ES2345506T3 - Ensayos de fret a base de colorantes lipofilos para determinar la actividad de la toxina clostridial. - Google Patents

Abstract

Una célula aislada que comprende: a)un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana, comprendiendo dicho sustrato i)un primer miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET); ii)una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que incluye un sitio de escisión de Toxina Clostridial; y iii)un dominio de dirección de membrana; b)un segundo miembro asociado a membrana de un par de FRET, en el que el segundo par del miembro de FRET es un colorante lipófilo; y c)un receptor que se une a una Toxina Clostridial; en el que la célula es capaz de intoxicación por Toxina Clostridial; en el que el par de FRET comprende un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de un fluoróforo donante; y en el que en las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se muestra entre el aceptor y el fluoróforo donante.

Description

Ensayos de FRET a base de colorantes lipófilos para determinar la actividad de la toxina clostridial.

Todos los listados de secuencia del GenBank citados en esta solicitud, como identificados por sus números de acceso del GenBank, están disponibles a partir del Centro Nacional Para Información Biotecnológica.

Las propiedades miorrelajantes de las toxinas clostridiales (CoNTs) se están explotando en una amplia diversidad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, por ejemplo William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004). Por ejemplo, las terapias con CoNTs se proponen para tratamiento de distonía, véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Method for treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, Patente de Estados Unidos Nº 6.319.505 (20 de noviembre de 2001); dolor véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, Patente de Estados Unidos Nº 6.464.986 (15 de octubre de 2002); lesiones musculares, véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, Patente de Estados Unidos Nº 6.423.319 (23 de julio de 2002); enfermedades cardiovasculares, véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxins, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2003/0185860 (2 de octubre de 2003); trastornos neuropsiquiátricos, véase, por ejemplo, Steven Donovan, Therapeutic Treatrments for Neuropsychiatric Disorders, Patente de Estados Unidos Nº 2003/0211121 (13 de noviembre de 2003); dolor de la espalda inferior, véase por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0037852 (26 de febrero de 2004); así como otros trastornos neuromusculares, véase por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Multiple Botulinum Toxins for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2001/0021695 (13 de septiembre de 2001); Kei Roger Aoki, et al., Tratamiento of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2002/0010138 (24 de enero de 2002); Kei Roger Aoki, et al., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0013692 (22 de enero de 2004) todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Los usos propuestos adicionales de CoNTs como neuromoduladores biofarmacéuticos se ha ampliado hasta cubrir una amplia diversidad de tratamientos que se dirigen a ciertos trastornos que carecen de una base neuromuscular. Por ejemplo, los efectos sobre el sistema nervioso autónomo ha permitido el desarrollo de una terapia de serotipo A de toxina de Botulinum (BoNT/A) para tratar hiperhidrosis axilar o sudoración, y los informes indican que BoNT/A puede ser un tratamiento eficaz para el dolor y tensión miofacial, apoplejía, lesión traumática del cerebro, parálisis cerebral, trastornos de motilidad gastrointestinal, cáncer de incontinencia urinaria y dolores de cabeza de migraña. Por último, aplicaciones cosméticas y otras terapéuticas se conocen ampliamente. De hecho, el uso esperado de CoNTs en tratamientos tanto terapéuticos como cosméticos de seres humanos se previo para ampliar un intervalo siempre más amplio de enfermedades y alimentos que se pueden beneficiar de las propiedades miorrelajantes de estas toxinas.

El documento WO 2004/029576 desvela procedimientos basados en sustrato y células que usan un sustrato a base de FRET en los que los fluoróforos del donante y receptor están unidos a cualquier lado del sitio de escisión de la Toxina Clostridial.

Usando estos sustratos, el procedimiento desvelado basado en células puede detectar cantidades nM de toxina Clostridial. Además la optimización no mejoró ni la sensibilidad (CE_{50}) ni la señal al ruido. Por lo tanto se concluyó que este planteamiento no era capaz de detectar cantidades pM de toxina como se necesita para desarrollar un ensayo que pueda medir la actividad de BoNT/A en un vial de producto formulado.

El documento US 2006/0063222 desvela dos tipos de sustratos de toxina Clostridial. El primer tipo de sustrato comprende un único fluoróforo, un sitio de escisión de sustrato de Toxina Clostridial y un grupo voluminoso como una única molécula. El Segundo tipo de sustrato comprende un fluoróforo donante, un sitio de escisión del sustrato de la Toxina Clostridial y un aceptor como una única molécula. Los sustratos D2 deben tener tanto un fluoróforo como un grupo voluminoso. Ni el primer tipo de sustrato ni los procedimientos que usan este sustrato dependen de los principios de polarización de fluorescencia y no transferencia de energía de resonancia de Fluorescencia (FRET). Con relación al segundo tipo de sustrato, D2 no destruye la novedad de de los sustratos reivindicados actualmente debido a que deben tener dos fluoróforos.

El desarrollo del uso clínico y terapéutico de toxinas clostridiales necesita que la industria farmacéutica use ensayos precisos para determinar la actividad de la Toxina Clostridial con el fin de, por ejemplo, asegurar formulaciones farmacéuticas precisas y el control establecido de los patrones de control de calidad. Además, dado el potencial peligro asociado a las pequeñas cantidades de toxinas Clostridiales en productos alimenticios, la industria alimentaria requiere ensayos de Toxina Clostridial, por ejemplo, para validar nuevos procedimientos de envasado y para asegurar la seguridad de los alimentos. La presente invención proporciona ensayos de Toxina Clostridial novedosos para determinar la presencia o actividad de Toxina Clostridial útil para diversas industrias, tales como, por ejemplo, las industrias farmacéutica y alimentaria, así como ventajas asociadas.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 muestra un esquema de un ensayo FRET basado en colorantes lipófilos sobre líneas celulares que contiene un sustrato de Toxina Clostridial y un colorante lipófilo que se incorporan en las membranas celulares. Fig. 1a muestra un escenario de ensayo donde el sustrato de la Toxina Clostridial comprende el fluoróforo donante y se detecta la presencia de un sustrato de la Toxina Clostridial sin escindir. Tras la excitación, el donante de la proteína fluorescente emite luz fluorescente a una longitud de onda característica. Sin embargo, debido a que el sustrato sin escindir está localizado en la membrana, la proximidad cercana del donante de la proteína fluorescente y el aceptor del colorante lipófilo permite la transferencia de energía eficaz. La emisión de la proteína fluorescente excita el colorante lipófilo que a su vez emite luz fluorescente a su longitud de onda característica. La detección de las emisiones del colorante lipófilo es indicativa de FRET y la presencia de un sustrato de toxina Clostridial no escindido. Fig. 1b muestra un escenario de ensayo donde se detecta el sustrato de Toxina Clostridial que comprende el fluoróforo donante y la presencia de sustrato de toxina Clostridial escindido. Tras la excitación, el donante de proteína fluorescente emite luz fluorescente a una longitud de onda característica. Sin embargo, debido a que el producto de escisión de la proteína fluorescente del sustrato de Toxina Clostridial se libera en el citoplasma, la distancia entre el donante de proteína fluorescente y el aceptor del colorante lipófilo excede de la máxima distancia permitida para la transferencia de energía eficaz. De este modo, las emisiones de la proteína fluorescente no excitan el colorante lipófilo y FRET no se produce. Una disminución en las emisiones de colorante lipófilo es indicativo de una disminución de FRET, una disminución en el sustrato de Toxina Clostridial no escindido y, de manera inversa, un incremento en el sustrato de Toxina Clostridial escindido. Fig. 1c muestra un escenario de ensayo donde el colorante lipófilo que comprende el fluoróforo donante y la presencia de un sustrato de toxina Clostridial no escindido se detecta. Tras la excitación, el donante de colorante lipófilo emite luz fluorescente a una longitud de onda característica. Sin embargo, debido a que el sustrato de toxina Clostridial no escindido se localiza en la membrana, la proximidad cercana del donante de colorante lipófilo y el aceptor de la proteína fluorescente permite la transferencia de energía eficaz. La emisión del colorante lipófilo excita la proteína fluorescente que a su vez emite luz fluorescente a su longitud de onda característica. La detección de las emisiones de la proteína fluorescente es indicativo de of FRET y la presencia de un sustrato de Toxina Clostridial no escindido. Fig. 1d muestra un escenario de ensayo donde el colorante lipófilo que comprende el fluoróforo donante y la presencia de un sustrato de Toxina Clostridial escindido se detecta. Tras la excitación, el donante de colorante lipófilo emite luz fluorescente a una longitud de onda característica. Sin embargo, debido a que el producto de escisión de la proteína fluorescente del sustrato de Toxina Clostridial se libera en el citoplasma, la distancia entre el donante de colorante lipófilo y el aceptor de la proteína fluorescente excede de la distancia máxima permitida para la transferencia de energía eficaz. De este modo, las emisiones del colorante lipófilo no exciten la proteína fluorescente y FRET no se produce. Una disminución en las emisiones de la proteína fluorescente es indicativo de una disminución de FRET, una disminución en el sustrato de toxina Clostridial no escindido y, de manera inversa, un incremento en el sustrato de Toxina Clostridial escindido. Abreviaturas: FP, proteína fluorescente; COLORANTE, colorante
lipófilo.

Fig. 2 muestra un esquema del paradigma actual del mecanismo de intoxicación de la actividad de tétanos y toxina botulínica en la neurona central y periférica. Este proceso de intoxicación se puede describir por comprender cuatro etapas: 1) unión al receptor, donde la Toxina Clostridial se une a un sistema receptor Clostridial inicia el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, donde después de la unión a la toxina, una vesícula que contiene un complejo del sistema toxina/receptor está en endocitosis en la célula; 3) la translocación de la cadena ligera donde se cree que se producen episodios múltiples, incluyendo cambios en el pH interno de la vesícula, formación de un poro de canal que comprende el dominio HN de la cadena pesada de la Toxina Clostridial, separación de la cadena ligera de la Toxina Clostridial de la cadena pesada, activación enzimática de la cadena ligera; y liberación de la cadena ligera activada y 4) modificación de la diana enzimática, donde la cadena ligera activada de la Toxina Clostridial escinde proteolíticamente sus sustratos SNARE diana, tal como, por ejemplo, SNAP-25, VAMP o Sintaxina.

Fig. 3 muestra un esquema de proteínas SNARE. Fig. 3a muestra la organización del dominio general de SNAP-25, VAMP y Sintaxina que muestran localizaciones aproximadas de las regiones a-helicoidales (cajas blancas), motivos SNARE (cajas con trama con designaciones S1, S2, S3, S4, V1, V2, X1 o X2) y los dominios que se anclan a membrana (cajas blancas designadas MA). Fig. 3b muestra la organización helicoidal de un motivo SNARE.

Fig. 4 muestra un esquema de la localización subcelular y sitios de escisión de SNAP-25, VAMP y Sintaxina. VAMP se localiza en la membrana de la vesícula sináptica, mientras que SNAP-25 y Sintaxina están localizados en la membrana plasmática. BoNT/A y BoNT/E escinden SNAP-25 cerca del extremo carboxilo, que libera nueve o 26 restos, respectivamente. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G y TeNT actúan sobre la parte central conservada de VAMP (caja blanca) y liberan la mitad citosólica amino terminal de VAMP en el citosol. BoNT/C1 se escinde. SNAP-25 cerca del extremo carboxilo así como la escisión de la Sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica. La acción de BoNT/C1 da como resultado la liberación de una gran parte del dominio citosólico de Sintaxina, mientras sólo una pequeña parte de SNAP-25 se libera mediante la proteolisis selectiva de BoNT/C1.

Fig 5. muestra un mapa de plásmido de la construcción de expresión en mamíferos pOBI 25/SNAP-25_{206}-GFP que codifica un péptido de GFP carboxilo terminal unido de manera operativa al péptido SNAP-25 de la SEQ ID NO: 1. Las abreviaturas son como sigue: P_{CMV}, como una región promotora de citomegalovirus; HCBoNT/A, la composición de ácido nucleico que codifica el péptido SNAP-25 de la SEQ ID NO: 1; GFP, una región que codifica un péptido de la Proteína Fluorescente Verde; BGH pA, un sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina; Neomicina, una región que codifica un péptido de aminofosfotransferasa que confiere resistencia a Neomicina; pUC ori, un origen de pUC de la región de replicación de plásmido; Ampicilina, una región que codifica un péptido \beta-lactamasa que confiere resistencia a Ampicilina.

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Fig. 6 muestra células PC12 transfectadas con un plásmido que codifica una proteína fluorescente verde sola (GFP, transfectada con un plásmido que codifica un sustrato de Toxina Clostridial solo (GFP-SNAP25_{206}), o co-transfectada con un plásmido que codifica un sustrato de Toxina Clostridial solo (GFP-SNAP25_{206}) y un plásmido que codifica la cadena ligera de BoNT/A (BoNT/ALC). Las células que expresan proteína fluorescente verde sola (GFP) tenía fluorescencia dispersada a través de la célula que incluye los núcleos. Se tomaron fotografías cofocales con el plano en el medio de la célula. Las células que expresan el sustrato de Toxina Clostridial solo (GFP-SNAP25_{206}) demostró la fluorescencia en la membrana plasmática del cuerpo celular y neuritas. Las células que co-expresan el sustrato de Toxina Clostridial y la cadena ligera de BoNT/A (GFP-SNAP-25_{206}, BoNT/A-LC) muestran una pérdida de la localización de la membrana plasmática de la fluorescencia de GFP. La fluorescencia de GFP en cambio se acumula en algunas áreas del citoplasma.

Fig. 7 muestra análisis de transferencia Western que identifica células con captación de alta afinidad por una Toxina Clostridial. Fig. 7a muestra un análisis de transferencia Western usado para identificar las células capaces de captar BoNT/A. La mancha muestra cinco líneas de células tratadas con 1 nM de BoNT/A puro durante toda una noche, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de BoNT/A SNAP-25_{197}. Fig. 7b muestra análisis de transferencia Western usado para evaluar el tiempo necesario para la captación de BoNT/A. Las manchas muestran o bien células Neuro-2A o células SH-SY5Y tratadas con 1 nM de BoNT/A puro durante diversos momentos, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con anticuerpo que detecta el producto de escisión BoNT/A SNAP-25_{197}. Fig. 7c muestra un análisis de transferencia Western usado para evaluar el intervalo de concentración necesario de captación de BoNT/A. Las manchas muestran las células Neuro-2A tratadas con un intervalo de concentraciones de BoNT/A puro durante toda una noche, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con anticuerpo que detecta el producto de escisión BoNT/A SNAP-25_{197}.

Fig. 8 muestra análisis de transferencia Western que identifica células con captación de alta afinidad por una Toxina Clostridial. Fig. 8a muestra un análisis de transferencia Western usado para identificar células capaces de captar BoNT/E. La mancha superior muestra células Neuro-2A y células SH-SY5Y tratadas o bien con 10 nM o 100 nM de BoNT/E di-cadena durante toda una noche, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta el sustrato SNAP-25_{206} no escindido y el producto de escisión de BoNT/E SNAP-25_{180}. La mancha inferior muestra diversas células tratadas con 20 nM de BoNT/E di-cadena, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con un anticuerpo para el sustrato SNAP-25_{206} no escindido y el producto de escisión de BoNT/E SNAP-25_{180}. Fig. 8b muestra análisis de transferencia Western usado para determinar el curso del tiempo para captación de BoNT/E. Las manchas muestran células SH-SY5Y tratadas o bien con 5 nM o 20 nM de BoNT/E di-cadena durante o bien 4 horas u 8 horas, con cantidades iguales de proteína cargada por calle o sondada con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta el sustrato SNAP-25_{206} no escindido y el producto de escisión de BoNT/E SNAP-25_{180}. Fig. 8c muestra un análisis de transferencia Western usado para evaluar el intervalo de concentración necesario de captación de BoNT/E. Las manchas muestran células SK-N-DZ tratadas con un intervalo de concentraciones de BoNT/E di-cadena durante aproximadamente 6 horas, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta el sustrato no escindido de SNAP-25_{206} y el producto de escisión de BoNT/E SNAP-25_{180}.

Fig. 9 muestra análisis de transferencia Western que evalúa los efectos de tratamientos usados para incrementar la captación de Toxina Clostridial. Fig. 9a muestra un análisis de transferencia Western que evalúa los efectos de tratamiento de gangliósido sobre la captación de BoNT/A. La mancha muestra células Neuro-2A tratadas sin o con 25 \mug/ml de GT1b (- o +) y expuestas durante toda una noche a tres concentraciones de BoNT/A (12,5 pM, 25 pM o 50 pM), con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con un anticuerpo que detecta el BoNT/A SNAP-25_{197} producto de escisión. Fig. 9b muestra análisis de transferencia Western que evalúa los efectos de diferenciación de células sobre la captación de BoNT/A. Las manchas muestran o bien células Neuro-2A o células SH-SY5Y tratadas con 2 nM de BoNT/A Puro durante toda una noche que se desarrollaron o bien en medio sin suero o con diversos reactivos de diferenciación (lonomicina, db-cAMP, ácido Retinoico, Neuraminidasa o N2), con cantidades iguales de proteína cargada por calle sondada con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta el sustrato P-25_{206} no escindido y el producto de escisión de T/A SNAP-25_{197}.

Fig. 10 muestra análisis de transferencia Western que evalúa los efectos de tratamientos usados para incrementar la captación de Toxina Clostridial. Fig. 10a muestra un análisis de transferencia Western que evalúa los efectos de tratamiento por gangliósido sobre la captación de BoNT/E. La mancha muestra células Neuro-2A tratadas o bien con 25 \mug/ml de GT1 b, GQ1b, GD1a, GD1b o GD3 y expuestas durante aproximadamente 5 horas a 14 nM de BoNT/E di-cadena, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta sustrato no escindido de SNAP-25_{206} y el producto de escisión de BoNT/E SNAP-25_{180}. Fig. 10b muestra análisis de transferencia Western que evalúa los efectos de diferenciación de células en la captación de BoNT/E. Las manchas muestran o bien células N1 E-115, células SH-SY5Y, células SK-N-DZ o células NG108-15 tratadas con o bien 0 nM, 2 nM o 20 nM de BoNT/E di-cadena durante aproximadamente 6 horas que se desarrollaron en medio sin suero, con cantidades iguales de proteína cargada por calle y sondada con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) que detecta el sustrato no escindido SNAP-25_{206} y el producto de escisión BoNT/E SNAP-25_{180}.

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Fig. 11 muestra la detección of FRET en una línea celular Neuro-2A que expresa SNAP25_{206}-GFP y teñida con uno de los siguientes colorantes lipófilos: Dil Vibrant, DilC_{18}(3), DilC_{18}-DS, SP-DilC_{18}, 5-5'-Ph2DilC_{18} o DiD. Las placas se expusieron a un láser de 488 nm para excitación de la GFP de fluoróforo donante. Emisión se recogió con un ajuste de filtro de 610 nm\pm 30 nm para detectar la fluorescencia roja de los diversos aceptores de colorante lipófilo. El incremento de fluorescencia en las células que expresan SNAP25_{206}-GFP en comparación con los controles no transfectados se debió a la transferencia de energía desde GFP al aceptor del colorante lipófilo.

Fig. 12 muestra el efecto de tratamiento de BoNT/A en FRET entre SNAP25_{206}-GFP y un colorante lipófilo localizado en la membrana de las células Neuro-2A. Fig. 12a muestra placas donde las células se expusieron durante toda una noche a 0 nM BoNT/A (control, sin toxina) o 5 nM de BoNT/A, y cargadas durante horas con el colorante lipófilo indicado: sin control de colorante, Dil Vibrant, DilC_{18} (3), SP-DilC_{18}, 5-5'-Ph2DilC_{18} o DiD. Las placas se expusieron a láser de 488 nm en el formador de imágenes Amersham Typhoon 9140 para excitar el fluoróforo donante de GFP. Emisión se recogió con un ajuste de a 610 nm \pm 30 nm de manera que la fluorescencia roja de los diferentes colorantes lipófilos se detecta. Fig 12b muestra la fluorescencia detectada en cada pocillo cuantificada usando el software Typhoon 9140. Se midió la cantidad de emisión de fluorescencia a 610 nm después de la excitación 488 nm en volumen. Con el fin de normalizar los datos en cada combinación de colorante, se representaron los números de fluorescencia brutos a 610 nm como un porcentaje de la emisión de fluorescencia de las células control que contenían colorante lipófilo pero no se habían tratado con toxina y se leyeron a 610 nm para normalizar los datos en cada combinación de colorante.

Fig. 13 muestra la respuesta a la dosis de células Neuro-2A que expresan SNAP25_{206}-GFP para el colorante lipófilo DilC_{18} (3) tratadas con 1 nM BoNT/A. Las células se expusieron durante 6 horas a concentración diferente de DilC_{18} (3) que varía entre 0,5 \muM y 10 \muM como se indica. La Fluorescencia se cuantificó usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y emisión a 610 nm. Las mayores diferencias entre células control y tratadas se observaron con 1,25 \muM y 2,5 \muM de colorante cargado durante 6 horas.

Fig. 14 muestra la respuesta de dosis de células SH-SY5Y que expresan SNAP25_{206}-GFP al colorante lipófilo DilC_{18} (3) y el colorante de catión lipófilo octadecilrrodamina. Las células control y que expresan SNAP25_{206}-GFP se expusieron durante hasta seis horas hasta concentraciones de (14a) DilC_{18} (3) o (14b) octadecilrrodamina. Después de la excitación a 488 nm, la emisión de fluorescencia a 610 nm se detectó y se cuantificó usando el software Typhoon 9140.

Fig. 15 muestra la respuesta de dosis de células Neuro-2A diferenciadas que expresan SNAP25_{206}-GFP tratadas con BoNT/A a dosis que varía entre 0,05 nM y 20 nM y se midió en el ensayo FRET basado en colorante lipófilo. Fig. 15a muestra la pérdida de FRET expresada después de 16 horas la exposición de BoNT/A como porcentaje de fluorescencia medida a 610 nm de las células no tratadas con toxina teñidas con DilC_{18}(3). Fig. 15b muestra la pérdida de FRET expresada después de 3 días de exposición a BoNT/A como porcentaje de fluorescencia medido a 610 nm de las células no tratadas con toxina teñidas con DilC_{18}(3).

Fig. 16 muestra la respuesta de dosis de células SH-SY5Y diferenciadas que expresan SNAP25_{206}-GFP tratadas durante 24 horas con BoNT/E di-cadena a dosis que varían entre 0,005 nM y 200 nM y medida en el ensayo FRET basado en colorante lipófilo. La curva CE_{50} se calculó usando el software SigmaPlot/SigmaStat.

Fig. 17 muestra la respuesta de dosis de células Neuro-2A que expresan SNAP25_{206}-GFP tratadas durante toda una noche con BoNT/A usando placas de cultivo de tejido de color negro con fondos transparentes. Fig. 17a muestra la respuesta de dosis de células Neuro-2A que expresan SNAP25_{206}-GFP tratadas durante toda una noche con BoNT/A a dosis que varían entre 0,002 nM y 10 nM y medida en el ensayo FRET basado en colorante lipófilo. Fig. 17b muestra una curva CE_{50} calculada con los datos de Fig. 17a usando el software SigmaPlot/SigmaStat.

Fig. 18 muestra la respuesta de dosis de células Neuro-2A que expresan SNAP25206-GFP tratadas durante toda una noche con BoNT/A usando placas de cultivo de tejido de color negro con fondos transparentes. Fig. 18a muestra la respuesta de dosis de placas de cultivo de tejido de color negro con fondos transparentes Neuro 2A que expresan SNAP25_{206}-GFP tratadas durante tres días con BoNT/A a dosis que varía entre 0,002 nM y 10 nM y medida en el ensayo FRET basado en colorante lipófilo. Fig. 18b muestra una curva de CE_{50} calculada con los datos de Fig. 18a usando el software SigmaPlot/SigmaStat.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona ensayos novedosos para determinar la presencia o ausencia de una Toxina Clostridial activa en una muestra y para determinar la actividad de una Toxina Clostridial, incluyendo toxinas botulínicas de todos los serotipos y toxina de tétanos. Los ensayos de transferencia de energía de resonancia fluorescente basados en células novedosos de la invención depende de las células en las que un colorante lipófilo u otro aceptor está asociado a membrana, por ejemplo, asociado a la membrana plasmática. Los ensayos de células y los basados en células novedosos de la invención reducen la necesidad de estudios de toxicidad animal, incluso sirven para analizar las funciones de toxina múltiples, a saber, unión y captación celular de toxina, translocación en el citosol de la célula, y actividad de la proteasa. Como se desvela más adelante, las células y procedimientos novedosos de la invención se pueden usar para analizar muestras brutas y a granel así como toxinas di-cadena altamente purificadas y productos de toxinas formulados y además son capaces de formatos de ensayo de alto rendimiento automatizados.

Los ensayos de transferencia de energía de resonancia fluorescente basados en células de la invención dependen de células tales como células neuronales que son capaces de captar de manera eficaz la Toxina Clostridial y que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que contiene un donante o aceptor de FRET. El segundo componente de la pareja FRET, tal como un colorante lipófilo, está asociado de manera separada a membrana. Como un ejemplo, una célula útil en la invención puede expresar una proteína de fusión SNAP25_{206}-proteína fluorescente verde (GFP) (absorbancia 488 nm, emisión 520 nm), que se localiza en la membrana plasmática. FRET se produce entre el fluoróforo donante GFP y un aceptor del colorante lipófilo localizado en la membrana plasmática y que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de GFP y un espectro de emisión que se desplaza de manera adecuada desde el de GFP. Se observa la transferencia de energía entre GFP y el aceptor del colorante lipófilo, por ejemplo, como fluorescencia roja que representa la emisión del colorante lipófilo (véase la Fig. 1a). Tras el tratamiento de BoNT/A de las células que expresan SNAP25_{206}-GFP y se han teñido con un aceptor del colorante lipófilo apropiado tal como DilC_{18}(3), se observa la emisión de rojo a 610 nM. Después de la escisión del sustrato SNAP25_{206}-GFP, GFP se libera en el citoplasma celular. Tras la excitación del fluoróforo donante de GFP con un láser, GFP se excita y emite luz a 520 nM. Sin embargo, debido a que la transferencia de energía no se puede producir entre GFP citoplasmática y el colorante lipófilo localizado en la membrana plasmática, FRET no se produce, y se observa una disminución en la emisión de rojo a 610 nM (véase Fig. 1b).

Los aspectos de la presente invención proporcionan una célula aislada que comprende (a) un sustrato de toxina Clostridial asociado a membrana que comprende (i) un primer miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET); (ii) una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que incluye un sitio de escisión y (iii) un dominio de dirección de membrana, y (b) un segundo miembro asociado a membrana del par FRET en el que el segundo miembro del par FRET es un colorante lipófilo y (c) un receptor que se une a la Toxina Clostridial, en el que la célula es capaz de intoxicación por Toxina Clostridial; en el que el par FRET comprende un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de un fluoróforo donante; y en el que, en las condiciones apropiadas, transferencia de energía de resonancia se muestra entre el aceptor y el fluoróforo donante.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan una célula neuronal respectiva.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan un procedimiento de determinación de la actividad de la Toxina Clostridial que comprende (a) poner en contacto una célula como se ha descrito anteriormente con una muestra (b) que excita el fluoróforo donante; (c) detectar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula puesta en contacto con relación a una célula control sometida a las etapas (b)-(c), en el que una diferencia en transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de actividad de Toxina Clostridial.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan dicho procedimiento para determinar la actividad de
BoNT/A.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan dicho procedimiento para determinar la actividad de BoNT/E.

Las bacterias del género Clostridia son bacilos formadores de esporas estrictamente anaerobios a tolerantes al aire encontrados en el suelo, sedimentos de agua dulce y agua salada, polvo doméstico and, la superficie de alimentos, heces así como en la flora intestinal normal de seres humanos y animales. Mientras la mayoría de los aislamientos son gram-positivos, existen unas pocas especies gram-negativas. Los miembros de este género producen exotoxinas sofisticadas que están entre las toxinas más potentes conocidas en el mundo. La exposición a estas toxinas durante el curso de la infección por Clostridia es la causa primaria de patogénesis patológica subyacente. Clostridia son una amenaza principal para la salud de los seres humanos y animales, siendo responsables de muchas enfermedades que incluyen botulismo, tétanos, gangrena gaseosa, colitis pseudomembranosa y envenenamiento por alimentos. Por ejemplo, Clostridium argentinense, C. bifermentans, C. histolyticum, C. novyi, C. septicum, C. sporogenes y C. tertium son agentes etilógicos de la gangrena gaseosa. C. perfringens es responsable de enfermedad de origen alimentaria, enteritis necrótica donde C. difficile es responsable de enterocolitis pseudomembranosa. Tanto C. baratii como C. butyricum son agentes causantes de una forma de botulismo de origen alimentario, intestinal y de heridas. De manera interesante, solamente unas pocas especies de estas bacterias son patógenas para seres humanos, la mayoría son saprofitas. De este modo, en la mayoría de los casos, Clostridia son patógenos oportunistas que infectan un huésped cuya salud está comprometida.

De todos los Clostridia, Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen la mayoría de las toxinas biológicas potentes conocidas y son los agentes causantes de los síndromes neuroparalíticos botulismo y tétanos. Siete tipos antigénicamente distintos de Toxinas botulínicas (BoNTs) se han identificado mediante la investigación de brote de botulismo en hombre (BoNT/A, /B, /E y /F), animales (BoNT/C1 y /D), o aisladas del suelo (BoNT/G). BoNTs posee aproximadamente 35% de identidad de aminoácido entre sí y comparten la misma organización del dominio funcional y arquitectura estructura global. Las secuencias de aminoácidos de ocho serotipos de Toxina Clostridial se han derivado de los genes correspondientes (Niemann, "Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins" en Sourcebook of Bacterial Protein Toxins Alouf y Freer (Eds.) p. 303-348 Londres: Academic Press 1991). Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada tipo de Toxina Clostridial pueden existir diversas cepas que difieren en algo en su secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Mientras los siete serotipos BoNT tienen estructura y propiedades farmacéuticas similares, cada una también muestra características bacteriológicas heterogéneas. Por el contrario, la toxina de tétanos (TeNT) se produce mediante un grupo uniforme de C. tetani. Otras dos especies de Clostridia, C. baratii y C. butyricum, también producen toxinas similares a BoNT/F y BoNT/E, respectivamente.

Las toxinas de Clostridia (CoNT) cada una de ellas se traduce como un polipéptido de una única cadena de aproximadamente 150 kDa que posteriormente se escinde mediante escisión proteolítica dentro de un bucle disulfuro mediante proteasas bacterianas o tisulares. Este procesamiento después de la traducción produce una molécula di-cadena que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa mantenidas conjuntamente mediante un puente diisulfuro individual e interacciones no covalentes. Cada molécula di-cadena madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio enzimático localizado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad de endopeptidasa dependiente de cinc que dirige de manera específica componentes del núcleo del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad amino terminal de la HC (H_{N}) que facilita la liberación de la toxina de las vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión encontrado dentro de la mitad carboxilo-terminal de la HC (H_{C}) que determina la actividad de unión y especificidad de unión de la toxina al complejo receptor localizado en la superficie de la célula diana.

La unión, translocación y actividad enzimática de estos tres dominios funcionales son todos necesarios para la toxicidad. Aunque todos los detalles de este proceso no se conocen de manera precisa, el mecanismo global celular de intoxicación mediante el cual las CoNT entran en una neurona e inhiben la liberación del neurotransmisor es similar, independientemente del tipo. Aunque los solicitantes no tienen deseo de estar limitados por la siguiente descripción, el mecanismo de intoxicación se puede describir por comprender cuatro etapas: 1) unión del receptor, 2) internalización del complejo, 3) translocación de la cadena ligera, y 4) modificación de la diana enzimática (véase Fig. 2). El proceso se inicia cuando el dominio H_{C} de un CoNT se une al complejo receptor específico de CoNT localizado sobre la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. La especificidad de unión de un complejo receptor se cree que se ha logrado, en parte, mediante combinaciones específicas de gangliósidos y los receptores de proteína que aparecen distintamente comprenden cada uno complejo receptor de toxina Clostridial. Una vez unidos, los complejos CoNT/receptor, se internalizan mediante endocitosis y las vesículas internalizadas se separan a vías intracelulares específicas. La etapa de translocación parece desencadenarse mediante la acidificación del compartimiento de la vesícula. Este proceso parece iniciar dos transposiciones estructurales dependientes de pH importantes que aumentan la hidrofobicidad y promueven la activación enzimática de la toxina. Una vez logrado, la endopeptidasa de la cadena ligera de la toxina se libera de la vesícula intracelulares el citosol donde específicamente dirige uno de los tres componentes centrales conocidos del aparato de liberación del neurotransmisor. De estas proteínas centrales, la proteína de membrana asociada a vesícula (VAMP)/sinaptobrevina, la proteína asociada a sinaptosomas de 25 kDa (SNAP-25) y Sintaxina, son necesarias para la reducción de la vesícula sináptica y fusión al terminal nervioso y constituye miembros de la familia de receptor de proteínas solubles de unión al factor sensible a la N-etilmaleimida receptor de proteína soluble de unión a factor sensible a N-etilmaleimida (SNARE) (véase Fig. 3). La proteolisis selectiva de las SNARE sinápticas justifica el bloqueo total de liberación de neurotransmisor provocado por las Toxinas clostridiales in vivo. Las dianas de las proteínas SNARE de las Toxinas clostridiales son comunes a exocitosis en una diversidad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad de la peptidasa de la cadena ligera inhibe exocitosis, véase, por ejemplo, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitterr Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); M. Zouhair Atassi, Basic and Therapeutic Aspects of Botulinum and Tetanus Toxins, (Dirk W. Dressler y Joseph J. Jankovic eds., 2003); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003) que se incorporan en el presente documento por referencia.

TeNT y BoNT/B, /D, /F, y /G reconocen específicamente VAMP (también conocida como sinaptobrevina), una proteína integral de la membrana de la vesícula sináptica. VAMP se escinde en distintos enlaces dependiendo de la toxina. BoNT/A y /E reconocen y específicamente escinden SNAP-25, una proteína de la membrana presináptica, en dos sitios diferentes en la parte carboxilo terminal de la proteína. BoNT/C1 escinde la Sintaxina, una proteína del plasmalema neuronal, además de SNAP-25. Las tres dianas de proteína de CoNT se conservan de levaduras a seres humanos aunque los sitios de escisión y susceptibilidad de la toxina no se conservan necesariamente, véase más adelante; véase, también, por ejemplo, Humeau, supra, (2000); Heiner Niemann et al., Clostridial neurotoxins: new tools for dissecting exocitosis, 4(5) Trends Cell Biol. 179-185 (1994); and Rossella Pellizzari et al., Tetanus and botulinum neurotoxins: mechanism of action and therapeutic uses, 354(1381) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.259-268 (1999).

Las dianas naturales de las Toxinas clostridiales incluyen VAMP, SNAP-25, y Sintaxina. VAMP están asociadas con la membrana de la vesícula sináptica, mientras SNAP-25 y Sintaxina están asociadas con la membrana plasmática (véase Fig. 4). BoNT/A y BoNT/E escinden SNAP-25 en la región carboxilo terminal, liberando un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y BoNT/C1 también escinde SNAP-25 cerca del extremo carboxilo. Los serotipos botulínicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G, y toxina de tétanos, actúan sobre la parte central conservada de VAMP, y liberan la parte amino terminal de VAMP en el citosol. BoNT/C1 escinde la Sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica. De este modo, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT proteolisis da como resultado la liberación de una gran parte del dominio citosólico de VAMP o Sintaxina, mientras que solamente una pequeña parte de SNAP-25 está liberada por la escisión de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, véase, por ejemplo, Humeau et al., supra, (2000); Turton et al., supra, (2002); Lalli et al., supra (2003).

SNAP-25 de origen natural, una proteína de aproximadamente 206 restos que carecen de un segmento transmembrana, está asociada a la superficie citosólica del plasmalema neuronal (véase Fig. 4). SNAP-25 se requiere para el crecimiento axonal durante el desarrollo y se puede requerir para la plasticidad terminal de los nervios en el sistema nervioso maduro. SNAP-25 se ha aislado de una diversidad de especies de vertebrados e invertebrados incluyendo, por ejemplo, especies que pertenecen a los géneros Homo, Macaca, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Carassius, Danio, Torpedo, Xenopus, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea y Caenorhabditis. En los seres humanos, al menos dos isoformas se expresan de manera diferencial durante el desarrollo; la isoforma a se expresa de manera constitutiva durante el desarrollo fetal, mientras la isoforma b aparece en el nacimiento y predomina en la vida adulta. Los análogos SNAP-25 tales como SNAP-23 también se expresan fuera del sistema nervioso, por ejemplo, en células pancreáticas.

VAMP de origen natural es una proteína de aproximadamente 120 restos, dependiendo la longitud exacta de las especies e isoforma. Como se muestra en la Fig. 4, VAMP contiene un corto segmento carboxilo terminal dentro del lumen de la vesícula mientras la mayoría de la molécula se expone al citosol. Los treinta restos amino terminal ricos en prolina son divergentes entre las especies e isoformas mientras que la parte central de VAMP (restos 30 a 96), que es rica en restos cargados e hidrófilos e incluye sitios de escisión conocidos, está altamente conservada. VAMP se colocaliza con sinaptofisina sobre las membranas de la vesícula sináptica. VAMP se ha aislado de una diversidad de especies de vertebrados e invertebrados incluyendo, por ejemplo, especies que pertenecen a los géneros Homo, Macaca, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Danio, Torpedo, Xenopus, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea, Aplysia y Caenorhabditis. Además, múltiples isoformas de VAMP se han identificado incluyendo VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina, y forma no sensible a la escisión de toxina se han identificado en células no neuronales. VAMP parece que está presente en todos los tejidos de vertebrados aunque la distribución de VAMP-1 y VAMP-2 varía en tipos diferentes de células. VAMP-1 de pollo y rata no están escindidos por TeNT o BoNT/B. Estos ortólogos de VAMP-1 tienen una valina en lugar de la glutamina presente en VAMP-1 de seres humanos y de ratón en el sitio de escisión de TeNT o BoNT/B. La substitución no afecta BoNT/D, /F o /G, que escinden tanto VAMP-1 como VAMP-2 con tasas similares.

La Sintaxina de origen natural se localiza se localiza en la superficie citosólica del plasmalema neuronal y se ancla a membrana mediante un segmento carboxilo terminal, con la mayoría de la proteína expuesta al citosol (véase Fig. 4). La Sintaxina se colocaliza con los canales de calcio en las zonas activas de la membrana presináptica, donde tiene lugar la liberación del neurotransmisor. Además, la Sintaxina interactúa con sinaptotagmina, una proteína de la membrana de SSV que forma un puente funcional entre el plasmalema y las vesículas. La Sintaxina se ha aislado de una diversidad de especies de vertebrados e invertebrados incluyendo, por ejemplo, especies que pertenecen a los géneros Homo, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Danio, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea y Aplysia. Tres isoformas de longitud ligeramente diferente (285 y 288 restos) se han identificados en células nerviosas (isoformas 1A, 1B1 y 1B2), con isoformas 2, 3, 4 y 5 expresadas en otros tejidos. Las diferentes isoformas tienen sensibilidades que varían para BoNT/C1, con las isoformas 1A, 1B1, 1B2, 2 y 3 de Sintaxina escindidas por esta toxina.

Las composiciones y procedimientos de la presente memoria descriptiva proporcionan una célula aislada que comprende, en parte, un sustrato de Toxina Clostridial. Por definición, un sustrato de Toxina Clostridial es susceptible a escisión mediante al menos una toxina Clostridial en condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa de la Toxina Clostridial. Una diversidad de sustratos de Toxina Clostridial se desvela en el presente documento más adelante. Sustratos de Toxina Clostridial se desvelan en, por ejemplo, Lance E. Steward, et al., FRET Protease Assays for Clostridial Toxins, Solicitud de Patente de Estados Unidos 2003/0143651 (31 de julio de 2003); Lance E. Steward, et al., FRET Protease Assays for Botulinum Serotype A/E Toxins, Solicitud de Patente de Estados Unidos 2003/0143650 (31 de julio de 2003); y Ester Fernández-Salas, et al., Cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Assays for Clostridial Toxins, Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0072270 (15 de abril de
2004).

Los sustratos de Toxina Clostridial desvelados en la presente memoria descriptiva comprenden, en parte, una secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial que incluye Un sitio de escisión. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial" significa un enlace escindible con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para la proteolisis detectable en el enlace escindible por una Toxina Clostridial en condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa de la Toxina Clostridial. Una diversidad de secuencias de reconocimiento de la Toxina Clostridial se desvelan en el presente documento más adelante.

Los sustratos de Toxina Clostridial útiles en los aspectos de la invención incluyen péptidos y miméticos de péptidos así como sus formas derivatizadas de los mismos. Como se usa en el presente documento, el término "mimético de péptido" se usa en sentido amplio para significar una molécula de tipo péptido que se escinde por la misma Toxina Clostridial que el sustrato de péptido en la que se basa estructuralmente. Tales miméticos de péptidos incluyen péptidos modificados químicamente, moléculas de tipo péptido que contienen aminoácidos de origen no natural, y peptoides, que son moléculas de tipo péptido que se producen a partir de un ensamblaje oligomérico de glicinas N-sustituidas, y se escinden por la misma Toxina Clostridial que el sustrato de péptido del que se deriva el mimético de péptido, véase, por ejemplo, Goodman y Ro, Peptidemimetics for Drug Design, p. 803-861, en "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol. 1 (ed. M.E. Wolff; John Wiley y Sons 1995).

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Se conoce en la técnica una diversidad de miméticos de péptidos incluyendo, por ejemplo, moléculas de tipo péptido que contienen un aminoácido encogido, un componente de no péptido que imita la estructura secundaria del péptido, o un isóstero de enlace amida. Un mimético de péptido que contiene un aminoácido encogido, de origen no natural puede incluir, por ejemplo, un aminoácido \alpha-metiilado; un \alpha,\alpha-dialquil-glicina o ácido \alpha-aminocicloalcano carboxílico; un aminoácido N^{\alpha}-C^{\alpha}ciclado; un aminoácido N^{\alpha}-metilado; un ácido \beta- o \gamma-amino cicloalcano carboxílico; un \alpha,\beta-aminoácido no saturado; un \beta, \beta-dimetil o \beta-metil aminoácido; un \beta-sustituido-2,3-metano aminoácido; un NC^{\delta} o C^{\alpha}-C^{\delta} aminoácido ciclado; o una prolina sustituida u otro mimético de aminoácido. Además, un mimético de péptido que imita la estructura secundaria del péptido puede contener, por ejemplo, un mimético no péptido \beta-turn; mimético de \gamma-turn; mimético de estructura \beta-hoja; o mimético de estructura helicoidal, cada uno de los cuales se conoce bien en la técnica. Un mimético de péptido también puede ser una molécula de tipo péptido que contiene, por ejemplo, un isóstero de enlace amida tal como una modificación retro-inversa; enlace de amida reducido; enlace metilentioéter o enlace metilenesulfóxido; enlace metilen éter; enlace etileno; enlace tioamida; enlace trans-olefina o fluoroolefina; anillo tetrazol 1,5-disustituido; enlace cetometileno o fluorocetometileno u otro isóstero de amida. Los expertos en la técnica entienden que estos y otros miméticos de péptidos están comprendidos dentro del significado del término "mimético de péptido" como se usa en el presente documento.

En otras realizaciones, un sustrato de Toxina Clostridial útil en la invención es un péptido o mimético de péptido que tiene una longitud definida. Un sustrato de Toxina Clostridial puede ser, por ejemplo, un péptido o mimético de péptido que tiene al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350 o al menos 500 restos. En otras realizaciones, un sustrato de toxina Clostridial tiene como mucho 20 restos, como mucho 30 restos, como mucho 40 restos, como mucho 50 restos, como mucho 100 restos, como mucho 150 restos, como mucho 200 restos, como mucho 250 restos, como mucho 300 restos, como mucho 350 restos o como mucho 400 restos.

Una amplia diversidad de secuencias de reconocimiento de Toxina Clostridial es útil en aspectos de la invención. Sitios específicos y distintos de para diferentes Toxinas clostridiales se conocen bien en la técnica. BoNT/A escinde un enlace a Gln-Arg; BoNT/B y TeNT escinden un enlace Gln-Phe; BoNT/C1 escinde un enlace Lys-Ala o Arg-Ala; BoNT/D escinde un enlace Lys-Leu; BoNT/E escinde un enlace Arg-Ile; BoNT/F escinde un enlace Gln-Lys; y BoNT/G escinde un enlace Ala-Ala (véase Tabla 1). En una nomenclatura estándar, la secuencia circundante un sitio de escisión de Toxina Clostridial se designa P_{5}-P_{4}-P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}'-P_{4}'-P_{5}', con P_{1}-P_{1}' que representa en enlace escindible. Se entiende que un sitio P_{1} o P_{1}', o ambos, se pueden sustituir con otro aminoácido mimético de aminoácido en lugar del resto de origen natural. Como ejemplo, los sustratos BoNT/A se han preparado para que la posición P_{1} (Gln) se modifique para que sea una alanina, resto de ácido 2-aminobutírico de asparagina; estos sustratos se hidrolizaron mediante BoNT/A en el enlace P1-Arg, véase, por ejemplo, James J. Schmidt y Karen A Bostian, La actividad de la endoproteinasa de la neurotoxina A botulínica A: los requerimientos del sustrato y activación por albúmina sérica, 16 (1) J. proteína Chem. 19-26 (1997). Aunque se reconoce que las sustituciones se pueden introducir en la posición P_{1} del enlace escindible posición del enlace escindible, por ejemplo, un enlace escindible, un enlace escindible BoNT/A se reconoce además que la conservación del resto P_{1}' puede ser ventajosa, véase, por ejemplo, Vadakkanchery V. Vaidyanathan et al., Proteolysis of SNAP-25 isoforms by botulinum neurotoxin types A, C, and E: domains and amino acid restos controlling the formation of enzyme-sustrate complexes and cleavage, 72(1) J Neurochem. 327-337 (1999).

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De este modo, una realización, un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana comprende, en parte, una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que comprende un sitio de escisión. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende una secuencia de reconocimiento Toxina Clostridial en la que el resto P_{1}' no está modificado o sustituido con relación al resto de origen natural en una proteína diana escindida por la Toxina Clostridial. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende una secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial en la que es resto P_{1} está modificado o sustituido con relación al resto de origen natural en una proteína diana escindida por la Toxina Clostridial; tal como un sustrato de Toxina Clostridial mantiene la susceptibilidad a escisión de enlace de péptido péptido entre los restos P_{1} y P_{1}'. Cualquiera de una diversidad de secuencias de reconocimiento de la Toxina Clostridial son útiles en las células de la invención incluyendo, sin limitación, secuencias de reconocimiento de la toxina botulítica tales como las secuencias de reconocimiento BoNT/A, secuencias de reconocimiento de BoNT/B, secuencias de reconocimiento de BoNT/C1, secuencias de reconocimiento de BoNT/D, secuencias de reconocimiento SoNT/E, secuencias de reconocimiento de BoNT/F, secuencias de reconocimiento de BoNT/G y secuencias de reconocimiento TeNT.

Una diversidad de secuencias de reconocimiento de BoNT/A se conocen bien en la técnica y son útiles en la invención, véase, por ejemplo, Mark A. Breidenbach y Axel T. Brunger, Sustrate recognition strategy for botulinum neurotoxin serotype A, 432(7019) Nature 925-929 (2004). Una secuencia de reconocimiento de BoNT/A puede tener, por ejemplo, restos 46-206, restos 134 a 206, restos 137 a 206 ó 146-206 de SNAP-25 de tipo humano, véase, por ejemplo, Teresa A. Ekong et al., Recombinant SNAP-25 is an effective sustrate eficaz for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro, 143 (Pt 10) Microbiology 3337-3347 (1997); Clifford C. Shone et al., Toxin Assays, Patente de Estados Unidos Nº 5.982.637 (5 de octubre de 1999); y Vaidyanathan et al., supra, (1999). Una secuencia de reconocimiento de BoNT/A también puede incluir, sin limitación, la secuencia Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 105) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 190 a 202 de SNAP-25 de tipo humano; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 106) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 187 a 201 de SNAP-25 de tipo humano; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 107) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 187 a 202 de SNAP-25 de tipo humano; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 108) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 187 a 203 de SNAP-25 de tipo humano; Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 109) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 186 a 202 de SNAP-25 de tipo humano; o Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 110) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 186 a 203 de SNAP-25 de tipo humano. Véase, por ejemplo, James J. Schmidt y Karen A Bostian, Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin, 14(8) J. Protein Chem. 703-708 (1995); Schmidt y Bostian, supra, (1997); James J. Schmidt et al., Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite, 435(1) FEBS Lett. 61-64 (1998); y James J. Schmidt y Karen A Bostian, Assay for the proteolytic activity of serotype a from clostridium botulinum, Patente de Estados Unidos Nº 5.965.699 (12 de octubre de 1999).

Una secuencia de reconocimiento de BoNT/A útil en los aspectos de la invención puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a la escisión por el serotipo A de la toxina botulínica, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/A. Como se muestra en la Tabla 2, una diversidad de proteínas de origen natural sensibles a la escisión por BoNT/A se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, seres humanos, rata, ratón, Danio, Carassius, SNAP-25A y SNAP-25B; y Torpedo SNAP-25. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25A o SNAP-25B de tipo humano; SNAP-25A o SNAP-25B bovino; SNAP-25A o SNAP-25B de rata; SNAP-25A o SNAP-25B de ratón; SNAP-25A o SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Torpedo; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea; SNAP-25 de Aplysia, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a la escisión por BoNT/A. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos de SNAP-25 nativo escindidas por BoNT/A revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas (véase la Tabla 2), que indican que una diversidad de sustituciones de aminoácido y las modificaciones con relación a una secuencia SNAP-25 sensible a BoNT/A se puede tolerar en una secuencia de reconocimiento de BoNT/A útil en la invención. Se entiende que se puede preparar una secuencia de reconocimiento similar de BoNT/A, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma de SNAP-25 sensible a BoNT/A, parálogo u ortólogo, tal como, la secuencia de reconocimiento de BoNT/A contienen en las proteínas de SNAP-25 identificadas en los organismos enumerados anteriormente y en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Tabla 2 - Escisión de SNAP-25 y proteínas relacionadas. Primate: restos 163-206 de SNAP-25A de tipo humano de la SEQ ID NO: 1; restos 163-206 de SNAP-25B de tipo humano de la SEQ ID NO: 2; restos 169-211 de SNAP-23A de tipo humano de la SEQ ID NO: 3; restos 116-158 de SNAP-23B de tipo humano de la SEQ ID NO: 4; restos 163-206 de SNAP-25B de mono de la SEQ ID NO: 5; Roedor: restos 163-206 de SNAP-25A de rata de la SEQ ID NO: 6; restos 163-206 de SNAP-25B de rata de la SEQ ID NO: 7; restos 163-206 de SNAP-25A de ratón de la SEQ ID NO: 8; restos 168-210 de SNAP-23 de rata de la SEQ ID NO: 9; restos 168-210 de SNAP-23 de rata de la SEQ ID NO: 10; Ave: restos 163-206 de SNAP-25B de pollo de la SEQ ID NO: 11; Pez: restos 161-204 de SNAP-25A de carpa dorada de la SEQ ID NO: 12; restos 160-203 de SNAP-25B de carpa dorada de la SEQ ID NO: 13; restos 161-204 de SNAP-25A del pez cebra de la SEQ ID NO: 14; restos 160-203 de SNAP-25B del pez cebra de la SEQ ID NO: 15; restos 174-214 de SNAP-23 del pez cebra de la SEQ ID NO: 16; Raya: restos 170-210 de SNAP-25 de la raya eléctrica jaspeada de la SEQ ID NO: 17; Anfibio: restos 163-206 de SNAP-25A de rana de la SEQ ID NO: 18; restos 163-206 de SNAP-25B de rana de la SEQ ID NO: 19; restos 163-204 de SNAP-23 de rana de la SEQ ID NO:: 20; restos 169-212 de SNAP-25 de erizo de mar de la SEQ ID NO: 21; Insecto: restos 171-212 de SNAP-25 de la mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 22; restos 170-212 de SNAP-24 de la mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 23; Gusano segmentado: restos 170-212 de SNAP-25 de sanguijuela de la SEQ ID NO: 24; Cefalópodo: restos 245-267 de SNAP-25 de calamar de la SEQ ID NO: 25; Gasterópodo: restos 244-266 de SNAP-25 de caracol de agua de la SEQ ID NO: 26; Gusano redondo: restos 165-207 de SNAP-25 de gusano nematodo de la SEQ ID NO: 27.

Un sustrato de Toxina Clostridial, tal como un sustrato que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/A, puede tener una o múltiple modificación comparada con la secuencia de origen natural que se escinde por la toxina Clostridial correspondiente. Como ejemplo, comparada con un 17-mer correspondiente a los restos 187 a 203 de SNAP-25 de tipo humano, la substitución de Asp193 con Asn en el sustrato de BoNT/A dio como resultado una tasa relativa de proteolisis de 0,23; substitución de Glu194 con Gln dio como resultado una tasa relativa de 2,08; la substitución de Ala195 con ácido 2-aminobutírico dio como resultado una tasa relativa de 0,38; y la substitución de Gln197 con Asn, ácido 2-aminobutírico o Ala dio como resultado una tasa relativa de 0,66, 0,25, o 0,19, respectivamente (véase Tabla 3). Además, la substitución de Ala199 con ácido 2-aminobutírico dio como resultado una tasa relativa de 0,79; la substitución de Thr200 con Ser o ácido 2-aminobutírico dio como resultado una tasa relativa de 0,26 ó 1,20, respectivamente; la substitución de Lys201 con Ala dio como resultado una tasa relativa de 0,12; y la substitución de Met202 con Ala o norleucina dio como resultado una tasa relativa de 0,38 o 1,20, respectivamente, véase, por ejemplo, Schmidt y Bostian, supra, (1997). Estos resultados indican que una diversidad de restos puede estar sustituida en un sustrato de Toxina Clostridial cuando se compara con una secuencia sensible a la toxina de origen natural. En el caso de BoNT/A, estos resultados indican que los restos que incluyen pero no se limitan a Glu194, Ala195, Gln197, Ala199, Thr200 y Met202, Leu203, Gly204, Ser205, and Gly206, así como los restos más distales del enlace escindible Gln-Arg, pueden estar sustituidos o conjugados a fluoróforo, grupo voluminoso, fluoróforo donante o aceptor en un sustrato de BoNT/A útil en la invención. Tal sustrato de BoNT/A se proteoliza de manera detectable en el enlace escindible por BoNT/A en condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa de la Toxina Clostridial. De este modo, un sustrato de BoNT/A puede incluir, si se desea, una o varias sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, con relación a una secuencia de SNAP-25 de origen natural.

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De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato de BoNT/A asociado a membrana sustrato que comprende un primer miembro de un par FRET y una secuencia de reconocimiento BoNT/A que incluye un sitio de escisión. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de reconocimiento de toxina botulínica serotipo A" es un sinónimo de "secuencia de reconocimiento de BoNT/A" y significa un enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacente o no adyacente, o ambos, suficiente para la proteolisis detectable en el enlace escindible por un BoNT/A en condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa de la Toxina Clostridial. Un enlace escindible escindido por BoNT/A puede ser, por ejemplo, Gln-Arg.

En un aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/A que contiene al menos seis restos consecutivos de SNAP-25 incluyendo Gln-Arg. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A que comprende la secuencia de reconocimiento de BoNT/A Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 96). En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A que comprende una parte de SNAP-25 tal como, por ejemplo, restos 1 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 46 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 134 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 137 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 146 a 206 de la SEQ ID NO: 1, o su mimético de péptido. En todavía otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento BoNT/A que comprende la SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109. o SEQ ID NO: 110, o su mimético de péptido.

Se conocen bien en la técnica una diversidad de secuencias de reconocimiento de BoNT/B o se pueden definir mediante procedimientos de rutina. Tales secuencias de reconocimiento de BoNT/B pueden incluir, por ejemplo, una secuencia correspondiente a algo o todo el núcleo hidrófilo de una proteína de VAMP tal como una VAMP-1 de tipo humano o VAMP-2 de tipo humano. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/B puede incluir, sin limitación, restos 33 a 94, restos 45 a 94, restos 55 a 94, restos 60 a 94, restos 65 a 94, restos 60 a 88 o restos-65 a 88 de VAMP-2 de tipo humano (SEQ ID NO: 31), o restos 60 a 94 de VAMP-1-1 de tipo humano (SEQ ID NO: 28), VAMP-1-2 (SEQ ID NO: 29) y VAMP-1-3 (SEQ ID NO: 30) véase, por ejemplo, Shone et al., Eur. J. Biochem. 217: 965-971 (1993); y Shone et al., supra, (Oct: 5, 1999). Una secuencia de reconocimiento de BoNT/B también puede incluir, sin limitación, la secuencia Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Leu-Lys (SEQ ID NO: 124) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 60 a 94 de VAMP-2 de tipo humano, véase, por ejemplo, James J. Schmidt y Robert G. Stafford, High Throughput Assays for the Proteolytic Activities of Clostridial Neurotoxins, Patente de Estados Unidos Nº 6.762.280 (13 de julio de 2004) y la secuencia de reconocimiento de BoNT/B Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Cys-Lys (SEQ ID NO: 125) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 62 a 96 de VAMP-1 de tipo humano.

Una secuencia de reconocimiento de BoNT/B útil en los aspectos de la invención pueden corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a escisión por la toxina botulínica serotipo B, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/B. Como se muestra en Tabla 4, se conocen en la técnica una de origen natural sensibles a escisión por BoNT/B e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de tipo humano y de ratón; VAMP-2 de tipo bovino; VAMP-2 y VAMP-3 de rata; VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD y synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; y SNB1 de Caenorhabditis. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de tipo humano; VAMP-2 de tipo bovino; VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD o synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a la escisión por BoNT/B. Además, como se muestra en Tabla 4, comparación de las secuencias de aminoácidos de VAMP escindidas por BoNT/B revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas, indicando que una diversidad de sustituciones de aminoácidos y modificaciones relativas a la secuencia de VAMP de origen natural se puede tolerar en un sustrato de BoNT/B de la invención. Se entiende que se puede preparar una secuencia de reconocimiento de BoNT/B similar si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/B, parálogo u ortólogo, tal como, la secuencia de reconocimiento de BoNT/B contienen en las proteínas de VAMP-1 y VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 4.

