JP6630717B2 - 組織試料における切断ｓｎａｐ２５の検出方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月７日に出願の米国仮出願第６２／０２１，３７９号、２０１５年５月８日に出願の米国仮出願第６２／１５８，９００号、及び２０１５年５月１９日に出願の米国仮出願第６２／１６３，８２９号の優先権を主張し、これらすべては全体が参照によって組み込まれる。

本開示は、組織試料おける、ボツリヌス神経毒素切断ＳＮＡＰ２５などの、切断ＳＮＡＰ２５を検出するための方法及び組成物に関する。本発明は、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ）によるＳＮＡＰ２５切断産物を含む、切断ＳＮＡＰ２５に対して結合する抗体をさらに提供する。

Ａ型ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）の治療的有用性は、過去数十年間にわたって大幅に拡大し、Ａｌｌｅｒｇａｎの製品であるオナボツリヌス毒素Ａは、現時点で、１１の主要な治療的効能及び美容的効能に関して世界的に承認されており、これには、様々な神経筋障害（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｃａｓｔａｎｅｄａ，Ｊ．ａｎｄ Ｊａｎｋｏｖｉｃ，Ｊ．，（２０１４）．“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｆｆｉｃａｃｙ，ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｉｎ ｄｙｓｔｏｎｉａ： ａ ２０−ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．” Ｔｏｘｉｃｏｎ ９０，３４４−３４８．、Ｙａｂｌｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｂｒｉｎ，Ｍ．Ｆ．，ＶａｎＤｅｎｂｕｒｇｈ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈｏｕ，Ｊ．，Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ−Ｒｕｆｆａｌｏ，Ｓ．Ｍ．，Ａｂｕ−Ｓｈａｋｒａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｂｅｄｄｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｆ．Ｃ．，ＩＩＩ（２０１１）．“Ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ ｏｎａｂｏｔｕｌｉｎｕｍｔｏｘｉｎＡ ｆｏｒ ｐｏｓｔ−ｓｔｒｏｋｅ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ： ａ ｐｏｏｌｅｄ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ．” Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ．２６，２０９−２１５．）、平滑筋及び自律神経の障害（Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ，Ｐ．ａｎｄ Ｔｒａｖｉｓ，Ｍ．，（２０１４）．“Ｏｎａｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ Ａ： ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｅｔｒｕｓｏｒ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ．” Ｕｒｏｌ．Ｎｕｒｓ．３４，１６５−１７１．、Ｇｒｕｎｆｅｌｄ，Ａ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｌｉｓｈ，Ｎ．，（２００９）．“Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ．” Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０，８７−１０２．）の治療、ならびに侵害受容性疼痛症候群（Ａｏｋｉ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．，（２０１１）．“Ｕｐｄａｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ Ａ．” Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．Ｒｅｌａｔ Ｄｉｓｏｒｄ．１７ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ２８−Ｓ３３．、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｖｙ，Ｄ．，Ａｏｋｉ，Ｋ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂｒｉｎ，Ｍ．Ｆ．，（２０１４）．“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｅａｌ ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ ｂｙ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ： ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｉｇｒａｉｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐａｉｎｓ．” Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ ３４，８５３−８６９．）の治療が含まれる。

シナプス前神経終末でのＢｏＮＴ／Ａの一般的な作用機構（ＭｏＡ）は、十分に確立されているが（Ｍｏｎｔａｌ，Ｍ．，（２０１０）．“Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ： ａ ｍａｒｖｅｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ．” Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９，５９１−６１７．）、細胞内輸送パターン及び毒素の一般的な「ライフサイクル」に関する未解決の疑問が依然として数多く存在する。こうした疑問の解決は部分的に、細胞内における毒素の位置、分布、及び移動を正確に検出する能力に依存する。抗体を使用するＢｏＮＴ／Ａの直接的検出は、その効力が高く、それ故に神経細胞内の濃度が極めて低くなるため、困難である。ＢｏＮＴ／Ａの存在を検出するための代替手段は、切断ＳＮＡＰ２５産物（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）に対する免疫染色によりその酵素活性を追跡することである。市販抗体及び専有抗体のいずれも、全長ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₂₀₆）またはＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）の発現を追跡するために使用されてきた。しかしながら、抗体を使用して、またはインタクトなＳＮＡＰ２５タンパク質を認識することなく、ＢｏＮＴ／Ａ切断後に生成されるＳＮＡＰ２５₁₉₇の末端エピトープを特異的に標的とすることは困難なことである（Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．，（１９９９）．“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｄｅｌｉｎｅａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．” Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５２，１１−１８．）。結果的に、免疫染色結果は誤解を招きやすいが、ある抗体はアッセイ依存のものである一方で、他の抗体は組織特異的なものである。それ故に、任意の組織型で、かつＢｏＮＴ／Ａへの曝露後に実施する複数のアッセイで、ＳＮＡＰ２５₁₉₇を同定することができる、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対する非常に選択的な抗体が必要とされている。

本開示は、様々な異なるアッセイにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５を含むボツリヌス毒素切断ＳＮＡＰ２５、及び位置「１９７」でＳＮＡＰ２５を切断する任意の他のＢｏＮＴ／Ａ関連化合物を検出するための方法及び組成物を提供することによって、こうした問題に対処するものであり、当該アッセイとして、限定はされないが、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する、高度に特異的な組換えモノクローナル抗体（ｒＭＡｂ）を使用する免疫組織化学などが含まれる。こうした抗体は、限定はされないが、ヒトなどの異なる種に由来する様々な組織におけるＳＮＡＰ２５₁₉₇の検出に使用することができる。また、こうした抗体は、限定はされないが、オナボツリヌス毒素Ａなどの神経毒素で処理されたヒトに由来する組織における活性及び効力を診断するためのツールとしても使用することができる。

本発明は、抗ＳＮＡＰ２５抗体を包含し、当該抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対して優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、ボツリヌス毒素血清型Ａの酵素（軽鎖）活性を有する組換えボツリヌス毒素によって切断されているＳＮＡＰ２５に対して優先的に結合する。他の実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、全長または未切断ＳＮＡＰ２５に対して結合しない。

他の実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、組織において、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（またはボツリヌス毒素血清型Ａの酵素（軽鎖）活性を有する組換えボツリヌス毒素によって切断されたＳＮＡＰ２５）を検出することが可能である。いくつかの実施形態では、組織は、生検試料である。他の実施形態では、組織は、皮膚をパンチしたものである。

いくつかの実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号１または配列番号２の軽鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号３または配列番号４の重鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号５または配列番号６の軽鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。他の実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号７または配列番号８の重鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。他の実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号１〜８の配列を１つまたは複数含む重鎖及び／または軽鎖を有する抗体の同一のエピトープに対して結合する抗体である。

本発明はまた、ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性に対して組織が曝露されているかどうかを診断する方法も包含し、当該方法は、ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性に対して曝露されている疑いがある組織試料と抗ＳＮＡＰ２５抗体とを接触させることであって、抗体が、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対して優先的に結合する、接触させることと、抗ＳＮＡＰ２５抗体が組織試料に対して結合したかどうかを検出することであって、組織試料に対して結合している抗ＳＮＡＰ２５抗体の存在が、組織試料がＢｏＮＴ／Ａの酵素活性に対して曝露されていることを示す検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性は、天然のＢｏＮＴ／Ａに由来する。他の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性は、ボツリヌス毒素血清型Ａの酵素（軽鎖）活性を有する組換えボツリヌス毒素に由来する。いくつかの実施形態では、本方法で使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号１または配列番号２の軽鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の実施形態では、本方法で使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号３または配列番号４の重鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の実施形態では、本方法で使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号５または配列番号６の軽鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。他の実施形態では、本方法で使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号７または配列番号８の重鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。他の実施形態では、本方法で使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号１〜８の配列を１つまたは複数含む重鎖及び／または軽鎖を有する抗体の同一のエピトープに対して結合する抗体である。

別の態様では、本発明は、ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性に対して組織が曝露されているかどうかを診断するキットを包含し、当該キットは、抗ＳＮＡＰ２５抗体を含み、当該抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対して優先的に結合する。いくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性は、天然のＢｏＮＴ／Ａに由来する。他の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａの活性は、ボツリヌス毒素血清型Ａの酵素（軽鎖）活性を有する組換えボツリヌス毒素に由来する。いくつかの実施形態では、本キットで使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号１または配列番号２の軽鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の実施形態では、本キットで使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号３または配列番号４の重鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の実施形態では、本キットで使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号５または配列番号６の軽鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。他の実施形態では、本キットで使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号７または配列番号８の重鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。他の実施形態では、本キットで使用される抗ＳＮＡＰ２５抗体は、配列番号１〜８の配列を１つまたは複数含む重鎖及び／または軽鎖を有する抗体の同一のエピトープに対して結合する抗体である。

ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対するヒト化組換えモノクローナル抗体及びマウス組換えモノクローナル抗体の推定エピトープの図表示を示す。本図は、元のモノクローナル抗体の生成に使用したＮ末端システイン残基（キーホールリンペットヘモシアニンへのコンジュゲートに使用される）を除いた１２残基ペプチドを示す。 濃度が３ｎＭの（Ｌ₃）ＢｏＮＴ／Ａを使用して、または（Ｌ₂）ＢｏＮＴ／Ａを使用せずに処理されたラット胚性皮質細胞可溶化液中の全長ＳＮＡＰ２５₂₀₆及び切断ＳＮＡＰ２５₁₉₇を検出するための、異なる抗体の特異性を比較するウエスタンブロット解析を示す。（Ａ）は、ＳＮＡＰ２５の全長（２０６）形態及び切断（１９７）形態の双方を認識する市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたブロットである。レーン２では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆のみが検出される一方、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₉₇（矢頭）の双方が検出されている。（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₂₀₆及びＳＮＡＰ２５₁₉₇の双方を認識すると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブされたブロットである。レーン３において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇のみが、単一バンド（矢頭）として出現する。（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に特異的であると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブされたブロットである。この抗体は、レーン３において、細いかすかなＳＮＡＰ２５₁₉₇バンドを認識する。（Ｄ）は、Ａｂ６３２抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｅ）は、Ａｂ６３５抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｆ）は、ＲＧＴ−１０９２抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｐＡｂでプローブされたブロットである。この抗体は、レーン３において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇（矢頭）を主に認識しているが、ＳＮＡＰ２５₁₉₇バンドの直上及び直下に２つかすかなバンドが確認することができる。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理の皮質細胞可溶化液であり、レーン３はＢｏＮＴ／Ａで処理した（３ｎＭ）皮質細胞可溶化液である。 濃度が３ｎＭの（Ｌ₃）ＢｏＮＴ／Ａを使用して、または（Ｌ₂）ＢｏＮＴ／Ａを使用せずに処理されたＳｉＭａ細胞可溶化液中の全長ＳＮＡＰ２５₂₀₆及び切断ＳＮＡＰ２５₁₉₇を検出するための、異なる抗体の特異性を比較するウエスタンブロット解析を示す。（Ａ）は、ＳＮＡＰ２５の全長（２０６）形態及び切断（１９７）形態の双方を認識する市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたブロットである。レーン２では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆のみが検出される一方で、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₉₇（矢頭）の双方が検出されている。（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₂₀₆及びＳＮＡＰ２５₁₉₇の双方を認識すると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブされたブロットである。レーン３において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇のみが、単一バンド（矢頭）として出現する。（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に特異的であると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブされたブロットである。抗体は、いずれのバンドも認識していないと考えられる。（Ｄ）は、Ａｂ６３２抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｅ）は、Ａｂ６３５抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｒＭＡｂでブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｆ）は、ＲＧＴ−１０９２抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｐＡｂでプローブされたブロットである。この抗体は、レーン３において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇（矢頭）を主に認識するが、ＳＮＡＰ２５₁₉₇のバンドの直上及び直下に２つのかすかなバンドを確認することができる。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理のＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン３は、ＢｏＮＴ／Ａで処理した（０．０１ｎＭ）ＳｉＭａ細胞可溶化液である。 図４Ａ、Ｂは、抗ＧＡＰＤＨｍＡｂでプローブされた、図２の皮質細胞試験及び図３のＳｉＭａ細胞試験の対照ウエスタンブロット解析を示し、レーン２及びレーン３において試料が等しく負荷されていることを示している。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理の細胞可溶化液であり、レーン３はＢｏＮＴ／Ａで処理した（３ｎＭ）皮質細胞可溶化液及び（０．０１ｎＭ）ＳｉＭａ細胞可溶化液である。図４Ｃ、Ｄは、ウエスタンブロット解析を示し、ＢｏＮＴ／Ａ（Ｌ₃）、ＢｏＮＴ／Ｃ（Ｌ₄）、ＢｏＮＴ／Ｅ（Ｌ₅）を使用して、または毒素（Ｌ₂）を使用せずに処理したＳｉＭａ細胞可溶化液を使用して、Ａｂ６３２−ｒＭＡｂのエピトープ特異性を示している。（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５の全長（２０６）形態ならびに切断（ＢｏＮＴ／Ａでは１９７、ＢｏＮＴ／Ｃでは１９８、ＢｏＮＴ／Ｅでは１８０）形態の双方を認識する市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたブロットである。レーン２では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆のみが検出されている一方で、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₉₇の双方が検出される。レーン４では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₉₈の双方が検出されており、レーン５では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₈₀の双方が検出されている。（Ｄ）は、Ａｂ６３２抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２、４、及び５では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇の単一バンドが検出されている。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理のＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン３はＢｏＮＴ／Ａで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン４はＢｏＮＴ／Ｃで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン５はＢｏＮＴ／Ｅで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液である。 オナボツリヌス毒素Ａ（１０Ｕ／ｋｇ）またはビヒクルいずれかで処理した後のラット膀胱の切片における、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｅ）は、オナボツリヌス毒素Ａが注射された膀胱排尿筋（ＤＭ）の共焦点画像であり、（Ａ）は、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販のｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブしたものであり、（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇及びＳＮＡＰ２５₂₀₆に対して第２の市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブしたものであり、（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブしたものであり、（Ｄ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｅ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＲＧＴ−１０９２ｐＡｂでプローブしたものである。（Ｆ〜Ｊ）は、ビヒクルが注射された対照ラット膀胱の共焦点画像であり、同一の５つの抗体でプローブされたものである。矢印（Ｆ及びＪ）は、ビヒクルで処理したラット膀胱に由来する神経線維内のＩＲ−シグナルを指している。ＤＭは排尿筋、スケールバー＝５０μｍである。 オナボツリヌス毒素Ａ（３０Ｕ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれかで処理した後のラット無毛皮膚の切片における、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｅ）は、オナボツリヌス毒素Ａが注射されたラット皮膚の共焦点画像であり、（Ａ）は、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販のｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブしたものであり、（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇及びＳＮＡＰ２５₂₀₆に対して第２の市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブしたものであり、（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販のｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブしたものであり、（Ｄ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｅ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＲＧＴ−１０９２ｐＡｂでプローブしたものである。（Ｆ〜Ｊ）は、ビヒクルが注射された対照ラット皮膚の共焦点画像であり、同一の５つの抗体でプローブされたものである。矢印（Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＪ）は、ビヒクルで処理したラット皮膚に由来する神経線維内のＩＲ−シグナルを指している。アスタリスク（Ｂ、Ｃ、Ｇ、及びＨ）は、血管腔内の非特異的ＩＲ−シグナルを指している。ＢＶは血管、ＣＴは結合組織、スケールバー＝５０μｍである。 オナボツリヌス毒素Ａ（３０Ｕ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれかで処理した後のラット無毛皮膚下層の骨格筋における、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｄ）は、オナボツリヌス毒素Ａが注射されたラット肢の下層筋肉内の運動神経末端（ＭＮＴ、矢印）を示す共焦点画像であり、（Ａ）は、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販のｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブしたものであり、（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇及びＳＮＡＰ２５₂₀₆に対して第２の市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブしたものであり、（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販のｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブしたものであり、（Ｄ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブしたものである。（Ｅ〜Ｈ）は、ビヒクルが注射された対照ラット肢に由来する共焦点画像であり、同一の４つの抗体でプローブされたものである。ＳＮＡＰ２５−ＩＲシグナルは、緑色であり（白黒の図では、灰色として示される）、下層の筋線維（ＭＦ）を示すために、ＤＩＣイルミネーションを使用した。矢印（Ｅ）は、ビヒクルで処理したラット肢に由来するＭＮＴ内のＩＲ−シグナルを指しており、アスタリスク（Ｂ、Ｃ、Ｆ、及びＧ）は、筋肉内の非特異的ＩＲ−シグナルを指している。スケールバー＝５０μｍである。 ＢＯＴＯＸ（登録商標）またはビヒクルのいずれかで処理した後のラット無毛皮膚（図７Ａ〜図７Ｊ）及びラット膀胱（図７Ｋ〜図７Ｔ）の切片における、様々なＳＮＡＰ２５₁₉₇特異的抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｊ）は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）が注射されたラット皮膚の共焦点画像であり、（Ａ）は、生成ロットがより古い（５／０２／２０１１）ヒト化Ａｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｂ）は、より最近のロットのヒト化Ａｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｃ）は、最近のロットのマウスＡｂ６３５−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｄ）は、Ａｂ５０７ｍＡｂ（１８３８３−ＣＩＰにおける細胞に基づくアッセイに使用されるクローン２Ｅ２Ａ６）でプローブしたものであり、（Ｅ）は、腹水から精製した、元の「非組換え」３Ｃ１Ａ５ｍＡｂでプローブしたものである。（Ｆ〜Ｊ）は、ビヒクルが注射された対照ラット皮膚の共焦点画像であり、同一の５つの抗体でプローブしたものである。矢印（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、血管周囲の神経線維内の特異的免疫反応性シグナルを指している。（Ｋ〜Ｔ）は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）が注射された膀胱平滑筋（ＳＭ）の共焦点画像であり、（Ｋ）は、より古い生成ロット（５／０２／２０１１）のヒト化Ａｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｌ）は、より最近のロットのヒト化Ａｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｍ）は、より最近のロットのマウスＡｂ６３５−ｒＭＡｂでプローブしたものであり、（Ｎ）Ａｂ５０７ｍＡｂ（１８３８３−ＣＩＰにおける細胞に基づくアッセイに使用されるクローン２Ｅ２Ａ６）でプローブしたものであり、（Ｏ）は、腹水から精製した、元の「非組換え」３Ｃ１Ａ５ｍＡｂでプローブしたものである。（Ｐ〜Ｔ）は、ビヒクルが注射された対照ラット膀胱の共焦点画像であり、同一の５つの抗体でプローブしたものである。矢印（Ｋ、Ｌ、Ｍ、及びＯ）は、膀胱平滑筋内の神経線維における特異的免疫反応性シグナルを指している。ＢＶは血管であり、ＣＴは結合組織であり、ＳＭは、排尿筋（ｄｅｔｒｕｓｏｒ ｍｕｓｃｌｅ）である。スケールバー＝５０μｍである。 オナボツリヌス毒素Ａ（１０Ｕ）またはビヒクルのいずれかで処理した後のヒト背中皮膚の切片における、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する市販（ＭＣ−６０５３）ｍＡｂとＡｂ６３５−ｒＭＡｂとの免疫組織化学的な比較を示す。（Ａ、Ｂ）はオナボツリヌス毒素Ａで処理したヒト皮膚における血管の共焦点画像であり、（Ｅ、Ｆ）はビヒクルで処理したヒト皮膚における血管の共焦点画像であり、この血管は、ＭＣ−６０５３ｍＡｂ（Ａ、Ｅ）またはＡｂ６３５−ｒＭＡｂ（Ｂ、Ｆ）のいずれかでプローブされたものである。（Ｃ、Ｄ）はオナボツリヌス毒素Ａで処理したヒト皮膚であり、（Ｇ、Ｈ）はビヒクルで処理したヒト皮膚における汗腺であり、この汗腺は、ＭＣ−６０５３ｍＡｂ（Ｃ、Ｇ）またはＡｂ６３５−ｒＭＡｂ（Ｄ、Ｈ）のいずれかでプローブされたものである。矢印は、ビヒクルで処理したヒト皮膚に由来する神経線維内のＩＲ−シグナルを指している。ＢＶは血管であり、ＣＴは結合組織であり、ＳＧは汗腺であり、スケールバー＝５０μｍである。 （Ａ〜Ｆ）は、異なる形態のＳＮＡＰ２５に対する抗体でプローブされた、ＢｏＮＴ／Ａ（３ｎＭ）またはビヒクルで処理した後根神経節（ＤＲＧ）培養物の共焦点画像を示す。（Ａ〜Ｃ）は、ＢｏＮＴ／Ａに対して３時間曝露したＤＲＧ培養物である。曝露後（Ａ）では、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販（ＳＭＩ−８１Ｒ）ｍＡｂで染色し、（Ｂ）では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販（ＭＣ−６０５３）ｍＡｂで染色し、（Ｃ）では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂで染色した。（Ｄ〜Ｆ）は、ビヒクルに対して曝露した対照ＤＲＧ培養物であり、同一の３つの抗体でプローブしたものである。Ｅの矢頭は、バックグラウンド標識を示している神経細胞体を指している。

Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味を有する。本明細書で使用されるとき、下記の用語は、別段の記載がない限り、それに起因する意味を有する。

「ＢｏＮＴ／Ａ」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって生成されるボツリヌス毒素血清型Ａを指す。

「オナボツリヌス毒素Ａ」は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）の商標名を指し、これは、ＦＤＡによる承認を受けた９００ｋＤａのボツリヌス神経毒素血清型Ａ複合体製剤である。

抗体またはポリペプチドに対して「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）エピトープは、当該技術分野においてよく理解されている用語であり、そのような特異的結合または優先的結合を決定する方法も当該技術分野においてよく知られている。分子は、代替の細胞または物質よりも長い持続期間及び強い親和性を伴って、頻繁に、迅速に、特定の細胞または物質と反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体が、他の物質に対する結合よりも強い親和性、結合力を伴って、迅速に、排他的に、かつ／または長い持続期間結合する場合、抗体は、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。この定義を読み取ることによって、例えば、第１標的に対して特異的または優先的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、第２標的に対して特異的または優先的に結合してもしなくてもよいと理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を（含み得るものの）必ずしも必要とするものではない。一般に本明細書に記載の結合に対する言及は優先的な結合を意味するが、これは必然的ではない。

本明細書で使用される「ＳＮＡＰ２５₁₉₇」は、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ２５）の１９７アミノ酸断片を指し、これは、全長ＳＮＡＰ２５タンパク質がボツリヌス毒素血清型Ａによって切断されるか、またはボツリヌス毒素血清型Ａの酵素（軽鎖）活性を有する組換えボツリヌス毒素によって切断されるときに生成されるものである。

本明細書で使用される「ＳＮＡＰ２５₂₀₆」は、２０６アミノ酸を含む全長ＳＮＡＰ２５タンパク質を指す。

本発明は、具体的に例示される抗体、製剤、またはそのような抗体の使用方法に限定されるものではなく、したがって、変化し得るものであることを理解されたい。本明細書に記載の専門用語は、本発明の特定の実施形態の説明のみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。

ＩＩ．ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して結合する抗体
シナプス小胞糖タンパク質２Ｃ（ＳＶ２Ｃ）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、及びＳＮＡＰ２５₂₀₆を含むＢｏＮＴ／Ａの分子標的は、ラット及び霊長類の膀胱及び無毛皮膚を含む全身にわたる自律神経線維及び感覚神経線維に幅広く発現かつ共局在化している。結果的に、神経終末は、ＢｏＮＴ／Ａの阻害作用に対して等しく感受性である可能性がある。ＢｏＮＴ／Ａの様々な分子標的に対する抗体が存在するが、（例えば、免疫蛍光を使用する）、ウエスタンブロット法及び同様に組織試料中の双方における切断（すなわち、ＢｏＮＴ／Ａ活性）ＳＮＡＰ２５（例えば、ＳＮＡＰ２５₁₉₇断片）の検出に有用である同定された最適な抗体は存在していない。

本開示の態様は、ＢｏＮＴ／ＡによるＳＮＡＰ２５の切断産物に特異的である抗ＳＮＡＰ２５抗体を部分的に含み、当該抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット用途、細胞培養アッセイ、及び組織試料で、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するために使用することができる。本発明の別の態様は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇断片のカルボキシ末端に対するエピトープを有し、全長ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₂₀₆）に対して実質的に結合しない抗ＳＮＡＰ２５抗体である。

抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の作製方法は、当該技術分野において知られている。用いられ得る方法の１つは、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）の方法またはその変更形態である。典型的には、モノクローナル抗体は、マウスなどの非ヒト種において発現する。一般に、マウスまたはラットが免疫化に使用されるが、他の動物を使用してもよい。また、一旦抗体が所望の結合特性を有すると同定されると、ヒトを含む他の種の抗体の定常ドメインまたは支持フレームワーク領域に対して、その相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合部位を融合することができる。いくつかの例では、こうした組換えモノクローナル抗体を生成させることで、こうした抗体が注射される患者または宿主動物における不必要な免疫応答を最小化することができる。他の例では、こうした組換えモノクローナル抗体を生成させることで、診断、または様々な動物種の組織におけるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するための使用を目的として、ある特定の結合特性を有する特異的抗体の有用性を拡大することができる。いくつかの例では、組換えモノクローナル抗体は、ＣＤＲのみならず、組換えＩｇＧ骨格にも起因する選択性により、「非特異的な（ｏｆｆ ｔａｒｇｅｔ）」シグナルを最小化する利点を有し得るものであり、これは、対象組織の内在性ＩｇＧとは大きく異なり得る。

抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体は、米国特許公開第ＵＳ２０１２／０２２５４３６Ａ１号において生成かつ説明されており、当該文献は、参照によって本明細書中に組み込まれる。こうしたモノクローナル抗体の１つであり、免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイにおける能力が優れているために選択されたモノクローナル抗体のＣＤＲの配列を決定し、ヒト（ＩｇＧ１）起源またはマウス（ＩｇＧ２Ａ）起源のいずれかである免疫グロブリン骨格へと組換え操作した。こうした抗体を、免疫蛍光を使用するウエスタンブロットアッセイ及び組織試料（ラット組織またはヒト組織のいずれか）の双方において、切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）に対するその特異性について、市販抗体と共にさらに特徴付けた。以下の表１は、この比較に使用した抗ＳＮＡＰ２５の一覧を含むものである。
ｎ／ａ＝入手不能、ｍＡｂ＝マウスモノクローナル抗体、ｒＭＡｂ＝組換えモノクローナル抗体、ｐＡｂ＝ウサギポリクローナル抗体

ＩＩＩ．抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体の特徴付け
抗ＳＮＡＰ２５抗体の特徴付けにいくつかの方法を使用することができる。１つの方法は、それが結合するエピトープを同定することである。エピトープマッピングは、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５，８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）といった様々な供給源から市販されているものである。エピトープマッピングは、抗ＳＮＡＰ２５抗体が結合する配列の決定に使用することができる。エピトープは、直鎖状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一区間に含まれているものであり得るか、または必ずしも単一区画に含まれ得るわけではないアミノ酸の３次元的相互作用によって形成された立体構造エピトープであり得る。可変長のペプチド（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸長）を単離または合成することができ（例えば、組換えによって）、抗ＳＮＡＰ２５抗体との結合アッセイに使用することができる。抗ＳＮＡＰ２５抗体が結合するエピトープは、細胞外配列から得られた重複ペプチドを使用し、かつ抗ＳＮＡＰ２５抗体による結合を決定することによって、系統的スクリーニングで決定することができる。

抗ＳＮＡＰ２５抗体の特徴付けに使用することができる別の方法は、同一抗原、または同一抗原上の同一エピトープにさえ結合する他の抗体との競合アッセイを使用することである。競合アッセイは、当業者によく知られているものである。

抗ＳＮＡＰ２５抗体を特徴付ける別の方法は、それが結合する抗原によるものである。抗ＳＮＡＰ２５抗体は、ウエスタンブロットにおいて使用することができる。具体的には、いくつかの実施形態では、ウエスタンブロットアッセイで抗ＳＮＡＰ２５抗体を使用して、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）に対するその特異性を決定した。ウエスタンブロットアッセイにおいて、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して優先的に結合し、全長（すなわち、未切断）ＳＮＡＰ２５に対しては結合しない抗ＳＮＡＰ２５抗体が本開示の好ましい実施形態である。ウエスタンブロットアッセイにおける抗ＳＮＡＰ２５抗体の特徴付けは、以下の実施例において詳述されている。

ＩＶ．組織試料におけるＢｏＮＴ／Ａ活性の診断方法
様々な組織におけるＢｏＮＴ／Ａ活性の有無の特定に、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）に対して結合する抗体を使用してよい。そのような組織には、無毛または有毛を含むがそれらに限定されない皮膚と、骨格筋及び平滑筋を含むがそれらに限定されない筋肉と、膀胱と、前立腺、涙腺、内分泌腺、及び外分泌腺を含むがそれらに限定されない腺組織と、血管と、脊髄と、脳と、こうした組織のいずれか及びすべての内部の神経線維と、が含まれ得る。そのような組織は、生検または皮膚をパンチしたものの一部として得てよい。

