CN106442969B - 一种用于检测肉毒毒素的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测肉毒毒素的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测肉毒毒素的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括组件甲和组件乙；所述组件甲为一个末端连接化合物B、另一个末端具有标签分子的特异蛋白质；所述组件乙为胶体金试纸条，其中，金标垫上包被有化合物A标记的胶体金，反应膜上的质控线位置包被所述化合物A的抗体，检测线位置包被所述标签分子的抗体；所述化合物B可与所述化合物A结合。使用本发明所提供的试剂盒检测肉毒毒素，操作简单，耗时短，准确率高，且特异性好，灵敏度高，最小检出限可达20pg/mL，具有重要的应用价值。

Description

一种用于检测肉毒毒素的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测肉毒毒素的试剂盒。
背景技术
肉毒素素是由肉毒梭状芽孢杆菌在生长繁殖过程中分泌的神经外毒素，主要有A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型。除肉毒梭菌外，某些酪酸梭菌(C.butyricum)和巴拉特梭菌(C.baratii)也可产生肉毒毒素。A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型在细胞内的底物和切割位点详见表1，其中A型、C型和E型肉毒素素在细胞内的底物均为SNAP-25蛋白(SNAP-25蛋白的ID号为XP-014937011)。
表1肉毒素素的切割位点
肉毒毒素类型 细胞内的底物 切割位点
A型 SNAP-25蛋白 Gln197-Arg198
B型 VAMP蛋白 Gln76-Phe77
C型 SNAP-25蛋白 Arg198-Ala199
C型 Syntaxin蛋白 Lys253-Ala254
D型 VAMP蛋白 Lys59-Leu60
E型 SNAP-25蛋白 Arg180-Ile181
F型 VAMP蛋白 Gln58-Lys59
G型 VAMP蛋白 Ala81-Ala82
检测肉毒素素的方法有小鼠的致死实验、基于免疫实验的双抗夹心的酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析法等等。小鼠的致死实验是检测肉毒毒素的金标准，其最小检出限可达10pg，但该方法存在检测周期长、工作量大、成本高、需要大量实验动物等缺点。基于免疫实验的双抗夹心的酶联免疫吸附试验的方法可检测如纯肉毒毒素、肉毒梭菌培养物、血液标本等干扰成分较少的样本，检测如食物、粪便、脓等干扰成分较多的样本实验结果会有一定的干扰，即存在局限性，而且该方法检测时间长，肉毒毒素检测和型别鉴定需5～6h，与小鼠的致死实验相比，最小检出限低10倍～100倍。基于免疫实验的双抗夹心的胶体金免疫层析法可快速检测肉毒毒素，检测时间约5min，最小检出限可达10～50ng，操作简单，适合现场快速筛查，但该方法无法检测肉毒毒素是否具有活性，也无法对肉毒毒素进行定量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测肉毒毒素。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于检测肉毒毒素的试剂盒甲。
本发明所提供的用于检测肉毒毒素的试剂盒甲，可包括组件甲和组件乙；所述组件甲可为一个末端连接化合物B、另一个末端具有标签分子的特异蛋白质；所述特异蛋白质可为a1)或a2)或a3)：
a1)SNAP-25蛋白；
a2)含有所述SNAP-25蛋白的蛋白质；
a3)所述SNAP-25蛋白与其它蛋白或肽段的融合蛋白；
所述组件乙可为胶体金试纸条，其中，金标垫上可包被有化合物A标记的胶体金，反应膜上的质控线位置可包被所述化合物A的抗体，检测线位置可包被所述标签分子的抗体；所述化合物B可与所述化合物A结合。
上述试剂盒甲中，所述质控线位置包被的所述化合物A的抗体的浓度可为1mg/mL以上，具体可为1mg/mL。
上述试剂盒甲中，所述检测线位置包被的所述标签分子的抗体的浓度可为1mg/mL以上，具体可为1mg/mL。
上述试剂盒甲中，所述金标垫的材质可为聚酯纤维素膜。
上述试剂盒甲中，所述化合物B可为生物素。所述化合物A可为亲和素。所述亲和素可为链霉亲和素。所述标签分子可为His标签。所述标签分子的抗体具体可为Anti-His抗体。所述亲和素的抗体具体可为链霉亲和素抗体。
上述试剂盒甲中，所述特异蛋白质可为b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第1至220位所示的蛋白质；
b2)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第16至220位所示的蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述试剂盒甲具体可由所述组件甲和所述组件乙组成。