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Tabla 4 - Escisión de VAMP y proteínas relacionadas. Primate: restos 49-92 de VAMP-1-1 de la SEQ ID NO: 28 de tipo humano; restos 49-92 de VAMP-1-2 de la SEQ ID NO: 29 de tipo humano; restos 49-92 de VAMP-1-3 de la SEQ ID NO: 30 de tipo humano; restos 47-90 de VAMP-2 de la SEQ ID NO: 32 de mono; restos 30-73 de VAMP-2/celubrevina de la SEQ ID NO: 33 de tipo humano; bovino: restos 47-90 de VAMP-2 de la SEQ ID NO: 34 de vaca; Roedor: restos 49-92 de VAMP-1 de la SEQ ID NO: 35 de rata; restos 49-92 de VAMP-1-b de la SEQ ID NO: 36 de rata; restos 49-92 de VAMP-1 de la SEQ ID NO: 37 de ratón; restos 47-90 de VAMP-2 de la SEQ ID NO: 38 de rata; restos 47-90 de VAMP-2-b de la SEQ ID NO: 39 de rata; restos 47-90 de VAMP-2 de la SEQ ID NO: 40 de ratón; restos 34-77 de VAMP-3/celubrevina de la SEQ ID NO: 41 de rata; restos 34-77 de VAMP-3/celubrevina restos 34-77 de la SEQ ID NO: 42 de ratón; Ave: restos 190-233 de VAMP-1 de la SEQ ID NO: 43 de pollo; restos 47-88 de VAMP-2 de la SEQ ID NO: 44 de pollo; restos 34-77 de VAMP-3/celubrevina de la SEQ ID NO: 45 de pollo; Pez: restos 50-93 de VAMP-1 de la SEQ ID NO: 46 de pez cebra; restos 41-84 de VAMP-2 de la SEQ ID NO: 47 de pez cebra; restos 33-60 de VAMP-3 de la SEQ ID NO: 48 de pez cebra; Raya: restos 51-94 de VAMP-1 de la SEQ ID NO: 49 de raya eléctrica jaspeada; Anfibio: restos 45-88 de VAMP-2 de la SEQ ID NO: 50 de rana; restos 32-75 de VAMP-3 de la SEQ ID NO: 51 de rana; restos 31-74 de VAMP la SEQ ID NO: 52 de erizo de mar; Insecto: restos 40-83 de SynA1 de la SEQ ID NO: 53 de mosca de la fruta; restos 63-106 de SynA2 de la SEQ ID NO: 54 de mosca de la fruta; restos 63-106 de SynB1 de la SEQ ID NO: 55 de mosca de la fruta; restos 63-106 de SynB2 de la SEQ ID NO: 56 de mosca de la fruta; restos 57-100 de SynC de la SEQ ID NO: 57 de mosca de la fruta; restos 66-109 de SynD de la SEQ ID NO: 58 de mosca de la fruta; restos 57-100 de SynE de la SEQ ID NO: 59 de mosca de la fruta; Gusano segmentado: restos 45-88 de VAMP de la SEQ ID NO: 60 de sanguijuela; Cefalópodo: restos 56-99 de VAMP de la SEQ ID NO: 61 de calamar; Gasterópodo: restos 49-92 de VAMP de la SEQ ID NO: 62 de caracol de agua dulce; restos 37-80 de VAMP de la SEQ ID NO: 63 de liebre marina; Gusano redondo: restos 72-115 de SNB1 de la SEQ ID NO: 64 de gusano nematodo; resto 82-115 de tipo SNB de la SEQ ID NO: 65 de gusano nematodo.

De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato de BoNT/B asociado a membrana que comprende un primer miembro de un par de FRET y una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que incluye un sitio de escisión. Como se usa en el presente documento, en término "secuencia de reconocimiento de la toxina botulínica serotipo B" es sinónimo de "BoNT/B secuencia de reconocimiento" y significa un enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para la proteolisis detectable en el enlace escindible por un BoNT/B en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/B puede ser, por ejemplo, Gln-Phe.

En un aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que contiene al menos seis restos consecutivos de VAMP incluyendo Gln-Phe. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que comprende la secuencia de reconocimiento de BoNT/B Gly-Ala-Ser-Gin-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 97). En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que comprende una parte de VAMP-1-1 tal como, por ejemplo, restos 1 a 118 de la SEQ ID NO: 28; restos 62 a 96 de la SEQ ID NO: 28, o su mimético de péptido. en otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que comprende una parte de VAMP-1-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 117 de la SEQ ID NO: 29; restos 62 a 96 de la SEQ ID NO: 29, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que comprende una parte de VAMP-1-3 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 30; restos 62 a 96 de la SEQ ID NO: 30, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que comprende una parte de VAMP-2 tal como, por ejemplo, restos 1 to 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 33 a 94 de la SEQ ID NO: 31; restos 45 a 94 de la SEQ ID NO: 31; restos 55 a 94 de la SEQ ID NO: 31; restos 60 a 94 de la SEQ ID NO: 31; restos 65 a 94 de la SEQ ID NO: 31; restos 60 a 88 de la SEQ ID NO: 31; restos 65 a 88 de la SEQ ID NO: 31, o su mimético de péptido.

Se entiende que una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a la escisión por toxina botulínica serotipo C1, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/C1. Como se muestra además en la Tabla 5, una diversidad de proteínas de origen natural sensible a escisión por BoNT/C1 se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, Sintaxina 1 A, Sintaxina 1B1 y Sintaxina 1B2 de tipo humano y de ratón; Sintaxina 1A y Sintaxina 1B2 de tipo bovino y de rata; Sintaxina 2 y Rat sintaxina 3 y de rata; Sintaxina de Strongylocentrotus; Sintaxina 1A de Drosophila; Sintaxina 1A de Hirudo; Sintaxina 1A de Loligo; Sintaxina 1 A de Aplysia. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de Sintaxina 1A, Sintaxina 1B1, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2-1, Sintaxina 2-2, Sintaxina 2-3 o Sintaxina 3A de tipo humano; Sintaxina 1A, Sintaxina 1B1 o Sintaxina 1B2 de tipo bovino; Sintaxina 1A, Sintaxina 1B1, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2 o Sintaxina 3A de rata; Sintaxina 1A, Sintaxina 1B1, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2, Sintaxina 3A, Sintaxina 3B o Sintaxina 3C de ratón; Sintaxina 1A o Sintaxina 2 de pollo; Sintaxina 1A o Sintaxina 1B de Xenopus; Sintaxina 1A, Sintaxina 1B o Sintaxina 3 de Danio; Sintaxina 1A o Sintaxina 1B de Torpedo; Sintaxina 1A o Sintaxina 1B de Strongylocentrotus; Sintaxina 1A o Sintaxina 1B de Drosophila; Sintaxina 1A o Sintaxina 1B de Hirudo; Sintaxina 1A o Sintaxina 1B de Loligo; Sintaxina 1A o Sintaxina 1B de Lymnaea, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/C1. Además, comparación de secuencia de aminoácidos de sintaxina nativa escindida por BoNT/C1 revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas (véase la Tabla 5), que indica que una diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácido y con relación a una secuencia de sintaxina sensible a BoNT/C1 de origen natural se puede tolerar en un sustrato de BoNT/C1 útil en la invención. Se entiende que una secuencia de reconocimiento similar de BoNT/C1 se puede preparar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma de sintaxina sensible a BoNT/C1, parálogo u ortólogo, tal como, la secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 contenida en las proteínas de sintaxina identificada en los organismos enumerados anteriormente y en la Tabla 5.

Tabla 5 - Escisión de Sintaxina y proteínas relacionadas. Primate: restos 242-264 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 66 de tipo humano; restos 241-263 de Sintaxina 1B1 de la SEQ ID NO: 67 de tipo humano; restos 241-263 de Sintaxina 1B2 de la SEQ ID NO: 68 de tipo humano; restos 241-263 de Sintaxina 2-1 de la SEQ ID NO: 69 de tipo humano; restos 241-263 de Sintaxina2-2 de la SEQ ID NO: 70 de tipo humano; restos 241-263 de Sintaxina2-3 restos 241-263 de la SEQ ID NO: 71 de tipo humano; restos 241-263 de Sintaxina 3 de la SEQ ID NO: 72 de tipo humano; Bovino: restos 242-264 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 73 de tipo vaca; restos 241-263 de Sintaxina 1B2 de la SEQ ID NO: 74 de vaca; Roedor; restos 242-264 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 75 de rata; restos-241-263 de Sintaxina 1B2 de la SEQ ID NO: 76 de rata; restos 242-264 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 77 de ratón; restos 241-263 de Sintaxina 1B1 de la SEQ ID NO: 78 de ratón; restos 241-263 de Sintaxina 1B2 de la SEQ ID NO: 79 de ratón; restos 243-265 de Sintaxina 2 de la SEQ ID NO: 80 de rata; Sintaxina2 restos 242-264 de la SEQ ID NO: 81 de ratón; restos 241-263 de Sintaxina 3A de la SEQ ID NO: 82 de rata; restos 241-263 de Sintaxina 3A de la SEQ ID NO: 83 de ratón; restos 241-263 de Sintaxina 3B de la SEQ ID NO: 84 de ratón; restos 223-245 de Sintaxina 3C de la SEQ ID NO: 85 de ratón; Ave: restos 235-257 de Sintaxina 1B de la SEQ ID NO: 86 de pollo; restos 240-262 de Sintaxina2 de la SEQ ID NO: 87 de pollo; Pez: restos 241-263 de Sintaxina 1B de la SEQ ID NO: 88 de pez cebra; restos 239-261 de Sintaxina3 de la SEQ ID NO: 89 pez cebra; restos 241-263 de Sintaxina 1B de la SEQ ID NO: 90 de erizo de mar; Insecto: restos 245-267 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 91 de mosca de la fruta; Gusano segmentado: restos 248-270 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 92 de sanguijuela; Cefalópodo: restos 245-267 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 93 de calamar; Gasterópodo: restos 244-266 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 94 de caracol de agua dulce; restos 244-266 de Sintaxina 1A de la SEQ ID NO: 95 de liebre marina.

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Como además se muestra en la Tabla 2, una diversidad de proteínas de origen natural sensibles a escisión por BoNT/C1 se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, SNAP-25A y SNAP-25B de tipo humano, de rata, de ratón, de Danio, de Carassius; y SNAP-25 de Drosophila. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25A o SNAP-25B de tipo humano; SNAP-25A o SNAP-258 de tipo bovino; SNAP-25A o SNAP-25B de rata; SNAP-25A o SNAP-25B de ratón; SNAP-25A o SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 Torpedo; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-25 o SNAP-24 de Drosophila; SNAP-25 de Hirudo; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/C1. Como se ha descrito anteriormente con respecto a las variantes de secuencias de sintaxina de origen natural, comparación de secuencia de aminoácidos de SNAP-25 nativa escindida por BoNT/C1 revela una variabilidad de secuencia significativa (Tabla 2), que indica que una diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácido con relación una secuencia de SNAP-25 de origen natural sensible a BoNT/C1 se pueden tolerar en sustrato de BoNT/C1 útil en la invención. Se entiende que se puede preparar una secuencia de reconocimiento similar de BoNT/C1, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma, parálogo u ortólogo de SNAP-25 sensible a BoNT/C1, tal como, la secuencia de reconocimiento BoNT/A contenida en las proteínas de SNAP-25 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 2.

De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato de BoNT/C1 asociado a membrana que comprende a un primer miembro de un par de FRET y una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que incluye un sitio de escisión. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de reconocimiento de la toxina botulínica serotipo C1" es un sinónimo de "secuencia de reconocimiento de BoNT/C1" y significa un enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para detectar proteolisis en el enlace escindible por un BoNT/C1 en condiciones apropiadas. Un enlace escindible por BoNT/C1 puede ser, por ejemplo, Lys-Ala o Arg-Ala.

En un aspecto de esta realización, el Sustrato de Toxina Clostridial codificado incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que contiene al menos seis restos consecutivos de Sintaxina incluyendo Lys-Ala. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende la secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 98). En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una Secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que contiene al menos seis restos consecutivos de SNAP-25 incluyendo Arg-Ala. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende la secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 99). En todavía otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que contiene al menos seis restos consecutivos de Sintaxina incluyendo Lys-Ala y una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que contiene al menos seis restos consecutivos de SNAP-25 incluyendo Arg-Ala.

En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-1A tal como, por ejemplo, restos 1 a 288 de la SEQ ID NO: 66, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-1B1 tal como, por ejemplo, restos 1 a 288 de la SEQ ID NO: 67, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-1 B2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 288 de la SEQ ID NO: 68, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina 2-1 tal como, por ejemplo, restos 1 a 287 de la SEQ ID NO: 69, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-2-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 288 de la SEQ ID NO: 70, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-2-3 tal como, por ejemplo, restos 1 a 289 de la SEQ ID NO: 71, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-3A tal como, por ejemplo, restos 1 a 289 de la SEQ ID NO: 83, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-3B tal como, por ejemplo, restos 1 a 283 de la SEQ ID NO: 84, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de Sintaxina-3C tal como, por ejemplo, restos 1 a 269 de la SEQ ID NO: 85, o su mimético de péptido.

En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 que comprende una parte de SNAP-25 tal como, por ejemplo, restos 1 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 93 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 134 to 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 137 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 146 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 137 a 202 de la SEQ ID NO: 1, o su mimético de péptido. En todavía otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento

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de BoNT/C1 que comprende SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, o SEQ ID NO: 110, o su mimético de péptido.

Una diversidad de secuencias de reconocimiento de BoNT/D son bien conocidas en la técnica o se pueden definir mediante procedimientos de rutina. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/D puede incluir, por ejemplo, restos 27 a 116; restos 37 a 116; restos 1 a 86; restos 1 a 76; o restos 1 a 69 de VAMP-2 de rata, véase, por ejemplo, Shinji Yamasaki et al., Clevage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinum neurotoxins and tetanus toxin, 269 (17) J. Biol. Chem. 12764-12772 (1994). De este modo, una Secuencia de reconocimiento de BoNT/D puede incluir, por ejemplo, restos 27 a 69 o restos 37 a 69 de VAMP-2 de rata. Una Secuencia de reconocimiento de BoNT/D también pueden incluir, sin limitación, la secuencia Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gin-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 126) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 37 a 75 de VAMP-2 de tipo humano, véase, por ejemplo, Schmidt y Stafford, supra, (13 de julio de 2004) y la Secuencia de reconocimiento de BoNT/D Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 127) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 39 a 77 de las isoformas de VAMP-1, VAMP-1-1, VAMP-1-2 y VAMP-1-3 de tipo humano.

Una Secuencia de reconocimiento de BoNT/D puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a escisión por la toxina botulínica serotipo D, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/D. Como se muestra en la Tabla 4, una diversidad de proteínas de origen natural sensible a escisión por BoNT/D se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de tipo humano, de rata y de ratón; VAMP-2 bovino; VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD, synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; Loligo VAMP; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; y SNB1 de Caenorhabditis. De este modo, una Secuencia de reconocimiento de BoNT/D puede corresponder, por ejemplo, un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de tipo humano; VAMP-2 bovino; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD, synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a la escisión por BoNT/D. Además, como se muestra en la Tabla 4 anterior, la comparación de la secuencia de aminoácidos de VAMP nativa escindida por BoNT/D revela una variabilidad de secuencia significativa, indicando que una diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia de VAMP de origen natural sensible a BoNT/D se puede tolerar en un sustrato de BoNT/D útil en la invención. Se entiende que una Secuencia de reconocimiento de BoNT/D similar se puede preparar, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/D, tal como, la Secuencia de reconocimiento de BoNT/B contenida en las proteínas de VAMP-1 y VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 4.

De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato asociado a membrana de BoNT/D que comprende un primer miembro de par de FRET y una Secuencia de reconocimiento de BoNT/D incluyendo un sitio de escisión. El término "secuencia de reconocimiento toxina botulínica serotipo D" es un sinónimo de "Secuencia de reconocimiento de BoNT/D" y significa a enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para detectar proteolisis en el enlace escindible por un BoNT/D en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/D puede ser, por ejemplo, Lys-Leu.

En un aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que contiene al menos seis restos consecutivos de VAMP incluyendo Lys-Leu. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que comprende la Secuencia de reconocimiento de BoNT/D Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (SEQ ID NO: 100). En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que comprende una parte de VAMP-1-1 tal como, por ejemplo, restos 1 a 118 de la SEQ ID NO: 28; restos 39 a 77 de la SEQ ID NO: 28, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que comprende una parte de VAMP-1-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 117 de la SEQ ID NO: 29; restos 39 a 77 de la SEQ ID NO: 29, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que comprende una parte de VAMP-1-3 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 30; restos 39 a 77 de la SEQ ID NO: 30, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el Sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que comprende una parte de VAMP-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 1 a 86 de la SEQ ID NO: 31; restos 1 a 76 de la SEQ ID NO: 31; restos 1 a 69 de la SEQ ID NO: 31; restos 27 a 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 37 a 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 27 a 68 de la SEQ ID NO: 31; restos 37 a 69 de la SEQ ID NO: 31, o su mimético de péptido.

Los expertos en la técnica aprecian que una secuencia de reconocimiento de BoNT/E puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a la escisión por toxina botulínica serotipo E, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/E. Una Secuencia de reconocimiento de BoNT/E puede tener, por ejemplo, restos 46-206, restos 92 a 206, restos 134 a 206, restos, 137 a 206; 146-206 ó 156-206 de SNAP-25 de tipo humano, véase, por ejemplo, Vaidyanathan et al., supra, (1999); and Schmidt y Stafford, supra,
(13 de julio de 2004).

Una Secuencia de reconocimiento de BoNT/E útil en los aspectos de la invención puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a la escisión por toxina botulínica serotipo E, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/E. Como se muestra en la Tabla 2, una diversidad de proteínas de origen natural sensible a escisión por BoNT/E se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, SNAP-25A y SNAP-25B de tipo humano, de pollo de Danio, Carassius; SNAP-25A, SNAP-25B y SNAP-23 de rata y de ratón; y SNAP-25 de Caenorhabditis. De este modo, una Secuencia de reconocimiento de BoNT/E puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25A o SNAP-25B de tipo humano o; SNAP-25A o SNAP-25B bovino; SNAP-25A, SNAP-25B o SNAP-23 de rata; SNAP-25A, SNAP-25B o SNAP-23 de ratón; SNAP-25A o SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-24 de Drosophila; SNAP-25 de Hirudo; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea; SNAP-25 de Caenorhabditis, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/C1. Además, como se muestra en Tabla 2, la comparación de la secuencia de aminoácidos de SNAP-23 y SNAP-25 nativa escindida por BoNT/E revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas, indicando que una diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia de SNAP-23 o SNAP-25 de origen natural sensible a BoNT/E se puede tolerar en un sustrato de BoNT/E útil en la invención. Se entiende que se puede preparar una Secuencia de reconocimiento similar de BoNT/E, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma, parálogo u ortólogo de SNAP-25 sensible a BoNT/E, tal como, la Secuencia de reconocimiento de BoNT/E contenida en las proteínas de SNAP-25 identificada en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 2.

De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato asociado membrana de BoNT/E que comprende un primer miembro de un par de FRET y una Secuencia de reconocimiento de BoNT/E que incluye un sitio de escisión. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de reconocimiento de toxina botulínica serotipo E" es un sinónimo de "secuencia de reconocimiento de BoNT/E" y significa un enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para detectar proteolisis en el enlace escindible por un BoNT/E en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/E puede ser, por ejemplo, Arg-Ile.

En un aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E que comprende una Secuencia de reconocimiento de BoNT/E que contiene al menos seis restos consecutivos de SNAP-25 incluyendo Arg-Ile. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una Secuencia de reconocimiento de BoNT/E que comprende la Secuencia de reconocimiento de BoNT/E Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (SEQ ID NO: 101). En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una Secuencia de reconocimiento de BoNT/E que comprende una parte de SNAP-25 tal como, por ejemplo, restos 1 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 46 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 92 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 134 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 137 a 206 de la SEQ ID NO: 1, restos 146 a 206 de la SEQ ID NO: 1; restos 156 a 206 de la SEQ ID NO: 1, o su mimético de péptido.

Una diversidad de secuencias de reconocimiento de BoNT/F se conocen bien en la técnica o se pueden definir por procedimientos de rutina. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/F puede incluir, por ejemplo, restos 27 a 116; restos 37 a 116; restos 1 a 86; restos 1 a 76; o restos 1 a 69 de VAMP-2 de rata, véase, por ejemplo, Yamasaki et al., supra, (1994). Una secuencia de reconocimiento de BoNT/F también puede incluir, por ejemplo, restos 27 a 69 o restos 37 a 69 de VAMP-2 de rata. Se entiende que una secuencia de reconocimiento similar de BoNT/F se puede preparar, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP sensible a BoNT/F, tal como, por ejemplo, VAMP-1 de tipo humano o VAMP-2 de tipo humano. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/F también puede incluir, sin limitación, la secuencia Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 126) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 37 a 75 de VAMP-2 de tipo humano, véase, por ejemplo, Schmidt y Stafford, supra, (13 de julio de 2004) y la secuencia de reconocimiento de BoNT/F Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 127) o su mimético de péptido, que corresponde a los restos 39 a 77 de VAMP-1 de tipo humano.

Una secuencia de reconocimiento de BoNT/F puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a escisión por toxina botulínica serotipo F, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/F. Como se muestra en la Tabla 4, una diversidad de proteínas de origen natural sensible a escisión por BoNT/F se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de tipo humano, de rata y de ratón; VAMP-2 bovino; VAMP-1 y VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; y sybA y synB de Drosophila. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de tipo humano; VAMP-2 bovino; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; sybA y synB de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/F. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1 o VAMP-2 de tipo humano, VAMP-1 o VAMP-2 de ratón, VAMP-1 o VAMP-2 bovino, VAMP-1 o VAMP-2 de rata, celubrevina de rata, VAMP-1 o VAMP-2 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Aplysia, syb de Drosophila, VAMP de sanguijuela, u otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/F. Además, como se muestra en Tabla 4 anterior, comparación de secuencias de aminoácidos nativa de VAMP escindidas por BoNT/F revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas, indicando que una diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia de origen natural de VAMP sensible a BoNT/F se puede tolerar en sustrato de BoNT/F útil en la invención. Se entiende que una secuencia de reconocimiento de BoNT/F similar se puede preparar, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/F, tal como, la secuencia de reconocimiento de BoNT/F contenida en VAMP-1 i VAMP-2 identificada en los organismos enumerados anteriormente y en la Tabla 4.

De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato de BoNT/F asociado a membrana que comprende un primer miembro de un par de FRET y una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que incluye un sitio de escisión. El término "secuencia de reconocimiento de toxina botulínica serotipo F", como se usa en el presente documento, es un sinónimo de "secuencia de reconocimiento de BoNT/F" y significa un enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para detectar proteolisis en el enlace escindible por un BoNT/F en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/F puede ser, por ejemplo, Gln-Lys.

En un aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que contiene al menos seis restos consecutivos de VAMP incluyendo Gln-Lys. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que comprende la secuencia de reconocimiento de BoNT/F Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (SEQ ID NO: 102). En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que comprende una parte de VAMP-1-1 tal como, por ejemplo, restos 1 a 118 de la SEQ ID NO: 28; restos 39 a 77 de la SEQ ID NO: 28, o su mimético de péptido.

En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que comprende una parte de VAMP-1-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 117 de la SEQ ID NO: 29; restos 39 a 77 de la SEQ ID NO: 29, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que comprende una parte de VAMP-1-3 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 30; restos 39 a 77 de la SEQ ID NO: 30, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el Sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F que comprende una parte de VAMP-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 1 a 86 de la SEQ ID NO: 31; restos 1 a 76 de la SEQ ID NO: 31; restos 1 a 69 de la SEQ ID NO: 31; restos 27 a 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 37 a 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 27 a 68 de la SEQ ID NO: 31; restos 37 a 75 de la SEQ ID NO: 31; restos 37 a 69 de la SEQ ID NO: 31, o su mimético de péptido.

Una secuencia de reconocimiento de BoNT/G puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a escisión por toxina botulínica serotipo G, o puede ser sustancialmente similar a tal segmento a BoNT/G. Como se muestra en Tabla 4, una diversidad de proteínas de origen natural sensible a escisión por BoNT/G se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de tipo humano, de rata y de ratón; VAMP-2 bovino; VAMP-1, y VAMP-2 de pollo; y VAMP-1 de Torpedo. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de tipo humano; VAMP-2 bovino; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; SNB1 de Caenorhabditis, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/G. Además, como se muestra en Tabla 4 anterior, la comparación de secuencia de aminoácidos de VAMP nativa escindida por BoNT/G revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas, indicando que una diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia de VAMP de origen natural sensible a BoNT/G se puede tolerar en un sustrato de BoNT/G útil en la invención. Se entiende que una secuencia de reconocimiento de BoNT/G similar se puede preparar, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/G, tal como, la secuencia de reconocimiento de BoNT/G contenida en VAMP-1 y VAMP-2 identificada en los organismos enumerados anteriormente y en la Tabla 4.

De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato de BoNT/G asociado a membrana que comprende un primer miembro de un par de FRET y una secuencia de reconocimiento de BoNT/G incluyendo un sitio de escisión. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de reconocimiento de toxina botulínica serotipo G" es un sinónimo de "secuencia de reconocimiento de BoNT/G" y significa un enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para detectar proteolisis en el enlace escindible por un BoNT/G en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/G puede ser, por ejemplo, Ala-Ala.

En un aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, a BoNT/G secuencia de reconocimiento que comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/G que contiene al menos seis restos consecutivos de VAMP incluyendo Ala-Ala. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G que comprende la secuencia de reconocimiento de BoNT/G Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 103). En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G que comprende una parte de VAMP-1-1 tal como, por ejemplo, restos 1 a 118 de la SEQ ID NO: 28, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G que comprende una parte de VAMP-1-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 117 de la SEQ ID NO: 29, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G que comprende una parte de VAMP-1-3 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 30, o su mimético de péptido. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G que comprende una parte de VAMP-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 31, o su mimético de péptido.

Una diversidad de secuencias de reconocimiento de TeNT se conocen bien en la técnica o se pueden definir mediante procedimientos de rutina e incluyen secuencias correspondientes a alguno o todo el núcleo hidrófilo de una VAMP tal como VAMP-1 de tipo humano o VAMP-2 de tipo humano. una secuencia de reconocimiento de TeNT puede incluir, por ejemplo, restos 25 to 93 o restos 33 a 94 de human VAMP-2 (SEQ ID NO: 31; F. Cornille et al., Solid-phase synthesis, conformational analysis and in vitro cleavage of synthetic human synaptobrevin II 1-93 by tetanus toxin L chain, 222(1) Eur. J. Biochem. 173-181 (1994); Patrick Foran et al., Differences in the protease activities of tetanus and botulinum B toxins revealed by the cleavage of vesicle-associated membrane protein and various sized fragments, 33 (51) Biochemistry 15365-15374 (1994); restos 51 a 93 o restos 1 a 86 de VAMP-2 de rata, véase, por ejemplo, Yamasaki et al., supra, (1994); o restos 33 a 94 de VAMP-1-1 de tipo humano (SEQ ID NO: 28), restos 33 a 94 de VAMP-1-2 de tipo humano (SEQ ID NO: 29) y restos 33 a 94 de VAMP-1-3 de tipo humano (SEQ ID NO: 30). Una secuencia de reconocimiento de TeNT también puede incluir, por ejemplo, restos 25 a 86, restos 33 a 86 o restos 51 a 86 de VAMP-2 de tipo humano (SEQ ID NO: 31) o VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 38). Se entiende que una secuencia de reconocimiento similar de TeNT se puede preparar, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma de VAMP sensible a TeNT o especies homologas tales como VAMP-1 de tipo humano o VAMP de erizo de mar o de Aplysia.

De este modo, una secuencia de reconocimiento de TeNT puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a escisión por toxina de tétanos, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a TeNT. Como se muestra en Tabla 4, una diversidad de proteínas de origen natural sensible a escisión por TeNT se conoce en la técnica e incluye, por ejemplo, VAMP-1,VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de tipo humano y de ratón; VAMP-2 bovino; VAMP-2 y -3 de rata; VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD y synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; y tipo SNB1 de Caenorhabditis. De este modo, una secuencia de reconocimiento de TeNT puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de tipo humano; VAMP-2 bovino; VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sybA, synB, synC, synD o synE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 y de tipo SNB de Caenorhabditis, sus isoformas, u otra proteína de origen natural sensible a escisión por TeNT. Además, comparación de secuencia de aminoácidos nativa de VAMP escindida por TeNT revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas (Tabla 4). Este hallazgo indica que una diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia de VAMP de origen natural sensible a TeNT se puede tolerar en un sustrato de TeNT útil en la invención. Se entiende que una secuencia de reconocimiento similar de TeNT se puede preparar, si se desea, a partir de un segmento (homólogo) correspondiente de otra isoforma, parálogo u ortólogo, VAMP-1 ó VAMP-2 sensible a TeNT, tal como, la secuencia de reconocimiento de TeNT contenida en VAMP-1 y VAMP-2 identificada en los organismos enumerados anteriormente y en la Tabla 4.

De este modo, en una realización, una célula comprende, en parte, un sustrato de TeNT asociado a membrana sustrato que comprende un primer miembro de un par de FRET y una secuencia de reconocimiento de TeNT incluyendo un sitio de escisión. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de reconocimiento de toxina de tétanos" significa un enlace escindible conjuntamente con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para detectar proteolisis en el enlace escindible mediante una toxina de tétanos en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por TeNT puede ser, por ejemplo, Gln-Phe.

En un aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de TeNT que comprende una secuencia de reconocimiento de TeNT que contiene al menos seis restos consecutivos de VAMP incluyendo Gln-Phe. En otro aspecto de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de TeNT que comprende la secuencia de reconocimiento de TeNT Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 104). En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de TeNT que comprende una parte de VAMP-1-1 tal como, por ejemplo, restos 1 a 118 de la SEQ ID NO: 28 o restos 33 a 94 de la SEQ ID NO: 28. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de TeNT que comprende una parte de VAMP-1-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 117 de la SEQ ID NO: 29 o restos 33 a 94 de la SEQ ID NO: 29. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de TeNT que comprende una parte de VAMP-1-3 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 30 o restos 33 a 94 de la SEQ ID NO: 30. En otros aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento de TeNT que comprende una parte de VAMP-2 tal como, por ejemplo, restos 1 a 116 de la SEQ ID NO: 31; restos 25 a 94 de la SEQ ID NO: 31; restos 33 a 94 de la SEQ ID NO: 31; restos 51 a 93 de la SEQ ID NO: 31; restos 1 a 86 de la SEQ ID NO: 31; restos 25 a 86 de la SEQ ID NO: 31; restos 33 a 86 de la SEQ ID NO: 31; restos 51 a 86 de la SEQ ID NO: 31, o su mimético de péptido.

SNAP-25, VAMP y Sintaxina comparten un motivo corto usualmente localizado dentro de regiones predichas para adoptar una conformación \alpha-helicoidal llamado el motivo SNARE. Este motivo usualmente comprende un motivo de nueve aminoácidos con la fórmula general de H-\Theta-\Theta-X-H-\Theta-X-H-P (véase Fig. 3b), donde H es un resto alifático, \Theta es un resto carboxilato residuo, P es un resto polar y X es cualquier aminoácido, véase por ejemplo, Ornella Rossetto et al., SNARE motif and neurotoxins, 372 (6505) Nature 415-416 (1994); Rossella Pellizzari et al., Structural determinants of the specificity for synaptic vesicle-associated membrana protein/synaptobrevin of tetanus and botulinum type B and G neurotoxins, 271(34) J. Biol. Chem. 20353-20358 (1996); Rossella Pellizzari et al., The interaction of synaptic vesicle-associated membrane protein/synaptobrevin with botulinum neurotoxins D and F, 409(3) FEBS Lett. 339-342 (1997); y Philip Washbourne et al., Botulinum neurotoxin types A and E require the SNARE motif in SNAP-25 for proteolysis, 418 (1-2) FEBS Lett. 1-5 (1997). Este motivo está presente en isoformas de SNAP-25, VAMP y de sintaxina expresadas en animales sensibles a las toxinas. Por el contrario, proteínas de SNAP-25 de Drosophila y levadura son resistentes a estas toxinas. Además, las isoformas de VAMP y de sintaxina no implicadas en exocitosis contienen las variaciones de secuencia en estas regiones de motivo \alpha-helicoidal.

Múltiples repeticiones del motivo \alpha-helicoidal están presentes en las proteínas sensibles a escisión por Toxinas Clostridiales: cuatro copias están naturalmente presentes en SNAP-25, denominadas S1-S4; dos copias están naturalmente presentes en VAMP, denominadas V1 y V2; y dos copias están naturalmente presentes en sintaxina, denominadas X1 y X2, véase, por ejemplo, Humeau et al., supra, (2000). Además, los péptidos correspondientes a la secuencia específica de los motivos \alpha-helicoidales pueden inhibir la actividad de la toxina in vitro e in vivo, y tales péptidos pueden inhibir de manera cruzada diferentes toxinas. Además, los anticuerpos inducidos contra tales péptidos pueden reaccionar de manera cruzada entre las tres proteínas diana, indicando que este motivo \alpha-helicoidal se expone sobre la superficie de la proteína y adopta una configuración similar en cada una de las tres proteínas diana. Consistente con estos hallazgos, las toxinas específicas de SNAP-25, específicas de VAMP y específicas de sintaxina se inhiben de manera cruzada entre sí mediante compitiendo por el mismo sitio de unión, aunque no escinden dianas no específicamente. Estos resultados indican que una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial puede incluir, si se desea, al menos un motivo \alpha-helicoidal. Si se reconoce que un motivo \alpha-helicoidal no se requiere para la escisión por una Toxina Clostridial, como se evidencia por sustratos de 16 meros y 17 meros para BoNT/A conocido en la técnica, véase, por ejemplo, Schmidt y Bostian, supra, (1997); Schmidt y Bostian, supra, (12 de octubre de1999); y Schmidt y Stafford, supra, 13 de julio de 2004).

Aunque múltiples motivos \alpha-helicoidales se encuentran en las proteínas de origen natural diana de SNAP-25, VAMP y sintaxina, una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial útil en un Sustrato de Toxina Clostridial puede tener un único motivo \alpha-helicoidal. En realizaciones particulares, un procedimiento de la invención depende de una secuencia de reconocimiento Toxina Clostridial incluyendo dos o más motivos \alpha-helicoidales. Una Secuencia de reconocimiento de BoNT/A o BoNT/E puede incluir, por ejemplo, el motivo \alpha-helicoidal de S4, solo o combinado con uno o más motivos \alpha-helicoidales adicionales; una secuencia de reconocimiento de BoNT/B, BoNT/G o TeNT puede incluir, por ejemplo, el motivo \alpha-helicoidal de V2, solo o combinado con uno o más motivos \alpha-helicoidales adicionales; una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 puede incluir, por ejemplo, el motivo \alpha-helicoidal de S4, solo o combinado con uno o más motivos \alpha-helicoidales adicionales, o el motivo \alpha-helicoidal de X2, solo o combinado con uno o más motivos \alpha-helicoidales adicionales; y una secuencia de reconocimiento de BoNT/D o BoNT/F puede incluir, por ejemplo, el motivo \alpha-helicoidal de V1, solo o combinado con uno o más motivos \alpha-helicoidales adicionales. Los motivos de SNARE representativos se presentan en las Tablas 6, 7 y 8.

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Tabla 6 - Motivos de SNARE de SNAP-25 y proteínas relacionadas. Primate: restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25A de tipo humano de la SEQ ID NO: 1; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25B de tipo humano de la SEQ ID NO: 2; restos 17-25, 31-39, 45-53, y 152-160 de SNAP-23A de tipo humano de la SEQ ID NO: 3; restos 17-25, 31-39, 45-53 and 152-160 de SNAP-23B de tipo humano de la SEQ ID NO: 4; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25B de mono de la SEQ ID NO: 5; Roedor: restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25A de rata de la SEQ ID NO: 6; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25B de rata de la SEQ ID NO: 7; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25B de ratón de la SEQ ID NO: 8; restos 17-25, 31-39, 45-53 y 151-159 de SNAP-23 de rata de la SEQ ID NO: 9; restos 17-25, 31-39, 45-53 y 151-159 de SNAP-23 de ratón de la SEQ ID NO: 10; Ave: restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 SNAP-25B de pollo de la SEQ ID NO: 11; Pez: restos 22-30, 36-44, 50-58 y 144-152 de SNAP-25A de pez dorado de la SEQ ID NO: 12; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 143-151 de SNAP-25B del pez dorado de la SEQ ID NO: 13; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 144-152 de SNAP-25A de pez cebra de la SEQ ID NO: 14; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 143-151 de SNAP-25B de Pez cebra de la SEQ ID NO: 15; restos 17-25, 31-39, 45-53 y 157-165 de SNAP-23 de Pez cebra de la SEQ ID NO: 16; Raya: restos 26-34, 40-48, 54-62 y 153-161 de SNAP-25 de raya eléctrica jaspeada de la SEQ ID NO: 17; Anfibio: restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25A de rana de la SEQ ID NO: 18; restos 22-30, 36-44, 50-58 y 146-154 de SNAP-25B de rana de la SEQ ID NO: 19; restos 17-25, 31-39, 45-53 y 146-154 de SNAP-23 de rana de la SEQ ID NO: 20; restos 24-32, 38-46, 52-60 y 152-160 de SNAP-25 de erizo de mar de la SEQ ID NO: 21; Insecto: restos 29-37, 43-51, 57-65 y 154-163 de SNAP-25 de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 22 212; restos 24-32, 38-46, 52-60 y 153-162 de SNAP-24 de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 23; Anillo segmentado: restos 30-38, 44-52, 58-66 y 153-161 de SNAP-25 de Sanguijuela de la SEQ ID NO: 24; Cefalópodo: restos 25-33, 39-47, 53-61 y 153-161 de SNAP-25 de calamar de la SEQ ID NO: 25; Gasterópodo: restos 32-40, 46-54, 60-68 y 160-168 de SNAP-25 de caracol de agua dulce de la SEQ ID NO: 26; Gusano redondo: restos 22-30, 36-44, 50-58 y 148-156 de SNAP-25 de gusano nematodo de la SEQ ID NO: 27.

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Tabla 7 - Motivos de SNARE de VAMP y proteínas relacionadas. Primate: restos 40-48 y 56-64 de VAMP-1-1 de tipo humano de la SEQ ID NO: 28; restos 40-48 y 56-64 de VAMP-1-2 de tipo humano de la SEQ ID NO: 29; restos 40-48 y 56-64 de VAMP-1-3 de tipo humano de la SEQ ID NO: 30; restos 39-47 y 63-71 de VAMP-2 de tipo humano de la SEQ ID NO: 31; restos 39-47 y 63-71 de VAMP-2 de mono de la SEQ ID NO: 32; VAMP-3/celubrevina restos 22-30 y 46-54 de VAMP-3/celubrevina de tipo humano de la SEQ ID NO: 33; Bovino: restos 39-47 y 63-71 de VAMP-2 de vaca de la SEQ ID NO: 34; Roedor: restos 40-48 y 56-64 VAMP-1 de rata de la SEQ ID NO: 35; restos 40-48 y 56-64 de VAMP-1-b de rata de la SEQ ID NO: 36; restos 40-48 y 56-64 de VAMP-1 de ratón de la SEQ ID NO: 37; de rata de VAMP-2 restos 39-47 y 63-71 de la SEQ ID NO: 38; restos 39-47 y 63-71 de VAMP-2-b de rata de la SEQ ID NO: 39; restos 39-47 y 63-71 de VAMP-2 de ratón de la SEQ ID NO: 40; restos 26-34 y 50-58 de VAMP-3/celubrevina de rata de la SEQ ID NO: 41; restos 26-34 y 50-58 de VAMP-3/celubrevina de ratón de la SEQ ID NO: 42; ave: restos 182-190 y 198-206 de VAMP-1 de pollo de la SEQ ID NO: 43; restos 37-45 y 61-69 de VAMP-2 de pollo de la SEQ ID NO: 44; restos 26-34 y 50-58 de VAMP-3/celubrevina de pollo de la SEQ ID NO: 45; Pez: restos 41-49 y 57-65 de VAMP-1 de pez cebra de la SEQ ID NO: 46; restos 33-41 y 57-65 de VAM-2 de pez cebra de la SEQ ID NO: 47; restos 25-33 y 49-57 de VAMP-3 de pez cebra de la SEQ ID NO: 48; Raya: restos 42-50 y 58-66 de VAM-1 de raya eléctrica jaspeada de la SEQ ID NO: 49; Anfibio: restos 37-45 y 61-69 de VAMP-2 de rana de la SEQ ID NO: 50; restos 24-32 y 48-56 de VAMP-3 de rana de la SEQ ID NO: 51; restos 23-31 y 39-47 de VAMP de erizo de mar de la SEQ ID NO: 52; Insecto: restos 31-39 y 47-55 de SynA1 de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 53; restos 54-62 y 70-78 de SynA2 de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 54; restos 54-62 y 70-78 de SynB1 de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 55; restos 54-62 y 70-78 de SynB2 de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 56; restos 48-56 y 64-72 de SynC de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 57; restos 67-75 y 83-91 de SynD de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 58; restos 67-75 y 83-91 de SynE de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 59; Gusano segmentado: restos 37-45 y 53-61 de VAMP de sanguijuela de la SEQ ID NO: 60; Cefalópodo: restos 47-55 y 63-71 de VAMP de calamar de la SEQ ID NO: 61; Gasterópodo: restos 40-48 y 56-64 de VAMP de caracol de agua dulce de la SEQ ID NO: 62; restos 30-38 y 46-54 de VAMP de liebre marina de la SEQ ID NO: 63; Gusano redondo: restos 34-42 y 50-58 de SNB1 de gusano nematodo de la SEQ ID NO: 64; restos 40-48 y 56-64 de tipo SNB de gusano nematodo de la SEQ ID NO: 65.

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Tabla 8 - Motivos SNARE de Sintaxina y proteínas relacionadas. Primate: restos 30-38 y 165-173 de Sintaxina 1A de tipo humano de la SEQ ID NO: 66; restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B1 de tipo humano de la SEQ ID NO: 67; restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B2 de tipo humano de la SEQ ID NO: 68; restos 29-37 y 168-176 de Sintaxina2-1 de tipo humano de la SEQ ID NO: 69; restos 29-37 y 168-176 de Sintaxina2-2 de tipo humano de la SEQ ID NO: 70; restos 29-37 y 168-176 de Sintaxina2-3 de tipo humano de la SEQ ID NO: 71; restos 32-40 y 165-173 de Sintaxina3 de tipo humano de la SEQ ID NO: 72; bovino: restos 30-38 y 165-173 de Sintaxina 1A de vaca de la SEQ ID NO: 73; restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B2 de vaca de la SEQ ID NO: 74; Roedor: restos 30-38 y 165-173 de Sintaxina 1A de rata de la SEQ ID NO: 75; restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B2 de rata de la SEQ ID NO: 76; restos 30-38 y 165-173 de Sintaxina 1A de ratón de la SEQ ID NO: 77; restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B1 de ratón de la SEQ ID NO: 78; restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B2 de ratón de la SEQ ID NO: 79; restos 31-39 y 170-178 de Sintaxina2 de rata de la SEQ ID NO: 80; restos 30-38 y 169-177 de Sintaxina2 de ratón de la SEQ ID NO: 81; restos 32-40 y 165-173 de Sintaxina 3A de rata de la SEQ ID NO: 82; restos 32-40 y 165-173 de Sintaxina 3A de ratón de la SEQ ID NO: 83; restos 32-40 y 165-173 de Sintaxina 3B de ratón de la SEQ ID NO: 84; restos 32-40 y 147-155 de Sintaxina 3C de ratón de la SEQ ID NO: 85; Ave: restos 29-37 y 157-165 de Sintaxina 1B de pollo de la SEQ ID NO: 86; restos 28-36 y 167-175 de Sintaxina2 de pollo de la SEQ ID NO: 87; Pez: restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B de pez cebra de la SEQ ID NO: 88; restos 29-37 y 163-171 de Sintaxina3 de pez cebra de la SEQ ID NO: 89; restos 29-37 y 164-172 de Sintaxina 1B de erizo de mar de la SEQ ID NO: 90; Insecto: restos 33-41 y 168-176 de Sintaxina 1A de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 91; Gusano segmentado: restos 36-44 y 171-179 de Sintaxina 1A de sanguijuela de la SEQ ID NO: 92; Cefalópodo: restos 33-41 y 168-176 de Sintaxina 1A de calamar de la SEQ ID NO: 93; Gasterópodo: restos 32-40 y 167-175 de Sintaxina 1A de caracol de agua dulce de la SEQ ID NO: 94; restos 32-40 y 167-175 de Sintaxina 1A de liebre marina de la SEQ ID NO: 95.

Como se ha descrito anteriormente, el complejo SNARE está comprendido por el t-SNARE SNAP-25 junto con otro t-SNARE, la sintaxina 1 y un v-SNARE VAMP/sinaptobrevina. Miembros de la familia SNAP-25 de proteínas pueden estar divididos en tres dominios estructurales y \alpha-hélice amino terminal de aproximadamente 84 restos, un bucle interhelicoidal de aproximadamente 36 aminoácidos y una \alpha-hélice carboxi terminal de aproximadamente 86 restos, dependiendo del miembro individual. Como se describirá más adelante, se pueden usar las tres regiones para dirigir SNAP-25 a la membrana plasmática o bien solas o en combinaciones de las tres.

El bucle interhelicoidal de SNAP-25 parece que sea importante para conferir la dirección de especificidad de esta proteína de SNARE a la membrana. Por ejemplo, en un estudio un dominio de dirección de membrana que comprende los restos 85-120 de SNAP-25 se mostró para localizar a la membrana de la célula Susana Gonzalo et al., SNAP-25 is targeted to the plasma membrane through a novel membrane-binding domain, 274(30) J. Biol. Chem.21313-21318 (1999). Esta región representa dos tercios del bucle interhelicoidal que conecta las \alpha-hélices amino- y carboxi-terminal \alpha-hélices de SNAP-25. La función de este dominio de dirección parece ser independiente de las interacciones proteína-proteína de SNARE ya que se eliminan de las regiones SNAP-25 que se asocian o bien con sintaxina o sinaptobrevina no interfirieron con la dirección apropiada de SNAP-25 a la membrana.

La alineación de los miembros de la familia de SNAP-25 reveló dos motivos conservados presentes dentro de la región del bucle interhelicoidal responsable de la dirección de la membrana. El primero es una región rica en cisteína presente en el borde amino terminal del dominio del bucle interhelicoidal de dirección de membrana. Una o más de las cisteínas presentes este motivo es graso acilado mediante enlace tioéster de palmitato. Palmitoilación de esta región rica en cisteína puede ser importante para la inserción en membrana debido a que la eliminación de estos restos de cisteína da como resultado una pérdida de la dirección de membrana de SNAP-25.

El segundo es un motivo de cinco aminoácidos localizado en el borde carboxi terminal del dominio del bucle interhelicoidal de dirección de membrana (QPXR(V/I)). Este motivo se cree que juega un papel en la asociación a membrana, véase, por ejemplo, Gonzalo et al., supra, (1999); Philip Washboume et al., Cysteine residues of SNAP-25 are required for SNARE disassembly and exocytosis, but not for membrane targeting, 357(Pt 3) Biochem. J. 625-634 (2001).

Las \alpha-hélices de los diversos miembros del complejo de SNARE parece que están implicados entre las interacciones proteína-proteína entre miembros. Por ejemplo, solución de la estructura de cristal del complejo SNARE revela que SNAP-25, sintaxina y sinaptobrevina parecen favorecer una asociación de haz de 4 hélices heterotriméricas, en paralelo, véase, por ejemplo, R. Bryan Sutton et al., Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution, 395 (6700) Nature 347-353 (1998). Este análisis indicaba un interlace extensivo de las \alpha-hélices con la región amino terminal del haz que comprende interacciones entre la \alpha-hélice amino terminal de SNAP-25 con sintaxina, varias asociaciones centrales entre los tres miembros y una asociación entre sintaxina y sinaptobrevina en la parte carboxilo terminal del haz de cuatro hélices.

Las interacciones proteína-proteína entre las \alpha-hélices de los miembros del complejo de SNARE parece ser otra forma de localizar SNAP-25 a la membrana. Por ejemplo, la co-expresión de SNAP-25 con sintaxina dio como resultado la dirección de SNAP-25 a la membrana en la ausencia de un bucle interhelicoidal funcional que sugiere que las interacciones de proteína-proteína entre estos dos t-SNARE puede dirigir los sustratos de Toxina Clostridial a la membrana, véase, por ejemplo, Washboume et al., supra, (2001).

Miembros de la familia de proteínas de la Sintaxina se pueden dividir en varios dominios estructurales. En la mitad amino-terminal de la proteína contiene una región Habc que comprende tres dominios \alpha-hélice localizados en los aminoácidos 30-60, 69-104 y 110-154. La mitad carboxi-terminal de la Sintaxina-1 contiene una \alpha-hélice de aproximadamente 52-69 restos, dependiendo del miembro individual y un dominio de anclaje a membrana de aproximadamente 23 aminoácidos. Como se describirá más adelante, regiones que comprende el dominio de anclaje a membrana de Sintaxina se puede usar para dirigir los sustratos de Toxina Clostridial a la membrana plasmática.

Los sustratos de Toxina Clostridial desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, un dominio de dirección de membrana. Como se usa en el presente documento, el término "dominio de dirección de membrana" es un sinónimo de "MTD" y significa un péptido de SNAP-25 o de Sintaxina que dirige un sustrato de Toxina Clostridial a la membrana celular. Cualquiera y todos de los dominios de dirección de membrana de SNAP-25 o Sintaxina se puede usar en aspectos de la presente invención, con la condición que el sustrato de la Toxina Clostridial mantenga la propiedad de escindirse por una Toxina Clostridial. Los ejemplos incluyen, sin limitación, dominios de dirección de membrana de origen natural presentes en SNAP-25, variantes de SNAP-25 MTD de origen natural, y variantes de SNAP-25 MTD de origen no natural, tal como, por ejemplo, variantes de SNAP-25 MTD modificadas por ingeniería genética, producidas, por ejemplo, mediante mutagénesis diseñada al azar o racional y miméticos de péptidos de SNAP-25 MTD; y dominios de dirección de membrana de origen natural presentes en Sintaxina, variantes de Sintaxina MTD de origen natural, y variantes de Sintaxina MTD de origen no natural, tales como, por ejemplo, variantes de Sintaxina MTD modificadas por ingeniería genética, producidas, por ejemplo, mediante mutagénesis diseñada al azar o racional de miméticos de péptido de Sintaxina MTD.

De este modo, aspectos de la presente invención proporcionan una célula aislada como se desvela en las reivindicaciones adjuntas.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan un procedimiento de determinación de la actividad de la Toxina Clostridial como se desvela en las reivindicaciones adjuntas.

De este modo, en una realización un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende una región de SNAP-25 suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. En un aspecto de esta realización, el dominio de dirección de membrana que comprende una región de la región interhelicoidal de SNAP-25 suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. En un aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, Se prevé que una región de bucle interhelicoidal de SNAP-25 de cualquiera y todas las longitudes puede comprender el dominio de dirección de membrana con la condición que la región de bucle sea suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. De este modo, aspectos de esta realización pueden incluir una región de bucle interhelicoidal que comprende, por ejemplo, al menos 35 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, al menos 30 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, al menos 25 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, al menos 20 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, al menos 15 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, al menos 10 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1 o al menos 5 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1. Los aspectos adicionales de esta realización pueden incluir una región de bucle interhelicoidal que comprende, por ejemplo, como mucho 35 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 30 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 25 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 20 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 15 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 10 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1 o como mucho 5 restos de los aminoácidos 85-120 de la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto de esta realización un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos CGLCVCPCNK (SEQ ID NO: 128). En otro aspecto de esta realización el dominio que dirige la membrana comprende aminoácidos CGLFICPCNK (SEQ ID NO: 129). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos CGLCSCPCNK (SEQ ID NO: 130). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos CGLCPCPCNK(SEQ ID NO: 131). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos CGIVCPWKK(SEQ ID NO: 132). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos CGICVLPCNK(SEO ID NO: 133). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos CGLCVLPWNK(SEQ ID NO: 134).

En otra realización un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana comprende los aminoácidos QPXRV(SEQ ID NO: 135), donde X es cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos OPXRI (SEQ ID NO: 136), donde X es cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos QPARV (SEQ ID NO: 137). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos QPQRV (SEQ ID NO: 138). En otro aspecto o de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos QPGRV (SEQ ID NO: 139). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos OPSRI (SEQ ID NO: 140). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos QPMRM (SEPA ID NO: 141). En otro aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos OPRI (SEQ ID NO: 142).

En otra realización un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos de la \alpha-hélice amino terminal de SNAP-25 suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. En un aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1. Se prevé que una \alpha-hélice amino terminal de SNAP-25 de cualquiera y todas las longitudes puede comprender el dominio de dirección de membrana con la condición que la región de bucle sea suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. De este modo, aspectos de esta realización pueden incluir una región \alpha-hélice amino-terminal que comprende, por ejemplo, al menos 80 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 75 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1. al menos 70 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 65 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 60 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 55 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 50 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 45 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 40 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 35 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 30 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 25 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 20 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 15 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, al menos 10 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1 o al menos 5 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1. Aspectos adicionales de esta realización pueden incluir una región \alpha-hélice amino terminal que comprende, por ejemplo, como mucho 80 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 75 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 70 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 65 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 60 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 55 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 50 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 45 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 40 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 35 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 30 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 25 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 20 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 15 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 10 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1 o como mucho 5 restos de los aminoácidos 1-84 de la SEQ ID NO: 1.

En todavía otra realización un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana comprende aminoácidos de la \alpha-hélice carboxi terminal de SNAP-25 suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. En un aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1. Se prevé que una \alpha-hélice carboxi terminal de SNAP-25 de cualquiera y todas las longitudes puede comprender el dominio de dirección de membrana con la condición que la región de bucle es suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. De este modo, aspectos de esta realización puede incluir una región \alpha-hélice carboxi terminal que comprende, por ejemplo, al menos 80 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1; al menos 75 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 70 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 65 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 60 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 55 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 50 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 45 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 40 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 35 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 30 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 25 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 20 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 15 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, al menos 10 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1 o al menos 5 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQID NO: 1. Aspectos adicionales de esta realización pueden incluir una región \alpha-hélice carboxi terminal que comprende, por ejemplo, como mucho 85 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1; como mucho 80 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1; como mucho 75 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 70 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 65 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 60 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 55 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 50 restos de los aminoácidos 121-208 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 45 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 40 restos de los aminoácidos 121-208 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 35 restos de los aminoácidos 121-206 of SEQ ID NO: 1, como mucho 30 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 25 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 20 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 15 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1, como mucho 10 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1 o como mucho 5 restos de los aminoácidos 121-206 de la SEQ ID NO: 1.

En otra realización un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende a región de Sintaxina suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. En un aspecto de esta realización, el dominio de dirección de membrana que comprende a región del dominio de anclaje a membrana de Sintaxina suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. En un aspecto de esta realización el dominio de dirección de membrana comprende los aminoácidos 266-288 de la SEQ ID NO: 66. Se prevé que un dominio de anclaje a membrana de Sintaxina de cualquiera y todas las longitudes puede comprender el dominio de dirección de membrana con la condición que la región de bucle sea suficiente para dirigir un sustrato de toxina descrito en la presente memoria descriptiva a la membrana. De este modo, aspectos de esta realización pueden incluir una región de bucle interhelicoidal que comprende, por ejemplo, al menos 20 restos de los aminoácidos 266-288 de la SEQ ID NO: 66; al menos 15 restos de los aminoácidos 266-288 de la SEQID NO: 66, o al menos 10 restos de los aminoácidos 266-288 de la SEQID NO: 66. Aspectos adicionales de esta realización pueden incluir un dominio de anclaje a membrana que comprende, por ejemplo, como mucho 20 restos de los aminoácidos 266-288 de la SEQ ID NO: 66; como mucho 15 restos de los aminoácidos
266-288 de la SEQ ID NO: 66 o como mucho 10 restos de los aminoácidos 266-88 de la SEQ ID NO: 66.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de tipo humano de la SEQ ID NO: 66. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIIICCVILGIVIASTVGGIFA, que corresponde a los restos 266-288 de la SEQ ID NO: 66. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1B1 de tipo humano de la SEQ ID NO: 67. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IIIIICCVVLGVVLASSIGCTLGL, que corresponde a los restos 265-288 de la SEQ ID NO: 67. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1B2 de tipo humano de la SEQ ID NO: 68. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIIICCVVLGVVLASSIGGTLGL, que corresponde a los restos 265-288 de la SEQ ID NO: 67. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-2-1 de tipo humano de la SEQ ID NO: 69. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos LMFIIICVIVLLVILGIILATTLS, que corresponde a los restos 264-287 de la SEQ ID NO: 69. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-2-2 de tipo humano de la SEQ ID NO: 70. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende aminoácidos WIIIAVSVVLWIIVLIIGLSVGK, que corresponde a los restos 264-288 de la SEQ ID NO: 70. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-2-3 de tipo humano de la SEQ ID NO: 71. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos WIIIAVSVVLVAIIALIIGLSVGK, que corresponde a los restos 264-288 de la SEQ ID NO: 71. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-3 de tipo humano de la SEQ ID NO: 72. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos LIIIIVLVVVLLGILALIIGISVGLN, que corresponde a los restos 264-289 de la SEQ ID NO: 72.

En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de vaca de la SEQ ID NO: 73. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIVICCVVLGIVIASTFGGIFG, que corresponde a los restos 266-288 de la SEQ ID NO: 67.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de rata de la SEQ ID NO: 75. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIIICCVILGIIIASTIGGIFG, que corresponde a los restos 266-288 de la SEO ID NO: 75. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1B2 de rata de la SEQ ID NO: 76. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIIICCWLGVVLASSIGGTLGL, que corresponde a restos 265-288 de la SEQ ID NO: 76. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-2 de rata de la SEQ ID NO: 80. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos WIIAAVVVAVIAVLALIIGLSVGK, que corresponde a los restos 267-290 de la SEQ ID NO: 80. En un aspecto de esta realización, un sustrato Clostridial de toxina comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-2 de ratón de la SEQ ID NO: 81. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos WIIAAVAVAVIAVLALIIGLSVGK, que corresponde a los restos 266-289 de la SEQ ID NO: 81. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-3A de rata de la SEQ ID NO: 82. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos LIIIIVIVVVLLGILALIIGISVGLK, que corresponde a los restos 264-289 de la SEQ ID NO: 82. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-3A de ratón de la SEQ ID NO: 83. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos LIIIIVVVVVLLGILALIIGLSVGLK, que corresponde a restos 264-289 de la SEQ ID NO: 83. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-3B de ratón de la SEQ ID NO: 84. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIMICCIILAIILASTIG, que corresponde a los restos 265-283 de la SEQ ID NO: 84. En un aspecto de esta realización, una Toxina Clostridial sustrato comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-3C de ratón de la SEQ ID NO: 85. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIMICCIILAIILASTTOGIFA, que corresponde a los restos 247-269 de la SEQ ID NO: 85.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de pollo de la SEQ ID NO: 86. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIIIFVVVLGVVLSPVICGTLGL, que corresponde a los restos 259-282 de la SEQ ID NO: 86. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-2 de pollo de la SEQ ID NO: 87. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos WIIIVSLVLIAVIGIIIGLSVGIR, que corresponde a los restos 263-288 de la SEQ ID NO: 87.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de pez cebra de la SEQ ID NO: 88. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIIICCVILGVVLRSSIGGTLGF, que corresponde a los restos 265-288 de la SEQ ID NO: 88. En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-3 de pez cebra de la SEQ ID NO: 89. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IIIIVSVVLVILAIIALIVGISVGLKR, que corresponde a los restos 262-288 de la SEQ ID NO: 89.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de erizo de mar de la SEQ ID NO: 90. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos YIAICCGVALGILILVLIIVLA, que corresponde a los restos 264-286 de la SEQ ID NO: 90.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de mosca de la fruta de la SEQ ID NO: 91. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMILICLTVLGILAASYVSSYFM, que comprende a los restos 269-291 de la SEQ ID NO: 91.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana of sanguijuela Sintaxina-1A de la SEQ ID NO: 92. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IIILICVSVLILIVGGSLLGIFIP, que corresponde a los restos 272-295 de la SEQ ID NO: 92.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de calamar de la SEQ ID NO: 93. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IAILVCLVILVLVIVSTVGGVFGG, que comprende a los restos 269-292 de la SEQ ID NO: 93.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de caracol de la SEQ ID NO: 94. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMIIICVCVLIIILVGILGGTFG, que corresponde a los restos 268-290 de la SEQ ID NO: 94.

En un aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana de Sintaxina-1A de liebre marina de la SEQ ID NO: 95. En otro aspecto de esta realización, un sustrato de Toxina Clostridial comprende, en parte, el dominio de dirección de membrana que comprende los aminoácidos IMILVCLAILIIILVGVIGGTLG, que corresponde a los restos 268-290 de la SEQ ID NO: 95.

Los sustratos de Toxina Clostridial descritas en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, un primer miembro de un par de FRET. Tal primer miembro de un par de FRET puede ser o bien un fluoróforo donante o un aceptor. De este modo, el sustrato de Toxina Clostridial narrado incluye, en parte, un primer miembro del par de FRET que es o bien fluoróforo donante o un aceptor.