組織におけるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するための使用に適した抗体は、（１）ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する結合に特異的であり、全長または未切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₂₀₆）に対する結合には特異的ではなく、（２）組織試料においてＳＮＡＰ２５₁₉₇を優先的に検出することができる（かつ全長または未切断ＳＮＡＰ２５は検出しない）必要がある。望ましい別の特性は、組織試料において、抗体が非特異的抗原に対して実質的に結合することなく（すなわち、バックグラウンド、非特異的結合が低いか、または存在しない）、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）に対して優先的に結合することである。

特定の組織試料においてＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ａ様化合物の活性の有無を決定することは、１）特定の組織または臨床効能におけるＢｏＮＴ／Ａの作用機構の理解、２）ＢｏＮＴ／Ａの活性及び／または注射部位を超えた伝播の評価、３）ＢｏＮＴ／Ａに対する疑わしい免疫の評価、４）ＢｏＮＴ／Ａの局所的な拡散（例えば、注射した筋肉から隣接する筋肉または組織へのもの）の評価及び理解、５）ヒトボツリヌス中毒の状況において、生検によって実施される、ＢｏＮＴ／Ａに対する曝露の可能性の評価、ならびに６）臨床薬理学的試験を含むがそれに限定されない様々な臨床診断目的及び非臨床診断目的で重要であり得る。

１つの実施形態では、使用には、ＳＮＡＰ２５₁₉₇と、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して特異的に結合する抗体との間の複合体形成が伴い得る。本発明の診断方法の１つの実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体は、検出可能な標識を有し得る。使用可能である標識の例には、放射性物質、蛍光色素分子、化学標識、限定はされないが、ビオチン／ストレプトアビジン検出、または酵素基質標識などの生物学的物質が含まれ得る。他の実施形態では、検出可能な標識を有し得る別の種の二次抗体を使用して、抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体を検出することができる。場合によっては、二次抗体を使用することで、一次抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体のシグナルが増強され、それによって、組織試料における低い／より低いレベルのＢｏＮＴ／Ａ活性が検出される。

Ｖ．本発明の組成物
本発明は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットアッセイ、及び組織試料において、未切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₂₀₆）を検出することなく、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５を優先的に検出することができる抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体を含む組成物も包含する。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体は、ＣＤＲが異なる種の抗体の支持フレームワークと融合している組換えモノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体は、ＣＤＲが同一種の抗体の支持フレームワークと融合している組換えモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体は、ＣＤＲがヒト抗体の支持フレームワークと融合している組換えモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体は、ＣＤＲがマウス抗体の支持フレームワークと融合している組換えモノクローナル抗体である。

以前ＵＳ２０１２／０２２５４３６において予備的に説明された１つの抗体である３Ｃ１Ａ５が、本発明において特に有用であることが明らかとなり、これは、当該抗体が、ＢｏＮＴ／Ａで処理した組織において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇を検出する固有の能力を有しているためである。３Ｃ１Ａ５は、免疫に基づく（例えば、ＥＬＩＳＡ）アッセイ及び／または細胞に基づくアッセイにおいて、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して優先的に結合することが知られていた。図１は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する、３Ｃ１Ａ５抗体の推定エピトープ結合部位を描写したものを示す。実施例において詳細に説明されるように、この抗体（及びその組換えヒト及びマウスバージョン）はまた、ウエスタンブロットアッセイにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）を優先的に検出した（またはそれに対して結合した）。また、驚くべきことに、この抗体（及びその組換えヒト及びマウスバージョン）は、ラット及びヒト組織試料において、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）を優先的に検出する（またはそれに対して結合する）ことが可能であった。抗切断ＳＮＡＰ２５抗体は、ウエスタンブロットアッセイ及び組織試料において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇を優先的に検出する（またはそれに対して結合する）ことが可能であるという報告が存在するものの、実施例において詳細に示すように、３Ｃ１Ａ５（またはその組換えヒト及びマウスバージョン）は、すべてのアッセイ及び異なる組織で、ＳＮＡＰ２５₁₉₇を一貫して検出し、かつ他のエピトープに対する非特異的結合を示さなかった唯一の抗体であった。

いくつかの場合では、本発明の抗体は３Ｃ１Ａ５である。他の場合では、本発明の抗体は、３Ｃ１Ａ５の抗原結合部位を含む組換え抗体であるが、同一または異なる種に由来する別の抗体のフレームワーク領域と融合しているものである。

１つの実施形態では、抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体の軽鎖／重鎖は、以下の表２に示す配列を１つまたは複数含む。

いくつかの場合では、本発明の抗体は、配列番号１または配列番号２の軽鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の場合では、本発明の抗体は、配列番号３または配列番号４の重鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である。他の場合では、本発明の抗体は、配列番号５または配列番号６の軽鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。他の場合では、本発明の抗体は、配列番号７または配列番号８の重鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である。

さらに他の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１〜８の配列を１つまたは複数含む重鎖及び／または軽鎖を有する抗体の同一のエピトープに対して結合する抗体であり得る。いくつかの場合、本発明の抗体は、配列番号１〜８の配列を１つまたは複数含む重鎖及び／または軽鎖を有する抗体の同一のエピトープに対する結合で競合することになる抗体であり得る。

下記の実施例は例示のために提供されるが、本発明を限定するものではない。

ＩＶ．実施例
実施例１．ウエスタンブロット比較
ＢｏＮＴ／Ａを使用してまたは使用せずに処理したラット胚性皮質細胞可溶化液及びＳｉＭａ細胞可溶化液の全長（２０６）形態またはＢｏＮＴ／Ａ切断（１９７）形態のＳＮＡＰ２５をＳＮＡＰ２５抗体（表１に示すもの）が認識する能力について、最初にウエスタンブロット解析によって比較した（図２及び図３を参照のこと）。

ラット皮質神経細胞は、胎仔（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐｕｐ）（Ｅ１８）から採取し、パパイン解離システム（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）において、３７℃で１５分間消化させることで、個々の細胞を得た。その後、Ｂ−２７サプリメント、０．５ｍＭのＬ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へと皮質細胞を移した。ラット後根神経節（ＤＲＧ）は、新生仔（ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｕｐ）（Ｐ７−Ｐ１４）から採取してプールし、パパイン含有ＨＢＳＳ（１ｍｌ当たり最終濃度の２０ユニットのパパインを含む１ｍＭのＬ−システイン）中、３７℃で１５分間消化させた。神経節を洗浄した後、１型コラゲナーゼ（１．７ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＣａ２＋／Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅ ＨＢＳＳ中で消化し、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。その後、Ｂ−２７サプリメント、０．５ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２０ｎｇ／ｍｌの２．５Ｓ神経成長因子（ＮＧＦ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で神経節を洗浄してから、パスツールピペットにより穏徐に粉砕した。皮質細胞及びＤＲＧ細胞を均一に分散させて、１００ｍｍの培養皿内に配置した１２ｍｍのポリ−Ｄ−リジン／ラミニン被覆カバーガラス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上へと播種し、処理を実施する前にインビトロで６〜７日増殖させた。動物のプロトコール及び手順はすべて、Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたものであり、ＮＩＨガイドラインに従って実施した。

選択日に、３ｎＭのＢｏＮＴ／Ａ（１５０ｋＤａ、Ｍｅｔａｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してまたは使用せずに、３７℃で３時間培養物を処理した。処理の後、細胞を洗浄してから、新鮮培養培地で一晩インキュベートした。その後、皮質細胞は、ＰＢＳで洗浄し、氷上で、新たに調製した溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、１ｎＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％トリトンＸ−１００、及びＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤の錠剤１錠）中に、２０分間溶解させた後、ウエスタンブロット（ＷＢ）解析の前に、４０００ｒｐｍで２０分間遠心してデブリを除去した。ＤＲＧ細胞は、洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで１０〜１５分間固定化して、後述のプロトコールに従って免疫細胞化学のために処理した。

ＳｉＭａ細胞（ＤＳＭＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの商品であるＣｏｌｌａｇｅｎ ＩＶフラスコ（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）中で通気式キャップを使用して培養した（Ｍａｒｉｎｉ，Ｐ．，ＭａｃＬｅｏｄ，Ｒ．Ａ．，Ｔｒｅｕｎｅｒ，Ｃ．，Ｂｒｕｃｈｅｌｔ，Ｇ．，Ｂｏｈｍ，Ｗ．，Ｗｏｌｂｕｒｇ，Ｈ．，Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇｉｒｇｅｒｔ，Ｒ．，１９９９．ＳｉＭａ，ａ ｎｅｗ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．１１２，１６１−１６４．）。増殖培地は、ＲＰＭＩ１６４０、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％のウシ胎仔血清からなるものであった。ＢｏＮＴ／Ａ（０．０１ｎＭ）を使用してまたは使用せずに、細胞を３７℃で２４時間処理した。処理の後、ＰＢＳでＳｉＭａ細胞を洗浄し、氷上で新たに調製した溶解緩衝液中に２０分間溶解させた後、ＷＢ解析の前に、４０００ｒｐｍで２０分遠心してデブリを除去した。

ＷＢアッセイでは、ラット胚性皮質神経細胞及びヒト神経芽細胞腫細胞株（ＳｉＭａ）を用いた。ヒト神経芽細胞腫細胞株（ＳｉＭａ）は、ＢｏＮＴ／Ａ媒介ＳＮＡＰ２５切断に対して感受性であることが知られている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｙ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｊａｃｋｙ，Ｂ．Ｐ．，ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｋ．Ｒ．，２０１２．Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｓｓａｙ ｔｏ ｒｅｐｌａｃｅ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｉｏａｓｓａｙ．ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．７，ｅ４９５１６．）。こうした培養物に由来する全細胞可溶化液を電気泳動（Ｂｉｏｒａｄ ＴＧＸ Ａｎｙ Ｋｄゲル）によって分離し、ゲルをＰＶＤＦ膜上へと転写した。緩衝液（５％の粉乳を含む１Ｘ ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、室温でブロットを１時間ブロックした後、ブロッキング緩衝液中、４℃で一次抗体を使用してインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でブロットをインキュベートし、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）によって発生させた。グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して、別々の対照ブロットをプローブして、細胞可溶化液試料が等しく負荷されていることを示した。可変モードＧＥ Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０撮像装置を使用してウエスタンブロットをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ．２００５ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して解析した。

