KR20170092583A - 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법 - Google Patents

세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 다클론성 또는 단클론성 항체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법으로서, a) BoNT/E 중독에 취약한 세포를 BoNT/E와 함께 일정 시간 동안 BoNT/E가 이의 생물학적 활성을 행사할 수 있는 조건하에 인큐베이팅하는 단계; b) 세포를 고정하고, 임의로, 세포를 세정제로 투과화시키는 단계; c) 세포를 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 포획 항체와, 지시된 기질에 대한 상기 포획 항체의 결합을 가능하게 하는 조건하에 접촉시키는 단계로서, 제2 포획 항체가 본 발명의 항체인, 상기 접촉시키는 단계; d) 세포를 제1 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 검출 항체와 상기 제1 포획 항체에 상기 제1 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시켜 제1 검출 복합체를 형성하고, 제2 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 검출 항체와 상기 제2 포획 항체에 상기 제2 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시켜 제2 검출 복합체를 형성하는 단계로서, 제1 검출 항체가 제2 검출 항체와는 상이한, 상기 제2 검출 복합체를 형성하는 단계; e) 단계 d)의 제1 및 제2 검출 복합체의 양을 결정하는 단계; 및 f) 제2 검출 복합체를 사용하여 상기 세포에서 BoNT/E에 의해 절단된 SNAP-25의 양을 계산하는 단계를 포함함으로써, 상기 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 결정하는, 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법{MEANS AND METHODS FOR THE DETERMINATION OF THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF BONT/E IN CELLS}
본 발명은 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 다클론성 또는 단클론성 항체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법으로서, a) BoNT/E 중독에 취약한 세포를 BoNT/E와 함께 일정 시간 동안 BoNT/E가 이의 생물학적 활성을 행사할 수 있는 조건하에 인큐베이팅(incubating)하는 단계; b) 세포를 고정하고, 임의로, 세포를 세정제로 투과화시키는 단계; c) 세포를 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 포획 항체와, 지시된 기질에 상기 포획 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시키는 단계로서, 여기서 제2 포획 항체가 본 발명의 항체인, 상기 접촉시키는 단계; d) 세포를 제1 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 검출 항체와 상기 제1 포획 항체에 상기 제1 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시켜 제1 검출 복합체를 형성하고, 제2 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 검출 항체와 상기 제2 포획 항체에 상기 제2 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시켜 제2 검출 복합체를 형성하는 단계로서, 여기서 제1 검출 항체가 제2 검출 항체와는 상이한, 상기 제2 검출 복합체를 형성하는 단계; e) 단계 d)의 제1 및 제2 검출 복합체의 양을 결정하는 단계; 및 f) 제2 검출 복합체를 사용하여 상기 세포에서 BoNT/E에 의해 절단된 SNAP-25의 양을 계산하는 단계를 포함하고, 이로써 상기 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 결정하는, 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 및 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)는 매우 강력한 신경독소, 즉, 보툴리눔 독소(BoNT) 및 파상풍 독소(TeNT)를 각각 생성한다. 이들 클로스트리디움 신경독소(CNT)는 신경 세포에 특이적으로 결합하며, 신경전달물질 방출을 저해한다. 각각의 독소는 불활성의 미가공된 대략 150 kDa의 단쇄 단백질로 합성된다. 번역후 가공은 박테리아성 프로테아제(들)에 의하여 이황화 브릿지의 형성 및 제한된 단백질분해(상성)를 수반한다.
대안적으로, 클로스트리디움 신경독소는 이종 세포에서 생성될 수 있고, 즉 적절한 호스트 세포에서 신경독소를 인코딩하는 핵산 서열을 발현함으로써 재조합적으로 생성될 수 있다. 이. 콜라이(E. coli)에서 클로스트리디움 신경독소의 재조합 발현을 위한 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, 제WO 00/12728호, 제WO 01/14570호, 제WO 2006/076902호 또는 제WO 2013/091895호 참조). 특정한 경우, 경쇄 및 중쇄는 개별적으로 수득된 다음, 시험관내에서 재구성된다(제WO 95/32738호 참조).
추가로, 클로스트리디움 신경독소는 진핵 발현 시스템, 예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피리차 메타놀리카(Pichia methanolica), 에스. 세레비시애(S. cerevisiae), 공충 세포 및 포유동물 세포에서 발현되었다(제WO 2006/017749호 참조).
모든 이들 발현 시스템에서, 이황화 결합에 의해 연결된, 경쇄 및 중쇄를 포함하는 최종 생물학적 활성 클로스트리디움 신경독소 단백질을 생성하기 위하여, 발효 동안 호스트 세포 효소에 의하거나, 발효 후에 단리된 미정제 단백질 물질에 대한 단백질분해 효소의 첨가에 의한 단쇄 신경독소 전구체의 단백질분해 절단이 필요하다.
활성 신경독소는 2개의 쇄인 이황화 결합에 의해 연결된 약 50 kDa의 N-말단 경쇄 및 약 100 kDa의 C-말단 중쇄로 이루어진다. CNT는 구조적 및 기능적으로 3개의 영역; 즉 촉매 경쇄, 전좌영역(N-말단 절반) 및 수용체 결합 영역(C-말단 절반)을 포함한 중쇄로 이루어진다(예를 들면, 문헌[Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49] 참조). 보툴리눔 신경독소는 150 kDa 신경독소 단백질 및 관련 비독성 단백질을 포함한 분자의 복합체로서 합성된다. 상기 복합체의 크기는 클로스트리디움 균주 및 300 kDa으로부터, 500 kDa 초과 및 900 kDa의 범위의 독특한 신경독 항원형에 기초해서 다르다. 이들 복합체 내의 비독성 단백질은 신경독을 안정화시키고, 그 열화로부터 보호한다(문헌[Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26] 참조).
클로스트리디움 보툴리눔은 보툴리눔 신경독소(BoNT)의 A 내지 G로 지정된 7개의 항원적으로 독특한 항원형을 분비한다. 클로스트리디움 테타니에 의해 분비된 관련된 파상풍 신경독소(TeNT)와 함께 모든 항원형은 SNARE 단백질을 절단함으로써 시냅스 엑소사이토시스를 차단하는 Zn2+-엔도프로테아제이고; 문헌[Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759]를 참조한다. CNT는 보툴리눔 중독증 및 파상풍에서 발견된 이완성 근육 마비를 일으킨다(문헌[Fischer 2007, PNAS 104, 10447] 참조).
이의 독성 작용에도 불구하고, 보툴리눔 독소 복합체는 많은 질병의 치료제로서 사용되고 있다. 보툴리눔 독소 항원형 A는 사시성, 안검경련 및 다른 장애의 치료용으로 1989년 미국에서 인간에 대한 사용이 허가되었다. 예를 들면, 상품명 BOTOX(알러간 인크(Allergan Inc)), 상품명 DYSPORT/RELOXIN(입센 엘티디(Ipsen Ltd))으로 보툴리눔 독소 A 단백질 제제로서 시판된다. 개선된 복합 단백질이 함유되지 않은 보툴리눔 독소 A 제제는 상품 XEOMIN(머즈 파마슈티칼스 게엠베하(Merz Pharmaceuticals GmbH))으로 시판된다. 치료 적용에 대해서, 제제를 근육에 직접 주입해서 치료한다. 생리적인 pH에서, 단백질 복합물로부터 독소를 방출하고 소망의 약리작용이 발생한다. 보툴리눔 독소의 작용은 일시적이고, 이는 치료작용을 유지하기 위해서 보툴리눔 독소의 반복적인 투여를 필요로 하는 이유이다.
클로스트리디움 신경독소는 수의근 강도를 약하게 하고, 사시증, 국소성 근긴장이상증, 예를 들면, 경부 근긴장이상증 및 양성 본태성 안검경련의 치료에 효과적이다. 이들은 안면경련 경감, 및 국소경직 경감시키고, 또한 광범위한 지표, 예를 들면, 위장 장애, 다한증 및 미용성 주름 개선에서 효과적인 것을 나타낸다(문헌[Jost 2007, Drugs 67, 669] 참조).
클로스트리디움 신경독소의 제조 공정 동안, 활성 신경독 폴리펩타이드의 정성적 및 정량적 결정 및 품질 관리는 특히 중요하다. 추가로, 정부 기관은 단순하고 신뢰할 수 있고 인증된 보툴리눔 독소 활성 분석만을 받아들인다. 현재, 마우스 LD50 생물분석, 치사율 시험은 여전히 이의 제형의 효능을 분석하기 위하여 제약 업체에 의해 사용되는 "최적 표준"이다(문헌[Arnon et al.(2001), JAMA 285, 1059-1070] 참조). 그러나, 최근 몇년 동안, 동물 시험에 대한 필요성 및 이러한 유형의 동물-기반의 분석과 연관된 모든 단점, 비용 및 윤리적 문제를 완화시키는 대안적인 접근을 구하는데 상당한 노력을 들여왔다. 추가로, 규제 기관은 제약 회사가 보툴리눔 신경독소의 효능 시험에 대하여 "3R" 원칙: "감소, 완화, 대체(Reduce, Refine, Replace)"를 적용하도록 한다(문헌[Straughan, Altern. Lab. Anim.(2006), 34, 305-313] 참조). 그 결과, 살아 있는 동물을 사용하는 방법에 대한 합리적인 대안을 제공하기 위하여 세포-기반의 시험 시스템이 개발되어 왔다. 아직, 소수의 세포 시험 시스템만이 이때까지는 신경독소 폴리펩타이드에 충분히 민감한 것으로 보였던 신경독소 생물학적 활성의 결정에 유용하다. 이들 세포-기반 시스템은 시험관내에서 분화된 설치류 배아로부터 단리된 1차 신경세포(Pellett et al.(2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392), 신경세포 분화된 유도 다능성 줄기 세포(Whitemarsh et al.(2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), 및 SiMa 세포주의 서브클론(WO 2010/105234 A1)의 사용을 포함한다.
그러나, 1차 신경세포의 단리는 동물을 죽이는 것이 필요하고, 힘들고 시간이 많이 걸린다. 추가로, 상이한 1차 신경세포를 사용하는 시험 시스템은 넓은 분산을 보인다. 유사하게, 신경세포 분화된 유도 다능성 줄기 세포의 발생은 어렵고 시간이 많이 걸린다. 추가로, 이러한 세포의 저장은 매우 문제가 많다. 종양 세포주를 사용하는 분석은 자주 BoNT에 충분히 민감하지 않다. 게다가, 복합체 분화 프로토콜이 상기 종양 세포주에 대하여 요구되고, 이는 상기 세포주를 사용하는 분석의 넓은 분산 및/또는 높은 실패율을 야기한다.
당해 분야에 기재된 클로스트리디움 신경독소의 생물학적 활성을 결정하기 위한 분석은 신경독소 활성이 세포 용해물 중의 절단된 신경독소 기질의 양에 의해 정량되는 웨스턴 블롯 분석을 포함한다. 다른 분석에서, 클로스트리디움 신경독소의 활성은 전기화학발광(ECL) 샌드위치 ELISA에 의해 측정된다(제WO 2009/114748 A1호 참조). 또한 이러한 경우에, 클로스트리디움 신경독소의 생물학적 활성은 세포 용해물로부터의 단리 후 절단된 클로스트리디움 신경독소 기질의 검출에 의해 결정된다. 추가로, 신경독소 기질은 두 분석에서 농축되어야 한다.
상기의 관점에서, 정부 기관에 의해 허용 가능하고/가능하거나 동물-기반 시험 시스템에 대안을 제공하는 신경독소 폴리펩타이드 활성의 결정을 위한 추가의 시험 시스템은 매우 바람직하다.
따라서, 본 발명에 대한 근본적인 기술적 문제는 상기 언급된 요구에 따르는 수단 및 방법의 제공으로서 보여질 수 있다. 기술적 문제는 청구항 및 하기 본 명세서에서 특성화된 실시형태에 의해 해결된다.
본 발명은, 제1 실시형태에 있어서, BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 다클론성 또는 단클론성 항체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 생성하는 침착된 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
본 발명은 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 절단 부위, 즉, BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 제공한다. 추가로, 본 발명은 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단클론성 항체를 제조하는, 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000을 제공한다. 이러한 하이브리도마 세포주는 수탁 번호 DSM ACC3261하에 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라베 7B 소재)에 부다페스트 조약하에 2014년 12월 17일에 출원인에 의해 수탁되었다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, SNAP-25는, 그 중에서도, BoNT/E 신경독소의 기질이다. SNAP-25는 아미노산 잔기 206의 전체 길이를 갖는다. SNAP-25의 BoNT/E 절단 부위는 아르기닌(R) 180 및 이소류신(I) 181 사이에 위치하고, "R180I"로도 지칭된다. 따라서, BoNT/E에 의한 SNAP-25206의 절단은 2개의 단편, 즉, 하기에서 "SNAP-25180 절단 생성물"로도 지칭되는 아미노산 잔기 1 내지 180의 N-말단 단편, 및 아미노산 잔기 181 내지 206의 C-말단 단편을 드러나게 한다. 본 발명의 항체는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 생성되고 특성화되었다. 간략하게, 마우스 단클론성 항체는 면역화 단백질에 커플링된 펩타이드 "C-NEIDTQNRQIDR-OH"(서열 번호 1)로 마우스를 면역화시킴으로써 제조되었다. 나타난 데이타는 이러한 항체가 SNAP-25180 절단 생성물을 특이적으로 검출하는 것으로 나타낸다. 따라서, 이러한 항체는 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 검출에 의한 BoNT/E의 생물학적 활성을 측정하는 분석에 특히 적합하다. 구체적으로, SNAP-25206 미절단된 기질에 비하여 SNAP-25180 절단 생성물에 대한 이의 높은 친화성 및 특이성으로 인하여, 이는 세포에서 직접적으로 BoNT/E의 생물학적 활성을 결정할 수 있는 본 발명의 방법을 위한 제2 포획 항체로서 사용될 수 있다. 이러한 항체는 아직 상업적으로 이용 가능하지 않다. 추가로 본 발명에 의해 구상 중인 것은, 예를 들면, 면역화 단백질에 펩타이드 "C-NEIDTQNRQIDR-OH"(서열 번호 1)를 커플링시키고, 예를 들면, 토끼, 염소, 말, 당나귀, 마우스, 래트, 또는 라마를 포함하지만 이에 한정되지 않는 종을 면역화시킴으로써 생성될 수 있는 다클론성 항혈청 또는 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 그 항원에 특이적으로 결합하는 특정한 항원에 대한 반응에서 만들어진 면역계에 의해 발생된 분자를 지칭하고, 천연 발생 항체 및 비천연 발생 항체 둘 다를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "항체"는 단클론성 항체, 다클론성 항혈청 또는 항체, 단쇄 항체, 이합체 또는 다합체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이중특이적 단쇄 항체, 다중특이적 항체, 합성 항체, 인간화 항체, 이작용성 항체, Ig 수용체와 같은 세포-연관된 항체, 선형 항체, 디아바디, 미니바디, 또는 임의의 상기 항체의 단편을 포함한다. 상기 항체의 단편은, 예를 들면, Fab, Fv, 또는 scFv 단편, 또는 임의의 이들 단편의 화학적으로 개질된 유도체를 포함한다. 항체는 당해 분야에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988] 참조). 단클론성 항체는 문헌[Kohler 1975, Nature 256, 495, and Galfre 1981, Meth. Enzymol. 73, 3]에 원래 기재된 기술에 의해 제조될 수 있다. 상기 기술은 면역화된 포유동물로부터 유도된 비장 세포에 대한 마우스 골수종 세포의 융합을 포함한다. 항체는 당해 분야에 잘 알려진 기술에 의해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들면, 비아코어(Biacore) 시스템에서 사용되는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명은 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효능을 증가시키는데 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol. Methods 183, 7] 참조). 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 항체는 또한 항체의 기능적 등가물, 즉, BoNT/E-절단된 SNAP-25 기질의 바람직한 에피토프(들) 또는 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 제제를 포함한다. 실시형태에 있어서, 이러한 기능적 등가물은 BoNT/E-절단된 SNAP-25 또는 이의 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 포함하고, 이는 상기 특이적인 결합을 매개할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 항체는 VH 및 VL 도메인, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체-길이 면역글로불린 분자, 또는 전체-길이 면역글로불린 분자의 면역 활성 단편, 예를 들면, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fc 단편, Fd 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 임의의 척추동물 종(예를 들면, 사람, 원숭이, 염소, 말, 당나귀, 마우스, 래트, 토끼, 또는 닭)으로부터 유도될 수 있고, 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, 또는 IgA), 클래스(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM) 또는 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2)일 수 있다. 천연 발생 항체, 비천연 발생 항체, 및 이의 항원성 화합물-결합 단편의 구조에 대한 일반적인 논의에 대하여, 이는 예를 들면, 문헌[Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Borrabeck, Antibody Engineering 2nd ed.(Oxford University Press)]를 참조한다. 천연 발생 항체는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 일반적으로 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의하여 중쇄에 연결되고, 이황화 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 동형의 중쇄마다 다를 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 쇄내 이황화 브릿지에서 규칙적인 간격을 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에서 가변 도메인(VH) 후, 약간의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에서 가변 도메인(VL) 및 이의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 맞춰 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 맞춰 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 접점을 형성하는 것으로 여겨진다.