Un primer miembro del par de FRET descrito en la presente memoria descriptiva incluye proteínas fluorescentes. Como se usa en el presente documento, el término "proteína fluorescente" significa a péptido que absorbe la energía de la luz de una cierta longitud de onda y emite energía luminosa de una diferente longitud de onda y abarca los que emiten en una diversidad de espectros, incluyendo violeta, azul, cian, verde, amarillo, naranja y rojo, véase la Tabla 9. Se prevé que proteínas fluorescentes derivada de cualquiera de una diversidad de especies pueden ser útiles en aspectos de la presente invención incluyendo, pero no se limitan a, proteínas fluorescentes de Aequorea, proteínas fluorescentes de Anemonia, proteínas fluorescentes de Anthozoa, proteínas fluorescentes de Discosoma, proteínas fluorescentes de Entacmeae; proteínas fluorescentes de Heteractis, proteínas fluorescentes de Montastrea, proteínas fluorescentes de Renilla, proteínas fluorescentes de Zoanthus, y proteínas fluorescentes de otros organismos. Las proteínas fluorescentes útiles en la invención abarcan, sin limitación, proteínas fluorescentes de tipo salvaje, variantes de origen natural, y variantes modificadas por ingeniería genética, producidas, por ejemplo, mediante mutagénesis diseñada al azar o racional, y fragmentos de péptido activos derivados de un organismo. Proteínas fluorescentes útiles en los aspectos de la invención incluyen, por ejemplo, las que se han modificado por ingeniería genética por comportamiento superior tal como, sin limitación, longitudes de onda alteradas de excitación o emisión; brillo potenciado, resistencia a pH, estabilidad o velocidad de formación de proteína fluorescente; fotoactivación; u oligomerización o blanqueamiento por luz reducida, véase, por ejemplo, Brendan P. Cormack et al., FACS-optimized Mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP), Patente de Estados Unidos Nº 5.804.387 (8 de septiembre de 1998); Roger Y. Tsien y Roger Heim, Modified Green Fluorescent Proteins. Patente de Estados Unidos Nº 6.800.733 (5 de octubre de 2004); Roger Y. Tsien et al., Long Wavelength Engineered Fluorescent Proteins, Patente de Estados Unidos 6.780.975 (24 de agosto de 2004); y Roger Y. Tsien et al., Fluorescent Protein Sensors For Measuring the pH of a Biological Sample, Patente de Estados Unidos 6.627.449 (30 de septiembre de 2003). Se entiende que una proteína fluorescente se puede modificar por ingeniería genética para la expresión de la proteína mejorada mediante conversión de los codones de tipo salvaje a otros codones utilizada más eficazmente en las células que sirven para expresar el sustrato de Toxina Clostridial, véase, por ejemplo, Brian Seed and Jurgen Haas, High Level Expression of Proteins, Patente de Estados Unidos Nº 5.795.737 (18 de agosto de 1998).

También se prevé que cualquiera de una diversidad de fragmentos de proteína activos pueden ser útiles en aspectos de la presente invención con la condición que estos fragmentos activos mantengan la capacidad de emitir energía luminosa en un intervalo adecuado para la operación apropiada de los aspectos de la presente invención, tal como, por ejemplo, 420-460 nm para las proteínas fluorescentes que emiten azul, 460-500 nm para proteínas fluorescentes que emiten cian, 500-520 nm para las proteínas fluorescentes que emiten verde, 520-550 nm para las proteínas fluorescentes que emiten amarillo y para 550-740 nm para las proteínas fluorescentes que emiten rojo. De este modo, aspectos de esta realización puede incluir fragmentos activos de proteínas fluorescentes que mantienen la capacidad de emitir energía luminosa en un intervalo adecuado para la operación apropiada de los aspectos de la presente invención que tienen una longitud de, por ejemplo, al menos 50 aminoácidos, al menos 60 aminoácidos, al menos 70 aminoácidos, al menos 80 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 125 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 175 aminoácidos y al menos 200 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización, pueden incluir fragmentos activos de proteínas fluorescentes que mantienen la capacidad de emitir energía luminosa en un intervalo adecuado para la operación apropiada de los aspectos de la presente invención que tienen una longitud de, por ejemplo, como mucho 50 aminoácidos, como mucho 60 aminoácidos, como mucho 70 aminoácidos, como mucho 80 aminoácidos, como mucho 90 aminoácidos, como mucho 100 aminoácidos, como mucho 125 aminoácidos, como mucho 150 aminoácidos, como mucho 175 aminoácidos y como mucho 200 aminoácidos.

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Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes que se pueden unir de manera operativa a un sustrato de CoNT descrito en la memoria descriptiva incluyen, por ejemplo, fotoproteínas, tal como, por ejemplo, aequorina; obelina; proteínas fluorescentes de Aequorea, tales como, por ejemplo, proteína fluorescente verdes (GFP, EGFP, ACGFP1), proteínas fluorescentes cian (CFP, ECFP), proteínas fluorescentes azules (BFP, EBFP), proteínas fluorescentes rojas (RFP), proteínas fluorescentes amarillas (YFP, EYFP), proteína fluorescente ultravioleta (GFPuv), sus variantes de potenciación de fluorescencia, sus variantes de desestabilización de péptidos, y similares; proteínas fluorescentes de arrecifes de coral, tales como, por ejemplo, proteínas fluorescentes rojas de Discosoma (DsRed, DsRed1, Dared2, y DsRed-Express), fluorescentes rojas de Anemonia (AsRed y AsRed2), proteínas fluorescentes de rojo lejano Heteractis (HcRed, HcRed1), proteínas fluorescentes cian de Anemonia (AmCyan, AmCyan1), proteínas fluorescentes verdes de Zoanthus (ZsGreen, ZsGreen1), proteínas fluorescentes amarillas de Zoanthus (ZsYellow, ZsYellowl), sus variantes de potenciación de fluorescencia, sus variantes de desestabilización de péptido, y similares; proteína fluorescente verde de Renilla reniformis (Vitality hrGFP), sus variantes de potenciación de fluorescencia, sus variantes de desestabilización de péptidos, y similares; y proteínas fluorescentes del Coral gran estrella, tal como, por ejemplo, proteína fluorescente de Montastrea cavemosa (Proteína fluorescente Monster Green®), sus variantes de potenciación de péptidos, sus variantes de desestabilización de péptidos, y similares. Los expertos en la técnica entienden que pueden ser útiles éstas y una diversidad de otras proteínas fluorescentes como una proteína fluorescente en los aspectos de la invención, véase, por ejemplo, Jennifer Lippincott-Schwartz y George H. Patterson, Development and Use of Fluorescent protein Markers in Living Cells, 300 (5616) Science 87-91 (2003); y Jin Zhang et al., 3(12) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 906-918 (2002). Los expertos en la técnica entienden que éstas y muchas otras proteínas fluorescentes, incluyendo especies ortólogas y paralógas de las proteínas fluorescentes de origen natural descritas anteriormente así como proteínas fluorescentes modificadas por ingeniería genética pueden ser útiles como una proteína fluorescente descritas en la memoria descriptiva de la presente invención. Los sustratos de CoNT desvelados en la presente memoria descriptiva que contiene, en parte, tales proteínas fluorescentes se pueden preparar y expresar usando procedimientos convencionales véase, por ejemplo, Living Colors® User Manual PT2040-1 (PRI1Y691), BD Biosciences-Clontech, (26 de noviembre de 2001); BD Living-Colors^{TM} User Manual Volume 11: Reef Coral Fluorescent Proteins, PT3404-1 (PR37085), BD Biosciences-Clontech, (17 de julio de 2003); Monster Green Florescent Protein pHMCFP Vector, TB320, Promega-Corp., (mayo, 2004); y Vitality hrGFP Mammalian Expression Vectors, Instruction Manual (rev. 064007g), Stratagene, Inc.. Los vectores de expresión adecuados para la expresión bacteriana, de mamífero y otra de proteínas fluorescentes están disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales incluyendo BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA); Promega Corp. (Madison, WI) y Stratagene, Inc. (La Jolla, CA).

En una realización, el primer miembro del par de FRET es una proteína fluorescente verde. Como se usa en el presente documento, el término "proteína fluorescente verde" es un sinónimo de "GFP" y significa una proteína que absorbe luz de una cierta longitud de onda y emite un máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-520 nm. Las proteína fluorescentes de color verde útiles en la invención incluyen, sin limitación, la AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143, variantes de AcGFP1 modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos de AcGFP1 que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm, el ZsGreen de la SEQ ID NO: 144, variantes modificadas por ingeniería genética de ZsGreen y sus fragmentos de ZsGreen activos que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm, el EGFP de la SEQ ID NO: 145, variantes modificadas por ingeniería genética de ECFP y sus fragmentos activos de ECFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm, la Proteína fluorescente verde Monster (MGFP) de la SEQ ID NO: 146, variantes modificadas por ingeniería genética MGFP y sus fragmentos activos de MGFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm, la Vitatity® hrGFP de la SEQ ID NO: 147, variantes de hrGFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de hrGFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm, así como, GFP de origen natural, variantes de GFP de origen natural, variantes de GFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de GFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm. Como ejemplos no limitantes, proteínas fluorescentes derivadas de Renilla tales como, por ejemplo, la GFP dimérica de Renilla mulleri, que tiene una excitación estrecha (498 nm) y máximos de emisión (509 nm), véase, por ejemplo, Beau Peelle et al., Characterization and use of green fluorescent proteins from Renilla mulleri and Ptilosarcus guemyi for the human cell display of functional peptides, 20(6) J. Protein Chem. 507-519 (2001); y proteínas fluorescentes derivadas de Aequorea como se desvela en, por ejemplo, Roger Y. Tsien y Roger Heim, Modified green fluorescent proteins, Patentes de Estados Unidos números 5.625.048 (29 de abril de 1997), 6.319.669 (20 de noviembre de 2001), 6.066.476 (23 de mayo de 2000) y 6.800.733 (5 de octubre de 2004).

De este modo, en aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una GFP que emite máximo de luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143, al menos 75% de identidad de identidad de aminoácidos con la AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la con AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho nueve, o diez sustituciones de aminoácido con relación a la AcGFP1 de la SEQ ID NO: 143.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la ZsGreen de la SEQ ID NO: 144, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la ZsGreen de la SEQ ID NO: 144, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la ZsGreen de SEQ ID NO: 144, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la ZsGreen de la SEQ ID NO: 144, al menos 90% de identidad de aminoácido con la ZsGreen de la SEQ ID NO: 144 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la ZsGreen de la SEQ ID NO: 144. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la ZsGreen de la SEQ ID NO: 144.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la EGFP de la SEQ ID NO: 145, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la EGFP de la SEQ ID NO: 145, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la EGFP de la SEQ ID NO: 145, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la EGFP de la SEQ ID NO: 145, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la EGPP de la SEQ ID NO: 145 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la EGFP de la SEQ ID NO: 145. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la EGFP de la SEQ ID NO: 145.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la MGFP de la SEQ ID NO: 146, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la MGFP de la SEQ ID NO: 146, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la MGFP de la SEQ ID NO: 146, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la MGFP de la SEQ ID NO: 146, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la MGFP de la SEQ ID NO: 146 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la MGFP de la SEQ ID NO: 146. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la MGFP de la SEQ ID NO: 146.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la hrGfP de la SEQ ID NO: 147, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la hrGfP de la SEQ ID NO: 147, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la hrGfP de la SEQ ID NO: 147, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la hrGfP de la SEQ ID NO: 147, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la hrGFP de la SEQ ID NO: 147 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la hrGfP de la SEQ ID NO: 147. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una GFP que emite luz en el intervalo de 500-520 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la hrGFP de la SEQ ID NO: 147.

En otra realización, el primer miembro del par de FRET es una proteína fluorescente. Cian Como se usa en el presente documento, el término "proteína fluorescente". Cian es un sinónimo de "CFP" y significa una proteína que absorbe luz de una cierta longitud de onda y emite a máximos de energía luminosa de longitudes de ondas en el intervalo de 460-500 nm. Las proteínas fluorescentes Cian útiles en la invención incluyen, sin limitación, la ECFP de la SEQ ID NO: 148, variantes de ECFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de ECFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 460-500 nm, la AmCyan de la SEQ ID NO: 149, variantes de AmCyan modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de AmCyan que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 460-500 nm, así como, proteínas fluorescentes cian de origen natural, variantes de CFP de origen natural, variantes de CFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de CFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 460-500 nm. Como un ejemplo no limitante, la variante de CFP conocida como "CGFP" contiene una sustitución de Thr203Tyr que cambia la excitación y emisión de longitudes de ondas de la ECFP de la SEQ ID NO: 148 a un intervalo entre CFP y EGFP; y proteínas fluorescentes derivadas de Aequorea como se desvela en, por ejemplo, Roger Y. Tsien y y Roger Heim, Modified Green Fluorescent Proteins, Patentes de Estados Unidos números 5.625.048 (29 de abril de
1997), 6.319.669 (20 de noviembre de 2001), 6.066.476 (23 de mayo de 2000) y 6.800.733 (5 de octubre de 2004).

De este modo, en aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una CFP que emite luz en el intervalo de 460-500 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la ECFP de la SEQ ID NO: 148, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la ECFP de la SEQ ID NO: 148, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la ECFP de la SEQ ID NO: 148, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la ECFP de la SEQ ID NO: 148, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la ECFP de la SEQID NO: 148 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la ECFP de la SEOID NO: 148. en otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una CFP que emite luz en el intervalo de 460-500 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la ECFP de la SEQ ID NO: 148.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una CFP que emite luz en el intervalo de 460-500 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la AmCyan de la SEQ ID NO: 149, al menos 75% identidad de aminoácidos con la AmCyan de la SEQ ID NO: 149, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la AmCyan de la SEQ ID NO: 149, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la AmCyan de la SEQ ID NO: 149, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la AmCyan de la SEQ ID NO: 149 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la AmCyan de la SEQ ID NO: 149. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una CFP que emite luz en el intervalo de 460-500 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la AmCyan de la SEQ ID NO: 149.

En todavía otra realización, el primer miembro del par de FRET es una proteína fluorescente azul. Como se usa en el presente documento, el término "proteína fluorescente azul" es un sinónimo de "BFP" y significa a proteína que absorbe luz de una cierta longitud de onda y emite a máximos de energía luminosa de longitudes de ondas en el intervalo de 420-460 nm. Las proteínas fluorescentes azul útiles en la invención incluyen, sin limitación, la EBFP de la SEQ ID NO: 150, variantes de EBFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de EBFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 420-460 nm, así como, proteínas fluorescentes azules de origen natural, variantes de BFP de origen natural, variantes de BFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de BFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 420-460 nm. Como ejemplos no limitantes, véanse las proteínas fluorescentes derivadas de Aequorea como se desvela en, por ejemplo, Roger Y. Tsien y Roger Heim, Modified Green Fluorescent Proteins, Patentes de Estados Unidos números 5.625.048 (29 de abril de 1997), 6.319.669 (20 de noviembre de2001), 6.066.476 (23 de mayo de 23. 2000) y 6.800.733 (5 de octubre de 2004).

De este modo, en aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una BFP que emite luz en el intervalo de 420-460 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la EBFP de la SEQ ID NO: 150, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la EBFP de la SEQ ID NO: 150, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la EBFP de la SEQ ID NO: 150, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la EBFP de la SEQ ID NO: 150, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la EBFP de la SEQ ID NO: 150 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la EBFP de la SEQ ID NO: 150. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una BFP que emite luz en el intervalo de 420-460 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la EBFP de la SEQ ID NO: 150.

En todavía otra realización, el primer miembro del par de FRET es una proteína fluorescente amarilla. Como se usa en el presente documento, el término "proteína fluorescente amarilla" es un sinónimo de "YFP" y significa a proteína que absorbe luz de una cierta longitud de onda y emite a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 520-550 nm. Las proteínas fluorescentes amarillas útiles en la invención incluyen, sin limitación, la EYFP de la SEQ ID NO: 151, variantes de EYFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos EYFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 520-550 nm, la ZsYellow de la SEQ ID NO: 152. variantes de ZsYellow modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de ZsYellow que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 520-550 nm, así como, YFPs de origen natural, variantes de YFP de origen natural, variantes de YFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de YFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 520-550 nm. Como ejemplos no limitantes, las variantes de YFP "Citine", que contienen sustituciones de Val68Leu y Gln69Met en la YFP de la SEQ ID NO: 151, y "Venus", que contiene sustituciones Phe46Leu, Met153Thr, Val163Ala y Ser175Gly en la YFP de la SEQ ID NO: 151, son YFP extremadamente luminosas y de maduración rápida, véase, por ejemplo, Oliver Griesbeck et al., Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications, 276(31) J. Biol. Chem. 29188-29194 (2001); and Takeharu Nagai et al., A variant of yellow fluorescent proteins with fase and efficient maturation for cell-biological applications, 20(1) Nat. Biotechnol. 87-90 (2002); y proteínas fluorescentes derivadas de Aequorea como se desvela en, por ejemplo, Roger Y. Tsien et al., Long Long Wavelength Engineered Fluorescent Proteins, Patentes de Estados Unidos números 6.124.128 (26 de septiembre de 2000), 6.054.321 (25 de
abril de 2000), 6.077.707 (20 de junio de 2000), 6.403.374 (11 de junio de2002) y 6.780.975 (24 de agosto de 2004).

De este modo, en aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una YFP que emite luz en el intervalo de 520-550 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la YFP de la SEQ ID NO: 151, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la YFP de la SEQ ID NO: 151, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la YFP de la SEQ ID NO: 151, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la YFP de la SEQ ID NO: 151, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la YFP de la SEQ ID NO: 151 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la YFP de la SEQ ID NO: 151. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una YFP que emite luz en el intervalo de 520-550 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la YFP de la SEQ ID NO: 151.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una YFP que emite luz en el intervalo de 520-550 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la ZsYellow de la SEQ ID NO: 152, al menos 75% identidad de aminoácidos con la Zs Yellow de la SEQ ID NO: 152, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la Zs Yellow de la SEQ ID NO: 152, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la Zs Yellow de la SEQ ID NO: 152, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la Zs Yellow de la SEQ ID NO: 152 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la Zs Yellow de la SEQ ID NO: 152. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una YFP que emite luz en el intervalo de 520-550 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la ZsYellow de la SEQ ID NO: 152.

En todavía otra realización, el primer miembro del par de FRET es una red proteína fluorescente roja. Como se usa en el presente documento, el término "proteína fluorescente roja" es un sinónimo de "RFP" y significa una proteína que absorbe luz de una cierta longitud de onda y emite a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 550-740 nm. Las proteínas fluorescentes rojas útiles en la invención incluyen, sin limitación, la Discosoma striata RFP OsRed de la SEQ ID NO: 153, DsRed1 de la SEQ ID NO: 154, DsRed2 de la SEQ ID NO: 155 y DsRed Express de la SEQ ID NO: 156, variantes de DsRed, DsRed1, DsRed2 y DsRed Express modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de DsRed, DsRed1, DsRed2 y DsRed Express que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 550-740 nm; la Heteractis crispa RFP HcRed de la SEQ ID NO: 157, variantes de HcRed modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos HcRed que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 550-740 nm; la Anemonia sulcata RFP AsRed de la SEQ ID NO: 158, variantes de AsRed modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de AsRed que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 550-740 nm, así como, RFP de origen natural, variantes de RFP de origen natural, variantes de RFP modificadas por ingeniería genética y sus fragmentos activos de RFP que mantienen la capacidad de emitir máximos de energía luminosa en el intervalo de 550-740 nm. Como un ejemplo no limitante, proteínas fluorescentes de Entacmeae quadricolor incluyendo proteínas fluorescentes rojas tales como, por ejemplo, eqFP611, véase, por ejemplo, Jörg Wiedenmann et al., Afar-red fluorescent protein with fast maturation and reduced oligomerization tendency from Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria), 99(18) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11646-11651 (2002).

De este modo, en aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la DsRed de la SEQ ID NO: 153, al menos 75% identidad de aminoácidos con la DsRed de la SEQ ID NO: 153, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la DsRed de la SEQ ID NO: 153, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la DsRed de la SEQ ID NO: 153, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la DsRed de la SEQ ID NO: 153 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la DsRed de la SEQ ID NO: 153. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET is a RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la DsRed of SEQ ID NO: 153.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la DsRed1 de la SEQ ID NO: 154, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la WsRedt de la SEQ ID NO: 154, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la DsRed1 de la SEQ ID NO: 154, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la DsRed1 de la SEQ ID NO: 154, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la DsRed1 de la SEQ ID NO: 154 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con the DsRed1 de la SEQ ID NO: 154. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la DsRed1 de la SEQ ID NO: 154.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la DsRed2 de la SEQ ID NO: 155, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la DsRed2 de la SEQ ID NO: 155, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la DsRed2 de la SEQ ID NO: 155, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la DsRed2 de la SEQ ID NO: 155, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la DsRed2 de la SEQ ID NO: 155 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la DsRed2 de la SEQ ID NO: 155. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la DsRed2 de la SEQ ID NO: 155.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una RPF que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la DsRed2 de la SEQ ID NO: 156, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la DsRed Express de la SEQ ID NO: 156, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la DsRed Express de la SEQ ID NO: 156, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la DsRed Express de la SEQ ID NO: 156, al menos 90% identidad de aminoácidos con la DsRed Express de la SEQ ID NO: 156 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la DsRed Express de la SEQ ID NO: 156. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la DsRed Express de la SEQ ID NO: 156.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una RPF que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la AsRed de la SEQ ID NO: 158, al menos 75% identidad de aminoácidos con la AsRed de la SEQ ID NO: 158, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la AsRed de la SEQ ID NO: 158, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la AsRed de la SEQ ID NO: 158, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la AsRed de la SEQ ID NO: 158 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la AsRed de la SEQ ID NO: 158. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la AsRed de la SEQ ID NO: 158.

En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una RPF que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la HcRed de la SEQ ID NO: 157, al menos 75% identidad de aminoácidos con la HcRed de la SEQ ID NO: 157, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la HcRed de la SEQ ID NO: 157, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la HcRed de la SEQ ID NO: 157, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la HcRed de la SEQ ID NO: 157 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la HcRed de la SEQ ID NO: 157. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET is a RFP que emite luz en el intervalo de 550-740 nm que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la HcRed of SEQ ID NO: 157.

Un primer miembro del par de FRET descrito en la presente memoria descriptiva incluye proteínas de unión a fluoróforo que están posteriormente marcadas con un fluoróforo. Una proteína de unión a fluoróforo establece un enlace covalente, o fuerte interacción no covalente, con el fluoróforo es una reacción selectiva química o bioquímica. Los ejemplos no limitantes de proteínas de unión a fluoróforo y fluoróforos correspondientes incluyen el sistema bis-arsenical, véase, por ejemplo, B. Albert Griffin et al., Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. 281(5374) Science 269-272 (1998); and B. Albert Griffin et al., Fluorescent labeling of recombinant proteins in living células with FlAsH, 327 Methods Enzymol. 565-578 (2000); el sistema alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT), véase, por ejemplo, Antje Keppler et al, A General Method for the Covalant Labelling of Fusion proteins with Small Molecules in vivo, 21(1) Nat. Biotech 86-89 (2003); Antje Keppler et al, Labeling of fusion proteins of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase with small molecules in vivo and in vitro, 32(4) Methods 437-444 (2004); and Antje Keppler et al, Labeling of Fusion Proteins with Synthetic Fluorophore in Live cells, 101(27) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9955-9959 (2004); y el sistema de deshalogenasa. Además, los ejemplos no limitantes de proteínas de unión a fluoróforo y fluoróforos correspondientes, así como reactivos bien caracterizados, condiciones y protocolos están fácilmente disponibles a partir de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, TC-FlAsH^{TM} TC-ReAsH^{TM} In-Cell Tetracisteína Tag Detection Kit (Invitrogin Corp., Carlsbad, CA); SNAP-tag^{TM} multi-purpose protein tag system (Covalys Biosciences AG, Suiza); y HaloTag^{TM} Interchangeable Labeling Technology (Promega Corp., Madison WI). Estos protocolos son procedimientos de rutina están bien del alcance de y enseñanza de los expertos en la técnica en el presente documento.

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El sistema bis-arsenical tetracisteína comprende una proteína de fusión incluyendo la proteína de interés y un hexapéptido de tetracisteína que comprende la secuencia de aminoácidos C-C-X-X-C-C (SEQ ID NO: 182) y un bis-arsenical fluoróforo que forma complejo con dos restos ditiol. En la reacción de etiquetado, el péptido de tetracisteína displaza los ditioles de los restos arsénico del fluoróforo. Esta interacción acoplamente fuertemente el fluoróforo con la proteína de unión a fluoróforo e incrementa de manera significativa la señal mediante reducción de la inactivación del fluoróforo. Los ejemplos no limitantes de fluoróforos bisarsenicales incluyen derivados biarsenicales no fluorescentes de fluoresceína, tal como, por ejemplo, FlAsH y derivados biarsenicales no fluorescentes de resorufina, tal como, por ejemplo, ReAsH.

El sistema de AGT comprende una proteína de fusión incluyendo la proteína de interés y un polipéptido de AGT 22 kDa modificado (SEQ ID NO: 183) una bencil guanina modificada en la posición para por una etiqueta fluorescente. En la reacción de etiquetado, la posición O6 de la bencil guanina para-sustituida se une de manera irreversible a una cisteína reactiva en el centro activo de AGT. Los ejemplos no limitantes de los fluoróforos de bencilguanina enumerados en la Tabla 10.

El sistema de deshalogenasa comprende una proteína de fusión incluyendo la proteína de interés y una deshalogenasa modificada y un fluoróforo modificado que comprende un resto alquilo. En la reacción de etiquetado, el fluoróforo modificado interactúa fuertemente con el sitio activo de la deshalogenasa modificada. La deshalogenasa modificada es un polipéptido de 33 kDa (SEQ ID NO: 184) que comprende una mutación en el centro activo que de manera significativa reduce la actividad catalítica de la enzima, creando de manera eficaz una interacción irreversible. Los ejemplos no limitantes de fluoróforos de bencilguanina modificados se enumeran en la Tabla 10.

De este modo en una realización, el primer miembro del par de FRET es una proteína de unión a fluoróforo que interactúa fuertemente con un fluoróforo. En otra realización, el primer miembro del par de FRET es un péptido de tetracisteína que interactúa fuertemente con un fluoróforo. En un aspecto de esta realización, el primer miembro del par de FRET es un péptido de tetracisteína comprende la SEQ ID NO: 182 que interactúa fuertemente con un fluoróforo. En otro aspecto de esta realización, el primer miembro del par de FRET es un péptido de tetracisteína que interactúa fuertemente con un derivado biarsenical no fluorescente de fluoresceína. En otro aspecto de esta realización, el primer miembro del par de FRET es un péptido de tetracisteína que interactúa fuertemente con un derivado biarsenical no fluorescente de resorufina.

De este modo, en una realización, el primer miembro del par de FRET es un polipéptido de AGT que interactúa fuertemente con un fluoróforo. En un aspecto de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una AGT que interactúa fuertemente con un fluoróforo comprende SEQ ID NO: 183. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser un AGT que interactúa fuertemente con un fluoróforo que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la AGT de la SEPA ID NO: 183, al menos 75% de identidad de aminoácidos con el AGT de la SEQ ID NO: 183, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la AGT de la SEQ ID NO: 183, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la AGT de la SEQ ID NO: 183, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la AGT de la SEQ ID NO: 183 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la AGT de la SEQ ID NO: 183. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una AGT que interactúa fuertemente con un fluoróforo que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácido con relación a la AGT de la SEQ ID NO: 183. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una AGT que interactúa fuertemente con un derivado para-sustituido de bencil guanina que comprende una dietilaminocumarina, una diacetilfluoresceína, un dyomic DY-505-05, un ATTO 488, un ATTO 532, a DY-547, una tetrametilrodamina, un ATTO 600, a dyomic DY-632, a dyomic DY-647, a dyomic DY-732 o un dyomic DY-747.

De este modo, en una realización, el primer miembro del par de FRET es un polipéptido de deshalogenasa que interactúa fuertemente con un fluoróforo. En un aspecto de esta realización, el primer miembro del par de FRET es deshalogenasa que interactúa fuertemente con un fluoróforo comprende SEQ ID NO: 184. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET puede ser una deshalogenasa que interactúa fuertemente con un fluoróforo que tiene, por ejemplo, al menos 70% de identidad de aminoácidos con la deshalogenasa de la SEQ ID NO: 184, al menos 75% de identidad de aminoácidos con la deshalogenasa de la SEQ ID NO: 184, al menos 80% de identidad de aminoácidos con la deshalogenasa de la SEQ ID NO: 184, al menos 85% de identidad de aminoácidos con la deshalogenasa de la SEQ ID NO: 184, al menos 90% de identidad de aminoácidos con la deshalogenasa de la SEQ ID NO: 184 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la deshalogenasa de la SEQ ID NO: 184. En todavía otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una deshalogenasa que interactúa fuertemente con un fluoróforo que tiene, por ejemplo, como mucho uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez sustituciones de aminoácidos con relación a la deshalogenasa de la SEQ ID NO: 184. En otros aspectos de esta realización, el primer miembro del par de FRET es una deshalogenasa que interactúa fuertemente con un derivado de cumarina tal como HaloTag Cumarina, un derivado de fluoresceína tal como HaloTag diAcFAM o un derivado de tetrametil rodamina tal como HaloTag TMR.

Las composiciones y procedimientos de la presente memoria descriptiva proporcionan una célula que comprende, en parte, un segundo miembro asociado a membrana del par de FRET. Tal Segundo miembro de un par de FRET puede ser o bien fluoróforo donante o un aceptor. De este modo, el par de FRET mencionado comprende, en parte, un segundo miembro del par de FRET que es o bien un fluoróforo donante o un aceptor.

Un segundo miembro asociado a membrana del par de FRET descrito en la presente memoria descriptiva incluye colorante lipófilos. Los colorantes lipófilos útiles en la invención incluyen, sin limitación, sondas anfifílicas que son moléculas que contienen un fluoróforo cargado que localiza la sonda en la superficie de la membrana y un lipófilo alifático "cola" que se inserta en la membrana y por lo tanto ancla la sonda a la superficie de la membrana. Las características de los colorantes lipófilos representativos se resumen en la Tabla 11. Los procedimientos para el etiquetado celular con colorantes lipófilos son bien conocidos en la técnica como se desvela, por ejemplo, en Wouterlood (Ed.), Neuroscience Protocols páginas 1-20 Elsevier Science Publishers (1993); y Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 6ª Edición, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, 1996.

Los colorantes lipófilos útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, colorantes lipófilos de carbocianina que incluyen carbocianinas de cadena corta con colas alquilo cortas de menos de 7 átomos de carbono, las dialquilcarbocianinas de cadena larga, que tienen al menos 12 carbonos en su cola alquilo, y colorantes dialqulaminoestirilo. Los colorante lipófilos de carbocianina son colorantes que absorben luz muy fuertemente que difunden lateralmente para teñir las células enteras y se conservarán bien en las membranas celulares. Además, estos colorantes son fluorescente débilmente en agua todavía poseen señales de mucho brillo con altos coeficientes de extinción. Las sondas de membrana de carbocianina usadas ampliamente incluyen las octadecil (C18) indocarbocianinas, Dil y DiD, tiacarbocianinas (DiS) oxacarbocianinas DiO. DiO emiten fluorescencia verde; Dil, fluorescencia naranja-rojo; y DiD, fluorescencia de rojo lejano.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los colorantes lipófilos de carbocianina útiles en la invención incluyen, sin limitación, octadecil indocarbocianinas tales como, por ejemplo, DilC_{18} (3) y oxacarbocianinas tales como, por ejemplo, DiOC_{18} (3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Las octadecil indocarbocianinas y oxacarbocianinas se diagnostican DilC_{18} (3) y DiOC_{18} (3) respectivamente, donde el subíndice es el número de átomos de carbono en cada cola de alquilo y el número entre paréntesis es el número de átomos de carbono en el puente entre los sistemas de anillo de indolina o benzoxazol. Las indocarbocianinas y las oxacarbocianinas útiles en la invención incluyen, sin limitación Dil y análogos de DiO con cola de alquilos no saturados tales como \Delta^{9}-Dil, FAST DiO y FAST Dil (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); Dil y análogos de DiO con cola de alquilos más corta tales como DilC_{12}(3), DilC_{16} (3) y DiOC_{16}(3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); carbocianinas excitables por la luz de larga longitud de onda tales como, por ejemplo, DilC_{18}(5) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); carbocianinas excitables por la luz de infrarroja tales como, por ejemplo, DilC_{18}(7) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); y derivados fenil sustituidos y sulfonados de Dil y DiO. Las sustituciones útiles incluyen las hechas sobre los sistemas de anillo de indolina o benzoxazol; tales derivados hechos mantienen las colas de octadecilo idénticas a las de Dil o DiO e incluyen, sin limitación, derivados de clorometilbenzamido Dil tales como CellTracker CM-Dil (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); derivados de difenil Dil tales como 5,5'-Ph2-DilC_{18}(3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); y derivados de sulfofenil aniónico tales como SP-DilC_{18}(3) y SP-DiOC_{18}(3); o derivados de sulfonato tales como DilC_{18}(3)-DS y DilC_{18}(S)-DS (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Las tiacarbocianinas útiles en la invención incluyen, sin limitación DiSBAC2(3) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Otras carbocianinas útiles en la invención incluyen, sin limitación yoduro de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1), yoduro de 3,3'-dimetil-naftoxacarbocianina (JC-9) y carbonil cianuro 3-clorofenilhidrazona (CCCP) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

Las características de una diversidad de colorantes lipófilos de carbocianina se resumen en la Tabla 11. Las carbocianinas lipófilos se conocen bien en la técnica como se revisa en, por ejemplo, Wolf, "Probing the Lateral Organization and Dynamics of Membranes", Spectroscopic Membrane Probes, Vol. I, Loew, Ed. p. 193-220 (1988). Como se sabe bien, las propiedades espectrales de dialquilcarbocianinas son ampliamente independientes de la longitud de las cadenas alquilo, siendo determinadas en lugar de por los heteroátomos en los sistemas de anillo terminal y la longitud del puente de conexión.

Los colorante lipófilos útiles en la invención además abarcan, sin limitación, colorantes lipófilos de aminoestirilo y colorantes de espirilo anfifílicos. Los colorantes de aminoestirilo incluyen, sin limitación, colorantes de dialquilaminoestirilo, que se insertan en las membranas sus dos colas de alquilo y su fluoróforo en general orientado paralelo a las cadenas acilo de fosfolípidos. Los colorantes lipófilos de aminoestirilo incluyen 4-Di-10-ASP-(D291); DiA,D3883andFASTDiA (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

Los colorantes lipófilos útiles en la invención además abarcan, sin limitación, una sonda anfifílica que comprende derivados de una rodamina, una fluoresceína una cumarina con un lipófilo "cola". Los ejemplos no limitantes de tales sondas anfifílicas incluyen octadecil rodamina B; fluoresceínas, tales como, por ejemplo, 5-Dodecanoylaminofluoresceína, 5-hexadecanoilamino fluoresceína, 5-octadecanoil-aminofluorescein y el octadecil éster de fluoresceína; y 4-heptadecil-7-hidroxicumarina.

Los colorantes lipófilos útiles en la invención además abarcan, sin limitación, una sonda anfifílica que comprende 1,6-Difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH) o derivados de DPH con un lipófilo "cola". Los ejemplos no limitantes de tales sondas anfifílicas incluyen 1,6-Difenil-1,3,5-hexatieno (DPH), 1-(4-trimetilamoniofenil)-6-fenil-1,3,5-hexatrieno p-toluenosulfonato (TMA-DPH), N-((4-(6-fenil-1,3,5-hexatrienil)fenil)propil)trimetilamonio p-toluenosulfonato (TMAP-DPH), ácido Dapoxil sulfónico 3-(4-(6-fenil)-1,3,5-hexatrienil)fenilpropiónico (ácido propiónico de DPH).

Los colorantes lipófilos adicionales útiles en la invención además abarcan, sin limitación, una sonda no polar que comprende una molécula de BODIPY con un lipófilo "cola". Los ejemplos no limitantes de tales sondas no polares incluyen BODIPY 493/503, BODIPY 505/515, BODIPY 665/676, BODIPY FL C5-ceramida y CellTrace BODIPY TR metil éster. Otros colorantes lipófilos útiles en la invención además abarcan, sin limitación, una sonda no polar que comprende un colorante fenoxazina rojo nilo, un 1,3-Bis-(1-pireno)propano o molécula de bimane azida con un lipófilo "cola".

Los colorantes lipófilos adicionales útiles en la invención además abarcan, sin limitación, una sonda de membrana con desplazamientos espectrales sensibles al ambiente con un lipófilo "cola". Los ejemplos no limitantes de tales sondas de membrana incluyen derivados de dapoxilo, tales como, por ejemplo, ácido dapoxil sulfónico acid; 6-propionil-2-dimetilaminonaftaleno (prodan), 6-dodecanoil-2-dimetilaminonaftaleno (laurdan), 6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrilodan), 6-bromoacetil-2-dimetilaminonaftaleno (badan); anilinonaftalensulfonato (ANS) y sus derivados, tales como, por ejemplo, ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (1,8-ANS), ácido 2-anilinonaftaleno-6-sulfónico (2,6-ANS), ácido 2-(p-toluidinil)naftaleno-6-sulfónico (2,6-TNS), ácido 4,4'-dianilino-1,1'-binaftil-5,5'-disulfónico (bis-ANS); 4-(dicianovinil)julolidina (DCVJ); y ácido 4-amino-4'-benzamidostilbeno-2,2'-disulfónico (MBDS o BADS).

Los colorantes lipófilos adicionales útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, cationes lipófilo tales como octadecil rodamina, y colorantes FM tales como dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(dibutilamino)estiril)piridinio (FM® 1-43), dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(dipentilamino)estiril)piridinio (FM® 1-84), dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(dietilamino)estiril)piridinio (FM® 2-10) dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(6-(4-(dietilamino)fenil)hexatrienil)piridinio (FM® 4-64), dibromuro de N-(3-trimetilamoniopropil)-4-(6-(4-(dietilamino)fenil)hexatrienil)piridinio (FM® 5-95), dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(4-(dietilamino)fenil)butadienil)piridinio (RH 414) y sus derivados (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); conjugados de fosfolípidos fluorescentes tales como NBD-PE (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), que se pueden emparejar con aceptores de rodamina tales como rodamina DHPE y Texas Red DHPE; sondas de serie de lípidos, que son insolubles en detergentes, esfingolípidos y microdominios de membrana de colesterol que forman ensamblajes laterales en la membrana plasmática y están disponibles a partir de Molecular Probes as Vybrant Lipid Raft Labeling Kits; los colorantes de respuesta rápida y de respuesta lenta para sondas potenciales de membrana y de membrana sensibles a ambientalmente. Los expertos en la técnica entienden y que otros colorantes lipófilos también pueden ser útiles en la
invención.

En una realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un DiO. Como se usa en el presente documento, el término "DiO" significa un colorante lipófilo que absorbe máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 425-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm. Los colorantes de DiO útiles en la invención incluyen, sin limitación, FAST DiO y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 425-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm; DiOC_{18}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 425-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm; DiOC16(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 425-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm; y SP-DIOC_{18}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 425-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-520 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un DiA. Como se usa en el presente documento, el término "DiA" significa un colorante lipófilo que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 600-620 nm. Los colorantes DiA útiles en la invención incluyen, sin limitación, 4-Di-16-ASP y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 600-620 nm; FAST DiA y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 600-620 nm; y 4-Di-10-ASP y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 600-620 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un DiS. Como se usa en el presente documento, el término "DiS" significa colorante lipófilo que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 510-550 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 540-580 nm. Los colorantes DiS útiles en la invención incluyen, sin limitación, DiSBAC2(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 525-545 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 550-570 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un Dil. Como se usa en el presente documento, el término "Dil" significa un colorante lipófilo que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm. Los colorante Dil útiles en la invención incluyen, sin limitación, DilC_{18}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; DilC_{16}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; DilC_{12}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; FAST Dil y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-500 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; \Delta^{9}-Dil y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; FM® Dil y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; CellTracker CM-Di; y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emiten máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; DilC_{18}(3)-DS y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; SP-DilC_{18}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm; y Br2-DilC_{18}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 500-560 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 560-580 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un 5,5'-Ph2-DilC_{18}(3). Como se usa en el presente documento, el término "5,5'-Ph2-DilC_{18}(3)" significa un colorante lipófilo análogo de Dil que absorbe máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 520-590 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 590-620 nm. Los colorantes 5,5'-Ph2-DilC_{18}(3) útiles en la invención incluyen, sin limitación, 5,5'-Ph2-DilC_{18}(3) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 520-590 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 590-620 nm.

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En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un DiD. Como se usa en el presente documento, el término "DiD" significa un colorante lipófilo que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 575-660 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 660-680 nm. Los colorantes DiD útiles en la invención incluyen, sin limitación, DilC_{18}(5) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 575-660 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 660-680 nm; y DilC_{18}(5)-DS y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 575-660 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 660-680 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un DiR. Como se usa en el presente documento, el término "DiR" significa un colorante lipófilo que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 725-770 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 770-790 nm. Los colorantes DiR útiles en la invención incluyen, sin limitación, DilC18(7) y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 725-770 nm y emiten máximos de energía luminosa en el intervalo de 770-790 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un derivado de rodamina, fluoresceína o cumarina. Tales colorantes útiles en la invención incluyen, sin limitación, 4-heptadecil-7-hidroxicumarina que absorbe máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 360-380 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 440-460 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un DPH o un derivado de DPH. Como se usa en el presente documento, el término "DPH" significa un colorante lipófilo que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 340-370 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 420-460 nm. DPH útiles en la invención incluyen, sin limitación, DPH que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 340-360 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 440-460 nm; y TMA-DPH que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 350-370 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 420-440 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un derivado de dapoxilo. Como se usa en el presente documento, el término "derivado de dapoxilo"significa un colorante lipófilo que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 350-400 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 490-530 nm. Los colorantes de derivado de Dapoxilo útiles en la invención incluyen, sin limitación, 6-propionil-2-dimetilaminonaftaleno (prodan) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 350-370 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 490-510 nm; 6-dooecanoil-2-dimetilaminonaftaleno (laurdan) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 355-375 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 490-510 nm; 6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrilodan) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 380-400 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 490-510 nm; 6-bromoacetil-2-dimetilaminonaftaleno (badan) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 380-400 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 510-530 nm; y ácido dapoxil sulfónico que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 350-370 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 510-530 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un anilinonaftaleno sulfonato (ANS) y derivados de ANS. Como se usa en el presente documento, el término "ANS" significa a colorante lipófilo que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 310-405 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 410-510 nm. Los colorantes ANS útiles en la invención incluyen, sin limitación, ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (1,8-ANS) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 360-380 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 470-490 nm, ácido 2-anilinonaftaleno-6-sulfónico (2,6-ANS) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 310-330 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 410-430 nm; ácido 2-(p-toluidinil)naftaleno-6-sulfónico (2,6-TNS) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 310-330 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 430-450 nm; y ácido 4,4'-dianilino-1,1'-binaphtil-5,5'-disulfónico (bis-ANS) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 385-405 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 490-510 nm.

En todavía otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser 4-(dicianovinil)julolidina (DCVJ) que absorbe a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 445-465 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 480-500 nm.

En otra realización, el segundo miembro del par de FRET puede ser un colorante FM. Los colorantes FM útiles en la invención incluyen, sin limitación, FM® 1-43 y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-525 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 590-610 nm; FM® 1-84 y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-525 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 610-640 nm; FM® 2-10 y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-525 nm y emiten a máximos de energía luminosa en el intervalo de 610-640 nm; RH 414 y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 400-525 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 610-640 nm; FM® 4-64 y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 425-575 nm y emite a máximos de energía luminosa en el intervalo de 730-770 nm; y FM® 5-95 y sus análogos que absorben a máximos de energía luminosa de longitudes de onda en el intervalo de 425-575 nm y emiten máximos de energía luminosa en el intervalo de 720-740 nm.

Los sustratos de Toxina Clostridial desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, un primer miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). Como se usa en el presente documento, el término "par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia", es un sinónimo de "par de FRET" y significa un fluoróforo donante y un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone al espectro de emisión del fluoróforo donante. Se entiende que, cuando el primer miembro del par FRET es un fluoróforo donante, el segundo miembro del par será un aceptor. De manera similar, cuando el primer miembro del par de FRET es un aceptor, el segundo miembro del par será un fluoróforo donante.

Como se usa en el presente documento, el término "fluoróforo donante" significa una molécula que, cuando se irradia con luz de una cierta longitud de onda, emite luz, también denominada fluorescencia, de una diferente longitud de onda. El término fluoróforo es sinónimo en la técnica del término "fluorocromo". Como se usa en el presente documento, el término "aceptor" significa una molécula que puede absorber energía de un fluoróforo donante y es un término que abarca fluoróforos así como moléculas no fluorescentes. Como se usa en el presente documento, el término "absorbe" es un sinónimo del término "excita" y el término "absorbancia" es un sinónimo del término "excitación". Un aceptor útil en la invención tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión del fluoróforo donante. Un aceptor útil en la invención en general tiene bastante menor absorción a una longitud de onda adecuada para excitación del fluoróforo donante. Como se ha establecido anteriormente, un aceptor tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión del fluoróforo donante. El término "que se superpone", como se usa en el presente documento con referencia al espectro de absorbancia de un aceptor y el espectro de emisión de un fluoróforo donante, significa un espectro de absorbancia y espectro de emisión que son parcialmente o completamente compartidos. De este modo, en tales espectros de superposición, el extremo superior del intervalo del espectro de emisión del fluoróforo donante es mayor que el extremo inferior del intervalo de espectro de absorbancia del aceptor.

En un sustrato de Toxina Clostridial útil en la invención, el fluoróforo donante y aceptor se seleccionan de manera que el fluoróforo donante y aceptor muestran transferencia de energía de resonancia cuando el fluoróforo donante se excita. Un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) comprende un fluoróforo donante y un aceptor cuando la superposición entre los espectros de emisión del fluoróforo donante y el espectro de absorbancia del aceptor es suficiente para permitir FRET.

La presente invención depende, en parte, de FRET, que es un proceso químico mediante el que la energía se transfiere de manera no radiada de un fluoróforo donante excitado a un aceptor, que puede ser otro fluoróforo, mediante acoplamiento intramolecular dipolo-dipolo de amplio intervalo. FRET depende de manera inversa a la sexta potencia de la separación intramolecular del fluoróforo donante y aceptor, y para una transferencia eficaz, el fluoróforo donante y aceptor están en proximidad cercana, separado, por ejemplo, en aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 100 \ring{A}. La transferencia de energía eficaz depende de las características espectrales del fluoróforo donante y aceptor así como su orientación relativa. Para la transferencia eficaz sobre 10 a 100 A, la producción cuantitativa del fluoróforo donante en general es al menos 0,1, y el coeficiente de absorción del aceptor en general es al menos 1000, véase, por ejemplo, Clegg, 6 Curr. Opin. Biotech. 103-110 (1995); y Selvin, 7 Nat. Struct. Biol. 730-734 (2000). Un factor a considerar en la elección del par fluoróforo donante/aceptor es la eficacia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor.

Como se conoce bien en la técnica, la eficacia de FRET depende de la distancia de separación y la orientación del fluoróforo donante y aceptor como se desvela por la ecuación de Förster, así como el rendimiento cuantitativo fluorescente del fluoróforo donante y la superposición energética con en aceptor. En particular, la eficacia de (E) de FRET se puede determinar como sigue: E = 1 - F_{DA}/F_{D} = 1/(1 + (R/R_{0})^{6}), donde F_{DA} y F_{D} son las intensidades de fluorescencia del fluoróforo donante en la presencia y ausencia del aceptor, respectivamente, y R es la distancia entre el fluoróforo donante y el aceptor.

El radio de Förster (Ro) es la distancia a la que la transferencia de energía de resonancia es un 50% eficaz, esto es, 50% de fluoróforos donantes excitados se desactivan mediante FRET, véase, por ejemplo, Förster, 2 Ann. Physik 55-75 (1948). La magnitud del radio de Förster depende del rendimiento cuantitativo del fluoróforo donante; el coeficiente de extinción del aceptor; y la superposición entre el espectro de emisión del fluoróforo donante y el espectro de excitación del aceptor

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donde

\kappa^{2} = factor de orientación de dipolo (intervalo 0 a 4; \kappa2 = 2/3 donantes y aceptores orientados al azar)

QY_{D} = rendimiento cuantitativo de fluorescencia del donante en la ausencia del aceptor

n = índice de refracción

J(\lambda) = superposición espectral integral = \int_{EA}(\lambda) \cdot FD(A) \cdot \lambda^{4}d\lambda cm^{3}M^{-1}, donde \varepsilon_{A} = coeficiente de extinción del aceptor

F_{D} = intensidad de emisión de fluorescencia del donante como una fracción de la intensidad integrada total.

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Cualquiera de un número de fluoróforos donantes y aceptores en diversas combinaciones pueden estar incluidos en un sustrato de Toxina Clostridial útil en la invención. un fluoróforo donante en general se selecciona de tal manera que existe una superposición de espectro substancial entre el espectro de emisión del fluoróforo donante y el espectro de excitación del aceptor. Además, un fluoróforo donante se puede seleccionar, por ejemplo, para que tenga un máximo de excitación cerca de una frecuencia de láser conveniente tal como Helio-Cadmio 442 nm o argón 488 nm, ya que la luz de láser sirve como un medio conveniente y eficaz excita el fluoróforo donante.

De este modo, en una realización, la distancia entre el centro del fluoróforo donante y el centro del aceptor es aproximadamente 10 \ring{A}. En otra realización, la distancia entre el centro del fluoróforo donante y el centro del aceptor es aproximadamente 50 \ring{A}. En otra realización, la distancia entre el centro del fluoróforo donante y el centro del aceptor es aproximadamente 100 \ring{A}. En aspectos de esta realización, la distancia entre el centro del fluoróforo donante y el centro del aceptor puede ser, por ejemplo, al menos 10 \ring{A}, al menos 20 \ring{A}, al menos 30 \ring{A}, al menos 40 \ring{A}, al menos 50 \ring{A}, al menos 60 \ring{A}, al menos 70 \ring{A}, al menos 80 \ring{A}, al menos 90 \ring{A} o al menos 100 \ring{A}. En otros aspectos de esta realización, la distancia entre el centro del fluoróforo donante y el centro del aceptor puede ser, por ejemplo, como mucho 10 \ring{A}, como mucho 20 \ring{A}, como mucho 30 \ring{A}, como mucho 40 \ring{A}, como mucho 50 \ring{A}, como mucho 60 \ring{A}, como mucho 70 \ring{A}, como mucho 80 \ring{A}, como mucho 90 \ring{A} o como mucho 100 \ring{A}.

En otra realización, la eficacia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor es aproximadamente 10%. En otra realización, la eficacia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor es aproximadamente 50%. En otra realización, la eficacia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor es aproximadamente 100%. En aspectos de esta realización, la eficacia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor puede ser, por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 100%. En otros aspectos de esta realización, la eficacia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor puede ser, por ejemplo, como mucho 10%, como mucho 20%, como mucho 30%, como mucho 40%, como mucho 50%, como mucho 60%, como mucho 70%, como mucho 80%, como mucho 90% o como mucho 100%.

En otra realización, el máximo de longitud de onda del espectro de emisión del aceptor es aproximadamente 10 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo donante. En otra realización, el máximo de longitud de onda del espectro de emisión del aceptor es aproximadamente 50 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo donante. En otra realización, el máximo de longitud de onda del espectro de emisión del aceptor es aproximadamente 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo donante. En aspectos de esta realización, el máximo de longitud de onda del espectro de emisión del aceptor es mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo donante en, por ejemplo, al menos 10 nm, al menos 20 nm, al menos 30 nm, al menos 40 nm, al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm o al menos 100 nm. En otros aspectos de esta realización, el máximo de longitud de onda del espectro de emisión del aceptor es mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo donante en, por ejemplo, como mucho 10 nm, como mucho 20 nm, como mucho 30 nm, como mucho 40 nm, como mucho 50 nm, como mucho 60 nm, como mucho 70 nm, como mucho 80 nm, como mucho 90 nm o como mucho 100 nm.

En otra realización, la superposición espectral entre el fluoróforo donante y aceptor es aproximadamente 10%. En otra realización, la superposición espectral entre el fluoróforo donante y aceptor es aproximadamente 50%. En otra realización, la superposición espectral entre el fluoróforo donante y aceptor es aproximadamente 80%. En aspectos de esta realización, la superposición espectral entre el fluoróforo donante y aceptor puede ser, por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% o al menos 80%. En otros aspectos de esta realización, la superposición espectral entre el fluoróforo donante y aceptor puede ser, por ejemplo, como mucho 10%, como mucho 20%, como mucho 30%, como mucho 40%, como mucho 50%, como mucho 60%, como mucho 70% o como mucho 80%.

En otra realización, la diferencia entre los máximos de energía luminosa emitida por el fluoróforo donante y los máximos de energía luminosa absorbidos por el aceptor puede ser, por ejemplo, al menos 25 nm, al menos 50 nm, al menos 75 nm o al menos 100 nm. En otra realización, la diferencia entre los máximos de energía luminosa emitida por fluoróforo donante y los máximos de energía luminosa absorbida por el aceptor puede ser, por ejemplo, como mucho 25 nm, como mucho 50 nm, como mucho 75 nm o como mucho 100 nm.

Los ejemplos no limitantes de pares de FRET incluyen, EBFP, ECFP, AmCyan o HaloTag Cumariana como fluoróforo donante y DiOC_{18}(3), DiOC_{16}(3), SP-DiOC_{18} (3), 4Di-16-ASP, FAST DiA o 4-Di-10-ASP como aceptor; DPH, TMA-DPH o 2,6-TNA como fluoróforo donante y ECFP, AmCyan, AcGFP o AGT/BG-430 como aceptor; AcGFP, ZsGreen, Vitality hrGFP, EGFP o Monster Green como fluoróforo donante y DiSBAC2(3), DilC18 (3), FM 1-84, FM 2-10 o RH 414 como aceptor, DPH, laurdan o bis-ANS como fluoróforo donante y AmCyan, AcGFP, ZsGreen, Vitality hrGFP, EGFP, Monster Green, tetracisteína/FlAsH, AGT/BG-DAF, AGT/BG-505, AGT/BG-488 o HaloTag diAcFAM como aceptor, Monster Green, EYFP, ZsYellow, tetracisteína/FlAsH, AGT/BG-DAF, AGTBG-505, AGT/BG-488 o HaloTag diAcFAM como fluoróforo donante y FM 1-84, DiSBAC2(3), DilC18 (3), DilC16 (3), DilC12 (3), FAST Dil, DilC18 (3)-DS o SP-DilC18 (3) como aceptor; FAST DiO, DiOC18 (3), DiOC16 (3), SP-DiOC18 (3), laurdan o bis-ANS como fluoróforo donante y Monster Green, EYFP, ZsYellow, tetracisteína/FlAsH, AGT/BG-DAF, AGT/BG-505, AGT/BG-488 o HaloTag diAcFAM como aceptor, DsRed, Ds-Red2, Ds-Red Express, AGT/BG-547, AGT/TMR-Star o HaloTag TMR como fluoróforo donante y FM Dil, DilC18 (3)-DS, SP-DilC18 (3) o Br2-DilC18 (3) como aceptor; DiSBAC2(3), DilC18 (3), DilC16 (3), DilC12 (3) o FAST Dil como fluoróforo donante y DsRed, Ds-Red2 o Ds-Red Express como aceptor; y DiSBAC2(3), DilC18 (3), DilC16 (3), DilC12 (3), FAST Dil, FM Dil, DilC18 (3)-DS, SP-DilC18 (3) o Br2-DilC18 (3) como fluoróforo donante y AsRed2 o HcRed1 como aceptor. Otras pares de combinaciones de pares de FRET están indicadas en la Tabla 14.

Aspectos de la presente invención pueden depender de un sustrato de Toxina Clostridial que contiene un aceptor no fluorescente. Como se usa en el presente documento, el término "aceptor no fluorescente" es sinónimo de "inactivador" y significa una molécula que absorbe energía luminosa luz de una cierta longitud de onda, que incluye, por ejemplo, violeta, azul, cian, verde, amarillo, naranja y roja, pero tiene reducida la capacidad de emitir o no puede emitir energía luminosa. Un aceptor no fluorescente puede ser útil, por ejemplo, en la eliminación de la fluorescencia de fondo que se produce a partir de la excitación del aceptor (no sensibilizado). Una diversidad de aceptores no fluorescentes se conocen en la técnica e incluyen sin limitación Dabcyl, Dabsyl, Malachite green, QSY 7, QSY 9, QSY 21, OSY 35, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 y BHQ-10. Estos inactivadores pueden estar unidos a un sustrato de Toxina Clostridial usando procedimientos de química conjugación convencionales conocidos en la técnica. Dabcyl y Dabsyl absorben a máximos de energía luminosa en el intervalo de 400-525 nm y puede ser útil en las aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para fluoróforo donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, BFP, CFP, GFP and YFP. QSY 35 absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 425-525 nm y puede ser útil en las aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, BFP, CFP, GFP y YFP. BHQ-0 absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 430-520 nm y puede ser útil en aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, BFP, CFP, GFP y YFP. BHQ-1 absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 480-580 nm y puede ser útil en aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, CFP, GFP, YFP y RFP. QSY 7 y QSY 9 absorben a máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-600 nm y pueden ser útiles en aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, GFP, YFP y RFP, BHQ-2 absorben a máximos de energía luminosa en el intervalo de 559-650 nm y pueden ser útiles en aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, YFP y RFP. Verde de malaquita absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 575-675 nm y puede ser útil en aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de intervalo de longitud de onda, tales como, por ejemplo, YFP y RFP. QSY 21 absorben a máximos de energía luminosa en el intervalo de 575-725 nm y pueden ser útiles en aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, YFP y RFP. BHQ-3 absorben a máximos de energía luminosa en el intervalo de 620-730 nm y pueden ser útiles en aplicaciones de FRET como un aceptor de transferencia de energía para los fluoróforos donantes que emiten energía luminosa dentro de este intervalo de longitud de onda, tal como, por ejemplo, RFP.

De este modo, una realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 400-525 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es Dabcyl. En otro aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es Dabsyl. En otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 425-525 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es QSY 35. En otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 430-520 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es BHQ-0.

En todavía otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 480-580 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es BHQ-1. en todavía otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 500-600 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es QSY 7. En otro aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es QSY 9.

En todavía otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 559-650 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es BHQ-2. En todavía otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 575-675 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es verde de malaquita En todavía otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 575-725 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente es QSY 21. En todavía otra realización, un aceptor no fluorescente puede ser una molécula que absorbe a máximos de energía luminosa en el intervalo de 620-730 nm. En un aspecto de esta realización, el aceptor no fluorescente
es BHQ-3.

Se entiende que un sustrato de Toxina Clostridial útil en la invención opcionalmente puede incluir uno o más componentes adicionales. Como un ejemplo no limitante, una secuencia espaciadora flexible tal como GGGGS (SEQ ID NO: 159) puede estar incluida en un sustrato de Toxina Clostridial útil en la invención. Un Sustrato de Toxina Clostridial útil además puede incluir, sin limitación, una o más de las etiquetas de unión a epítope, tales como por ejemplo, FLAG, Express^{TM}, hemaglutinina humana (HA) del virus de Influenza, proteína humana p62c-Myc (c-MYC), Glicoproteína del Virus de Estomatitis Vesicular (VSV-G), D precursor de virus de Herpes simplex (HSV) precursor de la glicoproteína D, V5, y AU1; unión de afinidad, tal como. por ejemplo, poli histidina (HIS), péptido de unión a estreptavidina (strep), y biotina o una secuencia de biotinilación; regiones de unión a péptido, tales como. por ejemplo, el dominio de unión a glutation de la glutation-S-transferasa, el dominio de unión a calmodulina de la proteína de unión a calmodulina, y el el dominio de unión a maltosa de la proteína de a maltosa; una región de articulación de inmunoglobulina; un engarce de N-hidroxisuccinimida; una vuelta de horquilla de péptido o mimético de péptido; o una secuencia hidrófila u otro componente o secuencia que, por ejemplo, promueve la solubilidad o estabilidad del sustrato de Toxina Clostridial. Los ejemplos no limitantes de protocolos específicos para seleccionar, preparar y usar un péptido de unión apropiado se desvelan en, por ejemplo, Epitope Tagging, p. 17.90-17.93 (Sambrook y Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3ª ed. 2001); Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow y David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1998); y Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998), que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia. Además, los ejemplos no limitantes de péptidos de unión así como los reactivos bien caracterizados, condiciones y protocolos están fácilmente disponibles de proveedores comerciales que incluyen, sin limitaciónn, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica y de la enseñanza en el presente documento.

