BR112015032749B1 - Método e kit para determinação direta da atividade biológica de um polipeptídeo neurotoxina em células - Google Patents

Abstract

MÉTODO E KIT PARA DETERMINAÇÃO DIRETA DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE UM POLIPEPTÍDEO NEUROTOXINA EM CÉLULAS A presente invenção refere-se a métodos e kits para a determinação da atividade biológica de Neurotoxinas de Clostridium. O método da invenção permite a determinação direta da atividade biológica de um polipeptídeo Neurotoxina em células. As células suscetíveis a uma neurotoxina, por exemplo, células neurológicas, são incubadas com a neurotoxina (por exemplo, BoTN/A), em seguida, fixada, e coradas utilizando um anticorpo que se liga especificamente a neurotoxina clivado (por exemplo, SNAP-25) e um anticorpo que se liga a ambos neurotoxina clivado e não clivado, para a determinação da quantidade total de ou o conteúdo de substrato de neurotoxina nas células. A atividade biológica do referido polipeptídeo Neurotoxina é determinada diretamente nas células, e calculada por meios de detecção dos dois complexos.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um método para determinação direta da atividade biológica de um polipeptídeo Neurotoxina em células, compreendendo as etapas de: a) incubar as células suscetíveis a intoxicação por Neurotoxina com um polipeptídeo Neurotoxina por um tempo e sob condições que permitam que o polipeptídeo Neurotoxina exerça a sua atividade biológica; b) fixar as células e, opcionalmente, permeabilizar as células com um detergente; c) pôr as células em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura de ligação específica a um substrato não clivado e clivado por Neurotoxina e com pelo menos um segundo anticorpo de captura de ligação específica ao sítio de clivagem do substrato clivado por Neurotoxina, sob condições que permitam a ligação dos referidos anticorpos de captura aos referidos substratos; d) pôr as células em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de detecção de ligação específica ao primeiro anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do referido primeiro anticorpo de detecção ao referido primeiro anticorpo de captura, formando assim os primeiros complexos de detecção, e pelo menos um segundo anticorpo de detecção de ligação específica ao segundo anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do referido segundo anticorpo de detecção ao referido segundo anticorpo de captura, formando assim os segundos complexos de detecção; e) determinar a quantidade de primeiro e segundo complexos de detecção da etapa d), e f) calcular a quantidade de substrato clivado pelo referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células por meio dos segundos complexos de detecção, determinando assim a atividade biológica do referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células. A invenção proporciona ainda um kit para realização do método da invenção.

[0002] Clostridium botulinum e Clostridium tetani produzem Neurotoxinas altamente potentes, ou seja, toxinas botulínicas (BoNTs) e toxinas de tétano (TeNT), respectivamente. Estas Neurotoxinas Clostridiais (CNT) se ligam especificamente a células neuronais e interrompem a liberação do neurotransmissor. Cada toxina é sintetizada como uma proteína de cadeia simples inativa não processada de aproximadamente 150 kDa. O processamento pós-tradução envolve a formação de pontes de dissulfeto, e proteólise limitada (nicking) pela(s) protease(s) bacteriana(s). Neurotoxina ativa é composto por duas cadeias, uma cadeia leve de N-terminal de aproximadamente 50 kDa e uma cadeia pesada de aproximadamente 100 kDa ligada por uma ligação dissulfeto. CNTs estruturalmente e funcionalmente consistem em três domínios, isto é, a cadeia leve catalítica, a cadeia pesada compreendendo o domínio de translocação (metade N-terminal) e o domínio de ligação ao receptor (metade C-terminal); ver, por exemplo, Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. Neurotoxinas botulínicas são sintetizadas na forma de complexos moleculares compreendendo a proteína neurotoxina de 150 kDa e proteínas não tóxicas associadas. Os tamanhos dos complexos diferem de acordo com a cepa Clostridium e os sorotipos distintos de Neurotoxina que variam de 300 kDa, mais de 500 kDa e 900 kDa. As proteínas não tóxicas nestes complexos estabilizam a neurotoxina e a protege contra a degradação; veja Silberstein 2004, Dor Prática 4, S19 - S26.

[0003] Clostridium botulinum expele sete sorotipos antigenicamente distintos designados de A até G da neurotoxina botulínica (BoNT). Todos os sorotipos, juntamente com a Tétano Neurotoxina relacionada (TeNT) secretada por Clostridium tetani, são Zn2+-endoproteases que bloqueiam exocitose sináptica por proteínas SNARE de clivagem; veja Couesnon de 2006, Microbiology, 152, 759. CNTs causam a paralisia muscular flácida visto em botulismo e tétano; ver Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

[0004] Apesar dos seus efeitos tóxicos, o complexo da toxina botulínica tem sido utilizado como um agente terapêutico em um grande número de doenças. O sorotipo da toxina botulínica A foi aprovado para uso humano nos Estados Unidos, em 1989, para o tratamento do estrabismo, blefarospasmo, e outras desordens. Ele está comercialmente disponível como preparação de proteína da toxina botulínica A (BoNT/A), por exemplo, sob o nome comercial de BOTOX (Allergan, Inc.) ou com o nome comercial DYSPORT/RELOXIN (Ipsen, Ltd). Uma preparação melhorada do complexo de toxina botulínica livre é comercialmente disponível sob o nome comercial XEOMIN (Merz Pharmaceuticals, LLC). Para aplicações terapêuticas, a preparação é injetável diretamente no músculo a ser tratado. No pH fisiológico, a toxina é libertada a partir do complexo de proteína e o efeito farmacológico desejado ocorre. O efeito da toxina botulínica é apenas temporário, o que é a razão para que a administração repetida de toxina botulínica possa ser necessária para manter efeito terapêutico.

[0005] As Neurotoxinas de Clostridium enfraquecem a força muscular voluntária e são terapia eficaz para estrabismo, distonia focal, incluindo distonia cervical e blefaroespasmo essencial benigno. Observou-se ainda que elas aliviam espasmo hemifacial e espasticidade focal e, além disso, são eficazes numa vasta gama de outras indicações, tais como distúrbios gastrointestinais, hiper-hidrose e correção cosmética de rugas; ver Jost 2007, Drugs 67, 669.

[0006] Durante o processo de fabricação de Neutoxinas de Clostridium, a determinação qualitativa e quantitativa das referidas neurotoxinas, bem como o controle de qualidade dos polipeptídeos neurotoxina biologicamente ativos é de importância particular. Além disso, agências governamentais aceitam apenas ensaios de atividade botulínica simples, confiáveis e validados. Atualmente, o ensaio biológico LD50 de roedores, um teste de letalidade, continua a ser o “padrão ouro” usado por fabricantes de produtos farmacêuticos para analisar a potência de suas preparações; veja Arnon et al. (2001), JAMA 285, 1059-1070. No entanto, nos últimos anos, um esforço considerável tem sido empreendido para buscar abordagens alternativas para aliviar a necessidade de ensaios em animais e todas as desvantagens, custos e preocupações éticas associadas a este tipo de ensaio baseado em animais. Além disso, as agências regulatórias estão engajando empresas farmacêuticas para aplicar o princípio dos três “Rs” para a testes de potência de Neurotoxinas Botulínicas: “Reduce, Refine, Replace”; veja Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313. Como consequência, sistemas de ensaio à base de células foram desenvolvidos a fim de proporcionar alternativas razoáveis para métodos que utilizam animais vivos. Contudo, apenas três sistemas de ensaio celulares estão disponíveis para a determinação da atividade biológica da neurotoxina que, até agora, demonstrou-se serem suficientemente sensíveis para polipeptídeos Neurotoxina. Estes sistemas de ensaio baseados em células incluem a utilização de neurônios primários isolados a partir de embriões de roedores que são diferenciados in vitro (Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392), células tronco pluripotentes neuronais diferenciadas induzidas (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), e um subclone da linhagem celular SiMa (WO 2010/105234 A1).

[0007] No entanto, o isolamento de neurônios primários exige o abate de animais e é trabalhoso e demorado. Além disso, sistemas de ensaio utilizando diferentes neurônios primários mostram grandes variações. Do mesmo modo, a geração de células tronco pluripotentes neuronais diferenciadas induzidas é difícil e demorada. Além disso, o armazenamento de tais células é muito problemático. Ensaios utilizando linhagens celulares tumorais neurotoxina são frequentemente não sensíveis o suficiente para BoNT. Além disso, complexos protocolos de diferenciação são necessários para as referidas linhagens celulares de tumores que resultam em grandes variações e/ou elevadas taxas de insucesso de ensaios que utilizam as referidas linhagens celulares.

[0008] Os ensaios para a determinação da atividade biológica de Neurotoxinas de Clostridium descritos no estado da técnica incluem a análise de Western blot em que a atividade Neurotoxina é quantificada pela quantidade de substrato da Neurotoxina clivado em lisados celulares. Em outros ensaios, a atividade de Neurotoxinas de Clostridium é medida com ELISA de tipo sanduíche por eletroquimioluminescência (ECL); ver WO 2009/114748 A1. Também neste caso, a atividade biológica da neurotoxina de Clostridium é determinada pela detecção do substrato da neurotoxina de Clostridium clivado após isolamento a partir do lisado celular. Além disso, o substrato neurotoxina tem de ser concentrado, em ambos os ensaios.

[0009] À luz do que é descrito acima, são altamente desejáveis outros sistemas de teste para a determinação da atividade do polipeptídeo Neurotoxina aceitáveis para agências governamentais e/ou prover uma alternativa para sistemas de testes baseados em animais.

[0010] Assim, o problema técnico subjacente à presente invenção pode ser visto como prover meios e métodos que satisfaçam as necessidades acima mencionadas. O problema técnico é resolvido pelas concretizações caracterizadas nas reivindicações e no presente relatório abaixo.

[0011] A presente invenção refere-se, num primeiro aspecto, a um método para determinar diretamente a atividade biológica de um polipeptídeo Neurotoxina em células, que compreende as etapas de: a) incubar as células suscetíveis a intoxicação por Neurotoxina com um polipeptídeo Neurotoxina por um tempo e sob condições que permitam que o polipeptídeo Neurotoxina exerça a sua atividade biológica; b) fixar as células e, opcionalmente, permeabilizar as células com um detergente; c) pôr as células em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura de ligação específica a um substrato não clivado e clivado por Neurotoxina e com pelo menos um segundo anticorpo de captura de ligação específica ao sítio de clivagem do substrato clivado por Neurotoxina, sob condições que permitam a ligação dos referidos anticorpos de captura aos referidos substratos; d) pôr as células em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de detecção de ligação específica ao primeiro anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do referido primeiro anticorpo de detecção ao referido primeiro anticorpo de captura, formando assim os primeiros complexos de detecção, e pelo menos um segundo anticorpo de detecção de ligação específica ao segundo anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do referido segundo anticorpo de detecção ao referido segundo anticorpo de captura, formando assim os segundos complexos de detecção; e) determinar a quantidade de primeiro e segundo complexos de detecção da etapa d), e f) calcular a quantidade de substrato clivado pelo referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células por meio dos segundos complexos de detecção, determinando assim a atividade biológica do referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células.

[0012] O método da invenção permite a determinação direta da atividade biológica de um polipeptídeo Neurotoxina em células. Isto significa que a lise das células e o isolamento ou concentração do substrato neurotoxina clivado a partir de lisados de células não são mais necessários, ao contrário dos métodos descritos no estado da técnica. Por exemplo, no ensaio baseado em análise de Western blot do estado da técnica, o substrato de Neurotoxina é concentrado para separação e concentração dos componentes da respectiva amostra no gel de poliacrilamida SDS. No ensaio ELISA tipo sanduíche mencionado acima descrito no estado da técnica, a concentração de substrato a neurotoxina é efetuada por utilização de anticorpos ligados especificamente ao substrato de Neurotoxina clivado em uma placa de microtitulação na qual se adicionou o lisado celular. O substrato de Neurotoxina clivado é isolado a partir do lisado por ligação do anticorpo mencionado que resulta numa concentração do referido substrato de Neurotoxina clivado de Clostridium. Em contraste, o substrato de Neurotoxina clivado, tal como exemplificado para SNAP-25, pode ser detectado diretamente na célula, no método da invenção. Para este fim, as células que são suscetíveis à intoxicação por neurotoxina, tal como definido em detalhes em outra parte do presente documento, são incubadas com um polipeptídeo Neurotoxina durante um tempo e sob condições que permitem ao polipeptídeo Neurotoxina exercer a sua atividade biológica. Numa etapa seguinte, as células são fixadas, por exemplo, por adição de um agente de fixação, tais como metanol, etanol, acetona, formaldeído ou misturas dos agentes de fixação mencionados. Opcionalmente, as células podem ser permeabilizadas utilizando pelo menos um detergente, tal como definido abaixo no presente documento, tais como Triton X-100, Tween 20, Saponina, Digitonina ou n-octil-beta- glicopiranosídeo. O detergente pode ser compreendido em um tampão apropriado tal como PBS. Em seguida, as células são colocadas em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura ligado especificamente ao substrato da neurotoxina não clivado e clivado e com, pelo menos, um segundo anticorpo de captura ligado especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado, sob condições que permitem a ligação de dos referidos anticorpos de captura aos referidos substratos. Aqui, o primeiro anticorpo de captura é capaz de determinar o teor total ou quantidade de substrato de Neurotoxina nas células, por se ligarem especificamente a um epítopo adequado presente em ambos os substratos de Neurotoxina não clivado e clivado pela neurotoxina. O segundo anticorpo de captura reconhece e se liga especificamente a um epítopo presente apenas no substrato de Neurotoxina clivado, por exemplo, ligando-se especificamente no sítio de Neurotoxina clivado no substrato neurotoxina. Alternativamente, as células podem ser colocadas em contato com uma mistura dos referidos primeiro e segundo anticorpos de captura, isto é, as células são colocadas em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura e pelo menos um segundo anticorpo de captura simultaneamente, sob as condições mencionadas. Na etapa seguinte, as células são colocadas em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de detecção que se liga especificamente ao primeiro anticorpo de captura, sob condições que permitem a ligação do referido primeiro anticorpo de detecção ao referido primeiro anticorpo de captura, formando assim os primeiros complexos de detecção. Na etapa subsequente, as células são postas em contato com, pelo menos, um segundo anticorpo de detecção que se liga especificamente ao segundo anticorpo de captura, sob condições que permitem a ligação do referido segundo anticorpo de detecção ao referido segundo anticorpo de captura, formando assim os segundos complexos de detecção. Alternativamente, as células podem ser colocadas em contato com uma mistura dos referidos primeiro e segundo anticorpos de detecção, isto é, as células são colocadas em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de detecção e, pelo menos, um segundo anticorpo de detecção, simultaneamente, sob as condições mencionadas. Alternativamente, após a permeabilização das células, elas podem ser colocadas em contato com uma mistura dos referidos primeiro e segundo anticorpos de captura e os referidos primeiro e segundo anticorpos de detecção simultaneamente, sob as condições mencionadas. Na etapa seguinte, as quantidades de primeiros e segundos complexos de detecção são determinadas. Finalmente, a quantidade de substrato clivado pelo referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células é calculada por meio dos segundos complexos de detecção. Deste modo, a atividade biológica do referido polipeptídeo Neurotoxina é determinada diretamente nas células.