완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위는 항체의 가변 도메인, 즉, Fv 단편 내에 포함된다. 이러한 단편은 밀집된 비공유 회합의 하나의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 하나의 경쇄 가변 도메인(VL)의 이합체를 포함한다. 각각의 도메인은 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함하고, 이는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 배열을 폭넓게 사용하고, 이는 루트 연결을 형성하고, 몇몇 경우에 베타-시트 구조의 부분을 형성한다. 각각의 초가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 총괄하여, 이는 항원-결합 특이성을 부여하는 VH-VL 이합체의 표면 위의 항체-결합 부위를 정의하는 6개의 CDR 영역(경쇄 위의 3개의 CDR 영역, 즉, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 및 중쇄 위의 3개의 CDR 영역, 즉, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)의 3차원 배열이다. 예를 들면, 문헌[Cyrus Chothia, et al., Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions, Nature 342(6252): 877-883(1989)]; [Elvin A. Kabat, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)]을 참조한다. 항체의 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예를 들면, 항체 의존성 세포성 세포독성에서의 항체의 참여를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "선택적 결합" 또는 "특이적인 결합"은 본 발명의 항체가 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하지만 비-절단된 SNAP-25, 또는 일반적으로 다른 폴리펩타이드와 상당한 정도로 교차 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 에피토프 특이성은 본 발명의 항체의 중요한 특성이다. 본 발명의 항체는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8로 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특이적인 결합은, 예를 들면, 경쟁 연구를 포함한 다양한 잘 알려진 기술에 의해 시험될 수 있다. 또 다른 중요한 특징은 항체의 민감성이다. 민감성은 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서 샘플 또는 세포에 의해 포함된 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%가 결합되도록 하여야 한다. 민감성은 잘 알려진 기술에 의해 시험될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 일상적인 실험을 사용하여 각각의 결정을 위한 작동 중인 최적의 분석을 결정할 수 있을 것이다. 결합 연구를 위한 통상적인 기술은 방사성면역, ELISA, 평형 투석, 등온선 미세열량측정, BIACORE(등록상표) 분석(표면 플라즈몬 공명, SPR) 또는 다른 표면 흡착 방법을 포함한다. BIACORE(등록상표) SPR 시스템은 항체-항원 상호작용을 측정한다. SPR 반응은 분석물이 결합하거나 해리됨에 따른 검출기 표면에서의 질량 농도의 변화를 반영한다. SPR을 기반으로, 실시간 BIACORE(등록상표) 측정은 이들이 발생함에 따라 직접적인 상호작용을 모니터링한다(문헌[BIAapplications Handbook, version AB(reprinted 1998), BIACORE(등록상표) code No: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB(reprinted 1998), BIACORE(등록상표) code No: BR-1001-84] 참조). 결합 성질, 예를 들면, 본 발명의 항체의 민감성은 원칙적으로 고정화된 항원, 예를 들면, 센서 표면에 존재하는 서열 번호 2("NEIDTQNRQIDR")(리간드)로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 사용하는 결합 연구에 의해 결정될 수 있다. 시험되는 항체(분석물)는 이동상, 즉, 용액 중에 제공될 것이다. 몇몇 경우에, 항원은 "포획 분자"로서 지칭되는 또 다른 고정화된 분자에 결합을 통해 표면에 간접적으로 부착된다. 항체가 고정화된 항원과 표면을 가로질러 별개의 펄스로 주입되는 경우, 필수적으로 3개의 상이 하위분리될 수 있다: (i) 샘플 주입 동안 항체와 항원의 회합; (ii) 샘플 주입 동안 평형 또는 정상 상태, 여기서 항체 결합 속도는 항체-항원 복합체로부터의 해리에 의해 균형이 맞춰지고; (iii) 버퍼 흐름 동안 표면으로부터의 항체의 해리. 이는 이러한 분석이 대안적으로 조사되는 고정화된 항체 및 이동상으로서의 항원 함유 용액과 함께 수행될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 회합 및 해리 상은 분석물-리간드 상호작용의 동역학에 대한 정보(ka 및 kd, 복합체 형성 및 해리의 속도, kd/ka=KD)를 제공한다. 평형 상은 분석물-리간드 상호작용(KD)의 친화성에 대한 정보를 제공한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "선택적 결합" 또는 "특이적인 결합"은, 예를 들면, 결합 친화성, 결합 특이성, 및 결합 활성과 같은 결합 성질을 포함한다(예를 들면, 문헌[David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, pp. 240(1998)] 참조). 결합 친화성은 이의 에피토프 결합 부위에서 항체 잔기의 시간 길이를 지칭하고, 이의 에피토프에 결합하는 항체와의 강도로서 표시될 수 있다. 결합 친화성은 항체의 평형 해리 상수(KD)로 설명도리 수 있고, 이는 평형에서 Kd/Ka 비로서 정의된다. Ka는 항체의 회합 속도 상수이고, Kd는 항체의 해리 속도 상수이다. 결합 친화성은 회합 및 해리 둘 다에 의해, 높은 회합 또는 낮은 해리가 높은 친화성을 보장할 수 없는 경우, 단독에 의해 결정된다. 회합 속도 상수(Ka), 또는 비-속도 상수(Kon)는 단위 시간당 결합 이벤트의 수, 또는 이의 항체-항원 복합체 내로 가역적으로 회합하는 항체 및 항원의 성향을 측정한다. 회합 속도 상수는 M-1 s-1로 표시되고, 하기와 같이 기호화된다: [Ab] x [Ag] x Kon. 회합 속도 상수가 커질수록, 항체는 이의 항원에 더 빠르게 결합하거나 항체와 항원 사이의 결합 친화성이 더 높아진다. 해리 속도 상수(Kd), 또는 오프-속도 상수(Koff)는 이의 구성 분자, 주로 항체 및 항원 내로 가역적으로 분리되는(해리되는) 항체-항원 복합체의 단위 시간 성향당 해리 이벤트의 수를 측정한다. 해리 속도 상수는 s-1로 표시되고, 하기와 같이 기호화된다: [Ab + Ag] x Koff. 해리 속도 상수가 더 적을수록, 항체는 이의 항원에 더 밀집되게 결합하거나, 항체와 항원 사이의 결합 친화성이 더 높아진다. 평형 해리 상수(KD)는 형성된 신규한 항체-항원 복합체가 항체-항원 복합체가 평형에서 해리되는 속도와 동일한 속도를 측정한다. 평형 해리 상수는 M으로 표시되고, Koff/Kon = [Ab] x [Ag] / [Ab+Ag]로 정의되고, 여기서 [Ab]는 항체의 몰 농도이고, [Ag]는 항원의 몰 농도이고, [Ab+Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, 모든 농도는 시스템이 평형일 때 이러한 성분의 농도이다. 평형 해리 상수가 작을수록, 항체가 이의 항원에 더 밀집되게 결합되거나, 항체와 항원 사이의 결합 친화성이 더 높아진다.
표적 항원, 예를 들면, BoNT/E 기질 SNAP-25는 일반적으로 소위 에피토프라고 불리는 하나 이상의 결합 부위를 갖고, 이는 항체의 CDR-형성된 항원-결합 부위에 의해 인식된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 "항원 결정소"와 동의어이며, 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적인 결합 또는 분자와 다른 상호작용을 할 수 있는 표적 항원, 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드, 다당류 또는 지질-함유 분자를 지칭한다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 본 명세서에서 지칭되는 "특이적인 결합"은, 예를 들면, 경쟁 실험 및 웨스턴 블롯을 포함한 다양한 잘 알려진 기술에 의해 시험될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 에피토프는 항체에 의해 인식되는 SNAP-25의 BoNT/E 절단 부위의 근처거나 인접하거나 그 내에 위치할 수 있는 BoNT/E-절단된 SNAP-25에서 항원 결정소에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로"는 선택적으로를 의미하고, 오직 하나의 방식으로 또는 오직 하나의 것에 독특한 효과 또는 영향을 갖거나 반응하는 것을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는"은, 항체 또는 결합 단백질 또는 결합 도메인과 관련하여 사용되는 경우, 항체 또는 결합 단백질/도메인이 비표적 에피토프와 실질적으로 교차 반응하지 않도록 하는 지시된 표적 에피토프에 대한 항체 또는 결합 단백질/도메인의 차별적인 결합을 나타낸다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 5 아미노산 잔기이고, 펩타이드 에피토프는 전형적으로 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 적어도 30 아미노산 잔기를 포함한다. 펩타이드 에피토프는 선형 또는 비연속 에피토프일 수 있다. 비연속 에피토프는 펩타이드의 1차 구조에 인접하지 않지만, 펩타이드의 2차, 3차 또는 4차 구조의 방식으로 에피토프 내로 함께 들어오는 아미노산 잔기를 포함한다. 추가로, 에피토프는 아미노산 서열, 예를 들면, 탄수화물 잔기, 당지질 또는 지단백질과 같은 지질 잔기, 또는 인산화된 아미노산과 같은 화학적으로 개질된 아미노산 잔기 이외의 분자의 일부를 포함할 수 있다는 것을 주의한다.
본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체의 또 다른 실시형태에 있어서, 항체는 서열 번호 1("C-NEIDTQNRQIDR-OH")로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 서열 번호 2로 나타낸 에피토프 SNAP-25169-180 "NEIDTQNRQIDR" 및/또는 SNAP-25180, 즉, BoNT/E-절단된 SNAP-25을 인식하고 이에 특이적으로 결합한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 서열 번호 3으로 나타낸 에피토프 SNAP-25170-180 "EIDTQNRQIDR" 및/또는 SNAP-25180, 서열 번호 4로 나타낸 서열의 에피토프 SNAP-25171-180 "IDTQNRQIDR" 및/또는 SNAP-25180, 서열 번호 5로 나타낸 에피토프 SNAP-25172-180 "DTQNRQIDR" 및/또는 SNAP-25180 , 서열 번호 6으로 나타낸 에피토프 SNAP-25173-180 "TQNRQIDR" 및/또는 SNAP-25180, 서열 번호 7로 나타낸 에피토프 SNAP-25174-180 "QNRQIDR" 및/또는 SNAP-25180, 또는 서열 번호 8로 나타낸 에피토프 SNAP-25175-180 "NRQIDR" 및/또는 SNAP-25180를 인식하고 이에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 단클론성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 단클론성 항체는 수탁 번호 DSM ACC3261하에 DSMZ(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라베 7B 소재)에 부다페스트 조약하에 2014년 12월 17일에 출원인에 의해 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된다.
본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체의 추가의 실시형태에 있어서, 항체는 100nM 미만, 50nM 미만, 10nM 미만, 5nM 미만, 2nM 미만, 1nM 미만 또는 바람직하게는 0.5nM 미만의 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대한 평형 해리 상수를 갖는다.
본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체의 다른 추가의 실시형태에 있어서, BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대한 항체의 평형 해리 상수는 BoNT/E에 이해 절단되지 않은 SNAP-25, 즉, 비-절단된 SNAP-25보다 적어도 10배, 적어도 50배 또는 바람직하게는 적어도 100배 높다.
본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체의 또 다른 실시형태에 있어서, 항체는 수탁 번호 DSM ACC3261하에 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 단클론성 항체에 포함된 CDR-L1(서열 번호 15), CDR-L2(서열 번호 16), CDR-L3(서열 번호 17), CDR-H1(서열 번호 18), CDR-H2(서열 번호 19) 및 CDR-H3(서열 번호 20)으로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 6개의 지시된 CDR을 포함한다.
본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체의 또 다른 실시형태에 있어서, 항체는 수탁 번호 DSM ACC3261하에 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 단클론성 항체에 포함된 VH 도메인 또는 VH 영역(서열 번호 22) 및/또는 VL 도메인 또는 VL 영역(서열 번호 21)을 포함한다.
이들 실시형태에 있어서, 본 발명은 항체 또는 이의 단편에 관한 것이고, 이는 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 절단 부위에 특이적으로 결합하고, 수탁 번호 DSM ACC3261하에 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 단클론성 항체에 포함된, 서열 번호 22로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 서열 번호 21로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역(들) 또는 도메인(들)의 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 추가로 본 발명에 포함된다. CDR-H1(서열 번호 18), CDR-H2(서열 번호 19) 및 CDR-H3(서열 번호 20)의 상응하는 서열 및 CDR-L1(서열 번호 15), CDR-L2(서열 번호 16) 및 CDR-L3(서열 번호 17)의 상응하는 서열은 각각 수탁 번호 DSM ACC3261하에 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 단클론성 항체에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 단클론성 항체이다. 더욱 바람직하게는, 단클론성 항체는 하기 실시예에서 생성되고 특성화된 마우스 단클론성 항체, 즉, 수탁 번호 DSM ACC3261하에 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 단클론성 항체이다. 상기 언급된 CDR, VH 및 VL 서열은 상기 항체이 상응하는 서열이다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은
a) BoNT/E 중독에 취약한 세포를 BoNT/E와 함께 일정한 시간 동안 BoNT/E가 이의 생물학적 활성을 행사할 수 있는 조건하에 인큐베이팅하는 단계;
b) 세포를 고정하고, 임의로, 세포를 세정제로 투과화시키는 단계;
c) 세포를 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 포획 항체와, 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대한 제1 포획 항체의 결합 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 제2 포획 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시키는 단계;
d) 세포를 제1 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 검출 항체와 상기 제1 포획 항체에 상기 제1 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시켜 제1 검출 복합체를 형성하고, 제2 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 검출 항체와 상기 제2 포획 항체에 상기 제2 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 반응시켜 제2 검출 복합체를 형성하는 단계로서, 여기서 제1 검출 항체가 제2 검출 항체와는 상이한, 상기 제2 검출 복합체를 형성하는 단계;
e) 단계 d)의 제1 및 제2 검출 복합체의 양을 결정하는 단계; 및
f) 제2 검출 복합체를 사용하여 상기 세포에서 BoNT/E에 의해 절단된 SNAP-25의 양을 계산하는 단계
를 포함하고, 이로써 상기 세포에서 상기 BoNT/E의 생물학적 활성을 결정하는, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 단계 c)에서 사용되는 제2 포획 항체는 본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체이다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 단계 c)에서 사용된 제2 포획 항체는 문헌[Jones et al., Journal of Immunological Methods 329(2008), p. 92-101]에 기재된 바와 같은 BoNT/E 절단 부위-특이적 항체이다.