Las composiciones y procedimientos de la presente memoria descriptiva proporcionan una célula aislada, en parte, capaces de la intoxicación por toxina Clostridial. Como se usa en el presente documento, el término "célula", significa cualquier célula eucariótica que expresa, o se puede modificar por ingeniería genética para exprese, al menos un receptor que se une a Toxina Clostridial. El término célula abarca las células de una diversidad de organismos, tales como, por ejemplo, células de tipo murino, de rata, de porcino, de bovino, de equino, de primate y de seres humanos; de una diversidad de tipos de célula tales como, por ejemplo, población de células neurales y no neurales; y se pueden aislar a partir de o parte de una población heterogénea, tejido u organismo. Se entiende que las células útiles en los aspectos de la invención pueden incluir, sin limitación, células primarias; células cultivadas; células establecidas; células normales; células transformadas; células tumorales; células infectadas; células de proliferación y terminalmente diferenciadas; y células estable o transitoriamente transfectadas, incluyendo células estable y transitoriamente transfectadas. Además se entiende que las células útiles en los aspectos de la invención pueden estar en cualquier estado como de proliferación o quiescente; intacto o permeabilizado tal como mediante la transfección mediada por compuestos químicos tal como, por ejemplo, mediada por fosfato de calcio, mediada por por dietilaminoetil (DEAE) dextrano, mediada por lípidos, mediada por poli etilenimina (PEI) y mediada por polibreno; mediada por compuestos físicos, tal como, por ejemplo, administración de partículas bioliisticas, microinyección y electroporación; y transfección mediada por virus, tal como, por ejemplo, transfección mediada por retrovirus. Además se entiende que las células útiles en los aspectos de la invención pueden incluir los que expresan un sustrato de Toxina Clostridial bajo control de un constitutivo, específico de tejido, específico de célula o elemento promotor inducible, elemento potenciador o ambos. Además se entiende que las células útiles en los aspectos de la invención pueden o no pueden expresar una o más proteínas endógenas diana de Toxina Clostridial, por ejemplo, SNAP-25,VAMP y sintaxina.

Las composiciones de célula descritas en la presente memoria descriptiva son capaces de intoxicación por Toxina Clostridial. Como se usa en el presente documento, el término "célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial" significa una célula que puede ser capaz de mecanismo celular global mediante el que una Toxina Clostridial escinde proteolíticamente un sustrato y abarca la unión de una Toxina Clostridial a un receptor de afinidad baja o alta, la internalización del complejo toxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la Toxina Clostridial en el citoplasma y la modificación diana enzimática de un sustrato de Toxina Clostridial. Por definición, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial debe expresar uno o más receptores endógenos de la Toxina Clostridial de baja o alta afinidad para uno o más serotipos de la Toxina Clostridial; expresar uno o más receptores exógenos de la Toxina Clostridial de baja o alta afinidad para uno o más serotipos de la Toxina Clostridial; o expresar una combinación de receptores endógenos de la Toxina Clostridial de baja o alta afinidad y receptores exógenos de la Toxina Clostridial de baja o alta afinidad para uno o más serotipos de la Toxina Clostridial para uno o más serotipos de la Toxina Clostridial.

De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula que expresa una toxina de la Toxina Clostridial. En aspectos de esta realización, el receptor de Toxina Clostridial puede ser un receptor Toxina Clostridial de baja afinidad, un receptor Toxina Clostridial de alta afinidad, un receptor endógeno de Toxina Clostridial, un receptor exógeno de Toxina Clostridial, o cualquiera de sus combinaciones. En otros aspectos de esta realización, el receptor de Toxina Clostridial puede ser un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/C1, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G o un receptor de TeNT.

En otra realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula que expresa una diversidad de receptores de Toxina Clostridial. En aspectos de esta realización, una diversidad de receptores de Toxina Clostridial puede comprender receptores de baja afinidad de Toxina Clostridial, receptores de alta afinidad de Toxina Clostridial, receptores endógenos de Toxina Clostridial, receptores exógenos de Toxina Clostridial, o cualquiera de sus combinaciones. En aspectos de esta realización, una diversidad de receptores de Toxina Clostridial puede comprender, por ejemplo, dos o más receptores de Toxina Clostridial, tres o más receptores de Toxina Clostridial, cuatro o más receptores de Toxina Clostridial, cinco o más receptores de Toxina Clostridial, seis o más receptores de Toxina Clostridial, siete o más receptores de Toxina Clostridial y ocho o más receptores de Toxina Clostridial. En otros aspectos de esta realización, célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede expresar dos o más de los siguientes receptores un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/C1, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G o un receptor de TeNT. En otros aspectos de esta realización, célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede expresar tres o más de los siguientes receptores un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/C1, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G o un receptor de TeNT. En otros aspectos de esta realización, célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede expresar cuatro o más de los siguientes receptores un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/C1, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G o un receptor de TeNT. En otros aspectos de esta realización, célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede expresar cinco o más de los siguientes receptores un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/C1, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G o un receptor de TeNT. En otros aspectos de esta realización, célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede expresar seis o más de los siguientes receptores un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/C1, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G o un receptor de TeNT. En otros aspectos de esta realización, célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede expresar siete o más de los siguientes receptores un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/C1, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G o un receptor de TeNT.

Células que expresan uno o más receptores endógenos o exógenos de la Toxina Clostridial se pueden identificar mediante procedimientos de rutina incluyendo ensayos directos e indirectos para captación de toxina. Los ensayos que determinan unión de Toxina Clostridial o propiedades de captación se pueden usar para determinar si una célula expresa un receptor de Toxina Clostridial. Tales ensayos incluyen, sin limitación, ensayos de reticulación usando Toxinas Clostridiales marcadas, tales como, por ejemplo, [125I] BoNT/A, [125I] BoNT/B, [125I] BoNT/C1, [125I] BoNT/D, [125I] BoNT/E, [125I] BoNT/F, [125I] BoNT/G y [125I] TeNT, véase, por ejemplo, Noriko Yokosawa et al., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); Noriko Yokosawa et al., Binding of botulinum type Cl, D y E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29 (2) Toxicon 261-264 (1991); y Tei-ichi Nishiki et al., Identification of proteína receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes, 269(14) J. Biol. Chem. 10498-10503 (1994). Otros ensayos no limitantes incluyen ensayos inmunocitoquímicos que detectan unión a toxina usando anticuerpos marcados o no marcados, véase, por ejemplo, Atsushi Nishikawa et al., El receptor y transportador para la internalización del precursor de la toxina de Clostridium botulinum tipo C en células HT-29, 319(2) Biochem. Biophys. Res. Commun. 327-333 (2004) y inmunoprecipitación ensayos, véase, por ejemplo, Yukako Fujinaga et al., Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes, 150(Pt 5) Microbiology 1529-1538 (2004), que detecta la toxina unida usando anticuerpos marcados o no marcados. Los anticuerpos útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, antibodies selected against a Clostridial toxin, tal como, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, anticuerpos seleccionados contra un receptor de CoNT, tal como, por ejemplo, FGFR3 o sinaptotagmina, y/o anticuerpos seleccionados contra un gangliósido, tal como, por ejemplo, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b, o GT1b. Si el anticuerpo está marcado, la unión de la molécula se puede detectar mediante diversos medios, incluyendo transferencia de Western, observación microscópica directa de la localización celular del anticuerpo, la medición de anticuerpo unido una célula o sustrato después de una etapa de lavado, o electroforesis, empleando las técnicas bien conocidas en la técnica los expertos en la técnica. Si el anticuerpo no está marcado, se puede emplear un anticuerpo secundario marcado para la detección indirecta de la molécula unida, y detección puede proceder como para un anticuerpo marcado. Se entiende que éstos y ensayos similares que determinan las propiedades o características de captación de la Toxina Clostridial puede ser útil en la selección de unas células neuronales u otras en los aspectos de la invención.

Los ensayos que controlan la liberación de una molécula después de la exposición a una Toxina Clostridial también se pueden usar para determinar si una célula expresa una Toxina Clostridial. En estos ensayos, la inhibición de la liberación de la molécula se produciría en las células que expresan un receptor de la Toxina Clostridial después de tratamiento por Toxina Clostridial. Los ensayos bien conocidos incluyen procedimientos que miden la inhibición de la liberación de catecolamina marcada radiactivamente de neuronas, tal como, por ejemplo, liberación de [3H] noradrenalina o [3H] dopamina, véase por ejemplo, A Fassio et al., Evidence for calcium-dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxin and botulinum toxin type F, 90(3) Neuroscience 893-902 (1999); y Sara Stigliani et al., The sensitivity of catecholamine release to botulinum toxin C1 and E suggests selective targeting of vesicles set into the readily releasable pool, 85(2) J. Neurochem. 409-421 (2003), o mide la liberación de cartecolamina usando un procedimiento fluorométrico, véase, por ejemplo, Anton de Paiva et al., A role for the intercadena disulfide o its participating thiols in the internalización of botulinum neurotoxin A revealed by a toxin derivative that binds to ecto-aceptors and inhibits transmitter release intracellularly, 268(28) J. Biol. Chem. 20838-20844 (1993); Gary W. Lawrence et al., Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the
25-kDa synaptosomal-associated protein (SNAP-25) or synaptobrevin by botulinum toxin A o B, 236(3) Eur. J. Biochem. 877-886 (1996); y Patrick Foran et al., Botulinum neurotoxin C1 cleaves both syntaxin and SNAP-25 in intact and permeabilized chromaffin cells: correlation with its blockade of catecholamine release, 35(8) Biochemistry 2630-2636 (1996). Otros ejemplos no limitantes incluyen ensayos que miden la inhibición de la liberación de hormonas de las células endocrinas, tal como, por ejemplo, células de la pituitaria anterior o células de ovario. Se entiende que éstos y ensayos similares para la liberación de la molécula puede ser útiles en la selección de una neurona u otras células útiles en los aspectos de la invención.

Los ensayos que detectan la escisión de un sustrato de Toxina Clostridial después de la exposición a una Toxina Clostridial también se puede usar para determinar si una célula expresa un receptor de Toxina Clostridial. En estos ensayos, la generación de un producto de escisión de sustrato de Toxina Clostridial se detectaría en las células que expresan un receptor de la Toxina Clostridial después de tratamiento por Toxina Clostridial. Los ejemplos no limitantes de procedimientos de transferencia de Western específicos, así como reactivos bien caracterizados, condiciones y protocolos están fácilmente disponibles a partir de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL; Promega Corporation, Madison, WI, y Stratagene, Inc., La Jolla, CA. Se entiende éstos y ensayos similares para la escisión del sustrato de la Toxina Clostridial puede ser útil en la selección de una neurona u otras células útiles en los aspectos de la invención.

Como ejemplos no limitantes, los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica producto escindido de BoNT/A SNAP-25 se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/A; los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica producto escindido de BoNT/C1 SNAP-25 se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/C1; y los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica un producto escindido de SoNT/E SNAP-25 se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/E. Los ejemplos de anticuerpos anti-SNAP-25 anticuerpos útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, antisuero anti-SNAP25197 pAb anti-SNAP25197 nº 1 de conejo poli clonal (Allergan, Inc., Irvine, CA), anticuerpo anti-SNAP-25 SMI-81 de ratón monoclonal (Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD), anticuerpo anti-SNAP-25 CI 71.1 de ratón monoclonal (synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo anti-SNAP-25 CI 71.2 de ratón monoclonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo anti-SNAP-25 SP12 de ratón monoclonal (Abcam, Cambridge, MA), de conejo poli clonal anti-SNAP-25 antisuero (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero clonal anti-SNAP-25 de conejo poli clonal (Abeam, Cambridge, MA).

Como ejemplos no limitantes adicionales, los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica un producto escindido de BoNT/B VAMP se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/B; los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica un producto escindido de BoNT/D VAMP se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/D; los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica un producto escindido de BoNT/F VAMP se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/F; los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica un producto escindido de BoNT/G VAMP se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/G; y los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica TENT. Los ejemplos de anticuerpos anti-VAMP útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, anticuerpo anti-VAMP-1 CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo anti-VAMP-1 SP10 de ratón monoclonal (Abeam, Cambridge, MA), anticuerpo anti-VAMP-1 SP11 de ratón monoclonal (Abcam, Cambridge, MA), antisuero anti-VAMP-1 de conejo poli clonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero anti-VAMP-1 de conejo poli clonal (Abcam, Cambridge, MA), anticuerpo anti-VAMP-2 CI 69.1 de ratón monoclonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero anti-VAMP-2 de conejo poli clonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero anti-VAMP-2 de conejo poli clonal (Abcam, Cambridge, MA), anticuerpo anti-VAMP-3 CI 10.1 de ratón monoclonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero anti-VAMP-3 de conejo poli clonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) y antisuero anti-VAMP-3 de conejo poli clonal (Abcam, Cambridge, MA).

Como otro ejemplo no limitante, los análisis de transferencia de Western que usan un anticuerpo que reconoce de manera específica producto escindido de BoNT/C1 Sintaxina se pueden usar para ensayar la captación de BoNT/C1. Los ejemplos de anticuerpos anti-Sintaxina útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, anticuerpo anti-Sintaxina-1 CI 78.2 de ratón monoclonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo anti-Sintaxina-1A CI 78.3 de ratón monoclonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero anti-Sintaxina-1A de conejo poli clonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero anti-Sintaxina-1B de conejo poli clonal (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), antisuero anti-Sintaxina de conejo poli clonal (Abcam, Cambridge, MA), antisuero anti-Sintaxina-2 de conejo poli clonal (Abcam, Cambridge, MA) y antisuero anti-Sintaxina-3 de conejo poli clonal (Abcam, Cambridge, MA).

Se prevé que un receptor de Toxina Clostridial exógeno puede incluir, sin limitación, una molécula de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, ADN y ARN, que codifica un receptor de la Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva y una péptido molécula o mimético de péptido que comprende un receptor de la Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. También se prevé que un receptor de Toxina Clostridial exógeno se puede expresar de manera transitoria y estable en una célula útil en aspectos de la invención. De este modo, aspectos de esta realización incluyen una célula que de manera transitoria contiene una molécula de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, ADN y ARN, que codifican un receptor de la Toxina Clostridial disclosed en la presente memoria descriptiva and una célula que de manera transitoria contiene a péptido molécula o mimético de péptido que comprende receptor de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. Otros aspectos de esta realización incluyen una célula que contiene de manera estable una molécula de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, ADN y ARN, que codifican un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva y una célula que contiene de manera estable una molécula de péptido mimético de péptido que comprende Sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. Las moléculas de ácido nucleico mantenidas de manera estable pueden ser extracromosómicas y replicar de manera autónoma, o se pueden integrar en material cromosómico en el material cromosómico de la célula y se replican de manera no autónoma.

Se entiende que la selección de una célula depende, en parte, de la Toxina Clostridial que se vaya a ensayar. Como un ejemplo no limitante, para ensayar la actividad de BoNT/A, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de alta o baja afinidad por BoNT/A. Como un ejemplo adicional, para ensayar la actividad de BoNT/B, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de baja o alta afinidad para BoNT/B. Como un ejemplo todavía adicional, para ensayar para la actividad de BoNT/C1, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de alta o baja afinidad por BoNT/C1. Como un ejemplo todavía adicional, para ensayar la actividad de BoNT/D, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de alta o baja afinidad por BoNT/D. Como un ejemplo todavía adicional, para ensayar la actividad de BoNT/E, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de alta o baja afinidad por BoNT/E. Como un ejemplo todavía adicional, para ensayar la actividad BoNT/F, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de alta o baja afinidad por BoNT/F. Como un ejemplo todavía adicional, para ensayar para la actividad de BoNT/G, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de alta o baja afinidad por BoNT/G. Como un ejemplo todavía adicional, para ensayar para la actividad de TeNT, se selecciona una célula que expresa o se puede modificar por ingeniería genética para expresar un receptor de alta o baja afinidad por TeNT.

Como se ha descrito anteriormente, se entiende que una célula útil en la invención expresa receptores de Toxina Clostridial de baja o alta afinidad endógenos o exógenos para una o más Toxinas Clostridiales, Tal célula también en general muestra la inhibición de exocitosis tras la exposición a Toxina Clostridial con, por ejemplo, una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM. En realizaciones particulares, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de BoNT/A que muestra inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a BoNT/A. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de BoNT/B que muestra la inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a BoNT/B, En otras realizaciones, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de BoNT/C1 que muestra inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a BoNT/C1. En todavía realizaciones adicionales, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de BoNT/D que muestra inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a BoNT/D. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de BoNT/E que muestra inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a BoNT/E. En todavía realizaciones adicionales, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de BoNT/F que muestra inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a BoNT/F. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de BoNT/G que muestra inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a BoNT/G. En todavía realizaciones adicionales, la invención proporciona una neurona que contiene un sustrato de TeNT que muestra inhibición de exocitosis con una CI_{50} de menos de 500 nM, menos de 100 mM, menos de 50 nM, menos de 5 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,005 nM, menos de 0,0005 nM, menos de 0,00005 nM o menos de 0,000005 nM tras la exposición a TeNT. Se entiende que la misma neurona puede expresar dos o más receptores por diferentes serotipos de Toxina Clostridial, con la misma o diferente CI_{50} para cada serotipo de toxina individual.

Las células útiles en los aspectos de la invención incluyen tanto células neuronales como no neuronales. Las células neuronales útiles en los aspectos de la invención incluyen, sin limitación, células primarias neuronales; células neuronales inmortalizadas o establecidas, células neuronales transformadas; células neuronales tumorales; células neuronales estable y transitoriamente transfectadas y además incluyen, pero sin limitación, células neuronales de mamífero, de tipo murino, de rata, de primate y de seres humanos. Los ejemplos no limitantes de células neuronales útiles en los aspectos de la invención incluyen, por ejemplo, células neuronales periféricas, tales como, por ejemplo, neuronas motoras y neuronas sensoriales; y células neuronales del CNS, tales como, por ejemplo, neuronas de la médula espinal como las neuronas de la médula espinal embrionarias, neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG), neuronas de la corteza cerebral, neuronas del cerebelo, neuronas del hipocampo y neuronas motoras. Las células neuronales útiles en la invención incluyen, sin limitación, las descritas en el presente documento más adelante o tabuladas en la Tabla 13. Tales células neuronales pueden ser, por ejemplo, neuronas del sistema nervioso central (CNS); células de neuroblastoma; neuronas motoras, neuronas de hipocampo o neuronas del cerebelo y además pueden ser, sin limitación, células Neuro-2A, SH-SY5Y, NG108-15, N1E-115 o SK-N-DZ. Los expertos en la técnica entienden que éstas y neuronas adicionales primarias y establecidas pueden ser útiles en las células y procedimientos de la invención.

Las neuronas útiles en los aspectos de la invención incluyen, sin limitación, cultivos primarios tales como cultivos primarios de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) embrionarias. Como un ejemplo, cultivos primarios de neuronas de DRG embrionarias se desvelan en Mary J. Welch et al., Sensitivity of embryonic rat dorsal root ganglia neurons to Clostridium botulinum neurotoxins, 38(2) Toxicon 245 258 (2000); y cultivos primarios de neuronas de médula espinal fetales, por ejemplo, cultivos primarios de neuronas de médula espinal fetales de tipo murino se desvelan en Elaine A. Neale et al., Botulinum neurotoxin A blocks synaptic vesicle exocitosis but not endocytosis at the nerve terminal, 147(6) J. Cell Biol. 1249-260 (1999), y John A. Chaddock et al., Inhibition de vesicular secretion in both neuronal and non-neuronal cells by a retargeted endopeptidase derivative of Clostridium botulinum neurotoxin type A, 68(5) Infect. Immun. 2587-2593 (2000). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una neurona. En aspectos de esta realización, una neurona puede ser una neurona de, por ejemplo, un cultivo primario, un cultivo primario del ganglio de la raíz dorsal o un cultivo primario de médula espinal fetal. Como ejemplos no limitantes, células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva puede incluir, una célula neuronal primaria, tal como, por ejemplo neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) embrionarias de rata o neuronas de la médula espinal fetales de tipo murino, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A o una secuencia de reconocimiento de BoNT/E; una célula neuronal primaria, tal como, por ejemplo, neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) embrionarias de rata o neuronas de la médula espinal fetales de tipo murino, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de VAMP; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B o una secuencia de reconocimiento de TeNT; y una célula neuronal primaria, tal como, por ejemplo, neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) embrionarias de rata o neuronas de la médula espinal fetales de tipo murino, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de Sintaxina; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1.

Las líneas celulares neuronales útiles en los aspectos de la invención incluyen, sin limitación, líneas celulares de neuroblastoma, líneas celulares neuronales híbridas, líneas celulares de la médula espinal, líneas celulares del sistema nervioso central, líneas celulares de la corteza cerebral, líneas celulares del ganglio de la raíz dorsal, líneas celulares del hipocampo y líneas celulares de feocromocitoma.

Las líneas celulares de neuroblastoma, tales como, por ejemplo, líneas celulares de neuroblastoma de tipo murino, de rata, de primate o de ser humano pueden ser útiles en aspectos de la invención. Las líneas celulares de neuroblastoma útiles en los aspectos de la invención incluyen, sin limitación, BE (2)-C (ATCC CRL-2268; ECACC 95011817), BE(2)-M17 (ATCC CRL-2267; ECACC 95011816), C1300 (ECACC 93120817), CHP-212 (ATCC CRL-2273), CHP-126 (DSMZ ACC 304), IMR 32 (ATCC CRL-127; ECACC 86041809; DSMZ ACC 165), KELLY (ECACC 92110411; DSMZ ACC 355), LA-N-2, véase, por ejemplo, Robert C. Seeger et al., Morphology, growth, chromosomal pattern and fibrinolytic activity of two new human neuroblastoma líneas celulares, 37(5) Cancer Res. 1364-1371 (1977); y G. J. West et al., Adrenergic, cholinergic, and inactive human neuroblastoma líneas celulares with the action-potential Na+ ionophore, 37(5) Cancer Res. 1372-1376 (1977), MC-IXC (ATCC CRL-2270), MHH-NB-11 (DSMZ ACC 157), N18Tg2 (DSMZ ACC 103), N1E-115 (ATCC CCL-2263; ECACC 88112303), N4TG3 (DSMZ ACC 101), Neuro-2A(ATCCCCL-131;ECACC89121404; DSMZ-ACC148), NB41A3(ATCCCCL-147; ECACC89121405), NS20Y (DSMZ ACC 94), SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; ECACC 94030304; DSMZ ACC 209), SIMA (DSMZ ACC 164), SK-NDZ (ATCC CRL-2149; ECACC 94092305), SK-N-F1 (ATCC CRL-2142, ECACC 94092304), SK-N-MC (ATCC HTB-10, DSMZACC203) y SK-N-SH (ATCC HTB-11, ECACC86012802). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por toxina Clostridial puede ser una célula de neuroblastoma. En aspectos de esta realización, una célula de neuroblastoma puede ser, por ejemplo, BE (2)-C, BE(2)-M17, C1300, CHP-212, CHP-126, IMR 32, KELLY, LA-N-2, MC-IXC, MHH-NB-11, N18Tg2, N1E-115, N4TG3, Neuro-2A, NB41A3, NS20Y, SH-SY5Y, SIMA, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-MC y SK-N-SH. Como ejemplos no limitantes, células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva pueden incluir, una célula de neuroblastoma, tal como, por ejemplo, células SH-SYSY, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A o una secuencia de reconocimiento de BoNT/E; células Neuro-2a, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A; y células N1E-115 o células SK-N-DZ, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E.

Las líneas celulares neuronales híbridas, tales como, por ejemplo, líneas celulares neuronales híbridas de tipo murino, de rata y de ser humano pueden ser útiles en los aspectos de la invención. Tales líneas celulares neuronales híbridas incluyen híbridos de neuroblastoma/glioma, tales como, por ejemplo, N18 (ECACC 88112301), NG108-15 (ATCC HB-12317, ECACC 88112302) y NG115-401 L (ECACC 87032003); híbridos de neuroblastoma/neurona motora, tal como, por ejemplo, NSC-19 y NSC-34, que expresa características de neuronas motoras, muestran un fenotipo de tipo neuronal multipolar, expresa altos niveles de colina acetiltransferasa (CHAT), generan potenciales acciones, expresan proteínas triplete neurofilamentosas y sintetizan, almacenan y liberan acetilcolina, véase, por ejemplo, N. R. Cashman et al., Neuroblastoma x médula espinal (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons, 194(3) Dev. Dyn. 209-221 (1992); y Christopher J. Eggett et al., Development and characterisation of a glutamate-sensitive motor neuronal cell line, 74(5) J. Neurochem. 1895-1902 (2000); neuroblastoma/dorsal root ganglion neuron hybrids, tales como, por ejemplo, F11, véase, por ejemplo, Doros Platika et al., Neuronal traits of clonal cell lines derived by fusion of dorsal root ganglia neurons with neuroblastoma cells, 82(10) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 3499-3503 (1985), ND-C (ECACC 92090913), ND-E (ECACC 92090915), ND-U1 (ECACC 92090916), ND3 (ECACC 92090901), ND7/23 (ECACC 92090903), ND8/34 (ECACC 92090904), ND8/47, ND15 (ECACC 92090907), ND27 (ECACC 92090912); híbridos de neuronas de neuroblastoma/hipocampo, tales como, por ejemplo, HN-33, véase, por ejemplo, Henry J. Lee et al., Neuronal properties and trophic activities of immortalized hippocampal cells from embryonic and young adult mice. 10(6) J. Neurosci. 1779-1787 (1990). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una neurona híbrida. En aspectos de esta realización, puede ser una neurona híbrida puede ser, por ejemplo, un híbrido de neuroblastoma/glioma, un híbrido de neuroblastoma/neurona motora, un híbrido de neuroblastoma/neurona de ganglio de raíz y neuroblastoma/neurona de hipocampo. En aspectos adicionales de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/glioma puede ser, por ejemplo, N18, NG108-15 and NG115-401L. En aspectos adicionales de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/neurona motora puede ser, por ejemplo, NSC-19 y NSC-32. En aspectos adicionales de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/neurona del ganglio de la raíz dorsal puede ser, por ejemplo, ND8-47. En aspectos adicionales de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/neurona del ganglio de la raíz puede ser, por ejemplo, F11, ND-C, ND-E, ND-U1, ND3, ND7/23, ND8/34, ND8/47, ND15 y ND27. En aspectos adicionales de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/neurona de hipocampo puede ser, por ejemplo, HN-33.

La línea celular NG108-15 es un híbrido de células neuroblastoma de ratón y de glioma de rata que se une a BoNT/C1 a concentraciones subnanomolares con una CI_{50} de 0,2 nM (0,18 ng de complejo por microlitro), alcanzando la saturación a 6 nM, véase, por ejemplo, Noriko Yokosawa et al., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); y Noriko Yokosawa et al., Binding of botulinum type CI, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29(2) Toxicon 261-264 (1991). Basándose en los datos de unión, la línea celular NG108-15 puede contener tanto receptores de baja como de alta afinidad por BoNT/C1. Como ejemplos no limitantes, células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva puede incluir, una célula híbrida neuronal, tal como, por ejemplo, células NG108-15, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 o una secuencia de reconocimiento de BoNT/E; y células NG108-15 células, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de Sintaxina; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1.

Las líneas celulares de médula espinal, tales como, por ejemplo, líneas celulares de médula espinal de tipo murino, de rata, de primate o de ser humano pueden ser útiles en aspectos de la invención e incluyen, sin limitación, TE 189.T (ATCC CRL-7947) y M4b, véase, por ejemplo, Ana M. Cardenas et al., Establishment and characterization of immortalized neuronal cell lines derived from the spinal cord of normal and trisomy 16 fetal mice, an animal model of Down syndrome, 68(1) J. Neurosci. Res. 46-58 (2002). Como un ejemplo, una línea celular de médula espinal humana se puede generar a partir de precursores de células de la médula espinal embrionarias humanas (embriones del primer trimestre) que se inmortalizan con un oncogen v-myc represible de tetraciclina como se desvela en Ronghao U et al., Motoneuron differentiation of immortalized human spinal cord cell lines, 59(3) J. Neurosci. Res. 342-352 (2000). Tales células se pueden expandir indefinidamente en condiciones de crecimiento proliferativas antes de la diferenciación rápida (4-7 días) en neuronas funcionales que expresan marcadores fenotípicos neuronales tales como la colina acetiltransferasa. Como otro ejemplo, una línea celular de médula espinal de tipo murino se puede preparar mediante inmortalización de un cultivo de médula espinal embrionario usando medios de transformación. Tal línea celular de médula espinal puede ser, por ejemplo, la línea M4b de tipo murino y puede expresar marcadores neuronales tales como NSE, sinaptofisina, MAP 2 y colina acetiltransferasa, y puede liberar acetilcolina tras la estimulación apropiada, véase, por ejemplo, Cardenas et al., supra, (2002). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula de médula espinal. En aspectos de esta realización, una célula de médula espinal puede ser, por ejemplo, THE 189.T y M4b.

Las líneas celulares del sistema nervioso central (CNS), tal como, por ejemplo, líneas celulares del CNS de tipo murino, de rata, de primate y de ser humano, pueden ser útiles en los aspectos de la invención. Una línea celular de CNS útil puede ser, por ejemplo, una línea celular del CNS inmortalizada con un oncogen v-myc de tetraciclina represible como se desvela en Dinah W. Sah et al., Bipotent progenitor cell lines from the human CNS, 15(6) Nat. Biotechnol. 574-580 (1997). Tras la represión del oncogen, las células se diferencian en neuronas. De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula del SNC.

Las líneas celulares de la corteza cerebral, tal como, por ejemplo, líneas celulares de la corteza cerebral de tipo murino, de rata, de primate y de ser humano cerebral, pueden ser útil en aspectos de la invención e incluyen, sin limitación, CNh, véase, por ejemplo, Ana M. Cardenas et al., Calcium signals in cell lines derived from the cerebral cortex of normal and trisomy 16 mice, 10(2) Neuroreport 363-369 (1999), HCN-1a (ATCC CRL-10442) and HCN-2 (ATCC CRL-10742). Como un ejemplo, los cultivos primarios de la corteza de tipo murino de 12-16 días los embriones se pueden inmortalizar, por ejemplo, mediante cultivo de las células en medios acondicionados de una línea celular de tiroides de rata que induce la transformación in vitro. Las células inmortalizadas se pueden diferenciar en neuronas que expresan marcadores neuronales usando los medios apropiados; estas células diferenciadas expresan colina acetiltransferasa y secretan acetilcolina y glutamato en respuesta a la desporalización y estimulación de nicotina, véase, por ejemplo, David D. Allen et al., Impaired cholinergic function in cell lines derived from the cerebral cortex of normal and trisomy 16 mice, 12(9) Eur. J. Neurosci. 3259-3264 (2000). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula de la corteza cerebral. En aspectos de esta realización, una célula de la corteza cerebral puede ser, por ejemplo, CNh, HCN-1a y HCN-2.

Las líneas celulares del ganglio de la raíz dorsal, tales como, por ejemplo, líneas celulares de ganglio de la raíz dorsal de tipo murino, de rata, de primate y de ser humano, pueden ser útiles en los aspectos de la invención e incluyen, sin limitación, G4b, véase, por ejemplo, David D. Allen et al., A dorsal root ganglia cell line derived from trisomy 16 fetal mice, a model for Down syndrome, 13(4) Neuroreport 491-496 (2002). Los cultivos primarios del ganglio de la raíz dorsal embrionarios se pueden inmortalizar con medios acondicionados de transformación como se ha descrito anteriormente. Tras la diferenciación, la línea celular muestra características neuronales y carece de marcadores gliales mediante inmunohistoquímica. La liberación de neurotransmisores tales como acetilcolina se puede inducir en respuesta a potasio y nicotina, véase, por ejemplo, Allen et al., supra, (2002). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula de ganglio de la raíz dorsal. En aspectos de esta realización, una célula de ganglio de la raíz dorsal puede ser, por ejemplo, G4b.

Las líneas celulares de hipocampo, tales como, por ejemplo, líneas de hipocampo de tipo murino, de rata, de primate y de ser humano puede ser útiles en aspectos de la invención e incluyen, sin limitación, HT-4, véase, por ejemplo, K. Frederiksen et al., Immortalization of precursor cells from the mammalian CNS, 1(6) Neuron 439-448 (1988) and HT-22, véase, por ejemplo, John B. Davis and Pamela Maher, Protein kinase C activation inhibits glutamate-induced cytotoxicity in a neuronal cell line, 652(1) Brain Res. 169-173 (1994). Como un ejemplo no limitante, la línea celular de hipocampo de tipo murino HT-22 puede ser útil en la invención. Como un ejemplo no limitante adicional, la línea celular inmortalizada de hipocampo HN33 puede ser útil en la invención. Esta línea celular de hipocampo se derivó de la fusión de neuronas primarias del hipocampo de ratones de 21 días postnatales con la línea celular N18TG2 de neuroblastoma, y, cuando se diferencia, comparte las propiedades de membrana con neuronas de hipocampo adultas en cultivo primario, véase, por ejemplo, Henry J. Lee et al., Neuronal Properties and Trophic Activities of Immortalized Hippocampal Cells from Embryonic and Young Adult Mice, 19(6) J. Neurosci. 1779-1787 (1990); y Henry J. Lee et al., Immortalized young adult neurons from the septal region: generation and characterization, 52(1-2) Brain Res. Dev Brain Res. 219-228 (1990). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula de hipocampo. En aspectos de esta realización, una célula de hipocampo puede ser, por ejemplo, HT-4, HT-22 and HN33.

Una diversidad de células no neuronales son útiles en los aspectos de la invención. Las células no neuronales útiles en aspectos de la invención incluyen, sin limitación, células no neuronales primarias; células no neuronales inmortalizadas o establecidas; células no neuronales transformadas; células no neuronales tumorales; células no neuronales estable y transitoriamente transfectadas y además incluyen, pero sin limitarse a, células no neuronales de mamífero, de tipo murino, de rata, de primate y de ser humano. Las células no neuronales útiles en los aspectos de la invención además incluyen, sin limitación, cualquiera de las siguientes células primarias o establecidas: células de pituitaria anterior; células adrenales, tales como. por ejemplo, células cromafines de la médula adrenal; células pancreáticas, tales como por ejemplo, células acinares pancreáticas, células \beta de los islotes pancreáticos y células de insulinoma HIT o INS-1; células de ovario, tales como. por ejemplo, células de ovario que producen esteroide; células de riñón, tales como. por ejemplo, células HEK-293 (ATCC CRL 1573) y células del conducto colector medular interno (IMCD); células del estómago, tales como, por ejemplo, células enterocromafines; células sanguíneas, tales como, por ejemplo, euritrocitos, leucocitos, plaquetas, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos; células epiteliales, tales como, por ejemplo, las de la membrana plasmática apical; fibroblastos; células de tiroides; condrocitos; células musculares; hepatocitos; células glandulares tales como, por ejemplo, células pituitarias, células adrenales, células cromafines; y las células implicadas en la translocación del transportador de glucosa (GLUT4). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser célula no neuronal. En aspectos de esta realización, una célula no neuronal puede ser de una línea celular no neuronal primaria o secundaria de las, por ejemplo, células de la pitutaria anterior, células adrenales, células pancreáticas, células de ovario, células de riñón, células de estómago, células sanguíneas, células epiteliales, fibroblastos, células de tiroides, condrocitos, células musculares, hepatocitos y células glandulares. En un aspecto de esta realización, una línea celular de riñón puede ser, por ejemplo, HEK-293.

Como ejemplos no limitantes, células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente memoria descriptiva puede incluir, una célula no neuronal primaria o establecida, tal como, por ejemplo, células cromafines o células acinares pancreátocas, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A o una secuencia de reconocimiento de BoNT/E; una célula neuronal primaria, tal como, por ejemplo, células cromafines o células acinares pancreáticas, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de VAMP; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B o una secuencia de reconocimiento de TeNT; y una célula neuronal primaria, tal como, por ejemplo, células cromafines o células acinares pancreáticas, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de Sintaxina; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1.

Como se ha descrito anteriormente, las células útiles en la invención incluyen células neuronales y no neuronales que expresan bajos niveles o indetectables de receptor endógeno pero que han sido transfectadas, o de otra manera modificadas para ingeniería genética, una o más moléculas de ácido nucleico exógeno que codifica uno o más Receptores de Toxina Clostridial. La selección del receptor de Toxina Clostridial depende de qué Toxina Clostridial se va a ensayar. Como un ejemplo no limitante, una célula neuronal o no neuronal se puede modificar por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica el receptor del factor 3 de crecimiento de fibroblastos (FGFR3), que sirve como un receptor de BoNT/A, véase, por ejemplo, Solicitud de Patente PCT Nº 2005/006421. Como otro ejemplo no limitante, una célula a neuronal o no neuronal se puede modificar por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una isoforma de glicoproteína 2 de vesícula sináptica (SV2), que sirve como un receptor de BoNT/A, véase, por ejemplo, Min Dong et al., SV2 Is the protein Receptor for Botulinum Neurotoxin A, Science (2006); S. Mahrhold et al, The Synaptic Vesicle protein 2C Mediates the Uptake of Botulinum Neurotoxin A into Phrenic Nerves, 580(8) FEBS Lett. 2011-2014 (2006). De manera adicional, una célula a neuronal o no neuronal se puede modificar por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar múltiples moléculas de ácido nucleico exógena que codifica FGFR3 y una isoforma de SV2. Como otro ejemplo no limitante, una célula a neuronal o no neuronal se puede modificar por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica la sinaptotagmina I, que sirve como un receptor de BoNT/B y como un receptor de BoNT/G, véase, por ejemplo, Min Dong et al., Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells, 162(7) J. Cell Biol. 1293-1303 (2003); y Andreas Rummel et al., Synaptotagmins I y II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G, 279(29) J. Biol. Chem. 30865-30870 (2004). Como otro ejemplo no limitante, una célula neuronal o no neuronal se puede modificar por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica la sinaptotagmina II, que sirve como un receptor de BoNT/B y como un receptor de BoNT/G, véase, por ejemplo, Min Dong et al., supra, (2003); y Andreas Rummel et al., supra, (2004).

De este modo en una realización, una célula a neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una FGFR3. En aspectos de esta realización, una célula neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica la FGFR3 de la SEQ ID NO: 173, la FGFR3 de la SEQ ID NO: 174 o la FGFR3 de la SEQ ID NO: 175.

En otra realización, una célula a neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una SV2. En aspectos de esta realización, una célula a neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica el SV2 de la SEQ ID NO: 176, el SV2 de la SEQ ID NO: 177, el SV2 de la SEQ ID NO: 178 o el SV2 de la SEQ ID NO: 179.

En otra realización, una célula a neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una FGFR3 y una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una SV2. En aspectos de esta realización, una célula a neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica la FGFR3 de la SEQ ID NO: 173, la FGFR3 de la SEQ ID NO: 174 o la FGFR3 de la SEQ ID NO: 175 y una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica la SV2 de la SEQ ID NO: 176, la SV2 de la SEQ ID NO: 177, la SV2 de la SEQ ID NO: 178 o la SV2 de la SEQ ID NO: 179.

En otra realización, una célula a neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una Sinaptotagmina I. En aspectos de esta realización, una célula neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica la Sinaptotagmina de la SEQ ID NO: 180.

En otra realización, una célula a neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una Sinaptotagmina II. En aspectos de esta realización, una célula neuronal o no neuronal se modifica por ingeniería genética de manera transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica la Sinaptotagmina de la SEQ ID NO: 181.

Células útiles en aspectos de la presente invención además incluyen, sin limitación, células transformadas, tumorales u otras que sobre expresan uno o más receptores de Toxina Clostridial endógena o que expresan uno o más receptores de Toxina Clostridial endógena. Se entiende el receptor sobre expresado puede ser una forma de tipo salvaje del receptor o pueden incluir una o más modificaciones de aminoácidos comparado con el receptor de tipo salvaje, con la condición que el proceso de intoxicación por Toxina Clostridial se pueda todavía producir. Como un ejemplo no limitante, las células útiles para determinar la actividad de BoNT/A abarca las que expresan o sobre expresan una forma del receptor del factor 3 de crecimiento de fibroblastos (FGFR3). Como otro ejemplo no limitante, las células útiles para determinar la actividad de BoNT/B abarca las que expresan o sobre expresan una forma de Sinaptotagmina I. Como otro ejemplo no limitante, las células útiles para determinar la actividad de BoNT/B abarca las que expresan o sobre expresan una forma de Sinaptotagmina II. Como otro ejemplo no limitante, las células útiles para determinar la actividad de BoNT/G abarca las que expresan o sobre expresan una forma de Sinaptotagmina I. Como otro ejemplo no limitante, las células útiles para determinar la actividad de BoNT/G abarca las que expresan o sobre expresan una forma de Sinaptotagmina II.

Las células que expresan o sobre expresan una forma del receptor del factor 3 de crecimiento de fibroblastos incluyen, pero no se limitan a, células de mieloma de origen natural y modificadas genéticamente así como primarias y establecidas, células de carcinoma de vejiga, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma de tiroides y células de carcinoma cervical. Tales células útiles en los aspectos de la invención además abarcan, sin limitación, líneas celulares de mieloma de tipo humano incluyendo H929 (ATCC CRL-9068; ECACC 95050415; DSMZ ACC 163), JIM-3, véase, por ejemplo, H. Barker et al., p. 155-158 (J. Radl y B. van Camp eds., EURAGE Monoclonal Gammopathies III: Clinical Significance and Basic Mechanisms, 1991), KMS-11, véase, por ejemplo, Masayoshi Namba et al., Establishment of five human myeloma cell lines, 25(8) In Vitro Cell Dev. Biol. 723-729 (1989), KMS-18, véase, por ejemplo, Naozo Nakazawa et al., Interphase detection of t(4;14)(p16.3;q32.3) by in situ hybridization and FGFR3 over-expression in plasma cell malignancies, 117(2) Cancer Genet. Cytogenet. 89-96 (2000), LB278, véase, por ejemplo, D. Ronchetti et al., Characterization of the t(4;14)(p16.3;q32) in the KMS-18 múltiple myeloma cell line, 15(5) Leukemia 864-865 (2001), LB375, véase, por ejemplo, Ronchetti et al., supra, (2001). LB1017, véase, por ejemplo, Ronchetti et al., supra, (2001), LB2100, véase, por ejemplo, Ronchetti et al., supra, (2001), LP-1 (DSMZ ACC 41), OPM-2 (DSMZ ACC 50), PCL1, véase, por ejemplo, Ronchetti et al., supra, (2001), UTMC-2, véase, por ejemplo, Shuji Ozaki et al., Characterization of a novel interleukin-6 autocrine-dependent human plasma cell line, 8(12) Leukemia 2207-2213 (1994), que sobre expresan FGFR3 debido a una translocación cromosómica t(4;14)(q16.3;q32.3) y otras células de mieloma con una translocación t(4:14); células de leucemia que incluyen células de leucemia mieloide (CML) tales como células CD34+ BCR-ABL+; y células de carcinoma de vejiga incluyendo células de carcinoma urotelial primarias y otras. Los expertos en la técnica entienden que éstas y otras células que sobre expresan o expresan una forma del receptor del factor 3 de crecimiento de fibroblastos pueden ser útiles en la determinación de la actividad de BoNT/A de acuerdo con un procedimiento de la invención.

De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula que expresa un receptor de Toxina Clostridial endógeno. En aspectos de esta realización, un receptor de Toxina Clostridial endógeno expresado por una célula es un receptor para, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT. En aspectos adicionales de esta realización, un receptor de Toxina Clostridial endógeno es, por ejemplo, FGFR3, Sinaptotagmina 1 o Sinaptotagmina II. En otro aspecto de esta realización, una célula que expresa un receptor de Toxina Clostridial endógeno puede ser de, por ejemplo, una línea celular de mieloma primaria, una línea celular de mieloma establecida, una línea celular de carcinoma de vejiga primaria; una línea celular de carcinoma de vejiga establecida, una línea celular de carcinoma cervical primario y una línea celular de carcinoma cervical establecido. En otra realización, una célula que expresa FGFR3 puede ser, por ejemplo, una célula que contiene una translocación cromosómica t(4;14)(q16.3;q32.3). En aspectos adicionales de esta realización, una célula que expresa FGFR3 puede ser, por ejemplo, H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 y UTMC-2.En aspectos adicionales de esta realización, una célula que expresa FGFR3 puede ser, por ejemplo, H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 y UTMC-2. Como ejemplos no limitantes, células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva puede incluir, una célula de mieloma, tal como, por ejemplo, KMS-11 o H929, que incluyen un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A; una célula de carcinoma de vejiga primaria o establecida que incluye un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A; y una célula de carcinoma cervical primaria o establecida que incluye un sustrato de Toxina Clostridial que comprende una secuencia de reconocimiento de SNAP-25; tal como, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A.

Además tales células útiles en los aspectos de la invención además abarcan, sin limitación, líneas celulares transfectadas de manera estable que expresan un receptor de Toxina Clostridial, incluyendo, por ejemplo, B9, véase, por ejemplo, Elizabeth E. Plowright et al., Ectopic expression of fibroblast growth factor receptor 3 promotes myeloma cell proliferation and prevents apoptosis, 95(3) Blood 992-998 (2000); TC, véase, por ejemplo, Hiroyuki Onose et al., Over-expression of fibroblast growth factor receptor 3 in a human thyroid carcinoma cell line results in overgrowth of the confluent cultures, 140(2) Eur. J. Endocrinol. 169-173 (1999); L6, véase, por ejemplo, M. Kana et al., Signal transduction pathway of human fibroblast growth factor receptor 3. Identification of a novel 66-kDa phosphoprotein, 272(10) J. Biol. Chem. 6621-6628 (1997); and CFK2, véase, por ejemplo, Janet E. Henderson et al., Expression of FGFR3 with the G380R achondroplasia mutation inhibits proliferation and maturation of CFK2 chondrocytic cells, 15(1) J. Bone Miner. Res. 155-165 (2000). Los expertos en la técnica entienden que éstas y otras células que sobre expresan o expresan una forma activada del receptor del factor 3 de crecimiento de fibroblastos puede ser útil en la determinación de la actividad de BoNT/A de acuerdo con un procedimiento de la invención. De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial puede ser una célula que expresa de manera estable un receptor de Toxina Clostridial exógeno. En aspectos de esta realización, un receptor de Toxina Clostridial exógeno expresado de manera estable por una celulares un receptor para, por ejemplo, BoNT/A. BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT. En aspectos adicionales de esta realización, un receptor de Toxina Clostridial exógeno es, por ejemplo, FGFR3. En aspectos adicionales de esta realización, una célula que expresa FGFR3 puede ser, por ejemplo, B9, TC, L6 and CFK2. Como ejemplos no limitantes, las células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva pueden incluir una célula B9 que expresa de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; una célula B9 que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; una célula TC que expresa de manera estable una molécula de molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; una célula TC que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; una célula L6 que expresa de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; una célula L6 que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; una célula CFK2 que expresa de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; y una célula CFK2 que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A.

Las composiciones celulares descritas en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, un sustrato de Toxina Clostridial. Se prevé que se puede usar cualquier sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. De este modo, los aspectos de esta realización incluyen moléculas de ácido nucleico, tales como, por ejemplo, ADN y ARN, que codifican un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva y molécula de péptido o mimético de péptido que comprende un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. Otros aspectos de esta realización incluyen, en parte, una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que incluye, sin limitación, una secuencia de reconocimiento de la toxina de BoNT/A, una secuencia de reconocimiento de la toxina de BoNT/B, una secuencia de reconocimiento de la toxina de BoNT/C1, una secuencia de reconocimiento de la toxina de BoNT/D, una secuencia de reconocimiento de la toxina de BoNT/E, una secuencia de reconocimiento de la toxina de BoNT/F, una secuencia de reconocimiento de la toxina de BoNT/G y una secuencia de reconocimiento de la toxina de TeNT. Otros aspectos de esta realización incluyen, en parte, un dominio de dirección de membrana que incluye, sin limitación, dominios de dirección de membrana de origen natural presentes en SNAP-25, variantes de SNAP-25 MTD de origen natural, y variantes de SNAP-25 MTD de origen no natural, y mimético de péptidos de SNAP-25 MTD; y dominios de dirección de membrana de origen natural presentes en sintaxina, variantes de MTD de origen natural de sintaxina, variantes de MTD de origen no natural de sintaxina y miméticos de péptidos de MTD de sintaxina. Otros aspectos de esta realización incluyen, en parte, un primer miembro de un par de FRET que incluye, sin limitación, proteínas fluorescentes de tipo salvaje, variantes de origen natural, variantes modificadas por ingeniería genética, y fragmentos de péptido activos derivados de proteínas fluorescentes de Aequorea, proteínas fluorescentes de Anemonia, proteínas fluorescentes de Anthozoa, proteínas fluorescentes de Discosoma, proteínas fluorescentes de Entacmeae, proteínas fluorescentes de Heteractis, proteínas fluorescentes de Montastrea, proteínas fluorescentes de Renilla, proteínas fluorescentes de Zoanthus. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes incluyen, por ejemplo, EBFP, ECFP, AmCyan, AcGFP, ZsGreen, Vitality® hrGFP, EGFP, Monster Green® hMGFP, EYFP, ZsYellow. DsRed-Express, DsRed2, DsRed, AsRed2 y HcRed1. Otros aspectos de esta realización incluyen, en parte, un segundo miembro de un par de FRET incluyendo, sin limitación, un colorante de carbocianina de cadena larga, un colorante de aminoestirilo, un colorante de anfifílica estirilo, un catión lipófilo, una sonda de membrana con desplazamientos espectrales sensibles al ambiente o colorante de FM. Los ejemplos no limitantes de los colorantes lipófilos incluyen colorantes de dialquilcarbocianina de cadena larga tales como, por ejemplo, Dil Vibrant, DilC_{18}(3), DilC_{18}(3)-DS, SP-DilC_{18}(3), 5-5'-Ph2-DilC_{18}(3) y DiD.

Octadecil rodamina B, 5-Dodecanoilaminofluoresceína, 5-hexadecanoil-aminofluoresceína, 5-octadecanoylaminofluoresceína, 4-heptadecil-7-hidroxicumarina, DPH, TMA-DPH, TMAP-DPH, DPH ácido propiónico, BODIPY 493/503, BODIPY 505/515, BODIPY 665/676, BODIPY FL C5-ceramida, CellTrace BODIPY TR metil éster, un colorante de fenoxazina rojo nilo, un 1,3-Bis-(1-pireno)propano, bimano azida, prodan, laurdan, acrilodan, badan, 1,8-ANS, 2,6-ANS, 2;6-TNS, bis-ANS, DCVJ, MBDS.

Las composiciones celulares descritas en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una célula que de manera transitoria contiene un sustrato de Toxina Clostridial. Como se usa en el presente documento, el término " que contiene transitoriamente" significa un sustrato de Toxina Clostridial que se introduce temporalmente en una célula con el fin de realizar los ensayos desvelados en la presente memoria descriptiva. Por definición, con el fin de realizar los ensayos desvelados en la presente memoria descriptiva al menos 50% de las células que comprenden una población de células debe contener un sustrato de Toxina Clostridial. Como se usa en el presente documento, el término "población de células" significa el número de células total usadas en un procedimiento que de manera transitoria introduce un sustrato de Toxina Clostridial para un ensayo dado. Como un ejemplo no limitante, dada una población de células que comprende 1,5x10^{5} células, al menos 7,5x10^{4} células debe contener un sustrato de Toxina Clostridial de origen no natural después de la transducción usando, por ejemplo, un procedimiento adenoviral o un procedimiento lentiviral. Como otro ejemplo no limitante, dada una población de células que comprende 1,5x10^{5} células, al menos 7,5x10^{4} células debe contener un sustrato de Toxina Clostridial después de la transfección usando, por ejemplo, un procedimiento de transfección de proteína. De este modo, aspectos de una célula que contiene transitoriamente un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la memoria descriptiva pueden incluir una célula que contiene un sustrato para, por ejemplo, como mucho aproximadamente un día, como mucho aproximadamente dos días, como mucho aproximadamente tres días, como mucho aproximadamente cuatro días, como mucho aproximadamente cinco días, y como mucho aproximadamente seis días, como mucho aproximadamente siete días, como mucho aproximadamente ocho días, como mucho aproximadamente nueve días y como mucho aproximadamente diez días y en los que la población de células que contiene un sustrato de Toxina Clostridial comprende, por ejemplo, al menos 50% de las células dentro de la población de células, al menos 60% de las células dentro de la población de células, al menos 70% de las células dentro de la población de células, al menos 80% de las células dentro de la población de células, y al menos 90% de las células dentro de la población de células.

De este modo, en una realización, una célula contiene de manera transitoria una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana. En aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana codificado por la molécula de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A, un sustrato de BoNT/B, un sustrato de BoNT/C1, un sustrato de BoNT/D, un sustrato de BoNT/E, un sustrato de BoNT/F, un sustrato de BoNT/G o un sustrato de TeNT. Como ejemplos no limitantes, las células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva pueden incluir células SH-SY5Y tales como, por ejemplo, células SH-SY5Y diferenciadas y células SH-SY5Y que expresan de manera transitoria una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E; células NG108-15 tales como, por ejemplo, células NG108-15 diferenciadas y células NG108-15 que expresan de manera transitoria una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E; células Neuro-2A tales como, por ejemplo, células Neuro-2A diferenciadas y células Neuro-2A que expresan de manera transitoria una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; células N1E-115 tales como, por ejemplo, células N1E-115 diferenciadas y células N1E-115 que expresan de manera transitoria una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E; y células SK-N-DZ tales como, por ejemplo, células SK-N-DZ diferenciadas y células SK-N-DZ que expresan de manera transitoria una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E.

En otra realización, una célula contiene de manera transitoria un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana. En aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial capaz de estar localizado en la membrana plasmática puede ser, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A, un sustrato de BoNT/B, un sustrato de BoNT/C1, un sustrato de BoNT/D, un sustrato de BoNT/E, un sustrato de BoNT/F, un sustrato de BoNT/G o un sustrato de TeNT. Como ejemplos no limitantes, las células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva pueden incluir células SH-SY5Y tales como, por ejemplo, células SH-SY5Y diferenciadas y células SH-SY5Y que contienen de manera transitoria un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E: células NG108-15 tales como, por ejemplo, células NG108-15 diferenciadas y células NG108-15 que contienen de manera transitoria un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E; células Neuro-2A tales como, por ejemplo, células Neuro-2A diferenciadas y células Neuro-2A que contienen de manera transitoria un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; células N1E-115 tales como, por ejemplo, células N1E-115 diferenciadas y células N1E-115 que contienen de manera transitoria un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E; y células SK-N-DZ tales como, por ejemplo, células SK-N-DZ diferenciadas y células SK-N-DZ que contienen de manera transitoria un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E.

Las composiciones de células descritas en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una célula que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial. Como se usa en el presente documento, el término "que contiene de manera estable" significa un sustrato de Toxina Clostridial que se introduce en una célula y se mantiene durante largos períodos de tiempo con en fin de realizar los ensayos de fluorescencia de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico mantenidas de manera estable abarcan moléculas de ácido nucleico mantenidas de manera estable que son extracromosómicas y se replican de manera autónoma y moléculas de ácido nucleico mantenidas de manera estable que están integradas en el material cromosómico de la célula y se replican de manera no autónoma. De este modo aspectos de una célula que contiene establemente un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la memoria descriptiva pueden incluir una célula que contiene un sustrato para, por ejemplo, al menos diez días, al menos 22 días, al menos 30 días, al menos cuarenta días, al menos 50 días, y al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días y al menos 100 días. Otros aspectos de una célula que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la memoria descriptiva pueden incluir una célula que contiene un sustrato para, por ejemplo, al menos 100 días, al menos 200 días, al menos 300 días, al menos 400 días, y al menos 500 días. Todavía otros aspectos de una célula que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la memoria descriptiva pueden incluir una célula que contiene de manera permanente un sustrato de Toxina Clostridial.

De este modo, en una realización, una célula que contiene de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana. En aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana codificado por la molécula de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A, un sustrato de BoNT/B, un sustrato de BoNT/C1, un sustrato de BoNT/D, un sustrato de BoNT/E, un sustrato de BoNT/F, un sustrato de BoNT/G o un sustrato de TeNT. Como ejemplos no limitantes, las células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva pueden incluir células SH-SY5Y tales como, por ejemplo, células diferenciadas SH-SY5Y y células "SH-SY5Y" que expresan de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E; células NG108-15 tales como, por ejemplo, células NG108-15 diferenciadas y células NG108-15 que expresan de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E; células Neuro-2A tales como, por ejemplo, células Neuro-2A diferenciadas y células Neuro-2A que expresa de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un Sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; células KMS-11 tales como, por ejemplo, células KMS-11 diferenciadas y KMS-11 células que expresan de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; células N1E-115 tales como, por ejemplo, células N1E-115 diferenciadas y células N1E-115 que expresan de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E; y células SK-N-DZ tales como, por ejemplo, células SK-N-DZ diferenciadas y células SK-N-DZ que expresan de manera estable una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E.

En otra realización, una célula que contiene de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana. En aspectos de esta realización, el sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana puede ser, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A, un sustrato de BoNT/B, un sustrato de BoNT/C1, un sustrato de BoNT/C, un sustrato de BoNT/E, un sustrato de BoNT/F, un sustrato de BoNT/G o un sustrato de TeNT. Como ejemplos no limitantes, células útiles para determinar la actividad de la Toxina Clostridial de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva pueden incluir células SH-SY5Y tales como, por ejemplo, células SH-SY5Y diferenciadas y células SHSY5Y que contienen de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E; células NG108-15 tales como, por ejemplo, NG108-15 diferenciadas y células NG108-15 que contienen de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A o un sustrato de BoNT/E; células Neuro-2A tales como, por ejemplo, Neuro-2A células y células Neuro-2A diferenciadas que contienen de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; células KMS-11 tales como, por ejemplo, células KMS-11 diferenciadas y células KMS-11 que contienen de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/A; células N1E-115 tales como, por ejemplo, células N1E-115 diferenciadas y células N1E-115 que contienen de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E; y células SK-N-DZ tales como, por ejemplo, células SK-N-DZ diferenciadas y células SK-N-DZ que contienen de manera estable un sustrato de Toxina Clostridial, tal como, por ejemplo, un sustrato de BoNT/E.

Como se ha mencionado anteriormente, una molécula de ácido nucleico se puede usar para expresar un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. Se prevé que cualquiera y todos los procedimientos para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula se pueden usar. Los procedimientos útiles para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula que incluyen, sin limitación, mediado por fosfato de calcio, mediado por DEAE dextrano, mediado por lípido, mediado por poli breno, mediado por poli lisina, mediado por virus, microinyección, fusión de protoplasto, biolístico, electroporación y conjugación a un anticuerpo, gramacidina S, envoltura artificial viral u otro vehículo intracelular tal como TAT., véase, por ejemplo, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian cells, p, 16.1-16:62 (Sambrook y Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3ª ed. 2001); Alessia Colosimo et al., Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells; 29(2) Biotechniques 314-318, 320-322, 324 (2000); Philip Washboume y A. Kimberley McAllister, Techniques for gene transfer into neurons, 12(5) Curr. Opin. Neurobiol. 566-573 (2002); y Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, p 9.16.4-9.16.11 (2000). Los expertos en la técnica entienden que la selección de un procedimiento específico para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula dependerá, en parte, de si la célula contendrá de manera transitoria el sustrato de Toxina Clostridial o si la célula contendrá de manera estable el sustrato de Toxina Clostridial.