[0013] A seguir, o método da presente invenção é descrito com mais detalhes. Para a cultura de células, as células sensíveis à intoxicação neurotoxina, tal como aqui definido, tais como células neuronais, células SiMa ou neurônios IPS- derivados, são primeiro semeadas em microplacas de 96 poços. Células SiMa são diferenciadas para um fenótipo neuronal, por exemplo, de acordo com os procedimentos revelados em WO 2010/105234, e neurônios IPS-derivados são diferenciados para um fenótipo neuronal, por exemplo, de acordo com os ensaios descritos no documento WO 2012/135621. Em seguida, as células são intoxicadas com um polipeptídeo de Neurotoxina, tal como de BoNT/A, durante cerca de 72 horas. Na etapa subsequente, as células são fixadas na placa de microtitulação, antes do ensaio de ELISA. Para a fixação das células, por exemplo, resfriamento com gelo e metanol (-20°C) pode ser feito nas células durante 20 minutos a -20°C.

[0014] Para realizar o ensaio de ELISA, as células são lavadas em primeiro lugar. Como tampão de lavagem, por exemplo, 0,1% de Triton X-100 em PBS 10 mM (pH 7,4) pode ser utilizado. Depois disso, as proteases endógenas são extintas por um tampão de resfriamento, tal como H2O2 0,6% em PBS 10 mM (pH 7,4), seguido por outra etapa de lavagem. Na etapa seguinte, os sítios de ligação livres na placa de microtitulação são bloqueados por uma solução tampão de bloqueio apropriada, tal como, por exemplo, 2% de BSA em tampão PBS 10 mM (pH 7,4) e 0,05% de Triton X-100. Em seguida, as células são permeabilizadas, usando um detergente apropriado. Como tampão de permeabilização, por exemplo, 0,5% de Triton X-100 em tampão PBS 10 mM pode ser utilizado. A permeabilização permite a difusão dos anticorpos através dos poros formados nas células. Em seguida, as células são lavadas por tampão de lavagem tal como citado acima.

[0015] Na etapa seguinte, as células permeabilizadas são incubadas, por exemplo, com uma mistura de dois anticorpos diferentes. A mistura compreende um primeiro anticorpo de captura ligado especificamente ao substrato de Neurotoxina clivado e não clivado e um segundo anticorpo de captura ligado especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado. Os referidos primeiro e segundo anticorpos de captura também podem ser aplicados em seguida. Por exemplo, o primeiro anticorpo de captura se pode ligar especificamente a ambos SNAP-25 clivado pela neurotoxina e não clivado, permitindo, assim, a quantificação da quantidade total ou conteúdo de SNAP-25 nas células. Além disso, este primeiro anticorpo de captura pode ser utilizado para a normalização da quantidade de SNAP 25 clivado nas células, após avaliação como descrita aqui. O segundo anticorpo de captura se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado e, portanto, permite a determinação e detecção do substrato de Neurotoxina clivado, tal como SNAP-25 BoNT/A-clivado.

[0016] A detecção seguinte do substrato total de Neurotoxina e o substrato de Neurotoxina clivado por neurotoxina no método da invenção pode ser realizada diretamente na placa de microtitulação ou placa de célula de cultura, ou seja, no interior das células. De um modo vantajoso, por conseguinte, não é necessário preparar extratos de células e isolar e/ou concentrar o substrato neurotoxina a partir do lisado celular no método da invenção, tal como nos métodos descritos no estado da técnica. Em seguida, as células são lavadas a fim de remover o excesso de anticorpo não ligado ao respectivo antígeno. Na etapa subsequente, as células permeabilizadas são postas em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de detecção e, pelo menos, um segundo anticorpo de detecção. Os referidos anticorpos podem ser aplicados como uma mistura, isto é, simultaneamente ou subsequentemente. O primeiro anticorpo de detecção se liga especificamente ao primeiro anticorpo de captura. Desse modo, os primeiros complexos de detecção estão sendo formados. O primeiro anticorpo de detecção pode ser direcionado contra a espécie a partir do qual o primeiro anticorpo de captura é derivado. Por exemplo, no caso, o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) é utilizado como um primeiro anticorpo de captura ligado especificamente ao substrato não clivado e BoNT/A- clivado de SNAP-25, um anticorpo conjugado com fosfatase alcalina anti-coelho pode ser utilizado como um primeiro anticorpo de detecção. O segundo anticorpo de detecção se liga especificamente ao segundo anticorpo de captura. Deste modo, os segundos complexos de detecção são formados. O segundo anticorpo de detecção pode ser direcionado contra a espécie a partir da qual o segundo anticorpo de captura é derivado. Por exemplo, no caso do anticorpo monoclonal de camundongo (mAb) 20-2-5 da invenção descrita aqui é utilizado como um segundo anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato de BoNT/A-clivado SNAP-25, uma peroxidase de raiz forte anti- camundongo (HRP)-conjugado pode ser utilizado como um segundo anticorpo de detecção. É evidente para os versados na técnica que o primeiro anticorpo de detecção e o segundo anticorpo de detecção são conjugados com enzimas diferentes, a fim de permitir a detecção específica do respectivo primeiro e segundo anticorpo de captura tal como utilizado no método da invenção. Por exemplo, a detecção HRP-baseada, como descrito aqui em outro local pode ser utilizada para o substrato de BoNT/A clivado SNAP-25 e a detecção à base de fosfatase alcalina para o total (de BoNT/A clivado e não clivado) de SNAP 25. Depois disso, as células são lavadas mais uma vez. Numa etapa subsequente, um substrato de HRP fluorogênico é adicionado às células. Como substrato de HRP, por exemplo, Amplex Ultrared (Invitrogen) pode ser utilizado que é animado, a 540 nm, e que emite a 600 nm. A incubação com o substrato de HRP é realizada durante um tempo suficiente para a conversão suficiente de substrato pela peroxidase de raiz forte. Após a incubação com o substrato de HRP, por exemplo, o substrato de AP DiFMUP (6,8-difluoro-4-metilumbeliferil fosfato; excitação a 360 nm; emissão 450 nm) pode ser adicionado ao substrato de HRP e as células são incubadas com um mistura dos referidos dois substratos. A incubação com o referido substrato AP é realizada durante um tempo que permite a conversão suficiente de substrato pela fosfatase alcalina. Como é conhecido no estado da técnica, um substrato tem que ser convertido em uma quantidade que é suficiente para que o sinal medido seja pelo menos tão alto como o valor médio do branco mais três desvios padrão da média, de acordo com a definição do limite de detecção. O limite de detecção pode ser determinado conforme descrito na literatura; ver, por exemplo, Armbruster e Pry, Biochem Clínica. Rev. 2008, 29 (Suplemento 1): S49-S52. Uma vez que o ponto ótimo da fosfatase alcalina de pH está na região alcalina, o tampão de substrato correspondente é fortemente alcalino. Se o substrato da fosfatase alcalina for adicionado ao substrato de HRP, a reação da peroxidase de raiz forte é parada pelo pH alcalino e a fosfatase alcalina converte DiFMUP. Substrato de HRP convertido não é influenciado pelo pH alcalino. Finalmente, a fluorescência dos dois substratos é medida conforme a seguir: Amplex UltraRed: Excitação 540 nm; emissão a 600 nm DiFMUP: Excitação 360 nm; emissão de 450 nm Como entendido pelos especialistas no estado da técnica, apenas os substratos fluorogênicos são apropriados para a detecção do primeiro e segundo anticorpo de captura no método da invenção, que exibem diferentes comprimentos de onda de excitação/emissão de os substratos utilizados. Apenas neste caso, eles permitem a detecção especifica de cada antígeno, ou seja, o substrato total de Neurotoxina (tal como o SNAP-25 não clivado e clivado por Neurotoxina) e o substrato de Neurotoxina clivado (tal como SNAP-25 clivado por Neurotoxina). Desta forma, é possível quantificar o conteúdo total de substrato de Neurotoxina e o conteúdo de substrato de Neurotoxina clivado em cada poço ou prato de célula de cultura ao mesmo tempo. À luz disto, é vantajosamente possível automatizar o método da invenção. Como apresentado aqui em outro lugar, prevê-se que os substratos fluorogênicos escolhidos para o método da invenção exibem uma deslocação suficiente entre os espectros de excitação/emissão a fim de permitir a detecção específica do respectivo substrato. Esta exigência é satisfeita, por exemplo, para o substrato de HRP Amplex e seus derivados e para o substrato de AP DiFMUP. Considerando que, em um caso ideal, não existe qualquer sobreposição entre os espectros de excitação/emissão dos substratos fluorogênicos usados, que se tem verificado que uma sobreposição de até 30% da área do pico do espectro de excitação dos substratos fluorogênicos utilizados é tolerável.

[0017] Tal como ainda reconhecido por aqueles versados na técnica, o método da presente invenção permite a detecção direta e quantificação do substrato de Neurotoxina clivado pelo polipeptídeo Neurotoxina nas células, determinando desse modo a atividade biológica do referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células. Vantajosamente, o método da presente invenção não requer a preparação de lisados ou extratos celulares e o isolamento ou a concentração do substrato de Neurotoxina clivado e removidos dos extratos/lisados celulares, que é necessário para os métodos conhecidos no estado da técnica. Como consequência disso, o material de amostra pode ser salvo. Além disso, a preparação da amostra e o número de amostras pode ser reduzido pelo método da presente invenção uma vez que a quantidade de substrato total de Neurotoxina e a quantidade de substrato de Neurotoxina clivado na amostra pode ser determinada ao mesmo tempo. Nos ensaios descritos no estado da técnica, as amostras têm de ser subdivididas, a fim de detectar ambos os antígenos, ou seja, substrato de Neurotoxina total e substrato de Neurotoxina clivado, separadamente um do outro. O método da invenção torna a subdivisão da amostra desnecessária. Desta forma, heterogeneidades resultantes da subdivisão das amostras podem ser evitadas e material de amostra pode ser salvo. Além disso, os antígenos podem ser degradados em ensaios descritos no estado da técnica que podem falsificar a detecção do substrato de Neurotoxina clivado. Isto porque, em ensaios descritos no estado da técnica, as células são incubadas com tampões de lise contendo detergente que, no entanto, não são capazes de inativar o polipeptídeo neurotoxina ou outras proteases endógenas resultando em degradação do substrato de Neurotoxina sobre um armazenamento mais prolongado das amostras. Tampões mais fortes de lise não podem ser usados no ensaio de ELISA sanduíche ECL descrito na técnica anterior, devido ao uso obrigatório do lisado celular no referido ensaio. Isto é devido ao fato da agregação dos antígenos mencionada acima podem resultar na adsorção não específica de antígenos na superfície de plástico das placas de cultura de células ou placas de microtitulação, que por sua vez atrapalham a detecção de antígenos por meio de anticorpos apropriados. Uma vez que os anticorpos para a detecção dos antígenos de entrar em contato com o lisado, também, os anticorpos podem também agregar. Neste caso, não há detecção fiável e exata do antígeno é mais possível. Os inventores da presente invenção experimentaram estas reações de degradação por meio de ensaios de Western blot para a detecção da atividade biológica de atividade de Neurotoxina descrita no estado da técnica. Após um armazenamento mais prolongado dos lisados a -20°C, em comparação com amostras de lisado frescas o sinal de detecção de um total de SNAP-25 foi encontrado para ser fortemente reduzido, e a razão entre substrato de Neurotoxina clivado SNAP-25 e substrato neurotoxina não clivado SNAP-25 tinha deslocada devido a processos de degradação durante o congelamento. Tem sido descoberto pelos presentes inventores que a degradação do substrato neurotoxina e/ou a instabilidade das amostras pode ser evitada fixando diretamente as células na placa de cultura de células, porque tanto o substrato de Neurotoxina e a neurotoxina ou outras proteases endógenas são inativadas imediatamente por agregação na placa de cultura de células. Isto pode ser obtido usando, por exemplo, a fixação das células por metanol ou outros fixadores ou agentes de fixação conhecidos no estado da técnica, tais como etanol, acetona, formaldeído ou misturas dos mesmos ou outros agentes de fixação descritos aqui. A análise da estabilidade de, por exemplo, células parentais (células SiMa de neuroblastoma humano; DSMZ ACC No.: 164) e neurônios IPS-derivados (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol Sci 126, 426-35), utilizando este método de fixação não revelou quaisquer diferença entre placas de cultura frescas e células armazenadas sete dias na geladeira.

[0018] Tal como utilizado aqui, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem as referências singular e plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. A título de exemplo, “uma célula” refere-se a uma ou mais de uma célula.

[0019] Tal como utilizado aqui, o termo “cerca de”, quando a qualificação de um valor de um ponto determinado, o número, porcentagem, ou termo refere-se a uma faixa de mais ou menos 10 por cento, 9 por cento, 8 por cento, de 7 por cento, 6 por cento, 5 por cento, 4 por cento, 3 por cento, 2 por cento ou 1 por cento do valor indicado do item, do número, da percentagem, ou do termo. É preferida uma faixa de mais ou menos 10 por cento.

[0020] Os termos “compreendendo”, “compreende” e “compreendido de” tal como utilizado aqui são sinônimos com “incluindo”, “inclui” ou “contendo”, “contém”, e são, inclusive, ou em aberto e não excluem adicional, membros não recitados, elementos ou etapas do método. Evidentemente, o termo “compreendendo” engloba o termo “consistindo de”. Mais especificamente, o termo “compreende” tal como utilizado aqui, significa que o pedido engloba todos os elementos ou etapas do método enumeradas, mas pode também incluir elementos não identificados, ou etapas do método adicionais. Por exemplo, um método compreendendo as etapas a), b) e c) compreendem, no seu sentido mais restrito, um método que consiste das etapas a), b) e c). A frase “que consiste de” significa que a composição (ou dispositivo, ou método) tem os elementos citados (ou etapas) e não mais. Em contraste, o termo “compreende” pode englobar também um método que inclui as etapas adicionais, por exemplo, as etapas d) e e), além das etapas a), b) e c).

[0021] No caso de faixas numéricas são utilizados aqui, tais como “em uma concentração entre 1 e 5 micromolar”, a faixa não inclui não apenas 1 e 5 micromolar, mas também qualquer valor numérico entre 1 e 5 micromolar, por exemplo, 2, 3 e 4 micromolar.