市販されて幅広く使用されている、すべての形態のＳＮＡＰ２５タンパクを対象とする第１のモノクローナル抗体（ＳＭＩ−８１Ｒ）は、ＳＮＡＰ２５₂₀₆及びＳＮＡＰ２５₁₉₇の双方を認識した（図２Ａ）。対照的に、両形態のＳＮＡＰ２５を認識するものとして説明される第２の市販モノクローナル抗体（ＭＣ−６０５０）は、驚くべきことに、毒素で処理した細胞に由来する可溶化液中のＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して特異的であった（図２Ｂ）。さらに、同一の会社から入手し、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５のみを認識するものとして説明される別の抗体（ＭＣ−６０５３）は、毒素処理のレーンにおいて、細く、かすかなバンドを排他的に示した（図２Ｃ）。

ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５を対象とするヒト（Ａｂ６３２）及びマウス（Ａｂ６３５）ｒＭＡｂは、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して非常に特異的であり、毒素処理した可溶化液において単一バンドのみを検出したが、未処理の対照レーンにおいては、バンドは検出されなかった（図２Ｄ、図２Ｅ）。同様に、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する社内のウサギｐＡｂ（ＲＧＴ−１０９２）は、ＢｏＮＴ／Ａで処理した試料において１つのバンドのみを検出したが、対照レーンにおいては、バンドは検出されなかった（図２Ｆ）。しかしながら、ｐＡｂは、２つのかすかなバンド（１つはＳＮＡＰ２５₁₉₇のバンド直上のもの、もう１つは約２０ｋＤａで毒素処理した試料中にのみ存在するもの）をさらに認識していることが認められたが、このことは容易に説明することができなかった。それにもかかわらず、未処理レーンにおいてバンドが観測されなかったため、上のバンドがインタクトなＳＮＡＰ２５である可能性は低い。ＢｏＮＴ／Ａで処理された及び処理されていないＳｉＭａ細胞培養物に由来する可溶化液を使用して類似のＷＢ結果が得られたが（図３）、但しＭＣ−６０５３では、対照レーンまたは毒素処理のレーンのいずれにおいてもバンドは観測されなかった（図３Ｃ）。ＧＡＰＤＨに対してプローブされた対照ブロットによって、皮質細胞可溶化液実験、及びＳｉＭａ細胞可溶化液実験の双方で、すべての試料が等しく負荷されていることが示された（図４Ａ、図４Ｂ）。

別々のＷＢ分析を実施し、ＢｏＮＴ／Ｃで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液、及びＢｏＮＴ／Ｅで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液を使用してＢｏＮＴ／Ａで処理した可溶化液と比較することにより、ｒＭＡｂのエピトープ特異性を調査した。ＢｏＮＴ／Ｃが、アミノ酸（ａａ）残基１９８でＳＮＡＰ２５を切断する一方で、ＢｏＮＴ／Ｅは、ａａ残基１８０でＳＮＡＰ２５を切断することが認められている［１１］。ＳＭＩ−８１ＲｍＡｂは、全長形態及びＢｏＮＴ切断形態のＳＮＡＰ２５のいずれも認識したが（図４Ｃ）、ヒトｒＭＡｂは、予想通り、ＢｏＮＴ／Ａで処理した可溶化液試料のみにおいて単一バンドを検出した（図４Ｄ）。

図２は、（Ｌ３）ＢｏＮＴ／Ａを使用して、または（Ｌ２）ＢｏＮＴ／Ａを使用せずに処理したラット胚性皮質神経細胞可溶化液を使用して、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較するＷＢ解析を示す。（Ａ）は、ＳＮＡＰ２５の全長（２０６）形態及び切断（１９７）形態の双方を認識する市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたブロットである。レーン２では、ＳＮＡＰ２５２０６のみが検出されているが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５２０６（矢印）及びＳＮＡＰ２５１９７（矢頭）の双方が検出されている。（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５２０６及びＳＮＡＰ２５１９７の双方を認識すると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブされたブロットである。レーン３において、ＳＮＡＰ２５１９７のみが、単一バンド（矢頭）として出現する。（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５１９７に特異的であると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブされたブロットである。この抗体は、レーン３において、細くかすかなＳＮＡＰ２５１９７バンドを認識している。（Ｄ）は、Ａｂ６３２抗ＳＮＡＰ２５１９７ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５１９７の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｅ）は、Ａｂ６３５抗ＳＮＡＰ２５１９７ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５１９７の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｆ）は、ＲＧＴ−１０９２抗ＳＮＡＰ２５１９７ｐＡｂでプローブされたブロットである。この抗体は、レーン３において、ＳＮＡＰ２５１９７（矢頭）を主に認識しているが、ＳＮＡＰ２５１９７のバンドの直上及び直下に２つのかすかなバンドを確認することができる。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理の皮質細胞可溶化液であり、レーン３はＢｏＮＴ／Ａで処理された（３ｎＭ）皮質細胞可溶化液である。

図３は、（Ｌ３）ＢｏＮＴ／Ａを使用してまたは（Ｌ２）ＢｏＮＴ／Ａを使用せずに処理したＳｉＭａ細胞可溶化液を使用して、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較するＷＢ解析を示す。（Ａ）は、ＳＮＡＰ２５の全長（２０６）形態及び切断（１９７）形態の双方を認識する市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたブロットである。レーン２では、ＳＮＡＰ２５２０６のみが検出されているが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５２０６（矢印）及びＳＮＡＰ２５１９７（矢頭）の双方が検出されている。（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５２０６及びＳＮＡＰ２５１９７の双方を認識すると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブされたブロットである。レーン３において、ＳＮＡＰ２５１９７のみが、単一バンド（矢じり）として出現する。（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５１９７に特異的であると報告されている市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブされたブロットである。抗体は、いずれのバンドも認識していないと考えられる。（Ｄ）は、Ａｂ６３２抗ＳＮＡＰ２５１９７ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５１９７の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｅ）は、Ａｂ６３５抗ＳＮＡＰ２５１９７ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５１９７の単一バンド（矢頭）が検出されている。（Ｆ）は、ＲＧＴ−１０９２抗ＳＮＡＰ２５１９７ｐＡｂでプローブされたブロットである。この抗体は、レーン３において、ＳＮＡＰ２５１９７（矢頭）を主に認識しているが、ＳＮＡＰ２５１９７のバンドの直上及び直下に２つのかすかなバンドを確認することができる。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理のＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン３はＢｏＮＴ／Ａで処理された（０．０１ｎＭ）ＳｉＭａ細胞可溶化液である。

図４（Ａ、Ｂ）は、抗ＧＡＰＤＨｍＡｂでプローブされた、図２の皮質細胞試験及び図３のＳｉＭａ細胞試験の対照ブロットを示し、レーン２及びレーン３において試料が等しく負荷されていることを示している。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理の細胞可溶化液であり、レーン３はＢｏＮＴ／Ａで処理された（３ｎＭ）皮質細胞可溶化液、及びＢｏＮＴ／Ａで処理された（０．０１ｎＭ）ＳｉＭａ細胞可溶化液である。図４（Ｃ、Ｄ）は、ＢｏＮＴ／Ａ（Ｌ₃）、ＢｏＮＴ／Ｃ（Ｌ₄）、ＢｏＮＴ／Ｅ（Ｌ₅）を使用して、または毒素（Ｌ₂）を使用せずに処理したＳｉＭａ細胞可溶化液を使用して、Ａｂ６３２−ｒＭＡｂのエピトープ特異性を示すウエスタンブロット解析を示す。（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５の全長（２０６）形態及び切断（ＢｏＮＴ／Ａでは１９７、ＢｏＮＴ／Ｃでは１９８、ＢｏＮＴ／Ｅでは１８０）形態の双方を認識する市販の抗ＳＮＡＰ２５ｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたブロットである。レーン２では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆のみが検出されている一方で、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₉₇の双方が検出されている。レーン４では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₉₈の双方が検出されており、レーン５では、ＳＮＡＰ２５₂₀₆（矢印）及びＳＮＡＰ２５₁₈₀の双方が検出されている。（Ｄ）は、Ａｂ６３２抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｒＭＡｂでプローブされたブロットである。レーン２、レーン４、及びレーン５では、バンドは検出されていないが、レーン３では、ＳＮＡＰ２５₁₉₇の単一バンドが検出されている。レーン１はタンパク質ラダーであり、レーン２は未処理のＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン３はＢｏＮＴ／Ａで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン４はＢｏＮＴ／Ｃで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液であり、レーン５はＢｏＮＴ／Ｅで処理したＳｉＭａ細胞可溶化液である。

実施例２．免疫組織化学的な比較−ラット組織
オナボツリヌス毒素Ａまたは生理食塩水のいずれかで処理した後、注射の２日後に採取したラット膀胱及び無毛皮膚において、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、抗体の特異性を試験した。こうしたＩＨＣ試験を通じて、一次抗体を使用せずに処理した隣接切片では、バックグラウンドのみ染色されることが示された（データ未掲載）。

雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの試験に使用した。ラットは、ＲＤ３ビバリウムに対で収容し、１２時間の明暗周期下で餌及び水を自由に接種できるようにした。手順はすべてＡｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたものであり、ＮＩＨガイドラインに準拠した。