上述任一所述的试剂盒甲中，所述肉毒毒素可为A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。
上述任一所述试剂盒甲在检测肉毒毒素中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述肉毒毒素可为A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。
为解决上述技术问题，本发明还提供了采用上述任一所述试剂盒甲检测检测待测样本中是否含有肉毒毒素的方法。
本发明所提供的采用上述任一所述试剂盒甲检测待测样本中是否含有肉毒毒素的方法，依次包括如下步骤：
(1)将待测溶液与所述组件甲混匀，得到孵育体系；所述待测溶液为待测液相样本或待测固相样本溶解得到的液相样本；
(2)孵育，用所述组件乙检测。
上述方法中，所述步骤(1)中，所述组件甲在所述孵育体系的浓度为50ng/mL以上。
上述方法中，所述步骤(1)可为将所述待测溶液、所述组件甲和含0.3-0.7mMZnCl2的pH7.0-7.5、0.005-0.015M的PBS缓冲液混匀，得到孵育体系。
上述方法中，所述步骤(1)具体可为将所述待测溶液、所述组件甲和含0.5mMZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS缓冲液混匀，得到孵育体系。
上述方法中，所述步骤(2)中，所述孵育的参数可为：35～39℃孵育12～14h。
上述方法中，所述步骤(2)中，所述孵育的参数具体可为：37℃孵育12h-14h。
上述方法中，所述步骤(2)中，用组件乙检测，检测结果可进行如下评判：如果质控线显示红色且检测线不显示红色，则所述待测溶液含有肉毒毒素；如果所述质控线和检测线均显出红色，则所述待测溶液不含有肉毒毒素。
上述任一所述的方法中，所述肉毒毒素可为A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种用于检测肉毒毒素的试剂盒乙。
本发明所提供的用于检测肉毒毒素的试剂盒乙，可包括组件甲、化合物A标记的的胶体金溶液、所述化合物A的抗体和标签分子的抗体；所述组件甲可为一个末端连接化合物B、另一个末端具有所述标签分子的特异蛋白质；所述特异蛋白质可为a1)或a2)或a3)：
a1)SNAP-25蛋白；
a2)含有所述SNAP-25蛋白的蛋白质；
a3)所述SNAP-25蛋白与其它蛋白或肽段的融合蛋白；
所述化合物B可与所述化合物A结合。
上述试剂盒乙中，所述化合物B可为生物素。所述化合物A可为亲和素。所述亲和素可为链霉亲和素。所述标签分子可为His标签。所述标签分子的抗体具体可为Anti-His抗体。所述亲和素的抗体具体可为链霉亲和素抗体。
上述试剂盒乙中，所述特异蛋白质可为b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第1至220位所示的蛋白质；
b2)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第16至220位所示的蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述试剂盒乙具体可由所述组件甲、所述化合物A标记的的胶体金溶液、所述化合物A的抗体和所述标签分子的抗体组成。
上述任一所述的试剂盒乙中，所述肉毒毒素可为A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。
实验证明，使用本发明所提供的试剂盒检测肉毒毒素，操作简单，耗时短，准确率高，且特异性好，灵敏度高，最小检出限可达20pg/mL。因此，本发明所提供的试剂盒在检测肉毒毒素中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例3的检测结果。
图2为实施例4的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、检测肉毒毒素的胶体金试纸的制备
质粒pET22b-SNAP25记载在如下文献中：刘昊，et al.,SNAP-25基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与鉴定.军事医学科学院院刊，2009(03)：p.228-230.
A型肉毒杆菌记载与如下文献中：游哲荣，et al.，抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测.军事医学，2014(03)：p.174-177+180.
B型肉毒毒素记载与如下文献中：Zhao，Y.，et al.，PEG precipitation coupledwith chromatography is a new and sufficient method for the purification ofbotulinum neurotoxin type B[corrected].PLoS One,2012.7(6):p.e39670.
E型肉毒毒素记载与如下文献中：贾宏丽,et al.，重组肉毒毒素E(BoNT/E)重链C端的表达、纯化及其抗原性分析.军事医学科学院院刊,2004(05):p.417-419+423.