본 발명의 방법에서, BoNT/E-절단된 SNAP-25는 세포(들)에서 직접적으로 검출될 수 있다. 이 때문에, 본 명세서에서 달리 더 상세하게 정의된 바와 같은 BoNT/E 중독에 취약한 세포를 일정 시간 동안 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드가 이의 생물학적 활성을 행사할 수 있는 조건하에 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드와 함께 인큐베이팅시켰다. 다음 단계에서, 세포를 고정하고, 사용된 고정제에 따라, 고정제, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 폼알데하이드 또는 언급된 고정제의 혼합물을 첨가함으로써 투과화시킨다. 임의로, 세포는 본 명세서에 달리 정의된 바와 같은 적어도 하나의 세정제, 예를 들면, 트리톤 X-100, 트윈 20, 사포닌, 디지토닌 또는 n-옥틸-β-글루코피라노시드를 사용하여 추가로 투과화될 수 있다. 세정제는 적절한 버퍼, 예를 들면, PBS 중에 포함될 수 있다. 그 후, 세포를 BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 포획 항체, 예를 들면, BoNT/E-절단된 SNAP-25의 절단 부위에 특이적으로 결합하는 항체와, 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 상기 제1 포획 항체를 결합하게 하고 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 제2 포획 항체를 결합하게 하는 조건하에 접촉시킨다. 적합한 에피토프, SNAP-25의 BoNT/E 절단 부위 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 항체의 발생 방법이 본 명세서에 기재된다. 추가로, 본 발명자는 하기 실시예에서 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 생성하고 특성화시켰다. 상기 항체는 SNAP-25206 미절단된 기질에 대한 이러한 절단 생성물의 바람직한 인식을 가능하게 하는 SNAP-25180 절단 생성물에 대한 높은 결합 특이성을 갖는다. 제1 포획 항체는 또한 BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25 둘 다에 존재하는 적절한 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 세포에서 BoNT/E 기질 SNAP-25의 총 함량 또는 양을 결정할 수 있다. 제2 포획 항체는 비-절단된 SNAP-25가 아닌 BoNT/E-절단된 SNAP-25에만 존재하는 에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합한다. 대안적으로, 세포를 상기 제1 및 제2 포획 항체의 혼합물과 접촉시킬 수 있고, 즉, 세포를 상기 언급된 조건하에 적어도 하나의 제1 포획 항체 및 적어도 하나의 제2 포획 항체와 동시에 접촉시킨다. 다음 단계에서, 세포를 상기 제1 포획 항체에 상기 제1 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 제1 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 검출 항체와 접촉시켜 제1 검출 복합체를 형성한다. 후속적인 단계에서, 세포를 상기 제2 포획 항체에 상기 제2 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 제2 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 검출 항체와 접촉시켜 제2 검출 복합체를 형성한다. 대안적으로, 세포를 상기 제1 및 제2 검출 항체의 혼합물과 접촉시킬 수 있고, 즉, 세포를 언급된 조건하에 적어도 하나의 제1 검출 항체 및 적어도 하나의 제2 검출 항체와 동시에 접촉시킨다. 대안적으로, 투과화된 세포를 언급된 조건하에 상기 제1 및 제2 포획 항체 및 상기 제1 및 제2 검출 항체의 혼합물과 동시에 접촉시킬 수 있다. 다음 단계에서, 제1 및 제2 검출 복합체의 양을 결정한다. 최종적으로, 상기 세포에서 BoNT/E에 의해 절단된 SNAP-25의 양을 제2 검출 복합체를 사용하여 계산한다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 바와 같은 용어 "계산하는"은 세포에서 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 양을 결정하는 것을 가능하게 하는 수학적 연산에 관한 것이다. 따라서, BoNT/E의 생물학적 활성을 세포에서 직접적으로 결정한다. 이는 당해 분야에 기재된 방법과 같이 세포의 용해 및 세포 용해물로부터의 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 단리 또는 농축이 더이상 필요하지 않다는 것을 의미한다. 추가로, 본 발명의 방법은 당해 분야에서 사용된 예를 들면, FRET-기반의 분석보다 시간이 덜 걸리고 덜 힘들고 더 정확하다.
본 발명의 방법은 하기에서 더욱 상세히 기재된다. 세포 배양을 위하여, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드 중독에 취약한 세포, 예를 들면, 신경 세포, SiMa 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPS)-유도된 신경세포를 먼저 96웰 마이크로티터 플레이트에 시딩한다. SiMa 세포를 예를 들면, 제WO 2010/105234호에 기재된 절차에 따라 신경세포 표현형으로 분화시키고, iPS-유도된 신경세포를, 예를 들면, 제WO 2012/135621호에 기재된 분석에 따라 신경세포 표현형으로 분화시킨다. 필요에 따라, 민감성, 각각 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드에 취약한 세포의 민감성의 균질성을 제WO 2015/124618호에 개시된 바와 같이 특정한 세포 배양 방법을 사용하여 최적화할 수 있다. 그 다음, 세포를 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드로 약 72시간 동안 중독시킨다. 후속적인 단계에서, 세포를 ELISA 분석 전에 마이크로티터 플레이트 위에 고정시킨다. 세포를 고정하기 위하여, 예를 들면, 얼음처럼 차가운 메탄올(-20℃)을 20분 동안 -20℃에서 세포에 첨가할 수 있다.
ELISA 분석을 수행하기 위하여, 세포를 먼저 세척한다. 세척 버퍼로서, 예를 들면, 10mM PBS 버퍼(pH 7.4)를 사용할 수 있다. 그 후, 내인성 프로테아제를 켄칭 버퍼, 예를 들면, 10mM PBS 중의 0.6% H2O2(pH 7.4)로 켄칭시킨 후, 또 다른 세척 단계를 수행한다. 하기 단계에서, 마이크로티터 플레이트 위의 결합 무함유 부위를 적절한 차단 버퍼, 예를 들면, 10mM PBS 버퍼 중의 2% BSA(pH 7.4)로 차단한다. 그 후, 세포를 상기 언급된 바와 같이 세척 버퍼로 세척한다.
다음 단계에서, 고정되고 투과화된 세포를, 예를 들면, 2개의 상이한 항체의 혼합물과 함께 인큐베이팅한다. 혼합물은 BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제2 포획 항체, 예를 들면, BoNT/E-절단된 SNAP-25의 BoNT/E 절단 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 목적을 위하여, 본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체는 특히 적합하다. 상기 제1 및 제2 포획 항체는 또한 후속적으로 적용될 수 있다. 예를 들면, 제1 포획 항체는 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있고, 따라서 세포에서 SNAP-25, 즉, BoNT/E-비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 총 양 또는 함량의 정량을 가능하게 한다. 추가로, 이러한 제1 포획 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 평가를 기초로 세포에서 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 양을 정규화하는데 사용될 수 있다. 제2 포획 항체는 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하고, 따라서 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 결정 및 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 방법에서 하기 전체(BoNT/E-비-절단된 및 BoNT/E-절단된) SNAP-25 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 검출을 마이크로티터 플레이트 또는 세포 배양 디쉬 위에서, 즉 세포 사이에서 직접적으로 수행할 수 있다. 유리하게는, 따라서 당해 분야에 기재된 방법과 같이, 본 발명의 방법에서 세포 추출물을 제조하고 세포 용해물로부터 BoNT/E-절단된 SNAP-25를 단리하고/단리하거나 농축시키는 것이 필요하지 않다. 그 후, 각각의 항원에 결합한 과량의 항체를 제거하기 위하여 세포를 세척한다. 후속적인 단계에서, 투과화된 세포를 적어도 하나의 제1 검출 항체 및 적어도 하나의 제2 검출 항체와 접촉시킨다. 상기 항체를 혼합물로서, 즉, 동시에 또는 후속적으로 적용할 수 있다. 제1 검출 항체는 제1 포획 항체에 특이적으로 결합한다. 따라서, 제1 검출 복합체가 형성된다. 제1 검출 항체는 제1 포획 항체가 이로부터 유도되는 종에 대한 것일 수 있다. 예를 들면, 토끼 다클론성 항-SNAP-25 항체 S9684(시그마(Sigma))가 BoNT/E-비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체로서 사용되는 경우, 항-토끼 알카리 포스파타제-접합된 항체를 제1 검출 항체로서 사용할 수 있다. 제2 검출 항체는 제2 포획 항체에 특이적으로 결합한다. 이에 따라, 제2 검출 복합체가 형성된다. 제2 검출 항체는 제2 포획 항체가 이로부터 유도되는 종에 대한 것일 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에서 생성되고 특성화된 마우스 단클론성 항체(mAb)가 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제2 포획 항체로서 사용되는 경우, 항-마우스 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체는 제2 검출 항체로서 사용될 수 있다. 제1 검출 항체 및 제2 검출 항체가 본 발명의 방법에서 사용되는 바와 같이 각각의 제1 및 제2 포획 항체의 특이적인 검출을 가능하게 하기 위하여 상이한 효소와 접합된다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 HRP-기반의 검출은 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대하여 사용할 수 있고, 알칼리 포스파타제-기반의 검출은 전체(BoNT/E-절단된 및 BoNT-E-비-절단된) SNAP-25에 대하여 사용할 수 있다. 그 후, 세포를 다시 세척한다. 후속적인 단계에서, 형광발생 HRP 기질을 세포에 가한다. HRP 기질로서, 예를 들면, 540㎚에서 여기하고 600㎚에서 방출하는 암플렉스 울트라레드(Amplex UltraRed)(인비트로젠)를 사용할 수 있다. HRP 기질과의 인큐베이션을 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 의한 기질의 충분한 전환에 충분한 시간 동안 수행한다. HRP 기질과의 인큐베이션에 후속적으로, 예를 들면, AP 기질 DiFMUP(6,8-다이플루오로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트; 여기 360㎚; 방출 450㎚)를 HRP 기질에 가할 수 있고, 세포를 상기 2개의 기질의 혼합물과 함께 인큐베이팅한다. 상기 AP 기질과의 인큐베이션을 알칼리 포스파타제에 의한 기질의 충분한 전환이 가능한 시간 동안 수행한다. 당해 분야에 알려진 바와 같이, 기질은 검출 한계의 정의에 따라, 측정된 신호가 적어도 평균의 3개의 표준 편차와 합한 블랭크의 평균 값만큼 높도록 하는데 충분한 양으로 전환되어야 한다. 검출 한계는 문헌에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다(예를 들면, 문헌[Armbruster and Pry, Clinical Biochem. Rev. 2008, 29(Supplement 1): S49-S52] 참조). 알칼리 포스파타제의 최적 pH가 알칼리 영역에 있기 때문에, 상응하는 기질 버퍼는 강한 알칼리성이다. 알칼리 포스파타제 기질을 HRP 기질에 첨가하는 경우, 홀스래디쉬 퍼옥시다제의 반응은 알칼리 pH에 의해 중단되고, 알칼리 포스파타제는 DiFMUP를 전환시킨다. 전환된 HRP 기질은 알칼리 pH에 영향을 받지 않는다. 최종적으로, 2개의 기질의 형광성은 하기와 같이 측정한다:
앰플렉스 울트라레드: 여기 540㎚; 방출 600㎚
DiFMUP: 여기 360㎚; 방출 450㎚
당해 분야의 숙련가에게 인식된 바와 같이, 이들 형광발생 기질만이 사용된 기질의 상이한 여기/방출 파장을 나타내는 본 발명의 방법에서 제1 및 제2 포획 항체의 검출에 적절하다. 오직 이러한 경우에만, 이들은 각각의 항원, 즉, 전체 SNAP-25(BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25) 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 특이적인 검출을 가능하게 한다. 이에 따라, 모든 웰 또는 세포 배양 디쉬에서 동시에 SNAP-25의 전체 함량 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 함량을 정량하는 것이 가능하다. 이러한 관점에서, 유리하게는 이를 본 발명의 방법에 자동화하는 것이 가능하다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법을 위하여 선택된 형광발생 기질은 각각의 기질의 특이적인 검출을 가능하게 하기 위하여 여기/방출 스펙트럼 사이의 충분한 쉬프트를 나타낸다는 것이 예상된다. 이러한 필요조건은, 예를 들면, HRP 기질 앰플렉스 및 이의 유도체 및 AP 기질 DiFMUP에 대하여 충족된다. 반면, 최적의 경우에, 사용된 형광발생 기질의 여기/방출 스펙트럼 사이의 겹침이 없고, 이는 사용된 형광발생 기질의 여기 스펙트럼의 피크 면적 중의 30% 이하의 겹침이 허용된다는 것을 경험하였다.