[0022] O termo “in vitro”, tal como utilizado aqui denota fora, ou externo ao corpo animal ou humano. O termo “in vitro”, tal como utilizado aqui deve ser entendido como incluindo “ex vivo”. O termo “ex vivo” tipicamente refere-se a células ou tecidos removidos de um corpo animal ou humano ou propagados e mantidos fora do corpo, por exemplo, num vaso de cultura. O termo “in vivo”, tal como utilizado aqui denota interior, interno ao corpo animal ou humano.

[0023] O termo “polipeptídeo neurotoxina” como utilizado aqui significa Neurotoxinas de Clostridium botulinum e Clostridium tetani, ou seja, toxinas botulínicas (BoNTs) e toxina tetânica (TeNT). Mais especificamente, o referido termo engloba BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, e Neurotoxina do Tétano (TeNT). O polipeptídeo neurotoxina e, em particular, a sua cadeia leve e cadeia pesada são deriváveis a partir de um dos antigenicamente diferentes serotipos de toxina neurotoxinas indicadas acima. Em um aspecto, o referido polipeptídeo neurotoxina de cadeia leve e pesada são a cadeia leve e pesada de uma neurotoxina selecionada de um o grupo que consiste de: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT. Num outro aspecto, o polinucleotídeo que codifica os referidos polipeptídeos neurotoxinas compreende uma sequência de ácido nucleico tal como mostrada em SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (de BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (de BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (de BoNT/G) ou SEQ ID NO: 15 (TeNT). Além disso, inseridos nisso, em um aspecto, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/L) ou SEQ ID NO: 16 (TeNT). Além disso, estão englobados, em um aspecto, meios e métodos da presente invenção, um polipeptídeo neurotoxina compreendendo ou consistindo numa sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) e SEQ ID NO: 16 (TeNT).

[0024] Em outro aspecto, o referido polinucleotídeo é um variante dos polinucleotídeos mencionados acima compreendendo uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de nucleotídeos que ainda outro aspecto podem resultar em um polipeptídeo possuindo uma ou mais substituições de aminoácidos, deleções e/ou adições. Além disso, um polinucleotídeo variante da invenção, deverá, em outro aspecto compreender uma variante da sequência de ácido nucleico que seja pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de ácido nucleico tal como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15 ou uma variante da sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75 %, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, ou 16. O termo “idêntico”, tal como utilizado aqui refere-se a identidade de sequência caracterizada pela determinação do número de aminoácidos idênticos entre duas sequências de ácidos nucleicos ou duas sequências de aminoácidos, em que as sequências são alinhadas de modo a que a maior ordem de combinação seja obtida. Ee pode ser calculado utilizando técnicas publicadas ou métodos codificados em programas de computador, tais como, por exemplo, BLASTP, BLASTN ou FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Os valores da porcentagem de identidade são, num aspecto, calculado sobre a sequência de aminoácidos completa. Uma série de programas baseados em uma variedade de algoritmos está disponível para o trabalhador qualificado para comparar sequências diferentes. Neste contexto, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman dão resultados particularmente confiáveis. Para realizar os alinhamentos de sequencia, o programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) ou programas Gap e Bestfit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), que fazem parte do pacote de software GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711), podem ser utilizados. Os valores de identidade de sequência especificada acima, em porcentagem (%) são determinados, em outro aspecto da presente invenção, utilizando o programa GAP sobre toda a região de sequência com as seguintes configurações: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average match: 10.000 e Average mismatch: 0,000, as quais, salvo indicação contrária, devem ser sempre usadas como configurações padrões para alinhamentos de sequência. Em um aspecto, cada um dos polinucleotídeos variantes mencionados acima codificam um polipeptídeo reter um ou mais e, noutro aspecto, todas as propriedades biológicas do respectivo polipeptídeo neurotoxina, ou seja, o substrato de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G ou Neurotoxina de tétano (TeNT). Os versados na técnica apreciarão que toda a atividade biológica é mantida apenas após ativação proteolítica, embora seja concebível que o precursor não processado pode exercer algumas funções biológicas, ou seja, parcialmente ativo. “Propriedades biológicas”, tal como utilizado aqui refere-se a (a) ligação, (b) a internalização, o receptor (c), a translocação através da membrana endossomal para o citosol, e/ou (d) clivagem endoproteolitica de proteínas envolvidas na fusão da membrana da vesícula sináptica. Os ensaios in vivo para avaliar a atividade biológica incluem o ensaio DL50 rato e no ensaio de hemidiafragma de rato ex vivo como descrito por Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) e Dressler et al. (Dressler 2005, 20 Mov Disord. 1617-1619, 2006 Keller, Neuroscience 139: 629-637). A atividade biológica é vulgarmente expressa em unidades de rato (UR). Tal como utilizado aqui, 1 UR é a quantidade de componente neurotóxico, que mata 50% de uma população especificada rato após injeção intraperitoneal, ou seja, quantidade de rato de DL50. Em um aspecto adicional, os polinucleotídeos variantes podem codificar neurotoxinas tendo as propriedades biológicas melhoradas ou alteradas, por exemplo, podem compreender sítios de clivagem que são melhorados para reconhecimento da enzima ou pode ser melhorado para ligação ao receptor, ou qualquer outra propriedade especificada acima.

[0025] Por conseguinte, o termo “atividade biológica de um polipeptídeo neurotoxina”, tal como utilizado aqui significa que as propriedades biológicas características para um polipeptídeo de Neurotoxina, ou seja, (a) receptor de ligação, (b) a internalização, (c) a translocação através da membrana endossomal para o citosol, e/ou (d) a clivagem endoproteolitica de proteínas envolvidas na fusão da membrana da vesícula sináptica. Prevê-se que o polipeptídeo de Neurotoxina, tal como utilizado aqui apresenta, pelo menos, uma das propriedades a) a d) acima mencionadas, de um modo preferido de clivagem endoproteolítica de proteínas envolvidas na fusão sináptica membrana da vesícula, ou dois ou três ou todas as quatro propriedades biológicas listadas de a) a d).

[0026] Os aspectos da presente divulgação compreendem, em parte, a partir de uma célula de uma linhagem celular estabelecida. Tal como utilizado aqui, o termo “célula” refere-se a qualquer célula eucariota suscetível a intoxicação por Neurotoxina por uma neurotoxina, tal como, por exemplo, BoNT/A, ou qualquer célula eucariótica que são capazes de absorver uma neurotoxina. O termo célula inclui células de uma variedade de organismos, tais como, por exemplo, células murinas, de rato, porcinas, bovinas, equinas, primata e humanas; a partir de uma variedade de tipos de células, tais como, por exemplo, neuronais e não neuronais; e podem ser isoladas a partir de ou de parte de uma população celular heterogênea, tecido ou organismo. Tal como utilizado aqui, o termo “linhagem celular estabelecida” é sinônimo de “linhagem de células imortal,” ou “linhagem celular transformada” e refere-se a uma cultura de células de células selecionadas para propagação indefinida de uma população de células derivadas a partir de um organismo, tecido, ou fonte de órgãos. Por definição, uma linhagem celular estabelecida exclui uma cultura celular de células primárias. Tal como utilizado aqui, o termo “células primárias” são células recolhidas diretamente a partir de tecidos frescos ou órgãos e não têm o potencial para propagar indefinidamente. Por exemplo, células neuronais primárias podem ser usadas no método da invenção. Uma linhagem de células estabelecida pode compreender uma população heterogênea de células ou uma população uniforme de células. Uma linhagem celular estabelecida derivada de uma única célula é referida como uma linhagem celular clonal. Uma linhagem de células estabelecida pode ser uma cujas células expressam endogenamente todos os componentes necessários para as células se submeter o mecanismo celular total por meio de uma Neurotoxina, tal como BoNT/A, proteoliticamente cliva um substrato, tal como SNAP- 25, e abrange a ligação de um neurotoxina a um receptor de Neurotoxina, tal como BoNT/A, a um substrato de BoNT/A, a internalização do complexo de Neurotoxina/receptor, a translocação de Neurotoxina de cadeia leve de uma vesícula intracelular para o citoplasma e a clivagem proteolítica de um substrato de Neurotoxina. Alternativamente, uma linhagem celular estabelecida pode ser uma cuja as células tenham introduzido de uma fonte exógena, pelo menos, um componente necessário para que as células se submetam ao mecanismo celular total por meio de que uma neurotoxina, tal como BoNT/A, proteoliticamente cliva um substrato, tal como SNAP - 25, e compreende a ligação de uma neurotoxina a um receptor, tal como BoNT/A a um receptor de BoNT/A, a internalização do complexo de Neurotoxina/receptor, a translocação da neurotoxina de cadeia leve a partir de uma vesícula intracelular para o citoplasma e a clivagem proteolítica do substrato uma neurotoxina. Também referido como uma linhagem celular geneticamente manipulada, células de uma tal linhagem celular estabelecida pode, por exemplo, expressar uma FGFR2 exógeno, um FGFR3 exógeno, um SV2 exógeno, um substrato de Neurotoxina exógeno como SNAP-25, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0027] O termo “célula(s) suscetível a intoxicação por neurotoxina” tal como é denotado aqui significa uma célula que pode sofrer os mecanismos celulares gerais através do qual um polipeptídeo neurotoxina (por exemplo, de BoNT/A) cliva um substrato de Neurotoxina (por exemplo, o substrato de BoNT/A SNAP-25) e abrange a ligação da neurotoxina ao seu receptor correspondente (por exemplo, a ligação de substrato de BoNT/A para ao receptor de BoNT/A), a internalização do complexo/receptor da neurotoxina, a translocação da cadeia leve neurotoxina de uma intracelular vesícula no citoplasma e a clivagem proteolítica do substrato neurotoxina. Os ensaios para a determinação da atividade biológica dos polipeptídeos neurotoxina são bem conhecidos no estado da técnica e também descritos aqui em outro local; ver, por exemplo, Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392; Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35. Assim, uma “célula sensível a intoxicação por neurotoxina” como utilizado aqui significa uma célula sensível a neurotoxina. O termo mencionado compreende uma célula ou uma linhagem celular, por exemplo, uma célula primária isolada ou uma linhagem celular da mesma ou uma célula de uma linhagem de células estabelecidas ou uma linhagem celular estabelecida, por exemplo, células tumorais ou linhagens celulares tumorais que são capazes de diferenciação para células neuronais, tais como células de neuroblastoma ou linhagens de células de neuroblastoma como definido aqui em outro local. Por exemplo, a referida linhagem de células de neuroblastoma pode ser uma linhagem de células SiMa que está comercialmente disponível de DSMZ (ACC 164). Clones específicos da linhagem celular de SiMa são, além disso, descritos em WO 2010/105234. Outras linhagens de células de neuroblastoma que podem ser usadas no método da invenção podem ser obtidas a partir de ATCC ou DSMZ, sob os seguintes números ATCC ou DSMZ: linhagem celular N1E-115 sob CRL-2263, linhagem celular Neuro2A sob CCL-131, linhagem celular SH-SY5Y sob CRL-2266, linhagem celular PC12 sob CRL- 1721, linhagem celular MHH-NB-11 sob ACC 157 (DSMZ) e linhagem celular SK-N-BE (2) sob CRL-2271. Outras células tumorais que são suscetíveis à intoxicação por neurotoxina são células P-19 (linhagem de células de carcinoma embrionário murino) (DSMZ No. ACC 316). Além disso, englobadas por células sensíveis à intoxicação por neurotoxina são células neuronais (iPS)- derivadas estaminais pluripontentes, de preferência células neuronais humanas tronco pluripotentes (iPS)-derivadas; ver, por exemplo, Whitemarsh et al. (2012), loc. cit. Tais derivados neurônios humanos IPS-derivados também estão disponíveis comercialmente, por exemplo, Cellular Dynamics. Métodos de geração de células iPS são descritos, por exemplo, em Yu et al. (Science 2009 maio 8; 324 (5928): 797-801 Epub 2009), WO 2011/056971 e WO 2011/025852. Em alguns aspectos, o IPS são diferenciadas em neurônios usando métodos adequados, como por exemplo, os descritos no documento WO 2012/135621 e pedidos de patente dos Estados Unidos US 2010/0279403 e US 2010/0216181.

[0028] O termo “fixação das células” significa a fixação das células utilizando métodos descritos no estado da técnica. Geralmente, a fixação é um processo químico pelo qual os tecidos biológicos são preservados de decaimento, impedindo assim a autólise. Fixação termina quaisquer reações bioquímicas em curso, e pode também aumentar a resistência mecânica ou estabilidade dos tecidos tratados. A fixação preserva uma amostra de material biológico tal como um tecido ou células, próximo ao seu estado natural quanto possível no processo de preparação do referido tecido ou células, para exame ou análise. Para este fim, um fixador normalmente atua para desativar biomoléculas intrínsecas - enzimas proteolíticas especialmente - que de outra forma digere ou danifica a amostra. Além disso, um fixador normalmente protege uma amostra de danos extrínsecos. Os fixadores são tóxicos para os microrganismos incluindo bactérias mais comuns que podem existir em uma cultura de tecidos ou células ou que possa de outra forma colonizar a cultura de tecidos ou de células fixadas. Além disso, muitos agentes fixadores alteram quimicamente o material fixo para torná-lo menos palatável indigesto, ou seja, tóxico para os microrganismos oportunistas. Finalmente, fixadores muitas vezes alteram as células ou tecidos para um nível molecular para aumentar a sua resistência mecânica ou sua estabilidade. Este aumento da resistência e rigidez pode ajudar a preservar a morfologia, tal como a forma e a estrutura da amostra, uma vez que é processada para análise posterior. É evidente para os versados na técnica que a escolha de protocolo fixador e fixação pode depender das etapas de processamento adicionais e as análises finais que são planejadas. Por exemplo, imuno-histoquímica utiliza anticorpos que se ligam especificamente a um alvo proteico específico, o antígeno. A fixação prolongada pode mascarar quimicamente essas metas e impedir a ligação do anticorpo. Nestes casos, por exemplo, um método de fixação rápida usando formalina a frio pode ser utilizado. Alternativamente, as células podem ser fixadas por adição de metanol arrefecido em gelo (-20°C). Além de aldeídos, tais como formaldeído ou glutaraldeído e álcoois tais como etanol ou metanol, agentes oxidantes, tampão ácido Hepes-glutâmico mediado por efeito de proteção de solvente orgânico fixador (HOPE), acetona, ou misturas dos mesmos, tais como uma mistura de metanol e acetona, metanol e etanol, paraformaldeído e Triton X-100, ou paraformaldeído e metanol, pode ser utilizada em protocolos de fixação. Num aspecto do método da invenção, a fixação das células é realizada através da adição de um agente de fixação selecionado a partir do grupo consistindo de: metanol, etanol, acetona, formaldeído ou misturas dos mesmos. Para assegurar e/ou apoiar o acesso livre do anticorpo ao seu antígeno, as células podem, opcionalmente, ser permeabilizadas usando um tampão de permeabilização adequado compreendendo pelo menos um detergente, como o Triton X-100. Um tampão de permeabilização que pode ser utilizado no método da invenção é, por exemplo, 0,5% de Triton X-100 em tampão PBS 10 mM. Em outros aspectos dos métodos da invenção, as células podem ser permeabilizadas utilizando um tampão de permeabilização tal como PBS compreendendo pelo menos um detergente selecionado a partir de Tween 20, Saponina, ou digitonina n-octil-beta- glicopiranosídeo. Em outros aspectos, as misturas de dois ou mais detergentes mencionados aqui podem ser usados no referido tampão de permeabilização. Em geral, as forças e os tempos de fixação são consideravelmente mais curtos para as células do que nas seções de tecidos mais grossos, estruturalmente complexos. Para imunocitoquímica, a preparação de amostras, essencialmente, implica a fixação das células-alvo para o slide, placa de cultura celular ou placa de microtitulação. A fixação perfeita seria imobilizar os antígenos, mantendo autêntica arquitetura celular e subcelular e permitir o acesso sem obstáculos de anticorpos para todas as células e compartimentos subcelulares. Uma vasta gama de fixadores como exemplificados acima, são vulgarmente utilizados, e a escolha correta do método irá depender da natureza do antígeno a ser examinado e sobre as propriedades do anticorpo usado. Os métodos de fixação geralmente caem em duas classes: solventes orgânicos e de reagentes de reticulação. Solventes orgânicos, tais como álcoois e acetona removem os lipídios e desidratam as células, enquanto precipitam as proteínas sobre a arquitetura celular. Reagentes de ligação cruzada tais como pontes intermoleculares formam paraformaldeído, normalmente por meio de grupos amina livres, criando assim uma rede de antígenos ligantes. Reticuladores preservam a estrutura celular melhor do que os solventes orgânicos, mas podem reduzir a antigenicidade de alguns componentes celulares, e frequentemente requerem a adição de uma etapa de permeabilização como indicado acima, para permitir o acesso do anticorpo à amostra. A fixação com ambos os métodos podem desnaturar antígenos de proteínas, e por essa razão, os anticorpos preparados contra as proteínas desnaturadas podem ser mais úteis para a coloração de células. O método de fixação apropriado deve ser escolhido de acordo com a aplicação relevante. Métodos de fixação das células estão bem descritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Methods in Cell Biology, Volume 37: Antibodies in Cell Biology, editado por David J. Asai, 1993, Academic Press Inc.).

