp Met FAe Met Asp Met Ala Met 210 215 220

Leu Vai Glu Ser Gin Gly Glu Met He Aep Arg He Glu Tyr asu Vai 225 230 235 2*0

Glu Ala Ala val Aap Tyr Xle Glu Thx Ala Lys Vai Aep T&r Lys Lye 245 aSO 255

Ala val Lys Tyr Gin Ser Lye Ala Arg Gin lye Lys Ile Ala Ile Leu 250 255 270 val Çy» Leu vai He Leu Val Leu Val He val Ser 5&r Val Gly Gly 275 280 285 val Pfcse Gly Gly 290 534

<210> 94 <211> 290 <212> PRT <213> Sintaxina-1A de Lymnaea stagnalis (caracol de água doce) <400> 94 mt íHsr Lys Asp Arg teu Ala Ala teu lys Ala Ala GlU Ser Asp Asp 1 5 10 15 ASP Glu &SU Asp Asp vai Ala Vãl ®tsr val Asp Ser Ser Gly <£h« Met 20 25 30 Glu Glu Phe Phe Glu Glu vai Asp Glu xle Arg Glu Met Xle Aep Lys 3S 40 45 lie Ala Ser Sflífl Vai Asp Glu Vai Lys Lys Lys His Ser Ala Xle. teu SB S5 60 Ser Ala Pre Gin Thr Asp Asp Lys Met Lys Glu Glu teu Glu Glu Leu 61 70 75 80 Met Ser Glu Xle Lys Lys Asa Ala Asa Lys Val Arg Ala Lys Leu Lys 85 00 55 Vai lie Glu Glu Asa Xle Glu Gin Glu Glu Hl» lbr Asa Lys Ser Ser 100 185 110 Ma Asp Leu Arg 11a Arg Lys 7&r Glu His Ala teu ser Arg Lys 115 120 125 fhe vai Glu Vai mt Asa Asp vyr Asn Ala Cys 01a Xle Asp Tyr Arg 130 135 140 Glu Arg Cy* Lye Gly Arg Xle Ly» Arg Glu teu Ala Xle íljr Gly Lys 141 ISO 1SS 160 Thr Thr X!hr mm Glu Glu teu Glu Asp Met Xle Glu Ser Gly Aau Pro 165 170 175 Ma 11a Phe ®af Glu Giy Xle Xle Met Glu Tbr Gin Glu Ala Lys Gla ISO 185 ISO Tfctr teu Ala Asp Xle Glu Ala Axg Hís Asa ASp Xle Met Lys Leu Glu XS5 200 205 ¥hr Ser Xle Arg Asp Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu 310 2X5 220 Vai Glu Ser Gin Gly Glu Met Xle Asp Arg Xle Glu *yr Asa val Glu 221 230 235 240 Gin Ma val mp fyr lie Glu Thr Ala Lys Met Asp $fcr Lys Lys Ala 345* 350 255 Vai Lye Tyr Glu Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Xle Met Xle Xle Xle 260 26S 270 Cys Vai Cy» Vai hm 11« ile Ile teu val a M 1 Leu Gly Gly Thr 275 280 385

Eh® Gly 280 535 <210> 95 <211> 290 <212> PRT <213> Sintaxina-1A de Aplysia californica (lesma-do-mar) <400> 95 ííet Thr Ly© Asp Mf Leal Ala Ala Leu Lya Ale Al a Glu Ser Asp Asp - 1 5 10 IS A&p Asp Mu Mp Asp vai Ala Vai Thr via Mp Ser Ser Gly Phs mt 20 25 30 Glu. Glu Phe PM Glu Gin Vai ASp Glu Xle Arg Gl» mt xle Mp Lys 35 40 " 45 lia Ala Ser MU vai Mp Glu Vai Lys Lye Lys Sis Bar Ala Xle Leu 50 S§ 60 Ser Ala Pr© ©Xu Thr ASp hBp Ly» KÔt Lye Glu Glu Leu Glu Glu Leu 65 70 . 75 80 mt Ser Glu Xle hys Q§ Ly» Mn Ala Am Lys q a val Arg Ala lys Leu Lys vai Xle Glu Gin ví? Am Xle Glu Glu Glu Glu Sis Thr Am lya 73 Ser Ser 100 105 110 Ala Mp Leu AT0 Xle Arg Lys Thr Glu Mis Ala Thr Leu Bar A*g Lys 115 120 125 Pfee Vai Glu val Met Am Asp Mn Ala Cys Glu Xle Asp Tyr Arg 130 135 140 ' Glu Mg ox* Lys Gly Arg Xle Ly» Arg Gin Leu- Ala He fhr Gly Lys 145 ISO -115 ISO Tfcr Tfer Thr Aett Glu Glu Leu Glu Asp mt Xle Glu Bar Gly Aan- Pre 165 170 175 Ala He PM Thr Gin Gly Um Xle Mt Glu Thr Glu Gin Ala Aan Glu v 180 1SS 190 Thr Leu Ale Mp Xle Gl» Ma Arg His Mn Asp xle Met Ly® Leu Glu 195 200 305 Tíir Ser lie Arg Me» Leu Hl® Asp Mae Phe Mafc Asp Mefc Ala mt Leu 210 .215, 230 Vai Glu Ser Gin Giy GlU Hat Xle Mp Mg Xle Glu Tyr Mn val Glu 225 230 235 240 Glu Ala Vai top He Glu Thr Ala Lys Mst Asp Thr Lys Lys Ala 245 £50 255 mi Lys Tyr Gl» Ser Lye Ala Arg Arg Lys Lys Xle Mt Xle Leu Val . 260 205 270 Cys Leu Ale Xle Leu xle Xle Xle Leu Vai Gly Vai He Gly Gly Thr 215 280 285

Leu Gly 290 536 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 96 Ala Gla Arg Ala Tfar Lys 1 5 <210 > 97 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de BoNT/B VAMP-2 <4 0 0> 97 Gly Ala Ser Gin Gla T&r -Gear 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> 537 <223> Ligação para clivagem de BoNT/Cl Sintaxina-1 <4 0 0> 98 Aap Tkr kys Ala Vai l»yB Tyr .1 S <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de BoNT/Cl SNAP-25 <4 0 0> 99 Ala Asa ©la Arg Ala Thx Lys Mefc 1 % <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de BoNT/D VAMP-2 <4 0 0> 100

Arg Asp Gin Lys hmx Ser Glu. Lett 538

<210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de BoNT/E SNAP-25 <4 0 0> 101

Gl» 11« Asrg lie Met Gltt 1 S

<210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de BoNT/F VAMP-2 <4 0 0> 102

Glu Gin Lm Ser Glu 1 5

<210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de BoNT/G VAMP-2 539 <4 Ο 0> 103