オナボツリヌス毒素Ａ（ＢＯＴＯＸ（登録商標）、Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）及びＢｏＮＴ／Ａ（１５０ｋＤａ、Ｍｅｔａｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の希釈標準溶液は、それぞれ０．９％の生理食塩水または０．５％ＢＳＡ／０．９％生理食塩水のいずれかで調製した。膀胱への注射では、最初にラットを麻酔し、手術の準備を行った。下腹部正中切開を実施し、膀胱、精嚢、及び前立腺を露出させた。その後、正中周辺に沿って等距離にある４つの部位で、膀胱壁に１０μｌのオナボツリヌス毒素Ａ（２．５Ｕ／ｋｇ）を注射し、最終毒素負荷を１０Ｕ／ｋｇとした。対照動物の同等標的部位に、１０μｌのビヒクル（０．９％の生理食塩水）を注射した。無毛皮膚への注射では、オナボツリヌス毒素Ａ（３０Ｕ／ｋｇ）またはビヒクルを単回の皮内（ＩＤ）注射（２５μｌ）として足蹠間の右後肢中央に投与した。

注射の２日後にラットを屠殺し、膀胱、または後肢の足底表面の中央部分を採取し、ザンボニ（Ｚａｍｂｏｎｉ）固定液（Ａｍｅｒｉｃａｎ ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ，Ｌｏｄｉ，ＣＡ）中、４℃で一晩固定化した。組織を洗浄し、３０％スクロース／ＰＢＳ溶液中、４℃で一晩凍結保護した。膀胱及び皮膚試料を正中に沿って半切除してＯ．Ｃ．Ｔ．（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に包埋し、切片作製まで−８０℃で凍結保管した。組織ブロックをクリオスタット切片化して（厚さ１４μｍ）、スライドに載置し、スライドを使用するまで−２０℃で保った。

スライドに載置させた組織切片、及び細胞培養カバーガラスの非特異的シグナルをブロッキング緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ＋０．１％のトリトンＸ−１００＋１０％の正常ロバ血清）で最初にブロックした後、ブロッキング緩衝液中で所望濃度の一次抗体を使用して４℃で一晩インキュベートした。数回洗浄した後、希釈した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で切片及びカバーガラスをブロッキング緩衝液中、４℃で２時間インキュベートした後、再度洗浄した。培養物を含むカバーガラスを反転させ、１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）を使用して、顕微鏡スライド上に載置した。スライドに載置させた切片には、同一の封入剤を使用してカバーガラスで覆った。一次抗体を使用せずに処理した隣接切片を負の対照とすることで、バックグラウンドシグナルを示した。解剖学的同定をより好適なものにするために、別の切片にはヘマトキシリン・エオシン染色を実施した。

ＺＥＮソフトウェアを備えるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ−７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）またはＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）のいずれかを使用して画像のキャプチャ解析を実施した。神経線維の定性解析には、Ｉｍａｒｉｓ（登録商標）（Ｂｉｔｐｌａｎｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｗｉｎｄｓｏｒ，ＣＴ）ソフトウェアを利用した。神経線維型は、その形態学及び神経化学に基づいて同定した。

ラット膀胱では、ＳＮＡＰ２５に対するＳＭＩ−８１Ｒ抗体は、排尿筋全体にわたって神経線維におけるＩＲ−シグナルを示した。ＳＮＡＰ２５−ＩＲパターンは、予想通り、オナボツリヌス毒素Ａで処理した膀胱及び生理食塩水で処理した膀胱の双方において同一であった（図５Ａ、図５Ｆ）。ＳＮＡＰ２５のインタクトな形態及びＢｏＮＴ／Ａ切断形態の双方を認識すると報告されているＭＣ−６０５０モノクローナル抗体は、毒素で処理した排尿筋に由来する神経線維においてはＩＲ−シグナルを示したが、生理食塩水で処理した膀胱ではＩＲ−シグナルを示さず（図５Ｂ、図５Ｇ）、これはウエスタンブロット解析に由来する結果と同様であった。同様に、ＭＣ−６０５３モノクローナル抗体は、毒素処理した膀胱のみでＩＲ−シグナルを示したが、生理食塩水で処理した膀胱ではＩＲ−シグナルを示さなかった（図５Ｃ、図５Ｈ）。ＷＢ解析において検出された特異性とは対照的に、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して生成されたＲＧＴ−１０９２ｐＡｂは、毒素で処理した膀胱及び生理食塩水で処理した膀胱の双方においてＩＲ−シグナルを示した（図５Ｅ、図５Ｊ）。最も重要なことは、Ａｂ６３２−ｒＭＡｂは、毒素で処理した膀胱の排尿筋に由来する神経線維において明瞭なＩＲ−シグナル示したが（図５Ｄ）、食塩水で処理した対照膀胱においては、シグナルは検出されなかった（図５Ｉ）ことである。さらに、別々の試験において、Ａｂ６３５−ｒＭＡｂは、ラット膀胱における、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対するＡｂ６３２−ｒＭＡｂのものと類似した特異性を示した（図８Ｍ、図８Ｒ）。

ラット無毛皮膚では、ＳＭＩ−８１Ｒ抗体は、（他の皮膚領域の中でも特に）血管周囲の神経線維においてＩＲ−シグナルを示した。この抗体に関する予想通り、ＳＮＡＰ２５−ＩＲパターンは、オナボツリヌス毒素Ａで処理した皮膚及び生理食塩水で処理した皮膚の双方において同一であった（図６Ａ、図６Ｆ）。ＭＣ−６０５０モノクローナル抗体は、主に毒素で処理した皮膚に由来する神経線維でＩＲ−シグナルを示した。しかしながら、生理食塩水で処理した皮膚に由来する神経線維においても僅かなＩＲ−シグナルが明瞭に認められた（図６Ｂ、図６Ｇ）。ＭＣ−６０５０抗体は、血管腔においても強いＩＲ−シグナルを示した（図６Ｂ、図６Ｇ）。しかし、この特定ＩＲ−シグナルは、他のＳＮＡＰ２５抗体によって決して示されることはなかったため、非特異的なものであると判定された。同様に、ＭＣ−６０５３モノクローナル抗体は、毒素で処理した皮膚及び生理食塩水で処理した皮膚の双方に由来する血管周囲の神経線維においてＩＲ特異的シグナルを示し、かつ血管腔において非特異的シグナルを示した（図６Ｃ、図６Ｈ）。ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して生成されたＲＧＴ−１０９２ｐＡｂは再度、毒素で処理したラット皮膚及び生理食塩水で処理したラット皮膚の双方において、ＩＲ−シグナルを示したが（図６Ｅ、図６Ｊ）、これによって、ＷＢ解析においてＲＧＴ−１０９２ｐＡｂが特異性を有しているにもかかわらず、この抗体がＩＨＣには適していないことが示唆される。明瞭に対照的であったのは、Ａｂ６３２−ｒＭＡｂが毒素で処理した皮膚の神経線維のみでＩＲ−シグナルを示したが、生理食塩水で処理した皮膚のものではＩＲ−シグナルを示さなかった（図６Ｄ、図６Ｉ）ことであるが、これはは、Ａｂ６３２−ｒＭＡｂが優れた特異性を有していることを裏付けるものである。

ラット無毛皮膚試料は、下層の骨格筋を含んでいることが多く、運動神経終末（ＭＮＴ）内のＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５を認識する能力についてｒＭＡｂを検証する好適な機会を提供するものである。他の皮膚神経線維型と同様に、ＭＮＴにおいても抗体特異性に関する同様の結果が観測された（図７）。ＳＭＩ−８１ＲｍＡｂは、ＭＮＴ及び軸索において、ＳＮＡＰ２５の全長形態及びＢｏＮＴ／Ａ切断形態の双方を認識し、市販ｍＡｂであるＭＣ−６０５０及びＭＣ−６０５３は、主に毒素で処理した皮膚に由来する神経線維でＩＲ−シグナルを示した。しかしながら、こうした市販ｍＡｂでは、生理食塩水で処理した組織において非特異的ＩＲ−シグナルも観測された（図７Ｆ、図７Ｇ）。対照的に、Ａｂ６３２−ｒＭＡｂは、毒素で処理した皮膚のＭＮＴ及び軸索のみでＩＲ−シグナルを示したが、生理食塩水で処理した皮膚のものではＩＲ−シグナルを示さなかった（図７Ｄ、図７Ｈ）。

組織中のＳＮＡＰ２５₁₉₇に対するＡｂ６３２−ｒＭＡｂの優れた特異性をさらに例示するために、Ａｂ６３２及びＡｂ６３５の免疫反応性シグナルと、初期バッチロット（５／０２／２０１１）のヒトｒＭＡｂ、腹水から精製した元の天然３Ｃ１Ａ５ｍＡｂ、及び２Ｅ２Ａ６（Ａｂ５０７）ｍＡｂ（ＢＯＴＯＸ（登録商標）に対するＡｌｌｅｒｇａｎの細胞に基づく効力アッセイに使用される（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｙ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｊａｃｋｙ，Ｂ．Ｐ．，ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｋ．Ｒ．，２０１２．Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｓｓａｙ ｔｏ ｒｅｐｌａｃｅ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｉｏａｓｓａｙ．ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．７，ｅ４９５１６．））とを比較した。こうした抗体のＩＲシグナルは、オナボツリヌス毒素Ａで処理した後のラット無毛皮膚及び膀胱組織において比較した。

ラット無毛皮膚では、Ａｂ６３２及びＡｂ６３５の双方は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）で処理した後の血管周囲の神経線維（図８Ｂ、図８Ｃ）及び他の領域（データ未掲載）においてＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する強いＩＲ−シグナルを示したが、ビヒクルで処理した対照に由来する神経線維においては、このＩＲ−シグナルは存在しなかった（図８Ｇ、図８Ｈ）。同様に、より古く洗練度が低いバッチロットのヒトｒＭＡｂも毒素で処理した後の皮膚神経線維において良好なＩＲ−シグナルを示した（図８Ａ）が、生理食塩水で処理した対照においてはＩＲ−シグナルを示さなかった（図８Ｆ）。対照的に、天然３Ｃ１Ａ５ｍＡｂまたはＡｂ５０７ｍＡｂのいずれを使用しても、毒素で処理した皮膚神経線維において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する特異的ＩＲ−シグナルは検出されなかった（図８Ｄ、図８Ｅ）。