[0029] O termo “pôr em contato”, tal como utilizado de acordo com o método da invenção significa colocar as células e os respectivos anticorpos em proximidade física, como para permitir a interação física e/ou química. As condições adequadas que permitem a interação específica são bem conhecidas dos versado na técnica. Evidentemente, as referidas condições dependerão dos anticorpos e das células nas quais são aplicadas no método da presente invenção e pode ser adaptado rotineiramente pelo versado na técnica. Além disso, um tempo que seja suficiente para permitir a interação também pode ser determinado pelo trabalhador qualificado sem mais especificações. É para ser entendido que entre as etapas individuais de contato das células e os respectivos anticorpos recitados no método da presente invenção, as etapas de lavagem podem ser realizadas de modo a obter as condições adequadas para o contato. Por exemplo, após o contato das células com, pelo menos, um primeiro anticorpo de captura específico para o substrato de Neurotoxina não clivado e clivado e com, pelo menos, um segundo anticorpo de captura ligado especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado na etapa c) do método da invenção, uma etapa de lavagem pode ser incorporada para remover a solução restante e/ou excesso de primeiro e segundo anticorpo de captura, antes de aplicar o primeiro anticorpo de detecção e/ou o segundo anticorpo de detecção. De forma similar, depois de levar as células em contato com o primeiro e/ou segundo anticorpo de detecção no método da invenção, uma etapa de lavagem pode ser incluída. Um tampão de lavagem adequado é, por exemplo, 0,1% de Triton X100 em tampão PBS 10 mM (pH 7,4). Mais especificamente, o termo “em contato”, tal como utilizado aqui, refere-se a colocar as células em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado e com, pelo menos, um segundo anticorpo de captura que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado, sob condições que permitem a ligação dos referidos anticorpos de captura para o referido substrato, na etapa c) do método da invenção. O primeiro e segundo anticorpo de captura podem ser aplicados às células ao mesmo tempo, por exemplo, como uma mistura, ou posteriormente. “Em contato” refere-se ainda a colocar em contato as células com pelo menos um primeiro anticorpo de detecção ligado especificamente ao primeiro anticorpo de captura, sob condições que permitem a ligação do referido primeiro anticorpo de detecção ao referido primeiro anticorpo de captura, e pelo menos um segundo anticorpo de detecção ligado especificamente ao segundo anticorpo de captura, sob condições que permitem a ligação do referido segundo anticorpo de detecção ao referido segundo anticorpo de captura, na etapa d) do método da invenção. Deste modo, os primeiro e segundo complexos de detecção são formados. Em alternativa, os primeiro e segundo anticorpos de detecção também podem ser aplicados posteriormente.

[0030] Tal como utilizado aqui, o termo “anticorpo” refere- se a uma molécula gerada por um sistema imunitário que foi feita em resposta a um antígeno particular que se liga especificamente a aquele antígeno, e inclui ambos os anticorpos que ocorrem naturalmente e os anticorpos que não ocorrem naturalmente. Um “anticorpo” tal como utilizado aqui, engloba um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo de cadeia simples, um dímero ou multímero, um anticorpo quimerizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo de cadeia simples biespecífico, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo sintético, um anticorpo humanizado, um anticorpo bifuncional, um anticorpo associado à célula como um receptor de Ig, um anticorpo linear, um diacorpo, um minicorpo, ou um fragmento de qualquer um dos referidos anticorpos. Os fragmentos dos referidos anticorpos incluem, por exemplo, fragmentos Fab, Fv, ou scFv, ou derivados modificados quimicamente de qualquer um destes fragmentos. Os anticorpos podem ser produzidos através de métodos que são descritos no estado da técnica; ver, por exemplo, Harlow e Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Prima, Cold Spring Harbor, 1988. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por meio das técnicas originalmente descritas em Kohler 1975, Nature 256, 495, e Galfré 1981, Meth. Enzymol. 73, 3. As referidas técnicas compreendem a fusão de células de mieloma de camundongo com células de baço provenientes de mamíferos imunizados. Os anticorpos podem ser ainda melhorados por meio de técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, a superfície de ressonância plasmônica como empregue no sistema Biacore pode ser utilizada para aumentar a eficiência de anticorpos de fagos que se ligam ao epítopo; ver, por exemplo, 1996 Schier, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; 1995 Malmborg, J. Immunol. Methods 183, 7. Anticorpos, tal como usados aqui também compreendem equivalentes funcionais de anticorpos, ou seja, agentes que são capazes de se ligar especificamente aos epítopos desejados ou partes dos substratos de Neurotoxina. Em um aspecto, tais equivalentes funcionais compreendem proteínas de ligação que se ligam especificamente a substratos de Neurotoxina ou domínios dos mesmos, que são capazes de mediar a referida ligação específica. Um anticorpo, tal como utilizado aqui, pode ser uma molécula de comprimento completo de imunoglobulina compreendendo os domínios VH e VL, bem como um domínio de cadeia leve constante (CL) e domínios de cadeia pesada constante, CH1, CH2 e CH3, ou um fragmento imunologicamente ativo de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total, tais como, por exemplo, um fragmento Fab, um F(ab')2, um fragmento Fc, um fragmento Fd ou um fragmento Fv. Um anticorpo pode ser derivado de qualquer espécie de vertebrado (por exemplo, humano, cabra, cavalo, burro, murino, rato, coelho, ou frango), e pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD ou IgA), classe (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, ou IgM) ou subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ou IgA2). Para a divulgação geral sobre a estrutura de anticorpos que ocorrem naturalmente, os anticorpos que não ocorrem naturalmente, e fragmentos de ligação a compostos antigênicos, veja, por exemplo, em The Pharmacology Plueckthun of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg e Moore, Springer-Verlag, Nova Iorque, pp 269-315 (1994); Borrabeck, Antibody Engineering 2d ed. (Oxford University Press). Anticorpos que ocorrem naturalmente são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve possui também pontes de dissulfeto intra-cadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada possui numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade. O domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Resíduos de aminoácidos particulares são acreditados por formarem uma interface entre a cadeia leve e os domínios variáveis da cadeia pesada.

[0031] O sítio de reconhecimento de antígeno e de ligação ao antígeno completo é contido dentro dos domínios variáveis do anticorpo, isto é, o fragmento Fv. Este fragmento inclui um dímero de um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) na associação estreita, não covalente. Cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FR), que adotam largamente uma configuração de folha beta, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam laços ligando, e em alguns casos formam parte da estrutura em folha beta. Cada região hipervariável compreende uma sequência de aminoácidos correspondente a uma região determinante de complementaridade (CDR). Coletivamente, a configuração tridimensional das seis regiões CDR que definem um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL que confere especificidade de ligação ao antígeno. Ver, por exemplo, Ciro Chothia, et al., Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions, Nature 342 (6252):. 877-883 (1989); Elvin A. Kabat, et al. Sequências de proteínas de interesse imunológico, 5th Ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md., (1991). Os domínios constantes do anticorpo não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetivas, tais como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

[0032] “Ligação seletiva” ou “ligação específica”, tal como utilizado aqui inclui as propriedades, tais como, por exemplo, afinidade de ligação, a especificidade de ligação, e a ligação avidez de ligação; ver, por exemplo, David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, pp. 240 (1998). A afinidade de ligação refere-se ao período de tempo que o anticorpo reside no seu sítio de ligação ao epítopo, e pode ser visto como a força com a qual um anticorpo se liga ao seu epítopo. A afinidade de ligação pode ser descrita como a constante de equilíbrio de dissociação de um anticorpo (Kd), que é definida como a razão Kd/Ka no estado de equilíbrio. Ka é a constante de velocidade de associação de anticorpos e Kd é constante de velocidade de dissociação do anticorpo. Afinidade de ligação é determinada tanto pela associação e a dissociação e sozinhas nem alta associação nem baixa dissociação podem garantir uma elevada afinidade. A constante de velocidade de associação (Ka), ou constante sobre-taxa (Kon), mede o número de eventos de ligação por unidade de tempo, ou a propensão do anticorpo e do antígeno a se associar de forma reversível em seu complexo anticorpo-antígeno. A constante de velocidade de associação está expressa em M-1 s-1, e é simbolizada como a seguir: [Ab] x [Ag] x Kon. Quanto maior for a constante de velocidade de associação, mais rapidamente o anticorpo liga-se ao seu antígeno, ou maior é a afinidade de ligação entre o anticorpo e o antígeno. A constante de velocidade de dissociação (Kd), ou a taxa de dissociação constante (Koff), mede o número de eventos de dissociação por unidade de tempo propensão de um complexo anticorpo-antígeno para separar (dissociar) reversivelmente nas suas moléculas componentes, ou seja, o anticorpo e o antígeno. A constante da taxa de dissociação é expressa em s-1, e é simbolizada como a seguir: [Ab + Ag] x Koff. Quanto menor for a constante de velocidade de dissociação, mais fortemente ligada ao anticorpo é ao seu antígeno, ou quanto maior a afinidade de ligação entre o anticorpo e o antígeno. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) mede a taxa a que novos complexos de antígeno-anticorpo formado é igual à taxa à qual os complexos antígeno-anticorpo se dissociam em equilíbrio. A constante de equilíbrio de dissociação é expressa em M, e é definido como Koff/Kon = [Ab] x [Ag]/[Ab + Ag] em que [Ab] é a concentração molar do anticorpo, [Ag] é a concentração molar do antígeno, e [Ab + Ag] é a concentração molar do complexo anticorpo- antígeno, em que todas as concentrações de tais componentes são quando o sistema está em equilíbrio. Quanto menor for a constante de equilíbrio de dissociação, o mais fortemente ligada ao anticorpo é para o seu antígeno, ou quanto maior a afinidade de ligação entre o anticorpo e o antígeno. Assim, num aspecto do método da invenção, o primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado pode ter uma constante de velocidade de associação de, por exemplo, menor do que 1 x 105 M-1 s-1, menor do que 1 x 106 M-1 s-1, menor do que 1 x 107 M-1 s-1 ou inferior a 1 x 108 M-1 s-1. Num outro aspecto, o primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado pode ter uma constante de velocidade de associação de, por exemplo, maior que 1 x 105 M-1 s-1, maior que 1 x 106 M-1 s-1, maior que 1 x 107 M-1 s-1 ou superior a 1 x 108 M-1 s-1. Num aspecto adicional, o primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato de Neurotoxina clivado e não clivado pode ter uma constante de velocidade de dissociação, por exemplo, inferior a 1 x 10-3 M-1 s-1, inferior a 1 x 104 M-1 s-1, inferior a 1 x 10-5 M-1 s-1 ou inferior a 1 x 10-6 M-1 s-1. Em ainda outro aspecto, o primeiro anticorpo de captura ligado especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado pode ter uma constante de velocidade de dissociação, por exemplo, maior que 1 x 10-3 M-1 s-1, maior que 1 x 10-4 M-1 s-1, maior que 1 x 10-5 M-1 s-1ou superior a 1 x 10-6 M-1 s-1. Num aspecto adicional, o segundo anticorpo de captura que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado pode ter uma constante de velocidade de associação, por exemplo, menor do que 1 x 105 M-1 s-1, menor do que 1 x 106 M-1 s-1, menor do que 1 x 107 M-1 s-1 ou inferior a 1 x 108 M-1 s-1. Em outro aspecto, o segundo anticorpo de captura que se liga especificamente ao ligando-se especificamente para o sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado pode ter uma constante de velocidade de associação, por exemplo, maior do que 1 x 105 M-1 s-1, maior do que 1 x 106 M-1 s-1, maior do que 1 x 107 M-1 s-1 ou superior a 1 x 108 M-1 s-1. Num aspecto adicional, o segundo anticorpo de captura especificamente ligado a ligação específica do sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado pode ter uma constante de velocidade de dissociação, por exemplo, inferior a 1 x 10-3 M-1 s-1, menor que 1 x 10-4 M-1 s-1, menor que 1 x 10-5 M-1 s-1 ou inferior a 1 x 10-6 M-1 s-1. Em outro aspecto adicional, o segundo anticorpo de captura ligado especificamente ao sítio de clivagem do substrato clivado por neurotoxina pode ter uma constante de velocidade de dissociação, por exemplo, maior que 1 x 10-3 M-1 s-1, maior que 1 x 10-4 M-1 s-1, maior que 1 x 10-5 M-1 s-1 ou superior a 1 x 10-6 M-1 s-1.