Glu Thr Ser Ma Ma Lys Leu bys 1 . S

<210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ligação para clivagem de TeNT VAMP-2 <4 0 0> 104

Gly Ma Ser Gin E&e Glu Thx Ser 1 i

<210> 105 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 105

Yhr &T0 lie Asp Glu Ala Asa Glu Arg Ala Thx hm Met 1 5 10 540

<210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 106

Ser Asa Lyis Arg He A&p Glu Ala Asa Gla Arg Ale T&r l S IO 15

<210> 107 <211> 16 <212> PART <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 107 Ser Asa l*ys Tlsr Arg He Asp Glu Ale Asa Gl» Argr Mi i 1 1 5 10 IS

<210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 541 <400> 108

Ser Asn X*y» tfcr Axg Ile Asp ©1» *1* As» ©1« Msr Ala Thr Lyss Mst • 1 s 10 IS teu

<210> 109 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 109

Asp Ser ABn hy& Arg xle Asp ©lu Ale Asn -Gin. Arg Ala Thx hys 15 16 15

Met

<210> 110 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <400> 110

Asp Ser Asn Lys i&r Arg lie Asp ©lu Ala Asm Sin Arg Ma SSar hys 1 5 10 15 teu 542

<210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 111

Ser Asn hm fhr Arg Ile Asp Glm Ala Asii Sim láff Ala Thr Lys Ala 1 S 10 is

Heta

<210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <221> VARIANTE <222> (16) ... (16) <223> Xaa = ácido 2-amino-hexanóico (norleucina) <4 0 0> 112

Ser Asn Lys fbr Arg Ile Aep Glu Ala &sn Gin Arg Ala Thr hym Xaa 1 5 10 IS

Hem <210> 113 <211> 17 543 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 113

Ser Asa hyw T&tr Arg xle Asp <5Xu Ale Asa Sisa Asrg Ale Tfcx Ale Mefc 1' § 1Q ' 15 <210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 114

Ser Asa hys Thr Arg Xle Asp Qlu Ale Asa Qla Arg Ala Ser l*ya M«t 1 Leu 5 10 15 <210> 115 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 544 <221> VARIANTE <222> (14) . . . (14) <223> Xaa = ácido 2-aminobutirico <4 0 0> 115 <4 0 0> 116

Ser Aea Lys Thr Arg 11« Asp Glu Ma Asa Qln .Axg Xaa ®hr Lya Met l Leu § m 15

<210> 117 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial

Ser Asn Lys Thr Arg tle Aap 01« Ma asm Olm Mg Ala &&a Lys «et 1 Leu § n is <210> 116 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <221> VARIANTE <222> (13) ... (13) <223> Xaa = ácido 2-aminobutirico 545 <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 117

Ser Am Lye Tltr Arg lie Asp Glu Ale Asa Ais. Arg Ala Thr hys Met 1$ 1Ô 1

Leu

<210> 118 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SN AP <221> VARIANTE <222> (11) ... (11) <223> Xaa = ácido 2-aminobutírico <4 0 0> 118 Ser Asa hy® Thr Arg lis Asp Glu Ala 1 5 Leu Asa Xaa Arg 10 <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SN AP m 546 <4 Ο 0> 119

Ser Aaa Lya Thr Mrg Ile Asp Glu Ala Asa A»» Arg Ala Thr Lys Het 1 s lô IS

Leu

<210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 120

Ser Asa Lys Thr Arg Ile Aep Gin Ala Ala Gin Arg Ala Tfer 1¾¾ Met 1 5 10 is

Leu

<210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <221> VARIANTE <222> (9) ... (9) <223> Xaa = ácido 2-aminobutirico <4 0 0> 121 547

S«r Asa hyB f&r lie &sp Gla xaa Asa 01a &rg Ala flur x*y® ttet 1 S ’ 10 iS t®a

<210> 122 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <400> 122

ser asb tys ftr Ile Aep 01a Ala Asa ©la Arg Ma f“hr i*y** mmt í 5 18 IS teu

<210> 123 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/A SNAP-25 <4 0 0> 123 ser Asa tye l&x Atg Xlm Mui Gin Ala Asa 61a Arg Ala Thr i>ys Met 1 5 10 15 teu <210> 124 <211> 35 548

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Local de reconhecimento de BoNT/B VAMP-2 <400> 124 teu Ser teu Asp Asp Arg Ma Asp Ma teu <3Ια Ala Gly Ala Ser 1 5 W 15

Gla Phe Sim Thr Ser Ala. Ala tye teu tys Arg Lys Tyr Trp Φτρ Gys 20 2$ 30

Asa Leu Lys 35

<210> 125 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/B VAMP-1 <400> 125 Leu Ser Glu % Gin Phe Sie Asa Cys Lys 35

Leu Asp Asp Arg Ala Aep Ala Leu Gin Ala Gly Ala Ser S 10 15

Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys fyr írp Trp Lys 20 25 30 <210> 126 <211> 39 <212> PRT <213> Sequência Artificial 549 <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/D e BoNT/F VAMP-2 <4 0 0> 126

Ma Gla Vai' Aep Glu v&l Vai Asp 11¾ Hat Arg Vai As» Vai ftsp Lys X S 10 IS

Vai Leu Glu Ar© Asp Gla lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Ma Asp 20 25 30

Ma Leu Gin Ma Gly Ml Ser 25

<210> 127 <211> 39 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Local de reconhecimento de BoNT/D e BoNT/F VANP-1 <400> 127

Ala Gin Vai Glu Glu Vai Vai Asp -Me 11« Arg Vai As» vai Asp W® 1 5 10 15

Vai Leu Glu hm Asp Gin Lys Leu Ser, Glu Leu Asp Asp hm Ala Asp 2Ô 25 30

Ma Leu Gin. Ala Gly Ala Ser 35

<210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 550 <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 128 Cye Gly Leu Cys Vai Cys Pr© Cys Asa Ly» *1 s ia <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 129 Cys Gly Leu Rhe Xle Cys pro Cys Asa Lym 1 S 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do dominio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 551 <4 Ο 0> 130

Cys ely £*<ãu Cys Ser Cy» Pro Cy» Atsa 1 B 10

<210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 131 Çys Qly l*eu Cys f ro €ys Pro Cys &§n hy& i 1 10

<210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 132

Cys Gly lie Cys Vai Cy® Pr© Trp Lys Lya l 5 10 552

<210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 133

Cye Gly Ils Cys Vai Ite Pro Cys te lys IS 1§

<210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 134

Cys Gly Iffôu Cys Vai Leu Pro Trp Ate I»ys 1 5 10

<210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial 553 <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <221> VARIANTE <222> (3) ... (3) <223> Xaa = qualquer aminoácido <4 0 0> 135