당해 분야의 숙련가에게 추가로 알려진 바와 같이, 본 발명의 방법은 세포에서 신경독소 폴리펩타이드 BoNT/E에 의하여 절단된 기질 SNAP-25의 직접적인 검출 및 정량을 가능하게 하고, 이로써 상기 세포에서 상기 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 결정한다. 유리하게는, 본 발명의 방법은 당해 분야에 알려진 방법 및 분석에 필요한, 세포 용해물 또는 추출물의 제조 및 세포 용해물/추출물로부터의 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 단리 및 농축이 필요하지 않다. 이의 결과로서, 샘플 물질을 절약할 수 있다. 추가로, 샘플 중의 전체 SNAP-25의 양 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 양이 동시에 결정될 수 있기 때문에, 샘플 제조 및 샘플의 수는 본 발명의 방법에 의해 감소될 수 있다. 당해 분야에 기재된 분석에서, 항원, 즉, 전체 신경독소 기질 및 절단된 신경독소 기질 둘 다를 서로 별개로 검출하기 위하여 샘플을 더 세분한다. 본 발명의 방법은 샘플의 세분을 불필요하게 만든다. 이로써, 샘플의 세분으로부터 야기되는 불균질성을 피할 수 있고, 샘플 물질을 절약할 수 있다. 추가로, 항원은 당해 분야에 기재된 분석에서 분해될 수 있고, 절단된 신경독소 기질의 검출을 변조할 수 있는 당해 분야에 기재된 분석으로 분해될 수 있다. 이는 당해 분야에 기재된 분석으로 인한 것이고, 세포를 세정제-함유 용해 버퍼와 함께 인큐베이팅하지만, 그러나, 이는 더 긴 샘플의 저장 동안 신경독소 기질의 분해를 야기하는 신경독소 폴리펩타이드 또는 다른 내인성 프로테아제를 불활성화할 수 없다. 더 강한 용해 버퍼는 상기 분석에서 세포 용해물의 필요한 사용으로 인하여 선행 기술에 기재된 ECL 샌드위치 ELISA에서 사용될 수 없다. 이는 상기 언급된 항원의 응집이 세포 배양 디쉬 또는 마이크로티터 플레이트의 플라스틱 표면에 대한 항원의 비특이적 흡착을 야기할 수 있고, 결국 적절한 항체에 의한 항원의 검출을 방해하기 때문이다. 항원의 검출을 위한 항체도 용해물과 접촉하게 되기 때문에, 항체는 또한 응집할 수 있다. 이러한 경우에, 항원의 신뢰할 수 있고 정확한 검출이 더 이상 불가능하게 된다. 본 발명자는 당해 분야에 기재된 신경독소 활성의 생물학적 활성의 검출에 대한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 이러한 분해 반응을 경험하였다. -20℃에서 용해물의 장기간 저장시, 새로운 용해물 샘플과 비교하여, 전체 SNAP-25의 검출 신호는 시험 시스템의 민감성을 감소시킴으로써 강하게 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다. BoNT/E 신경독소 기질 SNAP-25 및 BoNT/E 신경독소 또는 다른 내인성 프로테아제는 둘 다 세포 배양 디쉬 위의 응집에 의해 즉시 불활성화되기 때문에, SNAP-25의 분해 및/또는 샘플의 불안정성은 세포 배양 디쉬 위에 세포를 직접 고정시킴으로써 피할 수 있는 것으로 본 발명자에 의해 밝혀졌다. 이는, 예를 들면, 메탄올 또는 당해 분야에 알려진 다른 고정액 또는 고정제, 예를 들면, 에탄올, 아세톤, 폼알데하이드 또는 이들의 혼합물 또는 본 명세서세 기재된 다른 고정제에 의한 세포의 고정을 사용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 이러한 고정 방법을 사용한 모 SiMa 세포(인간 신경아세포종 세포; DSMZ no.: ACC 164) 및 iPS-유도 신경세포(Whitemarsh et al.(2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35)의 안정성의 분석은 신선한 것과 냉장고에서 7일 동안 저장된 세포 배양 디쉬 사이의 차이를 나타내지 않았다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나의" "한" 및 "그"는 문맥에서 명백하게 달리 진술하지 않는 한, 단수 및 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들면, "세포"는 하나 또는 그 이상의 세포를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 언급된 항목, 숫자, 퍼센트, 또는 용어의 수치를 정량할 때, 용어 "약"은 언급된 항목, 숫자, 퍼센트, 또는 용어의 수치의 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트, 9 퍼센트, 8 퍼센트, 7 퍼센트, 6 퍼센트, 5 퍼센트, 4 퍼센트, 3 퍼센트, 2 퍼센트 또는 1 퍼센트 범위를 나타낸다. 바람직하게는 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트의 범위이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "포함하는", "포함한다" 및 "에 포함된"은 "포함하는", "포함한다" 또는 "함유하는", "함유하다"와 동의어이고, 포함적이거나 또는 말단 개방형이며, 추가적인 언급되지 않은 구성, 요소 또는 방법의 단계를 배제하지 않는다. 명백하게, 상기 용어 "포함하는"은 용어 "로 이루어지는"을 포함한다. 더욱 구체적으로, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어 "포함한다"는 모든 열거된 요소 또는 방법의 단계를 포함하나, 또한 추가적인, 구체적으로 명명되지 않은 요소 또는 방법의 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 단계 a), b) 및 c)를 포함하는 방법은 그 가장 좁은 의미로 단계 a), b) 및 c)로 이루어지는 방법을 포함한다. 상기 문구 "로 이루어지는"은 상기 구성 (또는 장치, 또는 방법)이 언급된 요소 (또는 단계)를 가질 뿐, 그 이상은 아님을 의미한다. 대조적으로, 상기 용어 "포함한다"는 추가적인 단계, 예를 들면, 단계 a), b) 및 c)와 더불어 단계 d) 및 e)를 포함하는 방법 또한 포함할 수 있다.
"1 내지 5 마이크로몰"과 같이 수치의 범위가 본 명세서에서 사용되는 경우, 상기 범위는 1 및 5 마이크로몰 뿐만 아니라, 예를 들면, 2, 3 및 4 마이크로몰과 같이 1과 5 사이의 모든 수치 값을 또한 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어 "시험관내"는 동물 또는 인간의 몸체 외부 또는 바깥을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어 "시험관내"는 "생체외"를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 상기 용어 "생체외"는 전형적으로 동물 또는 인간의 몸체로부터 분리되고, 상기 몸체의 외부, 예를 들면, 배양 용기 내에서 유지 또는 번식된 조직 또는 세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어 "생체내"는 상기 동물 또는 인감 몸체에 대하여 안쪽, 또는 내부를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 시험관내 방법이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "신경독소 폴리펩타이드"는 클로스트리디움 보툴리눔 및 클로스트리디움 테타니 신경독소, 즉, 보툴리눔 독소(BoNTs) 및 파상풍 독소(TeNT)를 의미한다. 더욱 구체적으로, 상기 용어는 달리 기재되지 않는 경우, BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드 또는 BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드를 의미한다. BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드 및 이들을 인코딩하는 핵산 서열은 참조로서 본 명세서에 포함되는 제WO 2013/068476호에 정의되고 특성화되었고, 이의 기재 내용은 참조로서 본 명세서세 포함된다. 따라서, 신경독소 폴리펩타이드 및, 특히, 이의 경쇄 및 중쇄는 BoNT/E로부터 유도된다. 실시형태에 있어서, 신경독소 폴리펩타이드의 상기 경쇄 및 중쇄는 BoNT/E 신경독소의 경쇄 및 중쇄이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 신경독소 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 9(BoNT/E를 인코딩하는 핵산 서열), 서열 번호 11(BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 서열 번호 13(BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열)로 나타난 핵산 서열을 포함한다. 게다가, 실시형태에 있어서, 서열 번호 10(BoNT/E), 서열 번호 12(BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드) 또는 서열 번호 14(BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드)로 나타난 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 본 발명의 수단 및 방법의 실시형태에 있어서 서열 번호 10(BoNT/E), 서열 번호 12(BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드) 또는 서열 번호 14(BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드)로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 신경독소 폴리펩타이드가 추가로 포함된다. 추가의 실시형태에 있어서, 보툴리눔 신경독소는 제WO 2014/068317호에 기재된 코돈-최적화된 핵산 서열을 사용하여 수득할 수 있는 BoNT/E1이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는 상기 언급된 폴리뉴클레오타이드의 변이체이고, 또 다른 실시형태에 있어서 이는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 야기할 수 있다. 게다가, 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오타이드는 또 다른 실시형태에 있어서 서열 번호 9, 11 또는 13로 나타낸 핵산 서열과 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열 변이체, 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14로 나타낸 아미노산 서열과 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "동일한"은 2개의 핵산 서열 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일한 아미노산의 수를 결정하고 가장 높은 순서 매치가 수득되도록 서열을 정렬함으로써 특성화된 서열 동일성을 나타낸다. 이는, 예를 들면, BLASTP, BLASTN 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램에 기재된 공개된 기술 또는 방법을 사용하여 계산할 수 있다(Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). 퍼센트 동일성 값은, 하나의 실시형태에 있어서, 전체 아미노산 서열에 대하여 계산된다. 다양한 알고리즘을 기초로한 일련의 프로그램이 상이한 서열을 비교하기 위하여 숙련가에게 이용 가능하다. 이러한 맥락에서, 니들맨(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) 또는 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman)의 알고리즘이 특히 신뢰할 수 있는 결과를 제공한다. 서열 정렬을 수행하기 위하여, GCG 소프트웨어 패킷(Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)의 부분인 프로그램 PileUp(Higgins 1989, CABIOS 5, 151) 또는 프로그램 Gap 및 BestFit(Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482)를 사용할 수 있다. 퍼센트(%)로 상기 기재된 서열 동일성 값은 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 하기 설정으로 전체 서열 영역에 대한 프로그램 GAP을 사용하여 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 결정되는 것이다: 갭 중량: 50, 길이 중량: 3, 평균 매치: 10.000 및 평균 미스매치: 0.000, 달리 특정되지 않는 한, 이는 서열 정렬에 대한 표준 설정으로서 항상 사용될 것이다. 실시형태에 있어서, 각각의 상기 언급된 변이체 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 및, 또 다른 실시형태에 있어서, BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드 또는 BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드의 모든 생물학적 성질을 보유한 폴리펩타이드를 인코딩한다. 당해 분야의 숙련가는 심지어 미가공 전구체가 일부 생물학적 기능을 행사하거나 부분적으로 활성일 수 있다는 것이 가능함에도 불구하고, 완전한 생물학적 활성이 단백질분해 활성화 후에만 유지된다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "생물학적 성질"은 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 시토졸 내로 엔도솜 막을 가로지르는 자리이동, 및/또는 (d) 시냅스 소포 막 융합에 포함된 단백질의 엔도단백질분해 절단을 지칭한다. 생물학적 활성을 평가하기 위한 생체내 분석은 문헌[Pearce et al., Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77] 및 문헌[Dressler et al., Dressler 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637]에 기재된 바와 같은 마우스 LD50 분석 및 생체외 마우스 편측횡경막 분석을 포함한다. 생물학적 활성은 일반적으로 마우스 단위(MU)로 표시된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 1 MU는 복강 내 주입 후 특정된 생쥐 집단의 50%를 사멸시키는 신경독소 구성성분의 양, 즉, 생쥐 i.p. LD 50이다. 추가의 실시형태에 있어서, 변이체 폴리뉴클레오타이드는 개선되거나 변경된 생물학적 성질을 갖는 BoNT/E 신경독소 또는 BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있고, 예를 들면, 이들은 효소 인식을 위해 개선되는 절단 부위를 포함할 수 있고, 수용체 결합에 대하여 개선될 수 있고, 생물학적 활성, 또는 임의의 상기 특정된 다른 성질의 변경된, 예를 들면, 연장되거나 감소된 기간을 가질 수 있다.
따라서, 본명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드 또는 BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드의 생물학적 활성"은 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드에 대한 생물학적 성질 특성, 주로, (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 시토졸 내로 엔도솜 막을 가로지르는 자리이동, 및/또는 (d) 시냅스 소포 막 융합에 포함된 단백질의 엔도단백질분해 절단을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드 또는 BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드는 상기 언급된 성질 a) 내지 d) 중 적어도 하나, 바람직하게는 시냅스 소포 막 융합에 포함된 단백질의 엔도단백질분해 절단, 또는 a) 내지 d)에 열거된 2 또는 3 또는 모든 4개의 생물학적 성질을 나타내는 것으로 예상된다.
본 기재내용의 실시형태는, 부분적으로, 확립된 세포주로부터의 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포"는 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드 또는 BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드에 의한 중독에 취약한 임의의 진핵 세포 또는 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드 또는 BoNT/E-MDM2 폴리펩타이드를 흡수할 수 있는 임의의 진핵 세포를 나타낸다. 용어 세포는 다양한 유기체, 예를 들면, 뮤린, 래트, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간 세포; 예를 들면, 신경세포 및 비신경세포와 같은 다양한 세포로부터의 세포를 포함하고; 이종 세포 집단, 조직 또는 유기체 또는 그 부분으로부터 단리될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "확립된 세포주"는 "불멸 세포주" 또는 "형질전환된 세포주"와 동의어이고, 유기체, 조직, 또는 기관 공급원으로부터 유도된 세포 집단으로부터의 무기한 증식을 위하여 선택된 세포의 세포 배양물을 의미한다. 정의에 따르면, 확립된 세포주는 1차 세포의 세포 배양물을 배제한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "1차 세포"는 신선한 조직 또는 기관으로부터 직접 채취한 세포이고, 무제한으로 전파할 가능성을 갖지 않는다. 예를 들면, 1차 신경 세포는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 확립된 세포주는 세포의 이종 집단 또는 세포의 단일한 집단을 포함할 수 있다. 단일 세포로부터 유도된 확립된 세포주는 클론 세포주로 지칭된다. 확립된 세포주는 세포가 신경독소 폴리펩타이드, 예를 들면, BoNT/E로 기질, 예를 들면, SNAP-25를 단백질분해적으로 절단하고, 신경독소 수용체에 대한 신경독소, 예를 들면, BoNT/E 수용체에 대한 BoNT/E, 신경독소/수용체 복합체의 내재화, BoNT/E 신경독소 경쇄 세포내 소포로부터 세포질 내로 BoNT/E 신경독소 경쇄의 자리이동 및 BoNT/E 신경독소 기질 SNAP-25의 단백질분해 절단을 포함하는 전체 세포 메커니즘을 겪는데 필요한 모든 성분을 내인성으로 발현하는 세포 중 하나일 수 있다. 대안적으로, 확립된 세포주는 외인성 공급원으로부터 세포가 신경독소, 예를 들면, BoNT/E가 단백질분해적으로 기질, 예를 들면, SNAP-25 절단하고, 신경독소 수용체에 대한 신경독소, 예를 들면, BoNT/E 수용체에 대한 BoNT/E, 신경독소/수용체 복합체의 내재화, BoNT/E 신경독소 경쇄 세포내 소포로부터 세포질 내로 BoNT/E 신경독소 경쇄의 자리이동 및 BoNT/E 신경독소 기질 SNAP-25의 단백질분해 절단을 포함하는 전체 세포 메커니즘을 겪는데 필요한 적어도 하나의 성분을 유도하는 하나의 세포일 수 있다. 또한 유전적으로 조작된 세포주로 지칭되는 바와 같이, 이러한 확립된 세포주로부터의 세포는, 예를 들면, 외인성 FGFR2, 외인성 FGFR3, 외인성 SV2, 외인성 신경독소 기질 SNAP-25, 또는 이의 임의의 조합을 발현할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "BoNT/E 신경독소 중독에 취약한 세포(들)"는 BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드가 BoNT/E 신경독소 기질 SNAP-25을 절단하고, BoNT/E 수용체에 대한 BoNT/E, 신경독소/수용체 복합체의 내재화, BoNT/E 신경독소 경쇄 세포내 소포로부터 세포질 내로 BoNT/E 신경독소 경쇄의 자리이동 및 BoNT/E 신경독소 기질 SNAP-25의 단백질분해 절단을 포함하는 전체 세포 메커니즘을 겪을 수 있는 세포를 의미한다. BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 결정하는 분석은 당해 분야에 잘 알려져 있고 또한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같다(예를 들면, 문헌[Pellett et al.(2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392; Whitemarsh et al.(2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 참조). 따라서, "BoNT/E 신경독소 중독에 취약한 세포"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 BoNT/E 신경독소 민감성 세포를 의미한다. 언급된 용어는 세포 또는 세포주, 예를 들면, 단리된, 1차 세포 또는 이의 세포주 또는 확립된 세포주의 세포 또는 확립된 세포주, 예를 들면, 신경 세포로 분화될 수 있는 종양 세포 또는 종양 세포주, 예를 들면, 본 명세서에서 달리 정의된 바와 같은 신경아세포종 세포 또는 신경아세포종 세포주를 포함한다. 예를 들면, 상기 신경아세포종 세포주는 DSMZ(ACC 164)로부터 상업적으로 이용 가능한 SiMa 세포주일 수 있다. 세포주 SiMa의 특이적인 클론은 추가로 제WO 2010/105234호에 기재된다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다른 신경아세포종 세포주는 하기 ATCC 또는 DSMZ 번호하에 ATCC 또는 DSMZ로부터 수득될 수 있다: CRL-2263하에 세포주 N1E-115, CCL-131하에 세포주 Neuro2a, CRL-2266하에 세포주 SH-SY5Y, CRL-1721하에 세포주 PC12, ACC 157(DSMZ)하에 세포주 MHH-NB-11 및 CRL-2271하에 세포주 SK-N-BE(2). 신경독소 중독에 취약한 다른 종양 세포는 P-19 세포(뮤린 배아 암종 세포주)(DSMZ no. ACC 316)이다. 추가로, 유도 다능성 줄기 세포(iPS)-유도된 신경세포, 바람직하게는 인간 유도 다능성 줄기 세포(iPS)-유도된 신경세포가 BoNT/E 신경독소 중독에 취약한 세포에 포함된다(예를 들면, 문헌[Whitemarsh et al.(2012), loc. cit] 참조). 이러한 인간 iPS-유도된 신경세포는 또한, 예를 들면, 셀룰라 다이나믹스(Cellular Dynamics)로부터 상업적으로 이용 가능하다. iPS 세포의 생성 방법은, 예를 들면, 문헌[Yu et al.(Science 2009 May 8; 324(5928): 797-801. Epub 2009)], 제WO 2011/056971호 및 제WO 2011/025852호에 기재된다. 몇몇 실시형태에 있어서, iPS는, 예를 들면, 제WO 2012/135621호 및 미국 특허 출원 제US 2010/0279403호 및 제US 2010/0216181호에 기재된 적합한 방법을 사용하는 신경세포로 분화된다.