A液：含0.02M磷酸钠、0.5M氯化钠和0.04M咪唑的水溶液，pH值为7.4。
洗脱液：含0.02M磷酸钠、0.5M氯化钠和0.4M咪唑的水溶液，pH值为7.4。
LB液体培养基：将1g NaCl、0.5g酵母提取物和1g胰蛋白胨溶于100mL去离子水，调节pH值为7.0。
明胶磷酸盐缓冲液：将2g明胶和4g磷酸氢二钠溶于1L去离子水，加热溶解，然后调节pH值至6.2，121℃高压灭菌15min。
TPYG液体培养基：将3g蛋白胨、0.5g酵母抽提物、0.5g葡萄糖、0.05gL-半胱氨酸盐酸盐和0.025g硫代乙醇酸钠溶于100mL去离子水，然后用磷酸氢二钠调节pH值至6.2，112℃高压灭菌20min。
TPOM培养基：将1g酵母粉、2g酶水解酪素、0.05g巯基乙酸钠、0.1g L-盐酸半胱氨酸和0.5g葡萄糖，溶于100mL去离子水，然后调节pH值至7.2-7.4，112℃高压20min。
链霉亲和素抗体为Prospec-TanyTechnoGene公司产品。Anti-His为Abbkine公司产品。大肠杆菌BL21(DE3)为北京全式金生物技术有限公司的产品。Ni-NTA纯化柱、PD10除盐柱和DEAEFF柱均为GE公司产品，产品目录号分别为17-5319-01、17-0851-01和17-5055-01，简称镍柱。Avi-Tag试剂盒为Avidity公司产品，产品目录号为BirA500。HAucl4为上海拓思化学有限公司的产品，产品目录号为16903-35-8。链霉亲和素为Prospec公司的产品，产品目录号为PRO-283。聚酯纤维素膜为上海杰一生物技术有限公司的产品。硝酸纤维素膜和塑料背板均为上海杰一生物技术有限公司的产品，产品目录号分别为NC-b105和NC-b105。雌性昆明小鼠为军事医学科学院丰台实验动物中心产品。正常人的血清来源于北京307医院血液中心。
一、肉毒毒素底物蛋白的制备
1、重组大肠杆菌的获得
将质粒pET22b-SNAP25转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌，将其命名为BL21(DE3)/pET22b-SNAP-25。BL21(DE3)/pET22b-SNAP-25表达序列表的序列1所示的重组蛋白Avi-SNAP-25-His。重组蛋白Avi-SNAP-25-His依次包括Avi标签、蛋白SNAP-25和His标签，Avi标签的氨基酸序列如序列表中序列1自N端起第1至15位所示，蛋白SNAP-25的氨基酸序列如序列表中序列1自N端起第16至220位所示，His标签的氨基酸序列如序列表中序列1自N端起第221至226位所示。
2、重组蛋白Avi-SNAP-25-His的表达
(1)将BL21(DE3)/pET22b-SNAP25的单克隆接种于5mL含100μg/μL氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1，以1：100(体积比)接种于500mL含100μg/μL Amp的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm值0.4～0.6，得到培养菌液2。
(2)完成步骤(1)后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓度为1mM，然后25℃、120rpm振荡培养12h，得到诱导培养菌液。将诱导培养菌液4℃、6000rpm离心20min，收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。
(3)完成步骤(2)后，取IPTG诱导后的菌体，用A液重悬，然后置冰上在超声破碎仪上超声破碎(超声波功率100W，循环程序为：破碎6s，停4s，共计30min)，然后4℃、12000rpm离心20min，得到菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。
将菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀进行SDS-PAGE。结果表明，重组蛋白Avi-SNAP-25-His在菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀均存在，大小约为25.82kD。
3、重组蛋白Avi-SNAP-25-His的纯化
使用Ni-NTA纯化柱纯化重组蛋白Avi-SNAP-25-His，具体步骤如下：
(1)用10个柱体积的双蒸水冲洗镍柱(流速为5mL/min)；
(2)完成步骤(1)后，用5个柱体积的A液平衡镍柱(流速为5mL/min)。
(3)完成步骤(2)后，将步骤2中(3)得到的菌体破碎上清液上样至镍柱(流速为1mL/min)。