[0033] Um antígeno alvo, tais como os substratos de Neurotoxina não clivado ou clivado SNAP-25, VAMP/Sinaptobrevina, ou Sintaxina geralmente tem um ou mais sítios de ligação, também chamados de epítopos, que são reconhecidos pelo sítio de ligação do antígeno CDR-formado do anticorpo. Tal como usado aqui, um “epítopo” é sinônimo de “determinante antigênico” e refere-se ao sítio num antígeno alvo, tal como, por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo, polissacarídeo ou molécula contendo lipídios, capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de células T ou outra forma de interação com uma molécula. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente tem uma estrutura diferente. Assim, um antígeno pode ter mais do que um anticorpo correspondente. “Ligação específica”, como referida aqui pode ser testada através de várias técnicas bem conhecidas, incluindo, por exemplo, experiências de competição e Western blot. Um epítopo como utilizado de acordo com a invenção refere-se ao determinante antigênico nos substratos de Neurotoxina, por exemplo, SNAP-25, VAMP/sinaptobrevina, sintaxina ou que é reconhecido pelo anticorpo. Tal como utilizado aqui, o termo “especificamente” significa e refere- se seletivamente a ter um efeito único ou influência ou reação em apenas uma forma ou com uma única coisa. Tal como usado aqui, o termo “liga-se especificamente” ou “liga-se seletivamente” quando feito em referência a um anticorpo ou proteína de ligação ou domínio de ligação, refere-se à ligação discriminatória do anticorpo ou proteína/domínio de ligação ao epítopo-alvo indicada tal que a anticorpo ou proteína/domínio de ligação não reagem substancialmente de forma cruzada com epítopos não alvo. A dimensão mínima de um epítopo de peptídeo, tal como definido aqui, é cerca de cinco resíduos de aminoácidos, e um peptídeo epítopo incl ui tipicamente pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, ou pelo menos 30 resíduos de aminoácidos . Um peptídeo epítopo pode ser uma cadeia linear ou um epítopo descontínuo. Um epítopo descontínuo compreende resíduos de aminoácidos que não estão adjacentes à estrutura primária do peptídeo, mas são trazidos em conjunto para um epítopo através da estrutura secundária, terciária ou quaternária do peptídeo. Além disso, nota-se também que um epítopo pode compreender uma porção de uma outra molécula diferente da sequência de aminoácidos, tais como, por exemplo, porção de carboidrato, radical lipídico como glicolípidios ou lipoproteínas, ou uma porção de aminoácido quimicamente modificada como um aminoácido fosforilado.

[0034] De acordo com o método da resente invenção, o “primeiro anticorpo de captura” se liga especificamente a um epítopo compreendido de um substrato de Neurotoxina clivado e não clivado. Os referidos substratos de Neurotoxina podem ser, por exemplo, SNAP-25, VAMP/Sinaptobrevina, ou Sintaxina. Neste exemplo, SNAP-25 é um substrato conhecido de BoNT/A, BoNT/C1 e BoNT/E. VAMP/Sinaptobrevina é um substrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G e TeNT, em que Sintaxina é um substrato de BoNT/C1. O referido primeiro anticorpo de captura permite a determinação da quantidade total, ou seja, quantidade total dos respectivos substratos de Neurotoxina nas células. Por exemplo, em SNAP-25, possuindo um comprimento total de 205 resíduos de aminoácidos, o sítio de clivagem para BoNT/A é localizado entre os resíduos de aminoácidos Gln 197 e Arg 198. De forma similar, um anticorpo especificamente ligado a um epítopo posicionado com N-terminal ao sítio de clivagem de BoNT/A, ou seja, um epítopo localizado entre os resíduos de aminoácidos 1 e 198 de SNAP-25 pode ser usado como primeiro anticorpo de captura. Por exemplo, o referido anticorpo pode ser ligar especificamente ao N-terminal do epítopo ou um epítopo posicionado na parte média de SNAP-25. Para BoNT/C1, um epítopo posicionado pelo N-terminal a um sítio de clivagem de BoNT/Cl (Arg 198 - Ala 199), ou seja, entre os resíduos de aminoácidos 1 e 199 de SNAP-25 pode ser usado como primeiro anticorpo de captura. Para BoNT/E, um epítopo posicionado pelo N-terminal a um sítio de clivagem de BoNT/E (Arg 180 - Ile 181), ou seja, entre os resíduos de aminoácidos 1 e 181 de SNAP-25 pode ser usado como primeiro anticorpo de captura. Se VAMP é usado como substrato de Neurotoxina, um epítopo posicionado pelo N-terminal a um sítio de clivagem de BoNT/B (Gln 76 - Phe 77), ou seja, entre os resíduos de aminoácidos 1 e 77 de VAMP pode ser usado como primeiro anticorpo de captura. Um epítopo posicionado pelo N-terminal a um sítio de clivagem de BoNT/D (Lys 59 - Leu 60), ou seja entre os resíduos de aminoácidos 1 e 60 de VAMP2 pode ser usado como primeiro anticorpo de captura. Um epítopo posicionado pelo N- terminal a um sítio de clivagem de BoNT/F (Gln 58 - Lys 59), ou seja, entre os resíduos de aminoácidos 1 e 59 de VAMP2 pode ser usado como primeiro anticorpo de captura. Um epítopo posicionado pelo N-terminal a um sítio de clivagem de BoN/G (Ala 81 - Ala 82), ou seja, entre os resíduos de aminoácidos 1 e 82 de VAMP2 pode ser usado como primeiro anticorpo de captura. Se Sintaxina é usado como substrato, um epítopo posicionado pelo N-terminal a um sítio de clivagem de BoN/C1 (Lys 253 - Ala 254), ou seja, entre os resíduos de aminoácidos 1 e 254 de Sintaxina 1a pode ser usado como primeiro anticorpo de captura.

[0035] Um sítio de clivagem de neurotoxina reconhecido e clivado pela protease BoNT/A, em um aspect da invenção, é derivado de uma proteína que é sensível a clivagem pela BoNT/A. Em um aspecto, tal proteína é SNAP-25A ou SNAP-25B humana ou uma homóloga, paráloga ou ortóloga das mesmas de rato, camundongo, bovinos, e outros gêneros biológicos como Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea ou Aplysia. Sítios de clivagem adequados derivados das referidas proteínas são revelados em, por exemplo, EP 1 926 744 B1.

[0036] Um sítio de clivagem de neurotoxina reconhecido e clivado pela protease BoNT/B, em um aspecto da invenção, é derivado de uma protein que é sensível a clivagem pela BoNT/B. Em um aspecto, tal proteína é uma VAMP-1, VAMP-2 humana ou de camundongo e VAMP-3/celubrevina, VAMP-2 bovina, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato, VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de ave, Torpedo VAMP- 1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, ou syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 ou VAMP-3, Danio VAMP-1 ou VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP ou Caenorhabditis SNB1-semelhante ou qualquer ortóloga, paráloga ou homóloga das mesmas. Sítios de clivagem adequados derivados a partir de proteínas são revelados em EP 1 926 744 B1.

[0037] Um sítio de clivagem reconhecido e clivado pela protease BoNT/C1, em um aspecto da invenção, é derivado de uma proteína que é sensível a clivagem pela BoNT/C1. Em um aspecto, tal proteína é uma Sintaxina 1A, Sintaxina 1B1, Sintaxina 2-1, Sintaxina 2-2, Sintaxina 2-3 humana e de camundongo, Sintaxina 3A ou Sintaxina 1B2, Sintaxina 1a bovina ou de camundongo, Sintaxina 1B1 ou Sintaxina 1B2, Sintaxina 2 ou Sintaxina 3 de camundongo, Sintaxina 1A de rato, Sintaxina 1B1, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2, Sintaxina 3A, Sintaxina 3B ou Sintaxina 3C, Sintaxina 1A ou Sintaxina 2 de galinha; Xenopus Sintaxina 1A ou Sintaxina 1B, Danio Sintaxina 1A, Sintaxina 1B ou Sintaxina 3, Torpedo Sintaxina 1A ou Sintaxina 1B, Strongylocentrotus Sintaxina 1A ou Sintaxina 1B, Drosophila Sintaxina 1A ou Sintaxina 1B, Hirudo Sintaxina 1A ou Sintaxina 1B, Loligo Sintaxina 1A ou Sintaxina 1B, Lymnaea Sintaxina 1A ou Sintaxina 1B ou qualquer ortóloga, paráloga, ou homóloga da mesma. Sítios de clivagem adequados derivados das referidas proteínas são revelados em EP 1 926 744 B1.

[0038] Um sítio de clivagem reconhecido e clivado pela protease BoNT/D,em um aspecto da invenção, é derivado de uma proteína que é sensível a clivagem pela BoNT/D. Em um aspecto, tal proteína é VAMP-1, VAMP-2 humana ou de camundongo e VAMP-3/celubrevina, VAMP-2 bovina, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato, VAMP-1 de ave, VAMP-2 ou VAMP-3, Torpedo VAMP-1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, ou syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 ou VAMP-3, Danio VAMP-1 ou VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP ou Caenorhabditis SNB1-semelhante ou qualquer ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma. Sítios de clivagem adequados derivados das referidas proteínas são revelados em EP 1 926 744 B1.

[0039] Um sítio de clivagem reconhecido e clivado pela protease BoNT/E, em um aspecto da invenção, é derivado de uma proteína que é sensível a clivagem pela BoNT/E. Em um aspecto, tal proteína é uma SNAP-25A ou B humana ou de camundongo ou uma ortóloga, homóloga, paráloga das mesmas de rato, camundongo, bovinos e outros gêneros como Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea ou Aplysia. Sítios de clivagem adequados derivados das referidas proteínas são revelados em EP 1 926 744 B1.

[0040] Um sítio de clivagem reconhecido e clivado pela protease BoNT/F, em um aspecto da invenção, é derivado de uma proteína que é sensível a clivagem pela BoNT/F. Em um aspecto, tal proteína é VAMP-1, VAMP-2 humana ou de camundongo e VAMP- 3/celubrevina, VAMP-2 bovina, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato, VAMP- 1, VAMP-2 de ave ou VAMP-3, Torpedo VAMP-1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, ou syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 ou VAMP-3, Danio VAMP-1 ou VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP ou Caenorhabditis SNB1-semelhante ou qualquer ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma. Sítios de clivagem adequados derivados das referidas proteínas são revelados em EP 1 926 744 B1.

[0041] Um sítio de clivagem reconhecido e clivado pela protease BoNT/G,em um aspecto da invenção, é derivado de uma proteína que é sensível a clivagem pela BoNT/G. Em um aspecto, tal proteína é uma proteína VAMP-1, VAMP-2 humana ou de camundongo e VAMP-3/celubrevina, VAMP-2 bovina, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato, VAMP-1, VAMP-2 ou VAMP-3 de ave, Torpedo VAMP- 1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, ou syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 ou VAMP-3, Danio VAMP-1 ou VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP ou Caenorhabditis SNB1-semelhante ou qualquer ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma. Sítios de clivagem adequados derivados das referidas proteínas são revelados em EP 1 926 744 B1.

[0042] Um sítio de clivagem reconhecido e clivado pela protease TeNT,em um aspecto da invenção, é derivado de uma proteína que é sensível a clivagem pela TeNT. Em um aspecto, tal proteína é VAMP-1, VAMP-2 humana ou de camundongo e VAMP- 3/celubrevina, VAMP-2 bovina, VAMP-2 ou VAMP-3 de rato, VAMP- 1, VAMP-2 ou VAMP-3 de ave, Torpedo VAMP-1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, ou syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 ou VAMP-3, Danio VAMP-1 ou VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP ou Caenorhabditis SNB1-semelhante ou qualquer ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma. Sítios de clivagem adequados derivados das referidas proteínas são revelados em EP 1 926 744 B1.

[0043] Exemplos para anticorpos apropriados os quais podem ser usados como primeiro anticorpo de captura no método da invenção incluem, por exemplo, o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) (Fernández-Salas E, Wang J, Molina Y, Nelson JB, Jacky BPS, et al. (2012) Botulinum Neurotoxin Serotype a Specific Cell-Based Potency Assay to Replace the Mouse Bioassay. PLoS ONE 7(11): e49516. doi:10.1371/journal.pone.0049516), o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP25 PA5-19708 (Anticorpos Pierce), o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP25 PA5-19701 (Anticorpos Pierce), o anticorpo VAMP/Sinaptobrevina sc-13992 (Santa Cruz Biotechnology) ou # 104 203 (Synaptic Systems), ou anticorpo da Sintaxina ADI-VAM-SV013 (Enzo Life Sciences).

[0044] Num aspecto, o primeiro anticorpo de captura que reconhece o substrato de Neurotoxina não clivado e clivado, a fim de determinar a quantidade total de substrato de Neurotoxina na célula é usado para a normalização, como mostrado nos Exemplos a seguir.

[0045] O “segundo anticorpo de captura”, tal como utilizado aqui especificamente se liga ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado. Por conseguinte, o referido segundo anticorpo de captura reconhece seletivamente o substrato de Neurotoxina clivado pela Neurotoxina, por exemplo, o produto de SNAP-25 BoNT/A-clivado. Em contraste, o referido segundo anticorpo de captura não é capaz de se ligar ao substrato de Neurotoxina não clivado, tal como, por exemplo, SNAP-25 não clivado. Exemplos de anticorpos apropriados que podem ser utilizados como segundos anticorpos de captura no método da invenção incluem, por exemplo, os anticorpos monoclonais de camundongo da presente invenção, tal como indicado a seguir, o anticorpo monoclonal de camundongo MC-6053 (R & D Systems), que reconhece o substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado (Baldwin e Barbieri 2007, Biochemistry 46, 3200-3210), bem como o anticorpo monoclonal de camundongo DMAB4345 (Creative Diagnostics).

[0046] A presente invenção proporciona num outro aspecto, novos anticorpos monoclonais ligados especificamente ao sítio de clivagem de SNAP-25, isto é, o SNAP-25 clivado por Neurotoxina apenas, ao passo que eles não se ligam a SNAP-25 não clivado. Os referidos anticorpos monoclonais foram gerados e caracterizados tal como descrito nos Exemplos seguintes, e foram considerados particularmente apropriados como segundos anticorpos de captura para o método da invenção, devido à sua elevada afinidade e especificidade para SNAP-25 clivado por Neurotoxina. De um modo preferido, os anticorpos monoclonais da invenção reconhecem e se ligam especificamente ao epítopo de SNAP-25190-197 “TRIDEANQ” mostrada em SEQ ID NO: 74 e/ou para o SNAP-25197, ou seja, SNAP-25 de neurotoxina (por exemplo, BoNT/A) clivado. Mais preferencialmente, os anticorpos monoclonais da invenção reconhecem e se ligam especificamente ao epítopo SNAP-25191-197 “RIDEANQ” mostrada em SEQ ID NO: 75 e/ou ao SNAP-25197, ao epítopo de SNAP-25192-197 “IDEANQ” da sequência mostrada em SEQ ID NO: 76 e/ou para o SNAP-25197, ou o epítopo de SNAP-25193-197 “DEANQ” mostrada em SEQ ID NO: 77 e/ou ao SNAP-25197.