En un aspecto de esta realización, un procedimiento mediado por compuestos químicos, denominado transfección, se usa para introducir una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial en una célula. En los procedimientos mediados por compuestos químicos de transfección el reactivo químico un complejo con el ácido nucleico que facilita su captación en las células. tales reactivos químicos incluyen, sin limitación, mediado por fosfato de calcio, véase, por ejemplo, Martin Jordan y Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); mediado por dietil-laminoetil (DEAE) dextrano, mediado por lípidos, mediado por polímeros catiónicos como mediado por poli etileneimina (PEI) y mediado por poli lisina y mediado por poli breno, véase, por ejemplo, Chun Zhang et al., Poli etilenimine strategies for plasmid delivery to brainderived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004). Tales sistemas de distribución mediados por compuestos químicos se pueden preparar mediante procedimientos convencionales y están comercialmente disponibles, véase, por ejemplo, CellPhect Transfección Kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); Lipofectamine ^{TM}Transfección Reagent (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen500 Transfección kit (Fermentas, Inc., Hanover, MD), and SuperFect and Effectene Transfección Kits (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

En otro aspecto de esta realización, procedimiento mediado por compuestos físicos se usa para introducir una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial en una célula. Los reactivos físicos incluyen, sin limitación, electroporación, biolística y microinyección. Técnicas de biolística y microinyección perforan la pared celular con el fin de introducir la molécula de ácido nucleico en la célula, véase, por ejemplo, Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); y John O'Brien y Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004). Electroporación, también denominada electropermeabilización, usa en resumen, alta tensión, pulsos eléctricos para crear poros transitorios en la membrana a través de los cuales las moléculas de ácido nucleico entran y se pueden usar de manera eficaz para las transfecciones estables y transitorias de todos los tipos de células, véase, por ejemplo, M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); y Oliver Gresch et al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004).

En otro aspecto de esta realización, un procedimiento mediado por virus, denominado transducción, se usa para introducir una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial en una célula. En procedimientos mediados por virus de transducción transitoria, el procedimiento mediante el cual las partículas de virus infectan y se replican en una célula huésped se ha manipulado con el fin de usar este mecanismo para introducir una molécula de ácido nucleico en la célula. Los procedimientos mediados por virus se han desarrollado a partir de una amplia diversidad de virus incluyendo, sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus asociado a adeno, virus herpes, picornavirus, alfavirus y baculovirus, véase, por ejemplo, Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods164-172 (2004); y Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al. Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost y J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); y A. Huser y C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003).

Los adenovirus, que son virus de ADN sin envuelta, de doble cadena, se seleccionan a menudo para la transducción de células de mamífero debido a que los adenovirus manejan moléculas de ácido nucleico relativamente grandes de aproximadamente 36 kd, se producen a alta valoración, y pueden infectar de manera eficaz una amplia diversidad de células tanto que se están dividiendo como que no se están dividiendo, véase, por ejemplo, Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); e Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001). La transducción que usa sistema basado en adenovirus no soporta una expresión de proteína prolongada debido a que la molécula de ácido nucleico se lleva a cabo a partir de un episoma en el núcleo de la célula, en lugar de estar integrado en el cromosoma de la célula huésped. Los sistemas de vector adenovirual y protocolos específicos de cómo usar tales vectores se desvelan en, por ejemplo, ViraPower^{TM} Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y ViraPower^{TM} Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (15 de julio de 2002); y AdEasy^{TM} Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y AdEasy^{TM} Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.,

La distribución de la molécula de ácido nucleico también puede usar virus retrovirus de ARN de una sola cadena, tales como, por ejemplo, oncorretrovirus y lentivirus. Transducción mediada por retrovirales a menudo produce eficacias de transducción próximas a 100%, pueden fácilmente controlar el número de copias provirales mediante variación de la multiplicidad de infección (MOI), y se pueden usar para células transducidas o bien de manera transitoria estable, véase, por ejemplo, Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol, 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Félix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); y Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004). Retroviral particles consist of an RNA genome packaged in a protein capsid, surrounded by a lipid envelope. El retrovirus infecta una célula huésped mediante inyección de su ARN en el citoplasma junto con la enzima transcriptasa inversa. El molde de ARN de transcribe después de manera inversa en un cADN lineal, de cadena doble que se auto replica mediante integración en el genoma de la célula huésped. Las partículas virales se extiende tanto verticalmente (desde la célula precursora hasta las células hijas mediante el provirus) así como horizontalmente (de célula a célula mediante viriones). La estrategia de replicación permite la expresión persistente a largo plazo ya que las moléculas de ácido nucleico de interés se integran de manera estable en un cromosoma de la célula huésped, permitiendo por lo tanto expresión a largo plazo de la proteína. Por ejemplo, estudios animales han mostrado que los vectores lentivirales inyectados en una diversidad de tejidos produjeron expresión de proteína durante más de 1 año, véase, por ejemplo, Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996). Los sistemas de vector derivados de Oncoretrovirus, tales como, por ejemplo, virus de la leucemia murina Moloney (MoMLV), se usan ampliamente e infectan muchas células que no se dividen diferentes, incluyendo células que se dividen y no se dividen. Los lentivirus también pueden infectar muchos tipos de células diferentes, incluyendo células que se dividen y no se dividen y poseen proteínas de envuelta complejas, que permite alta dirección celular específica.

Los sistemas de vector retroviral y protocolos específicos de cómo usar tales vectores se desvelan en, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos números. Manfred Gossen y Hermann Bujard, Tight control de expresión génica en células eucarióticas mediante promotores sensibles a tetraciclina, Patente de Estados Unidos Nº 5.464.758 (7 de noviembre de 1995) y Hermann Bujard y Manfred Gossen, Procedimientos para regular la expresión génica, Patente de Estados Unidos Nº 5.814.618 (29 de septiembre de 1998) David S. Hogness, Poli nucleótidos que codifican poli péptidos del receptor de hormona esteroide y células transformadas con los mismos, Patente de Estados Unidos Nº 5.514.578 (7de mayo de 1996) y David S. Hogness, Poli nucleótido que codifica receptor de ecdisona de insecto, Patente de Estados Unidos 6.245.531 (12 de junio de 2001); Elisabetta Vegeto et al., Receptor de Progesterone que tiene truncamientos del dominio de unión de hormonas C. terminal, Patente de Estados Unidos Nº 5.364.791 (15 de noviembre de 1994), Elisabetta Vegeto et al., Receptores de hormona esteroide mutados, procedimientos para su uso y desplazamiento molecular para terapia génica, Patente de Estados Unidos Nº 5.874.534 (23 de febrero de 1999) y Elisabetta Vegeto et al., Receptores de hormona esteroide mutados, procedimientos para su uso y desplazamiento molecular para terapia génica, Patente de Estados Unidos Nº 5,935,934 (10 de agosto de1999). Además, tales sistemas de distribución viral se pueden preparar mediante procedimientos convencionales y están comercialmente disponibles, véase, por ejemplo, BD^{TM} Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) and BD^{TM} Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1. BD Biosciences Clonetech, (14 de marzo de 2003), GeneSwitch ^{TM} System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and GeneSwitch^{TM} SystemAMifepristone-Regulated Expression System for Mammalian cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (4 de noviembre de 2002); ViraPower^{TM} Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and ViraPower^{TM} Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (8 de diciembre de 2003); y Complete Control® Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) and Complete Control® Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005e.

Como se ha mencionado anteriormente, un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva se puede introducir en una célula. Se prevé que cualquiera y todos los procedimientos que usan un agente de distribución para introducir un sustrato de Toxina Clostridial en una población de células se pueden usar. Como se usa en el presente documento, el término "agente de distribución" significa cualquier molécula que permite o potencia internalización de una unida de manera covalente, unida de manera no covalente o o de cualquier otra manera asociada con un sustrato de Toxina Clostridial en una célula. De este modo, el término "agente de distribución" abarca, sin limitación, proteínas, péptidos, mimético de péptidos, molécula pequeña, moléculas de ácido nucleico, liposomas, lípidos, virus, retrovirus y células que, sin limitación, transportan un sustrato unido de manera covalente o no covalente a la membrana, citoplasma o núcleo celular. Además el término "agente de distribución" abarca moléculas que se internalizan mediante cualquier mecanismo, incluyendo agentes de distribución que funcionan mediante endocitosis mediada por receptor y las que son independientes de endocitosis mediada por receptor.

También se prevé que cualquiera y todos los procedimientos útiles para introducir un sustrato de Toxina Clostridial con un agente de distribución en una población de células puede ser útil con la condición que este procedimiento para introducir un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva en al menos 50% de las células dentro de una población de células dada. De este modo, aspectos de esta realización pueden incluir una población de células en la que, por ejemplo, al menos 90% de la población de células dada contiene un sustrato de Toxina Clostridial, al menos 80% de la población de células dada contiene un sustrato de Toxina Clostridial, al menos 70% de la población de células dada contiene un sustrato de Toxina Clostridial, al menos 60% de la población de células dada contiene un sustrato de Toxina Clostridial, al menos 50% de la población de células dada contiene un sustrato de Toxina Clostridial.

También se prevé que cualquiera y todos los procedimientos útiles para introducir un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva unido a un agente de distribución puede ser útil, incluyendo procedimientos que unen de manera covalente el agente de distribución al sustrato y los procedimientos que unen de manera no covalente el agente de distribución al sustrato. Los procedimientos de unión covalente que unen un agente de distribución a un sustrato de Toxina Clostridial pueden incluir conjugación química y proteínas de fusión producidas de manera genética. En un procedimiento no limitante, un poli nucleótido, tal como, por ejemplo, un plásmido u oligonucleótido, se une a un sustrato de Toxina Clostridial mediante química de conjugación y se introduce en la célula usando un procedimiento útil para introducir una molécula de ácido nucleico en una población de células como se desvela en la presente memoria descriptiva. En otro procedimiento no limitante, un lípido, tal como, por ejemplo, un liposoma catiónico, se une a un sustrato de Toxina Clostridial mediante química de conjugación y se introduce en la célula usando un procedimiento útil para introducir una molécula de ácido nucleico en una población de células como se desvela en la presente memoria descriptiva. En todavía otro procedimiento no limitante, un péptido, se une a un sustrato de Toxina Clostridial mediante química de conjugación y se introduce en la célula usando un procedimiento de distribución de proteína descrito más abajo. En todavía otro procedimiento no limitante, un péptido se une a un sustrato de Toxina Clostridial mediante la producción de una molécula de ácido nucleico que codifica el agente de distribución de péptido y sustrato como una proteína de fusión unida de manera operacional y esta proteína de fusión se introduce en la célula usando un procedimiento de administración de proteína descrito
más abajo.

En un aspecto de la presente invención, un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva se puede introducir en una célula usando un agente de distribución de péptido para producir una célula transitoriamente que contiene un sustrato de Toxina Clostridial capaz de localizarse en el plasma. Se prevé que una diversidad de agentes de distribución de péptido se pueden unir de manera covalente a un sustrato de Toxina Clostridial, incluyendo, sin limitación, el fragmento activo de los péptidos de transducción de proteína; el fragmento activo de los péptidos que penetran en la célula; fosfopéptidos; el fragmento activo de los péptidos de translocación de membrana; el fragmento activo de las proteínas secretadas; el fragmento activo de los péptidos de señal de localización nuclear; péptidos predominantemente hidrófobos; péptidos predominantemente \alpha-helicoidales, tales como, por ejemplo, péptido helicoidal anfipático; predominantemente péptidos básicos, tales como, por ejemplo, péptidos afipaticos básicos; péptidos que contiene D-aminoácidos; péptidoscortos, tales como, por ejemplo, KDEL; péptidos desnaturalizados unidos a un sustrato de Toxina Clostridial desnaturalizado o plegado como se desvela en, por ejemplo, Steven F. Dowdy, Methods for Transducing Fusion Molecules, Publicación PCT No. WO99/55899 (11 de noviembre de 1999); y Steven F. Dowdy, Novel Transduction Molecules and Methods for Using the Same, Publicación PCT No. WO00/62067 (19 de octubre de 2000); y cualquier otro péptido desnaturalizado o plegado, modificado o no modificado, de origen natural o sintético, mimético de péptidos o sus análogos.

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Se prevé que cualquiera y todas los longitudes de péptido de un agente de distribución puede ser útil en aspectos de la presente invención. En aspectos de esta realización, por lo tanto, un agente de distribución útil para introducir un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva en una célula puede ser un péptido o mimético de péptido que tiene una longitud de menos de 10 restos, una longitud de menos de 20 restos, una longitud de menos de 30 restos, una longitud de menos de 40 restos, o una longitud de menos de 50 restos.

Como ejemplos no limitantes, los agentes de distribución adecuadas para introducir un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva en una célula incluyen poli lisina; factor neurotrófico ciliar (CNTF) o su fragmento activo; caveolina o su fragmento activo; interleukina-1 (IL-1) o su fragmento activo; thioredoxina o su fragmento activo; péptidos derivados de homeodominio o su fragmento activo, tal como, por ejemplo, Antennapedia (Antp) o su fragmento activo, como penetratina-1 (SEQ ID NO: 160), Engrailed 1 (En1) o su fragmento activo, Engrailed 2 (En2) o su fragmento activo, Hoxb-4 o su fragmento activo, Hoxa-5 o su fragmento activo, Hoxc-8 o su fragmento activo, y Knotted-1 (KN1) o su fragmento activo; factor-1 de crecimiento de fibroblastos (FGF-1) o su fragmento activo; factor de crecimiento de fibroblastos de Kaposi (kFGF) o su fragmento activo, tal como, por ejemplo, AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 169); integrina de tipo humano 3 o su fragmento activo tal como, por ejemplo, una secuencia de señal hidrófoba; una secuencia de localización nuclear (NLS) o su fragmento activo, tal como, por ejemplo, TPPKKKRKVEDP (SEQ ID NO: 170); FGF-2 o su fragmento activo; transportan o su fragmento activo, tal como; por ejemplo, GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 171); lactoferrin o su fragmento activo; VP22 o su fragmento activo; transactivator de tipo I de VIH (HIV TAT) o su fragmento activo, tal como, por ejemplo, (YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 168); o una proteína de choque térmico tal como HSP70 o su fragmento activo. Éstos y otros agentes se conocen bien en la técnica como se desvela en, por ejemplo, Steven R. Schwarze and Steven F. Dowdy, In vivo protein transducción: intracellular delivery of biologically active proteínas, compounds and DNA, 21(2) Trends Pharmacol. Sci. 45-48 (2000); Dara J. Dunican and Patrick Doherty, Designing cell-permeant phosphopéptidos to modulate intracellular signaling pathways, 60(1) Biopolymers 45-60 (2001); K. G. Ford et al., proteín transducción: an alternative to genetic intervention? 8(1) Gene Ther. 1-4 (2001); Alain Prochiantz, Messenger proteínas: homeoproteínas, TAT and others, 12 (4) Curr. Opin. célula Biol. 400-406 (2000); J. J. Schwartz and S. Zhang, Peptide-mediated cellular delivery, 2(2) Curr. Opin. Mol. Ther. 162-167 (2000); y Steven F. Dowdy, Protein Transducción System and Methods of Use Thereof, Publicación PCT No. WO00/34308 (15 de junio de 2000).

En una realización, un agente de distribución puede ser una homeoproteína o su fragmento activo, tal como, por ejemplo, a homeodominio o su fragmento activo. Homeoproteínas son proteínas de hélice girada que contienen un dominio de unión a ADN de aproximadamente 60 restos, denominado homeodominio. una diversidad de homeoproteínas, homeodominios y sus fragmentos activos pueden ser agentes de distribución útiles en la invención incluyendo, sin limitación, Antennapedia, Engrailed1 (En1), Engrailed2 (En2), Hoxa-5, Hoxc-8, Hoxb-4 y Knotted-1 (KN1). Como un ejemplo, En1 y En1 se han expresado en células COS-7, donde primero se secretan y después se internalizan en otras células, véase, por ejemplo, Prochiantz, supra, (2000). Agentes de distribución que usan péptidos derivados de homeodominios y procedimientos de uso de tales agentes, por ejemplo, Gérard Chassaing y Alain Prochiantz, peptides which can be Used as Vectors for the Intracellular Addresing of Active Molecuels, Patente de Estados Unidos Nº 6,080,724 (27 de junio de 2000).

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En un aspecto de esta realización, una composición de composición de sustrato de la invención incluye un agente de distribución que es la proteína de homeodominio, Antennapedia o su fragmento activo, o su fragmento activo. Antennapedia es un miembro de una familia de homeoproteínas de Drosophila importantes desde el punto de vista de desarrollo que se transloca a través de las membranas neuronales. La tercera hélice del homeodominio de Antennapedia, el péptido 16 restos "penetratina-1" (SEQ ID NO: 160), se internaliza en células vivas. La internalización se produce tanto a 37ºC como a 4ºC, indicando que la distribución ni está mediada por receptor ni depende de la energía. Agentes de distribución adicionales incluyen péptidos y mimético de péptidos relacionados en la secuencia a Penetratina-1 tales como, sin limitación, uno de los péptidos mostrados más adelante en la Tabla 12 u otro péptido o mimético de péptido derivado de penetratina, incluyendo un péptido o mimético de péptido retroinverso de aminoácido D, o un péptido o mimético de péptido relacionado pero no de \alpha-hélice, véase. por ejemplo, Chassaing y Prochiantz, supra, (2000). En una realización, tal péptido derivado de penetratina mantiene los restos de triptófano, fenilalanina y glutamina de penetratina-1 (SEQ ID NO: 160).

En otra realización, una composición de sustrato de la invención incluye un agente de distribución que es un proteína de transactivator de VIH (TAT) o su fragmento activo. Tal agente de distribución puede incluir, por ejemplo, una secuencia idéntica o similar a los restos 47-57 o 47-59 de TAT de VIH, véase, por ejemplo, Alan Frankel et al., Fusion Protein Comprising TAT-derived Transport Moiert, Patente de Estados Unidos Nº 5.674.980 (7 de octubre de 1995); Alan Frankel et al., TAT-derived Transport Polipeptide Conjugates, Patente de Estados Unidos Nº 5.747.641 (5 de mayo de 1998); y Alan Frankel et al., TAT-derived Transport Polipeptids and Fusion Proteins, Patente de Estados Unidos Nº 5.804.604 (8 de septiembre de 1998). Como un ejemplo, las proteínas de fusión que incluyen los restos 47-57 de TAT de VIH (YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 168) cruzan la membrana plasmática de, por ejemplo, células de tipo in vitro e in vivo, véase, por ejemplo, Schwartz y Zhang, supra, (2000); una diversidad de proteínas de 15 a 120 KDa se ha mostrado que retienen la actividad biológica cuando se condensan a un agente de distribución TAT de VIH. Un agente de distribución TAT de VIH puede estar cargado de manera positiva y puede funcionar, por ejemplo, en un receptor de energía, transportador y endocitosis de manera independiente para administrar un sustrato de Toxina Clostridial unido de manera covalente, por ejemplo, 90-100% de células diana. Los agentes de distribución que usan péptidos derivados de TAT y los procedimientos de uso detalles agentes se desvelan en, por ejemplo, Frankel et al., supra, (1995); Frankel et al., supra, (1998); y Frankel et al., supra, (1998).

En otra realización, una composición de sustrato de la invención también puede incluir como agente de distribución una proteína o su fragmento activo de virus VP22 de herpes simplex. En un aspecto de esta realización, una composición de sustrato de la invención incluye una proteína o su fragmento activo de VP22 HSV tipo 1 (HSV-1). HSV VP22, un factor de transcripción nuclear, puede cruzar la membrana plasmática mediante endocitosis no clásica y puede entrar en las células independientes de las uniones de GAP y contactos físicos. Como una fusión con una diversidad de proteínas diferentes, HSV VP22 da como resultado la captación en la células de diferentes tipos incluyendo células terminalmente diferenciadas ay puede funcionar para administrar un sustrato de Toxina Clostridial unido a, por ejemplo, 90-100% de células cultivadas. Los agentes de distribución que usan péptidos derivados de TAT y procedimientos de uso tales agentes se desvelan en, por ejemplo, Peter F. J. O'Hare y Gillian D. Elliott, Transport Proteins and Their Uses, Publicación de Patente PCT No. WO97/05265 (13 de febrero de 1997); Peter F. J. O'Hare y Gillian D. Elliott, Fusion Proteins for Intracellular and Intercellular Transport and Their Uses, Publicación de Patente PCT No. WO98/32866 (30 de julio de 1998); Peter F. J. O'Hare et al., Use of Transport Proteins, Patente de Estados Unidos Nº 6.734.167 (11 de mayo de 2004).

En otra realización, un agente de distribución útil en la invención corresponde a o se deriva de una secuencia de señal hidrófoba. Tal agente de distribución puede ser, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos de Kaposi (kFGF) o su fragmento activo tal como AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 169); integrina \beta3 humana o su fragmento activo; u otro agente de distribución hidrófobo tales como los desvelados en, por ejemplo, Dunican y Doherty, supra, (2001). Los agentes de distribución que usan péptidos derivados de las secuencias de señal hidrófobas y procedimientos de uso de tales agentes se desvelan en, por ejemplo, Yao-Zhong Lin y Jack J. Hawiger, Method for importing biologically active molecules into cells, Patente de Estados Unidos Nº 5.807.746 (15 de septiembre de 1998); Yao-Zhong Lin y Jack J. Hawiger, Method for importing biologically active molecules into cells, Patente de Estados Unidos Nº 6.043.339 (28 de marzo de 2000); Yao-Zhong Lin et al., sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with cell Membrane Translocating Activity, Patente de Estados Unidos Nº 6.248.558 (19 de junio de 2001); Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with cell Membrane Translocating Activity, Patente de Estados Unidos Nº 6.432.680 (13 de agosto de 2002); Jack J. Hawiger et al., Method for importing biologically active molecules into cells, Patente de Estados Unidos Nº 6.495.518 (17 de diciembre de 2002); y Yao-Zhong Lin et al., secuencia and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, Patente de Estados Unidos Nº 6.780.843 (24 de agosto 2004).

En otra realización, un agente de distribución útil en la invención también puede ser una secuencia sintética que comparte una o más características de un agente de distribución de origen natural tal como, por ejemplo, un dominio de transducción de proteína (PTD). Tales agentes de distribución incluyen, pero no se limitan a, oligómeros de arginina L- y D-, por ejemplo, 9-meros de arginina L- y D- y peptoides relacionados, véase, por ejemplo, Jonathan B. Rothbard y Paul A Wender, Methd and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, Patente de Estados Unidos Nº 6.306.993 (23 de octubre 2001); y Jonathan B. Rothbard y Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, Patente de Estados Unidos Nº 6.495.663 (17 de diciembre de 2002). Tales agentes de distribución además incluyen péptidos and mimético de péptidos básicos; péptidos y mimético de péptidos básicos \alpha-helicoidales; y péptidos y mimético de péptidos con carácter de alineación de arginina normalizada u optimizada \alpha-helicoidal cuando se compara con un dominio de transducción de proteína de origen natural tal como los restos 47-57 de TAT de VIH, véase, por ejemplo, Rothbard y Wender, supra, (2001); y Rothbard y Wender, supra, (2002). Los expertos en la técnica entienden que éstos y otros agentes de distribución de origen natural y sintéticos pueden ser útil en las composiciones de sustrato de la invención.

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En otra realización, un conjugado de proteína consta de anticuerpo dirigido a un receptor sobre la membrana plasmática y un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva se puede introducir en una célula. Los agentes de distribución que usan anticuerpos y procedimientos de uso de tales agentes se desvela en, por ejemplo, Pamela B. Davis et al., Fusion proteins for protein delivery, Patente de Estados Unidos Nº 6.287.817 (11 de septiembre de 2001).

Un agente de distribución útil en la invención también puede ser un agente que permite o o potencia la captación celular sustrato de Toxina Clostridial asociado de manera no covalente. En una realización, tal agente de distribución es péptido que contiene dos dominios independientes: un dominio hidrófobo y un dominio hidrófilo. En otra realización, tal agente de distribución es un péptido MPG, que es un péptido derivado de tanto la secuencia de localización nuclear (NLS) de antígeno T SV40 grande como el dominio de péptido de fusión de VIH-1 gp41, véase, por ejemplo, Virginie Escriou et al., NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus, 55(2) Adv. Drug Deliv. Rev. 295-306 (2003). En una realización adicional, tal agente de distribución es un péptido MPG que tiene la secuencia de aminoácidos GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SEQ ID NO: 172). En todavía una realización adicional, tal agente de distribución es un péptido anfipático tal como Pep-1. éstos y agentes de distribución relacionados que funcionan en la ausencia de enlace covalente y procedimientos de uso de tales agentes se desvelan en, por ejemplo, Pilles Divita et al, Peptide-mediated Transfección Agents and Metods of Use, Patente de Estados Unidos Nº 6.841.535 (11 de enero de 2005); Philip L Felgner and Olivier Zelphati, Intracellular protein Delivery compositions and Methods of Use, Publicación de patente de Estados Unidos Nº 2003/0008813); y Michael Karas Intracellular Delivery of Small Molecules, Proteins and Nucleic Acids, Publicación de patente de Estados Unidos 2004/0209797 (21 de octubre de 2004). Tales agentes de distribución de péptido se puede preparar y usar mediante procedimientos convencionales y están comercialmente disponibles, véase, por ejemplo, the Chaiot^{TM} Reagent (Active Motif, Carisbad, CA); BioPORTER® Reagent (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego. CA), BioTrek^{TM} Protein Delivery Reagent (Stratagene, La Jolla, CA), y Pro-Ject^{TM} Protein Transfection Reagent (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL).

Otro aspecto de la presente invención proporciona construcciones de expresión que permiten la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. Estas construcciones de expresión comprenden una fase abierta de lectura que codifica un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva, unido de manera operativa a secuencias de control de un vector de expresión útil para expresar el sustrato de Toxina Clostridial en una célula. El término "unido de manera operativa" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquiera de una diversidad de procedimientos de clonación que puede ligar una molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria descriptiva en un vector de expresión de manera que un péptido codificado por la composición se cuando se introduce en una célula. Técnicas de biología molecular bien establecidas que pueden ser necesarias para preparar una construcción de expresión descrita en la presente memoria descriptiva incluyendo, pero sin limitación a, procedimientos que implican reacciones de enzima de restricción de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis en gel de agarosa, ligamiento de ácido nucleico, transformación bacteriana, purificación de ácido nucleico, secuenciación de ácido nucleico son procedimientos de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica y de la enseñanza en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de protocolos específicos para preparar una construcción de expresión se desvelan en por ejemplo, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley y Sons, 2004), que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia. Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica y de la enseñanza en el presente documento.

Se pueden emplear una amplia diversidad de vectores de vectores de expresión para expresar una fase abierta de lectura que codifica un sustrato de Toxina Clostridial e incluyen sin limitación, vectores de expresión virales, vectores de expresión procarióticos y vectores de expresión eucarióticos incluyendo vectores de expresión de levadura, de insecto y de mamíferos y en general son equivalentes a los vectores de expresión desvelados en el presente documento en los ejemplos 4-6 y 8-14. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión, junto con reactivos y condiciones bien establecidos para preparar y usar una construcción de expresión a partir de tales vectores de expresión están fácilmente disponibles a partir de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. La selección, preparación y uso de un vector de expresión son procedimientos de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica y de las enseñanzas en el presente documento.

Se prevé que cualquiera de una diversidad de sistemas de expresión pueden ser útiles para expresar composiciones de construcción descritas en la presente memoria descriptiva. Un sistema de expresión abarca tanto sistemas de expresión basados en células como sin células. Los sistemas basados en células incluyen, sin limitación, viral sistemas de expresión, sistemas de expresión procarióticos, sistemas de expresión de levaduras, baculoviral sistemas de expresión baculovirales, sistemas de expresión de insectos y sistemas de expresión de mamíferos. Los sistemas sin células incluyen, sin limitación, extractos de germen de trigo, extractos de reticulocitos de conejo y extractos de E. coli. Expresión que usa un sistema de expresión puede incluir cualquiera de una diversidad de características incluyendo, sin limitación, expresión inducible, expresión no inducible, expresión constitutiva, expresión mediada por virus, expresión establemente integrada, y expresión transitoria. Los sistemas de expresión que incluyen vectores bien caracterizados, reactivos, condiciones y células están bien establecidos y están fácilmente disponibles a partir de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; RocheApplied Science, Indianapolis, IN; y Stratagene, La Jolla, CA. Los ejemplos no limitantes en la selección y uso de sistemas de expresión heterólogos apropiados se desvelan en por ejemplo, PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez y James P. Hoeffler, GENE SISTEMAS DE EXPRESIÓN. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); and Meena Rai y Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001), que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia. Estos protocolos
son procedimientos de rutina dentro de los expertos en la técnica y de la enseñanza en el presente documento.

Una construcción de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva puede estar ligado de manera operacional a una diversidad de elementos reguladores que pueden modular positivamente o negativamente, o bien directa o indirectamente, la expresión de una molécula de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, promotores y potenciadores constitutivos, específicos de tejido, inducibles o sintéticos. Los ejemplos no limitantes de elementos reguladores constitutivos incluyen, por ejemplo, los elementos reguladores de citomegalovirus (CMV), timidina quinasa de virus herpes simplex (HSV TK), virus 40 de simio (SV40) temprano, repetición terminal larga en 5' (LTR), factor-1\alpha de elongación (EF-1\alpha) y poli biquitina (UbC). Los ejemplos no limitantes de elementos reguladores inducibles útiles en aspectos de la presente invención incluyen, por ejemplo, elementos reguladores inducibles por compuestos químicos tales como, sin limitación, regulados por alcohol, regulados por tetraciclina, regulados por esteroide, regulados por metal y relacionados con la patogénesis y elementos reguladores inducibles por compuestos físicos tales como, sin limitación, regulados por temperatura y regulados por la luz. Tales elementos reguladores inducibles se pueden preparar y usar mediante procedimientos convencionales y están comercialmente disponibles, incluyendo, sin limitación, elementos inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina tales como, por ejemplo, Tet-On^{TM} y Tet-Off^{TM} (BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA) y el T-REx^{TM} (Expresión Regulada por Tetraciclina) y Sistemas Flp-In^{TM} T-REx^{TM} (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); elementos reguladores inducibles por ecdisona tal como, por ejemplo, el Sistema de expresión de mamíferos inducible Complete Control® (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); elementos reguladores inducibles por isopropil \beta-D-galactopiranósido (IPTG) tal como, por ejemplo, el Sistema de expresión de mamíferos inducible LacSwitch® II (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); y elementos reguladores inducibles por esteroide tal como, por ejemplo, el sistema inducible del receptor de progesterona quimérico, GeneSwitch^{TM} (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Los expertos en la técnica entienden que éstos y una diversidad de otros sistemas reguladores constitutivos e inducibles están comercialmente disponibles o o se conocen bien en la técnica y pueden ser útiles en la invención para controlar la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de Toxina Clostridial.

En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica el sustrato de Toxina Clostridial puede opcionalmente estar ligado a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo.

En otra realización, una molécula de ácido nucleico que codifica el sustrato de Toxina Clostridial puede opcionalmente estar ligado a un elemento regulador tal como un elemento regulador inducible. En un aspecto de esta realización, la expresión de la molécula de ácido nucleico se induce usando, por ejemplo, inducible por tetraciclina, inducible por ecdisona o inducible por esteroide.

Los aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos de determinación de la actividad de Toxina Clostridial que comprende (a) poner en contacto con una muestra una célula que comprende (1) un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana que comprende (i) un primer miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET); y (ii) una secuencia de reconocimiento de toxina Clostridial que incluye un sitio de escisión; y (2) un segundo miembro asociado a membrana del par de FRET, en el que la célula es capaz de intoxicación por Toxina Clostridial; en el que el par de FRET contiene un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de un fluoróforo donante; y en el que, en las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se exhibe entre el el primer y segundo miembros del par de FRET; (b) excitar el fluoróforo donante; y (c) determinar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula puesta en contacto con relación a una célula control, donde una diferencia en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de actividad de la Toxina Clostridial.

Además se proporciona en el presente documento un procedimiento de determinación de la actividad de BoNT/A que comprende (a) poner en contacto con una muestra una célula neuronal que comprende (1) una molécula de ácido nucleico expresada de manera estable que codifica un sustrato de BoNT/A asociado a membrana que comprende (i) una proteína fluorescente; y (ii) una secuencia de reconocimiento de BoNT/A incluyendo un sitio de escisión; y (2) un colorante lipófilo asociado a membrana que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de la proteína fluorescente; en el que la célula neuronal es capaz de intoxicación por BoNT/A; y en el que, en las condiciones apropiados, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se muestra entre la proteína fluorescente y el colorante lipófilo; (b) que excita la proteína fluorescente; y (c) determinar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula neuronal puesta en contacto con relación a una célula control, donde una diferencia en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula neuronal que se ha puesto en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de la actividad de BoNT/A. En una realización, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/A se practica usando una célula neuronal que es una célula Neuro-2A. En otra realización, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/A se practica usando un sustrato de BoNT/A que contiene, en parte una proteína fluorescente verde. En una realización adicional, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/A se practica usando un sustrato de BoNT/A que comprende, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A que incluye restos 1 a 206 de la SEQ ID NO: 90. En una realización adicional, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/A se practica usando DilC_{18}(3) como el colorante lipófilo.

La presente invención de manera adicional proporciona un procedimiento de determinación de la actividad de BoNT/E que comprende

(a)

poner en contacto con una muestra una célula neuronal que comprende (1) una molécula de ácido nucleico expresada de manera estable que codifica un sustrato de BoNT/E asociado a membrana que comprende (i) una proteína fluorescente; y (ii) una secuencia de reconocimiento de BoNT/E que incluye un sitio de escisión; y (2) un colorante lipófilo asociado a membrana que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de la proteína fluorescente;

en el que la célula neuronal es capaz de intoxicación por BoNT/E; y en el que, en las condiciones apropiadas, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se exhibe entre la proteína fluorescente y el colorante lipófilo; (b) excitar la proteína fluorescente; y (c) determinar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula neuronal puesta en contacto con relación a una célula control, donde una diferencia en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula neuronal que se ha puesto en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de la actividad de BoNT/E. En una realización, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/E se practica usando célula neuronal que es una célula SK-N-DZ. En otra realización, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/E se practica usando célula neuronal que es una célula SH-SYSY. En otra realización, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/E se practica usando un sustrato de BoNT/E que contiene, en parte, una proteína fluorescente verde. En una realización adicional, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/E se practica usando un sustrato de BoNT/E que contiene, en parte, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E que incluye restos 1 a 206 de la SEQ ID NO: 90. En una realización adicional, un procedimiento de la invención para determinar la actividad de BoNT/E se practica usando DilC18 (3) como el colorante lipófilo.

Los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, un sustrato de Toxina Clostridial. Se prevé que cualquiera y todos los sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva se pueden usar para practicar los presentes procedimientos. De este modo, aspectos de esta realización incluyen moléculas de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, ADN y ARN, que codifican un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva y molécula de péptido o mimético de péptido que comprende un sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. Otros aspectos de esta realización incluyen, en parte, una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que incluye, sin limitación, una secuencia de reconocimiento de toxina de BoNT/A, una secuencia de reconocimiento de toxina de BaNT/B, una secuencia de reconocimiento de toxina de BoNT/C1, una secuencia de reconocimiento de toxina de BoNT/D, una secuencia de reconocimiento de toxina de BoNT/E, una secuencia de reconocimiento de toxina de BoNT/F, una secuencia de reconocimiento de toxina de BoNT/G y una secuencia de reconocimiento de toxina de TeNT. Otros aspectos de esta realización incluyen, en parte, a dominio de dirección de membrana que incluyen, sin limitación, dominios de dirección de membrana de origen natural presentes en SNAP-25, variantes de SNAP-25 MTD de origen natural, y variantes de SNAP-25 MTD de origen no natural, y mimético de péptidos de SNAP-25 MTD; y dominios de dirección de membrana de origen natural presentes en sintaxina, variantes de MTD de origen natural de sintaxina, y variantes de MTD de origen no natural de sintaxina y de miméticos de péptidos de MTD de sintaxina.

Los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, un primer miembro de un par de FRET que incluyen, sin limitación, proteínas fluorescentes de tipo salvaje, variantes de origen natural, variantes modificadas por ingeniería genética, fragmentos de péptidos activos derivados de proteínas fluorescentes de Aequorea, proteínas fluorescentes de Anemonia, proteínas fluorescentes de Anthozoa, proteínas fluorescentes de Discosoma, proteínas fluorescentes de Entacmeae, proteínas fluorescentes de Heteractis, proteínas fluorescentes de Montastrea, proteínas fluorescentes de Renilla, proteínas fluorescentes de Zoanthus y proteínas de unión a fluoróforo. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes incluyen, por ejemplo, EBFP, ECFP, AmCyan, AcGFP, ZsGreen, Vitality® hrGFP, -EGFP, Monster Green® hMGFP, EYFP, ZsYellow, DsRed-Express, DsRed2, DsRed, AsRed2 y HcRed1. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes incluyen, por ejemplo, un péptido de tetracisteína, una AGT y una deshalogenasa.

Los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, un segundo miembro de un par de FRET que incluye, sin limitación, un colorante de carbocianina de cadena larga, colorante de aminoestirilo, colorante de espirilo anfifílico, colorante de catión lipófilo o de FM. Una diversidad de colorantes lipófilos son útiles en procedimientos de la presente invención incluyen, sin limitación, FAST DiO, DiOC18 (3), DiOC16(3), SP-DiOC18(3), 4-Di-16-ASP, 4-Di-10-ASP, FAST DiA, DilC18(3), DilC16(3), DilC12(3), FAST Dil, \Delta^{9}-Dil, FM®Dil, CellTracker CM-Dil, DilC18(3)-DS, SP-DilC18(3), Br2-DilC18(3), 5,5'-Ph2-DilC18(3), DilC18(5), DilC18(5)-DS, DilC18(7), FM® 1-43, FM® 1-84, FM® 2-10, FM® 4-64, FM® 5-95,RH414. DiSBAC2(3), JC-1, CCCP, octadecil rodamina B; 5-Dodecanoilaminofluoresceína, 5-hexadecanoil-aminofluoresceína, 5-octadecanoil-aminofluoresceína y el octadecil éster de fluoresceína, 4-heptadecil-7-hidroxicumarina, DPH, TMA-DPH, TMAP-DPH, ácido DPH ppropiónico, BODIPY 493/503, BODIPY 505/515, BODIPY 665/676, BODIPY FL C5-ceramida, CellTrace BODIPY TR metil éster, colorante de fenoxazina rojo nilo, 1,3-Bis-(1-pireno)propano, ácido dapoxil sulfónico, prodan, laurdan, acrilodan, badan, 1,8-ANS, 2,6-ANS, 2,6-TNS, bis-ANS, DCVJ y MBDS.

Los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una célula capaz de intoxicación por Toxina Clostridial. Se prevé que cualquiera y todas las células descritas en la presente memoria descriptiva se pueden usar para practicar los presentes procedimientos. De este modo, aspectos de esta realización incluyen células, tales como, por ejemplo, células que expresan uno o más Receptores de Toxina Clostridial incluyendo, sin limitación, un receptor de Toxina Clostridial de baja afinidad, un receptor de Toxina Clostridial de alta afinidad, un receptor de Toxina Clostridial endógeno, un receptor de Toxina Clostridial exógeno, un receptor de BoNT/A, un receptor de BoNT/B, un receptor de BoNT/Cl, un receptor de BoNT/D, un receptor de BoNT/E, un receptor de BoNT/F, un receptor de BoNT/G y un receptor de TeNT. Otros aspectos de esta realización incluyen células, tales como, por ejemplo, células neuronales que incluyen, sin limitación, células neuronales primarios; células neuronales inmortalizadas o establecidas; células neuronales transformadas; células neuronales tumorales; células neuronales transfectadas de manera estable y transitoria que expresan un receptor de Toxina Clostridial, y además incluyen, aunque no se limitan a, células neuronales de mamífero, de tipo murino, de rata, de primate y de ser humano. Otros aspectos de esta realización incluyen células de, tales como, por ejemplo, líneas celulares neuronales que incluyen, sin limitación, líneas celulares de neuroblastoma, líneas celulares híbridas neuronales, líneas celulares de la médula espinal, líneas celulares sistema nervioso central, líneas celulares de la corteza cerebral, líneas celulares del ganglio de la raíz dorsal, líneas celulares del hipocampo y líneas celulares de feocromocitoma. Los ejemplos no limitantes de líneas celulares neuronales incluyen, por ejemplo, líneas celulares de neuroblastoma BE (2)-C, BE(2)-M17, C1300, CHP-212, CHP-126, IMR 32, KELLY, LA-N-2, MC-IXC, MHH-NB-11, N18Tg2, N1E-115, N4TG3, Neuro-2A, NB41A3, NS20Y, SH-SYSY, SIMA, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-MC y SK-N-SH; líneas celulares híbridas de neuroblastoma/glioma N18, NG108-15 y NG115-401L; líneas celulares híbridas de neuroblastoma/neurona motora NSC-19 y NSC-32; líneas celulares híbridas de neuroblastoma/neurona de ganglio de la raíz F11, ND-C, ND-E, ND-U1, ND3, ND7/23, ND8/34, ND8/47, ND15 y ND27; las líneas celulares híbridas de neuroblastoma/neurona del hipocampo HN-33; líneas celulares de la médula espinal TE 189.T y M4b; líneas celulares de la corteza cerebral CNh, HCN-1a y HCN-2; línea celular del ganglio de la raíz dorsal G4b; líneas celulares del hipocampo HT-4, HT-22 y HN33; FGFR3 que expresan las líneas celulares H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 y UTMC-2.En aspectos adicionales de esta realización, una célula que expresa FGFR3 puede ser, por ejemplo, H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 UTMC-2, B9, TC, L6 and CFK2. Otros aspectos de esta realización incluyen células, tales como, por ejemplo, células no neuronales que incluyen, sin limitación, células no neuronales primarias; células no neuronales inmortalizadas o establecidas; células no neuronales transformadas; células no neuronales tumorales; células no neuronales transfectadas de manera estable y transitoria que expresan un receptor de Toxina Clostridial, y además incluyen, aunque no se limitan a, células no neuronales de mamífero, de tipo murino, de rata, de primate y de ser humano. Otros aspectos de esta realización incluyen células, tales como, por ejemplo, células no neuronales útiles en los aspectos de la invención además incluyen, sin limitación, células de la pituitaria anterior; células adrenales, células pancreáticas, células de ovario, células de riñón, tal como, por ejemplo, HEK293, células del estómago, células sanguíneas, células epiteliales, fibroblastos, células de tiroides, condrocitos, células musculares, hepatocitos, células glandulares y células implicadas en la translocación del transportador de glucosa (GLUT4).

Los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una muestra. Como se usa en el presente documento, el término "muestra" significa cualquier materia biológica que contiene o potencialmente contiene Toxina Clostridial activa. una diversidad de muestras se puede usar para ensayar de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva incluyendo, sin limitación, Toxina Clostridial purificada, parcialmente purificada, o no purificada; toxina de una sola cadena o di-cadena recombinante con una secuencia de origen natural o no natural; Toxina Clostridial recombinante con una especificidad de proteasa modificada; Toxina Clostridial recombinante con una especificidad de célula alterada; toxina quimérica que contiene elementos estructurales de especies o subtipos múltiples de Toxina Clostridial; Toxina Clostridial a granel; producto de Toxina Clostridial formulado, incluyendo, por ejemplo, productos de BoNT/A y BoNT/E formulados; y alimentos; células o lisados de células brutos, fraccionados o parcialmente purificados célula, por ejemplo, modificados por ingeniería genética para incluir un ácido nucleico recombinante que codifica una Toxina Clostridial; lisados bacterianos, baculovirales y de levadura; alimentos crudos, cocinados, parcialmente cocinados o procesados; bebidas; alimentos animales; muestras de suelo; muestras de agua; sedimentos de estanques; lociones; cosméticos; y formulaciones clínicas. Se entiende que el término muestra abarca muestras de tejido, incluyendo, sin limitación, muestras de tejido de mamífero, muestras de tejido de ganado tales como muestras de tejido de oveja, vaca y cerdo; muestras de tejido de primate; y muestras de tejido de seres humanos. Tales muestras abarcan, sin limitación, muestras de intestino tales como muestras de de intestino de niños, y muestras de tejidos obtenidas de una herida. Como ejemplos no limitantes, un procedimiento de la invención puede ser útil para determinar la presencia o actividad de una Toxina Clostridial en una muestra de alimento o bebida; para ensayar una muestra de un ser humano o animal, por ejemplo, expuesto a una Toxina Clostridial o que tiene uno o más síntomas de una Toxina Clostridial; para que siga la actividad durante la producción y purificación de Toxina Clostridial; o para ensayar los productos de Toxina Clostridial formulados tales como compuestos farmacéuticos o cosméticos.

En varios procedimientos de la invención, transferencia de energía de resonancia de la célula puesta en contacto se determina con relación a una célula control. Como se usa en el presente documento, el término "célula control" significa una célula del mismo o tipo similar que la célula puesta en contacto y desarrollada en las mismas condiciones pero no puestas en contacto con cualquier muestra o se pone en contacto con una muestra negativa definida o una muestra positiva definida. Los expertos en la técnica entienden que una diversidad de células control son útiles en los procedimientos de la invención y que una célula control puede ser una célula control positiva o una célula control negativa. Una célula control puede ser, por ejemplo, una célula control negativa tal como una célula similar o idéntica que contiene el mismo o similar sustrato de Toxina Clostridial puesto en contacto con una muestra similar, negativa definida, que se conoce que carece de Toxina Clostridial activa, o que no está en contacto con ninguna muestra. Una célula control también puede ser, por ejemplo, a célula control positiva tal como una célula que contiene uno o ambos productos de escisión que se produce de la proteolisis del sustrato de Toxina Clostridial en el sitio de escisión o una célula que contiene el mismo o similar sustrato puesto en contacto con una muestra definida positiva, que se sabe que incluye Toxina Clostridialactiva.

Los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, determinar la actividad de la Toxina Clostridial de una muestra mediante la determinación de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una célula puesta en contacto con muestra con relación a un célula control. Una diversidad de significa puede ser útil en los procedimientos de la invención para determinar transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una célula puesta en contacto con muestra con relación a una célula control. En una realización, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se determina mediante la detección de la intensidad de fluorescencia de aceptor de la célula puesta en contacto, donde la disminución de la la intensidad de fluorescencia de aceptor de la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de la actividad de la toxina Clostridial. En otra realización, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se determina mediante la detección de intensidad de fluorescencia de donante de la célula puesta en contacto, donde el aumento de la intensidad de fluorescencia del donante de la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de la actividad de la Toxina Clostridial. En todavía otra realización, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se determina mediante la detección de un máximo de emisión de aceptor y un máximo de emisión de fluoróforo donante de la célula puesta en contacto, donde un desplazamiento en los máximos de emisión de cerca del máximo de emisión del aceptor a cerca del máximo de emisión del aceptor del fluoróforo donante es indicativo de la actividad de la Toxina Clostridial. En todavía otra realización, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se determina mediante la detección de la relación de amplitudes de fluorescencia cerca de un máximo de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia cerca de un máximo de emisión de fluoróforo del donante, donde una disminución de de la relación en la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de la actividad de la Toxina Clostridial. En una realización adicional, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia se determina mediante la detección de la vida útil de estado excitado del fluoróforo donante en la célula puesta en contacto, donde un incremento de la vida útil de estado excitado del fluoróforo donante fluoróforo donante en la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula control es indicativo de la actividad de la Toxina Clostridial.

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y, por lo tanto, la actividad de la Toxina Clostridial, se puede detectar mediante una diversidad de medios, por ejemplo, mediante la detección del incremento de la intensidad de fluorescencia del donante; disminución de la intensidad de fluorescencia del aceptor; un desplazamiento en los máximos de emisión de cerca del máximo de emisión del aceptor a cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante un incremento de la relación de amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del donante a las amplitudes de fluorescencia cerca del máximo del fluoróforo aceptor; una disminución de la relación de amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante; un incremento de la vida útil del estado excitado del fluoróforo donante; o una disminución de la vida útil del estado excitado del fluoróforo aceptor. En aspectos de esta realización, un incremento de la intensidad de fluorescencia del donante puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos veinte veces o más con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En otros aspectos de esta realización, un incremento de la intensidad de fluorescencia del donante puede ser, por ejemplo, como mucho dos veces, como mucho tres veces, como mucho cuatro veces, como mucho cinco veces, como mucho diez veces, como mucho veinte veces con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía otros aspectos de esta realización, una disminución de la intensidad de fluorescencia del aceptor puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos veinte veces o más con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía otros aspectos de esta realización, una disminución de la intensidad de fluorescencia del aceptor puede ser, por ejemplo, como mucho dos veces, como mucho tres veces, como mucho cuatro veces, como mucho cinco veces, como mucho diez veces, como mucho veinte veces con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control.

En aspectos adicionales de esta realización, un desplazamiento en los máximos de emisión del máximo de emisión del aceptor a cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos veinte veces o más con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía aspectos adicionales de esta realización, un desplazamiento en los máximos de emisión de cerca del máximo de emisión del aceptor a cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante puede ser, por ejemplo, como mucho dos veces, como mucho tres veces, como mucho cuatro veces, como mucho cinco veces, como mucho diez veces, como mucho veinte veces con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control.

En todavía otros aspectos de esta realización, una disminución en la relación de amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos veinte veces o más con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía otros aspectos de esta realización, una disminución en la relación de amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante puede ser, por ejemplo, como mucho dos veces, como mucho tres veces, como mucho cuatro veces, como mucho cinco veces, como mucho diez veces, como mucho veinte veces con relación a la intensidad de fluorescencia a la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia a la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía otros aspectos de esta realización, un incremento en la relación de amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del donante a las amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del fluoróforo aceptor puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos veinte veces o más con relación a la intensidad de fluorescencia a la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia a la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía otros aspectos de esta realización, un incremento en la relación de amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión del donante a las amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de emisión de fluoróforo aceptor puede ser, por ejemplo, como mucho dos veces, como mucho tres veces, como mucho cuatro veces, como mucho cinco veces, como mucho diez veces, como mucho veinte veces con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control.

En aspectos adicionales de esta realización, un incremento de la vida útil del estado excitado del fluoróforo donante puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos veinte veces o más con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía aspectos adicionales de esta realización, un incremento de la vida útil del estado excitado del fluoróforo donante puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, como mucho tres veces, como mucho cuatro veces, como mucho cinco veces, como mucho diez veces, como mucho veinte veces con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, a control-cell. En todavía aspectos adicionales de esta realización, una disminución de la vida útil del estado excitado del fluoróforo aceptor puede ser, por ejemplo, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos veinte veces o más con relación a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia a la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control. En todavía aspectos adicionales de esta realización, una disminución de la vida útil del estado excitado del fluoróforo aceptor puede ser, por ejemplo, como mucho dos veces, como mucho tres veces, como mucho cuatro veces, como mucho cinco veces, como mucho diez veces, como mucho veinte veces con relación a la intensidad de fluorescencia a la misma longitud de onda de la misma célula detectada en momentos diferentes, o con relación a la intensidad de fluorescencia a la misma longitud de onda de una célula similar no puesta en contacto con una muestra, tal como, por ejemplo, una célula control.

Se reconoce que cambios en la cantidad absoluta de sustrato de Toxina Clostridial en la célula, la intensidad de excitación, y turbidez u otro absorbancia de fondo en la longitud de onda de excitación afecta a las intensidades de fluorescencia de los fluoróforos donantes y aceptores de más o menos en paralelo. De este modo, se entiende que una relación de las intensidades de emisión es independiente de la cantidad absoluta de sustrato, intensidad de excitación, y turbidez u otra absorbancia de fondo, y puede ser un indicador útil de actividad de la Toxina Clostridial. De manera similar, los expertos en la técnica entiende que la vida útil des estado de excitación de un fluoróforo donante es independiente de la cantidad absoluta de sustrato, intensidad de excitación, y turbidez u otra absorbancia de fondo y puede ser útil en un procedimiento de la invención. Se entiende que las intensidades de fluorescencia relevante o vidas útiles de estado excitado se detectan en la longitud de onda o intervalo de longitudes de onda apropiados. Como un ejemplo, cuando se detecta la intensidad de fluorescencia del donante, la longitud de onda apropiada está en o cerca de los máximos de emisión del fluoróforo donante, o es un intervalo de longitudes de onda que abarca o esta cerca de los máximos de emisión del fluoróforo donante.

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En una realización, la actividad de la Toxina Clostridial de una muestra se determina mediante la detección de la intensidad de fluorescencia. La detección de la intensidad de fluorescencia se puede poner en práctica como ensayos "de tiempo fijo" o como ensayos de tiempo continuo y las comparaciones se puede realizar usando momentos diferentes tomados de la misma célula puesta en contacto con relación a una célula control.. De este modo, aspecto de esta realización incluyen detección de la intensidad de fluorescencia en, por ejemplo, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes y al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la intensidad de fluorescencia durante intervalos de tiempo son, por ejemplo, separados no más de 1 minuto separados no más de 5 minutos, separados no más de 10 minutos, separados no más de 15 minutos, separados no más de 30 minutos y separados no más de 30 minutos. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la intensidad de fluorescencia durante intervalos de tiempo que están, por ejemplo, separados no menos de 15 minutos, separados no menos de 30 minutos, separados no menos de 45 minutos, separados no menos de 60 minutos, separados no menos de 90 minutos y separados no menos de 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la intensidad de fluorescencia de manera continua en el tiempo durante, por ejemplo, como mucho aproximadamente 5 minutos, como mucho aproximadamente 10 minutos, como mucho aproximadamente 15 minutos, como mucho aproximadamente 30 minutos, como mucho aproximadamente 45 minutos, como mucho aproximadamente 60 minutos, como mucho aproximadamente 90 minutos y como mucho aproximadamente 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la intensidad de fluorescencia de manera continua en el tiempo durante, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente 60 minutos, al menos aproximadamente 90 minutos y al menos aproximadamente 120 minutos.

Se entiende que la intensidad de fluorescencia se puede determinar a partir de un único momento o una diversidad de momentos. Se prevé que la comparación de la intensidad de fluorescencia detectada a partir de la célula puesta en contacto con la intensidad de fluorescencia detectada a partir de la célula control se puede realizar usando los valores obtenidos a partir del mismo, o similar momento o de momentos diferentes. De este modo, aspectos de esta realización incluyen la detección de la intensidad de fluorescencia de la célula puesta en contacto y célula control en, por ejemplo, al menos un momento diferente, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes and al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización pueden incluir la comparación de la intensidad de fluorescencia detectada a partir de la célula puesta en contacto obtenida a partir de un único momento con la intensidad de fluorescencia detectada a partir de la célula control obtenida, por ejemplo, en el mismo momento, en un momento similar, en un momento posterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos posteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto y en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, Otros aspectos de esta realización pueden incluir la comparación de la intensidad de fluorescencia detectada a partir de la célula puesta en contacto obtenida a partir de una pluralidad de de momentos con la intensidad de fluorescencia detectada a partir de la célula control obtenida, por ejemplo, a partir de un único momento, en los mismos momentos, en un momento similar, en un momento posterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, a una pluralidad de momentos posteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto y en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto.

En otra realización, la actividad de la Toxina Clostridial a partir de una muestra se determina mediante la detección del desplazamiento en los máximos de emisión. La detección del desplazamiento en los máximos se puede poner en práctica como un ensato de "tiempo fijo" o como un ensayo de tiempo continuo y las comparaciones se pueden realizar usando momentos diferentes tomados a partir de de la misma célula puesta en contacto o con relación a una célula control. De este modo, aspectos de esta realización incluyen la detección del desplazamiento en los máximo de emisión en, por ejemplo, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes y al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección del desplazamiento en los máximos de emisión durante intervalos de tiempo que están, por ejemplo, separados no más de 1 minuto, separados no más de 5 minutos, separados no más de 10 minutos, separados no más de 15 minutos, separados no más de 30 minutos y separados no más de 30 minutos. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección del desplazamiento en los máximos de emisión durante intervalos de tiempo que están, por ejemplo, separados no menos de 15 minutos, separados no menos de 30 minutos, separados no menos de 45 minutos, separados no menos de 60 minutos, separados no menos de 90 minutos and separados no menos de 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección del desplazamiento en los máximos de emisión continuamente con el tiempo durante, por ejemplo, como mucho aproximadamente 5 minutos, como mucho aproximadamente 10 minutos, como mucho aproximadamente 15 minutos, como mucho aproximadamente 30 minutos, como mucho aproximadamente 45 minutos, como mucho aproximadamente 60 minutos, como mucho aproximadamente 90 minutos and como mucho aproximadamente 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección del desplazamiento en los máximos de emisión continuamente con el tiempo durante, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente 60 minutos, al menos aproximadamente 90 minutos y al menos aproximadamente 120 minutos. Se entiende que el desplazamiento observado en los máximos de emisión en general no serán un desplazamiento completo pero que solamente parte de la intensidad de emisión se desplazará a cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante.

Se entiende que el desplazamiento en los máximos de emisión se puede detectar a partir de un único momento o una pluralidad de momentos. Se prevé que la comparación del desplazamiento de los máximos de emisión detectado a partir de la célula puesta en contacto con el desplazamiento en los máximos de emisión detectado a partir de la célula control se puede realizar usando los valores obtenidos a partir del mismo, o momento similar o a partir de momentos diferentes. De este modo, aspectos de esta realización incluyen la detección del desplazamiento en los máximos de emisión a partir de la célula puesta en contacto y célula control en, por ejemplo, al menos un momento diferente, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes and al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización pueden incluir la comparación del desplazamiento de los máximos de emisión detectados a partir de la célula puesta en contacto obtenidos a partir de un único momento con el desplazamiento en los máximos de emisión detectados a partir de la célula control obtenidos, por ejemplo, en el mismo momento, en un momento similar, en un momento posterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos posteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto and en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, Otros aspectos de esta realización pueden incluir la comparación del desplazamiento de los máximos de emisión detectado a partir de la célula puesta en contacto obtenido a partir de una pluralidad de momentos con el desplazamiento en los máximos de emisión detectados a partir de la célula control obtenidos, por ejemplo, de un único momento, en los mismos momentos, en un momento similar, en un momento posterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, a una pluralidad de momentos posteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto and en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto.

En otra realización, la actividad de la Toxina Clostridial a partir de una muestra se determina mediante la detección de la relación de amplitudes fluorescentes. La detección de la relación de amplitudes fluorescentes se puede poner en práctica como un ensayo de "tiempo fijo" o como un ensayo de tiempo continuo y las comparaciones se pueden realizar usando momentos diferentes tomados a partir de la misma célula puesta en contacto o con relación a una célula control. De este modo, aspectos de esta realización incluyen la detección de la relación de amplitudes fluorescentes en, por ejemplo, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes y al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la relación de amplitudes fluorescentes durante intervalos de tiempo que están, por ejemplo, separados no más de 1 minuto, separados no más de 5 minutos, separados no más de 10 minutos, separados no más de 15 minutos, separados no más de 30 minutos y separados no más de 30 minutos. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la relación de amplitudes fluorescentes durante intervalos de tiempo que están, por ejemplo, separados no menos de 15 minutos, separados no menos de 30 minutos, separados no menos de 45 minutos, separados no menos de 60 minutos, separados no menos de 90 minutos y separados no menos de 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la relación de amplitudes fluorescentes continuamente con el tiempo durante, por ejemplo, como mucho aproximadamente 5 minutos, como mucho aproximadamente 10 minutos, como mucho aproximadamente 15 minutos, como mucho aproximadamente 30 minutos, como mucho aproximadamente 45 minutos, como mucho aproximadamente 60 minutos, como mucho aproximadamente 90 minutos y como mucho aproximadamente 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la relación de amplitudes fluorescentes continuamente con el tiempo durante, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente 60 minutos, al menos aproximadamente 90 minutos y al menos aproximadamente 120 minutos.

Se entiende que la relación de amplitudes fluorescentes se puede detectar a partir de un único momento o una pluralidad de momentos. Se prevé que la comparación de la relación de amplitudes fluorescentes detectadas a partir de la célula puesta en contacto con la relación de amplitudes fluorescentes detectadas a partir de la célula control se puede realizar usando los valores obtenidos a partir del mismo, o similar momento o a partir de momentos diferentes. De este modo, aspectos de esta realización incluyen la detección de la relación de amplitudes fluorescentes a partir de la célula puesta en contacto y la célula control en, por ejemplo, al menos un momento diferente, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes y al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización pueden incluir la comparación de la relación de amplitudes fluorescentes detectadas a partir de la célula puesta en contacto obtenidas a partir de un único momento con la relación de amplitudes fluorescentes detectadas a partir de la célula control obtenidas, por ejemplo, en el mismo momento, en un momento similar, en un momento posterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos posteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto y en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, Otros aspectos de esta realización pueden incluir la comparación de la relación de amplitudes fluorescentes detectadas a partir de la célula puesta en contacto obtenidas a partir de una pluralidad de momentos con la relación de amplitudes fluorescentes detectadas a partir de la célula control obtenida, por ejemplo, a partir de un único momento, en los mismos momentos, en un momento similar, en un momento posterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, a una pluralidad de momentos posteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto y en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto.