용어 "세포를 고정시키는 것" 또는 "세포의 고정"은 당해 분야에 기재된 방법을 사용하여 세포를 고정시키는 것을 의미한다. 일반적으로, 고정은 생물학적 조직이 부패하는 것을 방지하고 따라서 자가분해를 방지하는 화학적 공정이다. 고정은 임의의 진행 중인 생화학적 반응을 종료시키고, 또한 처리된 조직의 기계적 강도 또는 안정성을 증가시킬 수 있다. 고정은 시험 또는 분석을 위하여 상기 조직 또는 세포를 제조하는 공정에서 가능한 한 이의 천연 상태와 가깝게 생물학적 물질의 샘플, 예를 들면, 조직 또는 세포를 보존한다. 이 때문에, 고정액은 일반적으로 샘플을 달리 소화시키거나 손상시키는 고유한 생분자(특히 단백질분해 효소)를 무력화시키는 작용을 한다. 추가로, 고정액은 전형적으로 외적인 손상으로부터 샘플을 보호한다. 고정액은 조직 또는 세포 배양물 중에 존재할 수 있거나 고정된 조직 또는 세포 배양물을 달리 클론화시킬 수 있는 박테리아를 포함한 대부분 흔한 미생물에 독성이다. 추가로, 많은 고정액은 화학적으로 고정된 물질을 덜 맛있게 만들거나 기회감염성 미생물을 소화하지 않거나 이에 독성이다. 최종적으로, 고정액은 세포 또는 조직을 이의 기계적 강도 또는 안정성을 증가시키는 분자 수준으로 종종 변경한다. 이러한 증가된 강도 및 경직성은 추가의 분석을 위하여 가공됨에 따라 샘플의 모양과 구조와 같은 형태학을 보존하는데 도움이 될 수 있다. 고정액 및 고정 프로토콜이 추가의 가공 단계 및 계획된 최종 분석에 따라 좌우될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 예를 들면, 면역조직화학은 특이적인 단백질 표적, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한다. 연장된 고정은 이들의 표적을 화학적으로 차폐하고 항체 결합을 방지할 수 있다. 이들 경우에, 예를 들면, 차가운 포르말린을 사용하는 빠른 고정 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 얼음처럼 차가운 메탄올(-20℃)을 추가하여 고정화될 수 있다. 알데히드, 예를 들면, 폼알데하이드 또는 글루타알데히드 및 알코올, 예를 들면, 에탄올 또는 메탄올 이외에, 산화제, HEPES-글루탐산 버퍼-매개된 유기 용매 보호 이펙트(HOPE) 고정액, 아세톤, 또는 이들의 혼합물, 예를 들면, 메탄올 및 아세톤, 메탄올 및 에탄올, 파라폼알데하이드 및 트리톤 X-100, 또는 파라폼알데하이드 및 메탄올의 혼합물이 고정 프로토콜에 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 세포를 고정시키는 것은 메탄올, 에탄올, 아세톤, 폼알데하이드 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 고정제의 첨가에 의해 수행된다. 이의 항원에 대한 항체의 자유로운 접근을 보장하고/보장하거나 지지하기 위하여, 세포는 적어도 하나의 세정제, 예를 들면, 트리톤 X-100을 포함하는 적절한 투과화 버퍼를 사용하여 투과화시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 투과화 버퍼는, 예를 들면, 10mM PBS 버퍼 중의 0.5% 트리톤 X-100이다. 본 발명의 방법의 다른 실시형태에 있어서, 세포는 투과화 버퍼, 예를 들면, 트윈 20, 사포닌, 디지토닌 또는 n-옥틸-β-글루코피라노시드로부터 선택된 적어도 하나의 세정제를 포함하는 PBS를 사용하여 투과화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 언급된 둘 이상의 세정제의 혼합물은 상기 투과화 버퍼 중에 사용될 수 있다. 일반적으로, 고정 강도 및 시간은 더 두껍고 구조적으로 복합적인 조직 분획보다 세포의 경우에 더 상당히 짧다. 면역세포화학에서, 샘플 제조는 필수적으로 슬라이드, 세포 배양 디쉬 또는 마이크로티터 플레이트에 표적 세포를 고정할 수 있다. 완벽한 고정은 항원을 고정화시킬 것이고, 정확한 세포 및 세포이하 구조물을 유지하고, 모든 세포 및 세포이하 구획에 대한 항체의 차단되지 않은 접근을 허용한다. 상기 예시된 바와 같은 넓은 범위의 고정액이 일반적으로 사용되고, 방법의 정확한 선택은 시험되는 항원의 성질 및 사용된 항체의 성질에 따라 좌우될 것이다. 고정 방법은 일반적으로 2개의 클래스에 속한다: 유기 용매 및 가교 결합 시약. 유기 용매, 예를 들면, 알코올 및 아세톤은 지질을 제거하고 세포를 탈수시키고, 세포 구조물 위의 단백질이 침전된다. 가교 결합 시약, 예를 들면, 파라폼알데하이드는 일반적으로 유리 아미노기를 통해 연결된 항원의 네트워크를 생성하는 분자간 브릿지를 형성한다. 가교 결합제는 유기 용매보다 우수한 세포 구조를 보존하지만, 일부 세포 구성원의 항원성을 감소시킬 수 있고, 종종 상기 지시된 투과화 단계의 첨가를 필요로 하고, 견본에 항체의 접근을 허용한다. 두 방법에 의한 고정은 단백질 항원을 변성시킬 수 있고, 이러한 이유로, 항체는 세포 염색에 더 유용할 수 있는 변성된 단백질에 대하여 제조된다. 적절한 고정 방법은 관련 출원인에 따라 선택될 수 있다. 세포의 고정 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 따라서 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Methods in cell biology, Volume 37: Antibodies in cell biology; Edited by David J. Asai; 1993, Academic Press Inc] 참조).
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "접촉시키는"은 화합물의 물리적 및/또는 화학적 상호작용이 가능하도록 적어도 두 개의 상이한 화합물을 물리적으로 가까이 두는 것을 의미한다. 이러한 특이적인 상호작용을 가능하게 하는 적합한 조건은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 분명히, 상기 조건은 본 발명의 방법에서 적용되는 항체 및 세포에 따라 좌우될 것이고, 당해 분야의 숙련가에 의해 일상적으로 적응될 수 있다. 게다가, 상호작용을 가능하게 하는데 충분한 시간은 숙련가에 의해 지체 없이 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 기재된 세포와 각각의 항체를 접촉시키는 개별적인 단계 사이에, 접촉에 적합한 조건을 수득하기 위하여 세척 단계가 수행될 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 단계 c)에서 세포를 BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 포획 항체와 접촉시킨 후, 세척 단계를 도입하여 제1 검출 항체 및/또는 제2 검출 항체를 적용하기 전에, 남은 용액 및/또는 과량의 제1 및 제2 포획 항체를 제거할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 방법에서 세포를 제1 및/또는 제2 검출 항체와 접촉시킨 후, 세척 단계가 포함될 수 있다. 적절한 세척 버퍼는, 예를 들면, 10mM PBS 버퍼(pH 7.4)이다. 더욱 특이적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "접촉시키는"은 본 발명의 방법의 단계 c)에서 상기 SNAP-25에 상기 포획 항체가 결합할 수 있는 조건하에 세포를 적어도 하나의 BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 포획 항체와 접촉시키는 것을 지칭한다. 제1 및 제2 포획 항체는 세포에 동시에, 예를 들면, 혼합물로서, 또는 후속적으로 적용될 수 있다. "접촉시키는"은 추가로 본 발명의 단계 d)에서 세포를 상기 제1 포획 항체에 상기 제1 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에, 제1 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 검출 항체 및 상기 제2 포획 항체에 상기 제2 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 제2 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 검출 항체와 접촉시키는 것을 지칭한다. 이로써, 제1 및 제2 검출 복합체가 형성된다. 대안적으로, 제1 및 제2 검출 항체는 또한 후속적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, "제1 포획 항체"는 BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 포함된 에피토프에 특이적으로 결합한다. SNAP-25는 BoNT/E의 알려진 기질이다. 상기 제1 포획 항체는 비절단된 SNAP-25 및 BoNT-E-절단된 SNAP-25 둘 다에서 이용 가능한 에피토프에 특이적으로 결합하도록 전체 양, 즉, 세포에서 SNAP-25의 완전한 함량을 결정하는 것을 가능하게 한다. BoNT/E에 있어서, BoNT/E 절단 부위(Arg(R) 180 - Ile(I) 181)에 N-말단 위치에, 즉, SNAP-25의 아미노산 잔기 1과 180 사이에 위치한 에피토프를 제1 포획 항체에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법의 실시형태에 있어서, SNAP-25는 인간 SNAP-25A 또는 B 또는 래트, 마우스, 소, 다니오(Danio), 붕어, 손톱개구리속, 토르페도(Torpedo), 둥근성게, 꼴두기, 물달팽이, 히말라야 원숭이(Rhesus macaque), 침팬지 또는 군소로부터 이의 호몰로그, 파랄로그 또는 오쏠로그이다. 뮤린 및 인간 SNAP-25의 상응하는 아미노산 서열은, 예를 들면, 각각 UniProt 등록 번호 P60879 및 P60880로 나타낸다. SNAP-25는 천연 발생, 재조합, 외인성 또는 내인성 핵산 분자 또는 폴리펩타이드로서 사용될 수 있다. 상기 지시된 SNAP-25 단백질 중의 BoNT/E 절단 부위는, 예를 들면, 제EP 1 926 744 B1호에 개시된다.
본 발명의 방법에서 제1 포획 항체로서 사용될 수 있는 적절한 항체의 예는, 예를 들면, 토끼 다클론성 항-SNAP-25 항체 S9684(시그마)(Fernandez-Salas E, Wang J, Molina Y, Nelson JB, Jacky BPS, et al.(2012) Botulinum Neurotoxin Serotype a Specific Cell-Based Potency Assay to Replace the Mouse Bioassay. PLoS ONE 7(11): e49516. doi:10.1371/journal.pone.0049516), 토끼 다클론성 항-SNAP25 항체 PA5-19708(피어스 안티바디스(Pierce Antibodies), 토끼 단클론성 항-SNAP25 항체 ab108990(압캠), 또는 토끼 다클론성 항-SNAP25 항체 PA5-19701(피어스 안티바디스)를 포함한다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체는, 예를 들면, 1 x 105 M-1 s-1 미만, 1 x 106 M-1 s-1 미만, 1 x 107 M-1 s-1 미만 또는 1 x 108 M-1 s-1 미만의 회합 속도 상수를 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체는, 예를 들면, 1 x 105 M-1 s-1 이상, 1 x 106 M-1 s-1 이상, 1 x 107 M-1 s-1 이상 또는 1 x 108 M-1 s-1 이상의 회합 속도 상수를 가질 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체는, 예를 들면, 1 x 10-3 s-1 미만, 1 x 10-4 s-1미만, 1 x 10-5 s-1 미만 또는 1 x 10-6 s-1 미만의 해리 속도 상수를 가질 수 있다. 또한 추가의 실시형태에 있어서, BoNT/E 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체는, 예를 들면, 1 x 10-3 s-1 이상, 1 x 10-4 s-1 이상, 1 x 10-5 s-1 이상 또는 1 x 10-6 s-1 이상의 해리 속도 상수를 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 회합 속도 상수는 항체가 이의 표적에 얼마나 빨리 결합하는지를 특성화하는데 사용되는 상수이다. 해리 속도 상수는 항체가 이의 표적으로부터 얼마나 빨리 해리되는지를 특성화하는데 사용되는 상수이다.
추가의 실시형태에 있어서, 제1 포획 항체는 세포에서 BoNT/E-절단된 SNAP-25를 정규화하는데 사용된다.
본 발명의 방법의 추가의 실시형태에 있어서, BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제2 포획 항체는 본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체이다. 따라서, 본 발명의 항체에 관한 정의 및 양태는 본 발명의 방법에 사용되는 제2 포획 항체에 대하여 필요한 부분만 수정하여 적용한다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제2 포획 항체는 문헌[Jones et al., Journal of Immunological Methods 329(2008), p. 92-101]에 기재된 바와 같은 BoNT/E 절단 부위-특이적 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "제1 검출 항체"는 제1 포획 항체에 특이적으로 결합하는 항체이다. 상기 제1 검출 항체는 제1 포획 항체의 특이적인 검출을 가능하게 한다. 제1 검출 복합체 중의 결합된 제1 검출 항체의 양이 제1 검출 복합체에 포함된 제1 포획 항체의 양(및 따라서 전체 SNAP-25, 즉, BoNT/E-절단된 및 비-절단된 SNAP-25의 양)과 연관이 있기 때문에, 결합된 제1 검출 항체의 양을 측정함으로써 제1 검출 복합체의 양을 결정할 수 있다. 예를 들면, 적절한 종-특이적 항체는 제1 검출 항체로서 사용될 수 있다: 마우스 항체가 제1 포획 항체로서 사용되는 경우, 상기 제1 검출 항체는 마우스 항체에 특이적으로 결합되는 항-마우스 항체일 수 있다. 제1 검출 항체는, 예를 들면, 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체, 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체 또는 형광 염료에 접합된 항체일 수 있다. 예를 들면, 글루타알데히드를 사용하는 항체에 대한 효소의 접합이 당해 분야에 잘 알려져 있다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 거의 40년간 광범위한 화합물 및 병원균을 정량하는데 사용되었다. 초기에, 방사성활성을 사용하여 분석을 정량하였지만, 방사성-면역분석(RIA)은 효소를 이용하여 비색분석 결과를 수득하는 분석으로 교체되었다. 최근에, 형광 및 발광 생성물을 제조하기 위한 신규한 기질이 개발되었다. 신규한 분석의 기본 원리는 비색분석 검정과 동일하게 유지된다: 기질을 특이성을 부여하는 항체에 접합된 단백질의 효소적 활성에 의해 측정 가능한 화합물로 전환시킨다.