[0047] Num aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado, e que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 18 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 19. Além disso, inseridos pela presente invenção estão os anticorpos ou fragmentos dos mesmos que compreendem um, dois ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da referida região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve. As sequências de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 correspondentes estão apresentadas em SEQ ID NOs. 20 a 22, respectivamente, enquanto que as sequências correspondentes CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são mostradas em SEQ ID NOs. 23 a 25, respectivamente. As sequências mencionadas correspondem ao anticorpo monoclonal de camundongo 20-2-5, como mostrado nos Exemplos a seguir. Além disso, a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado, e que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 26 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 27. Além disso, inseridos pela presente invenção estão os anticorpos ou fragmentos dos mesmos que compreendem uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da referida região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve. As sequências correspondentes de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 estão apresentadas nas SEQ ID NOs. 28 a 30, respectivamente, enquanto que as sequências correspondentes CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são mostradas em SEQ ID NOs. 31 a 33, respectivamente. As sequências mencionadas correspondem ao anticorpo monoclonal de camundongo 5-10-5 como mostrado nos Exemplos seguintes. Além disso, a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado, e que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 34 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 35. Além disso, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos inseridos pela presente invenção compreendem uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da referida região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve. As sequências de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 correspondentes estão apresentadas em SEQ ID NOs. 36 a 38, respectivamente, enquanto que as sequências correspondentes CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são mostradas em SEQ ID NOs. 39 a 41, respectivamente. As sequências mencionadas correspondem ao anticorpo monoclonal de ratinho 1-10-4 como mostrado nos Exemplos seguintes. A presente invenção refere-se também a um anticorpo ou um seu fragmento, que se liga especificamente ao local de clivagem do substrato de BoNT/A-clivado SNAP-25, e que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 42 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 43. Além disso, inseridos pela presente invenção estão os anticorpos ou fragmentos dos mesmos que compreendem uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da referida região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve. As sequências de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 correspondentes estão apresentadas em SEQ ID NOs. 44 a 46, respectivamente, enquanto que as sequências correspondentes CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são mostradas em SEQ ID NOs. 47 a 49, respectivamente. As sequências mencionadas correspondem ao anticorpo monoclonal de camundongo 16-5-4, como mostrado nos Exemplos seguintes. Além disso, a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado, e que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 50 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 51. Além disso, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos englobados pela presente invenção compreendem uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da referida região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve. As sequências de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 correspondentes estão apresentadas em SEQ ID NOs. 52 a 54, respectivamente, enquanto que as sequências correspondentes CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são mostradas na SEQ ID NOs. 55 a 57, respectivamente. As sequências mencionadas correspondem a anticorpo monoclonal de camundongo 6-3-8 como mostrado nos Exemplos seguintes. A presente invenção refere-se ainda a um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado, e que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 58 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 59. Além disso, inseridos pela presente invenção estão os anticorpos ou fragmentos dos mesmos que compreendem uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da referida região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve. As sequências de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 correspondentes estão apresentadas em SEQ ID NOs. 60 a 62, respectivamente, enquanto que as sequências correspondentes CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são mostradas em SEQ ID NOs. 63 a 65, respectivamente. As sequências mencionadas correspondem ao anticorpo monoclonal de camundongo 18-3-3, como mostrado nos Exemplos seguintes. Além disso, a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado, e que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 66 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 67. Além disso, inseridos pela presente invenção estão anticorpos ou fragmentos dos mesmos que compreendem uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da referida região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve. As sequências de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 correspondentes estão apresentadas em SEQ ID NOs. 68 a 70, respectivamente, enquanto que as sequências correspondentes CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são mostradas em SEQ ID NOs. 71 a 73, respectivamente. As sequências mencionadas correspondem ao anticorpo monoclonal de camundongo 14-12-1 como se mostra nos Exemplos seguintes.

[0048] O termo “primeiro anticorpo de detecção” tal como usado aqui, é um anticorpo que se liga especificamente ao primeiro anticorpo de captura. O referido primeiro anticorpo de detecção permite a detecção específica do primeiro anticorpo de captura. Ao medir a quantidade de anticorpo ligado em primeiro lugar a detecção, a quantidade de complexos de detecção primeiros pode ser determinada uma vez que a quantidade de anticorpo ligado à primeira detecção no primeiro complexo de detecção se correlaciona com a quantidade de anticorpo primeira captura (e, consequentemente, a quantidade do total, ou seja, clivado e substrato neurotoxina não clivado) composta pelo primeiro complexo de detecção. Por exemplo, um anticorpo específico da espécie adequada pode ser utilizado como um primeiro anticorpo de detecção: Se um anticorpo de ratinho foi utilizado como um primeiro anticorpo de captura, o referido anticorpo primeira detecção pode ser um anticorpo anti-rato de se ligar especificamente ao anticorpo de ratinho. O primeiro anticorpo de detecção pode ser, por exemplo, uma fosfatase alcalina (AP) conjugado a anticorpo, uma peroxidase de raiz forte (HRP) conjugado a um anticorpo ou anticorpo conjugado com um corante fluorescente. A conjugação de enzimas a anticorpos, por exemplo, através da utilização de glutaraldeído é bem conhecido no estado da técnica.

[0049] Ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA) foi utilizado para quantificar uma grande variedade de compostos e agentes patogênicos há quase 40 anos. Inicialmente, a radioatividade foi utilizada para quantificar os ensaios, mas os radioimunoensaios (RIA) foram substituídos com testes que utilizam enzimas para obter resultados colorimétricos. Recentemente novos substratos foram desenvolvidos para produzir produtos fluorescentes e luminescentes. O princípio básico dos novos ensaios permanece o mesmo como teste colorimétrico. O substrato é convertido em um composto mensurável pela atividade enzimática de proteínas conjugadas a um anticorpo, a qual confere especificidade.

[0050] Conjugados de enzimas comumente utilizados em ELISA são fosfatase alcalina ou peroxidase de raiz forte. Por conseguinte, num aspecto, o primeiro anticorpo de detecção pode ser, por exemplo, conjugado com fosfatase alcalina ou peroxidase de raiz forte. Outros exemplos de conjugados de enzimas e que podem ser utilizados como um primeiro anticorpo de detecção no método da invenção incluem a glicose oxidase, que utiliza a glicose como substrato, a tirosinase, que converte o substrato 1-(4-metil-cumarin-7-il)-3-(4- hidroxifenil)ureia) (PAP-AMC) (Stratis Avrameas, Immunochemistry, Volume 6, Edição 1, janeiro de 1969, Páginas 43-48, IN9-IN11, 49-52) ou β-galactosidase que converte o substrato 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil-SS-d- galactopiranosídeo (DiFMUG) (Gee et al., Analytical Biochemistry, Volume 273, Número 1, Agosto de 1999, páginas 41-48). Após a adição de um substrato, o referido substrato é convertido pela enzima de uma forma detectável. Por exemplo, a fosfatase alcalina catalisa a clivagem de ésteres de ácido fosfórico. Se uma fosfatase alcalina (AP)-conjugada ao anticorpo é utilizada como um primeiro anticorpo de detecção, um substrato apropriado, tal como um 4-metillumbeliferil derivado de fosfato, por exemplo, fosfato de 6,8-difluoro-4- metilumbeliferil (DiFMUP), ou difosfato de fluoresceína (FDP). Fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeli-feril (DiFMUP) é convertido pelo AP para uma forma detectável, isto é, o produto fluorogênico 6,8-difluoro-4-metilumbeliferona. O referido substrato é fornecido, por exemplo, por Sonda Molecular. Intensidades de fluorescência do produto de reação de DiFMUP pode ser medida utilizando máximos de excitação/emissão de cerca de358/450 nm. Outros substratos que podem ser utilizados para este fim são 9H-(1,3-dicloro-9,9- dimetilacridin-2-ona-7-il) fosfato (DDAO-fosfato; Invitrogen), difosfato de fluoresceína (FDP, Sigma Aldrich) ou fosfato de 4-metilumbeliferil (MUP; Invitrogen). DDAO-fosfato é convertido pelo AP para o produto dimetilacridinona fluorogênico (DDAO), contendo um máximo de excitação/emissão de cerca de 646/659 nm. Se FDP é utilizada como substrato para o AP, o produto da reação é fluoresceína, com um máximo de excitação/emissão de cerca de 490/514 nm. Para MUP, o produto de reacção correspondente é 4-metilumbeliferona (7-hidroxi-4- metilcumarina), contendo uma máximos de excitação/emissão de cerca de 360/449 nm. Também estes substratos estão disponíveis comercialmente, por exemplo, a partir de Sonda Molecular. Alternativamente, a peroxidase de raiz forte pode ser usada como conjugado de enzima no primeiro anticorpo de detecção do método da invenção. A peroxidase de raiz forte (HRP) catalisa a redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) e a água (H2O). Na presença de substratos específicos, que agem como doadores de hidrogênio, a ação de da HRP converte moléculas incolores ou não fluorescentes em partes coloridas e/ou fluorescentes, respectivamente. Por exemplo, Amplex® Red (Life Technologies) é um substrato para utilização com HRP contendo ensaios. Amplex Red, na presença da enzima peroxidase, reage com o H2O2 na proporção estequiométrica de 1:1 para produzir resorufina, um composto fluorescente vermelho que tem uma absorção e emissão de fluorescência máxima 563 nm e 587 nm, respectivamente. Outro exemplo de um substrato de HRP é Amplex® Ultrared (Life Technologies). Tem sido relatado que o reagente Amplex® Ultrared (excitação/emissão de ~570/585 nm) melhora o desempenho do reagente Amplex®Red, oferecendo fluorescência mais brilhante e mais sensível em uma base por mol de peroxidase de raiz forte ou ensaio de enzima peroxidase de raiz forte-acoplada. A fluorescência do reagente oxidado Amplex® Ultrared (reagente Amplex® UltroxRed) também é menos sensível ao pH, e o substrato e seu produtos de oxidação exibem maior estabilidade que o reagente Amplex® Red na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2) ou tióis tais como ditiotreitol (DTT). Além disso, substratos de HRP apropriados que podem ser utilizados no método da invenção incluem, por exemplo, 10-acetil-3,7-Dihidroxifenoxazina (ADHP; AnaSpec) ou ácido 3-(4-hidroxifenil)propiônico (HPPA; AnaSpec) (Tuuminen et al., 1991, J. Immunoassay 12, 29-46).

[0051] Alternativamente, o primeiro anticorpo de detecção pode transportar um marcador apropriado, detectável que permite a detecção do primeiro anticorpo de captura. A marcação pode ser feita por métodos diretos ou indiretos. A marcação direta envolve a ligação do marcador diretamente (covalentemente ou não covalentemente) com o primeiro anticorpo de detecção. Marcação indireta envolve a ligação (de forma covalente ou não covalente) de um agente que se liga especificamente ao primeiro anticorpo de detecção e que transporta um marcador detectável. Tal agente pode ser, por exemplo, um anticorpo secundário (de ordem superior) que se liga especificamente ao primeiro anticorpo de detecção. O anticorpo secundário, em tal caso será acoplado a um marcador detectável. Deve entender-se que os anticorpos ainda, de ordem mais elevada, podem ser utilizados em adição à detecção do primeiro complexo de detecção. Os anticorpos de ordem superior são muitas vezes usados para aumentar o sinal. Os anticorpos adequados de ordem superior podem também incluir o sistema estreptavidina-biotina bem conhecido (Vector Laboratories, Inc.), e o bem conhecido Dako LSAB™2™ e LSAB + (estreptavidina marcada com biotina), ou Dako PAP (Anti-Peroxidase peroxidase). Num outro aspecto, o referido marcador do primeiro anticorpo de detecção é um corante fluorescente, isto é, o primeiro anticorpo é conjugado com um corante fluorescente. Neste caso, a fluorescência pode ser medida diretamente por um leitor de fluorescência. Marcadores fluorescentes típicos incluem proteínas fluorescentes, tais como GFP e seus derivados, corantes tais como Cy Cy3, Cy5 ou, Texas Red, fluoresceína, e os corantes Alexa, por exemplo, Alexa 568.

[0052] O “segundo anticorpo de detecção” tal como utilizado aqui, é um anticorpo que se liga especificamente ao segundo anticorpo de captura. O segundo anticorpo de detecção pode ser, por exemplo, conjugados com uma enzima tal como fosfatase alcalina, peroxidase de raiz forte, glicose-oxidase ou a tirosinase. Em consequência, num aspecto, o segundo anticorpo de detecção é uma fosfatase alcalina (AP) conjugada ao anticorpo, uma peroxidase de raiz forte (HRP) conjugado ao anticorpo, um anticorpo conjugado com glicose oxidase ou um anticorpo conjugado com tirosinase. O referido segundo anticorpo de detecção permite a detecção específica do segundo anticorpo de captura. Ao medir a quantidade de segundo anticorpo de detecção ligado, a quantidade de segundos complexos de detecção pode ser determinada uma vez que a quantidade de segundo anticorpo de detecção ligado no segundo complexo de detecção se correlaciona com a quantidade de segundo anticorpo de captura (e, consequentemente, a quantidade de substrato de Neurotoxina clivado) composta pelo primeiro complexo de detecção. Por exemplo, se um anticorpo de coelho foi usado como um segundo anticorpo de captura, um anticorpo anti-coelho pode ser usado como um segundo anticorpo de detecção. O segundo anticorpo de detecção pode transportar uma enzima tal como descrito acima ou um marcador, tal como um corante fluorescente (isto é, o segundo anticorpo de detecção é conjugado com um corante fluorescente) como mencionado em outras partes deste documento no que diz respeito ao primeiro anticorpo de detecção. Num aspecto do método da invenção, a enzima conjugada com o primeiro anticorpo de detecção difere da enzima conjugada com o segundo anticorpo de detecção, a fim de permitir a detecção específica do respectivo primeiro e segundo anticorpo de captura no método da invenção. Por exemplo, se o primeiro anticorpo de detecção é um anticorpo conjugado com AP, o segundo anticorpo de detecção pode ser uma peroxidase de raiz forte (HRP) conjugada ao anticorpo, ou vice-versa. Ademais, os espectros de excitação/emissão dos substratos fluorogênicos do AP e HRP não se sobrepõem, substancialmente, mas diferem uns dos outros, isto é, eles mostram uma clara mudança, de modo a permitir a distinção das intensidades de fluorescência geradas pelo respectivo produto. Por exemplo, DiFMUP exibe excitação/emissão a ~358/450 nm, enquanto que Amplex Ultrared exibe excitação/emissão de ~570/585 nm, permitindo assim medições precisas sobre as intensidades de fluorescência gerada pela conversão dos referidos substratos fluorogênicos pela respectiva enzima. Num outro aspecto, a fosfatase alcalina (AP) conjugada ao anticorpo é utilizada como um primeiro anticorpo de detecção para o antígeno que está presente em excesso na célula, ou seja, para a medição da quantidade total de substrato de Neurotoxina (não clivado e clivado), tal como o total de SNAP- 25, na célula. O anticorpo peroxidase de raiz forte (HRP)- conjugado é usado como um segundo anticorpo de detecção para o antígeno que está presente na célula numa quantidade menor, isto é, para a medição da quantidade de substrato de Neurotoxina clivado, tal como SNAP-25 de BoNT/A-clivado, na célula. Como é conhecido no estado da técnica, os substratos de HRP são mais sensíveis do que os substratos de AP mostrando que menores quantidades de analitos pode ser detectada. Se um anticorpo de HRP é utilizado como anticorpo secundário para a detecção da clivagem de SNAP-25, quantidades menores de SNAP- 25 clivados são detectáveis. Por sua vez, quantidades menores de BoNT/A pode ser determinadas, aumentando assim a sensibilidade do ensaio. Uma vez que o anticorpo AP mede a quantidade total de SNAP-25 na célula, a alta sensibilidade para o substrato não é necessária, devido ao excesso de analito.