En otra realización, la actividad de la Toxina Clostridial a partir de una muestra se determina mediante la detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo. La detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo se puede poner en práctica un ensayo de "tiempo fijo" o como un ensayo de tiempo continuo y las comparaciones se pueden realizar usando momentos diferentes tomados de la misma célula puesta en contacto o con relación a una célula control. De este modo, aspectos de esta realización incluyen la detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo in, por ejemplo, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes y al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo durante intervalos de tiempo que están, por ejemplo, separados no más de 1 minuto, separados no más de 5 minutos, separados no más de 10 minutos, separados no más de 15 minutos, separados no más de 30 minutos y separados no más de 30 minutos. Otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo durante intervalos de tiempo que están, por ejemplo, separados no menos de 15 minutos, separados no menos de 30 minutos, separados no menos de 45 minutos, separados no menos de 60 minuto, separados no menos de 90 minutos aparte y separados no menos de 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo continuamente con el tiempo durante, por ejemplo, como mucho aproximadamente 5 minutos, como mucho aproximadamente 10 minutos, como mucho aproximadamente 15 minutos, como mucho aproximadamente 30 minutos, como mucho aproximadamente 45 minutos, como mucho aproximadamente 60 minutos, como mucho aproximadamente 90 minutos y como mucho aproximadamente 120 minutos. Todavía otros aspectos de esta realización incluyen la detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo continuamente con el tiempo durante, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente 60 minutos, al menos aproximadamente 90 minutos y al menos aproximadamente 120 minutos.

Se entiende que la vida útil de estado excitado de fluoróforo se puede detectar a partir de un único momento o una pluralidad de momentos. Se prevé que comparación de la vida útil de estado excitado de fluoróforo detectada a partir de la célula puesta en contacto con la vida útil de estado excitado de fluoróforo detectada a partir de la célula control se puede realizar usando los valores obtenidos a partir del mismo, o similar momento o a partir de momentos diferentes. De este modo, aspectos de esta realización incluyen la detección de la vida útil de estado excitado de fluoróforo a partir de la célula puesta en contacto y célula control en, por ejemplo, al menos un momento diferente, al menos dos momentos diferentes, al menos tres momentos diferentes, al menos cuatro momentos diferentes, al menos cinco momentos diferentes, al menos diez momentos diferentes y al menos 20 momentos diferentes. Otros aspectos de esta realización pueden incluir comparación de la vida útil del estado excitado de fluoróforo a partir de la célula puesta en contacto obtenida a partir de un único momento con la vida útil de estado excitado de fluoróforo obtenido a partir de la célula control obtenida, por ejemplo, en el mismo momento, en un momento similar, en un momento posterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos posteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto and en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores al momento obtenido a partir de la célula puesta en contacto, Otros aspectos de esta realización pueden incluir la comparación de la vida útil de estado excitado de fluoróforo detectada a partir de la célula puesta en contacto obtenida a partir de una pluralidad de momentos con la vida útil de estado excitado de fluoróforo detectada a partir de la célula control obtenida, por ejemplo, a partir de un único momento, en los mismos momentos, en un momento similar, en un momento posterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en un momento anterior a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, a una pluralidad de momentos posteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto, en una pluralidad de momentos anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto y en una pluralidad de momentos tanto posteriores como anteriores a los momentos obtenidos a partir de la célula puesta en contacto.

La fluorescencia de una célula puesta en contacto típicamente se determina usando un fluorímetro. En general, la radiación de excitación de una fuente de excitación que tiene una primera longitud de onda pasa a través de la óptica de excitación. La óptica de excitación provoca la radiación de excitación para excitar el sustrato en la célula. En respuesta, la proteína fluorescente en el sustrato emite radiación que tiene una longitud de onda que es diferente de la longitud de onda de excitación. La óptica de colección después recoge la emisión; si se desea, el dispositivo incluye un controlador de temperatura para mantener la célula a una temperatura específica mientras se mantiene en barrido. Si se desea, una fase de translación de eje múltiple se mueve a una placa de microvaloración que contiene una pluralidad de muestras con el fin de posicionar diferentes pocillos para que se expongan. Se entiende que la fase de translación de eje múltiple, controlador de temperatura, característica de autofoco, y electrónica asociada a la formación de imágenes y recogida de datos se puede dirigir mediante el ordenador digital apropiado. Los aspectos de la invención implican la excitación de un fluoróforo donante dentro de una célula. Los expertos en la técnica entienden que un fluoróforo donante en general se excita a o cerca de la longitud de onda de absorción óptima (longitud de onda de excitación) del fluoróforo donante. Como un ejemplo, donde el fluoróforo donante es fluoresceína, el donante puede estar excitado, por ejemplo, a o cerca de la longitud de onda de absorción óptima de 488 nm.

Para la detección de la intensidad de la fluorescencia del donante, la excitación se establece en la longitud de onda de absorción de fluoróforo donante, y la emisión del fluoróforo donante se controla. La longitud de onda de emisión del fluoróforo donante en general se selecciona de manera que poca o ninguna contribución de la fluorescencia del aceptor se observa. La presencia de inactivaciones de fluorescencia del aceptor. La eficacia de transferencia de energía, E, se calcula a partir de E = 1 - I_{DA}/I_{D}, donde I_{DA} e I_{D} son intensidades del donante en la presencia y ausencia de aceptor. Ambos se normalizan a la misma concentración de fluoróforo donante. Si se desea, las mediciones de tiempo resueltas, para las que la concentración de fluoróforo donante no se requiere, se puede realizar usando E = 1 - {T_{DA}}/T_{D}, donde {T_{DA}} y {T_{D}} son vidas útiles promedio de amplitud del fluoróforo donante en la presencia y ausencia del aceptor.

Para la detección de la intensidad de la fluorescencia del aceptor, la excitación se establece en la longitud de onda de absorción de fluoróforo donante, y la emisión del fluoróforo aceptor se controla. La longitud de onda de emisión del fluoróforo aceptor en general se selecciona de manera que poca o ninguna contribución de la fluorescencia del aceptor se observa. La presencia de inactivaciones de fluorescencia del donante. La eficacia de transferencia de energía, E, se calcula a partir de E = 1 - I_{AD}/I_{A}, donde I_{AD} e I_{A} son intensidades del aceptor en la presencia y ausencia de donante. Ambos se normalizan a la misma concentración de fluoróforo aceptor. Si se desea, las mediciones de tiempo resueltas, para las que la concentración de fluoróforo aceptor no se requiere, se pueden realizar usando E = 1 - {T_{AD}}/T_{A}, donde {T_{AD}} y {T_{A}} son vidas útiles promedio de amplitud del fluoróforo aceptor en la presencia y ausencia del aceptor.

Además se entiende que los procedimientos de la invención se pueden automatizar y se pueden configurar con un formato de alto rendimiento o de rendimiento ultra alto que usa, sin limitación, placas de 96 pocillos, 384 pocillos o 1536 pocillos. Como un ejemplo no limitante, la emisión de fluorescencia se puede detectar usando el lector de microplacas SpectraMaxM5 microplate (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), un monocromador dual, lector de microplacas de detección múltiple con un intervalo de longitud de onda de 250-850 nm y una capacidad de lectura de 6-384 microplacas. Como otro ejemplo no limitante, la emisión de fluorescencia se puede detectar usando el sistema Typhoon 9410 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Designado para los ensayos de microplacas, este sistema que se utiliza es capaz de fluorescencia de excitación a 488 nm, 532 nm o 633 nm y tiene un sistema óptimo semiconfocal con una cámara de dispositivo acoplado a carga (OCD) para iluminar y formar imágenes de la placa entera. El lector de placas de 96 pocillos FPM-2 (Folley Consulting and Research, Round Lake, IL) puede ser útil en la detección de la emisión de fluorescencia en los procedimientos de la invención. Los expertos en la técnica entienden que éstos y otros sistemas automatizados con la compatibilidad espectroscópica apropiada tal como el lector de cubetas ECLIPSE (Varian-Cary; Walnut Creek, CA) y los sistemas de espectrofluorómetro FLIPR® y Gemini XPS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Se prevé que una diversidad de condiciones adecuadas para determinar la actividad de la Toxina Clostridial en una muestra pueden ser útiles de acuerdo con los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva. En aspectos de esta realización, las condiciones adecuadas para determinar la actividad de la Toxina Clostridial se pueden proporcionar de manera que, por ejemplo, al menos 10% del sustrato se escinda, al menos 20% del sustrato se escinda, al menos 30% del sustrato se escinda, al menos 40% del sustrato se escinda, al menos 50% del sustrato se escinda, al menos 60% del sustrato se escinda, al menos 70% del sustrato se escinda, al menos 80% del sustrato se escinda o al menos 90% del sustrato se escinda. En otros aspectos de esta realización, condiciones adecuadas para determinar la actividad de la Toxina Clostridial se pueda proporcionar de manera que, por ejemplo, como mucho 10% del sustrato se escinda, como mucho 20% del sustrato se escinda, como mucho 30% del sustrato se escinda, como mucho 40% del sustrato se escinda, como mucho 50% del sustrato se escinda, como mucho 60% del sustrato se escinda, como mucho 70% del sustrato se escinda, como mucho 80% del sustrato se escinda o como mucho 90% del sustrato se escinda. En otro aspecto de esta realización, condiciones adecuadas para determinar la actividad de la Toxina Clostridial se puede proporcionar de manera que el 100% del sustrato se escinda. En otro aspecto de esta realización, las condiciones adecuadas para determinar la actividad de la Toxina Clostridial se proporcionan de manera que el ensayo es lineal. En otro aspecto de esta realización, las condiciones adecuadas para determinar la actividad de la Toxina Clostridial se proporcionan de manera que el ensayo no es lineal.

Las toxinas clostridiales son zinc metaloproteasas, y una fuente de zinc, tales como cloruro de zinc o acetato de zinc, típicamente en el intervalo de 1 a 500 \muM, por ejemplo, 5 a 10 \muM se pueden incluir, si se desea, como parte de las condiciones adecuadas para determinar la actividad de la Toxina Clostridial. Los expertos en la técnica entienden que los quelatos de zinc tales como EDTA en general se excluyen de un tampón para determinar la presencia o actividad de una Toxina Clostridial.

La concentración de Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada a analizar en un procedimiento de la invención en general está en el intervalo de aproximadamente 0,0001 ng/ml a 500 \mug/ml de toxina, por ejemplo, aproximadamente 0,0001 ng/ml a 50 \mug/ml toxin, 0,001 ng/ml a 500 \mug/ml de toxina, 0,001 ng/ml a 50 \mug/ml de toxina, 0,0001 a 5000 ng/ml de toxina, 0,001 ng/ml a 5000 ng/ml, 0,01 ng/ml a 5000 ng/ml, 0,1 ng/ml a 5000 ng/ml, 0,1 ng/ml a 500 ng/ml, 0,1 ng/ml a 50 ng/ml, 1 ng/ml a 5000 ng/ml, 1 ng/ml a 500 ng/ml, 1 ng/ml a 50 ng/ml, 10 ng/ml a 5000 ng/ml, 10 ng/ml a 500 ng/ml, 50 ng/ml a 5000 ng/ml, 50 ng/ml a 500 ng/ml o 100 ng/ml a 5000 ng/ml de toxina, que puede ser, por ejemplo, producto de toxina di-cadena o de una sola cadena recombinante purificada o de Toxina Clostridial formulado que contiene albúmina sérica humana y excipientes. En aspectos de esta realización, la concentración de la Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada ensayada dé como resultado la escisión de, por ejemplo, al menos 10% del sustrato total presente, al menos 20% del sustrato total presente, al menos 30% del sustrato total presente, al menos 40% del sustrato total presente, al menos 50% del sustrato total presente, al menos 60% del sustrato total presente, al menos 70% del sustrato total presente, al menos 80% del sustrato total presente o al menos 90% del sustrato total presente. En aspectos adicionales de esta realización, la concentración de la Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada ensayada da como resultado la escisión de, por ejemplo, como mucho 10% del sustrato total presente, como mucho 20% del sustrato total presente, como mucho 30% del sustrato total presente, como mucho 40% del sustrato total presente, como mucho 50% del sustrato total presente, como mucho 60% del sustrato total presente, como mucho 70% del sustrato total presente, como mucho 80% del sustrato total presente o como mucho 90% del sustrato total presente, En otro aspecto de esta realización, la concentración de la Toxina Clostridial
purificada o parcialmente purificada ensayada da como resultado la escisión de 100% del sustrato total presente.

La concentración de Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada ensayada en un procedimiento de la invención puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pM a 500 \muM, 0,1 pM a 100 \muM, 0,1 pM a 10 \muM, 0,1 pM a 1 \muM, 0,1 pM a 500 nM, 0,1 pM a 100 nM, 0,1 pM a 10 nM, 0,1 pM a 1 nM, 0,1 pM a 500 pM, 0,1 pM a 100 pM, 0,1 pM a 50 pM, 0,1 pM a 10 pM, 1 pM a 500 \muM, 1 pM a 100 \muM, 1 pM a 10 \muM, 1 pM a 1 \muM, 1 pM a 500 nM, 1 pM a 100 nM, 1 pM a 10 nM, 1 pM a 1 nM, 1 pM a 500 pM, 1 pM a 100 pM, 1 pM a 50 pM, 1 pM a 10 pM, 10 pM a 500 \muM, 10 pM a 100 \muM, 10 pM a 10 \muM, 10 pM a 10 \muM, 10 pM a 500 nM, 10 pM a 100 nM, 10 pM a 10 nM, 10 pM a 1 nM, 10 \muM a 500 pM, 10 pM a 100 pM, 10 pM a 50 pM, 100 pM a 500 \muM, 100 pM a 100 \muM, 100 pM a 10 \muM, 100 pM a 1 \muM,100 pM a 500 nM, 100 pM a 100 nM, 100 pM a 10 nM, 100 pM a 1 nM, 100 pM a 500 pM1 nM a 500 \muM, 1 nM a 100 \muM, 1 nM a 10 \muM, 1 nM a 1 \muM, 1 nM a 500 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 50 nM, 1 nM a 10 nM, 3 nM a 100 nM de toxina, que puede ser, por ejemplo, producto de toxina di-cadena o de una sola cadena recombinante purificada o de Toxina Clostridial formulado que contiene albúmina sérica humana y excipientes. Los expertos en la técnica entienden que la concentración de Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada dependerá del serotipo de la toxina ensayada, así como de la pureza o secuencia de la toxina, la presencia de componentes inhibidores, y las condiciones de ensayo. Adicionalmente se entiende que las muestras purificadas, parcialmente purificadas o en bruto se pueden diluir hasta un intervalo conveniente para ensayar la actividad de la Toxina Clostridial contra una curva estándar. De manera similar, se entiende que una muestra se puede diluir, si se desea, de manera que el ensayo sea lineal. En aspectos de esta realización, la concentración de Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada ensayada da como resultado la escisión de, por ejemplo, al menos 10% del sustrato total presente, al menos 20% del sustrato total presente, al menos 30% del sustrato total presente, al menos 40% del sustrato total presente, al menos 50% del sustrato total presente, al menos 60% del sustrato total presente, al menos 70% del sustrato total presente, al menos 80% del sustrato total presente al menos 90% del sustrato total presente. En aspectos adicionales de esta realización, la concentración de Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada ensayada da como resultado la escisión de, por ejemplo, como mucho 10% del sustrato total presente, como mucho 20% del sustrato total presente, como mucho 30% del sustrato total presente, como mucho 40% del sustrato total presente, como mucho 50% del sustrato total presente, como mucho 60% del sustrato total presente, como mucho 70% del sustrato total presente, como mucho 80% del sustrato total presente como mucho 90% del sustrato total presente. En otro aspecto de esta realización, la concentración de Toxina Clostridial purificada o parcialmente purificada ensayada da como resultado la escisión de100% del sustrato total presente.

En todavía otra realización, se prevé que cualquiera y todas las temperaturas que permitan la función de un ensayo de la actividad Clostridial se puede usar en los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva. Las temperaturas de ensayo se pueden variar según sea apropiado por los expertos en la técnica y en general dependerán, en parte, de la concentración, pureza y actividad de la Toxina Clostridial, la muestra a ensayar, el tiempo de ensayo o la conveniencia del experto en la técnica. De este modo, una temperatura de ensayo no debe ser tan baja que provoque que la solución se congele y no debe ser tan alta que desnaturalice la Toxina Clostridial, el sustrato de Toxina Clostridial descrito en la presente memoria descriptiva. En un aspecto de esta realización, el ensayo se realiza con un intervalo de temperatura por encima de 0ºC, pero por debajo de 40ºC. En otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 37ºC. En todavía otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 2ºC a 10ºC. En todavía otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza a aproximadamente 4ºC. En todavía otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 18ºC. En todavía otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza a aproximadamente 16ºC. En todavía otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 18ºC a aproximadamente 32ºC. En todavía otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza a aproximadamente 20ºC. En otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 32ºC a aproximadamente 40ºC. En otro aspecto de esta realización, el ensayo se realiza a aproximadamente 37ºC. En aspectos de esta realización, la cantidad de sustrato de Toxina Clostridial escindida dentro de un intervalo de temperatura es, por ejemplo, al menos 10% del sustrato total presente, al menos 20% del sustrato total presente, al menos 30% del sustrato total presente, al menos 40% del sustrato total presente, al menos 50% del sustrato total presente, al menos 60% del sustrato total presente, al menos 70% del sustrato total presente, al menos 80% del sustrato total presente o al menos 90% del sustrato total presente. En aspectos adicionales de esta realización, la cantidad de sustrato de Toxina Clostridial escindida dentro de un intervalo de temperatura es, por ejemplo, como mucho 10% del sustrato total presente, como mucho 20% del sustrato total presente, como mucho 30% del sustrato total presente, como mucho 40% del sustrato total presente, como mucho 50% del sustrato total presente, como mucho 60% del sustrato total presente, como mucho 70% del sustrato total presente, como mucho 80% del sustrato total presente o como mucho 90% del sustrato total presente. En otro aspecto de esta realización, la cantidad de sustrato de Toxina Clostridial escindida dentro de un intervalo de temperatura es 100%.

En todavía otra realización, se prevé que cualquiera y todos los tiempos suficientes para la detección de la presencia de productos de escisión de sustrato de Toxina Clostridial se puede usar en los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva. Los tiempos de ensayo se pueden variar según sea apropiado por los expertos en la técnica y en general dependerán, en parte, de la concentración, pureza y actividad de la Toxina Clostridial, la muestra a ensayar, temperatura de incubación o la conveniencia del experto en la técnica. Los tiempos de ensayo en general varían, sin limitación, en el intervalo de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 4 horas, 30 minutos a 8 horas, 1 hora a 12 horas, 2 horas a 24 horas, 4 horas a 48 horas, 6 horas a 72 horas. En aspectos de esta realización, la cantidad de sustrato de Toxina Clostridial escindida durante el tiempo de ensayo es, por ejemplo, al menos 10% del sustrato total presente, al menos 20% del sustrato total presente, al menos 30% del sustrato total presente, al menos 40% del sustrato total presente, al menos 50% del sustrato total presente, al menos 60% del sustrato total presente, al menos 70% del sustrato total presente, al menos 80% del sustrato total presente o al menos 90% del sustrato total presente. En aspectos adicionales de esta realización, la cantidad de sustrato de Toxina Clostridial escindida durante un tiempo de ensayo, por ejemplo, como mucho 10% del sustrato total presente, como mucho 20% del sustrato total presente, como mucho 30% del sustrato total presente, como mucho 40% del sustrato total presente, como mucho 50% del sustrato total presente, como mucho 60% del sustrato total presente, como mucho 70% del sustrato total presente, como mucho 80% del sustrato total presente o como mucho 90% del sustrato total presente. En otro aspecto de esta realización, la cantidad de sustrato de Toxina Clostridial escindida durante un tiempo de ensayo es 100%. Se entiende que los ensayos se pueden terminar, si se desea, antes de la excitación de la proteína fluorescente.

Aspectos de la presente invención también se pueden describir como sigue:

1. Una célula aislada que comprende:

a)

un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana, comprendiendo dicho sustrato

i)

un primer miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET);

ii)

una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que incluye un sitio de escisión de Toxina Clostridial; y

iii)

un dominio de dirección de membrana;

b)

un segundo miembro asociado a membrana de un par de FRET, en el que el segundo miembro del par de FRET es un colorante lipófilo; y

c)

un receptor que se une a una Toxina Clostridial;

en el que la célula es capaz de intoxicación por Toxina Clostridial;

en el que el par de FRET comprende un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con un espectro de emisión de un fluoróforo donante; y en el que en las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se muestra entre el aceptor y fluoróforo donante.

2. La célula del artículo 1, en el que la célula transitoriamente contiene el sustrato de Toxina Clostridial.

3. La célula del artículo 1, en el que la célula que contiene de manera estable el sustrato de Toxina Clostridial.

4. La célula del artículo 1, en el que el sustrato de Toxina Clostridial se expresa a partir de una molécula de ácido nucleico.

5. La célula del artículo 1, en el que la célula es una célula neuronal.

6. La célula del artículo 1, en el que la célula es una célula no neuronal.

7. La célula del artículo 1, en el que el primer miembro del par de FRET es una proteína fluorescente o una proteína de unión a fluoróforo.

8. La célula del artículo 1, en el que el primer miembro del par de FRET es el aceptor y el segundo miembro del par de FRET es el fluoróforo donante.

9. La célula del artículo 1, en el que el primer miembro del par de FRET es el fluoróforo donante y el segundo miembro del par de FRET es el aceptor.

10. La célula de acuerdo con el artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/A incluyendo un sitio de escisión de BoNT/A, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B incluyendo un sitio de escisión de BoNT/B, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 incluyendo un sitio de escisión de BoNT/C1, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D incluyendo un sitio de escisión de BoNT/D, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E incluyendo un sitio de escisión de BoNT/E, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F incluyendo un sitio de escisión de BoNT/F, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G incluyendo un sitio de escisión de BoNT/G, o una secuencia de reconocimiento de TeNT incluyendo un sitio de escisión de TeNT.

11. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Arg.

12. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Phe.

13. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial secuencia de reconocimiento comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Arg-Ala.

14. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial secuencia de reconocimiento comprende al menos seis restos consecutivos de Sintaxina, comprendiendo los seis restos consecutivos Lys-Ala.

15. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial secuencia de reconocimiento comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Lys-Leu.

16. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial secuencia de reconocimiento comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Arg-Ile.

17. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial secuencia de reconocimiento comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Lys.

18. La célula del artículo 1, en el que la secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial secuencia de reconocimiento comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Ala-Ala.

19. La célula del artículo 1, en el que el receptor es un receptor de Toxina Clostridial endógeno.

20. La célula del artículo 1, en el que el receptor es un receptor de Toxina Clostridial exógeno.

21. Un procedimiento de determinación de la actividad de la Toxina Clostridial, que comprende

a)

poner en contacto una célula de acuerdo con el artículo 1 con una muestra;

b)

excitar dicho fluoróforo donante;

c)

detectar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de dicha célula puesta en contacto; y

d)

comparar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia detectada a partir de la célula puesta en contacto con la transferencia de energía de resonancia detectada a partir de una célula control sometida a las etapas (b)-(c);

en el que una diferencia en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula puesta en contacto comparada con la célula control es indicativa de la actividad de la Toxina Clostridial.

22. El procedimiento del artículo 21, en el que la muestra es un lisado de célula bruto, una Toxina Clostridial a granel, una Toxina Clostridial parcialmente purificada, una Toxina Clostridial purificada o un producto de Toxina Clostridial formulado.

23. El procedimiento del artículo 21, en el que la muestra comprende un producto de Toxina Clostridial formulado.

24. El procedimiento del artículo 23, en el que el producto de Toxina Clostridial formulado es un producto de BoNT/A formulado.

25. El procedimiento del artículo 21, en el que la muestra es un alimento crudo, un alimento parcialmente cocinado o procesado, un alimento cocinado o procesado, una bebida, un pienso animal, una muestra de suelo, una muestra de agua, o un sedimento de estanque.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para fines ilustrativos únicamente con el fin de facilitar un entendimiento más completo de las realizaciones descritas y en modo alguno se pretende que limiten las realizaciones descritas en la presente invención.

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Ejemplo I Construcción de sustratos de toxina clostridial 1. Construcción de sustratos SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/Cl y BoNT/E 1a. Construcción depQBI25/SNAP-25_{206}-GFP

Para construir pOBI-25/GFP-SNAP-25_{206}, se digirió una construcción pGEX/SNAP-25_{206} con BamHI y EcoRI para escindir un fragmento que contenga todo el marco de lectura abierto de SNAP-25_{206}. Se purificó el fragmento de restricción resultante mediante el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Inc., Valencia, CA), y se subclonó usando un procedimiento con T4 ADN ligasa en un vector pQBI-2SC3 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA), digerido con BamHI y EcoRI, dando pOBI-25/GFP-SNAP-25_{206}. Se transformó la mezcla de ligadura en células TOP10 de E. coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultivaron dispuestas en un incubador a 37ºC durante la noche. Se analizaron colonias resistentes a ampicilina usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se cribaron construcciones de expresión candidatas mediante mapeo de endonucleasa de restricción para determinar la presencia y orientación del fragmento de inserción correcto. Se usaron cultivos que contienen la construcción de expresión deseada para inocular matrazces con deflectores de 1 l que contienen 200 ml de medio Luria-Bertani que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se cultivaron dispuestos en un incubador a 37ºC, agitando a 250 rpm, durante la noche. Se aisló ADN plásmido purificado que corresponde a una construcción de expresión usando el procedimiento Maxi-prep de OIAGEN (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) y se secuenció para verificar que se preparó la construcción de expresión correcta (contrato de servicio con Sequetech Corp., Mountain View, CA). Esta estrategia de clonación dio una construcción de expresión de pOBI-25 que codifica un GFP-SNAP-25_{206}.

Para construir pOBI-25/SNAP-25_{206}-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende SNAP-25_{206} en ADN de pQBI-25/GFP-SNAP25_{206} usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). La construcción pCR2.1/SNAP-25_{206} resultante se digiere con BamHI y EcoRI para escindir un fragmento que contiene el marco de lectura abierto completo de SNAP-25_{206}. Se purificó el fragmento de restricción resultante con el kit de extracción de gel OIAquick (OIAGEN, Inc., Valencia, CA), y se subclonó usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pOBI-25A2 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA), se digirió con BamHI y EcoRI, dando pOBI-25/SNAP-25_{206}-GFP. Se transformó la mezcla de ligadura en células TOP10 de E. coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se dispusieron en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultivaron dispuestas en un incubador a 37ºC durante la noche. Se analizaron colonias resistentes a ampicilina usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se cribaron construcciones de expresión candidatas mediante mapeo de endonucleasa de restricción para determinar la presencia y orientación del fragmento de inserción correcto. Se usaron cultivos que contienen la construcción de expresión deseada para inocular matrazces con deflectores de 1 l que contienen 200 ml de medio Luria-Bertani que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se cultivaron dispuesto en un incubador a 37ºC, agitando a -250 rpm, durante la noche. Se aisló ADN de plásmido purificado que corresponde a una construcción de expresión usando el procedimiento Maxi-prep QUIAGEN (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) y se secuenció para verificar que se preparó la construcción de expresión correcta (contrato de servicio con Sequetech Corp., Mountain View, CA). Esta estrategia de clonación dio una construcción de expresión pOBI-25 que codifica un SNAP-25_{206}-GFP (véase Fig. 5).

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1b. Construcción de pQBI25/SNAP-25_{134}-GFP

Para construir pOBI-25/SNAP-25_{206}-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende SNAP-25_{206} en ADN de pQBI-25/GFP-SNAP25_{206} usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Se digiere la construcción pCR2.1/SNAP-25_{206} resultante con BamHI y EcoRI para escindir un fragmento que contiene el marco de lectura abierto completo de SNAP-25_{206}. Se purificó el fragmento de restricción resultante con el kit de extracción de gel de QIAquick (OIAGEN, Inc., Valencia, CA), y se subclonó usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pOBI-25A2 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA), se digiere con BamHI y EcoRI, dando pQBI-25/SNAP-25_{206}-GFP. Se transformó la mezcla de ligadura en células TOP10 de E. coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultivaron dispuestas en un incubador a 37ºC durante la noche. Se analizaron colonias resistentes a ampicilina usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se cribaron construcciones de expresión candidatas mediante mapeo de endonucleasa de restricción para determinar la presencia y orientación del fragmento de inserción correcto. Se usaron cultivos que contienen la construcción de expresión deseada para inocular matrazces con deflectores de 1 l que contienen 200 ml de medio Luria-Bertani que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se cultivaron dispuestas en un incubador a 37ºC, agitando a 250 rpm, durante la noche. Se aisló el ADN de plásmido purificado hasta una construcción de expresión usando el procedimiento maxi-prep de OIAGEN (OIAGEN, Inc., Valencia, CA) y se secuenció para verificar que se preparó la construcción de expresión correcta (contrato de servicio con Sequetech Corp., Mountain View, CA). Esta estrategia de clonación dio una construcción de expresión pOBI-25 que codifica un SNAP-25_{206}-GFP.

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1c. Localización subcelular de sustrato SNAP-25-GFP y productos de escisión

Con el fin de determinar si un sustrato BoNT/A puede asociarse con la membrana celular, se evalúa si una célula que expresa un plásmido que codifica un sustrato SNAP-25-GFP era capaz de localizar el sustrato en la membrana celular. Para expresar de forma transitoria un sustrato SNAP-25-GFP en una línea celular, se dispuso una densidad adecuada de células PC12 en los pocillos de placas de cultivo de tejido recubiertas con poli-D-lisina/lamanina de 6 pocillos que contienen 3 ml de un medio adecuado (véase la tabla 13), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan la densidad deseada (véase la tabla 13). Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 10 \mug de una construcción pOBI-25/GFP-SNAP-25_{206} o 10 \mug de una construcción OBI-25/SNAP-25_{206}-GFP. Esta transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplazó el medio con medio no suplementado fresco y se añadió a las células la solución de transfección de 500 \mul. Se incubaron luego las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 6 a 18 horas. Se reemplazó el medio de transfección con 3 ml de medio fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 48 horas se fijaron las células con paraformaldehído y se emitieron imágenes en un microscopio confocal como se desvela, por ejemplo, por parte de Ester Fernández-Salas y col., Plasma membrane localization signals in la cadena ligera de botulinum neurotoxin, 101(9) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 3208-3213 (2004). Los dos sustratos GFP-SNAP252_{206} y SNAP25_{206}-GFP se localizaron en la membrana plasmática (véase la Fig. 6).

Con el fin de determinar si un sustrato BonT/A localizado en la membrana celular puede ser susceptible de escisión de BoNT/A, se evalúa si la exposición de BoNT/A a una célula que contiene un sustrato SNAP-25-GFP localizado en la membrana daba lugar a la escisión del sustrato. Se transfectaron transitoriamente células PC12 con pOBI-25-SNAP25_{206}-GFP una construcción de plásmido que codifica un sustrato SNAP25_{206}-GFP, y pcDNA3.1-LC/A, una construcción de plásmido que codifica la cadena ligera de BoNT/A como se describió anteriormente en el ejemplo I, 1b. La observación de células vivas de 24 a 48 horas tras la transfección usando un microscopio inverso de fluorescencia indicaba que las células PC12 que co-expresan SNAP25_{206}-GFP y la cadena ligera de BoNT/A daban lugar a un cambio en la intensidad fluorescente respecto a las células de control que expresan sólo el sustrato SNAP25_{206}-GFP. El cambio en la intensidad de fluorescencia resultaba de un nivel reducido de fluorescencia emitido de las células, así como también un cambio en localización subcelular de la fluorescencia de GFP; la fluorescencia en las células que coexpresan el sustrato y el enzima se observó en el citoplasma con acumulación de algunas áreas o estructuras citoplásmicas (véase la Fig. 6). Esta acumulación citoplásmica parece representar el producto de escisión que contiene el fragmento de escisión de 9 aminoácidos de SNAP-25 fusionado con GFP. Estos resultados indican que hay un modelo de fluorescencia distinto así como también un grado diferente de fluorescencia en células que contienen el sustrato SNAP25_{206}-GFP escindido en comparación con las células que contienen los productos de escisión de este sustrato (SNAP25_{197} y el fragmento de 9 residuos restante de SNAP-25 condensado con GFP).

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1d. Construcción de pOBI67/SNAP-25_{206}-GFP

Para construir pOBI-67/SNAP-25_{206}-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende el sustrato SNAP-25_{206}-GFP en ADN de pOBI-25/SNAP25_{206}-GFP usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un pCR2.1 vector usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción de pCR2.1/SNAP-25_{206}-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido SNAP-25_{206}-GFP; y 2) permite a este inserto estar unido de forma operativa a un vector pOBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pQBI-67 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pOBI-67/SNAP-25_{206}-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultivan dispuestas en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica el SNAP-25_{206}-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pQBI-67.

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2. Construcción de sustratos VAMP de BoNTB, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G y TeNT 2a. Construcción de pOBI25/VAMP-1-GFP

Para preparar un sustrato VAMP-1 adecuado para los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva, se preparará una construcción pOBI-25NAMP-1-GFP usando una reacción en cadena de la polimerasa con prolongación del solapamiento del empalme (SOE-PCR), véase, por ejemplo, R. M. Horton y col., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989); y R. M. Horton, PCR-mediated recombination y mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 (1995). Un fragmento de ácido nucleico que comprende una región que codifica aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) se unirá de forma operativa por SOE-PCR a una secuencia VAMP-1 que comprende una región que codifica aminoácidos 49 a 92 de ID SEC Nº: 28 y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción pCR2./VAMP-1 resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica los aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) y aminoácidos 49-92 de VAMP-1 (ID SEC Nº: 28); y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pOBI-25A (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA). Se purificará el fragmento de restricción resultante con el kit de extracción de gel OIAquick (OIAGEN, Inc., Valencia, CA), y se subclonará usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pOBI-25A en un vector pOBI-25A (Obiogene, Inc., Irvine, CA) dando pQBI-25/VAMP-1-GFP. Esta estrategia de clonación dio una construcción de expresión pOBI-25 que codifica un dominio de direccionamiento de membrana SNAP-25 que comprende aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1), una secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial que comprende aminoácidos 49-92 de VAMP-1 (ID SEC Nº: 28) y un GFP unidos de forma operativa y adecuados para detectar actividad en BoNTB, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT.

La localización subcelular de sustratos de VAMP-1-GFP y sus productos de escisión serán analizados usando los procedimientos como se describieron esencialmente anteriormente en el ejemplo I, 1c, con la excepción de que se usará la construcción pOBI-25/VAMP-1-GFP descrita anteriormente en el ejemplo I, 2a en lugar de las construcciones de expresión que codifican SNAP-25_{206}-GFP. Además, se usará una construcción de expresión adecuada que codifica la cadena ligera de una toxina clostridial apropiada, tal como, por ejemplo, BoNT/B. BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT de cadena ligera en lugar de la construcción pcDNA3.1-LC/A.

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2b. Construcción de pQBI25/VAMP-2-GFP

Para preparar un sustrato VAMP-2 adecuado para los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva, se preparará una construcción pQBI-25NAMP-2-GFP usando un procedimiento SOE-PCR. Se unirá de forma operativa un fragmento de ácido nucleico que comprende una región que codifica los aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) mediante SOE-PCR a una secuencia VAMP-2 que comprende una región que codifica los aminoácidos 47-90 de ID SEC Nº: 31 y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción pCR2.1/VAMP-2 resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica los aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) y los aminoácidos 47-90 de VAMP-2 (ID SEC Nº: 31 ); y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pOBI-25A (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA). El fragmento de restricción resultante se purificará con el kit de extracción de gel OIAquick (OIAGEN, Inc., Valencia, CA), y se subclonará usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pOBI-25A en un vector pOBI-25A (Qbiogene, Inc., Irvine, CA) dando pOBI-25/VAMP-2-GFP. Esta estrategia de clonación dio una construcción de expresión pOBI-25 que codifica un dominio de direccionamiento de la membrana SNAP-25 que comprende aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1), una secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial que comprende aminoácidos 47-90 de VAMP-2 (ID SEC Nº: 31) y un GFP unidos de forma completamente operativa y adecuados para detectar actividad en BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT.

La localización subcelular de sustratos VAMP-2-GFP y sus productos de escisión serán analizados usando los procedimientos como se describieron esencialmente anteriormente en el ejemplo I, 1 c, con la excepción de que se usará la construcción pOBI-25NAMP-2-GFP descrita anteriormente en el ejemplo I, 2b en lugar de las construcciones de expresión que codifican SNAP-25_{206}-GFP. Además, se usará una construcción de expresión adecuada que codifica la cadena ligera de una toxina clostridial apropiada, tal como, por ejemplo, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT de cadena ligera en lugar de la construcción pcDNA3.1-LC/A.

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2c. Construcción de pQBI25/VAMP-3-GFP

Para preparar un sustrato VAMP-3 adecuado para los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva, se preparará una construcción pOBI-25NAMP-3-GFP usando un procedimiento SOE-PCR. Se unirá de forma operativa un fragmento de ácido nucleico que comprende una región que codifica los aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) mediante SOE-PCR a una secuencia de VAMP-3 que comprende una región que codifica los aminoácidos 34-77 de ID SEC Nº: 33 y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción pCR2.1/VAMP-3 resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica los aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) y aminoácido 34-77 de VAMP-3 (ID SEC Nº: 33); y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pQBI-25A (Obiogene, Inc., Carlsbad, CA). El fragmento de restricción resultante se purificará con el kit de extracción de gel OIAquick (OIAGEN, Inc., Valencia, CA), y se subclonará usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pOBI-25A (Qbiogene, Inc., Irvine, CA) dando pQBI-25/VAMP-3-GFP. Esta estrategia de clonación dio una construcción de expresión de pQBI-25 que codifica un dominio de direccionamiento de la membrana SNAP-25 que comprende aminoácidos 85-120 of SNAP-25 (ID SEC Nº: 1), una secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial que comprende aminoácidos 34-77 de VAMP-3 (ID SEC Nº: 33) y un GFP unido de forma completamente operativa y adecuado para detectar actividad en BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT.

La localización subcelular de sustratos VAMP-3-GFP y sus productos de escisión serán analizados usando los procedimientos esencialmente como se describieron anteriormente en el ejemplo I, 1c, con la excepción de que se usará la construcción pQBI-25/VAMP-3-GFP descrita anteriormente en el ejemplo I, 2c en lugar de las construcciones de expresión que codifican SNAP-25_{206}-GFP. Además, se usará una construcción de expresión adecuada que codifica la cadena ligera de una toxina clostridial apropiada, tal como, por ejemplo, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT de cadena ligera en lugar de la construcción pcDNA3.1-LC/A.

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2d. Construcción de pGBI67/VAMP-1-GFP

Para construir pQBI-67/VAMP-1-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende el sustrato VAMP-1-GFP como se describió anteriormente en el ejemplo I, 2a, en ADN de pOBI. 25NAMP-1-GFP usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digirió la construcción pCR2.1/VAMP-1-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido VAMP-1-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un pQBI-67 vector (Obiogene, Inc., Irvine, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pOBI-67 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pOBI-67NAMP-1-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica el VAMP-1-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pQBI-67.

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2e. Construcción de pQBI67/VAMP-2-GFP

Para construir pOBI-67NAMP-2-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende el sustrato VAMP-2-GFP como se describió anteriormente en el ejemplo I, 2b, en ADN de pOBI-25NAMP-2-GFP usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción pCR2.1/VNAMP-2-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido VAMP-2-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pOBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pQBI-67 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pQBI-67/VAMP-2-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica el VAMP-2-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pOBI-67.

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2f. Construcción de pQSI67/VAMP-3-GFP

Para construir pOBI-67NAMP-3-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende el sustrato VAMP-3-GFP como se describió anteriormente en el ejemplo I, 2c, en ADN de pOBI-25/VAMP-3-GFP usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. La construcción pCR2.1/VAMP-3-GFP resultante se digiere con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido VAMP-3-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pQBI-67 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pQBI-87 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pOBI-67NAMP-3-,GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica el VAMP-3-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pQBI-67.

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3. Construcción de sustratos sintaxina de BoNT/C1 3a. Construcción de pQBI25/Sintaxina-1-GFP

Para preparar un sustrato sintaxina-1 adecuado para los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva, se preparó una construcción de pQBI-25/Sintaxina-1-GFP usando un procedimiento de SOE-PCR. Se unirá de forma operativa un fragmento de ácido nucleico que comprende una región que codifica los aminoácidos 85 a 120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) mediante SOE-PCR a una secuencia de sintaxina-1 que comprende una región que codifica los aminoácidos 242-264 de ID SEC Nº: 66 y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción de pCR2.1/Sintaxina-1 resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica los aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1) y aminoácidos 242-264 de sintaxina-1 (ID SEC Nº: 66); y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pQBI-25A (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA). El fragmento de restricción resultante se purificará con el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Inc., Valencia, CA), y se subclonará usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pOBI-25A (Qbiogene, Inc., Irvine, CA) dando pQBI-25/sintaxina-1-GFP. Esta estrategia de clonación dio una construcción de expresión de pQBI-25 que codifica un dominio de direccionamiento de la membrana SNAP-25 que comprende aminoácidos 85-120 de SNAP-25 (ID SEC Nº: 1), una secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial que comprende aminoácidos 242-264 de sintaxina-1 (ID SEC Nº: 66) y un GFP unido de forma completamente operativa y adecuado para detectar actividad en BoNT/C1.

La localización subcelular de sustratos sintaxina-1-GFP y sus productos de escisión será analizada usando los procedimientos como se describieron esencialmente anteriormente en el ejemplo I, 1c, con la excepción de que se usará la construcción pQBI-25/Sintaxina-1-GFP descrita anteriormente en el ejemplo I, 2c en lugar de las construcciones de expresión que codifican SNAP-25_{206}-GFP. Además, se usará una construcción de expresión adecuada que codifica la cadena ligera de una toxina clostridial apropiada, tal como, por ejemplo, la BoNT/C1 de cadena ligera en lugar de la construcción pcDNA3.1-LC/A.

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3b. Construcción de pQBI67/Sintaxina-1-GFP

Para construir pQBI-67/Sintaxina-1-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende el sustrato de sintaxina-1-GFP como se describió anteriormente en el ejemplo I, 3a, en ADN de pQBI-25/Sintaxina-1-GFP usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción de pCR2.1/Sintaxina-1-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido sintaxina-1-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pQBI-67 (Obiogene, Inc., Irvine, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pQBI-67 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pQBI-67/Sintaxina-1-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica la sintaxina-1-GFP unida de forma operativa a los elementos de expresión del vector pQBI-67.

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Ejemplo II Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad para CoNTs

Se podrían esperar sensibilidades distintas para cada uno de los serotipos CoNT en base a los sistemas receptores individuales para cada toxina y serotipo de toxina diferente y su expresión diferente en diferentes líneas celulares. La presencia de un sistema receptor de alta afinidad en una célula para CoNT se puede caracterizar por dos atributos: una captación rápida de la neurotoxina por parte de la célula y una baja concentración de neurotoxina necesaria para la intoxicación celular. Para identificar una línea celular que presenta un sistema receptor de alta afinidad para un CoNT, se ensayaron líneas celulares que usan uno de dos ensayos de escisión in vitro diferentes, uno para determinar la cantidad de toxina requerida para intoxicación, el otro para determinar el periodo de tiempo necesario para que la célula capte la neurotoxina.

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1. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por BoNT/A 1a. Ensayo para determinar la concentración de BoNT/A necesaria para intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de BoNT/A necesaria para intoxicar una celular, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la concentración de toxina necesaria para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se dispuso una densidad de semillas de células adecuada de cada línea en pocillos individuales de placas de cultivo de tejido recubiertas con poli-D-lisina/lamanina de 6 pocillos que contienen 3 ml de un medio adecuado (véase la tabla 13), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se añadió BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 5 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) al medio de cultivo que contiene las células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se recogieron células en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y luego se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Se lisaron las células en 0,5 ml de tampón de lisis que contiene ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N-(2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(\beta-aminoetiléter) N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerol al 10% y 1% (v/v) de Triton-X® 100 (4-octilfenol polietoxilato), con rotación durante 1 hora a 4ºC. Se centrifugaron células lisadas a 5000 rpm durante 10 min at 4ºC para eliminar la debris y se transfirieron los sobrenadantes a tubos siliconizados frescos. Se midieron las concentraciones de proteína mediante
procedimiento Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentración mayor.

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Para detectar la presencia de un sustrato de BoNT/A escindido se hirvieron muestras durante 5 minutos, y se separaron alícuotas de 40 \mul mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida prefundidos Bis-Tris 4-12'C NuPAGE® (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Se transfirieron péptidos separados desde el gel a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) por Western blotting usando un equipo de transferencia de células electroforético semi-seco Trans-Blot® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se bloquearon membranas de PVDF mediante incubación a temperatura ambiente durante 2 horas en una solución que contiene solución salina tri-tamponada 25 mM (ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanediolclorhídrico (Tris-HCl) 25 mM (pH 7,4), cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM), TWEEN-20® al 0,1%, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán, albúmina de suero bovino al 2%, leche seca no grasa al 5%. Se incubaron membranas bloqueadas a 4ºC durante la noche en solución salina tri-tamponada TWEEN® (solución salina tri-tamponada 25 mM, TWEEN-20® al 0,1%, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán) que contiene una dilución 1:5.000 de antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo anti-SNAP25197 #1, un anticuerpo policlonal que es específico del producto de escisión SNAP25_{197} y no reacciona de forma cruzada con SNAP25_{206} de longitud completa, (Allergan, Inc., generado bajo el contrato con Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA). Se lavaron manchas de muestra de anticuerpo primario tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20®. Se incubaron las membranas lavadas a temperatura ambiente durante 2 horas en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20® que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-conejo policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugada con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) como un anticuerpo secundario. Se lavaron manchas de muestra de anticuerpo secundario tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20®. Se visualizó la detección de señal del producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A marcado usando el ECL Plus® Western Blot Detection System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se emitió la imagen de la membrana y se cuantificó el producto de escisión con un Typhoon 9410 Variable Mode Imager y software Imager Analysis (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La elección del tamaño de píxel (de 100 a 200 píxel) y ajustes de voltaje de PMT (de 350 a 600, normalmente 400) depende de la mancha individual. Se detectó un producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A en las líneas celulares SH-SY5Y, NG108-15, N1E-115, Neuro-2A y SK-N-BE(2) después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/A al menos 5 mM, lo que indica la capacidad de BoNT/A de intoxicar estas líneas celulares-(véase Fig. 7a).

La línea celular del neuroblastoma de ratón Neuro-2A se analizó adicionalmente con concentraciones inferiores de BoNT/A para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena. Se cultivaron células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadió BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM y 20 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente B o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se determinó la presencia de un producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se detectó un producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A en la línea celular Neuro-2A después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/A al menos 0,5 nM, lo que indica la capacidad de BoNT/A de intoxicar estas líneas celulares (véase Fig. 7c).

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1b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/A

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo que necesita una línea celular para captar BoNT/A, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena. Se cultivaron células de cada línea en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadió BoNT/A aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se recogieron células tratadas con toxina y se lisaron como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se determinó la presencia de un producto de escisión de SNAP25_{197} de BoNT/A mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se detectó un producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A en las líneas celulares Neuro-2A, SH-SY5Y, y NG108-15 después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/A 1 nM, lo que indica la capacidad de estas líneas celulares para captar rápidamente BoNT/A (véase Fig. 7b).

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2. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por BoNT/B 2a. Ensayo para determinar la concentración de BoNT/B necesaria para la intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de BoNT/B necesaria para intoxicar una línea celular; se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir VAMP expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadirá BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM y 100 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán las células como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a.

Para detectar la presencia de un sustrato de BoNT/B escindido, se llevarán a cabo análisis por western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que se incubarán membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene uno de los siguientes anticuerpos con el fin de detectar producto de escisión VAMP de BoNT/B más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1: 1) dilución 1:1000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-1 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); 2) dilución 1:20.000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-2 monoclonal de ratón CI 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); o 3) dilución 1:1000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-3 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania). Además se usará una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra. La detección de un producto de escisión de VAMP de BoNT/B en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/B al menos 20 nM indicará la capacidad de BoNT/B para intoxicar estas líneas celulares.

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2b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/B

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo requerido por una línea celular para captar BoNT/B, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir VAMP expresado de forma endógena. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 2a. Se añadirá BoNT/B aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 2a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/B mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 2a. La detección de un producto de escisión VAMP de BoNT/B en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/B1 nM indicará que una línea celular puede captar rápidamente BoNT/B.

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3. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por BoNT/C1 3a. Ensayo para determinar la concentración de BoNT/C1 necesaria para intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de BoNT/C1 necesaria para intoxicar una línea celular, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena o sintaxina expresada de forma endógena (véase la tabla 13). Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadirá BoNT/C1 (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM y 100 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán las células como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a.

Para detectar la presencia de un sustrato BoNT/C1 escindido, se llevarán a cabo análisis por western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción: 1) se incubarán membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene una dilución 1:50.000 de anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1 y una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra con el fin de detectar un producto de escisión de SNAP25_{188} de BoNT/C1; 2) se incubarán membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene una dilución 1:5000 de clon de anticuerpo anti-sintaxina-1 monoclonal de ratón CI 78.2 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti SNAP25197 #1 y una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratín policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra con el fin de detectar un producto de escisión de BoNT/C1 sintaxina. La detección de un producto de escisión SNAP_{198} en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con al menos BoNT/C1 20 nM indicará la capacidad de BoNT/C1 para intoxicar estas líneas celulares. La detección del producto de escisión de sintaxina en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/C1 al menos 20 nM indicará la capacidad de BoNT/C1 para intoxicar estas líneas celulares.

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3b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/C1

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo que necesita una línea celular para captar BoNT/C1, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena o sintaxina expresada de forma endógena. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 3a. Se añadirá BoNT/C1 aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 3a. Se determinará la presencia de un producto de escisión SNAP25_{198} de BoNT/C1 y producto de escisión sintaxina de BoNT/C1 mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 3a. La detección de un producto de escisión SNAP25_{198} de BoNT/C1 en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/C1 1 nM indicará que una línea celular puede captar rápidamente BoNT/C1. La detección de un producto de escisión sintaxina de BoNT/C1 en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/C1 1 nM indicará que una línea celular puede captar rápidamente BoNT/C1.

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4. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por BoNT/D 4a. Ensayo para determinar la concentración de BoNT/D necesaria para la intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de BoNT/D necesaria para intoxicar una línea celular, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir VAMP expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadirá BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM y 100 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán las células como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a.

Para detectar la presencia de un sustrato BoNT/D escindido, se llevará a cabo análisis por western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que se incubarán membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene uno de los siguientes anticuerpos con el fin de detectar un producto de escisión BoNT/D VAMP más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1: 1) dilución 1:1000 de clon anticuerpo anti-VAMP-1 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); 2) dilución 1:20.000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-2 monoclonal de ratón CI 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); o 3) dilución 1:1000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-3 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), Además se usará una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugada con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra. La detección de un producto de escisión BoNT/D VAMP en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/D al menos 20 nM indicará la capacidad de BoNT/D para intoxicar estas líneas celulares.

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4b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/D

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo que necesita una línea celular para captar BoNT/D, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir VAMP expresado de forma endógena. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 4a. Se añadirá BoNT/D aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 4a. La presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/D se determinará mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 4a. La detección de un producto de escisión VAMP de BoNT/D en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/D 1 nM indicará que una línea celular puede captar rápidamente BoNT/D.

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5. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por BoNT/E 5a. Ensayo para determinar la concentración de BoNT/E necesaria para intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de BoNT/E necesaria para intoxicar una línea celular, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de origen neuronal para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se dispuso una densidad adecuada de células de cada línea en pocillos individuales de placas de cultivo de tejido recubiertas con poli-D-lisina/lamanina de 6 pocillos que contienen 3 ml de un medio adecuado (véase la tabla 13), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se añadió BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 2 nM o 20 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 6 o aproximadamente 16 horas. Se recogieron células en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y luego se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1:5 ml. Se lisaron las células en 0:5 ml de tampón de lisis que contiene ácido N-(2-hidroxietil) piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(\beta-aminoetil)éter) N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), glicerina al 10% y Triton-X® 100 (4-octilfenol polietoxilato) al 1% (v/v), con rotación durante 1 hora a 4ºC. Se centrifugaron las células lisadas a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC para eliminar el debris y se transfirieron los sobrenadantes a tubos siliconizados frescos. Se midieron las concentraciones de proteína mediante el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentración mayor.

Para detectar la presencia de un sustrato BoNT/E escindido, se llevaron a cabo análisis por western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que se incubaron membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene una dilución 1:50.000 de anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD) más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1 y una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra con el fin de detectar un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E. Se detectó un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E en las líneas celulares Neuro-2A, SH-SY5Y, N1E-115, SK-N-BE(2), NG108-15, SK-N-DZ y BE(2)-C después de al menos una incubación de 6 horas con BoNT/E al menos 20 nM, lo que indica la capacidad de BoNT/E para intoxicar estas líneas celulares (véase Fig. 8a).

Se analizó adicionalmente la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-DZ concentraciones inferiores de BoNT/E para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena. Se cultivaron células en placas de 6 pocillos de poli-D-lisina alanina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se añadió BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 2 nM y 5 nM) en el medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 6 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se determinó la presencia de un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se detectó un producto de escisión SNAP25_{180} de A BoNT/E en la línea celular SK-N-DZ después de al menos una incubación de 6 horas con BoNT/E al menos 0,1 nM, lo que indica la capacidad de BoNT/E para intoxicar estas líneas celulares (véase Fig. 8c).

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5b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/E

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo que necesita una línea celular para captar BoNT/E, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se cultivaron células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se añadió BoNT/E aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se determinó la presencia de un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se detectó un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E en las líneas celulares Neuro-2A, SH-SY5Y, y NG108-15 después de al menos una incubación de 6 horas con BoNT/E 1 nM, lo que indica la capacidad de estas líneas celulares para captar rápidamente BoNT/F (véase Fig. 8b).

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6. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por BoNT/F 6a. Ensayo para determinar la concentración de BoNT/F necesaria para la intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de SoNT/F necesaria para intoxicar una línea celular, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir VAMP expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadirá BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM y 100 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán las células como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a.

Para detectar la presencia de un sustrato BoNT/F escindido, se llevarán a cabo análisis por western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que se incubarán membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene uno de los siguientes anticuerpos con el fin de detectar un producto de escisión VAMP de BoNT/F más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1: 1) dilución 1:1000 de clon anticuerpo anti-VAMP-1 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); 2) dilución 1:20.000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-2 monoclonal de ratón CI 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); o 3) dilución 1:1000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-3 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania). Además se usará una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology. Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra. La detección de un producto de escisión VAMP de BoNT/F en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/F al menos 20 nM indicará la capacidad de BoNT/F para intoxicar estas líneas celulares.

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6b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/F

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo que necesita una línea celular para captar BoNT/F, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir VAMP expresado de forma endógena. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 6a. Se añadirá BoNT/F aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 6a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/F mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 6a. La detección de un producto de escisión VAMP de BoNT/F en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/F 1 nM indicará que una línea celular puede captar rápidamente BoNT/F.

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7. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por BoNT/G 7a. Ensayo para determinar la BoNT/G concentración de necesaria para la intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de BoNT/G necesaria para intoxicar una línea celular, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir VAMP expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadirá BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM y 100 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán las células como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a.

Para detectar la presencia de un sustrato de BoNT/G escindido, se llevará a cabo análisis por western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que se incubarán membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene uno de los siguientes anticuerpos con el fin de detectar un producto de escisión VAMP de BoNT/G más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1: 1) dilución 1:1000 de clon anticuerpo anti-VAMP-1 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); 2) dilución 1:20.000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-2 monoclonal de ratón CI 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); o 3) dilución 1:1000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-3 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania). Además se usará una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra. La detección de un producto de escisión VAMP de BoNT/G en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/G al menos 20 nM indicará la capacidad de BoNT/G para intoxicar estas líneas celulares.

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7b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/G

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo que necesita una línea celular para captar BoNT/G, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir VAMP expresado de forma endógena. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 7a. Se añadirá BoNT/G aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 7a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/G mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 7a. La detección de un BoNT/G producto de escisión VAMP en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con BoNT/G 1 nM indicará que una línea celular puede captar rápidamente BoNT/G.

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8. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad por TeNT 8a. Ensayo para determinar la concentración de TeNT necesaria para la intoxicación celular

Con el fin de evaluar la cantidad de TeNT necesaria para intoxicar una línea celular, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir VAMP expresado de forma endógena (véase la tabla 13). Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadirá TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM y 100 nM) al medio de cultivo que contiene células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán células y se lisarán como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a.

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Para detectar la presencia de un sustrato escindido de sustrato TeNT, se llevarán a cabo análisis por western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que se incubarán membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene uno de los siguientes anticuerpos con el fin de detectar un producto de escisión VAMP de TeNT más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1: 1) dilución 1:1000 de clon anticuerpo anti-VAMP-1 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); 2) dilución 1:20.000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-2 monoclonal de ratón CI 69.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania); o 3) dilución 1:1000 de clon de anticuerpo anti-VAMP-3 monoclonal de ratón CI 10.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania). Además se usará una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra. La detección de un producto de escisión VAMP de TeNT en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con TeNT al menos 20 nM indicará la capacidad de TeNT para intoxicar estas líneas celulares.

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8b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar TeNT

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo que necesita una línea celular para captar TeNT, se seleccionó un conjunto de líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar el intervalo de exposición a toxina necesario para escindir VAMP expresado de forma endógena. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 8a. Se añadirá TeNT aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 8a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de TeNT mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 8a. La detección de un producto de escisión VAMP de TeNT en una línea celular después de al menos una incubación de 8 horas con TeNT 1 nM indicará que una línea celular puede captar rápidamente TeNT.

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Ejemplo III Tratamientos para aumentar la captación de una célula por una toxina clostridial

Los gangliósidos de superficie celular son parte del sistema receptor para toxinas clostridiales y parecen participar en la unión de una toxina con su sistema receptor. Si bien la unión de la toxina no es estrictamente dependiente de la presencia de gangliósidos, la presencia de gangliósidos específicos parece ser requerida para unión de alta afinidad. De forma particular se ha observado que CoNTs interaccionan in vitro e in vivo con polisialogangliósidos, especialmente los de las series G1b (GD1a, GD1b, GD3, GQ1b, o GT1b), véase, p.e., Jane L. Halpern & Elaine A. Neale, Neurospecific binding, internalization, and retrograde axonal transport, 195 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 221-241 (1995). Igualmente el estado diferenciado de una célula podría influenciar la expresión o nivel de expresión de componentes importantes de un sistema receptor de toxina clostridial, tal como, por ejemplo, un receptor de superficie celular. Por ejemplo, se pueden diferenciar células Neuro-2A y SH-SY5Y para adquirir un fenotipo de tipo neuronal que puede facilitar la captación de toxina. Para determinar si se podría aumentar la captación de una toxina clostridial por parte de una célula particular, se ensayó 1) si un tratamiento que aumentaba el contenido de gangliósido de la membrana celular aumentaba la captación de una toxina clostridial por una célula; y 2) si el cambio del estado de diferenciación de una célula podría aumentar la captación de una toxina clostridial por parte de una célula.