ELISA에서 일반적으로 사용되는 효소 접합체는 알칼리 포스파타제 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제이다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 제1 검출 항체는, 예를 들면, 알칼리 포스파타제 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 접합될 수 있다. 본 발명의 방법에서 제1 검출 항체로서 사용될 수 있는 효소 접합체의 추가의 예는 기질로서 글루코스를 사용하는 글루코스 옥시다제, 기질 1-(4-메틸-쿠마린-7-일)-3-(4-하이드록시페닐)우레아)(PAP-AMC)을 전환시키는 티로시나제(Stratis Avrameas, Immunochemistry, Volume 6, Issue 1, January 1969, Pages 43-48, IN9-IN11, 49-52) 또는 기질 6,8-다이플루오로-4-메틸-움벨리페릴 β-d-갈락토피라노시드(DiFMUG)를 전환시키는 β-갈락토시다제(Gee et al., Analytical Biochemistry, Volume 273, Issue 1, August 1999, pages 41-48)를 포함한다. 기질이 첨가되면, 상기 기질은 검출 가능한 형태로 효소에 의해 전환된다. 예를 들면, 알칼리 포스파타제는 인산의 에스터의 절단을 촉매한다. 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체가 제1 검출 항체로서 사용되는 경우, 적절한 기질, 예를 들면, 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 유도체, 예를 들면, 6,8-다이플루오로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트(DiFMUP), 또는 플루오레세인 디포스페이트(FDP). 6,8-다이플루오로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트(DiFMUP)는 AP에 의해 검출 가능한 형태, 즉, 형광발생 생성물 6,8-다이플루오로-4-메틸움벨리페론으로 전환된다. 상기 기질은, 예를 들면, 몰라큘라 프로브스(Molecular Probes)로 제공된다. DiFMUP의 이러한 반응 생성물의 형광성 강도는 약 358/450㎚의 여기/방출 최대를 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있는 추가의 기질은 9H-(1,3-디클로로-9,9-디메틸아크리딘-2-온-7-일) 포스페이트(DDAO-포스페이트; 인비트로젠(Invitrogen)), 플루오레세인 디포스페이트(FDP; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 또는 4-메틸-움벨리페릴 포스페이트(MUP; 인비트로젠)이다. DDAO-포스페이트는 AP에 의하여 약 646/659㎚의 여기/방출 최대를 갖는 형광발생 생성물 디메틸아크리딘온(DDAO)으로 전환된다. FDP를 AP에 대한 기질로서 사용하는 경우, 약 490/514㎚의 여기/방출 최대를 갖는 반응 생성물은 플루오레세인이다. MUP에 있어서, 상응하는 반응 생성물은 약 360/449㎚의 여기/방출 최대를 갖는 4-메틸움벨리페론(7-하이드록시-4-메틸쿠마린)이다. 또한 이들 기질은, 예를 들면, 몰라큘라 프로브스로부터 상업적으로 이용 가능하다. 대안적으로, 홀스래디쉬 퍼옥시다제는 본 발명의 방법의 제1 검출 항체에서 효소 접합체로서 사용될 수 있다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)는 과산화수소(H2O2)의 물(H2O)로의 환원을 촉매한다. 특이적인 기질의 존재하에, 수소 공여체로서 작용하고, HRP의 작용은 무색 또는 비형광성 분자를 각각 착색 및/또는 형광성 잔기로 전환시킨다. 예를 들면, 앰플렉스(등록상표) 레드(라이프 테크놀로지(Life Technologies))는 HRP 함유 분석에 사용하기 위한 기질이다. 퍼옥시다제 효소의 존재하에 앰플렉스 레드는 H2O2와 1:1 화학량론으로 반응하여 각각 563㎚ 및 587㎚의 흡수 및 형광 방출 최대를 갖는 레조루핀, 적색 형광 화합물을 생성한다. HRP 기질에 대한 또 다른 예는 앰플렉스(등록상표) 울트라레드(라이프 테크놀로지스). 앰플렉스(등록상표) 울트라레드 시약(~570/585㎚의 여기/방출)은 앰플렉스(등록상표) 레드 시약의 성능보다 개선되고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제-커플링된 효소 분석에서 몰당 기반으로 더 밝아진 형광성 및 개선된 민감성을 제공하는 것으로 보고되었다. 산화된 앰플렉스(등록상표) 울트라레드 시약(앰플렉스(등록상표) 울트록스레드(UltroxRed) 시약)의 형광성은 또한 pH에 덜 민감하고, 기질 및 이의 산화 생성물은 과산화수소(H2O2) 또는 티올, 예를 들면, 디티오트레이톨(DTT)의 존재하에 앰플렉스(등록상표) 레드 시약보다 더 큰 안정성을 나타낸다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 추가의 적절한 HRP 기질은, 예를 들면, 10-아세틸-3,7-다이하이드록시펜옥사진(ADHP; AnaSpec) 또는 3-(4-하이드록시페닐) 프로피온산(HPPA; AnaSpec)(Tuuminen et al. 1991, J. Immunoassay 12, 29-46)을 포함한다.
대안적으로, 제1 검출 항체는 제1 포획 항체를 검출할 수 있는 적절한 검출 가능한 라벨을 가질 수 있다. 라벨링은 직접적인 또는 간접적인 방법으로 수행될 수 있다. 직접적인 라벨링은 제1 검출 항체에 대한 라벨의 직접적인(공유적인 또는 비공유적인) 라벨의 결합을 포함한다. 간접적인 라벨링은 제1 검출 항체에 특이적으로 결합하고 검출 가능한 라벨을 가지고 있는 제제의 결합(공유적인 또는 비공유적인)을 포함한다. 이러한 제제는, 예를 들면, 제1 검출 항체에 특이적으로 결합하는 2차(더 높은 차수) 항체일 수 있다. 이러한 경우에 2차 항체는 검출 가능한 라벨에 커플링될 것이다. 추가의 더 높은 차수의 항체가 제1 검출 복합체의 검출에 대한 첨가에서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 더 높은 차수의 항체는 종종 신호를 증가시키는데 사용된다. 적합한 더 높은 차수의 항체는 또한 잘 알려진 스트렙타비딘-비오틴 시스템(벡터 라보라토리스 인크(Vector Laboratories, Inc.)), 및 잘 알려진 Dako LSAB™2 및 LSAB™+(라벨링된 스트렙타비딘-비오틴), 또는 Dako PAP(퍼옥시다제 항-퍼옥시다제)를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 제1 검출 항체의 상기 라벨은 형광성 염료이고, 즉, 제1 항체는 형광성 염료에 접합된다. 이러한 경우에, 형광성은 형광성 리더에 의해 직접적으로 측정될 수 있다. 전형적인 형광성 라벨은 형광성 단백질, 예를 들면, GFP 및 이의 유도체, Cy 염료, 예를 들면, Cy3, 또는 Cy5, 텍사스 레드, 플루오레세인, 및 알렉사 염료, 예를 들면, 알렉사 568를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "제2 검출 항체"는 제2 포획 항체에 특이적으로 결합하는 항체이다. 제2 검출 항체는, 예를 들면, 알칼리 포스파타제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 또는 티로시나제와 같은 효소에 접합될 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에 있어서, 제2 검출 항체는 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체, 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체, 글루코스 옥시다제-접합된 항체 또는 티로시나제-접합된 항체이다. 상기 제2 검출 항체는 제2 포획 항체의 특이적인 검출을 가능하게 한다. 제2 검출 복합체 중의 결합된 제2 검출 항체의 양이 제2 검출 복합체에 포함된 제2 포획 항체의 양(및 따라서 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 양)과 연관이 있기 때문에, 결합된 제2 검출 항체의 양을 측정함으로써 제2 검출 복합체의 양을 결정할 수 있다. 예를 들면, 마우스 항체가 제2 포획 항체로서 사용된 경우, 항-마우스 항체는 제2 검출 항체로서 사용될 수 있다. 제2 검출 항체는 상기 기재된 바와 같은 효소 또는 제1 검출 항체에 관하여 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 바와 같은 형광성 염료와 같은 라벨(즉, 제2 검출 항체는 형광성 염료에 접합됨)을 가질 수 있다. 본 발명의 방법의 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에서 각각의 제1 및 제2 포획 항체의 특이적인 검출을 가능하게 하기 위하여, 제1 검출 항체에 접합된 효소는 제2 검출 항체에 접합된 효소와는 상이하다. 예를 들면, 제1 검출 항체가 AP-접합된 항체인 경우, 제2 검출 항체는 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체 또는 그 반대일 수 있다. 추가로, AP 및 HRP의 형광발생 기질의 여기/방출 스펙트럼은 실질적으로 겹치지 않지만 서로 상이하고, 즉, 이들은 각각의 생성물에 의해 발생한 형광 강도의 차이를 가능하게 하기 위하여 뚜렷한 쉬프트를 나타낸다. 예를 들면, DiFMUP는 ~358/450㎚에서 여기/방출을 나타내는 반면, 앰플렉스 울트라레드는 ~570/585㎚의 여기/방출을 나타내고, 따라서 각각의 효소에 의해 상기 형광발생 기질의 전환에 의해 발생한 형광 강도의 정확한 측정을 가능하게 한다. 추가의 실시형태에 있어서, 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체는 세포에서 과량으로 존재하는 항원에 대한 제1 검출 항체로서 사용되고, 즉, 세포에서 전체(BoNT/E-절단된 및 비-절단된) SNAP-25의 양의 측정을 위하여 사용된다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체는 세포에서 낮은 양으로 존재하는 항원에 대한 제2 검출 항체로서 사용되고, 즉, 세포에서 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 양의 측정을 위하여 사용된다. 당해 분야에 알려진 바와 같이, HRP 기질은 AP 기질보다 더 민감하고, 이는 분석물의 낮은 양이 검출될 수 있다는 것을 의미한다. HRP 항체가 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 검출에 대한 2차 항체로서 사용되는 경우, BoNT/E-절단된 SNAP-25의 낮은 양이 검출 가능하다. 결국, BoNT/E의 낮은 양이 결정될 수 있고, 이에 따라 분석의 민감성을 증가시킨다. AP 항체가 세포에서 SNAP-25의 전체 양을 측정하기 때문에, 과량의 분석물로 인하여 기질에 대한 높은 민감성이 필요하지 않다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "적어도", 예를 들면, "적어도 하나의 제1 포획 항체"는 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질에 특이적으로 결합하는 항체 이외에, 언급된 특이성을 갖는 하나 이상의 추가의 항체가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 유사하게, "적어도 하나의 제2 포획 항체"는 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 절단 부위에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 이외에, 언급된 특이성을 갖는 하나 이상의 추가의 항체가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 추가로, 제1 검출 항체(또는 제1 검출 항체들)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제1 검출 항체는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 유사하게, 제2 검출 항체(또는 제2 검출 항체들)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 검출 항체는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
용어 "제1 검출 복합체"는 세포에서 SNAP-25의 전체 함량을 결정할 수 있는 제1 포획 항체 및 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 제1 검출 항체를 포함하는 복합체를 나타낸다. 제1 검출 복합체의 양은 특이적으로 결합된 제1 검출 항체의 양의 결정에 의해 측정될 수 있다. 이는, 예를 들면, 형광성의 강도에 의해 측정됨으로써 효소의 성질 또는 제1 검출 항체의 라벨에 따라 달성될 수 있다.
용어 "제2 검출 복합체"는 제2 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 절단 부위에 특이적으로 결합하는 제2 검출 항체를 포함하는 복합체를 의미하고, 이로써 세포에서 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 함량을 결정할 수 있다. 제2 검출 복합체의 양은 특이적으로 결합된 제2 검출 항체의 양의 결정에 의해 측정될 수 있다. 이는, 예를 들면, 형광성의 강도를 측정함으로써, 효소의 성질 또는 제2 검출 항체의 라벨에 따라 달성될 수 있다.
신호 대 잡음 비가 배경 신호와 형성된 항체-항원 복합체로부터의 신호가 통계적으로 유의미한 정도로 구별될 수 있는 한, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 대신에 임의의 검출 시스템을 사용하여 본 발명의 방법의 실시형태를 실시하는데 사용될 수 있다는 것이 예상된다. 면역-기반의 검출 시스템의 비제한적인 예는 웨스턴 블롯팅 및 닷-블롯팅, 면역침강 분석, 및 샌드위치 ELISA와 같은 면역블롯 분석을 포함한다. 신호의 검출은 이미징 또는 인광이미징(AU), 생물발광(BL), 형광, 공명 에너지 전이, 평면 편광, 비색분석, 또는 유동 세포 분석(FC)을 갖는 방사능자동사진법을 사용하여 달성될 수 있다. 면역계 검출 시스템의 설명은, 예를 들면, 문헌[Commonly Used Techniques in Molecular Cloning, pp. A8.1-A8-55(Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001)]; [Detection Systems, pp. A9.1-A9-49(Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001)]에 개시되어 있다.
본 발명의 방법의 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 형광성 방법이다.
추가의 실시형태에 있어서, 세포, 항체, 예를 들면, 본 발명의 항체, 신경독소 폴리펩타이드, 예를 들면, BoNT/E 및 신경독소 기질, 예를 들면, SNAP-25 또는 본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 임의의 다른 생성물은 각각 단리된 세포, 항체, 신경독소 폴리펩타이드, 신경독소 기질 또는 생성물이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 예를 들면, 단리된 항체에서와 같이 용어 "단리된"은 인간 개입의 사용에 의해 이의 자연 환경으로부터 분리된 분자를 나타낸다.
본 발명의 방법의 하나의 실시형태에 있어서, BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a) 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열; 및
b) 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 방법의 추가의 실시형태에 있어서, 세포는 1차 신경 세포, 신경아세포종 세포와 같은 신경 세포로 분화될 수 있는 종양 세포, P19 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(IPS)-유도된 신경세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포 또는 신경세포 분화된 세포이다.
본 발명의 방법의 추가의 실시형태에 있어서, 세포를 고정하는 것은 메탄올, 에탄올, 아세톤, 폼알데하이드 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 고정제의 첨가에 의해 수행된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 기질에 특이적으로 결합하는 제1 포획 항체는 토끼 다클론성 항-SNAP-25 항체 S9684, 토끼 다클론성 항-SNAP25 항체 PA5-19708(피어스 안티바디스), 토끼 단클론성 항-SNAP25 항체 ab108990(압캠(Abcam)) 또는 토끼 다클론성 항-SNAP25 항체 PA5-19701(피어스 안티바디스)이다.
본 발명의 방법의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 검출 항체는 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체, 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체 또는 형광성 염료에 접합된 항체이다.
본 발명의 방법의 하나의 실시형태에 있어서, 제2 검출 항체는 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체, 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체, 글루코스 옥시다제-접합된 항체, 티로시나제-접합된 항체 또는 β-갈락토시다제 항체이다. 바람직하게는, 제2 검출 항체는 제1 검출 항체와는 상이하다.
추가의 본 발명의 방법의 실시형태에 있어서, HRP 기질은 앰플렉스 울트라레드, 10-아세틸-3,7-다이하이드록시펜옥사진(ADHP) 또는 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산(HPPA)이다.