[0053] O termo “pelo menos”, como usado aqui, tal como, por exemplo, “pelo menos um primeiro anticorpo de captura” significa que, além de um anticorpo ligado especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado, um ou mais outros anticorpos com a especificidade mencionada podem ser utilizados no método da invenção. Da mesma forma, “pelo menos um segundo anticorpo de captura” significa que, além de um anticorpo ligado especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado, um ou mais anticorpos com a especificidade mencionada podem ser utilizado no método da invenção. Além disso, um ou mais primeiros anticorpos de detecção se ligam especificamente ao primeiro anticorpo de detecção (ou primeiros anticorpos de detecção) podem ser usados no método da invenção. De forma similar, um ou mais anticorpos de detecção que se ligam especificamente ao segundo anticorpo de detecção (ou segundos anticorpos de detecção) podem ser utilizados no método da invenção.

[0054] O termo “primeiro complexo de detecção” refere-se a um complexo que compreende um primeiro anticorpo de captura e um primeiro anticorpo de detecção que se liga especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado, permitindo, assim, a determinação do teor total de substrato de Neurotoxina na célula. A quantidade do primeiro complexo de detecção pode ser medida por determinação da quantidade de primeiro anticorpo de detecção especificamente ligado. Isto pode ser obtido dependendo da natureza da enzima ou marcador do primeiro anticorpo de detecção, por exemplo, medindo a intensidade de fluorescência.

[0055] O termo “segundo complexo de detecção” refere-se a um complexo que compreende o segundo anticorpo de captura e o segundo anticorpo de detecção que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado, permitindo, assim, a determinação do teor de substrato de Neurotoxina clivado na célula. A quantidade do segundo complexo de detecção pode ser medida por determinação da quantidade de segundo anticorpo de detecção especificamente ligado. Isto pode ser obtido dependendo da natureza da enzima ou marcador do segundo anticorpo de detecção, por exemplo, medindo a intensidade de fluorescência.

[0056] Prevê-se que, ao invés de usar p ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), qualquer sistema de detecção pode ser utilizado para praticar os aspectos do método da invenção, com a condição de que a relação sinal- ruído pode distinguir para um grau estatisticamente significativo o sinal a partir dos complexos antígeno- anticorpo formados a partir do sinal de fundo. Exemplos não limitativos de sistemas de detecção imuno-baseados incluem análise de imunotransferência, como Western blotting e dot blotting, análise por imunoprecipitação, e ELISA tipo sanduíche. A detecção do sinal pode ser alcançada utilizando imagiologia ou autorradiografia com a imagiologia de fósforo (UA), bioluminescência (BL), fluorescência, transferência de energia de ressonância, polarização plana, colorimétrica, ou citometria de fluxo (FC). As descrições de sistemas de detecção imuno-baseados são divulgados, por exemplo, nas técnicas vulgarmente usadas em clonagem molecular, pp. A8.1- A8-55 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3. Ed sup.rd 2001).; Sistemas de Detecção, pp. A9.1-A9-49 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001).

[0057] Em outro aspecto, as células, anticorpos, polipeptídeos Neurotoxina e substratos de Neurotoxina a ou qualquer outro produto, tal como referido na presente memória descritiva são anticorpos, células isoladas, polipeptídeos Neurotoxina, substratos de Neurotoxina ou produtos, respectivamente. Tal como utilizado aqui, o termo “isolado”, tal como um anticorpo isolado refere-se a uma molécula separada do seu ambiente natural pelo uso da intervenção humana.

[0058] Num aspecto do método da invenção, o método é um método de fluorescência.

[0059] Em outro aspecto do método da invenção, o polipeptídeo Neurotoxina é um polipeptídeo BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F ou BoNT/G ou um polipeptídeo Neurotoxina de Tétano (TeNT), conforme definido em detalhes deste documento.

[0060] Num aspecto adicional do método da invenção, o substrato de Neurotoxina é VAMP/sinaptobrevina, SNAP-25 ou Sintaxina.

[0061] A seguir, os números de acesso correspondentes dos respectivos substratos de Neurotoxina que são usados no método da invenção são indicados: SNAP-25 humana P60880, Sintaxina-1A humana Q16623, Sintaxina-1B P61266, Sintaxina-2 P32856, Sintaxina-3 Q13277, Sintaxina-4 Q12846, Sintaxina-5 Q13190, Sintaxina-6 O43752, Sintaxina-7 O15400, Sintaxina-8 Q9UNK0, Sintaxina-10 O60499, Sintaxina-11 O75558, Sintaxina-12 Q86Y82, Sintaxina-16 O14662, Sintaxina-17 P56962, Sintaxina-18 Q9P2W9, Sintaxina-19 Q8N4C7; Sinaptobrevina-1 humana P23763, Sinaptobrevina-2 P63027, Sinaptobrevina-3 Q15836; Sinaptotagmina humana: Sinaptotagmina-1 P21579, Sinaptotagmina-2 Q8N9I0, Sinaptotagmina-3 Q9BQG1, Sinaptotagmina-4 Q9H2B2, Sinaptotagmina-5 O00445, Sinaptotagmina-6 Q5T7P8, Sinaptotagmina-8 Q8NBV8,

[0062] Em outro aspecto da invenção, as células são células neuronais ou células diferenciadas neuronais selecionadas a partir do grupo que consiste de: células neuronais primárias, as células tumorais que são capazes de se diferenciarem para células neuronais, tais como células de neuroblastoma ou linhagens celulares, tal como definido em outro lugar aqui, células P19 ou neurônios (iPS)-derivados de células tronco pluripotentes, de preferência neurônios (iPS)-derivados de células tronco pluripotentes humanos.

[0063] Em outro aspecto do método da invenção, as células de fixação são realizadas através da adição de um agente de fixação selecionado a partir do grupo consistindo em: metanol, etanol, acetona, formaldeído ou misturas dos mesmos. De preferência, a fixação das células é realizada por adição de metanol resfriado em gelo (-20°C) e incubação durante cerca de 20 minutos a -20°C.

[0064] Em um aspecto do método da invenção, o primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado permite a determinação da quantidade total de substrato de Neurotoxina nas células. Regiões de ligação adequadas e os epítopos do primeiro anticorpo de captura dentro do respectivo substrato de Neurotoxina foram definidos neste documento.

[0065] De acordo com aspectos específicos do método da invenção, o primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato de Neurotoxina não clivado e clivado é o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 S9684, o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 PA5-19708 (anticorpos Pierce), ou o anticorpo policlonal de coelho anti- SNAP25 PA5-19701 (anticorpos Pierce).

[0066] De acordo com outros aspectos do método da invenção, o segundo anticorpo de captura é o anticorpo monoclonal de camundongo 20-2-5, 5-10-5, 1-10-4, 16-5-4, 6-3-8, 18-3-3, ou 14-12-1 da invenção, ou o clone do anticorpo monoclonal de camundongo MC-6053 (R & D Systems). De preferência, o segundo anticorpo de captura é o anticorpo monoclonal de camundongo 20-2-5. As sequências correspondentes das regiões variáveis e as CDR dos anticorpos monoclonais de camundongo da invenção foram descritas aqui em outro local.

[0067] De acordo com aspectos específicos do método da invenção, o primeiro e/ou segundo anticorpo de captura é/são imobilizadas. Por exemplo, os referidos primeiro e/ou segundo anticorpos de captura é/são ligados a um suporte de fase sólida. Tal como usado aqui, o termo “suporte de fase sólida” é sinônimo de “fase sólida” e refere-se a qualquer matriz que pode ser utilizada para a imobilização de um primeiro e/ou segundo anticorpo de captura descrito na presente especificação. Exemplos não limitativos de suportes de fase sólida incluem, por exemplo, um tubo; um prato; uma coluna; pinos ou “dipsticks”; uma partícula magnética, um grânulo ou outros meios cromatográficos esféricas ou fibrosas, tais como, por exemplo, agarose, sefarose, sílica e plástico; e folhas ou membranas, tais como, por exemplo, nitrocelulose e fluoreto de polivinilideno (PVDF). O suporte de fase sólida pode ser construído utilizando uma ampla variedade de materiais, tais como, por exemplo, vidro, carbono, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, diazocellulose, ou amido. O suporte de fase sólida selecionada pode ter uma propriedade física que torna prontamente separável do material solúvel ou não ligado e em geral, permite que os materiais não ligados, tal como, por exemplo, reagentes em excesso, subprodutos da reação, ou solventes, sejam separados ou removidos de outra forma (através de, por exemplo, lavagem, filtração, centrifugação, etc.) do componente de ensaio ligado ao suporte de fase sólida. Exemplos de como fazer e utilizar uma fase sólida suportes são descritos em, por exemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, supra, (2001) não limitativos; e Current Protocols in Molecular Biology, supra, (2004), cada um dos quais são inseridos aqui por referência na sua totalidade. Num aspecto, o primeiro e/ou segundo anticorpo de captura é conjugado com esferas. Prevê-se que os conjugados anticorpo-grânulos são suficientemente pequenos por serem capazes de entrar nas células através dos poros causados pela permeabilização das referidas células.

[0068] De acordo com aspectos específicos do método da invenção, o primeiro anticorpo de detecção é um anticorpo fosfatase alcalina (AP)-conjugado, um anticorpo peroxidase de raiz forte (HRP)-conjugado ou um anticorpo conjugado com um corante fluorescente.

[0069] De acordo com aspectos mais específicos do método da invenção, o segundo anticorpo de detecção é um anticorpo fosfatase alcalina (AP)-conjugado, um anticorpo peroxidase de raiz forte (HRP)-conjugado, um anticorpo conjugado com glicose oxidase, um anticorpo tirosinase-conjugado ou um anticorpo β- galactosidase-conjugado.

[0070] De preferência, o anticorpo fosfatase alcalina (AP)- conjugado é utilizado como um primeiro anticorpo de detecção para a medição da quantidade total (não clivado e clivado) de substrato de Neurotoxina, tal como o total de SNAP-25, na célula; e o anticorpo peroxidase de raiz forte (HRP)-conjugado é utilizado como um segundo anticorpo de detecção para a medição da quantidade de substrato de Neurotoxina clivado, tal como de BoNT/A-clivado SNAP-25, na célula.

[0071] Em certos aspectos do método da invenção, o substrato de AP é um derivado de fosfato de 4-metilumbeliferil tal como fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil (DiFMUP), ou difosfato de fluoresceína (FDP).

[0072] De acordo com aspectos específicos do método da invenção, o substrato de HRP é Amplex Ultrared, 10-acetil-3,7- Dihidroxifenoxazinaq (ADHP) ou ácido 3-(4-hidroxifenil)- propiônico (HPPA).

[0073] Em um aspecto mais específico do método da invenção, o método é realizado como se ilustra na Figura 1.

[0074] A invenção, num outro aspecto refere-se a um kit para realizar o método da invenção que compreende: a) uma combinação de um primeiro anticorpo de captura, um segundo anticorpo de captura, um primeiro anticorpo de detecção e um segundo anticorpo de detecção, em que a referida combinação permite a realização dos métodos de qualquer uma das reivindicações de 1 a 14; b) meios para calcular a quantidade do substrato clivado pela referida Neurotoxina baseado nas quantidades do primeiro e segundo complexos de detecção determinadas pela combinação de acordo com a); e c) instruções para realização do referido método.

[0075] O termo “kit”, tal como utilizado aqui refere-se a uma série dos meios referidos acima ou reagentes da presente invenção que podem ou não podem ser embalados em conjunto. Os componentes do kit podem ser constituídos por embalagens separadas (isto é, como um kit de partes separadas) ou fornecidos num único frasco. Além disso, é para ser entendido que o kit da presente invenção é para ser utilizado para a prática dos métodos referidos aqui acima. Num aspecto, prevê- se que todos os componentes são fornecidos de uma forma pronto-para-uso para a prática do método referido aqui. Num aspecto adicional, o kit contém instruções para realizar o referido método. As instruções podem ser fornecidas por um manual do usuário em forma aplicada sobre papel ou eletrônico. Por exemplo, o manual pode compreender instruções para interpretar os resultados obtidos quando se realizar os métodos mencionados aqui, utilizando o kit da presente invenção.