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1. Identificación de tratamientos que aumentaban la captación de BoNT/A por una célula 1a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/A por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de BoNT/A para intoxicar una célula, se pretrató una línea celular Neuro-2A con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar podrían aumentar la captación de BoNT/A por parte de estas células. Se dispusieron en placas células Neuro-2A a una densidad adecuada en pocillos individuales de placas de cultivo de tejido recubiertas con poli-D-lisina/lamanina de 6 pocillos que contienen 3 ml de un medio adecuado (véase la tabla 13), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de aproximadamente 24 horas, se reemplazó el medio con un medio sin suero y se añadió 25 \mug/ml de uno de los siguientes gangliósidos a pocillos individuales: GD1a, GD1b, GD3, GQ1b, o GT1b (AXXORA, LLC, San Diego, CA). Después de un periodo de incubación de 37ºC durante la noche, se lavaron las células tratadas con gangliósido tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubaron a 37ºC con medio con suero al 1% que contiene diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) de BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se recogieron las células en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y luego se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Se lisaron las células en 0,5 ml de tampón de lisis que contiene ácido N-(2-hidroxietil) piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(\beta-aminoetiléter) N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10% y Triton-X® 100 (4-octilfenol polietoxilato) al 1% (v/v), con rotación durante 1 hora a 4ºC. Se centrifugaron las células lisadas a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC para eliminar el debris y se transfirieron los sobrenadantes a tubos siliconizados frescos. Se midieron las concentraciones de proteína mediante el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentración mayor. Se determinó la presencia de un producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1 a. Se detectó un aumento en producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A en la línea celular Neuro-2A tratada con el gangliósido GT1b, lo que indica que el tratamiento con GT1b puede aumentar la captación de BoNT/A por parte de células Neuro-2A (véase Fig. 9a).

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1b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/A por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de BoNT/A para intoxicar una célula, se trataron células Neuro-2A y SH-SY5Y con diferentes condiciones de cultivo o reactivos de diferenciación para determinar si la diferenciación de estas células podría dar lugar a una mayor captación de BoNT/A por parte de estas células. Se dispusieron células en placas a una densidad adecuada en pocillos individuales de placas de cultivo de tejido recubiertas con poli-D-lisina/lamanina de 6 pocillos que contienen 3 ml de un medio adecuado (véase la tabla 13), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de aproximadamente 24 horas, se reemplaza el medio con un medio de cultivo sin suero o un medio con suero al 10% y se añadió uno de los siguientes reactivos de diferenciación a pocillos individuales: 0,2 unidades de neuraminidasa tipo V (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), en agua que contiene ALBUMAX II al 0,2% (Invitrogen, Inc., Carlsbad, 'CA); ácido todo-trans retinoico 20 \muM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); sal sódica de monofosfato N6, 2'-0-dibutiriladenosina 3':5'-cíclica (db-cAMP) 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); lonomicina 1 \muM, sal de calcio (Molecular Probes, Eugene, OR) en DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); o 1 x suplemento N-2 (Invitrogen, Inc., 17502-048, Carlsbad, CA). Después de un periodo de incubación de tres días a 37ºC se lavaron las células en medio sin suero y tratadas con reactivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubaron a 37ºC con medio sin suero que contiene toxina Pure A (BTX-540) 2 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos en condiciones de cultivo), o medio con suero al 10% que contiene toxina Pure A (BTX-540) 2 nM (Metabiologics, Inc.. Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos con reactivo de diferenciación). Se cultivaron células mediante tratamiento con tripsina, se recogieron en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y luego se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Se lisaron las células en 0,5 ml de tampón de lisis que contiene ácido N-(2-hidroxietil) piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(\beta-aminoetiléter) N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10% y Triton-X® 100 (4-octilfenol polietoxilato) al 1% (v/v), con rotación durante 1 a 2 horas at 4ºC. Se centrifugaron células lisadas a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC para eliminar el debris y se transfirieron los sobrenadantes a tubos siliconizados de 1,5 ml frescos. Se midieron las concentraciones de proteína mediante el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentración mayor. Se determinó la presencia de un producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que se incubaron membranas de PVDF bloqueadas en una solución de anticuerpo primario que contiene una dilución 1:50.000 de anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón (SMI-81; Sternberger Monoclonals, LulheNille, MD) más que el antisuero anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 #1 y una solución de anticuerpo secundario que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) más que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra con el fin de detectar los dos productos SNAP-25 no escindido y el producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A. Se detectó un aumento en producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A en células Neuro-2A y SH-SY5Y diferenciadas en condiciones sin suero en comparación con el medio con suero al 10%, lo que indica que las condiciones de medio sin suero pueden aumentar la captación de BoNT/A por parte de células Neuro-2A y SH-SY5Y (véase Fig. 9b). Igualmente se detectó un aumento en producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/A en células Neuro-2A tratadas con ácido todo-trans retinoico, lo que indica que la diferenciación inducida por retinoico de Neuro-2A puede aumentar la captación de BoNT/A por parte de estas células (véase Fig. 9b).

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2. Identificación de tratamiento que aumentan la captación de BoNT/B por una célula 2a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/B por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de BoNT/B para intoxicar una célula, se pretrataron células de mamífero adecuadas con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar pueden aumentar la captación de BoNT/B por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina y se tratan con gangliósidos como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a, Las células tratadas con gangliósido se incubarán con BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio con suero al 1% durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/B mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 2a. Un aumento en producto de escisión VAMP de BoNT/B detectado en la línea celular tratada con un gangliósido indicará que el tratamiento con ese gangliósido puede aumentar la captación de BoNT/B por parte de estas células.

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2b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/B por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de BoNT/B para intoxicar una célula, se tratarán células de mamífero adecuadas con diferentes condiciones de cultivo o reactivos de diferenciación para determinar si la diferenciación de estas células puede dar lugar a una mayor captación de BoNT/B por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina usando medio sin suero o con suero al 10% tratado con reactivos de diferenciación como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Después de un periodo de incubación de tres días a 37ºC, se lavarán las células en medio sin suero y las células tratadas con reactivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubará a 37ºC con medio sin suero que contiene BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos en condiciones de cultivo), o medio con suero al 10% que contiene BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos con reactivo de diferenciación). Se cosecharon, recogieron y lisaron células como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/B mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 2a. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/B detectado en células cultivadas en medio sin suero indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/B por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/B detectado en células tratadas con un reactivo de diferenciación indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/B por parte de estas células.

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3. Identificación de tratamientos que aumentaban la captación de BoNT/C1 por una célula 3a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/C1 por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de BoNT/C1 para intoxicar una célula, se pretrataron células de mamífero adecuadas con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar pueden aumentar la captación de BoNT/C1 por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina y se tratan con gangliósidos como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Las células tratadas con gangliósido se incubarán con BoNT/C1 (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio con suero al 1% durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión SNAP25_{197} de BoNT/C1 mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 3a. Se determinará la presencia de un producto de escisión de sintaxina de BoNT/C1 mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 3a. Un aumento en producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/C1 detectado en la línea celular tratada con un gangliósido indicará que el tratamiento con ese gangliósido puede aumentar la captación de BoNT/C1 por parte de estas células. Un aumento en producto de escisión sintaxina de BoNT/C1 detectado en la línea celular tratada con un gangliósido indicará que el tratamiento con ese gangliósido puede aumentar la captación de BoNT/C1 por parte de estas células.

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3b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/C1 por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de BoNT/C1 para intoxicar una célula, se tratarán células de mamífero adecuadas con diferentes condiciones de cultivo o reactivos de diferenciación para determinar si la diferenciación de estas células puede dar lugar a una mayor captación de BoNT/C1 por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina usando medio sin suero o con suero al 10% tratado con reactivos de diferenciación como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Después de un periodo de incubación de tres días a 37ºC, se lavarán las células en medio sin suero y las células tratadas con reactivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubará a 37ºC con medio sin suero que contiene BoNT/C1 (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos en condiciones de cultivo), o medio con suero al 10% que contiene BoNT/C1 (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos con reactivo de diferenciación). Se cosecharon, recogieron y lisaron células como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/C1 mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 3a. Se determinará la presencia de un producto de escisión de sintaxina de BoNT/C1 mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 3a. Un aumento en un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/C1 detectado en células cultivadas en medio sin suero indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/C1 por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/C1 detectado en células tratadas con un reactivo de diferenciación indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/C1 por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión de sintaxina de BoNT/C1 detectado en células cultivadas en medio sin suero indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/C1 por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión de sintaxina de BoNT/C1 detectado en células tratadas con un reactivo de diferenciación indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de-BoNT/C1 por parte de estas células.

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4. Identificación de tratamientos que aumentan la captación de BoNT/D por una célula 4a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/D por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de BoNT/D para intoxicar una célula, se pretrataron células de mamífero adecuadas con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar pueden aumentar la captación de BoNT/D por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina y se tratan con gangliósidos como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Las células tratadas con gangliósido se incubarán con BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio con suero al 1% durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/D mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 4a. Un aumento en producto de escisión VAMP de BoNT/D detectado en la línea celular tratada con un gangliósido indicará que el tratamiento con ese gangliósido puede aumentar la captación de BoNT/D por parte de estas células.

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4b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/D por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de BoNT/D para intoxicar una célula, se tratarán células de mamífero adecuadas con diferentes condiciones de cultivo o reactivos de diferenciación para determinar si la diferenciación de estas células puede dar lugar a una mayor captación de BoNT/D por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina usando medio sin suero o con suero al 10% tratado con reactivos de diferenciación como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Después de un periodo de incubación a 37ºC de tres días, se lavarán las células en medio sin suero y las células tratadas con reactivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubarán a 37ºC con medio sin suero que contiene BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos en condiciones de cultivo), o medio con suero al 10% que contiene BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos con reactivo de diferenciación). Se cosecharon, recogieron y lisaron células como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/D mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 4a. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/D detectado en células cultivadas en medio sin suero indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/D por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/D detectado en células tratadas con un reactivo de diferenciación
indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/D por parte de estas células.

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5. Identificación de tratamientos que aumentan la captación de BoNT/E por una célula 5a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/E por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de BoNT/E para intoxicar una célula, se pretrató una línea celular Neuro-2A con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar podrían aumentar la captación de BoNT/E por parte de estas células. Se cultivaron células Neuro-2A en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina y se tratan con gangliósidos como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se incubaron las células tratadas con gangliósido con BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio con suero al 1% durante aproximadamente 6 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se determinó la presencia de un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se detectó un aumento en producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E en las líneas celulares Neuro-2A tratadas con los gangliósidos GD3, GD1b y GD1a, lo que indica que el tratamiento con GD3, tratamiento con GD1b o tratamiento con GD1a puede aumentar la captación de BoNT/E por células Neuro-2A (véase Fig. 10a).

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5b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/E por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de BoNT/E para intoxicar una célula, se trataron células SH-SY5Y con diferentes condiciones de crecimiento para determinar si la diferenciación de estas células podría dar lugar a una mayor captación de BoNT/E por parte de estas células. Se cultivaron células SH-SY5Y en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina usando medio sin suero como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Se incubaron las células en medio sin suero con BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a concentraciones de 5 nM y 20 nM durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 8 horas y aproximadamente 16 horas. Se cosecharon, recogieron y lisaron células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Se determinó la presencia de un producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 5a. Se detectó un aumento en producto de escisión SNAP25_{180} de BoNT/E en células SH-SY5Y diferenciadas en condiciones sin suero tan pronto como 4 horas tras la exposición a toxina, con una señal máxima evidente al menos a 8 horas tras el tratamiento con BoNT/E, en comparación con el medio con suero al 10%, lo que indica que las condiciones de medio sin suero pueden aumentar la captación de BoNT/E por parte de células SH-SY5Y (véase Fig. 10b).

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6. Identificación de tratamientos que aumentan la captación de BoNT/F por una célula 6a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/F por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de BoNT/F para intoxicar una célula, se pretrataron células de mamífero adecuadas con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar pueden aumentar la captación de BoNT/F por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina y se tratan con gangliósidos como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1 a. Las células tratadas con gangliósido se incubarán con BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio con suero al 1% durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplos III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/F mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 6a. Un aumento en producto de escisión VAMP de SoNT/F detectado en la línea celular tratada con un gangliósido indicará que el tratamiento con ese gangliósido puede aumentar la captación de BoNT/F por parte de estas células.

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6b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/F por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de BoNT/F para intoxicar una célula, se tratarán células de mamífero adecuadas con diferentes condiciones de cultivo o reactivos de diferenciación para determinar si la diferenciación de estas células puede dar lugar a una mayor captación de BoNT/F por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina usando medio sin suero o con suero al 10% tratado con reactivos de diferenciación como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Después de un periodo de incubación de tres días a 37ºC, se lavarán las células en medio sin suero y las células tratadas con reactivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubará a 37ºC con medio sin suero que contiene BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos en condiciones de cultivo), o medio con suero al 10% que contiene BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos con reactivo de diferenciación). Se cosecharon, recogieron y lisaron células como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/F mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 6a. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/F detectado en células cultivadas en medio sin suero indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/F por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/F detectado en células tratadas con un reactivo de diferenciación
indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/F por parte de estas células.

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7. Identificación de tratamientos que aumentan la captación de BoNT/G por una célula 7a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/G por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de BoNT/G para intoxicar una célula, se pretrataron células de mamífero adecuadas con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar pueden aumentar la captación de BoNT/G por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina y se tratan con gangliósidos como se describió anteriormente en el ejemplo III. 1a. Las células tratadas con gangliósido se incubarán con BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio con suero al 1% durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/G mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 7a. Un aumento en producto de escisión VAMP de BoNT/G detectado en la línea celular tratada con un gangliósido indicará que el tratamiento con ese gangliósido puede aumentar la captación de BoNT/G por parte de estas células.

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7b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/G por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de BoNT/G para intoxicar una célula, se tratarán células de mamífero adecuadas con diferentes condiciones de cultivo o reactivos de diferenciación para determinar si la diferenciación de estas células puede dar lugar a una mayor captación de BoNT/G por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina usando medio sin suero o con suero al 10% tratado con reactivos de diferenciación como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Después de un periodo de incubación de tres días a 37ºC, se lavarán las células en medio sin suero y las células tratadas con reactivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubará a 37ºC con medio sin suero que contiene BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos en condiciones de cultivo), o medio con suero al 10% que contiene BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos con reactivo de diferenciación). Se cosecharon, recogieron y lisaron células como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de BoNT/G mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 7a. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/G detectado en células cultivadas en medio sin suero indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/G por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión VAMP de BoNT/G detectado en células tratadas con un reactivo de diferenciación
indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de BoNT/G por parte de estas células.

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8. Identificación de tratamientos que aumentan la captación de TeNT por una célula 8a. Tratamiento con gangliósido para aumentar la captación de alta afinidad de TeNT por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido en la capacidad de TeNT para intoxicar una célula, se pretrataron células de mamífero adecuadas con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar pueden aumentar la captación de TeNT por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina y se tratan con gangliósidos como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Las células tratadas con gangliósido se incubarán con TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) a diferentes concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio con suero al 1% durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Se cosecharán y lisarán células tratadas con toxina como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de TeNT mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 8a. Un aumento en producto de escisión VAMP de TeNT detectado en la línea celular tratada con un gangliósido indicará que el tratamiento con ese gangliósido puede aumentar la captación de TeNT por parte de estas células.

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8b. Tratamiento con reactivo de diferenciación para aumentar la captación de alta afinidad de TeNT por una célula

Con el fin de evaluar el efecto de diferenciación celular en la capacidad de TeNT para intoxicar una célula, se tratarán células de mamífero adecuadas con diferentes condiciones de cultivo o reactivos de diferenciación para determinar si la diferenciación de estas células puede dar lugar a una mayor captación de TeNT por parte de estas células. Se cultivarán células en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina usando medio sin suero o con suero al 10% tratado con reactivos de diferenciación como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1b. Después de un periodo de incubación de tres días a 37ºC, se lavarán las células en medio sin suero y las células tratadas con reactivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y luego se incubarán a 37ºC con medio sin suero que contiene TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos en condiciones de cultivo), o medio con suero al 10% que contiene TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI) durante aproximadamente 18 horas (los experimentos con reactivo de diferenciación). Se cosecharon, recogieron y lisaron células como se describió anteriormente en el ejemplo III, 1a. Se determinará la presencia de un producto de escisión VAMP de mediante análisis por Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo II, 8a. Un aumento en un producto de escisión VAMP de TeNT detectado en células cultivadas en medio sin suero indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de TeNT por parte de estas células. Un aumento en un producto de escisión VAMP de TeNT detectado en células tratadas con un reactivo de diferenciación indicará que el tratamiento con ese reactivo puede aumentar la captación de TeNT por parte de estas células.

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Ejemplo IV Generación de células que contienen transitoriamente un sustrato de toxina clostridial 1. Generación de células que contienen un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E mediante transducción adenoviral 1a. Construcción de pAd-DEST/SNAP-25_{206}-GFP

Para preparar un construcción de pAd-DEST/SNAP-25_{206}-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región de aminoácido que comprende SNAP-25_{206}-GFP en ADN de pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase ejemplo I, 1a) usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. La construcción pCR2.1/SNAP-25_{206}-GFP resultante se digiere con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido SNAP-25_{206}-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pAd-DEST (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pAd-DEST que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pAd-DEST/SNAP-25_{206}-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, y cultivadas dispuestas en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica el SNAP-25_{206}-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pAd-DEST.

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1b. Producción de un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/SNAP-25-GFP

Para producir un stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/SNAP-25_{206}-GfP, se disponen en placas aproximadamente 5x10^{5} células 293A en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), solución de 1 x penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Después de un día de la transfección se reemplaza medio DMEM suplementado completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM. Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio de suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de la construcción de expresión linearizada que codifica un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tales como, por ejemplo, pAd-DEST/SNAP-25_{206}-GFP. Para linealizar una construcción pAd-DEST/SNAP-25-GFP, se digiere 5 \mug de una construcción pAd-DEST/SNAP-25-GFP con Pad (New England Biolabs, Beverly, MA). Se purifica el plásmido linearizado usando el procedimiento del kit QIAquick (GIAGEN. Inc., Valencia, CA) y se resuspende en tampón TE. Esta transfección es incubada a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se añade luego la solución de transfección de 500 \mul a las células 293A y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de DMEM suplementado completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se tripsinizan las células y se transfieren los contenidos de cada pocillo a una placa de cultivo de tejido de 10 cm estéril que contiene 10 ml de DMEM suplementado completo. Se reemplaza el medio viejo con DMEM suplementado completo fresco cada 2 ó 3 días hasta que se observan regiones visibles de efecto citopático (de forma típica de 7 a 10 días). Se rellena el medio de cultivo viejo con DMEM suplementado completo fresco y permite que tengan lugar infecciones hasta aproximadamente el 80% del efecto citopático (de forma típica de 10 a 13 días post-transfection). Se cultivaron células que contienen adenovirus mediante desprendimiento de las células usando el medio de cultivo y células de rascado de la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y medios a un tubo de 15 ml. Se lisaron las células cosechadas usando un ciclo de congelación-descongelación consistente en -80ºC durante 30 minutos luego 37ºC durante 15 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000 x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas adenovirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente 1x10^{7} a 10^{8} pfu de partículas adenovirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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1c. Amplificación de un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/SNAP-25-GFP

Para amplificar el stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/SNAP-25_{206}-GFP, se disponen aproximadamente 3x10^{6} células 293A en un disco de cultivo de 100 mm que contiene 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 80-90% de confluencia (6-16 horas). Las células son células inoculadas con 100 \mul de solución stock adenoviral y se incubaron durante aproximadamente 48-72 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células emergen y flotan o se unen débilmente a la placa de cultivo. Se cosechan las células que contienen adenovirus desprendiendo las células usando el medio de cultivo y células de racado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml. Se lisaron las células cosechadas usando tres ciclos de congelación-descongelación consistente en -80ºC durante 30 minutos luego 37ºC durante 15 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000 x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas adenovirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente 1x10^{8} a 10^{9} pfu de partículas adenovirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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1d. Transducción de células con un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/SNAP-25-GFP

Para transducir células con el stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/SNAP-25_{206}-GFP, se disponen en placas aproximadamente 1,5x10^{5} células SH-SY5Y en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de EMEM y medio F12 de Ham (EMEM:F12) 1:1 completo, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio al 1% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales en MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se inoculan las células con aproximadamente 4 \mul del stock adenoviral (aproximadamente 5x10^{8} pfu/ml) y se incuban durante aproximadamente 24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de EMEM:F12 suplementado completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se pueden usar las células transducidas para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un sustrato SNAP-25-GFP.

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2. Generación de células que contienen un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E por transducción lentiviral 2a. Construcción de pLenti6Ubc/V5-SNAP-25_{206}-GFP

Para preparar una construcción pLenti6Ubc/V5-SNAP-25_{206}-GFP, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, por ejemplo, en ADN de pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1a) usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción pCR2.1/SNAP-25_{206}-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido SNAP-25_{206}-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pLenti6Ubc/V5 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pLenti6Ubc/V5 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pLenti6Ubc/V5-SNAP-25_{206}-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da lugar a una construcción de expresión en mamífero que codifica el SNAP-25_{206}-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pLenti6Ubc/V5 vector en el péptido V5 con terminal amino.

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2b. Producción de un stock lentiviral que contiene pLenti6Ubc/V5-SNAP-25-GFP

Para producir un stock lentiviral que contiene pLenti6Ubc/V5-SNAP-25-GFP, se prepara una solución de transfección de 3,0 ml mediante adición de 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 36 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos con 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 3 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-SNAP-25_{206}-GFP y 9 \mug de ViraPower^{TM} Packaging Mix. Después de una incubación de aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente, se añaden los complejos ADN-lípido a una placa de cultivo de tejido de 10 cm que contiene 5 ml medio con suero reducido OPTI-MEM. Se añade luego una suspensión de células de 5 ml que contiene aproximadamente 6x16^{6} células 293A al medio de complejo de ADN-lípido y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante la noche. Se reemplaza el medio de transfección con 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24-48 horas. Se cosechan las células que contienen lentiovirus mediante desprendimiento de las células usando el medio de cultivo y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml y se centrifuga (5.000x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas lentivirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente 5x10^{5} a 2x 10^{7} pfu/ml de partículas lentivirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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2c. Transducción de células con un stock lentiviral que contiene un pLenti6Ubc/V5-SNAP-25-GFP

Para transducir células con el stock lentiviral que contiene pLenti6Ubc/V5-SNAP-25-GFP, se disponen en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células SH-SY5Y en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de EMEM y medio F12 de Ham (EMEM:F12) 1:1 completo, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio al 1% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 1x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se inoculan las células con el stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-SNAP-25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1), usando una multiplicidad adecuada de infección y se incuban durante aproximadamente 16-24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de EMEM:F12 suplementado completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24-48 horas. Se pueden usar las células transducidas para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un sustrato SNAP-25-GFP.

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3. Generación de células que contienen un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E mediante transformación de proteína 3a. Expresión de un sustrato SNAP-25-GFP usando una línea celular bacteriana

Para expresar un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando bacterias, se introduce una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-67/SNAP-25_{206}-GFP como se describió anteriormente en el ejemplo I, 1d, en células BL21 (DE3) de E. coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un protocolo de transformación de choque térmico. Se dispone luego en placa la reacción de choque térmico en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Se usa una colonia resistente a ampicilina simple de E. coli transformado que contiene pQBI-67/SNAP-25_{206}-GFP para inocular un tubo de ensayo de 15 ml que contiene 3,0 ml de medio Luria-Bertani, (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina que se cultiva luego dispuesto en un incubador a 37ºC, agitando a 250 rpm, durante la noche. Se usa el cultivo iniciador resultante de la noche para inocular un matraz con deflectores de 1,0 l que contiene 100 ml de medio Luria-Bertani, (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina a una dilución de 1:1000. Este cultivo se cultiva en un incubador a 32ºC agitando a 250 rpm durante aproximadamente 6,5 horas hasta alcanzar la fase semilogarítmica (DO_{600} de aproximadamente 0,6-0,8). Se induce luego la expresión de proteína mediante adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) 1 mM y se dispone el cultivo en placas en un incubador a 32ºC agitando a 250 rpm durante la noche. Se cosechan las células mediante centrifugación (4.000 rpm a 4ºC durante 20-30 minutos) para agregar las células. Se desecha el sobrenante y se usa el agregado celular inmediatamente para las etapas subsiguientes, o se conserva el agregado a -80ºC hasta que se necesite.

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3b. Expresión de un sustrato SNAP-25-GFP usando una línea celular de mamífero

Para expresar un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando una línea celular de mamífero, se dispone en placas aproximadamente 1,5x10^{5} células SH-SY5Y en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml of EMEM y medio F12 de Ham (EMEM:F12) 1:1 completo, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio al 1% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25-GFP de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1a). Esta transfección es incubada a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio EMEM:F12 suplementado completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM y se añade la solución de transfección de 500 \mul a las células SH-SY5Y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de EMEM:F12 suplementado completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 48 horas. Se cosechan las células mediante células de aclarado una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y desprendimiento de células aclaradas mediante adición de 500 \mul de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas a un tubo de ensayo de 1,5 ml y se agregan mediante microcentrifugación (10.000x g a 4ºC durante 5 minutos). Se desecha el sobrenante y se usa el agregado celular inmediatamente para las etapas subsiguientes, o se conserva el agregado a -80ºC hasta que se necesite.

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3c. Purificación de un sustrato SNAP-25-GFP

Para purificar un sustrato SNAP-25-GFP, se resuspende un agregado celular que expresa una construcción de expresión que codifica un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, una construcción pQBI-67/SNAP-25_{206}-GFP o pQBI-25/SNAP-25_{206}-GFP, en 10 ml de tampón Tris-EDTA (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0), que contiene 1 mg/ml de lisozima y se lisan las células usando tres ciclos de congelación-descongelación consistentes en -80ºC durante 5 minutos, luego 37ºC durante 5 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000x g a 4ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular y se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo que contiene un volumen igual de tampón de unión en columna (sulfato de amonio 4 M). Se prepara una columna de cromatografía por interacción hidrófoba (CIH) usando un soporte de columna Econo-Pac de 20 ml (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que está empaquetado con 2,5-5,0 ml de resina de ClH metílica (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), que se equilibra luego lavando con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio de columna (sulfato de amonio 2 M). Se aplica el lisado clarificado lentamente a la columna equilibrada por flujo de gravidez (aproximadamente 0,25-0,3 ml/minuto). Se lava luego la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de lavado en columna (sulfato de amonio 1,3 M). Se eluye el sustrato SNAP-25_{206}-GFP con 20-30 ml de tampón de elución en columna (tampón TE 10 mM) y se recoge en aproximadamente doce fracciones de 1 ml. Se controla el progreso de la muestra de sustrato SNAP-25_{206}-GFP a través de la columna así mismo se controla también aquellas fracciones de elución que contienen la muestra usando una luz ultravioleta de un transluminador manual. Se determina la cantidad de sustrato SNAP-25_{206}-GFP contenido en cada fracción de elución mediante un ensayo con tinte Bradford. En este procedimiento se combina 20 \mul de alícuota de cada fracción de 1,0 ml con 200 \mul de reactivo Bio-Rad Protein (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), diluido de 1 a 4 con agua desionizada y destilada, y luego se mide la intensidad de la señal colorimétrica usando un espectrofotómetro. Se considera que las cinco fracciones con la señal más fuerte comprenden el pico de elución y se reúnen. Se determina el rendimiento de proteína total mediante estimación de la concentración de proteína total de las fracciones de elución de pico reunidas usando globulina gamma bovina como un patrón (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La cantidad de sustrato SNAP-25_{206}-GFP se ajusta a una concentración de proteína de aproximadamente 100 ng/ml.

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3d. Transformación de proteína de un sustrato SNAP-25-GFP

Para transformar un sustrato SNAP-25-GFP en una línea de células de mamífero, se disponen en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células SH-SY5Y en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml of EMEM y medio F12 de Ham (EMEM:F12) 1:1 completo, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio al 1% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 1x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de proteína de 200 \mul mediante adición de 100 \mul de agua destilada que contiene 6 \mul de agente de liberación de proteína Chariot^{TM} (Active Motif, Carlsbad, CA) a 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 que contiene 1 \mug de un sustrato SNAP25-GFP, tal como, por ejemplo, SNAP25_{206}-GFP, y se incuba esta solución a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Después de la incubación se lavan las células una vez con células de aclarado con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4. Se añade la solución de transfección de proteína de 200 \mul a las células lavadas, seguido de 400 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 1 hora. Se añade 1 ml de EMEM:F12 suplementado completo fresco a las células y se incuba en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 1 a 2 horas se pueden usar las células transformadas para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E.

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4. Generación de células que contienen un sustrato VAMP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT mediante transducción adenoviral 4a. Construcción de pAd-DEST/VAMP-GFP

Para preparar una construcción pAd-DEST/VAMP-GFP que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende VAMP-GFP en, p.e., ADN de pQBI-25/VAMP-1-GFP, ADN de pOBI-25/VAMP-2-GFP o ADN de pQBI-25/VAMP-3-GFP (véase el ejemplos I, 2a; I, 2b; o I, 2c) usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción pCR2.1/VAMP-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido VAMP-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pAd-DEST (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pAd-DEST que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pAd-DEST/VAMP-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica el VAMP-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pAd-DEST.

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4b. Producción de un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/VAMP-GFP

Para producir un stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/VAMP-GFP, se disponen aproximadamente 5x10^{5} células 293A cells en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Un día después de la transfección se reemplaza el medio DMEM completo sumplementado con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM. Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de la construcción de expresión linearizada que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/VAMP-GFP. Para linearizar una construcción pAd-DEST/VAMP-GFP, se digiere 5 \mug de una construcción pAd-DEST/VAMP-GFP con PacI (New England Biolabs, Beverly, MA). Se purifica el plásmido linearizado usando el procedimiento del kit QIAquick (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) y se resuspende en tampón TE. Esta transfección es incubada a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se añade luego la solución de transfección de 500 \mul a las células 293A y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de DMEM suplementado completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se tripsinizan las células y se transfieren los contenidos de cada pocillo a una placa de cultivo de tejido de 10 cm estéril que contiene 10 ml de DMEM suplementado completo. Se reemplaza el medio viejo con DMEM suplementado completo fresco cada 2 ó 3 días hasta que se observan regiones visibles de efecto citopático (típicamente de 7 a 10 días). Se restituye el medio de cultivo viejo con DMEM suplementado completo fresco y se deja que tengan lugar infecciones hasta que se observa aproximadamente el 80% del efecto citopático (típicamente 10-13 días post transfección). Se cosechan las células que contienen adenovirus desprendiendo las células usando el medio de cultivo y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml. Se lisaron las células cosechadas usando un ciclo de congelación-descongelación consistente en -80ºC durante 30 minutos luego 37ºC durante 15 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas adenovirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente 1x10^{7} a 10^{8} pfu de partículas adenovirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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4c. Amplificación de un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/VAMP-GFP

Para amplificar el stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/VAMP-GFP, se dispone en placas aproximadamente 3x10^{6} células 293A en un disco de cultivo de 100 mm que contiene 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 80-90% de confluencia (6-16 horas). Las células son células inoculadas con 100 \mul de solución stock adenoviral y se incubaron durante aproximadamente 48-72 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células emergen y flotan o ligeramente unidas a la placa de cultivo. Se cosechan las células que contienen adenovirus mediante desprendimiento de las células usando el medio de cultivo y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml. Se lisaron las células cosechadas usando tres ciclos de congelación-descongelación consistente en -80ºC durante 30 minutos luego 37ºC durante 15 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas adenovirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente 1x10^{8} a 10^{9} pfu de partículas adenovirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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4d. Transducción de células con un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/VAMP-GFP

Para transducir células con la solución stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pAd-DESTNAMP-GFP, se disponen en placas una densidad adecuada (de 1x10^{5} a 1x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad apropiada para transducción. Se inoculan las células con aproximadamente 4 \mul del stock adenoviral (aproximadamente 5x10^{8} pfu/ml) y se incuban durante aproximadamente 24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de medio suplementado, completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se pueden usar las células transducidas para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando un sustrato VAMP-GFP.

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5. Generación de células que contienen un sustrato BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT mediante transducción lentiviral 5a. Construcción de pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP

Para preparar una construcción pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, p.e., en ADN de pQBI-25NAMP-1-GFP, ADN de pQBI-25/VAMP-2-GFP o ADN de pQBI-25/VAMP-3-GFP (véase el ejemplos I, 2a; I, 2b; o I, 2c), usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción pCR2.1/VAMP-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido VAMP-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pLenti6Ubc/V5 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pLenti6Ubc/V5 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuestas en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da lugar a una construcción de expresión en mamífero que codifica el VAMP-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pLenti6Ubc/V5 vector en el péptido V5 con terminal amino.

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5b. Producción de un stock lentiviral que contienepLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP

Para producir un stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, se prepara una solución de transfección de 3,0 ml mediante adición de 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 36 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos para 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 3 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP y 9 \mug of ViraPower^{TM} Packaging Mix. Después de una incubación de aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente, se añaden los complejos ADN-lípido a una placa de cultivo de tejido de 10 cm que contiene 5 ml medio con suero reducido OPTI-MEM. Se añade luego una suspensión de células de 5 ml que contiene aproximadamente 6x10^{6} células 293A a medio de complejo ADN-lípido y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante la noche. Se reemplaza el medio de transfección con 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24-48 horas. Se cosechan las células que contienen lentiovirus mediante desprendimiento de las células usando el medio de cultivo y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml y se centrifuga (5.000x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas lentivirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente de 5x10^{5} a 2x 10^{7} pfu/ml de partículas lentivirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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5c. Transducción de células con un stock lentiviral que contiene un pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP

Para transducir células con el stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, se dispone en placa una densidad adecuada (1,5x10^{5} a 1,5x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se inoculan las células con el stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-VAMP-GFP, usando una multiplicidad adecuada de infección y se incuban durante aproximadamente 16-24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de medio suplementado, completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24-48 horas. Se pueden usar las células transducidas para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando un sustrato VAMP-GFP.

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6. Generación de células que contienen un sustrato BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT por transformación de proteína 6a. Expresión de un sustrato VAM-GFP usando una línea de células bacterianas

Para expresar un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando bacterias, se introduce una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pQBI-67/VAMP-1-GFP, pQBI-67/VAMP-2-GFP o pQBI-67/VAMP-3-GFP como se describió anteriormente en el ejemplos I, 2d; I, 2e; o I, 2f, en células BL21 (DE3) de E. coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un protocolo de transformación de choque térmico. Se dispone luego en placa la reacción de choque térmico en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Se usa una colonia resistente a ampicilina simple de E. coli transformada que contiene pOBI-67/VAMP-GFP para inocular un tubo de ensayo de 15 ml que contiene 3,0 ml de medio Luria-Bertani, (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina que se cultiva luego dispuesto en un incubador a 37ºC, agitando a 250 rpm, durante la noche. Se usa el cultivo iniciador resultante de la noche para inocular un matraz con deflectores de 1,0 l que contiene 100 ml de medio Luria-Bertani, (pH 7,0) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina a una dilución de 1:1000. Este cultivo se cultiva en un incubador a 32ºC agitando a 250 rpm durante aproximadamente 6,5 horas hasta que se alcanza la fase semilogarítmica (DO_{600} de aproximadamente 0,6-0,8). Se induce luego la expresión de proteína mediante adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) 1 mM y se dispone el cultivo en placas en un incubador a 32ºC agitando a 250 rpm durante la noche. Se cosechan las células mediante centrifugación (4.000 rpm a 4ºC durante 20-30 minutos) para agregar las células. Se desecha el sobrenante y se usa el agregado celular inmediatamente para las etapas subsiguientes, o se conserva el agregado a -80ºC hasta que se necesite.

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6b. Expresión de un sustrato VAMP-GFP usando una línea celular de mamífero

Para expresar un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando una línea celular de mamífero, se dispone en placa una densidad adecuada (1,0x10^{5} a 1,0x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pQBI-25/VAMP-1-GFP, pQBI-25/VAMP-2-GFP o pQBI-25/VAMP-3-GFP (véanse los ejemplos I, 2a; I, 2b; o I, 2c). Esta transfección es incubada a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio de cultivo suplementado completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM y se añade 500 \mul de solución de transfección a las células y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de EMEM:F12 suplementado completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 48 horas. Se cosechan las células mediante células de aclarado una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y se desprenden las células aclaradas mediante adición de 500 \mul de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas a un tubo de ensayo de 1,5 ml y se agregan mediante microcentrifugación (10,000x g a 4ºC durante 5 minutos). Se desecha el sobrenante y se usa el agregado celular inmediatamente para las etapas subsiguientes, o se conserva el agregado a -80ºC hasta que se necesite.

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6c. Purificación de un sustrato VAMP-GFP

Para purificar un sustrato VAMP-GFP, se resuspende un agregado celular que expresa una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, una construcción pQBI-67NAMP-1-GFP o pQBI-25/VAMP-1-GFP, en 10 ml de tampón Tris-EDTA (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0), que contiene 1 mg/ml de lisozima y se lisan las células usando tres ciclos de congelación-descongelación consistentes en -80ºC durante 5 minutos, luego 37ºC durante 5 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000x g a 4ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular y se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo que contiene un volumen igual de tampón de unión en columna (sulfato de amonio 4 M). Se prepara una columna de cromatografía por interacción hidrófoba (CIH) usando un soporte de columna Econo-Pac de 20 ml (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que está empaquetado con 2,5-5,0 ml de resina de CIH metílica (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), que se equilibra luego lavando con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio de columna (sulfato de amonio 2 M). Se aplica el lisado clarificado lentamente a la columna equilibrada por flujo de gravidez (aproximadamente 0,25-0,3 ml/minuto). Se lava luego la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de lavado en columna (sulfato de amonio 1,3 M). Se eluye el sustrato VAMP-GFP con 20-30 ml de tampón de elución en columna (tampón TE 10 mM) y se recoge en aproximadamente doce fracciones de 1 ml. Se controla el progreso de la muestra de sustrato VAMP-GFP a través de la columna así como también aquellas fracciones de elución que contienen la muestra usando una luz ultravioleta de un transluminador manual. La cantidad de sustrato VAMP-GFP contenido en cada fracción de elución se determina mediante un ensayo con tinte Bradford. En este procedimiento se combina 20 \mul de alícuota de cada fracción de 1,0 ml con 200 \mul de reactivo Bio-Rad Protein (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), diluido de 1 a 4 con agua desionizada y destilada, y luego se mide la intensidad de la señal colorimétrica usando un espectrofotómetro. Se considera que las cinco fracciones con la señal más fuerte comprenden el pico de elución y se reúnen. Se determina el rendimiento de proteína total mediante estimación de la concentración de proteína total de las fracciones de elución de pico reunidas usando globulina gamma bovina como un patrón (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se ajusta la cantidad de sustrato VAMP-GFP a una concentración de proteína de aproximadamente 100 ng/ml.

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6d. Transformación de proteína de un sustrato VAMP-GFP

Para transformar un sustrato VAMP-GFP en una línea de células de mamífero, se dispone en placa una densidad adecuada (de 1,0x10^{5} a 1,0x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de proteína de 200 \mul mediante adición de 100 \mul de agua destilada que contiene 6 \mul de agente de liberación de proteína Chariot® (Active Motif, Carlsbad, CA) a 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 que contiene 1 \mug de un sustrato VAMP-GFP y se incuba esta solución a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Después de la incubación se lavan las células una vez con células de aclarado con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4. Se añade la solución de transfección de proteína de 200 \mul a las células lavadas, seguido de 400 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 1 hora. Se añade 1 ml de medio de cultivo suplementado, completo freso a las células y se incuba en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 1-2 horas se pueden usar las células transformadas para conducir un ensayo de actividad de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando un sustrato VAMP-GFP.

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7. Generación de células que contienen un sustrato sintaxina de BoNT/C1 mediante transducción adenoviral 7a. Construcción de pAd-DEST/Syntaxin-GFP

Para preparar una construcción pAd-DEST/Sintaxina-GFP que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende sintaxina-GFP de una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/C1-GFP, tal como, por ejemplo, ADN de pQBI-25/Sintaxina-1-GFP (véase el ejemplo I, 3a) usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. Se digiere la construcción de pCR2.1/Sintaxina-GFP resultante con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido Sintaxina-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pAd-DEST (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pAd-DEST que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pAd-DEST/Sintaxina-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da una construcción de expresión en mamífero que codifica el Sintaxina-GFP unido de forma operativa a los elementos de expresión del vector pAd-DEST.

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7b. Producción de un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/Sintaxina-GFP

Para producir un stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, se disponen en placa aproximadamente 5x10^{5} células 293A en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Un día después de la transfección se reemplaza el medio DMEM completo sumplementado con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM. Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos a 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de la construcción de expresión linearizada que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/Sintaxina-GFP. Para linearizar una construcción de pAd-DEST/Sintaxina-GFP, se digiere 5 \mug de una construcción pAd-DEST/Sintaxina-GFP con Pad (New England Biolabs, Beverly, MA). Se purifica el plásmido linearizado usando el procedimiento del kit QIAquick (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) y se resuspende en tampón TE. Esta transfección es incubada a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se añade luego la solución de transfección de 500 \mul a las células 293A y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de DMEM suplementado completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se tripsinizan las células y se transfieren los contenidos de cada pocillo a una placa de cultivo de tejido de 10 cm estéril que contiene 10 ml de DMEM suplementado completo. Se reemplaza el medio viejo con DMEM suplementado completo fresco cada 2 ó 3 días hasta que se observan regiones visibles de efecto citopático (típicamente de 7 a 10 días). Se restituye el medio de cultivo viejo con DMEM suplementado completo fresco y permite que tengan lugar infecciones hasta aproximadamente el 80% del efecto citopático (típicamente de 10 a 13 días post transfección). Se cosechan las células que contienen adenovirus mediante desprendimiento de las células usando el medio de cultivo y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml. Se lisaron las células cosechadas usando un ciclo de congelación-descongelación consistente en -80ºC durante 30 minutos luego 37ºC durante 15 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas adenovirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente 1x10^{7} a 10^{8} pfu de partículas adenovirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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7c. Amplificación de un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/Sintaxina-GFP

Para amplificar el stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/Sintaxina-GFP, se disponen en placa aproximadamente 3x10^{8} células 293A en un disco de cultivo de 100 mm que contiene 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 1x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 80-90% de confluencia (6-16 horas). Las células son células inoculadas con 100 \mul de stock adenoviral y se incuban durante aproximadamente 48-72 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células emergen y flotan o están débilmente unidas a la placa de cultivo. Se cosechan las células que contienen adenovirus mediante desprendimiento de las células usando el medio de cultivo y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml. Se lisaron las células cosechadas usando tres ciclos de congelación-descongelación consistente en -80ºC durante 30 minutos luego 37ºC durante 15 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas adenovirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente 1x10^{8} a 10^{9} pfu de partículas adenovirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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7d. Transducción de células con un stock adenoviral que contiene pAd-DEST/Sintaxina-GFP

Para transducir células con la solución stock adenoviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pAd-DEST/Sintaxina-GFP, se dispone en placa una densidad adecuada (de 1x10^{5} a 1x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad apropiada para transducción. Se inoculan las células con aproximadamente 4 \mul del stock adenoviral (aproximadamente 5x10^{8} pfu/ml) y se incuban durante aproximadamente 24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de medio suplementado, completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se pueden usar las células transducidas para llevar a cabo un ensayo de actividad BoNT/C1 usando un sustrato de sintaxina-GFP.

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8. Generación de células que contienen un sustrato BoNT/C1 mediante transducción lentiviral 8a. Construcción de pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP

Para preparar una construcción pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP que codifica un sustrato sintaxina-GFP de
BoNT/C1, se amplifica un fragmento de ácido nucleico que codifica la región del aminoácido que comprende un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, p.e., en ADN de pQBI-25/Sintaxina-1-GFP (véase el ejemplo I, 3a) usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona en un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para esta reacción se diseñan para incluir sitios de enzima de restricción únicos útiles para etapas de subclonación subsiguientes. La construcción de pCR2.1/Sintaxina-GFP resultante se digiere con enzimas de restricción que 1) escinden el inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el péptido Sintaxina-GFP; y 2) permiten que este inserto esté unido de forma operativa a un vector pLenti6Ubc/V5 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Este inserto se subclona usando un procedimiento de T4 ADN ligasa en un vector pLenti6Ubc/V5 que se digiere con endonucleasas de restricción apropiadas dando pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP. La mezcla de ligadura se transforma en células BL21 (DE3) de E. Coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, dispuestas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina, y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Las bacterias que contienen construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Se aíslan construcciones candidatas usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo de digesto de endonucleasa por restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación da lugar a una construcción de expresión en mamífero que codifica la sintaxina-GFP unida de forma operativa a los elementos de expresión del vector pLenti6Ubc/V5 vector en el péptido V5 con terminal amino.

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8b. Producción de un stock lentiviral que contiene pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP

Para producir un choque lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, se prepara una solución de transfección de 3,0 ml mediante adición de 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 36 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 3 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato de sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP y 9 \mug of ViraPower® Packaging Mix. Después de una incubación de aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente, se añaden los complejos ADN-lípido a una placa de cultivo de tejido de 10 cm que contiene 5 ml medio con suero reducido OPTI-MEM. Se añaden luego una suspensión de células de 5 ml que contiene aproximadamente 6x10^{5} células 293A al medio de complejo ADN-lípido y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante la noche. Se reemplaza el medio de transfección con 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24-48 horas. Se cosechan las células que contienen lentiovirus mediante desprendimiento de las células usando el medio de cultivo y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas y el medio a un tubo de 15 ml y se centrifuga (5.000x g a 20ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular. Se transfiere el sobrenadante clarificado que contiene las partículas lentivirales a crioviales de 2 ml en alícuotas de 1 ml y deberían contener aproximadamente de 5x10^{5} a 2x 10^{7} pfu/ml de partículas lentivirales. Las alícuotas se pueden conservar a -80ºC hasta que se necesiten.

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8c. Transducción de células con un stock lentiviral que contiene unpLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP

Para transducir células con el stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, se dispone en placa una densidad adecuada (1,5x10^{5} a 1,5x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se inoculan las células con el stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-Sintaxina-GFP, usando una multiplicidad adecuada de infección y se incuban durante aproximadamente 16-24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de medio suplementado, completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24-48 horas. Se pueden usar las células transducidas para llevar a cabo un ensayo de actividad BoNT/C1 usando un sustrato de sintaxina-GFP.

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9. Generación de células que contienen un sustrato BoNT/C1 por transformación de proteína 9a. Expresión de un sustrato sintaxina-GFP usando una línea celular bacteriana

Para expresar un sustrato Sintaxina-GFP usando bacterias, se introduce una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pQBI-67/Sintaxina-1-GFP como se describió anteriormente en el ejemplo I, 3b, en células BL21 (DE3) de E. coli químicamente competitivas (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un protocolo de transformación de choque térmico. Se dispone luego en placa la reacción de choque térmico en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina y se cultiva dispuesto en un incubador a 37ºC durante la noche. Se usa una colonia resistente a ampicilina simple de E. coli transformado que contiene pQBI-67/Sintaxina-GFP para inocular un tubo de ensayo de 15 ml que contiene 3,0 ml de medio Luria-Bertani, (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina que se cultiva luego en un incubador a 37ºC, agitando a 250 rpm, durante la noche. Se usa el cultivo iniciador resultante de la noche para inocular un matraz con deflectores de 1,0 l que contiene 100 ml de medio Luria-Bertani, (pH 7,0) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina a una dilución de 1:1000. Este cultivo se cultiva en un incubador a 32ºC agitando a 250 rpm durante aproximadamente 6,5 horas hasta que se alcanza la fase semilogarítmica (DO_{600} de aproximadamente 0,6-0,8). Se induce luego la expresión de proteína mediante adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) 1 mM y se dispone el cultivo en placas en un incubador a 32ºC agitando a 250 rpm durante la noche. Se cosechan las células mediante centrifugación (4.000 rpm a 4ºC durante 20-30 minutos) para agregar las células. Se desecha el sobrenante y se usa el agregado celular inmediatamente para las etapas subsiguientes, o se conserva el agregado a -80ºC hasta que se necesite.

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9b. Expresión de un sustrato sintaxina-GFP usando una línea celular de mamífero

Para expresar un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1 usando una línea celular de mamífero, se dispone una densidad adecuada (de 1,0x10^{5} a 1,0x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 ml de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pQBI-25/sintaxina-1-GFP (véase el ejemplo I, 3a). Esta transfección es incubada a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio de cultivo suplementado completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM y se añade 500 \mul de solución de transfección a las células y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 48 horas. Se cosechan las células mediante células de aclarado una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y desprendimiento de células aclaradas mediante adición de 500 \mul de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y células de rascado en la placa de cultivo. Se transfieren las células desprendidas a un tubo de ensayo de 1,5 ml y se agregan mediante microcentrifugación (10.000x g a 4ºC durante 5 minutos). Se desecha el sobrenante y se usa el agregado celular inmediatamente para las etapas subsiguientes, o se conserva el agregado a -80ºC hasta que se necesite.

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9c. Purificación de un sustrato sintaxina-GFP

Para purificar un sustrato sintaxina-GFP, se resuspende un agregado celular que expresa una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, una construcción pQBI-67/Sintaxina-1-GFP o una construcción pQBI-25/Sintaxina-1-GFP, en 10 ml de tampón Tris-EDTA (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA1 mM, pH 8,0), que contiene 1 mg/ml de lisozima y se lisan las células usando tres ciclos de congelación-descongelación consistentes en -80ºC durante 5 minutos, luego 37ºC durante 5 minutos. Se centrifuga el lisado celular (5.000x g a 4ºC durante 15 minutos) para agregar el debris celular y se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo que contiene un volumen igual de tampón de unión en columna (sulfato de amonio 4 M). Se prepara una columna de cromatografía por interacción hidrófoba (ClH) usando un soporte de columna Econo-Pac de 20 ml (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que está empaquetado con 2,5-5,0 ml de resina de ClH metílica (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), que se equilibra luego lavando con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio de columna (sulfato de amonio 2 M). Se aplica el lisado clarificado lentamente a la columna equilibrada por flujo de gravidez (aproximadamente 0,25-0,3 ml/minuto). Se lava luego la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de lavado en columna (sulfato de amonio 1,3 M). Se eluye el sustrato sintaxina-GFP con 20-30 ml de tampón de elución en columna (tampón TE 10 mM) y se recoge en aproximadamente doce fracciones de 1 ml. Se controla el progreso de muestra de sustrato sintaxina-GFP a través de la columna así como también aquellas fracciones de elución que contienen la muestra usando una luz ultravioleta de un transluminador manual. Se determina la cantidad de sustrato sintaxina-GFP contenido en cada fracción de elución mediante un ensayo con tinte Bradford. En este procedimiento se combina alícuota de 20 \mul de cada fracción de 1,0 ml con 200 \mul de reactivo Bio-Rad Protein (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), diluido de 1 a 4 con agua desionizada y destilada, y luego se mide la intensidad de la señal colorimétrica usando un espectrofotómetro. Se considera que las cinco fracciones con la señal más fuerte comprenden el pico de elución y se reúnen. Se determina el rendimiento de proteína total mediante estimación de la concentración de proteína total de las fracciones de elución de pico reunidas usando globulina gamma bovina como un patrón (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La cantidad de sustrato sintaxina-GFP se ajusta a una concentración de proteína de aproximadamente 100 ng/ml.

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9d. Transformación de proteína de un sustrato sintaxina-GFP

Para transformar un sustrato de sintaxina-GFP en una línea de células de mamífero, se dispone una densidad adecuada (1,0x10^{5} a 1,0x10^{6}) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de proteína de 200 \mul mediante adición de 100 \mul de agua destilada que contiene 6 \mul de agente de liberación de proteína Chariot® (Active Motif, Carlsbad, CA) a 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 que contiene 1 \mug de un sustrato sintaxina-GFP y se incuba esta solución a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Después de la incubación se lavan las células una vez con células de lavado con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4. Se añade la solución de transfección de proteína de 200 \mul a las células lavadas, seguido de 400 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 1 hora. Se añade 1 ml de medio de cultivo suplementado, completo freso a las células y se incuban en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 1-2 horas, se pueden usar las células transformadas para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/C1 usando un sustrato de sintaxina-GFP.

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Ejemplo V Generación de células que contienen de forma estable un sustrato de toxina clostridial 1. Generación de células que contienen de forma estable un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E 1a. Células Neuro-2A transformadas de forma estable usando un procedimiento de cruce recombinante

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un procedimiento de cruce, se dispusieron en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células Neuro-2A en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de EMEM completo, suplementado con FBS al 10%, glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio y 1 x solución de aminoácidos no esenciales en MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml. Se preparó una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 ml de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el Ejemplo I, 1). Esta transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplazó el medio EMEM suplementado, completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM y se añadió la solución de transfección de 500 \mul a las células Neuro-2A y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplazó el medio de transfección con 3 ml de EMEM suplementado, completo fresco y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 48 horas. Se reemplazó el medio con 3 ml de EMEM completo fresco, que contiene aproximadamente 5 \mug/ml de G418, FBS al 10%, glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). 1,5 g/l de bicarbonato de sodio y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 4 semanas, reemplazándose el medio viejo con EMEM suplementado, completo, selectivo de G418 fresco cada 4 a 5 días. Una vez se establecieron colonias de Neuro-2A resistentes a G418, se redispusieron en placas clones resistentes en nuevas placas de cultivo de 35 mm que contienen EMEM suplementado, completo selectivo de G418 fresco, hasta que estas células alcanzaron una densidad de 6 a 20x10^{5} células/ml.

Para ensayar la expresión de SNAP-25_{206}-GFP en líneas celulares Neuro-2A aisladas esa construcción de expresión integrada de forma estable que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1a), se disponen en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células Neuro-2A de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de EMEM suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplazó el medio con 3 ml de EMEM suplementado, completo, selectivo de G418 fresco y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 48 horas se cosecharon las células mediante aclarado de las células una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y se lisaron con un tampón que contiene ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiolclorhídrico 62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8 y laurilsulfato de sodio al 2% (SDS). Se centrifugaron células lisadas a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC para eliminar el debris y se transfirieron los sobrenadantes a tubos siliconizados frescos. Se midieron las concentraciones de proteína mediante el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentration mayor.

Para detectar la presencia del sustrato SNAP-25-GFP, se hirvieron muestras durante 5 minutos, y se separaron alícuotas de 40 \mul mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida prefundidos Bis-Tris NuPAGE® Novex al 4-12% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Se transfirieron los péptidos separados del gel a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) mediante Western blotting usando un equipo de transferencia de células electroforético semiseco Trans-Blot® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se bloquearon las membranas de PVDF mediante incubación a temperatura ambiente durante 2 horas en una solución que contiene solución salina tri-tamponada 25 mM (ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiolclorhídrico 25 mM (Tris-HCl)(pH 7,4), cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM), TWEEN-20® al 0,1%, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán, albúmina de suero bovino al 2%, leche seca no grasa al 5%. Se incubaron membranas bloqueadas a 4ºC durante la noche en solución salina tri-tamponada TWEEN® (solución salina tri-tamponada 25 mM, TWEEN-20® al 0,1%, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán) que contiene una dilución 1:50.000 de anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD). Se lavaron las manchas de muestra de anticuerpo primario tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20®. Se incubaron las membranas lavadas a temperatura ambiente durante 2 horas en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20® que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) como un anticuerpo secundario. Se lavaron manchas de muestra de anticuerpo secundario tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20®. Se visualizó la detección de señal del sustrato SNAP-25206-GFP marcado usando el sistema de detección Western Blot ECL Plus® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se emitió la imagen de la membrana y se cuantificó el sustrato con un Typhoon 9410 Variable Mode Imager y software Imager Analysis (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La elección del tamaño de píxel (de 100 a 200 píxeles) y ajustes de voltaje de PMT (de 350 a 600, normalmente 400) depende de cada mancha individual. Se identificaron X líneas celulares Neuro-2A aisladas que se integraban y expresaban de forma estable el sustrato SNAP-25_{206}-GFP de ID SEC Nº: 1.

Para determinar la localización subcelular del sustrato SNAP-25-GFP en líneas celulares Neuro-2A aisladas que integraban de forma estable una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1a), se dispusieron en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células Neuro-2A de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de EMEM suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplazó el medio con 3 ml de EMEM suplementado, completo, selectivo de G418 fresco y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 24-48 horas se observaron células vivas usando un microscopio invertido de fluorescencia. Se detectaron X líneas celulares Neuro-2A aisladas que presentan la localización de la fluorescencia GFP en la membrana celular lo que indica que el SNAP25_{206}-GFP expresado en estas líneas celulares Neuro-2A aisladas era dirigido correctamente a la membrana celular. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E.

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1b. Células SH-SY5Y transducidas de forma estable usando un procedimiento lentiviral

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un procedimiento lentiviral, se disponen en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células SH-SY5Y en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml of EMEM y medio F12 de Ham (EMEM:F12) 1:1 completo, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), piruvato de sodio al 1% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se inoculan las células con el stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-SNAP-25_{206}-GFP, como se describió anteriormente en el ejemplo IV, 2b, usando una multiplicidad adecuada de infección y se incuban durante aproximadamente 16-24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de EMEM:F12 suplementado completo fresco que contiene una cantidad apropiada de blasticidina. Se incuban células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 2 semanas, reemplazando el medio viejo con EMEM suplementado, completo, selectivo de blasticidina fresco:F12 cada 3 a 4 días. Una vez que se establecen las colonias SH-SY5Y resistentes a blasticidina, se redisponen en placa clones resistentes en placas de cultivo de 35 mm nuevas que contiene EMEM suplementado, completo, selectivo de blasticidina fresco:F12, hasta que estas células alcanzaron una densidad de 6 a 20x10^{5} células/ml.

Se determinará la presencia del sustrato SNAP-25-GFP en líneas celulares aisladas mediante análisis por Western blot como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 1a. Se determinará la localización subcelular del sustrato SNAP-25_{206}-GFP en líneas celulares aisladas mediante microscopía de fluorescencia como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 1a. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E.

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1c. Células SK-N-DZ transducidas de forma estable usando un procedimiento de cruce recombinante

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un procedimiento de cruce, se disponen en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células SK-N-DZ en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM completo, suplementado con FBS al 10%, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células hayan alcanzado una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml. Se preparó una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 \mul de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1a). Esta transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplazó el medio DMEM suplementado, completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM y se añadió la solución de transfección de 500 \mul a las células SK.N-DZ y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplazó el medio de transfección con 3 ml de DMEM suplementado completo fresco y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 48 horas. Se reemplazó el medio con 3 ml de DMEM completo fresco, que contiene aproximadamente 5 \mug/ml de G418, FBS al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 4 semanas, reemplazando el medio viejo con DMEM suplementado, completo, selectivo de G418 fresco cada 4 a 5 días. Una vez que se establecieron colonias SK-N-DZ resistentes a G418, se redispusieron en placas clones resistentes en placas de cultivo de 35 mm nuevas que contienen DMEM completo fresco, suplementado con aproximadamente 5 \mug/ml de G418, FBS al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), hasta que estas células alcanzaron una densidad de 6 a 20x10^{5} células/ml.

Para ensayar la expresión de SNAP-25-GFP de líneas celulares SK-N-DZ aisladas que integran de forma estable una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1a), se dispusieron en placas aproximadamente 1,5x10^{5} de células SK-N-DZ de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplazó el medio con 3 ml de DMEM suplementado, completo, selectivo de G-418 fresco y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 48 horas se cosecharon las células mediante aclarado de las células una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y se lisaron con un tampón que contiene ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiolclorhídrico 62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8 y laurilsulfato de sodio al 2% (SDS). Se centrifugaron células lisadas a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC para eliminar el debris y se transfirieron los sobrenadantes a tubos siliconizados frescos. Se midieron las concentraciones de proteína mediante el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentración mayor.