(4)完成步骤(3)后，用5个柱体积的A液平衡镍柱(流速为5mL/min)，以去除杂蛋白。
(5)完成步骤(4)后，依次用5个柱体积的含100mmol/L咪唑的洗脱液、5个柱体积的含150mmol/L咪唑的洗脱液和冲洗镍柱(流速为1.5mL/min)，以去除大多数的杂蛋白，最后用5个柱体积的含350mmol/L咪唑的洗脱液冲洗镍柱(流速为1.5mL/min)并收集过柱后溶液，即为浓度为2mg/mL的重组蛋白Avi-SNAP-25-His溶液。
4、重组蛋白Avi-SNAP-25-His的生物素化
按照Avi-Tag试剂盒的操作步骤，对重组蛋白Avi-SNAP-25-His溶液进行生物素化，具体步骤如下：
(1)反应体系由500μL重组蛋白Avi-SNAP-25-His溶液、96.8μL BiomaxA、96.8μLBiomaxB、9.68μL BirA酶和264.72μL H2O组成；其中BiomaxA、BiomaxB和BirA酶均为Avi-Tag试剂盒中的组件。
(2)完成步骤(1)后，将反应体系置于30℃孵育5h，得到反应混合物。
(3)完成步骤(2)后，反应混合物经PD10除盐柱除盐，并采用超滤管进行超滤浓缩，得到的浓缩液即为肉毒毒素底物蛋白溶液。
二、检测肉毒毒素的胶体金试纸的制备
1、胶体金溶液的制备
胶体金溶液的制备方法为：将HAucl4配制成0.01％(0.01g/100mL)HAucl4水溶液，取100mL 0.01％(0.01g/100mL)HAucl4水溶液，加热至煮沸，然后加入2mL 1％(1g/100mL)枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸直至溶液呈葡萄酒红色，冷却后用无菌水定容至100mL，即为胶体金溶液，该胶体金溶液中胶体金颗粒直径约为20nm。
2、金标垫的制备
(1)胶体金包链霉亲和素溶液的制备
经过大量实验，胶体金包链霉亲和素的制备方法如下：取100mL胶体金溶液，加入5.6mg链霉亲和素，调节pH值至7.8，用混匀搅拌机搅拌30min(目的为使链霉亲和素和金颗粒结合)；然后加入2mL的5％(质量百分比)的BSA水溶液，混匀放置30min(目的为封闭)，得到胶体金包链霉亲和素溶液。
(2)金标垫的制备
取胶体金包链霉亲和素溶液，均匀涂布在聚酯纤维素膜上并使其厚度为2mm，然后自然晾干，得到金标垫。
3、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜的制备
(1)用去离子水稀释链霉亲和素抗体，得到浓度为1mg/mL的质控线溶液，用于包被质控线。
(2)用去离子水稀释Anti-His，分别得到浓度为1mg/mL的检测线溶液，用于包被检测线。
(3)完成步骤(1)和(2)后，通过划膜仪向硝酸纤维素膜划质控线溶液和检测线溶液，形成相互分离的质控线(C)和检测线(T)，37℃干燥2h，得到包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜。
4、检测肉毒毒素的胶体金试纸的组装
检测肉毒毒素的胶体金试纸由吸水纸(如滤纸)、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫(材质为玻璃纤维素膜)四部分组成。
检测肉毒毒素的胶体金试纸的组装步骤如下：将吸水纸用双面胶粘贴在包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜的一端，然后在包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜的另一端上用双面胶粘贴金标垫的一端，将金标垫的另一端上用双面胶粘贴样品垫，最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，切成宽度为4mm的胶体金试纸。将该胶体金试纸用塑封袋密封后放干燥盒保存备用。
5、检测肉毒毒素的胶体金试纸的使用方法和判断标准
(1)处理体系：向18μL含0.5mMZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS缓冲液中加入1μL待测样品(待测样品分为待测液体样品(如血清、尿液、胃内容物或其它液体样品)和待测固体样品，待测固体样品需使用pH7.2、0.01M的PBS缓冲液溶解得到相应的溶液)和1μL肉毒毒素底物蛋白溶液(其中含有1ng肉毒毒素底物蛋白)，得到处理体系。
(2)处理：将处理体系37℃孵育14h，得到处理后体系。
(3)测定：将胶体金试纸的样品垫浸入处理后体系，样品垫即吸取液体向上端移动，流经金标垫时与胶体金包链霉亲和素溶液发生作用，然后向包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜渗移。根据硝酸纤维素膜上显出的红色反应线条情况进行如下判断：