Gia fra Kaa,,junr vai 1 5

<210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <221> VARIANTE <222> (3) ... (3) <223> Xaa = qualquer aminoácido <4 0 0> 136

Sia Ero x&a. hx$ He 1 5 <210> 137 <211> 5 554

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 137

Oln Pro Ala Arg Vai 1 5

<210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 138

Pro olm Arg V&l I 5

<210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial 555 <22 0> membrana <223> Fragmento do domínio de endereçamento para de SNAP-25 <4 0 0> 139 ala fro <31y Ar$ vai 1 $

<210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> membrana <223> Fragmento do domínio de endereçamento para de SNAP-25 <4 0 0> 140

ala Fro Ser Arg Ile 1 S

<210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> membrana <223> Fragmento do domínio de endereçamento para de SNAP-25 <4 0 0> 141 556 01α Pro ttet &rg Met 1 5

<210> 142 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do domínio de endereçamento para a membrana de SNAP-25 <4 0 0> 142 01b £ro Xle 1

<210> 143 <211> 239 <212> PRT <213> Proteína fluorescente verde de Aequorea coerulescens <4 0 0> 143 557

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Glu Gly Glu Gly Asp Ala Ttr Tyr 35 4Θ

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Vai Lys Ph© Glu Gly Asp Thr Mu Vai Asa Arg ll« Glu mu Tfar Gly * 115 120 125

Ttor Asp PM Lys Glu Asp Gly Asa lie Mu Gly Asa Ay® «et Glu Tyr 130 135 140

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Vai Gin Mu Ala Asp Eis Tyr Gin Gin lusa ffer Pr© II® Gly Asp Gly 180 185 190

Pro Vai Mu Mu Par© Asp Asa Bis Tyr Mu Ser Xfcr Gin Gar Ala Mu 195, .200 * 205

Ser Lys Asp Pro Asa Glu Lys Arg Asp His Ket II© Tyr Phe Gly Phe 210 215 220

Vai Thr Ala Ala Ala lie Thx Bis Gly «st Asp Glu Mu Tyr Ay® 225 230 235

<210> 144 <211> 231 <212> PRT <213> Proteína fluorescente verde de Zoanthus <4 0 0> 144 558 558 mt Ala Gin Ser Lys Hl® ®xy Leu Thr Lya Glu Met Thr 1 5 10 Arg Met Glu Qiy Qye val As? Gly His i*ys me Val Xle 20 25 Qly 11© Qly Tyx Pr© Pfee Lye Qly Lye Gin Ala lie Asa - 35 40 45 vai 61¾ Qly Qly Pr© Leu Pr© Phe Ma Glu AS? xle Leu 50 55 60 Pise Met Tyr Qly Asa Arg Val Phe Thr Qlu Tyr Pr© Glu 6S 70 75 Asp fyr Ptie Lya Asa Ser Cys Pr© Ala Gly Tyr Thr Trp 95 90 Phe L©U Ph© Glu As? Qly Ala Val.Cys xle Cy» Asa Ala 100 105 Vai Ser Vai Glu Glu Asa cys mt, Vyr 8is QlU Ser Lya ns 130 125 V&l &8U Ph* Pr© Ala As? Gly Pr© Val mt Lys Met 130 135 140 Ttp Glu Pr© Ser C^S Glu Lya lie Xle Pz© Val Pz© Lys 145 150 155 Leu Lye Qly Asp Vai Ser Mefc Tyr Leu Leu List Lye AS? 255 170 Leu Arg Cy» Qls» P&® As? Thr Val Tyr Lye Ala ItfS Ser ISO 185 Ly$ Met Pr© As? Trp HÍS me ΙΪ© Gin His Lye Leu Thr 195 200 205 Arg Ser AS? Ma Lye Asa Qln Lye Trp Bis Leu Thr QlU 210 315 220 Ala Ser Qly Ser Ala Leu Pr© 225 230 Het Lys fyr is 5&r Qly 431¾ 30 Leu CyB Vai Ser Ala Ma <210> 145 <211> 239 <212> PRAT <213> Proteína fluorescente verde de Aequorea victoria

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<210> 149 <211> 229 <212> PRT <213> Proteína fluorescente azul esverdeada de Anemonia majano <400> 149 563

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<210> 151 <211> 239 <212> PRT <213> Proteína fluorescente amarela de Aequorea victoria <4 0 0> 151 565

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<210> 163 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento de penetratina <4 0 0> 163

Arg ©la XI# Lys lia trp Phe Para Asn Arg Arg Met Hys Trp Lys lys 1 5 10 15

<210> 164 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento de penetratina <400> 164

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<210> 165 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento de penetratina <4 0 0> 165 1¾¾ Gin Π« im Ιΐβ |*he -<31ώ Astt Met teg fjya TO Lys 1 s <210> 16 6 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento de penetrat <4 0 0> 16 6

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<211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial 576 <22 0> <223> Fragmento de penetratina <400> 167 lorg Jâfg TXP fJírP Afcff Arg Trp Arg Arg 1Ô 15

Arg JSãfi Trp t&Q W i £ <210> 168 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Fragmento de TAT do VIH <400> 168

Qiy ftjfg t*ye I*y» Arg A£V ©In Arg Arg &rg 1 § 3-0

<210> 169 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento do factor de crescimento de fibroblastos de

Kaposi <4 0 0> 169

Ma Ma Vai Ma X©» !»©tt Pro Ala Vai Leu Leu Ala £ieu L©u Ma Pro

15 1Ô IS 577

<210> 170 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento de sinalização da localização nuclear <4 0 0> 170

Thr pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Vai Glu Asp Fr© i $ 10 '

<210> 171 <211> 27 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Fragmento de transporte <4 0 0> 171