同様の結果が、ＢＯＴＯＸ（登録商標）で処理した後のラット膀胱において示された。３つのｒＭＡｂ（Ａｂ６３２、Ａｂ６３５、及びより古いヒトバッチロット）はすべて、膀胱排尿筋の全体にわたって神経線維において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する特異的ＩＲ−シグナルを示した（図８Ｋ、図８Ｌ、図８Ｍ）。また、ラット膀胱神経線維において、天然３Ｃ１Ａ５ｍＡｂを使用して特異的ＩＲ−シグナルが観測された（図８Ｏ）。しかしながら、ラット無毛皮膚と同様に、ＢＯＴＯＸ（登録商標）に対する、Ａｌｌｅｒｇａｎの細胞に基づく効力アッセイに使用されるＡｂ５０７ｍＡｂを使用しても、毒素で処理した膀胱において特異的ＳＮＡＰ２５₁₉₇ＩＲ−シグナルは検出されなかった（図８Ｎ）。抗体のいずれかを利用しても、ビヒクルで処理した対照ラット膀胱において、ＩＲ−シグナルは検出されなかった（図８Ｐ〜図８Ｔ）。

図５は、オナボツリヌス毒素Ａ（１０Ｕ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれかで処理した後のラット膀胱の切片における、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｅ）は、オナボツリヌス毒素Ａが注射された膀胱排尿筋（ＤＭ）の共焦点画像であり、（Ａ）は、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販のｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたものであり、（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇及びＳＮＡＰ２５₂₀₆に対して第２の市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブされたものであり、（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブされたものであり、（Ｄ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブされたものであり、（Ｅ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＲＧＴ−１０９２ｐＡｂでプローブされたものである。（Ｆ〜Ｊ）は、ビヒクルが注射された対照ラット膀胱の共焦点画像であり、同一の５つの抗体でプローブされたものである。矢印（Ｆ及びＪ）は、ビヒクルで処理したラット膀胱に由来する神経線維内のＩＲ−シグナルを指している。ＤＭは排尿筋であり、スケールバー＝５０μｍである。

図６は、オナボツリヌス毒素Ａ（３０Ｕ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれかで処理した後のラット無毛皮膚の切片における、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｅ）は、オナボツリヌス毒素Ａが注射されたラット皮膚の共焦点画像であり、（Ａ）は、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販のｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたものであり、（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５１９７及びＳＮＡＰ２５₂₀₆に対して第２の市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブされたものであり、（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブされたものであり、（Ｄ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブされたものであり、（Ｅ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＲＧＴ−１０９２ｐＡｂでプローブされたものである。（Ｆ〜Ｊ）は、ビヒクルが注射された対照ラット皮膚の共焦点画像であり、同一の５つの抗体でプローブされたものである。矢印（Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＪ）は、ビヒクルで処理したラット皮膚に由来する神経線維内のＩＲ−シグナルを指している。アスタリスク（Ｂ、Ｃ、Ｇ、及びＨ）は、血管腔内の非特異的ＩＲ−シグナルを指している。ＢＶは血管であり、ＣＴは結合組織であり、スケールバー＝５０μｍである。

図７は、オナボツリヌス毒素Ａ（３０Ｕ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれかで処理した後のラット無毛皮膚下層の骨格筋における、ＳＮＡＰ２５に対する抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｄ）は、オナボツリヌス毒素Ａが注射されたラット肢の下層筋肉内の運動神経終末（ＭＮＴ、矢印）を示す共焦点画像であり、（Ａ）は、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販のｍＡｂ（ＳＭＩ−８１Ｒ）でプローブされたものであり、（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇及びＳＮＡＰ２５₂₀₆に対して第２の市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５０）でプローブされたものであり、（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販ｍＡｂ（ＭＣ−６０５３）でプローブされたものであり、（Ｄ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂでプローブされたものである。（Ｅ〜Ｈ）は、ビヒクルが注射された対照ラット肢に由来する共焦点画像であり、同一の４つの抗体でプローブされたものである。ＳＮＡＰ２５−ＩＲシグナルは、緑色（白黒の図では、灰色として示される）であり、ＤＩＣイルミネーションは、下層の筋線維（ＭＦ）を示すために使用した。矢印（Ｅ）は、ビヒクルで処理したラット肢に由来するＭＮＴ内のＩＲ−シグナルを指し、アスタリスク（Ｂ、Ｃ、Ｆ、及びＧ）は、筋肉内の非特異的ＩＲ−シグナルを指す。スケールバー＝５０μｍである。

図８は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）またはビヒクルで処理した後のラット無毛皮膚（Ａ〜Ｊ）及びラット膀胱（Ｋ〜Ｔ）の切片における、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に特異的な抗体の特異性を比較する免疫組織化学的な解析を示す。（Ａ〜Ｅ）は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）を注射した後のラット皮膚の共焦点画像であり、すべてのｒＭＡｂを使用した血管周囲の神経線維におけるＳＮＡＰ２５₁₉₇に対するＩＲ−シグナルを示している（古いバッチ及び新しいバッチ、矢印）。２Ｅ２Ａ６クローン（Ａｂ５０７）及び３Ｃ１Ａ５腹水抗体のいずれも、この組織において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇シグナルのいずれも検出しなかった。（Ｆ〜Ｊ）では、ビヒクルで処理した対照において、いずれの抗体を使用してもＳＮＡＰ２５−ＩＲは検出されていない。（Ｋ〜Ｏ）では、２Ｅ２Ａ６クローンを除くすべての抗体を使用して、ＢＯＴＯＸ（登録商標）で処理した後のラット膀胱の排尿筋を巡る神経線維において、ＳＮＡＰ２５₁₉₇−ＩＲシグナル（矢印）が検出されている。（Ｐ〜Ｔ）では、ビヒクルで処理した対照において、いずれの抗体を使用しても、ＳＮＡＰ２５₁₉₇−ＩＲは検出されていない。ＢＶは血管であり、ＣＴは結合組織であり、ＳＭは平滑筋である。

実施例３．免疫組織化学的な比較−ヒト組織
ＳＮＡＰ２５に対する市販抗体の中で、ＳＮＡＰ２５₁₉₇を標的とするＭＣ−６０５３モノクローナル抗体が、抗体の型及び種に関して、マウスＡｂ６３５−ｒＭＡｂと最も類似している（表１）。それ故に、オナボツリヌス毒素Ａで処理したヒト背中皮膚及び生理食塩水で処理したヒト背中皮膚の生検試料において、Ａｂ６３５−ｒＭＡｂとＭＣ−６０５３ｍＡｂとの間で、ＳＮＡＰ２５−ＩＲの発現パターンの直接比較を実施した。これはマウス抗体を使用したヒト組織のプローブであるため、（供給源とは無関係に）非特異的ＩＲ−シグナルは最小となるであろうと推定された。

ヒト皮膚生検試料は、Ａｌｌｅｒｇａｎの第１相臨床試験によって得た。この試験は、優良臨床試験基準の指針及び規制、ならびに関連するすべての地域及び国のプライバシー指針に準拠して実施した。試験プロトコール、インフォームドコンセント、及びすべての適切な試験関連文書は、治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）／倫理委員会（Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたものである。

成人ヒト背中皮膚に対して、１０Ｕのオナボツリヌス毒素ＡまたはビヒクルのいずれかをＩＤ注射した。処理の１４日後に、背中皮膚からパンチした生検試料を採取し、同一の固定液中で一晩固定化した。組織を洗浄し、３０％スクロース／ＰＢＳ溶液中、４℃で一晩凍結保護した。正中に沿って皮膚試料を半切除してからＯ．Ｃ．Ｔ．（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に包埋し、切片作成まで−８０℃で凍結保管した。組織ブロックをクリオスタット切片化し（厚さ１４μｍ）、スライドに載置し、スライドを使用するまで−２０℃で保った。ＩＨＣ及びデータ解析は、上記概説の通りに実施した。

ヒト背中皮膚では、血管周囲の神経線維及び皮膚内の汗腺において、両抗体に対するＩＲ−シグナルが観測された（図９）。オナボツリヌス毒素Ａで処理した背中皮膚及び生理食塩水で処理した背中皮膚の双方に由来する神経線維において、ＭＣ−６０５３ｍＡｂに対するＩＲ−シグナルが観測された。明瞭に対照的であったのは、我々のマウスＡｂ６３５−ｒＭＡｂに対するＩＲ−シグナルが、オナボツリヌス毒素Ａで処理したヒト背中皮膚に由来する神経線維のみにおいて観測されたが、生理食塩水で処理したヒト背中皮膚に由来するものでは観測されなかった（図９）ことであり、このことは、マウスＡｂ６３５−ｒＭＡｂの特異性が優れていることを示し、さらに重要なこととして、それが臨床診断ツールとして有用であることを示している。