①如果仅在硝酸纤维素膜上的质控线处显出红色反应线条，则待测样品中含有肉毒毒素；其原理为待测样品中的肉毒毒素可将肉毒毒素底物蛋白切割为两段，一段是经生物素化的多肽甲，另一段为携带His标签的多肽乙，其中多肽甲可与金标垫上的胶体金包链霉亲和素溶液结合形成复合物，此复合物流经检测线不能与Anti-His结合、因而检测线处不显出红色反应线条，此复合物流经质控线能与链霉亲和素抗体结合、因而质控线处显出红色反应线条；
②如果在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线处均显出红色反应线条，则待测样品中不含有肉毒毒素；其原理为待测样品中不含有肉毒毒素，所以不对肉毒毒素底物蛋白进行切割，肉毒毒素底物蛋白与金标垫上的胶体金包链霉亲和素溶液结合形成复合物，此复合物流经检测线能与Anti-His结合、因而检测线处显出红色反应线条，此复合物流经质控线能与链霉亲和素抗体结合、因而质控线处显出红色反应线条；
③如果仅在硝酸纤维素膜上的检测线处显出红色反应线条或在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线处均不显出红色反应线条，则为无效实验结果，需重新测定。
实施例2、A型肉毒毒素的制备和纯化
一、A型肉毒毒素的制备和纯化
①将A型肉毒杆菌的单克隆接种于5mLTPYG液体培养基，置于厌氧温箱，37℃培养24-48h，得到菌液1。
②完成步骤①后，取1mL菌液1，以1：5(体积比)接种于5mL TPYG液体培养基，置于厌氧温箱，37℃培养12-16h，得到菌液2。
③完成步骤②后，取菌液2，以1：200(体积比)接种于1L TPOM培养基，置于厌氧温箱，室温静置96h，得到沉淀甲。
④完成步骤③后，取沉淀甲，用灭菌水洗涤，离心，收集沉淀乙。
⑤完成步骤④后，取沉淀乙，用50mL的pH6.0、0.2MPBS缓冲液重悬，将得到的重悬液离心，收集上清液甲。
⑥完成步骤⑤后，向上清液甲中加入核糖核酸酶，得到混合液(该混合液中，核糖核酸酶的浓度为50～100μg/mL)；然后将该混合液34℃处理3h～5h，得到反应溶液。将该反应溶液离心，收集上清液乙。
⑦完成步骤⑥后，向上清液乙中缓慢加入饱和硫酸铵溶液直至硫酸铵溶液的饱和度达到60％(在冰浴中进行)，待沉淀丙析出，离心，收集沉淀丙。
⑧完成步骤⑦后，取沉淀丙，用5mL的pH5.5、0.05M的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，将得到的重悬液离心，收集上清液丙并用0.22μm滤器过滤，得到上样液。
⑨完成步骤⑧后，将上样液上样至DEAEFF柱，然后用2个柱体积的pH3.4、0.1M的柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集A260/A280的比值在0.6以下的第一个洗脱峰的洗脱产物，即获得A型肉毒毒素溶液。
二、A型肉毒毒素的小鼠毒力实验
①取A型肉毒毒素溶液，用明胶磷酸盐缓冲液进行稀释，分别得到毒素稀释液1(稀释度为1：5×106，即蛋白浓度为40pg/mL)、毒素稀释液2(稀释度为1：107，即蛋白浓度为20pg/mL)、毒素稀释液3(稀释度为1：20×106，即蛋白浓度为10pg/mL)和毒素稀释液4(稀释度为1：40×106，即蛋白浓度为5pg/mL)。
②取体重为14～16g的雌性昆明小鼠，随机分成实验组一、实验组二、实验组三、实验组四和对照组(每组4只)，分别进行如下处理：
实验组一：实验第1天腹腔注射0.5mL毒素稀释液1，实验第4天观察雌性昆明小鼠的生存状态；
实验组二：实验第1天腹腔注射0.5mL毒素稀释液2，实验第4天观察雌性昆明小鼠的生存状态；
实验组三：实验第1天腹腔注射0.5mL毒素稀释液3，实验第4天观察雌性昆明小鼠的生存状态；
实验组四：实验第1天腹腔注射0.5mL毒素稀释液4，实验第4天观察雌性昆明小鼠的生存状态；
对照组：实验第1天腹腔注射0.5mL明胶磷酸盐缓冲液，实验第4天观察雌性昆明小鼠的生存状态。
表2A型肉毒毒素的小鼠毒力实验结果
观察天数 死亡(只数) 存活(只数)
实验组一 4天 3 1
实验组二 4天 1 3
实验组三 4天 0 4
实验组四 4天 0 4
对照组 4天 0 4
实验结果见表2。结果表明，步骤一获得的A型肉毒毒素溶液可导致小鼠死亡，毒力值为1.3×107LD50/mL。
实施例3、胶体金试纸的最小检出限
取A型肉毒毒素溶液，用pH7.2、0.01M的PBS缓冲液进行稀释，分别得到毒素稀释液6(稀释度为1：106，即蛋白浓度为200pg/mL)、毒素稀释液7(稀释度为1：108，即蛋白浓度为2pg/mL)和毒素稀释液8(稀释度为1：109，即蛋白浓度为0.2pg/mL)。
1、体系的制备