Gly frp ^hr Leu Asn Ser Ma Gly Tyr Leu Leu Gly Lys fie Asn Leu 1 S .10 is

Lys Ala Leu Ala Ala Léu Ala Lys Lya lia Lm 20 25

<210> 172 <211> 27 <212> PRT <213> Sequência Artificial 578 <22 0>

<223> Fragmento de MPG <400> 172

«ay Ala Lfilí Phe Leu Giy fiha Lm Gly Ala Ma Gly Ser ®hr «et Gly 1 5 10 15 Ala ser Ola Pr© lya Ser iy» Arg Lys Val 20 25 <210 > 10 '3 <211 > 808 <212 > PRT <213> Homo sapi ens <400 > 173 mt Gly Ma Pr© Ma Cys Ma leu Ala hm Cys Val Ma Val lie 1 5 10 15 Val Ma sly Ma Ser Ser Olu Ser Létt Sly fbr Slu Gin Arg vai Val 20 25 30 Gly Arg Ma Ma Glu val Pró Sly Pr© Glu Pr© Sly Gin Gin Gin 35 46 45 Leti Val fM Gly Ser Sly ASp Ma val Gim Leu Ser Cya pro pro Pro SQ 55 60 Gly Gly Gly Prô Met Gly Prô f&r Val ifcp Val Lys Asp Gly ftsr Gly 45 70 75 ao Lesa Vai pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gla Arg La© S1q Val S5 to 95 Leu AS» Ma Ser Mia Ola Asp Ser Gly Ma Tyr Ser cys Arg MIm Arg 100 105 110 Leu qjir Ola A?9 val Lm cys Hi* Fhe Ser Val ATf Vai Thr mp Ma 115 120 125 Pro Ser- Ser Sly Asp Asp Glu Aflp Gly giu Asp Glu Ma Glii ABp S&r ÍM 13S 140 Gly 145 vai Mp ffer «ay Ma Ρϊ© ?yr íTrp Ihr ârg Fr© GlU Arg ««t Asp ISO 151 1€Q 579

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<210> 174 <211> 806 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 174 581 l®et Gly Ma Pro Ala Cys ala Leu Ala Leu cys vai Ma Vai Ma xle IS 10 is

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143 150 155 ISO

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<210> 175 <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 175 584 mt Gly Ala Fr© Ale Cys e Ala Leu Mi Leu Cys 1 ft Va l Al a Val Ma 1K Xle X vai Ala Gly Ha 3 Ser Ser Glu 4 w Ser Leu Gly Thr Glu Gin <fL >3 Arg Val val 20 25 30 Gly Arg Ala Ma Glu V*X Pr© Gly Fro Glu fro Gly Gin Gin Glu Gin 25 - 40 48 Leu Vai Pfce <ay Ser Gly ASP Ma val Glu neu Ser Gya fr© -Pr© fr© 50 55 60 Gly Giy Gly Pr© s$et Gly fro g&r val frp val Lya Asp Gly fhr Gly «S 70 75 80 Lee Vai Pr© Ser Glu Arg vai Leu Vai Gly fr© Gin Arg Leu Gin Val 85 90 95 Lee Asn Ala Ser His Gin Asp Ser Gly Ma Tyr -Ser Cys Arg Gin Arg 100 105 UG Lee ffer Gin Arg Vai Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Aep Ala 11S 220 125 Pr© Sm ser Gly Aep Asp.Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ma Glu Aep ífcoc no 135 140 G3y vai aep ffcr Gly Ala fr© Tyr Trp Thr Arg fro Glu Arg Mafc AGEp 145 ISO 155 160 Lys Lyu Leu Lee Ma Vai fr© Ala Ala Asna 7&r val Arg fhe Arg Cye 165 170 175 fr© Ala Ala Gly Aaa fro Thr fr© Ser He Ser frp Leu Lys Aan Gly 1$0 - 185 190 Arg Glu PLe Arg Gly Glu Hia Arg Ile Gly Gly 21« Lya Leu Arg Eis 195 200 2 0S Gl» eia T*P Bear Leu Vai Mefe Glu Ser VAI Val Par© ser Asp Mg Gl y 210 215 330 AS» Tyr Xhr Cye vai Vai GlU Ana Lya Pite Gly Sex Ile Arg Gin Thx 225 230 235 240 T&r Lm Aí3p Vai Leu Glu Arg Ser fr© His Arg fr© lie Leu Gin 245 250 255 Ala Gly Leu Pro Ma Aen Gin fftr Ala val hm Gly. Ser Asp Val Glu 260 • » 285 270 Fhe Hls Cys Lys Vâl Tyr Ser Asp Ala Gin fr© Eia lie Gin 7?rp Leu 275 280 285 1#» Sis vai Glu Val M Gly Ser Lys Val Gly Fr© Asp Gly Thr fr© 290 295 300 tfyr Vai *Η$χ- vai Leu Lya Val Ser Leu Glu Ser Aaa Ma Ser Mefc Ser 305 310 315 320 Ser Ae» fjsr fro Leu Val Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ser Gly Glu Gly 325 330 335 Pr© fhr hm Ala Asn val Ser Glu Leu Glu Leu Pr© Ala Aáft Fr© Lys 340 345 350 Trp Glu Léu Ser Arg Ma Arg Leu Tfcr Leu Gly Lys fr© Leu Gly Glu 355 360 365 Gly Cys Bis Gly Gin Val Val Me© Ala Glu Ala Ile Gly Ile A&p Lys 370 375 380 585

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<210> 176 <211> 604 <212> PRT <213> Homo sapiens 586 <4 0 C )> 176 Ala 1 Gin Arg AT» Lys '§ Gla Arg Giu Glu Leu 10 Ala Gin Gin w* Glu 15 Ma Ile Leu Arg Glu cy® Gly His €ly Arg Gla írg tter Le» fy* Phe 30 25 30 Vâl Vai Leu Gly Leu Ma Leu Môt Ma Asp Gly Vai Giu Vai A« Vai 35 40 45 <siy Sfee vai Leu Pro ser Ala Glu Ly» Asp Hat -Qye Leu Ser h&p Ser 50 55 00 vai Asa Lys Gly Mêt Leu Gly Leu ile Vai tyr Leu Gly mt Met Gly 6S 70 75 Gin 80 Ala Phe Leu Trp eiy Gly Leu Ma Asp Arg Leu Gly Arg Mg Cys 35 30 PS Leu Leu 11« Ser LeU Ser Vai Asa ser Vai JPhe Ma Mte Pite Ser sSer 100 105 110 587

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REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pelo requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • US 6319505 B [0002] • US 6464986 B [0002] • US 6423319 B [0002] US 20030185860 A [0002] US 20030211121 A [0002] US 20040037852 A [0002] US 20010021695 A [0002] US 20020010138 A [0002] US 20040013692 A [0002] wo 2004029576 A [0002] US 20060063222 A [0002] US 20030143651 A [0037] US 20030143650 A [0037] US 20040072270 A [0037] US 5982637 A [0044] US 5965699 A [0044] US 6762280 B [0050] US 5804387 A [0115] US 6800733 B [0115] [0118] [0124] [0127] US 6780975 B [0115] [0129] US 6627449 B [0115] 601 us 5795737 A [0115] us 5625048 A [0118] [0124] [0127] us 6319669 B [0118] [0124] [0127] us 6066476 A [0118] [0124] [0127] us 6124128 A [0129] us 6054321 A [0129] us 6077707 A [0129] us 6403374 B [0129] wo 2005006421 W [0214] us 5464758 A [0238] us 5814618 A [0238] us 5514578 A [0238] us 6245531 B [0238] us 5364791 A [0238] us 5874534 A [0238] us 5935934 A [0238] wo 9955899 A [0242] wo 0062067 A [0242] wo 0034308 A [0244] us 6080724 A [0245] us 5674980 A [0247] us 5747641 A [0247] us 5804604 A [0247] wo 9705265 A [0248] wo 9832866 A [0248] us 6734167 B [0248] us 5807746 A [0249] us 6043339 A [0249] us 6248558 B [0249] us 6432680 B [0249] us 6495518 B [0249] 602 us 6780843 B [0249] us 6306993 B [0250] us 6495663 B [0250] us 6287817 B [0251] us 6841535 B [0252] us 20030008813 A [0252] us 20040209797 A [0252] us 60668942 B [0460]