본 발명의 방법의 추가의 실시형태에 있어서, AP 기질은 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 유도체, 예를 들면, 6,8-다이플루오로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트(DiFMUP), 또는 플루오레세인 다이포스페이트(FDP)이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
a) 제1 포획 항체, 바람직하게는 본 발명의 다클론성 또는 단클론성 항체인 제2 포획 항체, 제1 검출 항체 및 제2 검출 항체의 배열체로서, 여기서 상기 배열체가 본 발명의 방법을 수행하도록 하는 배열체;
b) a)에 따른 배열체에 의해 결정된 제2 검출 복합체의 양을 기초로 하여 BoNT/E에 의해 절단된 SNAP-25의 양을 계산하는 수단; 및
c) 상기 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "키트"는 함께 포장될 수 있거나 포장될 수 없는 본 발명의 상기 언급된 수단 또는 시약의 수집품을 나타낸다. 키트의 구성원은 분리된 바이알로(즉, 분리된 부분의 키트로서) 포함될 수 있거나, 단일 바이알로 제공될 수 있다. 게다가, 본 발명의 키트는 상기 본 명세서에 언급된 방법을 실시하기 위하여 사용되는 것으로 이해된다. 하나의 실시형태에 있어서, 모든 구성원은 본 명세서에 언급된 방법을 실시하기 위한 사용할 준비(ready-to-use) 방식으로 제공되는 것으로 구상된다. 추가의 실시형태에 있어서, 키트는 상기 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다. 설명서는 종이 또는 전자 형태로 사용자 매뉴얼에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 매뉴얼은 본 발명의 키트를 사용하는 상기 언급된 방법을 수행시 수득된 결과를 해석하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
최종적으로, 본 발명은 또 다른 실시형태에 있어서 (i) 본 발명의 방법에 의해 BoNT/E 신경독소 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 결정하는 단계 및 (ii) 제형화된 BoNT/E 신경독소 생성물 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 생성물이 수득되도록 약제학적 또는 화장용 적용에서 사용하기 위하여 BoNT/E 신경독소 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 폴리펩타이드를 제형화하는 단계를 포함하는, 약제학적 또는 화장용 적용에서 제형화된 BoNT/E 신경독소 생성물 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 생성물의 제조 방법에 관한 것이다. BoNT/E 신경독소 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 폴리펩타이드는 당해 분야에 알려진 목적하는 적용에 따른 다양한 기술에 의해 BoNT/E 신경독소 생성물 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 생성물로 제형화될 수 있다. 예를 들면, (생물학적 활성) BoNT/E 신경독소 폴리펩타이드는 약제학적 조성물로서 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 조합으로 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 캐리어(들)는 제형화의 다른 성분과 혼화성이고 이의 부형제에 해롭지 않다는 의미에서 허용 가능하여야 한다. 사용되는 약제학적 캐리어는 고체, 겔, 또는 액체를 포함할 수 있다. 고체 캐리어의 예는 락토스, 테라 알바, 슈크로스, 탈크, 겔라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 스테아르산마그세늄, 스테아르산 등이다. 액체 캐리어의 예는 글리세롤, 포스페이트 완충 식염수, 물, 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제 등이다. 적합한 캐리어는 상기 언급된 것들 및 당해 분야에 잘 알려진 다른 것들을 포함한다(예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania] 참조). 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 투여 전에 희석제 중에 용해될 수 있다. 희석제는 또한 BoNT/E 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 영향을 주지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수 또는 생리학적 식염수이다. 추가로, 약제학적 조성물 또는 제형은 또한 다른 캐리어 또는 비독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다. 따라서, 제형화된 BoNT/E 신경독소 생성물 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 생성물은 실시형태에 있어서 액체 또는 동결건조된 형태로 존재할 수 있다. 실시형태에 있어서, 이는 글리세롤, 단백질 안정화제(HSA) 또는 비-단백질 안정화제, 예를 들면, 폴리비닐 피롤리돈(PVP), 히알루론산 또는 유리 아미노산과 함께 존재할 수 있다. 실시형태에 있어서, 적합한 비-단백질성 안정화제는 제WO 2005/007185호 또는 제WO 2006/020208호에 기재된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 의한 단계(i)에 따라 결정된 생물학적 활성은 25, 50, 75, 100, 125, 150 또는 200 U(마우스 LD50 단위)의 BoNT/E 신경독소 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 폴리펩타이드 활성에 상응한다. 제형화된 BoNT/E 신경독소 생성물 또는 BoNT/E-MDM2 신경독소 생성물은 치료학적 유효량으로 다양한 질환 또는 장애의 인간 또는 동물 치료법 또는 미용적 목적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 언급된 바와 같은 질환 또는 장애는 수의근 근력, 경부, 두부 근긴장이상, 및 본태성 안검경련, 반축안면경련, 및 국소강직을 포함한 포함한 국소성 근긴장이상, 위장관 장애, 다한증, 및 미용 주름 교정, 안검경련, 경구 하악 근긴장이상, 턱 개방형, 턱 폐쇄형, 이갈이, 메이그 증후군, 혀 근긴장이상, 눈꺼풀의 실행증, 개방 경부 근긴장이상, 목전굴, 목후굴, 측경, 사경, 인두 근긴장이상, 후두 근긴장이상, 경련성 발성장애/내전형, 경련성 발성장애/외전형, 돌발성 호흡곤란, 사지 근긴장이상, 팔 근긴장이상, 과제 특정 근긴장이상, 서경, 음악가의 경직, 골퍼의 경직, 다리 근긴장이상, 허벅지 내전, 허벅지 외전 무릎 굴곡, 무릎 확장, 발목 굴곡, 발목 확장, 내반첨족, 기형 발 근긴장이상, 비틀린 발가락, 발가락 굴곡, 발가락 확장, 축근긴장이상, 피사 증후군, 벨리 댄서 근긴장이상, 분절 근긴장이상, 반근긴장이상, 일반적인 근긴장이상, 루백(lubag)에서의 근긴장이상, 피질기저 퇴행에서의 근긴장이상, 루백에서의 근긴장이상, 지발성 근긴장이상, 척수소뇌실조증에서의 근긴장이상, 파킨슨병에서의 근긴장이상, 헌팅톤병에서의 근긴장이상, 할러포르덴-스파츠병에서의 근긴장이상, 도파-유도된 운동장애/도파-유도된 근긴장이상, 지발성 운동장애/지발성 근긴장이상, 발작성 운동장애/근긴장이상, 돌발운동유발 비-돌발운동유발 행동-유도된 구개간대성근경련, 섬유성 근간대경련, 경직, 양성 근육 경련, 유전적인 턱 떨림, 기이 턱 근육 활동, 무의식적 수축(hemimasticatory spasm), 비후성 아가미 근질환, 교근 비대, 경측 전비대증, 안구진탕증, 핵상 응시 마비, 간질, 부분 간질, 돌발성 사경 수술의 계획, 외향근 성대 마비, 난치성 돌연변이성 발성장애, 상부 식도괄약근 기능장애, 성대 육아종, 발음장애 질레 드 라 뚜렛 증후군, 중이 간대성근경련, 보호성 후두 폐쇄, 후두절제술후, 연설 장애, 보호성 하수증, 내번 괄약근 오디 기능장애, 거짓이완불능증, 노나찰시아(nonachalsia), 식도 운동 장애, 질경, 수술 후 고정화 떨림, 방광 기능장애, 배뇨근 괄약근 긴장이상, 방광 괄약근의 경련, 반검 경련, 재신경지배 운동장애, 융기보조개, 스티프 펄슨 신드롬, 테타누스 전립선 비대증, 비만증, 유아 뇌성 마비 사시 치료, 혼합 마비 수반, 망막 박리 수술 후, 백내장 수술 후, 무수 정체 외안근 사시에서, 근병성 사시증, 해리된 수직 편위, 사실 수술에 대한 보조, 내사시, 외사시, 식도이완 불능증, 항문균열, 외분비샘항진, 프레이 신드롬, 악어눈물 증후군, 다한증, 겨드랑이 발바닥 손바닥 비루, 뇌졸중에 상대적인 타액분비항진, 파킨슨 병에서, 근 위축성 측삭 경련 조건 경화증에서, 뇌염과 척수염 자가면역 과정에서, 다발성 경화증, 횡단척수염, 배포장치 증후군, 바이러스 감염, 세균감염, 기생충감염, 진균감염, 유전경련 중풍발작 후 대부전 마비 반검 경색, 뇌간경색, 심근경색, 편두통, 중추신경계 외상, 반구 병변, 뇌간 병변, 심근병변, 중추 신경계 출혈에서, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 경막하 출혈, 척수내 출혈, 신생물, 반구종양, 뇌간종양, 심근종양 및 질경으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 미용적 사용은 눈가의 잔주름 또는 GFL과 같은 주름, 찡그림, 얼굴 비대칭의 치료 또는 감소로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 모든 지시대상은 이의 전체 개시 내용 및 본 명세서에 특정하게 언급된 개시 내용에 관하여 참조로서 본 명세서에 포함된다.
도면은 하기를 나타낸다:
도 1: 본 발명의 세포-기반 분석의 작동 방식을 나타내는 다이어그램. BoNT/E 중독에 취약한 세포를 멀티웰 플레이트에 시딩하고, 그 후, 세포를 BoNT/E로 중독시키고, 세포의 정해진 중독 기간 후 고정시킨다. BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적인 항체 및 비절단된 SNAP-25에 특이적인 항체는 SNAP-25 위의 특이적인 결합 부위에 결합한다. 효소-커플링된 항-호스트 특이적인 2차 항체를 사용하여, 이들 결합 이벤트는 측정 가능한 신호를 발생시키는데 사용될 수 있고, 이는 웰 내에서 BoNT/E-절단된 SNAP-25의 농도 및 SNAP-25의 전체 양과 연관이 있다. BoNT/E 농도를 증가시키면서, 측정된 절단된 SNAP-25의 양은 신호의 습득에서의 결과를 증가시킨다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 도시될 것이고, 이는, 그러나, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25의 절단 부위에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체의 생성
BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25의 절단 부위에 특이적으로 결합하는 마우스 단클론성 항체를 하이브리도마 표준 기술을 사용하여 생성하였다. 이를 위하여, Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 펩타이드 "C-NEIDTQNRQIDR-OH"(서열 번호 1)로 면역화시켰다. N-말단 시스테인 잔기는 SNAP-25 아미노산 서열로부터 유도하지 않지만, 키홀 림펫 헤모사이아닌(KLH)에 대한 펩타이드의 연결을 위하여 도입되었다. 하이브리도마 세포를 독일 미생물 및 세포 배양 수집물(DSMZ GmbH, Braunschweig, ACC 146)로부터 구입한 골수종 세포주 SP2/0-Ag14(SP2/0)와 마우스 비장 세포의 융합에 의해 수득하였다(또한 문헌[Hemmerlein et al., Molecular Cancer 2006, 5, 41] 참조). BoNT/E-절단된 기질 SNAP-25의 절단 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 ELISA에서 스크리닝하였다. 수득된 클론은 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대한 이들의 특이성 및 친화성에 관하여 선택하였다. 음성 대조군으로서, 비-절단된 SNAP-25206에 이들의 비결합에 대하여 클론을 시험하였다. 결과적으로, 하이브리도마 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 마우스 단클론성 항체는 ELISA 및 웨스턴 블롯에서 SNAP25206에 대한 검출 가능한 교차-반응성을 갖지 않으면서 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대하여 매우 특이적인 것으로 밝혀졌다.
BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단클론성 항체를 제조하는 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000은 수탁 번호 DSM ACC3261하에 DSMZ(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라베 7B 소재)에 부다페스트 조약하에 2014년 12월 17일에 출원인에 의해 수탁되었다. 이러한 단클론성 항체의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 18, 19 및 20로 나타낸다. 이러한 단클론성 항체의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 15, 16 및 17로 나타낸다. 이러한 단클론성 항체의 VH 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 22로 기재되고, 이러한 단클론성 항체의 VL 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 21로 나타낸다.
실시예 2: 이중-형광-CB-BoNT/E 활성 ELISA
세포의 고정
1. 매질/독소 용액을 제거한다. 얼음처럼 차가운 메탄올(-20℃) 100 ㎕/웰을 가자고, 20분 동안 -20℃에서 인큐베이팅한다.
주의: 모든 후속적인 단계는 실온에서 수행한다.
세포 고정 후:
1. 메탄올 용액을 제거하고, PBS 버퍼 100 ㎕/웰을 가한다. 장기간 저장 동안(> 1일), 300 ㎕/웰 PBS 버퍼를 가하여야 하고, 플레이트를 파라필름으로 밀봉하여야 한다. 플레이트를 냉장고에 저장하여야 한다.
2. PBS 버퍼를 제거하고, 세포를 PBS 버퍼 300 ㎕/웰로 3회 세척한다. 각각의 단계를 1분 동안 부드러운 진탕하에 수행하여야 한다.
3. PBS 버퍼를 제거하고, 켄칭 버퍼 100 ㎕/웰을 가하고, 20분 동안 부드러운 진탕하에 인큐베이팅한다.
4. 켄칭 버퍼를 제거하고, 세포를 PBS 버퍼 300 ㎕/웰로 3분 동안 부드러운 진탕하에 1회 세척한다.
5. PBS 버퍼를 제거하고, 차단 버퍼 200 ㎕/웰를 가하고, 1시간 동안 부드러운 진탕하에 인큐베이팅한다.
6. 차단 버퍼를 제거하고, 각각의 웰에 1차 항체 혼합물(차단 버퍼 중의 항체 희석) 100 ㎕를 가한다. 밤새(16-18시간) 부드러운 진탕하에 인큐베이팅한다. 세포를 BoNT/E-절단된 SNAP25에 특이적인 마우스 항체와 SNAP-25를 인식하는 다클론성 토끼 항체(정규화에 대한 SNAP-25의 전체 양을 결정하기 위한 항체)인 2종의 1차 항체와 동시에 인큐베이팅한다.
7. 1차 항체 혼합물을 제거하고, 세포를 PBS 버퍼 300 ㎕로 4회 세척한다. 각각이 단계는 3분 동안 부드러운 진탕하에 수행하여야 한다.
9. PBS 버퍼를 제거하고, HRP-접합된 항-마우스 및 AP-접합된 항-토끼 2차 항체(차단 버퍼 중의 항체 희석)의 2차 항체 혼합물 100 ㎕를 각각의 웰에 가하고, 2.5 - 3시간 동안 부드러운 진탕하에 인큐베이팅하였다.
10. 2차 항체 혼합물을 제거하고, 세포를 HEPES 버퍼 300 ㎕/웰로 6회 세척한다. 각각의 세척 단계는 3분 동안 부드러운 진탕하에 수행하여야 한다.
11. HEPES 버퍼를 플레이트로부터 제거하고, 홀스래디쉬-퍼옥시다제에 대한 형광발생 기질(HRP 기질) 75 ㎕를 각각의 웰 가한다. 50분 동안 부드러운 진탕하에 인큐베이팅한다. 플레이트를 직광으로부터 보호한다.
12. 알칼리 포스파타제에 대한 형광발생 기질(AP 기질) 75 ㎕를 각각의 웰에 가하고, 추가의 50분 동안 부드러운 진탕하에 인큐베이팅한다. 플레이트를 직광으로부터 보호한다.
13. 형광 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 판독한다:
540㎚에서 여기; 600㎚에서 방출.
360㎚에서 여기; 450㎚에서 방출.
15. 계산
정규화를 위하여, BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대한 RFU 값(600㎚에서 형광)을 전체 SNAP-25에 대한 RFU(450㎚)으로 각각의 웰에서 정규화시킨다. 다이어그램에서 RFU의 우수한 예시를 위하여, 하기 식을 사용하여 모든 값을 지수 1000과 곱한다:
Figure pct00001
후속적으로 수득된 RFU 값을 각각의 표준 또는 샘플에 대하여 평균을 낸다.