Para detectar la presencia del sustrato SNAP-25_{206}-GFP, se hirvieron muestras durante 5 minutos, y se separaron alícuotas de 40 \mul mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida prefundidos Bis-Tris NuPAGE® Novex al 4-12% (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Se transfirieron los péptidos separados del gel a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) mediante Western blotting usando un equipo de transferencia de células electroforético semi-seco Trans-Blot® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se bloquearon las membranas de PVDF mediante incubación a temperatura ambiente durante 2 horas en una solución que contiene solución salina tri-tamponada 25 mM (ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiolclorhídrico 25 mM (Tris-HCl)(pH 7,4), cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM), TWEEN-20® al 0,1%, monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán, albúmina de suero bovino al 2%, leche seca no grasa al 5%. Se incubaron membranas bloqueadas a 4ºC durante la noche en solución salina tri-tamponada TWEEN® (solución salina tri-tamponada 25 mM, 0.1% TWEEN-20® al 0,1%, monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán) que contiene una dilución 1:50.000 de anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD). Se lavaron manchas de muestra de anticuerpo primario tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20®. Se incubaron las membranas lavadas a temperatura ambiente durante 2 horas en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20® que contiene una dilución 1:20.000 de inmunoglobulina G anti-ratón policlonal de cabra, anticuerpo de cadenas pesada y liviana (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano-caballo (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) como un anticuerpo secundario. Se lavaron manchas de muestra de anticuerpo secundario tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20(R). Se visualizó la detección de señal del sustrato SNAP-25206-GFP marcado usando el sistema de detección Western Blot ECL Plus® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se emitió la imagen de la membrana y cuantificó el sustrato con un Typhoon 9410 Variable Mode Imager y software Imager Analysis (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La elección del tamaño de píxel (100 a 200 píxels) y ajustes de voltaje de PMT (350 a 600, normalmente 400) dependía del blot individual. Se identificaron X líneas celulares SK-N-DZ aisladas que integraban y expresaban de forma estable el sustrato SNAP-25_{206}-GFP de ID SEC Nº: 1.

Para determinar la localización subcelular del sustrato SNAP-25_{206}-GFP de líneas celulares SK-N-DZ aisladas que integran de forma estable una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pQBI-25/SNAP25_{206}-GFP (véase el ejemplo I, 1a), se dispusieron en placa aproximadamente 1,5x10^{5} células SK-N-DZ de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplazó el medio con 3 ml de DMEM suplementado, completo, selectivo de G-418 fresco y se incubaron las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 24-48 horas se observaron células vivas usando un microscopio invertido de fluorescencia. Se detectaron X líneas celulares SK-N-DZ aisladas que presentaban la localización de la fluorescencia GFP en la membrana celular lo que indica que el SNAP25_{206}-GFP expresado en estas líneas celulares SK-N-DZ asiladas era dirigido correctamente a la membrana celular. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un sustrato
SNAP-25-GFP.

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1d. Células SK-N-DZ transducidas de forma estable usando un procedimiento lentiviral

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato SNAP-25 de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un procedimiento lentiviral, se dispusieron en placas aproximadamente 1,5x10^{5} células SK-N-DZ en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de DMEM completo, suplementado con FBS al 10%, glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se inoculan las células con el stock lentiviral que contiene una construcción de expresión que codifica un sustrato BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E, tal como, por ejemplo, pLenti6Ubc/V5-SNAP-25_{206}-GFP, como se describió anteriormente en el ejemplo IV, 2b, usando una multiplicidad adecuada de infección y se incuban durante aproximadamente 16-24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de EMEM:F12 suplementado completo fresco que contiene una cantidad apropiada de blasticidina. Se incuban células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 2 semanas, reemplazando el medio viejo con EMEM suplementado, completo, selectivo de blasticidina fresco:F12 cada 3 a 4 días. Una vez que se establecen las colonias SH-SY5Y resistentes a blasticidina, se redisponen en placa clones resistentes en placas de cultivo de 35 mm nuevas que contiene EMEM suplementado, completo, selectivo de blasticidina fresco:F12, hasta que estas células alcanzaron una densidad de 6 a 20x10^{5} células/ml.

Se determinará la presencia del sustrato SNAP-25_{206}-GFP en líneas celulares aisladas mediante análisis por Western blot como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 1a. Se determinará la localización subcelular del sustrato SNAP-25_{206}-GFP en líneas celulares aisladas microscopía de fluorescencia como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 1a. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E usando un sustrato SNAP-25-GFP.

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2. Generación de células que contienen de forma estable un sustrato BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT 2a. Células transformadas de forma estable usando un procedimiento de cruce recombinante

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato VAMP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando un procedimiento de cruce, se dispone en placa una densidad adecuada (1 x10^{5} a 1 x106^{6} células) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad apropiada para transfección. Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 ml de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pQBI-25/VAMP-1-GFP, pQBI-25/VAMP-2-GFP o pQBI-25/VAMP-3-GFP (véase el ejemplos I, 2a; I, 2b; o I, 2c). Esta transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio suplementado, completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM y se añade 500 \mul de solución de transfección a las células y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 48 horas. Se reemplaza el medio con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo fresco, que contiene aproximadamente 5 \mug/ml de G418. Se incuban células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 4 semanas, reemplazando el medio viejo con medio suplementado, completo, selectivo de G418 fresco cada 4 a 5 días. Una vez se establecen las colonias resistentes a G418, se redisponen en placa los clones resistentes en placas de cultivo de 35 mm nuevas que contienen medio de cultivo completo fresco, suplementado con aproximadamente 5 \mug/ml de G418 hasta que estas células alcanzaron una densidad de
6 a 20x10^{5} células/ml.

Para ensayar la expresión de un VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT de líneas celulares aisladas que integran de forma estable una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pQBI-25/VAMP-1-GFP, pQBI-25/VAMP-2-GFP o pQBI-25NAMP-3-GFP (véase el ejemplos I, 2a; I, 2b; o I, 2c), se disponen en placas aproximadamente 1,5x10^{5} células de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplaza el medio con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo, selectivo de G418 fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 48 horas, se cosechan las células mediante aclarado de las células una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y se lisaron con un tampón que contiene ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiolclorhídrico 62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8 y laurilsulfato de sodio al 2% (SDS). Se centrifugan las células lisadas a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC para eliminar el debris y se transfieren los sobrenadantes a tubos siliconizados frescos. Se miden las concentraciones de proteína mediante el procedimiento de Bradford y se resuspenden en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentración mayor.

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Para detectar la presencia del sustrato VAMP-GFP, se separan muestras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS y se analizan mediante procedimientos Western blottings como se describió anteriormente en el ejemplos II, 2a; II, 4a; II, 6a; II, 7a; y II, 8a, con el fin de identificar líneas celulares que se han integrado de forma estable y expresan el sustrato VAMP-GFP.

Para determinar la localización subcelular del sustrato VAMP-GFP de líneas celulares aisladas que integran de forma estable una construcción de expresión que codifica un sustrato VAMP-GFP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT, tal como, por ejemplo, pQBI-25/VAMP-1-GFP, pQBI-25/VAMP-2-GFP o pQBI-25/VAMP-3-GFP (véase el ejemplos I, 2a; I, 2b; o I, 2c), se disponen en placas aproximadamente 1,5x10^{5} células de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplaza el medio con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo, selectivo de G418 fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 24-48 horas, se observaron células vivas usando un microscopio invertido de fluorescencia con el fin de identificar líneas celulares aisladas que muestran fluorescencia de GFP localizada en la membrana celular, lo cual indica que el VAMP-GFP expresado en estas líneas celulares se dirige correctamente a la membrana celular. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando un sustrato VAMP-GFP.

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2b. Células transducidas de forma estable usando un procedimiento lentiviral

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato VAMP de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando un procedimiento lentiviral, se dispone en placa una densidad adecuada (de 1 x10^{5} a 1 x106^{6} células) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad apropiada para transducción. Se inoculan las células con el stock lentiviral, como se describió anteriormente en el ejemplo IV, 5b, usando una multiplicidad adecuada de infección y se incuban durante aproximadamente 16-24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de medio suplementado, completo fresco que contiene una cantidad apropiada de blasticidina. Se incuban células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 2 semanas, reemplazando el medio viejo con medio suplementado, completo, selectivo de blasticidina fesco cada 3 a 4 días. Una vez establecidas las colonias resistentes a blasticidina, se redisponen clones resistentes en nuevas placas de cultivo de 35 mm que contienen medio suplementado, completo, selectivo de blasticidina fesco, hasta que estas células alcanzan una densidad de 6 a 20x10^{5} células/ml.

La presencia del sustrato VAMP-GFP en líneas celulares aisladas se determinará mediante análisis por Western blot como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 2a. Se determinará la localización subcelular del sustrato VAMP-GFP en líneas celulares aisladas mediante microscopía de fluorescencia como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 2a. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT usando un sustrato VAMP-GFP.

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3. Generación de células que contienen de forma estable un sustrato sintaxina de BoNT/C1 3a. Células transformadas de forma estable usando un procedimiento de cruce recombinante

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato sintaxina de BoNT/C1 usando un procedimiento de cruce, se dispone en placa una densidad adecuada (1 x10^{5} a 1 x106^{6} células) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultiva en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad apropiada para transfección. Se prepara una solución de transfección de 500 \mul añadiendo 250 \mul de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 ml de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos en 250 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 \mug de construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pQBI-25/Syntaxin-1-GFP (véase el ejemplo I, 3a). Esta transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio suplementado, completo con 2 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM y se añade 500 \mul de solución de transfección a las células y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 16 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 48 horas. Se reemplaza el medio con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo fresco, que contiene aproximadamente 5 \mug/ml de G418. Se incuban células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 4 semanas, reemplazando el medio viejo con medio suplementado, completo, selectivo de G418 fresco cada 4 a 5 días. Una vez se establecen las colonias resistentes a G418, se redisponen en placa los clones resistentes en placas de cultivo de 35 mm nuevas que contienen medio de cultivo completo fresco, suplementado con aproximadamente 5 \mug/ml de G418 hasta que estas células alcanzaron una densidad de 6 a 20x10^{5} células/ml.

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Para ensayar la expresión de una sintaxina-GFP de BoNT/C1 de líneas celulares aisladas que integran de forma estable una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pQBI-25/Syntaxin-1-GFP (véase el ejemplo I, 3a), se disponen en placas aproximadamente 1,5x10^{5} células de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplaza el medio con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo, selectivo de G418 fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 48 horas, se cosechan las células mediante aclarado de las células una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y are se lisaron con un tampón que contiene ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiolclorhídrico 62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8 y laurilsulfato de sodio al 2% (SDS). Se centrifugan las células lisadas a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC para eliminar el debris y se transfieren los sobrenadantes a tubos siliconizados frescos. Se miden las concentraciones de proteína mediante el procedimiento de Bradford y se resuspenden en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o concentración mayor.

Para detectar la presencia del sustrato sintaxina-GFP, se separan muestras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS y se analizan mediante procedimientos Western blottings como se describió anteriormente en el ejemplos II, 3a, con el fin de identificar líneas celulares que se han integrado de forma estable y expresan el sustrato sintaxina-GFP.

Para determinar la localización subcelular del sustrato sintaxina-GFP de líneas celulares aisladas que integran de forma estable una construcción de expresión que codifica un sustrato sintaxina-GFP de BoNT/C1, tal como, por ejemplo, pQBI-25/Syntaxin-1-GFP (véase el ejemplo I, 3a), se disponen en placas aproximadamente 1,5x10^{5} células de cada línea celular en un disco de cultivo de tejido de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo, selectivo de G418 y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5x10^{5} células/ml (6-16 horas). Se reemplaza el medio con 3 ml de medio de cultivo suplementado, completo, selectivo de G418 fresco y se incuban las células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Después de 24-48 horas, se observaron células vivas usando un microscopio invertido de fluorescencia con el fin de identificar líneas celulares aisladas que muestran fluorescencia de GFP localizada en la membrana celular, lo que indica que la sintaxina-GFP expresada en estas líneas celulares aisladas se dirige correctamente a la membrana celular. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad BoNT/C1 usando un sustrato de sintaxina-GFP.

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3b. Células transducidas de forma estable usando un procedimiento lentiviral

Para generar una línea celular integrada de forma estable que expresa un sustrato sintaxina de BoNT/C1 usando un procedimiento lentiviral, se dispone en placa una densidad adecuada (1 x10^{5} a 1 x106^{6} células) de células apropiadas en un disco de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad apropiada para transducción. Se inoculan las células con el stock lentiviral, como se describió anteriormente en el ejemplo IV, 8b, usando una multiplicidad adecuada de infección y se incuban durante aproximadamente 16-24 horas en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5%. Se reemplaza el medio de transducción con 3 ml de medio suplementado, completo fresco que contiene una cantidad apropiada de blasticidina. Se incuban células en un incubador a 37ºC en dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 2 semanas, reemplazando el medio viejo con medio suplementado, completo, selectivo de blasticidina fesco cada 3 a 4 días. Una vez establecidas las colonias resistentes a blasticidina, se redisponen clones resistentes en nuevas placas de cultivo de 35 mm que contienen medio suplementado, completo, selectivo de blasticidina fesco, hasta que estas células alcanzaron una densidad de 6 a 20x10^{5} células/ml.

Se determinará la presencia del sustrato sintaxina-GFP en líneas celulares aisladas mediante análisis por Western blot como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 3a. Se determinará la localización subcelular del sustrato de sintaxina-GFP en líneas celulares aisladas mediante microscopía de fluorescencia como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 3a. Se pueden usar células transducidas de forma estable para llevar a cabo un ensayo de actividad en BoNT/C1 usando un sustrato de sintaxina-GFP.

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Ejemplo VI Condiciones de optimización de los ensayos de FRET a base de Colorante lipófilo 1. Identificación de los colorantes lipófilos adecuados para los ensayos de FRET a base de Colorante lipófilo

Para determinar la capacidad de adecuación de un colorante lipófilo como un segundo miembro de un par de FRET, el espectro de absorbancia de los diversos los colorantes lipófilos se examinaron primero para determinar la superposición espectral de los espectros de emisión del primer miembro un par de FRET. Los colorantes candidatos se seleccionaron basándose en la superposición de los espectros adecuados (véase la Tabla 14).

Con el fin de de determinar la capacidad de adecuación de los colorantes lipófilos seleccionados como un segundo miembro de un par de FRET, pares de FRET candidatos se ensayan para FRET. Como un ejemplo no limitante, una línea celular Neuro-2A que contiene de manera estable un sustrato SNAP-25_{206}-GFP se trató previamente con diferentes colorantes lipófilos para determinar si se puede producir FRET. Aproximadamente 2,5x10^{5} de células Neuro-2A se sembraron en cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos que contiene 2 ml de EMEM completo, suplementado selectivo de G418 -y se desarrolló en un incubador 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante toda una noche para permitir la unión de la célula. El medio se reemplazó con 3 ml de G418 selectivo reciente, EMEM sin suero y las células se incubaron en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir la diferenciación. Las células se incubaron durante 2 horas en un medio sin suero que contiene 0,1 \muM, 1,0 \muM y 10 \muM de cada uno de los colorantes lipófilos: Dil Vibrant, DiIC_{18}(3), DiIC_{18}(3)-DS, SP-DiIC_{18}, 5-5'-Ph2-DiIC_{18} y DiD (véase la Tabla 14). Los diversos colorantes se seleccionaron de manera que no se excitaran por el láser a 488 nm (espectros de absorción \sim 550-590 nm) y requerirán la transferencia de energía de SNAP25206-GFP para fluorescencia. Las células se exploran usando un conjunto de Typhoon 9140 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a los siguientes parámetros: la excitación por láser se estableció 488 nm y las emisiones se detectaron usando un filtro de recogida establecido a 610 nm 6 30 nm con el plano focal del láser 3 mm por encima del vidrio. Las células Neuro-2A que expresan SNAP25206-GFP muestran un incremento de fluorescencia roja en las células expuestas a diversos colorantes a concentraciones que varían entre 1 \muM a 10 \muM durante dos horas. Por ejemplo, existía una fluorescencia en las células que expresan SNAP25206-GFP teñidas que contienen 1,0 \muM de DiI Vibrant, 1,0 \muM DiIC_{18}(3) o 1,0 \muM DiIC_{18}(3)-DS (Fig. 11). Sin embargo, no existe fluorescencia a esta longitud de onda detectada en las células control que carecen de SNAP25206-GFP (no transfectadas) tratadas con 1,0 \muM de Dil Vibrant, 1,0 mM DiIC_{18}(3) o 1,0 \muM DiIC_{18}(3)-DS (Fig. 11). Estos resultados indican que el incremento de fluorescencia roja en las células que expresan SNAP25206-GFP se debió a la transferencia de energía desde la GFP excitada al colorante de la membrana y posteriormente la emisión por el colorante.

Con el fin de determinar la capacidad de adecuación de de una proteína fluorescente seleccionada como un segundo miembro de un par de FRET, los pares de FRET candidatos se ensayan para la evaluación de FRET. Como un ejemplo no limitante, una línea celular Neuro-2A que contiene de manera estable un sustrato de SNAP-25_{206}-HcRed1 se tratará de manera previa con colorantes lipófilos diferentes para determinar si se podría producir FRET. Aproximadamente 2,5x10^{5} de células Neuro-2a se sembraron en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contiene 2 ml de EMEM selectivo de G418, completo, suplementado y se desarrollará un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante toda una noche para permitir la unión de la célula. Se reemplazará el medio con 3 ml de G418 selectivo fresco, EMEM sin suero y las células se incubarán en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir la diferenciación. Las células se incubarán durante 2 horas en medio sin suero que contiene 0,1 \muM, 1.0 \muM y 10 \muM de cada uno de los siguientes colorantes lipófilos : 4-Di-16-ASP, 4-Di-10-ASP, FAST DiA (véase la Tabla 14). La proteína fluorescente se selecciona de manera que no se excitara mediante un láser 492 nm (espectro de absorción \sim 500-600 nm) y requeriría la transferencia de energía de los colorantes lipófilos para fluorescencia. Las células se exploran usando un Typhoon 9140 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) fijado en los siguientes parámetros: láser excitación se fija a 492 nm y las emisiones se detectan usando un filtro de recogida fijado a 618 nm \pm 30 nm con el plano focal del láser 3 mm por encima del vidrio. Las células Neuro-2A que contienen un colorante lipófilo adecuado SNAP25_{206}-HcRed1 del par de FRET mostrará un incremento de la fluorescencia roja debido a la transferencia de energía del colorante lipófilo excitado al SNAP25_{206}-HcRed1.

Para determinar si la actividad de una Toxina Clostridial se podía medir usando un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo donde el primer miembro de FRET es una proteína fluorescente y el segundo miembro es un colorante lipófilo, células Neuro-2a que contienen de manera estable un sustrato SNAP-25_{206}-GFP se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y diferenciadas como se ha descrito anteriormente en el ejemplo VI, 1. Las células diferenciadas se expusieron después a 5 nM de BoNT/A durante 16 horas. Células tratadas con BoNT/A se incubaron después durante horas con uno de los siguientes colorante lipófilos: DiI Vibrant, DiIC_{18}(3), SP-DiIC_{18}, 5-5'-Ph2-DiIC_{18} y DiD. las células se excitaron con un láser de 488 nm y las emisiones se recogieron a 610 nm +/- 30 nm. En las células teñidas con DiIC_{18}(3), existía una disminución de la señal fluorescente a 610 nm después del tratamiento con BoNT/A comparada con el control no tratado (véase la Fig. 12a). Estos datos demuestran que la actividad de BoNT/A se puede detectar usando el ensayo de FRET. La fluorescencia detectada en cada ensayo se cuantificó con el software TYPHOON 9140 IMAGE QUANT TL A (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). El software asigna un valor numérico a cada pocillo que contiene células basado en la cantidad (volumen) de fluorescencia emitida. La cantidad de fluorescencia se expresó después como un porcentaje del control no tratado para normalizar la fluorescencia de fondo de los colorantes (Fig. 12b). Existía una disminución de un 30% en FRET en las células tratadas con BoNT/A comparado con las células control no tratadas usando el marcador lipófilo DiIC_{18}(3).

Para determinar si la actividad de una Toxina Clostridial se podía medir usando un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo donde el primer miembro de FRET es una proteína fluorescente y el segundo miembro es proteína fluorescente, células Neuro-2a que contienen de manera estable un sustrato SNAP-25_{206}-HcRed1 se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferencian como se ha descrito anteriormente en el ejemplo VI, 1. Diferenciadas células se exponen después a 5 nM de BoNT/A durante 16 horas. Células tratadas con BoNT/A se incubaron después durante dos horas con uno de los siguientes colorante lipófilos: 4-Di-16-ASP, 4-Di-10-ASP, FAST DiA. Las células se excitaron con un láser de 492 nm láser y las emisiones se recogieron a 618 nm +/- 30 nm. La fluorescencia detectada en cada ensayo se cuantificará con el software TYPHOON 9140 IMAGE QUANT TL A (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). El software asigna un valor numérico a cada pocillo que contiene células basado en la cantidad (volumen) de fluorescencia emitida. La cantidad de fluorescencia se expresará después como un porcentaje del control no tratado para normalizar la fluorescencia de fondo de la proteína fluorescente. Las células que muestran una disminución en la señal fluorescente a 618 nm después de tratamiento con BoNT/A comparado con el control no tratado indicará que la actividad de BoNT/A se puede detectar usando en ensayo de FRET.

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Usando los procedimientos indicados anteriormente, líneas celulares que contienen de manera estable un sustrato de VAMP-GFP o un sustrato de Sintaxina-GFP desvelados en la presente memoria descriptiva se pueden ensayar con diferentes colorantes lipófilos para identificar los colorantes que provocan una respuesta de FRET adecuada útil para poner en práctica los aspectos de la presente invención. Del mismo modo, los sustratos de Toxina Clostridial unidos de manera operacional a una proteína fluorescente diferente, tal como, por ejemplo, una BFP, una CFP, una YFP o una RFP se pueden ensayar con diferentes colorantes lipófilos para identificar colorantes que provocan una respuesta de FRET útil para practicar aspectos de la presente invención. (véase la Tabla 14). Además, los procedimientos indicados anteriormente pueden ensayar diversos colorantes lipófilos como fluoróforos donantes adecuados junto con proteínas fluorescentes como aceptores (véase Tabla 14).

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2. Optimización de las condiciones de colorante lipófilo para ensayos de FRET a base de colorante lipófilo

Diferentes concentraciones de colorante lipófilo y diferentes tiempos de carga de colorante se evalúan con el fin de determinar condiciones de FRET más óptimas para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo.

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A, células Neuro-2a que contienen de manera estable un sustrato SNAP-25_{206}-GFP se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciaron como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 1. Las células diferenciadas se expusieron después a 1 nM de BoNT/A durante 16 horas. Las células tratadas con BoNT/A se incubaron después con 0 \muM, 0,5 \muM, 1,25 \muM, 2,5 \muM, 5,0 \muM o 10 \muM de DiIC_{18}(3) y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de la emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas. La diferencia mayor entre células Neuro-2A tratadas con BoNT/A y células Neuro-2A no tratadas se produjo cuando las células se incubaron con DiIC_{18}(3) en un intervalo de 1,25 \muM-2,5 \muM durante aproximadamente 4 a 6 horas (Fig. 13). Un procedimiento similar se llevará a cabo para optimizar las condiciones usando un colorante lipófilo como un fluoróforo donante y un sustrato de BoNT/A como un
aceptor.

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/B, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/B VAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, por ejemplo, como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 2. El medio se reemplazará con 2 ml de medio selectivo de antibiótico, sin suero, y las células se incubarán en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir diferenciación. Las células diferenciadas se expusieron después a 1 nM de BoNT/B durante 16 horas. Las células tratadas con BoNT/B se incubarán después con 0 \muM, 0,5 \muM, 1,25 \muM, 2,5 \muM, 5,0 \muM o 10 \muM de un colorante lipófilo adecuado, por ejemplo, como se identifica anteriormente en el ejemplo VI, 1, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas. La mayor diferencia en la respuesta de FRET entre las células tratadas con BoNT/B y las células no tratadas identificarán las concentraciones de colorante adecuadas y tiempos de carga de colorante útiles para poner en práctica los aspectos de la presente invención.

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/C1, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/C1 SNAP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, por ejemplo, como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 1. El medio se reemplazará con 2 ml de medio selectivo de antibiótico, sin suero, y las células se incubarán en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir diferenciación. Las células diferenciadas se expusieron después a 1 nM de BoNT/C1 durante 16 horas. Las células tratadas con BoNT/C1 se incubarán después con 0 \muM, 0,5 \muM, 1,25 \muM, 2,5 \muM, 5,0 \muM o 10 \muM de un colorante lipófilo adecuado, por ejemplo, como se identifica anteriormente en el ejemplo VI, 1, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas. La mayor diferencia en la respuesta de FRET entre las células tratadas con BoNT/C1 y las células no tratadas identificarán las concentraciones de colorante adecuadas y tiempos de carga de colorante útiles para poner en práctica los aspectos de la presente invención.

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/D, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/D VAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, por ejemplo, como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 2. El medio se reemplazará con 2 ml de medio selectivo de antibiótico, sin suero, y las células se incubarán en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir diferenciación. Las células diferenciadas se expondrán después a 1 nM de BoNT/D durante 16 horas. Las células tratadas con BoNT/D se incubarán después con 0 \muM, 0,5 \muM, 1,25 \muM, 2,5 \muM, 5,0 \muM o 10 \muM de un colorante lipófilo adecuado, por ejemplo, como se identifica anteriormente en el ejemplo VI, 1, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas. La mayor diferencia en la respuesta de FRET entre las células tratadas con BoNT/D y las células no tratadas identificarán las concentraciones de colorante adecuadas y tiempos de carga de colorante útiles para poner en práctica los aspectos de la presente invención.

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Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/E, aproximadamente 2,5x10^{5} de células SH-SY5Y que contienen de manera estable un sustrato SNAP-25_{206}-GFP se sembraron en cada pocillo de de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contiene 2 ml de G418-selectivo, 1:1 EMEM y medio de Ham F12 (EMEM:F12), complementado con 10% de albúmina sérica bovina (FBS), 4 mM glutamina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1% de piruvato de sodio (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, solución 1 x de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x MEM de solución de aminoácidos no esenciales (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se desarrollaron en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante toda una noche para permitir la unión a la célula. Se reemplazó el medio con 3 ml de EMEM:F12 selectivo de G418, sin suero y las células en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir la diferenciación. Las células diferenciadas se expusieron después a 100 nM de BoNT/E durante aproximadamente 18-24 horas. Las células tratadas con BoNT/E se incubaron después con 0 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1,0 mM, 2,5 mM o 5,0 mM de DiIC_{18}(3) u octadecil rodamina B y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de la emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas y 6 horas. La mayor diferencia entre células SHSY5Y tratadas con BoNT/E y células SH-SY5Y no tratadas se produjo cuando las células se incubaron con 0,5 mM de DiIC_{18}(3) durante aproximadamente 4 a 6 horas (Fig. 14a).

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/F, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/F VAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, por ejemplo, como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 2. El medio se reemplazará con 2 ml de medio selectivo de antibiótico, sin suero, y las células se incubarán en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir diferenciación. Las células diferenciadas se expondrán después a 1 nM de BoNT/F durante 16 horas. Las células tratadas con BoNT/F se incubarán después con 0 \muM, 0,5 \muM, 1,25 \muM, 2,5 \muM, 5,0 \muM o 10 \muM de un colorante lipófilo adecuado, por ejemplo, como se identifica anteriormente en el ejemplo VI, 1, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas. La mayor diferencia en la respuesta de FRET entre las células tratadas con BoNT/F y las células no tratadas identificarán las concentraciones de colorante adecuadas y tiempos de carga de colorante útiles para poner en práctica los aspectos de la presente invención.

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/G, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/G VAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, por ejemplo, como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 2. El medio se reemplazará con 2 ml de medio selectivo de antibiótico, sin suero, y las células se incubarán en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir diferenciación. Las células diferenciadas se expondrán después a 1 nM de BoNT/G durante 16 horas. Las células tratadas con BoNT/G se incubarán después con 0 \muM, 0,5 \muM, 1,25 \muM, 2,5 \muM, 5,0 \muM o 10 \muM de un colorante lipófilo adecuado, por ejemplo, como se identifica anteriormente en el ejemplo VI, 1, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas. La mayor diferencia en la respuesta de FRET entre las células tratadas con BoNT/G y las células no tratadas identificarán las concentraciones de colorante adecuadas y tiempos de carga de colorante útiles para poner en práctica los aspectos de la presente invención.

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/F, células que contienen de manera estable un sustrato TENT VAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, por ejemplo, como se desvela anteriormente en el ejemplo V, 2. El medio se reemplazará con 2 ml de medio selectivo de antibiótico, sin suero, y las células se incubarán en un incubador a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para inducir diferenciación. Las células diferenciadas se expondrán después a 1 nM de TENT durante 16 horas. Las células tratadas con TENT se incubarán después con 0 \muM, 0,5 \muM, 1,25 \muM, 2,5 \muM, 5,0 \muM o 10 \muM de un colorante lipófilo adecuado, por ejemplo, como se identifica anteriormente en el ejemplo VI, 1, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm a 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas. La mayor diferencia en la respuesta de FRET entre las células tratadas con TENT y las células no tratadas identificarán las concentraciones de colorante adecuadas y tiempos de carga de colorante útiles para poner en práctica los aspectos de la presente invención.

Los procedimientos indicados anteriormente se pueden usar para optimizar más las condiciones de los colorantes lipófilos para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para determinar la actividad de la Toxina Clostridial usando los colorantes lipófilos como fluoróforos donantes junto con las proteínas fluorescentes como aceptores usando, por ejemplo, las condiciones descritas anteriormente en el ejemplo VI, 1.

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3. Optimización de las condiciones de Toxina Clostridial para ensayos de FRET a base de colorante lipófilo

Diferentes concentraciones de Toxina Clostridial y diferentes tiempos de tratamiento de Toxina Clostridial se evalúan con el fin de determinar condiciones de FRET más óptimas para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo.

Para determinar condiciones más óptimas de BoNT/A para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células Neuro-2a que contienen de manera estable un sustrato SNAP-25_{206}-GFP se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciaron como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 1 Las células diferenciadas después se expusieron a un intervalo de dosis de BoNT/A (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM y 20 nM) y se incubaron durante un intervalo de tiempo (15 minutos, 1 hora, 16 horas y 3 días). Las células tratadas con BoNT/A se incubaron con 1,25 \muM DilC_{18}(3) durante 6 horas y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm. Se observó una respuesta a la dosis en las células tratadas durante 16 horas y durante 3 días. Para los tratamientos de 16 horas, se detectó una señal positiva con concentraciones de BoNT/A (150 KDa) tan bajas como 0,5 nM (Fig. 15a). Los tratamientos de tres días dieron señales positivas a concentraciones de BoNT/A tan bajas como 0,05nM (Fig. 15b).

Para determinar condiciones más óptimas de BoNT/B para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/B VAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciarán como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 2 Las células diferenciadas después se expondrán a un intervalo de dosis de BoNT/B (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM y 20 nM) y se incubaron durante un intervalo de tiempo de (15 minutos, 1 hora, 16 horas y 3 días). Las células tratadas con BoNT/B se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante un tiempo adecuado, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI,2, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm.
Se generará una respuesta a la dosis y se determinará la concentración de BoNT/B y tiempo de tratamiento.

Para determinar condiciones más óptimas de BoNT/C1 para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/C1 SNAP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciarán como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 1 Las células diferenciadas después se expondrán a un intervalo de dosis de BoNT/C1 (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM y 20 nM) y se incubaron durante un intervalo de tiempo de (15 minutos, 1 hora, 16 horas y 3 días). Las células tratadas con BoNT/B se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante un tiempo adecuado, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI,2, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm. Se generará una respuesta a la dosis y se determinará la concentración de BoNT/C1 y tiempo de tratamiento.

Para determinar condiciones más óptimas de BoNT/D para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/D WAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciarán como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 2 Las células diferenciadas después se expondrán a un intervalo de dosis de BoNT/D (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM y 20 nM) y se incubaron durante un intervalo de tiempo de (15 minutos, 1 hora, 16 horas y 3 días). Las células tratadas con BoNT/D se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante un tiempo adecuado, por ejemplo, como se desvela en el Ejemplo VI,2, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm.
Se generará una respuesta a la dosis y se determinará la concentración de BoNT/D y tiempo de tratamiento.

Para determinar condiciones más óptimas de BoNT/E para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células SH-SY5Y que contienen de manera estable un sustrato SNAP-25_{206}-GFP se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciaron como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 1 Las células diferenciadas después se expusieron a un intervalo de dosis de BoNT/E (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM. 100 nM y 200 nM) y se incubaron durante aproximadamente 18-24 horas. Las células tratadas con BoNT/E se incubaron con 0,25 \muM DilC_{18}(3) durante 6 horas y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm. Se observó una respuesta a la dosis en las células tratadas durante 24 horas, y se detectó una señal positiva con concentraciones de BoNT/E (150 KDa) tan bajas como 0,5 nM (Fig. 16).

Para determinar condiciones más óptimas de BoNT/F para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/F WAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciarán como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 2 Las células diferenciadas después se expondrán a un intervalo de dosis de BoNT/F (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM y 20 nM) y se incubaron durante un intervalo de tiempo de (15 minutos, 1 hora, 16 horas y 3 días). Las células tratadas con BoNT/F se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante un tiempo adecuado, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI,2, y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm. Se generará una respuesta a la dosis y se determinará la concentración de BoNT/F y tiempo de tratamiento.

Para determinar condiciones más óptimas de BoNT/G para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células que contienen de manera estable un sustrato BoNT/G WAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciarán como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 2 Las células diferenciadas después se expondrán a un intervalo de dosis de BoNT/G (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM y 20 nM) y se incubaron durante un intervalo de tiempo de (15 minutos, 1 hora, 16 horas y 3 días). Las células tratadas con BoNT/G se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante un tiempo adecuado, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI,2, y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm. Se generará una respuesta a la dosis y se determinará la concentración de BoNT/G y tiempo de tratamiento.

Para determinar condiciones más óptimas de TeNT para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, células que contienen de manera estable un sustrato TeNT WAMP-GFP se desarrollarán en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciarán como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 2 Las células diferenciadas después se expondrán a un intervalo de dosis de TeNT (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 5,0 nM y 20 nM) y se incubaron durante un intervalo de tiempo de (15 minutos, 1 hora, 16 horas y 3 días). Las células tratadas con TeNT se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante un tiempo adecuado, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI,2, y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm +/- 30 nm. Se generará una respuesta a la dosis y se determinará la concentración de TeNT y tiempo de tratamiento.

Los procedimientos indicados anteriormente se pueden usar para optimizar más las condiciones de la Toxina Clostridial para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para determinar la actividad de la Toxina Clostridial usando los colorantes lipófilos como fluoróforos donantes junto con las proteínas fluorescentes como aceptores usando, por ejemplo, las condiciones descritas anteriormente en el ejemplo VI, 1.

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4. Optimización de las condiciones de placa de cultivo para ensayos de FRET a base de colorante lipófilo

Para determinar condiciones más óptimas de colorante lipófilo para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo, se evaluaron placas de cultivo de tejido de color negro con fondos transparentes. Células Neuro-2a que contienen de manera estable un sustrato SNAP-25206-GFP se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se diferenciaron como se desvela anteriormente en el ejemplo VI, 1, con la excepción de las placas de cultivo de tejido de 24 pocillos de color negro con fondos transparentes se usaron en lugar de placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos de plástico transparente. Las células diferenciadas se expusieron después a un intervalo de dosis de BoNT/A (0 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 2,0 nM, 5,0 nM y 10 nM) y se incubaron durante o bien aproximadamente 16 horas o 3 días. Células tratadas con BoNT/A se incubaron con 1,25 \muM DilC_{18}(3) durante 6 horas y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de la emisión a 610 nm +/- 30 nm. El uso de las placas de cultivo de tejido de color negro redujo el ensayo a una variabilidad de ensayo que da como resultado uno mucho más claro. Para los tratamientos de 16 horas, se detectó una señal positiva con concentraciones de BoNT/A (150 KDa) tan bajas como 0,005 nM (véase la Fig. 17a), un incremento de sensibilidad de aproximadamente 100 veces comparado con los resultados obtenidos de placas de cultivo de tejido de plástico de color transparente (comparar la Fig 15a con la Fig. 17a). Para los tratamientos de 3 días, se detectó una señal positiva con concentraciones de BoNT/A (150 KDa) tan bajas como 0,002 nM (Fig. 18a), y se detectó un incremento de sensibilidad global del ensayo a todas las concentraciones usadas con relación al tratamiento de 16 horas (comparar la Fig. 17a con la Fig. 18a).

Los procedimientos indicados anteriormente se pueden usar para optimizar más las condiciones de FRET para un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo en los colorantes lipófilos como fluoróforos donantes junto con las proteínas fluorescentes como aceptores usando, por ejemplo, las condiciones descritas anteriormente en el ejemplo VI, 1.

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Ejemplo VII Ensayos de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad Clostridial 1. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A 1a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A en un producto BOTOX@

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto BOTOX®, células Neuro-2A diferenciadas que expresan de manera estable un sustrato BoNT/A SNAP25_{206}-GFP se desarrollaron y se diferenciaron en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes como se desvela anteriormente en los Ejemplos VI, 1d. Se obtuvo una curva estándar mediante tratamiento de células Neuro-2A diferenciadas con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de Pure A (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se trataron con tres viales separados de BOTOX® disuelto en 1 ml de medio EMEM completo hasta una concentración final de aproximadamente 5,5 pM. Las células en tres pocillos replicados se trataron con el contenido de cada vial de BOTOX® resuspendido. Las células tratadas con BoNT/A se incubaron con 1,25 \muM DilC_{18}(3) durante 6 horas y se determinó FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de Pure A y cada muestra de BOTOX® se calcularon como un porcentaje de control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración de BOTOX® derivada experimentalmente para cada vial se extrapoló a partir de la curva de concentración de Pure A usando el valor calculado a partir de una media de tres pocillos replicados. Los valores medios calculados para los tres viales eran 6,3 pM, 9,0 pM y 17,7 pM, con la media para cada uno de los tres viales de BOTOX® calculada para ser 11,0 pM. Estos resultados demostraron que la Actividad de la Toxina Clostridial tal como, por ejemplo, actividad de BoNT/A de los productos formulados tales como BOTOX®, se puede detectar usando un ensayo de FRET en el que un colorante lipófilo incorporado en una membrana actúa como el aceptor de FRET.

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1b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células Neuro-2A diferenciadas que expresan de manera estable un sustrato BoNT/A SNAP-2_{206}-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes como se desvela anteriormente en los Ejemplos VI, 1d. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células Neuro-2A diferenciadas con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de Pure A (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado de viales de BOTOX® diluido en 1 ml de medio EMEM completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/A se incubarán con 1,25 \muM DilC_{18}(3) durante 6 horas y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de Pure A y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje de control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración de derivada experimentalmente de BoNT/A presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de Pure A usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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2. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/B 2a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/B en un producto de BoNT/B formulado

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/B usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto de BoNT/B formulado, células que expresan un sustrato BoNT/B VAMP-GAP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos VI, 2 y V, 2. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células Neuro-2A diferenciadas con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con BoNT/B formulado disuelto en 1 ml de medio de cultivo completo hasta una concentración de aproximadamente 0,0055 nM. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada vial de BoNT/B formulado resuspendido. Las células tratadas con BoNT/B se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/B y cada muestra de BoNT/B formulado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/B formulado para cada vial se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/B usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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2b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/B@ en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/B usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células que expresan un sustrato BoNT/B VAMP-GAP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos VI, 2 y V, 2. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 nM de BoNT/B (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado de viales de BoNT/B formulado diluido en 1 ml de medio de cultivo completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/B se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/B y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/B presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/B usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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3. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/C1 3a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/C1 en un producto de BoNT/C1 formulado

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/C1 usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto de BoNT/C1 formulado, células que expresan un sustrato BoNT/C1 SNAP-25_{206}-GFP o un sustrato BoNT/C1 Sintaxina-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 3 y V, 3. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de BoNT/C1 (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con BoNT/C1 formulado disuelto en 1 ml de medio de cultivo completo hasta una concentración de aproximadamente 0,0055 nM. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada vial BoNT/C1 formulado resuspendido. Las células tratadas con BoNT/C1 se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/C1 y cada muestra de BoNT/C1 formulado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/B formulado para cada vial se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/C1 usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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3b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/C1 en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/C1 usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células que expresan un sustrato BoNT/C1 Sintaxina-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 3 y V, 3. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 nM de BoNT/C1 (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado en una placa de 24 pocillos. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado a partir de viales de BoNT/C1 formulado diluido en 1 ml de medio de cultivo completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/C1 se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/C1 y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/C1 presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/C1 usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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4. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/D 4a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/D en un producto de BoNT/D formulado

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/D usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto de BoNT/D formulado, células que expresan un sustrato BoNT/D VAMP-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 4 y V, 4. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con BoNT/D formulado disuelto en 1 ml de medio de cultivo completo hasta una concentración de aproximadamente 0,0055 nM. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada vial BoNT/D formulado resuspendido. Las células tratadas con BoNT/D se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/D y cada muestra de BoNT/D formulado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/D formulado para cada vial se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/D usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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4b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/D en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/D usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células que expresan un sustrato BoNT/D VAMP GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 4 y V, 4. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 nM de BoNT/D (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado en una placa de 24 pocillos. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado a partir de viales de BoNT/D formulado diluido en 1 ml de medio de cultivo completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/D se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/D y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/D presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/D usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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5. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/E 5a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/E en un producto de BoNT/E formulado

Para llevar a cabo un ensayo para evaluar la actividad de BoNT/E usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto de BoNT/E formulado, células SK-N-DZ diferenciadas que expresan un sustrato BoNT/E SNAP-25_{206}-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 5 y V, 5. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células SK-N-DZ con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con BoNT/E formulado disuelto en 1 ml de medio DMEM completo hasta una concentración de aproximadamente 0,0055 nM. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada vial BoNT/E formulado resuspendido. Las células tratadas con BoNT/E se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/E y cada muestra de BoNT/E formulado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/E formulado para cada vial se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/E usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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5b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/E en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/E usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células SK-N-DZ diferenciadas que expresan un sustrato BoNT/E SNAP-25_{206}-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 5 y V, 5. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células SK-N-DZ con 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 nM de BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado en una placa de 24 pocillos. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado a partir de viales de BoNT/E formulado diluido en 1 ml de medio DMEM completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/E se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/E y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/E presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/E usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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6. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/F 6a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/F en un producto de BoNT/F formulado

Para llevar a cabo un ensayo para evaluar la actividad de BoNT/F usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto de BoNT/F formulado, células que expresan un sustrato BoNT/F VAMP-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 6 y V, 6. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con BoNT/F formulado disuelto en 1 ml de medio de cultivo completo hasta una concentración de aproximadamente 0,0055 nM. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada vial BoNT/F formulado resuspendido. Las células tratadas con BoNT/F se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/F y cada muestra de BoNT/F formulado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/F formulado para cada vial se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/F usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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6b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/F en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/F usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células que expresan un sustrato BoNT/F VAMP-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 6 y V, 6. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 nM de BoNT/F (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado en una placa de 24 pocillos. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado a partir de viales de BoNT/F formulado diluido en 1 ml de medio de cultivo completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/F se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/F y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/F presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/F usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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7. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/G 7a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/G en un producto de BoNT/G formulado

Para llevar a cabo un ensayo para evaluar la actividad de BoNT/G usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto de BoNT/G formulado, células que expresan un sustrato BoNT/G VAMP-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 7 y V, 7. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con BoNT/G formulado disuelto en 1 ml de medio de cultivo completo hasta una concentración de aproximadamente 0,0055 nM. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada vial BoNT/G formulado resuspendido. Las células tratadas con BoNT/G se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/G y cada muestra de BoNT/G formulado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/G formulado para cada vial se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/G usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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7b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/G en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de actividad de BoNT/G usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células que expresan un sustrato BoNT/G VAMP-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 7 y V, 7. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 nM de BoNT/G (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado en una placa de 24 pocillos. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado a partir de viales de BoNT/G formulado diluido en 1 ml de medio de cultivo completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/G se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de BoNT/G y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de BoNT/G presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de BoNT/G usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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8. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de TeNT 8a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de TeNT en un producto de TeNT formulado

Para llevar a cabo un ensayo para evaluar la actividad de TeNT usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto de TeNT formulado, células que expresan un sustrato TeNT VAMP-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 8 y V, 8. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con TeNT formulado disuelto en 1 ml de medio de cultivo completo hasta una concentración de aproximadamente 0,0055 nM. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada vial TeNT formulado resuspendido. Las células tratadas con TeNT se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo, como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de TeNT y cada muestra de TeNT formulado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de TeNT formulado para cada vial se extrapolará a partir de la curva de concentración de TeNT usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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8b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de TeNT en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de actividad de TeNT usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células que expresan un sustrato TeNT VAMP-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes usando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno de los procedimientos como se desvela anteriormente en los Ejemplos IV, 8 y V, 8. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células con 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 nM de TeNT (Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado en una placa de 24 pocillos. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado a partir de viales de TeNT formulado diluido en 1 ml de medio de cultivo completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con TeNT se incubarán con un colorante lipófilo adecuado durante una duración de tiempo apropiada, por ejemplo como se desvela en el ejemplo VI, 2 y se determinará FRET usando el software Typhoon 9140 con excitación a 488 nm y recogida de emisión a 610 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de TeNT y cada muestra de alimento procesado se calcularán como un porcentaje del control no tratado (fluorescencia medida a 610 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración derivada experimentalmente de TeNT presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de TeNT usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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9. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad Clostridial usando colorantes lipófilos como fluoróforo donantes

Los procedimientos indicados anteriormente en los ejemplos VII, 1-8 se pueden usar para ensayar productos de Toxina Clostridial formulados y productos alimenticios usando un ensayo de FRET a base de colorante a base de los colorantes lipófilos como fluoróforo donantes junto con proteínas fluorescentes como aceptores usando, por ejemplo, las condiciones descritas anteriormente en el ejemplo VI, 1.

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9a. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A en un producto BOTOX®

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A usando un producto de neurotoxina botulínica formulado tal como, por ejemplo, un producto BOTOX®, células Neuro-2A diferenciadas que expresan de manera estable un sustrato BoNT/A SNAP25_{206}-GFP se desarrollaron y se diferenciaron en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes como se desvela anteriormente en los Ejemplos VI, 1d. Se obtuvo una curva estándar mediante tratamiento de células Neuro-2A diferenciadas con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de Pure A (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se trataron con tres viales separados de BOTOX® disuelto en 1 ml de medio EMEM completo hasta una concentración final de aproximadamente 5,5 pM. Las células en tres pocillos replicados se trataron con el contenido de cada vial de BOTOX® resuspendido. Las células tratadas con BoNT/A se incubaron con 5 \muM DPH durante 6 horas y se determinó FRET usando el software Spectra max M5 con excitación a 350 nm y recogida de emisión a 515 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de Pure A y cada muestra de BOTOX® se calcularon como un porcentaje de control no tratado (fluorescencia medida a 515 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración de BOTOX® derivada experimentalmente para cada vial se extrapoló a partir de la curva de concentración de Pure A usando el valor calculado a partir de una media de tres pocillos replicados. Los valores medios calculados para los tres viales eran 6,3 pM, 9,0 pM y 17,7 pM, con la media para cada uno de los tres viales de BOTOX® calculada para ser 11,0 pM. Estos resultados demostraron que la Actividad de la Toxina Clostridial tal como, por ejemplo, actividad de BoNT/A de los productos formulados tales como BOTOX®, se puede detectar usando un ensayo de FRET en el que un colorante lipófilo incorporado en una membrana actúa como el aceptor de FRET.

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9b. Ensayo de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A en una muestra de alimento

Para llevar a cabo un ensayo de FRET a base de colorante lipófilo para evaluar la actividad de BoNT/A usando una muestra de alimento tal como, por ejemplo, una muestra de alimento procesado, células Neuro-2A diferenciadas que expresan de manera estable un sustrato BoNT/A SNAP-2_{206}-GFP se desarrollarán y se diferenciarán en placas de cultivo de tejido de color negro de 24 pocillos con fondos transparentes como se desvela anteriormente en los Ejemplos VI, 1d. Se obtendrá una curva estándar mediante tratamiento de células Neuro-2A diferenciadas con 0,001 nM, 0,002 nM, 0,005 nM, 0,01 nM, 0,02 nM o 0,05 nM de Pure A (BTX-540; Metabiologics, Inc., Madison, WI), con cada una de las concentraciones desarrolladas por triplicado. De manera simultánea, los pocillos separados en la misma placa se tratarán con una muestra de alimento procesado de viales de BOTOX® diluido en 1 ml de medio EMEM completo. Las células en tres pocillos replicados se tratarán con el contenido de cada muestra diluida. Las células tratadas con BoNT/A se incubarán con 5 \muM DPH durante 6 horas y se determinará FRET usando el software Max M5 con excitación a 350 nm y recogida de emisión a 515 nm \pm 30 nm. Las emisiones a cada concentración de Pure A y cada muestra de BOTOX® se calcularán como un porcentaje de control no tratado (fluorescencia medida a 515 nm \pm 30 nm de células no tratadas con toxina). La concentración de derivada experimentalmente de BoNT/A presente en la muestra de alimento procesado se extrapolará a partir de la curva de concentración de Pure A usando el valor calculado a partir de una media de los tres pocillos replicados.

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<110> Fernández-Salas, Ester

\hskip1cm

Steward, Lance E.

\hskip1cm

Aoki, Kei Roger

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<120> Ensayos de FRET a base de Colorante lipófilo para evaluar la Actividad de la Toxina Clostridial

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<130> 17796 (BOT)

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<150> 60/668,942

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<151> 05-04-2005

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<160> 184

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens SNAP-25A (Humano)

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<400> 1

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29

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<210> 2

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens SNAP-25B (Humano)

\newpage

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<400> 2

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30

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<210> 3

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<211> 211

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens SNAP-23A (Humano)

\newpage

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<400> 3

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31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 158

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens SNAP-23B (Humano)

\newpage

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<400> 4

32

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<210> 5

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Macaca mulatta SNAP-25B (mono Rhesus)

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<400> 5

33

\newpage

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<210> 6

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus SNAP-25A (Rata)

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<400> 6

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34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus SNAP-25B (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Mus musculus SNAP-2SB (Ratón)

\newpage

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<400> 8

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36

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<210> 9

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<211> 210

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus SNAP-23 (Rata)

\newpage

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<400> 9

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37

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 210

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<212> PRT

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<213> Mus musculus SNAP-23 (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus SNAP-25B (Pollo)

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 11

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39

40

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<210> 12

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<211> 204

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<212> PRT

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<213> Carassius auratus SNAP-25A (Pez dorado)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

41

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<210> 13

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<211> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Carassius auratus SNAP-25B (Pez dorado)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 204

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<212> PRT

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<213> Danio rerio SNAP-25A (Pez cebra)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 203

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<212> PRT

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<213> Danio rerio SNAP-25B (Pez cebra)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 16

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<211> 214

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<212> PRT

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<213> Danio rerio SNAP-23 (Pez cebra)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Torpedo marmorata SNAP-25 (Raya eléctrica jaspeada )

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevis SNAP-25A (Rana de uñas africana)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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47

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<210> 19

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<211> 206

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevis SNAP-25B (Rana de uñas africana)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Xenopus laevis SNAP-23 (Rana de uñas africana)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Strongylocentrotus purpuratus SNAP-25 (Erizo de mar)

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<400> 21

51

\newpage

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<210> 22

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster SNAP-25 (Mosca de la fruta)

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<400> 22

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52

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<210> 23

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster SNAP-24 (Mosca de la fruta)

\newpage

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<400> 23

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53

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Hirudo medicinalis SNAP-25 (Sanguijuela)

\newpage

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<400> 24

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54

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Loligo pealei SNAP-25 (Calamar pálido )

\newpage

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<400> 25

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55

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<210> 26

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<211> 220

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<212> PRT

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<213> Lymnaea stagnalis SNAP-25 (Gran caracol de agua dulce)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

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56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

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<211> 207

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<212> PRT

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<213> Caenorhabditis elegans SNAP-25 (Gusano redondo)

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 27

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57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens VAMP-1-1 (Humano)

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 28

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59

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens VAMP-1-2 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

60

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens VAMP-1-3 (Humano)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens VAMP-2 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Macaca mulatta VAMP-2 (Mono Rhesus)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens VAMP-3 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus VAMP-2 (Vaca)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus VAMP-1 (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus VAMP-1b (Rata)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus VAMP-1 (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus VAMP-2 (Rata)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus VAMP-2b (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus VAMP-2 (Ratón)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus VAMP-3 (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mums musculus VAMP-3 (Ratón)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus VAMP-1 (Pollo)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus VAMP-2 (Pollo)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210>-45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus VAMP-3 (Pollo)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio VAMP-1 (Pez cebra)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio VAMP-2 (Pez cebra)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio VAMP-3 (Pez cebra)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Torpedo marmorata VAMP-1 (Raya eléctrica jaspeada )

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis VAMP-2 (Rana de uñas africana)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis VAMP-3 (Rana de uñas africana)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Strongylocentrotus purpuratus VAMP (Erizo de mar)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster SynA1 (Mosca de la fruta)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster SynA2 (Mosca de la fruta)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster SynB1 (Mosca de la fruta)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster SynB2 (Mosca de la fruta)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster SynC (Mosca de la fruta)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster Synod (Mosca de la fruta)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster SynE (Mosca de la fruta)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hirudo medicinalis VAMP (Sanguijuela)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

92

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Loligo pealei VAMP (Calamar pálido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lymnaea stagnalis VAMP (Gran caracol de agua dulce)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

94

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aplysia californica VAMP (Liebre marina de California)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Caenorhabditis elegans SNB1 (Gusano redondo)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Caenorhabditis elegans SNB1-like (Gusano redondo)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens Sintaxina-1A (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens Sintaxina-1B1 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens Sintaxina-1B2 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens Sintaxina-2-1 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens Sintaxina-2-2 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens Sintaxina2-2-3 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens Sintaxina-3 (Humano)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus Sintaxina-1A (Vaca)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus Sintaxina-1B2 (Vaca)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus Sintaxina-1A (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus Sintaxina-1B2 (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus Sintaxina-1A (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus Sintaxina-1B1 (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus Sintaxina-1B2 (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus Sintaxina-2 (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus Sintaxina-2 (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus Sintaxina-3A (Rata)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus Sintaxina-3A (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus Sintaxina-3B (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus Sintaxina-3C (Ratón)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus Sintaxina-1B (Pollo)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus Sintaxina-2 (Pollo)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio Sintaxina-1B (Pez cebra)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio Sintaxina-3 (Pez cebra)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Strongylocentrotus purpuratus Sintaxina-1B (erizo)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster Sintaxina-1A (Mosca de la fruta)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hirudo medicinalis Sintaxina-1A (Sanguijuela)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Loligo pealei Sintaxina-1A (Calamar pálido)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lymnaea stagnalis Sintaxina-1A (Gran caracol de agua dulce)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aplysia californica Sintaxina-1A (liebre marina)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/A SNAP-25

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/B VAMP-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/C1 Sintaxina-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/C1 SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/D VAMP-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/E SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/F VAMP-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de BoNT/G VAMP-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlace de escisión de TeNT VAMP-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PART

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)...(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = ácido 2-aminohexanoico (norleucina)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)...(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = ácido 2-aminobutírico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)...(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = ácido 2-aminobutírico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)...(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = ácido 2-aminobutírico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP=25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)...(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = ácido 2-aminobutírico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/A SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/B VAMP-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/B VAMP-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/D y BoNT/F VAMP-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de BoNT/D y BoNT/F VANP-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de dominio de dirección de membrana de SNAP-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente verde de Aequorea coerulescens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente verde de Zoanthus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRAT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente verde de Aequorea victoria

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Montastrea cavernosa Monster Green

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente verde de Renilla reniformis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente ciano de Aequorea victoria Cyan

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

182

183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente ciano de Anemonia majano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente azul de Aequorea victoria

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente amarilla de Aequorea victoria

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente amarilla de Zoanthus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente roja de Discosoma striata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente 1 amarilla de Discosoma striata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente 2 roja de Discosoma striata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente roja Express de Discosoma striata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente roja de Heteractis crispa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Proteína fluorescente roja de Anemonia sulcata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de espaciador flexible

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de Penetratina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento TAT de VIH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del factor de crecimiento de fibroblastos Kaposi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de señal de localización Nuclear

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento transportan

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

207

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento MPG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 808

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

209

210

211

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 806

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

212

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 694

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

215

216

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 604

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

217

218

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 683

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

219

220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 727

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

221

222

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 742

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

224

225

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 422

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

226

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

228

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Hexapéptido de tetracisteína

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)...(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rhodococcus rhodochrous

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

232

Claims (25)

1. Una célula aislada que comprende:

a)

un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana, comprendiendo dicho sustrato

i)

un primer miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET);

ii)

una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que incluye un sitio de escisión de Toxina Clostridial; y

iii)

un dominio de dirección de membrana;

b)

un segundo miembro asociado a membrana de un par de FRET, en el que el segundo par del miembro de FRET es un colorante lipófilo; y

c)

un receptor que se une a una Toxina Clostridial;

en el que la célula es capaz de intoxicación por Toxina Clostridial;

en el que el par de FRET comprende un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de un fluoróforo donante; y

en el que en las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se muestra entre el aceptor y el fluoróforo donante.

\vskip1.000000\baselineskip

2. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula contiene de manera transitoria el sustrato de Toxina Clostridial.

3. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula que contiene de manera estable el sustrato de Toxina Clostridial.

4. La célula de la reivindicación 1, en la que el sustrato de Toxina Clostridial se expresa a partir de una molécula de ácido nucleico.

5. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula en una célula neuronal.

6. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula en una célula no neuronal.

7. La célula de la reivindicación 1, en la que el primer miembro del par de FRET es una proteína fluorescente o una proteína de unión a fluoróforo.

8. La célula de la reivindicación 1, en la que el primer miembro del par FRET es el aceptor y el segundo miembro del par de FRET es el fluoróforo donante.

9. La célula de la reivindicación 1, en la que el primer miembro del par FRET es el fluoróforo donante y el segundo miembro del par FRET es el aceptor.

10. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/A incluyendo un sitio de escisión de BoNT/A, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B incluyendo un sitio de escisión BoNT/B, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 incluyendo un sitio de escisión de BoNT/C1, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D incluyendo un sitio de escisión de BoNT/D, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E incluyendo un sitio de escisión de BoNT/E, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F incluyendo a BoNT/F sitio de escisión, a BoNT/G secuencia de reconocimiento incluyendo un sitio de escisión de BoNT/G, o una secuencia de reconocimiento de TeNT incluyendo un sitio de escisión de TeNT.

11. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Arg.

12. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Phe.

13. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Arg-Ala.

14. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de Sintaxina, comprendiendo los seis restos consecutivos Lys-Ala.

15. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Lys-Leu.

16. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Arg-Ile.

17. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Lys.

18. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Ala-Ala.

19. La célula de la reivindicación 1, en el que el receptor es un receptor de Toxina Clostridial endógeno.

20. La célula de la reivindicación 1, en el que el receptor es un receptor de Toxina Clostridial exógeno.

21. Un procedimiento de determinación de la actividad de la Toxina Clostridial, que comprende

a)

poner en contacto una célula de acuerdo con la reivindicación 1 con una muestra;

b)

excitar dicho fluoróforo donante;

c)

detectar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de dicha célula puesta en contacto; y

d)

comparar la transferencia de energía de resonancia detectada a partir de la célula puesta en contacto con la transferencia de energía de resonancia detectada a partir de la célula control sometida a las etapas (b)-(c);

en el que una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula puesta en contacto comparado con la célula control es indicativo de la actividad de la Toxina Clostridial.

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22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la muestra es un lisado de células bruto, una Toxina Clostridial a granel, una Toxina Clostridial parcialmente purificada, una Toxina Clostridial purificada o un producto o de Toxina Clostridial formulado.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la muestra comprende un producto de Toxina Clostridial formulado.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el producto de Toxina Clostridial formulado es un producto de BoNT/A formulado.

25. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la muestra es un alimento crudo, un alimento parcialmente cocinado o procesado, un alimento cocinado o procesado, una bebida, un alimento animal, una muestra de suelo, una muestra de agua, o un sedimento de estanque.