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • william J. Lipham. COSM^TIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN. Slack, Inc, 2004 [0002] • Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins. Niemann. Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Academic Press, 1991, 303-348 [0029] • Yann Humeau et al. How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release. Biochimie, 2000, vol. 82 (5), 427-446 [0031] • Kathryn Turton et al. Botulinum and Tetanus Neurotoxins:

Structure, Function and Therapeutic Utility. Trends

Biochem. Sei., 2002, vol. 27 (11), 552-558 [0031] • M. Zouhair Atassi. Basic and Therapeutic Aspects of Botulinum and Tetanus Toxins. 2003 [0031] • Giovanna Lalli et al. The Journey of Tetanus and

Botulinum Neurotoxins in Neurons. Trends Microbiol., 2003, vol. 11 (9), 431-437 [0031] • Heiner Niemann et al. Clostridial neurotoxins: new tools for dissecting exocytosis. Trends Cell Biol., 1994, vol. 4 (5), 179-185 [0032] 603 • Rossella Pellizzari et al. Tetanus and botulinum neurotoxins: mechanism of action and therapeutic uses. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei., 1999, vol. 354 (1381), 259-268 [0032] • Peptidomimetics for Drug Design. Goodman ; Ro. Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery. John Wiley & Sons, 1995, vol. 1, 803-861 [0039] • James J. Schmidt ; Karen A Bostian. Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin. J. Protein Chem., 1997, vol. 16 (1), 19-26 [0042] • Vadakkanchery V. Vaidyanathan et al. Proteolysis of SNAP-25 isoforms by botulinum neurotoxin types A, C, and E: domains and amino acid residues controlling the formation of enzyme-substrate complexes and cleavage. J Neurochem., 1999, vol. 72 (1), 327-337 [0042] • Mark A. Breidenbach ; Axel T. Brunger. Substrate recognition strategy for botulinum neurotoxin serotype A. Nature, 2004, vol. 432 (7019), 925-929 [0044] • Teresa A. Ekong et al. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology, 1997, vol. 143, 3337-3347 [0044] • James J. Schmidt ; Karen A Bostian. Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin. J. Protein Chem., 1995, vol. 14 (8), 703-708 [0044] • James J. Schmidt et al. Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the SI' binding subsite. FEBS Lett., 1998, vol. 435 (1), 61-64 [0044] 604 • Shone et al. Eur. J. Biochem., 1993, vol. 217, 965-971 [0050] • Shinji Yamasaki et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinum neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem.f 1994, vol. 269 (17), 12764-12772 [0062] • F. Cornille et al. Solid-phase synthesis, conformational analysis and in vitro cleavage of synthetic human synaptobrevin II 1-93 by tetanus toxin L chain. Eur. J. Biochem., 1994, vol. 222 (1), 173-181 [0077] • Patrick Foran et al. Differences in the protease activities of tetanus and botulinum B toxins revealed by the cleavage of vesicle-associated membrane protein and various sized fragments. Biochemistry, 1994, vol. 33 (51), 15365-15374 [0077] • Ornella Rossetto et al. SNARE motif and neurotoxins.

Nature, 1994, vol. 372 (6505), 415-416 [0081] • Rossella Pellizzari et al. Structural determinants of the specificity for synaptic vesicle-associated membrane protein/synaptobrevin of tetanus and botulinum type B and G neurotoxins. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271 (34), 20353- 20358 [0081] • Rossella Pellizzari et al. The interaction of synaptic vesicle-associated membrane protein/synaptobrevin with botulinum neurotoxins D and F. FEBS Lett., 1997, vol. 409 (3), 339-342 [0081] • Philip Washbourne et al. Botulinum neurotoxin types A and E require the SNARE motif in SNAP-25 for proteolysis. FEBS Lett., 1997, vol. 418 (1-2), 1-5 [0081] 605 • Susana Gonzalo et al. SNAP-25 is targeted to the plasma membrane through a novel membrane-binding domain. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274 (30), 21313-21318 [0088] • Philip Washboume et al. Cysteine residues of SNAP-25 are required for SNARE disassembly and exocytosis, but not for membrane targeting. Biochem. J., 2001, vol. 357, 625-634 [0090]

• R. Bryan Sutton et al. Crystal structure of a SNARE

complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution. Nature, 1998, vol. 395 (6700), 347-353 [0091] • Jennifer Lippincott-Schwartz ; George H. Patterson.