図９は、オナボツリヌス毒素Ａ（１０Ｕ）またはビヒクルのいずれかで処理した後のヒト背中皮膚の切片における、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対する市販（ＭＣ−６０５３）ｍＡｂとＡｂ６３５−ｒＭＡｂとの免疫組織化学的な比較を示す。（Ａ、Ｂ）は、オナボツリヌス毒素Ａで処理したヒト皮膚の共焦点画像であり、（Ｅ、Ｆ）はビヒクルで処理したヒト皮膚における血管の共焦点画像である。（Ａ、Ｅ）はＭＣ−６０５３ｍＡｂでプローブされたものであり、（Ｂ、Ｆ）Ａｂ６３５−ｒＭＡｂでプローブされたものである。（Ｃ、Ｄ）はオナボツリヌス毒素Ａで処理したヒト皮膚の汗腺であり、（Ｇ、Ｈ）はビヒクルで処理したヒト皮膚の汗腺である。（Ｃ、Ｇ）はＭＣ−６０５３ｍＡｂでプローブされたものであり、（Ｄ、Ｈ）はＡｂ６３５−ｒＭＡｂでプローブされたものである。矢印は、ビヒクルで処理したヒト皮膚に由来する神経線維内のＩＲ−シグナルを指している。ＢＶは血管であり、ＣＴは結合組織であり、ＳＧは汗腺であり、スケールバー＝５０μｍである。

細胞内におけるＢｏＮＴ／Ａの位置及び移動を検出することが困難であること考慮すると、専有組換えヒト化α−ＳＮＡＰ２５₁₉₇及び専有組換えマウスα−ＳＮＡＰ２５₁₉₇を使用することで、他の種においてＳＮＡＰ２５₁₉₇を交差検出することができる。他のα−ＳＮＡＰ２５抗体は検出能力を有するが、組換えマウスα−ＳＮＡＰ２５₁₉₇を使用してヒト組織におけるＳＮＡＰ２５₁₉₇を検出するか、または組換えヒト化α−ＳＮＡＰ２５₁₉₇を使用してマウスにおけるＳＮＡＰ２５₁₉₇を検出することにより、ＢｏＮＴ／Ａの作用機構を詳細に解析することができる。これは、他の利用可能な抗体では不可能なことである。

実施例４．免疫細胞化学的比較
いくつかの抗体は、１つのアッセイ／指標に対して、別のものよりも良好に機能する場合がある。それ故に、解析を完結させるために、ＢｏＮＴ／Ａ（３ｎＭ）または生理食塩水のいずれかで処理したＤＲＧ細胞培養物において、いくつかの抗体に由来するＩＲ−シグナルを比較した。

上記概説の通りにＤＲＧ細胞培養物を調製して処理した。上記詳説の通りに免疫細胞化学及びデータ解析を実施した。

組織の場合と同様に、ＳＭＩ−８１Ｒ抗体は、ＢｏＮＴ／Ａで処理した培養物及び生理食塩水で処理した培養物の双方において、強いＩＲ−シグナルを示した（図１０Ａ、図１０Ｄ）。市販ｍＡｂであるＭＣ−６０５３及びヒトＡｂ６３２−ｒＭＡｂの双方が、ＢｏＮＴ／Ａで処理した培養物に由来する神経細胞において、特異的なＳＮＡＰ２５₁₉₇−ＩＲシグナルを示した（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。生理食塩水で処理した培養物においては、シグナルは検出されなかった（図１０Ｅ、図１０Ｆ）。しかしながら、ＭＣ−６０５３ｍＡｂは、生理食塩水で処理した培養物において、神経細胞体にわたってかすかなバックグラウンドシグナルを示した（図１０Ｅ）。

図１０は、異なる形態のＳＮＡＰ２５に対する抗体でプローブした、ＢｏＮＴ／Ａ（３ｎＭ）またはビヒクルで処理した後根神経節（ＤＲＧ）培養物の共焦点画像を示す。（Ａ〜Ｃ）は、ＢｏＮＴ／Ａに対して３時間曝露したＤＲＧ培養物である。曝露後、（Ａ）は、全長（２０６）ＳＮＡＰ２５及び切断（１９７）ＳＮＡＰ２５に対して市販（ＳＭＩ−８１Ｒ）ｍＡｂで染色したものであり、（Ｂ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して市販（ＭＣ−６０５３）ｍＡｂで染色したものであり、（Ｃ）は、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対してＡｂ６３２−ｒＭＡｂで染色したものである。（Ｄ〜Ｆ）は、ビヒクルに対して曝露され、かつ同一の３つの抗体でプローブされた対照ＤＲＧ培養物である。Ｅの矢頭は、バックグラウンド標識を示している神経細胞体を指している。

ＳＮＡＰ２５を発現する細胞における活性ＢｏＮＴ／Ａの存在は、切断基質（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）に対する選択的抗体の使用によって判定される場合が多い。本試験では、社内で開発した、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対するｒＭＡｂをいくつか導入し、それらの免疫反応性シグナルと市販抗体のものとを、様々な異なる方法を使用して比較した（表３）。ヒトｒＭＡｂ及びマウスｒＭＡｂのいずれも一貫して、すべてのアッセイにおいて、異なる組織上で、ＳＮＡＰ２５₁₉₇を検出したが、予想通り、全長ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₂₀₆）は検出しなかった。このことは、ＳＮＡＰ２５₁₉₇に対して意図的に選択される他の抗体には当てはまらなかったが、こうした抗体は、アッセイに依存して特異性が変化するものであった。こうした結果は、抗体を使用して、インタクトなＳＮＡＰ２５タンパク質を認識することなく、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５エピトープを特異的に標的とすることは困難であることを確認するものであり、そのため、適切な対照が用意されない場合、結果が誤解される可能性がある。それ故に、任意の所与のＳＮＡＰ２５₁₉₇抗体を、複数の条件及び組織型の下で試験して、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５の存在検出における、その忠実度を裏付けるべきである。

部位特異的抗体は、インビトロ解析及びインビボ解析の双方で使用されることが多くなっている。こうした抗体は、リン酸化部位または酵素切断部位を検出することができ、タンパク質の成熟、活性、及び分解を理解する上で貴重なツールである（Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．，１９９９．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｄｅｌｉｎｅａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５２，１１−１８．、Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ．，Ｆｌａｎｎｅｒｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｍａｋｋｅｒｈ，Ｊ．，Ｋｒｕｐａ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｅ．Ｒ．，２００３．Ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉ−ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．１０７−１１４．、Ｎａｇａｔａ，Ｋ．，Ｉｚａｗａ，Ｉ．，ａｎｄ Ｉｎａｇａｋｉ，Ｍ．，２００１．Ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｓｉｔｅ− ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ６，６５３−６６４．）。ボツリヌス神経毒素の分野では、切断部位特異的抗体は、少量のＢｏＮＴ軽鎖の活性の検出（さもなければこの軽鎖の感知は非常に困難な場合がある）に役立ち得るものである。そのような目的で、ポリクローナル抗体使用の価値が限定される場合があるが、これは、免疫グロブリン集団の混合が生成される可能性があり、そのすべてが切断エピトープに対する特異性を必要とすることになるためである（Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．，１９９９．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｄｅｌｉｎｅａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５２，１１−１８．）。さらに、標的エピトープから離れた配列の一部に対して結合する抗体が生成される可能性が低下するように、ペプチド抗原は相対的に短くあるべきである。

今回の試験において提示した抗ＳＮＡＰ２５₁₉₇ｍＡｂは、ＩＨＣアッセイで、その能力が優れているかについて最初にスクリーニングして選択した。この抗体からその後に生成させたｒＭＡｂ（Ａｂ６３２及びＡｂ６３５）は、ＩＨＣを含むいくつかの異なるアッセイにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対して優れた特異性を示した。さらに、こうしたｒＭＡｂは、試験した他の抗体と比較して、優れたＳＮＡＰ２５₁₉₇特異性を示した（表３）。したがって、ｒＭＡｂは、細胞内及び臨床試料においてＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するための有効な新しいツールを示すものであり、未来の試験で対象の組織におけるＢｏＮＴ／Ａの効力を特徴付けるために利用されることになる。こうした抗体の特定配列は、上記表２に示されている。

全体として、ウエスタンブロットアッセイ、組織上の免疫組織化学、及び細胞上の免疫細胞化学において試験した抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₁₉₇）及び未切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５₂₀₆）に対して様々な特異性を示した。結果の要約を以下の表３に示す。
ｎ／ｔ＝未試験、ｂ＝バックグラウンド

本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示のみが目的であり、その観点から様々な変更形態または変更が当業者には示唆されることになり、それらは本出願の趣旨及び範囲内に含まれることになることを理解されたい。個々の出版物、特許、または特許出願のそれぞれが、具体的かつ個々に示されて、参照によって組み込まれるのと同程度に、本明細書に引用されている出版物、特許、及び特許出願はすべて、あらゆる目的を対象としてそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (3)

1. 全長ＳＮＡＰ２５に結合せず、組織においてＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対して優先的に結合することができる抗ＳＮＡＰ２５抗体であって、
   配列番号１の軽鎖配列及び配列番号３の重鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である、又は
   配列番号５の軽鎖配列及び配列番号７の重鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である、前記抗ＳＮＡＰ２５抗体。
2. ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性に対して組織試料が曝露されているかどうかを決定する方法であって、
   ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性に対して曝露された疑いがある組織試料と抗ＳＮＡＰ２５抗体とを接触させる工程、ここで、前記抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対して優先的に結合する、及び
   前記抗ＳＮＡＰ２５抗体が前記組織試料に対して結合したかどうかを検出する工程、ここで、前記組織試料に対して結合している前記抗ＳＮＡＰ２５抗体の存在が、前記組織試料がＢｏＮＴ／Ａ活性に対して曝露されていることを示す、
   を含み、かつ
   抗体が配列番号１の軽鎖配列及び配列番号３の重鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である、又は
   配列番号５の軽鎖配列及び配列番号７の重鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である、前記方法。
3. ＢｏＮＴ／Ａの酵素活性に対して組織が曝露されているかどうかを診断するキットであって、ＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５に対して優先的に結合する抗ＳＮＡＰ２５抗体を含み、かつ
   抗体が配列番号１の軽鎖配列及び配列番号３の重鎖配列を含み、かつ組換えマウス抗体である、又は
   配列番号５の軽鎖配列及び配列番号７の重鎖配列を含み、かつ組換えヒト抗体である、
   前記キット。