시약 제형
PBS 버퍼(10mM):
포스페이트 완충 식염수(시그마, # P5368)(pH 7.4)
켄칭 버퍼:
10mM PBS 버퍼 중의 0.6% H2O2(pH 7.4)
차단 버퍼:
10mM PBS 버퍼 중의 2% BSA(pH 7.4)
HEPES 버퍼:
50mM HEPES(pH 7,4)
HRP 기질:
50mM HEPES(pH 7.4)
0.007% H2O2
150μM 앰플렉스 울트라레드
AP 기질:
25mM 다이에탄올아민(pH 9.8)
2mM MgCl2
100μM DiFMUP
<110> Merz Pharma GmbH & Co.KGaA <120> Means and Methods for the determination of the biological activity of BoNT/E in cells <130> MP12918PC <150> EP 14199282.6 <151> 2014-12-19 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/E epitope <400> 1 Cys Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asn Arg Gln Ile Asp Arg 1 5 <210> 9 <211> 3756 <212> DNA <213> Clostridium botulinum <400> 9 atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat 60 attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg 120 ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca 180 ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag 240 gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga 300 gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca 360 gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc 420 caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact 480 aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcaccg ttttggatca 540 atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa ttgtatgaat 600 gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga 660 ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta 720 ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta 780 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Asn Asp Asn Leu Val Arg Lys Asn Asp Gln Val 1155 1160 1165 Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His Leu Phe Pro Leu Tyr Ala 1170 1175 1180 Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser 1185 1190 1195 1200 Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn 1205 1210 1215 Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu 1220 1225 1230 Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His 1235 1240 1245 Met Arg Asp His Thr Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser 1250 1255 1260 Glu Glu His Gly Trp Gln Glu Lys 1265 1270 <210> 13 <211> 3819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant protein BONT/E with MDM2 binding motif <400> 13 atgccgaaaa tcaacagctt caactataac gatccggtga acgatcgtac catcctgtat 60 attaaaccgg gcggttgcca ggaattttac aaaagcttca acatcatgaa aaacatctgg 120 attattccgg aacgtaacgt gattggcacc accccgcagg attttcatcc gccgaccagc 180 ctgaaaaacg gcgatagcag ctattatgat ccgaactatc tgcagtctga tgaagaaaaa 240 gatcgcttcc tgaaaatcgt gaccaaaatc ttcaaccgca tcaacaacaa cctgagcggc 300 ggcattctgc tggaagaact gagcaaagcg aatccgtatc tgggcaacga taacactcca 360 gataaccagt ttcatattgg tgatgcgagc gcggtggaaa ttaaatttag caacggctct 420 caggacattc tgctgccgaa cgtgattatt atgggcgcgg aaccggacct gtttgaaacc 480 aacagcagca acattagcct gcgtaacaac tatatgccga gcaaccatgg ttttggcagc 540 attgcgattg tgacctttag cccggaatat agctttcgct tcaacgataa cagcatgaac 600 gaatttattc aggacccggc gctgaccctg atgcacgagc tgattcatag cctgcatggc 660 ctgtatggcg cgaaaggcat taccaccaaa tataccatca cccagaaaca gaatccgctg 720 attaccaaca ttcgtggcac caacattgaa gaatttctga cctttggcgg caccgatctg 780 aacattatta ccagcgcgca gagcaacgat atctatacca acctgctggc cgattataaa 840 aaaatcgcgt ctaaactgag caaagtgcag gtgagcaatc cgctgctgaa tccgtataaa 900 gatgtgtttg aagcgaaata tggcctggat aaagatgcta gcggcattta tagcgtgaac 960 atcaacaaat tcaacgacat cttcaaaaaa ctgtatagct ttaccgaatt tgatctggcc 1020 accaaatttc aggtgaaatg ccgccagacc tatattggcc agtataaata ttttaaactg 1080 agcaacctgc tgaacgatag catttacaac atcagcgaag gctataacat caacaacctg 1140 aaagtgaact ttcgtggcca gaacgcgaat ttaaatccgc gtattattac cccgattacc 1200 ggccgtggac tagtgaaaaa aattatccgt ttttgcgtgc gtggcattat caccagcctg 1260 acctttgaac ataattgggc acagctggaa aacaaaagcc tggtgccgcg tggcagcaaa 1320 gcgttaaatg atttatgcat cgaaatcaac aacggcgaac tgttttttgt ggcgagcgaa 1380 aacagctata acgatgataa catcaacacc ccgaaagaaa ttgatgatac cgtgaccagc 1440 aataacaact acgaaaacga tctggatcag gtgattctga actttaacag cgaaagcgca 1500 ccgggcctgt ctgatgaaaa actgaacctg accattcaga acgatgcgta tatcccgaaa 1560 tatgatagca acggcaccag cgatattgaa cagcatgatg tgaacgaact gaacgtgttt 1620 ttttatctgg atgcgcagaa agtgccggaa ggcgaaaaca acgtgaatct gaccagctca 1680 attgataccg cgctgctgga acagccgaaa atctatacct tttttagcag cgaattcatc 1740 aacaacgtga acaaaccggt gcaggcggcg ctgtttgtga gctggattca gcaggtgctg 1800 gttgatttta ccaccgaagc gaaccagaaa agcaccgtgg ataaaattgc ggatattagc 1860 attgtggtgc cgtatattgg cctggccctg aacattggca acgaagcgca gaaaggcaac 1920 tttaaagatg cgctggaact gctgggtgcg ggcattctgc tggaatttga accggaactg 1980 ctgattccga ccattctggt gtttaccatc aaaagctttc tgggcagcag cgataacaaa 2040 aacaaagtga tcaaagcgat taacaacgcg ctgaaagaac gtgatgaaaa atggaaagaa 2100 gtgtatagct tcattgtgtc taactggatg accaaaatca acacccagtt caacaaacgt 2160 aaagaacaaa tgtatcaggc gctgcagaac caggtgaacg cgattaaaac catcatcgaa 2220 agcaaataca acagctacac cctggaagaa aaaaacgaac tgaccaacaa atatgacatc 2280 aaacaaatcg aaaatgaact gaaccagaaa gtgagcattg ccatgaacaa cattgatcgc 2340 tttctgaccg aaagcagcat tagctacctg atgaaactga tcaacgaagt gaaaatcaac 2400 aaactgcgcg aatatgatga aaacgtgaaa acctacctgc tgaactatat tattcagcat 2460 ggcagcattc tgggcgaaag ccagcaagaa ctgaacagca tggttaccga taccctgaac 2520 aacagcattc cgtttaaact gagcagctac accgatgata aaatcctgat cagctacttc 2580 aacaaattct tcaaacgcat caaaagcagc agcgtgctga acatgcgtta taaaaacgat 2640 aaatacgtag ataccagcgg ctatgatagc aatatcaaca ttaacggtga tgtgtataaa 2700 tacccgacca acaaaaacca gttcggcatc tacaacgata aactgagcga agtgaacatt 2760 agccagaacg attatatcat ctacgataat aaatataaaa acttcagcat cagcttttgg 2820 gtgcgtattc cgaactacga taacaaaatc gtgaacgtga acaacgaata caccatcatt 2880 aactgcatgc gtgataacaa cagcggctgg aaagtgagcc tgaaccataa cgaaatcatc 2940 tggaccctgc aggataacgc cggcattaac cagaaactgg cctttaacta tggcaacgcg 3000 aacggcatta gcgattacat caacaaatgg atctttgtga ccattaccaa cgatcgtctg 3060 ggcgatagca aactgtatat taacggcaac ctgatcgacc agaaaagcat tctgaacctg 3120 ggcaacattc atgtgagcga taacatcctg ttcaaaattg tgaactgcag ctatacccgt 3180 tatattggca tccgctattt caacatcttc gataaagaac tggatgaaac cgaaattcag 3240 accctgtata gcaacgaacc gaacaccaac atcctgaaag atttctgggg caactatctg 3300 ctgtacgata aagaatatta tctgctgaac gtgctgaaac cgaacaactt tattgatcgc 3360 cgtaaagata gcaccctgag cattaacaac attcgtagca ccattctgct ggccaaccgt 3420 ctgtatagcg gcattaaagt gaaaattcag cgcgtgaaca atagcagcac caacgataac 3480 ctggtgcgta aaaacgatca ggtgtatatc aactttgtgg ccagcaaaac ccacctgttt 3540 ccgctgtatg cggataccgc gaccaccaac aaagaaaaaa ccattaaaat cagcagcagc 3600 ggcaaccgtt ttaaccaggt ggtggtgatg aacagcgtgg gcaacaactg tacaatgaac 3660 ttcaaaaaca acaacggcaa caacattggc ctgctgggct ttaaagcgga taccgtggtg 3720 gcgagcacct ggtattatac ccacatgcgt gatcatacca acagcaacgg ctgcttttgg 3780 aactttatta gcgaagaaca tggctggcag gaaaaatga 3819 <210> 14 <211> 1272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant protein BONT/E with MDM2 binding motif <400> 14 Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg 1 5 10 15 Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser 20 25 30 Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile 35 40 45 Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly 50 55 60 Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys 65 70 75 80 Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn 85 90 95 Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro 100 105 110 Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp 115 120 125 Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu 130 135 140 Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr 145 150 155 160 Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His 165 170 175 Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe 180 185 190 Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu 195 200 205 Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala 210 215 220 Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu 225 230 235 240 Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr 260 265 270 Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys 275 280 285 Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu 290 295 300 Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn 305 310 315 320 Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu 325 330 335 Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile 340 345 350 Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile 355 360 365 Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe 370 375 380 Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr 385 390 395 400 Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Val Arg Gly Ile 405 410 415 Ile Thr Ser Leu Thr Phe Glu His Asn Trp Ala Gln Leu Glu Asn Lys 420 425 430 Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Glu 435 440 445 Ile Asn Asn Gly Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn 450 455 460 Asp Asp Asn Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser 465 470 475 480 Asn Asn Asn Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn 485 490 495 Ser Glu Ser Ala Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile 500 505 510 Gln Asn Asp Ala Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp 515 520 525 Ile Glu Gln His Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp 530 535 540 Ala Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser 545 550 555 560 Ile Asp Thr Ala Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser 565 570 575 Ser Glu Phe Ile Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe 580 585 590 Val Ser Trp Ile Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn 595 600 605 Gln Lys Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro 610 615 620 Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn 625 630 635 640 Phe Lys Asp Ala Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe 645 650 655 Glu Pro Glu Leu Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser 660 665 670 Phe Leu Gly Ser Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn 675 680 685 Asn Ala Leu Lys Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe 690 695 700 Ile Val Ser Asn Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg 705 710 715 720 Lys Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys 725 730 735 Thr Ile Ile Glu Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn 740 745 750 Glu Leu Thr Asn Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn 755 760 765 Gln Lys Val Ser Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu 770 775 780 Ser Ser Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn 785 790 795 800 Lys Leu Arg Glu Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr 805 810 815 Ile Ile Gln His Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn 820 825 830 Ser Met Val Thr Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser 835 840 845 Ser Tyr Thr Asp Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe 850 855 860 Lys Arg Ile Lys Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp 865 870 875 880 Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly 885 890 895 Asp Val Tyr Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn 900 905 910 Asp Lys Leu Ser Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr 915 920 925 Asp Asn Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro 930 935 940 Asn Tyr Asp Asn Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile 945 950 955 960 Asn Cys Met Arg Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His 965 970 975 Asn Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys 980 985 990 Leu Ala Phe Asn Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn 995 1000 1005 Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys 1010 1015 1020 Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu 1025 1030 1035 1040 Gly Asn Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys 1045 1050 1055 Ser Tyr Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys 1060 1065 1070 Glu Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn 1075 1080 1085 Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys 1090 1095 1100 Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile Asp Arg 1105 1110 1115 1120 Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser Thr Ile Leu 1125 1130 1135 Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys Ile Gln Arg Val 1140 1145 1150 Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg Lys Asn Asp Gln Val 1155 1160 1165 Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His Leu Phe Pro Leu Tyr Ala 1170 1175 1180 Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser 1185 1190 1195 1200 Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn 1205 1210 1215 Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu 1220 1225 1230 Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His 1235 1240 1245 Met Arg Asp His Thr Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser 1250 1255 1260 Glu Glu His Gly Trp Gln Glu Lys 1265 1270 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Thr Leu Ser Ser Gln His Asn Thr Tyr Thr Ile Glu 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Lys Asp Gly Ser His Ser Thr 1 5 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Gly Tyr Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Val Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Arg Ile Arg Ser Lys Ser Tyr Asn Tyr Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gly Asn Gly Asn Tyr Val Ser Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Asn Thr Tyr Thr 20 25 30 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met 35 40 45 Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser 65 70 75 80 Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Thr Val Leu 115 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Tyr Asn Tyr Val Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Lys Gly Asn Gly Asn Tyr Val Ser Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120

Claims (14)

  1. BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 다클론성 또는 단클론성 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 1("C-NEIDTQNRQIDR") 또는 서열 번호 2("NEIDTQNRQIDR")로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는, 다클론성 또는 단클론성 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 수탁 번호 DSM ACC3261하에 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라베 7B 소재)에 2014년 12월 17일자로 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 단클론성 항체에 포함된 CDR-L1(서열 번호 15), CDR-L2(서열 번호 16), CDR-L3(서열 번호 17), CDR-H1(서열 번호 18), CDR-H2(서열 번호 19) 및 CDR-H3(서열 번호 20)으로 이루어진 군으로부터 선택된 상보성 결정 영역(CDR) 중 적어도 하나를 포함하는, 다클론성 또는 단클론성 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 수탁 번호 DSM ACC3261하에 DSMZ(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라베 7B 소재)에 2014년 12월 17일자로 수탁된 하이브리도마 세포주 pCNEI 32-7-1, 3614-000에 의해 제조된 단클론성 항체에 포함된 VH 영역(서열 번호 22) 및/또는 VL 영역(서열 번호 21)을 포함하는, 다클론성 또는 단클론성 항체.
  5. 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법으로서,
    a) BoNT/E 중독에 취약한 세포를 BoNT/E와 함께 일정 시간 동안 BoNT/E가 이의 생물학적 활성을 행사할 수 있는 조건하에 인큐베이팅(incubating)하는 단계;
    b) 상기 세포를 고정하고, 임의로, 상기 세포를 세정제로 투과화시키는 단계;
    c) 상기 세포를 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 포획 항체 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 포획 항체와, 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대한 상기 제1 포획 항체의 결합 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 대한 상기 제2 포획 항체의 결합을 가능하게 하는 조건하에 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 포획 항체가 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 다클론성 또는 단클론성 항체인, 상기 접촉시키는 단계;
    d) 상기 세포를 상기 제1 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 검출 항체와 상기 제1 포획 항체에 상기 제1 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시켜 제1 검출 복합체를 형성하고, 상기 제2 포획 항체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 검출 항체와 상기 제2 포획 항체에 상기 제2 검출 항체가 결합할 수 있는 조건하에 접촉시켜 제2 검출 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 제1 검출 항체가 상기 제2 검출 항체와는 상이한, 상기 제2 검출 복합체를 형성하는 단계;
    e) 단계 d)의 상기 제1 및 제2 검출 복합체의 양을 결정하는 단계; 및
    f) 제2 검출 복합체를 사용하여 상기 세포에서 BoNT/E에 의해 절단된 SNAP-25의 양을 계산하는 단계
    를 포함하고, 이로써 상기 세포에서 상기 BoNT/E의 생물학적 활성을 결정하는, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 BoNT/E가,
    a) 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열; 및
    b) 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 세포가 1차 신경 세포, 신경아세포종 세포와 같은 신경 세포로 분화될 수 있는 종양 세포, P19 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(IPS)-유도된 신경세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포 또는 신경세포 분화된 세포인, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 고정하는 것이 메탄올, 에탄올, 아세톤, 폼알데하이드 또는 이들의 혼합물로 이루어진 고정제의 첨가에 의해 수행되는, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-절단된 및 BoNT/E-절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 상기 제1 포획 항체가 토끼 다클론성 항-SNAP-25 항체 S9684, 토끼 다클론성 항-SNAP25 항체 PA5-19708(피어스 안티바디스(Pierce Antibodies)), 토끼 단클론성 항-SNAP25 항체 ab108990(압캠(Abcam)), 또는 토끼 다클론성 항-SNAP25 항체 PA5-19701(피어스 안티바디스)인, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 검출 항체가 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체, 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체 또는 형광 염료에 접합된 항체인, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 항체가 알칼리 포스파타제(AP)-접합된 항체, 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 항체, 글루코스 옥시다제-접합된 항체, 티로시나제-접합된 항체 또는 β-갈락토시다제 항체인, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HRP 기질이 앰플렉스 울트라레드(Amplex UltraRed), 10-아세틸-3,7-다이하이드록시펜옥사진(ADHP) 또는 3-(4-하이드록시페닐) 프로피온산(HPPA)인, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AP 기질이 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 유도체, 예를 들면, 6,8-다이플루오로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트(DiFMUP), 또는 플루오레세인 다이포스페이트(FDP)인, 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성을 직접적으로 결정하는 방법.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
    a) 제1 포획 항체, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체인 제2 포획 항체, 제1 검출 항체 및 제2 검출 항체의 배열체로서, 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는, 상기 배열체;
    b) 상기 a)에 따른 배열체에 의해 결정된 상기 제1 및 제2 검출 복합체의 양을 기초로 하여 BoNT/E에 의해 절단된 SNAP-25의 양을 계산하는 수단; 및
    c) 상기 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
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