Development and Use of Fluorescent Protein Markers in Living Cells. Science, 2003, vol. 300 (5616), 87-91 [0117] • Jin Zhang et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2002, vol. 3 (12), 906-918 [0117] • Oliver Griesbeck et al. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276 (31), 29188- 29194 [0129] • Takeharu Nagai et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol., 2002, vol. 20 (1), 87-90 [0129] • Jõrg Wiedenmann et al. A far-red fluorescent protein with fast maturation and reduced oligomerization tendency from Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria). Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 2002, vol. 99 (18), 11646-11651 [0132] • B. Albert Griffin et al. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science, 1998, vol. 281 (5374), 269-272 [0139] 606 • B. Albert Griffin et al. Fluorescent labeling of recombinant proteins in living cells with FlAsH. Methods Enzymol., 2000, vol. 327, 565-578 [0139] • Antje Keppler et al. A General Method for the Covalant Labelling of Fusion proteins with Small Molecules in vivo. Nat. Biotech, 2003, vol. 21 (1), 86-89 [0139] • Antje Keppler et al. Labeling of fusion proteins of 06- alkylguanine-DNA alkyltransferase with small molecules in vivo and in vitro. Methods, 2004, vol. 32 (4), 437-444 [0139] • Antje Keppler et al. Labeling of Fusion Proteins with Synthetic Fluorophores in Live Cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2004, vol. 101 (27), 9955-9959 [0139] • Neuroscience Protocols. Elsevier Science Publishers, 1993, 1-20 [0147] • Haugland. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Molecular Probes, Inc, 199 6 [0147] • Probing the Lateral Organization and Dynamics of Membranes. Wolf. Spectroscopic Membrane Probes. 1988, vol. I, 193-220 [0150] • Clegg. Curr. Opin. Biotech., 1995, vol. 6, 103-110 [0173] • Selvin. Nat. Struct. Biol., 2000, vol. 7, 730-734 [0173] • Fõrster. Ann. Physik, 1948, vol. 2, 55-75 [0175] • Epitope Tagging. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2001, vol. 3, 17.90-17.93 [0187] • Antibodies:ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 1998 [0187] • Edward Harlow ; Davld Lane. Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998 [0187] 607 • Noriko Yokosawa et al. Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines. Infect. Immun., 1989, vol. 57 (1), 272-277 [0192] [0206] • Noriko Yokosawa et al. Binding of botulinum type Cl, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes. Toxicon, 1991, vol. 29 (2), 261-264 [0192] • Tei-ichi Nishiki et al. Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269 (14), 10498-10503 [0192] • Atsushi Nishikawa et al. The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, vol. 319 (2), 327-333 [0192] • Yukako Fujinaga et al. Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes. Microbiology, 2004, vol. 150, 1529-1538 [0192] • A Fassio et al. Evidence for calcium-dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxin and botulinum toxin type F. Neuroscience, 1999, vol. 90 (3), 893-902 [0193] • Sara Stigliani et al. The sensitivity of catecholamine release to botulinum toxin Cl and E suggests selective targeting of vesicles set into the readily releasable pool. J. Neurochem., 2003, vol. 85 (2), 409-421 [0193] • Anton de Paiva et al. A role for the interchain disulfide or its participating thiols in the internalization of botulinum neurotoxin A revealed by a toxin derivative that binds to ecto-acceptors and inhibits transmitter release 608 intracellularly. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268 (28), 20838-20844 [0193] • GaryW.Lawrence et al. Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 25-kDa synaptosomal-associated protein (SNAP-25) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B. Eur. J. Biochem., 1996, vol. 236 (3), 877-886 [0193] • Patrick Foran et al. Botulinum neurotoxin Cl cleaves both syntaxin and SNAP-25 in intact and permeabilized chromaffin cells: correlation with its blockade of catecholamine release. Biochemistry, 1996, vol. 35 (8), 2630-2636 [0193] • Mary J. Welch et al. Sensitivity of embryonic rat dorsal root ganglia neurons to Clostridium botulinum neurotoxins. Toxicon, 2000, vol. 38 (2), 245 258 [0202] • Elaine A. Neale et al. Botulinum neurotoxin A blocks synaptic vesicle exocytosis but not endocytosis at the nerve terminal. J. Cell Biol., 1999, vol. 147 (6), 1249-1260 [0202] • John A. Chaddock et al. Inhibition of vesicular secretion in both neuronal and non-neuronal cells by a retargeted endopeptidase derivative of Clostridium botulinum neurotoxin type A. Infect. Immun., 2000, vol. 68 (5), 2587-2593 [0202] • Robert C. Seeger et al. Morphology, growth, chromosomal pattern and fibrinolytic activity of two new human neuroblastoma cell lines. Câncer Res., 1977, vol. 37 (5), 1364-1371 [0204] • G. J. West et al. Adrenergic, cholinergic, and inactive human neuroblastoma cell lines with the action-potential Na+ ionophore. Câncer Res., 1977, vol. 37 (5), 1372-1376 [0204] 609 • N. R. Cashman et al. Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons. Dev. Dyn., 1992, vol. 194 (3), 209-221 [0205] • Christopher J. Eggett et al. Development and characterization of a glutamate-sensitive motor neuronal cell line. J. Neurochem., 2000, vol. 74 (5), 1895-1902 [0205] • Doros Platika et al. Neuronal traits of clonal cell lines derived by fusion of dorsal root ganglia neurons with neuroblastoma cells. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1985, vol. 82 (10), 3499-3503 [0205] • Henry J. Lee et al. Neuronal properties and trophic activities of immortalized hippocampal cells from embryonic and young adult mice. J. Neurosci., 1990, vol. 10 (6), 1779-1787 [0205] • Noriko Yokosawa et al. Binding of botulinum type Cl, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes. Toxicon, 1991, vol. 29 (2), 261-264 [0206] • Ana M. Cardenas et al. Establishment and characterization of immortalized neuronal cell lines derived from the spinal cord of normal and trisomy 16 fetal mice, an animal model of Down syndrome. J. Neurosci. Res., 2002, vol. 68 (1), 46-58 [0207] • Ronghao U et al. Motoneuron differentiation of immortalized human spinal cord cell lines. J. Neurosci. Res., 2000, vol. 59 (3), 342-352 [0207] • Dinah W. Sah et al. Bipotent progenitor cell lines from the human CNS. Nat. Biotechnol., 1997, vol. 15 (6), 574-580 [0208] 610 • Ana M. Cardenas et al. Calcium signals in cell lines derived from the cerebral córtex of normal and trisomy 16 mice. Neuroreport, 1999, vol. 10 (2), 363-369 [0209] • David D. Allen et al. Impaired cholinergic function in cell lines derived from the cerebral córtex of normal and trisomy 16 mice. Eur. J. Neurosci., 2000, vol. 12 (9), 3259-3264 [0209] • David D. Allen et al. A dorsal root ganglia cell line derived from trisomy 16 fetal mice, a model for Down syndrome. Neuroreport, 2002, vol. 13 (4), 491-496 [0210] • K. Frederiksen et al. Immortalization of precursor cells from the mammalian CNS. Neuron, 1988, vol. 1 (6), 439-448 [0211] • John B. Davis ; Pamela Maher. Protein kinase C activation inhibits glutamate-induced cytotoxicity in a neuronal cell line. Brain Res., 1994, vol. 652 (1), 169-173 [0211] • Henry J. Lee et al. Neuronal Properties and Trophic Activities of Immortalized Hippocampal Cells from Embryonic and Young Adult Mice. J. Neurosci., 1990, vol. 19 (6), 1779-1787 [0211] • Henry J. Lee et al. Immortalized young adult neurons from the septal region: generation and characterization. Brain Res. Dev Brain Res., 1990, vol. 52 (1-2), 219-228 [0211] • Min Dong et al. SV2 Is the Protein Receptor for Botulinum Neurotoxin A. Science, 2006 [0214] • S. Mahrhold et al. The Synaptic Vesicle Protein 2C Mediates the Uptake of Botulinum Neurotoxin A into Phrenic Nerves. FEBS Lett., 2006, vol. 580 (8), 2011-2014 [0214] • Min Dong et al. Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxinBinto cells. J. Cell Biol., 2003, vol. 162 (7), 1293-1303 [0214] 611 • Andreas Rummel. Synaptotagmins I and II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G. J. Biol. Chem., 2004, vol. 279 (29), 30865-30870 [0214] • H. Barker et al. EURAGE Monoclonal Gammopathies III: Clinicai Significance and Basic Mechanisms. 1991, 155-158 [0221] • Masayoshi Namba et al. Establishment of five human myeloma cell lines. Vitro Cell Dev. Biol., 1989, 723-729 [0221] • Naozo Nakazawa et al. Interphase detection of t (4; 14) (pl6.3;q32.3) by in situ hybridization and FGFR3 over-expression in plasma cell malignancies. Câncer Genet. Cytogenet., 2000, vol. 117 (2), 89-96 [0221] • D. Ronchetti et al. Characterization of the t(4;14)(pl6.3;q32) in the KMS-18 multiple myeloma cell line. Leukemia, 2001, vol. 15 (5), 864-865 [0221] • Shuji Ozaki et al. Characterization of a novel interleukin-6 autocrine-dependent human plasma cell line. Leukemia, 1994, vol. 8 (12), 2207-2213 [0221] • Elizabeth E. Plowright et al. Ectopic expression of fibroblast growth factor receptor 3 promotes myeloma cell proliferation and prevents apoptosis. Blood, 2000, vol. 95 (3), 992-998 [0223] • Hiroyuki Onose et al. Over-expression of fibroblast growth factor receptor 3 in a human thyroid carcinoma cell line results in overgrowth of the confluent cultures. Eur. J. Endocrinol., 1999, vol. 140 (2), 169-173 [0223] • M. Kana et al. Signal transduction pathway of human fibroblast growth factor receptor 3. Identification of a novel 66-kDa phosphoprotein. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272 (10), 6621-6628 [0223] 612 • Janet E. Henderson et al. Expression of FGFR3 with the G380R achondroplasia mutation inhibits proliferation and maturation of CFK2 chondrocytic cells. J.BoneMiner. Res., 2000, vol. 15 (1), 155-165 [0223] • Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian cells. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2001, vol. 3 [0232] • Alessia Colosimo et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. Biotechniques, 2000, vol. 29 (2), 314-318320-322324 [0232] • Philip Washboume ; A. Kimberley McAllister. Techniques for gene transfer into neurons. Curr. Opin. Neurobiol., 2002, vol. 12 (5), 566-573 [0232] • Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 2000 [0232] • Martin Jordan ; Florian Worm. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods, 2004, vol. 33 (2), 136-143 [0233] • Chun Zhang et al. Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells. Methods, 2004, vol. 33 (2), 144-150 [0233] • Jeike E. Biewenga et al. Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique. J. Neurosci. Methods., 1997, vol. 71 (1), 67-75 [0234] • John 0'Brien ; Sarah C. R. Lummis. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods, 2004, vol. 33 (2), 121-125 [0234] • M. Golzio et al. In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression. Methods, 2004, vol. 33 (2), 126-135 [0234] 613 • Oliver Gresch et al. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods, 2004, vol. 33 (2), 151-163 [0234] • Armin Blesch. Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer. Methods, 2004, vol. 33 (2), 164-172 [0235] [0237] • Maurizio Federico. From lentiviruses to lentivirus vectors. Methods Mol. Biol., 2003, vol. 229, 3-15 [0235] • E. M. Poeschla. Non-primate lentiviral vectors. Curr. Opin. Mol. Ther., 2003, vol. 5 (5), 529-540 [0235] • Karim Benihoud et al. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr. Opin. Biotechnol., 1999, vol. 10 (5), 440- 447 [0235] • H. Bueler. Adeno-associated virai vectors for gene transfer and gene therapy. Biol. Chem., 1999, vol. 380 (6), 613-622 [0235] • Chooi M. Lai et al. Adenovirus and adeno-associated virus vectors. DNA Cell Biol., 2002, vol. 21 (12), 895-913 [0235] • Edward A. Burton et al. Gene delivery using herpes simplex virus vectors. DNA Cell Biol., 2002, vol. 21 (12), 915-936 [0235] • Paola Grandi et al. TargetingHSVamplicon vectors. Methods, 2004, vol. 33 (2), 179-186 [0235] • Ilya Frolov et al. Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1996, vol. 93 (21), 11371-11377 [0235] • Markus U. Ehrengruber. Alphaviral gene transfer in neurobiology. Brain Res. Buli., 2002, vol. 59 (1), 13-22 [0235] 614 • Thomas A. Kost ; J. Patrick Condreay. Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors. Trends Biotechnol., 2002, vol. 20 (4), 173-180 [0235] • A. Huser ; C. Hofmann. Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications. Am. J. Pharmacogenomics, 2003, vol. 3 (1) , 53-63 [0235] • WimT. J. M. C. Hermens et al. Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in theCNSand PNS. J. Neurosci. Methods, 1997, vol. 71 (1), 85-98 [0236] • Hiroyuki Mizuguchi et al. Approaches for generating recombinant adenovirus vectors. Adv. Drug Deliv. Rev., 2001, vol. 52 (3), 165-176 [0236] • Tiziana Tonini et al. Transient production of retroviral-and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells. Methods Mol. Biol, 2004, vol. 285, 141-148 [0237] • Félix Recillas-Targa. Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animais. Methods Mol. Biol., 2004, vol. 267, 417-433 [0237] • Roland Wolkowicz et al. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol., 2004, vol. 246, 391-411 [0237] • Luigi Naldini et al. In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector. Science, 1996, vol. 272 (5259), 263-267 [0237] • Steven R. Schwarze ; Steven F. Dowdy. In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA. Trends Pharmacol. Sei., 2000, vol. 21 (2), 45-48 [0244] 615 • Dara J. Dunican ; Patrick Doherty. Designing cell- permeant phosphopeptides to modulate intracellular signaling pathways. Biopolymers, 2001, vol. 60 (1), 45-60 [0244] • K. G. Ford et al. Protein transduction: an alternative to genetic intervention?. Gene Ther., 2001, vol. 8 (1), 1-4 [0244] • Alain Prochiantz. Messenger proteins: homeoproteins, TAT and others. Curr. Opin. Cell Biol., 2000, vol. 12 (4), 400-406 [0244] • J. J. Schwartz ; S. Zhang. Peptide-mediated cellular delivery. Curr. Opin. Mol. Ther., 2000, vol. 2 (2), 162-167 [0244] • Virginie Escriou et al. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, vol. 55 (2), 295-306 [0252] • CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. John Wiley & Sons, 2004 [0253] • PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH. Oxford University Press, 1999 [0255] • Joseph M. Fernandez ; James P. Hoeffler. GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION. Academic Press, 1999 [0255] • Meena Rai ; Harish Padh. Expression Systems for Production of Heterologous Proteins. CURRENT SCIENCE, 2001, vol. 80 (9), 1121-1128 [0255] • Ester Femandez-Salas et al. Plasma membrane localization signals in the light chain of botulinum neurotoxin. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 2004, vol. 101 i (9), 3208-3213 [0297] 616 • R. M. Horton et al. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension. Gene, 1989, vol. 77 (1), 61-68 [0300] • R. M. Horton. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol. Biotechnol., 1995, vol. 3 (2), 93-99 [0300] • Jane L. Halpern ; Elaine A. Neale. Neurospecific binding, internalization, and retrograde axonal transport. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1995, vol. 195, 221-241 [0339]