取17μL含0.05mM ZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS缓冲液，加入1μL正常人的血清、1μL肉毒毒素底物蛋白溶液(其中含有1ng肉毒毒素底物蛋白)和1μL毒素稀释液2，得到体系1。
将体系1中的毒素稀释液2替换为毒素稀释液6，其它成分均不变，得到体系2。
将体系1中的毒素稀释液2替换为毒素稀释液7，其它成分均不变，得到体系3。
将体系1中的毒素稀释液2替换为毒素稀释液8，其它成分均不变，得到体系4。
2、处理
将体系(体系1、体系2、体系3或体系4)37℃孵育12-14h，得到处理后体系。
3、测定
将胶体金试纸1的样品垫浸入处理后体系，一段时间后，观察硝酸纤维素膜上显出的红色反应线条情况。
实验结果见图1(1为体系4，2为体系3，3为体系1，4为体系2)：体系1或体系2的处理后体系仅在硝酸纤维素膜上的质控线处显出红色反应线条，而体系3或体系4的处理后体系在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线处均显出红色反应线条。结果表明，胶体金试纸的最小检出限为20pg/mL。
实施例4、胶体金试纸的特异性
1、体系的制备
取17μL含0.05mM ZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS缓冲液，加入1μL正常人的血清、1μL肉毒毒素底物蛋白溶液(其中含有1ng肉毒毒素底物蛋白)和1μL毒素稀释液2，得到体系1。
将体系1中的毒素稀释液2替换为B型肉毒毒素其它成分均不变，得到体系2。
将体系1中的毒素稀释液2替换为E型肉毒毒素，其它成分均不变，得到体系3。
2、处理
将体系(体系1、体系2或体系3)37℃孵育12h-14h(即孵育过夜)，得到处理后体系。
3、测定
将胶体金试纸1的样品垫浸入处理后体系，一段时间后，观察硝酸纤维素膜上显出的红色反应线条情况。
实验结果见图2(1为体系2，2为体系3，3为体系1)：体系2或体系3的处理后体系在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线处均显出红色反应线条，而体系1的处理后体系仅在硝酸纤维素膜上的质控线处显出红色反应线条。结果表明，胶体金试纸具有较好的特异性。

Claims (9)

1.一种用于检测肉毒毒素的试剂盒甲，包括组件甲和组件乙；
所述组件甲为一个末端连接化合物B、另一个末端具有标签分子的特异蛋白质；所述特异蛋白质为a1)或a2)或a3)：
a1)SNAP-25蛋白；
a2)含有所述SNAP-25蛋白的蛋白质；
a3)所述SNAP-25蛋白与其它蛋白或肽段的融合蛋白；
所述组件乙为胶体金试纸条，其中，金标垫上包被有化合物A标记的胶体金，反应膜上的质控线位置包被所述化合物A的抗体，检测线位置包被所述标签分子的抗体；所述化合物B可与所述化合物A结合。
2.如权利要求1所述的试剂盒甲，其特征在于：所述化合物B为生物素；所述化合物A为亲和素。
3.如权利要求2所述的试剂盒甲，其特征在于：所述亲和素为链霉亲和素；所述标签分子为His标签。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒甲，其特征在于：所述特异蛋白质为b1)或b2)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第1至220位所示的蛋白质；
b2)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第16至220位所示的蛋白质。
5.权利要求1至4任一所述试剂盒甲在检测肉毒毒素中的应用。
6.采用权利要求1至4任一所述试剂盒甲检测待测样本中是否含有肉毒毒素的方法，依次包括如下步骤：
(1)将待测溶液与所述组件甲混匀，得到孵育体系；所述待测溶液为待测液相样本或待测固相样本溶解得到的液相样本；
(2)孵育，用所述组件乙检测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将所述待测溶液、所述组件甲和含0.3-0.7mM ZnCl2的pH7.0-7.5、0.005-0.015M的PBS缓冲液混匀，得到孵育体系。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述孵育的参数为：35～39℃孵育12～14h。
9.如权利要求1至4任一所述的试剂盒甲，或，权利要求5所述的应用，或权利要求6至8任一所述的方法，其特征在于：所述肉毒毒素为A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。
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