Lisboa, 3/08/2010

Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Célula isolada que compreende: a) um substrato de toxina de clostrídeo associado à membrana, em que o referido substrato compreende i) um primeiro componente de um par de transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET); ii) uma sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo que inclui um local de clivagem da toxina de clostrideo; e iii) um dominio de endereçamento membranar; b) um segundo componente, associado à membrana, de um par de FRET, em que o segundo componente do par de FRET é um corante lipofílico; e c) um receptor que se liga a uma toxina de clostrideo; em que a célula é sensível a intoxicação com toxina de clostrideo; em que o par de FRET compreende um aceitador que possui um espectro de absorvência que se sobrepõe ao espectro de emissão de um fluoróforo dador; e em que a transferência de energia de ressonância, em condições adequadas, ocorre entre o aceitador e o fluoróforo dador.

2. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula contém transitoriamente o substrato de toxina de clostrídeo.

3. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula contém estavelmente o substrato de toxina de clostrídeo. 2 4. 4. em que o partir de Célula de acordo com a reivindicação 1, substrato de toxina de clostrideo é expresso a uma molécula de ácido nucleico.

5. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula neuronal • 6. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula não neuronal. 7. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro componente do par de FRET é uma proteína fluorescente ou uma proteína que se liga a um fluoróforo. 8. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que 0 primeiro componente do par de FRET é o aceitador e o segundo componente do par de FRET é o fluoróforo dador.

9. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro componente do par de FRET é o fluoróforo dador e o segundo componente do par de FRET é o aceitador.

10. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende uma sequência de reconhecimento de BoNT/A que contém um local de clivagem de BoNT/A, uma sequência de reconhecimento de BoNT/B que contém um local de clivagem de BoNT/B, uma sequência de reconhecimento de BoNT/Cl que contém um local de clivagem de BoNT/Cl, uma sequência de reconhecimento de BoNT/D que contém um local de clivagem de BoNT/D, uma sequência de reconhecimento de BoNT/E que contém um local de clivagem de BoNT/E, uma sequência de reconhecimento de BoNT/F que contém um local de clivagem de BoNT/F, uma sequência de reconhecimento de BoNT/G que contém um local de clivagem de BoNT/G ou uma sequência de reconhecimento de TeNT que contém um local de clivagem de TeNT. 3

11. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, em que os seis resíduos consecutivos contêm Gln-Arg.

12. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis resíduos consecutivos contêm Gln-Phe.

13. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, em que os seis resíduos consecutivos contêm Arg-Ala.

14. Cél ula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de Sintaxina, em que os seis resíduos consecutivos contêm Lys-Ala.

15. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis resíduos consecutivos contêm Lys-Leu.

16. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de SNAP-25, em que os seis resíduos consecutivos contêm Arg-Ile.

17. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis resíduos consecutivos contêm Gln-Lys.

18. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de reconhecimento da toxina de clostrideo 4 compreende pelo menos seis resíduos consecutivos de VAMP, em que os seis resíduos consecutivos contêm Ala-Ala.

19. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor é um receptor endógeno da toxina de clostrídeo.

20. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor é um receptor exógeno de toxina de clostrídeo.

21. Processo para determinar a actividade da toxina de clostrídeo, o qual compreende: a) colocar uma célula de acordo com a reivindicação 1 em contacto com uma amostra; b) excitar o referido fluoróforo dador; c) detectar a transferência da energia de ressonância fluorescente da referida célula colocada em contacto; e d) comparar a transferência de energia de ressonância detectada a partir da célula colocada em contacto com a transferência de energia de ressonância detectada a partir de uma célula de controlo sujeita aos passos (b)-(c); em que a existência de uma diferença entre a transferência de energia de ressonância fluorescente da célula contactada, comparativamente com a célula de controlo, é um indicador da actividade da toxina de clostrídeo.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a amostra é um lisado celular bruto, uma toxina de clostrídeo bruta, uma toxina de clostrídeo parcialmente purificada, uma toxina de clostrídeo purificada ou um produto formulado de toxina de clostrídeo.

23. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a amostra compreende um produto formulado de toxina de clostrídeo. 5

24. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produto formulado de toxina de clostrideo é um produto formulado de BoNT/A.

25. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a amostra é um alimento cru, um alimento parcialmente cozinhado ou processado, um alimento cozinhado ou processado, uma bebida, um alimento animal, uma amostra de solo, uma amostra de água ou sedimentos de um reservatório. Lisboa, 3/08/2010 1/19 Excitação da protelna fluorescente Emissão de corante lipofilico

Emissão da proteína fluorescenteV Excitação corante lipofilico FIG* 1b. Sem emissão de corante lipofilico

Excitação da proteína fluorescente Hão há FRET Emissão de proteína fluorescente Sem excitação do corante lipofilico \ /

2/19 FIQ, 1α

Emissão de corante lipofílico Excitação de proteína fluorescente FIG. M Excitação do corante lipofílico

Sem emissão de proteína fluorescente

''^^Hão há FHET Emissão de corante lipofílico Sem excitação de proteína fluorescente FI6.2.

3/19

a «c 4/19 F!G, 3a, SNÂP-25 M-

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5/19 F1G. 4

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14/19 m. 13. Percentagem do sinal fluorescente (488 nm/610 nm) Percentagem de fluorescência (%)

a 4 8 s Tempo de carga do corante (horas) 15/19

IS Percentagem de fluorescência (%)

Tempo de carga do corante (horas) F1G* Octadscilrodamina id H ϋa <u ϋ nu u 0 3ϊί ϋ -B€u & 0 +ja ti ϋ M ϋ CM n I"

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Percentagem de fluorescência (¾) 2 Percentagem de fluorescência (%)

17/19 m 16. Curva CE» BoNT/E (24 hora)

18/19 FH3.17a. E xpos iç ão a B oHT/A (16 hora) 120 υ u ϋ H u o ai 3 cu H 4-1 7 100 < fl H u a <0 u n

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19/19 FIO, 18a. Exposição a BoNT/A (3 dia) 120*

PoNT/A] (nM) F!G. 18b. Curva CE de BoNT/ A (3 dia)