[0076] Finalmente, a invenção refere-se num outro aspecto a um método produção de um produto Neurotoxina formulado para utilização em aplicações cosméticas ou farmacêuticas, compreendendo (i) a determinação da atividade biológica de um produto Neurotoxina pelo método da invenção e (ii) formulação do produto Neurotoxina para utilização em aplicações farmacêuticas ou cosméticas. O produto Neurotoxina pode ser formulado através de várias técnicas que dependem das finalidades de aplicação desejados, que são conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, o produto Neurotoxina (biologicamente ativo) pode ser utilizado em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis como uma composição farmacêutica. O(s) veículo(s) aceitável farmaceuticamente deve ser aceitável no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e sendo não prejudiciais para o seu recipiente. O veículo farmacêutico empregue pode incluir um sólido, um gel ou um líquido. Exemplos de veículos sólidos são lactose, terra alba, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, acácia, estearato de magnésio, ácido esteárico e semelhantes. Exemplos de transportadores líquidos são o glicerol, solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões, vários tipos de agentes umidificantes, e semelhantes. Os veículos adequados incluem os mencionados aqui e outros bem conhecidos no estado da técnica, ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia. Em um aspecto, a composição farmacêutica pode ser dissolvida num diluente, antes da administração. O diluente é também selecionado de modo a não afetar a atividade biológica do produto neurotoxina. Exemplos destes diluentes são água destilada ou solução salina fisiológica. Adicionalmente, a composição ou formulação farmacêutica também pode incluir outros veículos ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos e semelhantes. Assim, o produto Neurotoxina formulado pode estar presente, em um aspecto, em forma líquida ou liofilizada. Em um aspecto, ele pode estar presente em conjunto com glicerol, estabilizadores de proteínas (HSA) ou estabilizantes não proteicos, tal como pirrolidona de polivinila (PVP), ácido hialurônico ou aminoácidos livres. Em um aspecto, os estabilizadores não proteicos adequados são descritos em WO 2005/007185 ou WO 2006/020208. Num aspecto, a atividade biológica determinada de acordo com a etapa (i), pelo método da invenção corresponde a uma atividade de toxina botulínica de 25, 50, 75, 100, 125, 150 ou 200 U (unidades de DL50 do rato). O produto de Neurotoxina formulado pode ser utilizado para a terapia humana ou animal de diversas doenças ou distúrbios em uma dose terapeuticamente eficaz ou para fins cosméticos.

[0077] A doença ou patologia tal como referido aqui é selecionada a partir do grupo que consiste de força voluntária muscular, distonia focal, incluindo colo do útero, distonia craniana, e blefaroespasmo essencial benigno, espasmo hemifacial, e espasticidade focal, distúrbios gastrointestinais, hiperidrose, e cosmético correção de rugas, blefaroespasmo, distonia oromandibular, tipo de abertura da mandíbula, tipo de fechamento da mandíbula, bruxismo, síndrome de Meige, distonia lingual, apraxia da pálpebra, abrindo cervical distonia, antecolo, retrocolo, laterocolo, torcicolo, distonia de faringe, distonia laríngea, disfonia espasmódica/tipo adutor, disfonia espasmódica/tipo abdutor, dispnéia espasmódica, distonia de membros, distonia de braço, distonia de tarefa específica, câimbra do escritor, cólicas do músico, cãibra do jogador de golfe, distonia de perna, adução da coxa, flexão de joelho com abdução de coxa, extensão de joelho, flexão do tornozelo, extensão do tornozelo, equinovarus, distonia de deformidade do pé, dedo do pé estriado, flexão do dedo do pé, extensão do dedo do pé, distonia axial, síndrome pisa, distonia de dançarina do ventre, distonia segmentar, hemidistonia, distonia generalizada, distonia em lubag, distonia em degeneração córtico-basal, distonia em lubag, distonia tardia, distonia na ataxia espinocerebelar, distonia na doença de Parkinson, distonia na doença de Huntington, distonia na doença de Hallervorden-Spatz, distonia de discinesias dopa- induzida/dopa-induzida, discinesias tardia/distonia tardia, discinesia/distonias paroxística, ação quinesiogênica não quinesiogênica induzida por mioclinia palatal, mioquimia mioclinia, rigidez, cãibras musculares benignas, tremor hereditário de queixo, atividade muscular de mandíbula paradoxal, espasmos hemimastigatório, miopatia branquial hipertrófica, hipertrofia massetérica, hipertrofi tibial anterior, nistagmo, oscilopsia supranuclear, paralisia do olhar, epilepsia parcial contínua, planejamento de operação de torcicolo espasmódico, paralisia do abdutor da corda vocal, disfonia mutacional recalcitante, disfunção do esfíncter esofágico superior, granuloma de processo vocal, gagueira de Gilles da síndrome la Tourette, mioclinia do ouvido médio, o fechamento de laringe protetora, pós-laringectomia, insuficiência de discurso, ptose protetora, disfunção do esfíncter Odii de entrópio, pseudoacalasia, nonachalsia, distúrbios motores do esôfago, vaginismo, tremor de imobilização pós-operatória, disfunção da bexiga, dissinergia do esfíncter detrusor, espasmo de bexiga esfíncter, espasmo hemifacial, discinesias de reinervação, ondulações mentalis, síndrome de pessoa rígida, hiperplasia da próstata com tétano, adipositas, estrabismo do tratamento da paralisia cerebral infantil, misturado com paralisia concomitante, após a cirurgia de descolamento de retina, após a cirurgia de catarata, em estrabismo miosítico afaquia, estrabismo miopático, desvio vertical dissociado, como adjuvante da cirurgia de estrabismo, esotropia, exotropia, acalasia, fissuras anais, hiperatividade da glândula exócrina, síndrome de Frey, síndrome das lágrimas de crocodilo, hiperidrose, rinorreia axilar e palmo-plantar, hipersalivação relativa em acidente vascular cerebral, em doença de Parkinsos, na esclerose lateral amiotrófica, condições espásticas, em encefalite e mielite processos auto-imunes, esclerose múltipla, mielite transversa, síndrome de Devic, infecções virais, infecções bacterianas, infecções parasitárias, infecções fúngicas, em síndrome do infarto hemisférico pos- apoplético de paraparesia espástica hereditária, infarto tronco cerebral, infarto do mieloma, no trauma do sistema nervoso central, lesões hemisféricas, lesões de tronco encefálico, lesão do mieloma, na hemorragia do sistema nervoso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnóidea, a hemorragia subdural, hemorragia intraespinhal, em neoplasias, tumores hemisféricos, tumores do tronco cerebral, tumor do mieloma e vaginismo. Um uso cosmético é selecionado a partir do tratamento ou redução de rugas, como pés de galinha ou GFL, testa franzida, assimetrias faciais.

[0078] Todas as referências citadas nesta especificação são incorporadas aqui por referência no que diz respeito a todo o seu conteúdo de divulgação e o conteúdo de divulgação especificamente mencionado na presente especificação.

[0079] As figuras mostram:

[0080] Figura 1: Diagrama que representa o modo de ação do ensaio à base de células da presente invenção. As células suscetíveis à intoxicação por Neurotoxina são cultivadas em placas de múltiplos poços, portanto, as células são intoxicadas com polipeptídeo Neurotoxina e após um dado período de intoxicação as células são fixadas. O anticorpo específico para o SNAP-25 clivado por Neurotoxina e o anticorpo específico para SNAP-25 não clivado liga-se aos sítios de ligação específicos em SNAP-25. Utilizando anticorpos secundários específicos anti-hospedeiros de enzima acoplada, estes eventos de ligação podem ser utilizados para gerar sinais mensuráveis que se correlacionam com a concentração de SNAP-25 e clivado por neurotoxina a quantidade total de SNAP-25 dentro do poço. Com o aumento da concentração de BoNT/A a quantidade de medidas de SNAP-25 clivado aumenta, resultando em um ganho de sinal.

[0081] Figura 2: Os dois gráficos representam as curvas de calibração de BoNT/A resultante para neurônios iPS-derivados e células SiMa acordo com o Exemplo 2. Eles mostram a dependência entre, respectivamente, a concentração e atividade de BoNT/A e o sinal de fluorescência determinado (RFU) para o substrato de HRP e o conteúdo de BoNT/A-clivado de SNAP-25 normalizado para a quantidade total de SNAP-25 dentro do poço. Mediante o aumento da concentração e atividade, respectivamente, de BoNT/A, mais SNAP-25 é convertido pela Neurotoxina, resultando num aumento no teor de SNAP-25 clivado.

[0082] Figura 3: O gráfico representa a curva de calibração de BoNT/A resultante para o neurônios IPS derivados de acordo com o Exemplo 4. Ela mostra a dependência entre, respectivamente, a concentração e a atividade de BoNT/A e o sinal de fluorescência determinado (RFU) para a substrato de HRP e o conteúdo de BoNT/A-clivado de SNAP-25 e o conteúdo de BoNT/A-clivado de SNAP-25 normalizado para a quantidade total de SNAP-25 dentro do poço. Mediante o aumento da concentração e atividade, respectivamente, de BoNT/A, mais SNAP-25 é convertido pela Neurotoxina, resultando num aumento no teor de SNAP-25 clivado.

[0083] A invenção será agora ilustrada pelos exemplos seguintes, os quais devem, no entanto, não devem ser entendidos como limites do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais ligados especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 clivado por Neurotoxina

[0084] Os anticorpos monoclonais de camundongos ligados especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 clivado por Neurotoxina foram gerados utilizando a técnica de hibridoma padrão. Para este fim, os ratos Balb/c (fêmeas, 8 semanas) foram imunizados com o SNAP-25190-197 com um resíduo de cisteína no N-terminal, “C-TRIDEANQ” (SEQ ID NO: 17). O referido resíduo de cisteína no N-terminal não é derivado da sequência de aminoácidos de SNAP-25, mas foi introduzido para ligar o peptídeo SNAP-25.190-197 (SEQ ID NO: 74) à hemocianina de lapa (KLH). As células de hibridoma foram obtidas pela fusão de células de baço de rato com a linhagem celular de mieloma SP2/0-Ag14 (SP2/0) adquirido a partir da Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas celular (DSMZ GmbH, Braunschweig, ACC 146); ver também Hemmerlein et al., Molecular Cancer 2006, 5, 41. Os anticorpos ligados especificamente ao sítio de clivagem do substrato de Neurotoxina clivado SNAP-25 foram rastreados no ELISA. Os clones obtidos foram selecionados em relação à sua especificidade e afinidade ao SNAP-25 BoNT/A-clivado. Como um controle negativo, os clones foram testados quanto à sua não ligação a SNAP-25206 não clivado. Como resultado, os anticorpos monoclonais 20-2-5, 5-10-5, 1-10-4, 16-5-4, 6-3-8, 18-3-3, e 14-12-1 foram encontrados por serem altamente específicos para BoNT/A-clivado SNAP-25197, sem reatividade cruzada detectável com SNAP25206 em ELISA e Western blots. Isotipagem dos referidos anticorpos monoclonais tem sido realizada utilizando o kit de teste de isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo (Serotec). Como resultado, verificou-se que o mAb 20-2-5, 14-12-1, 6-3-8, e 5-10-5 são anticorpos IgG1, ao passo que mAb 18-3-3, 16-5-4, e 1-10-4 são anticorpos IgG2a.

[0085] As sequências correspondentes de aminoácidos das cadeias VH e VL e sequências correspondentes de CDR (região determinante de complementaridade) dos anticorpos monoclonais de camundongo mencionadas são indicadas na listagem de sequências. Exemplo 2: ELISA de atividade Dupla-Fluorescência-CB-BoNT/A Fixação de células 1. Remover a solução de meio/toxina. Adicionam-se 100 μL/poço resfriado a gelo com metanol (-20°C) e incubar durante 20 min a -20°C. Nota: Execute todas as etapas subsequentes à temperatura ambiente. Após a fixação celular 1. Remover a solução de metanol e adicionar 100 μL/poço de tampão PBS. Para períodos mais longos (> 1 dia) deve-se adicionar 300 μL/poço de tampão PBS e selar as placas com parafilme. As placas devem ser guardadas no frigorífico. 2. Remover o tampão PBS e lavar as células 3 vezes com 200 μL/poço de tampão de lavagem. Cada etapa deve ser realizada durante 1 minuto com agitação suave. 3. Remover o tampão de lavagem e adiciona-se 100 μL/poço de tampão de têmpera e incubar durante 20 minutos com agitação suave. 4. Remover o tampão de têmpera e lavar as células uma vez com 300 μL/poço de tampão de lavagem durante 5 minutos, sob agitação suave. 5. Remover o tampão de lavagem, e adicionar 200 μL/poço de tampão de bloqueio e incubar durante 1 hora com agitação suave. 6. Remover o tampão de bloqueio, e adicionar 100 μL/poço de tampão de permeabilização e incubar durante 15 minutos com agitação suave. 7. Remover o tampão de permeabilização e lavar as células uma vez com 300 μL/poço de tampão PBS. Esta etapa deve ser realizada durante 1 minuto com agitação suave. 8. Remover o tampão PBS e adicionar 100 μL da mistura de anticorpo primário (diluição de anticorpo em tampão de bloqueio) a cada poço. Incubar durante a noite (16-18h) com agitação suave. As células são incubadas simultaneamente com dois anticorpos primários: um anticorpo de camundongo específico para o substrato de SNAP-25 BoNT/A-clivado e um anticorpo policlonal de coelho que reconhece SNAP-25 (anticorpo para a determinação da quantidade total de SNAP-25 para a normalização). 9. Remover a mistura de anticorpo primário e lavar as células 4 vezes com 200 μL de tampão de lavagem. Cada etapa deve ser realizada durante 5 minutos com agitação suave. 10. Remover o tampão de lavagem, e adicionar 100 μL da mistura de anticorpo secundário: anticorpos secundários HRP- conjugado anti-camundongo e AP-conjugado anti-coelho (diluição de anticorpo em tampão de bloqueio) a cada poço e incubar durante 2,5-3 horas com agitação suave. 11. Remover a mistura de anticorpo secundário e lavar as células 5 vezes com 200 μL/poço de tampão de lavagem, seguido por uma etapa de lavagem com 300 μL/poço de tampão de HEPES. Cada etapa de lavagem deve ser realizada durante 5 minutos com agitação suave. 12. Remover o tampão PBS a da placa e adicionar 75 μL de um substrato fluorogênico para peroxidase de raiz forte (substrato de HRP) em cada poço. Incubar durante 50 minutos com agitação suave. Proteja as placas de luz direta. 13. Adicionar 75 μL de um substrato fluorogênico para a fosfatase alcalina (substrato de AP) em cada poço e incubar durante um período adicional de 50 minutos a com agitação suave. Proteja as placas de luz direta. 14. Ler as placas utilizando um leitor de placas de fluorescência: excitação a 540 nm; emissão a 600 nm. excitação a 360 nm; emissão a 450 nm. 15. Cálculo Para a normalização, o valor de RFU para SNAP-25 clivado (fluorescência a 600 nm) é normalizado para a RFU do total de SNAP-25 (450 nm) em cada poço. Para uma melhor ilustração dos RFUs em um diagrama, todos os valores são multiplicados por um fator de 1000, utilizando a equação a seguir: Subsequentemente os valores de RFU resultantes são uma média para cada amostra ou padrão. Preparação do Reagente Tampão de lavagem: 0,1% de Triton X-100 em tampão PBS 10 mM (pH 7,4) Tampão PBS (10 mM): Solução salina tamponada com fosfato (Sigma, # P5368) (pH 7,4) Tampão de têmpera: 0,6% de H2O2 em tampão PBS 10 mM (pH 7,4) Tampão de bloqueio: 2% de BSA em tampão PBS 10 mM (pH 7,4) + 0,05% de Triton X-100 Tampão de permeabilização: 0,5% de Triton X-100 em tampão PBS 10 mM Tampão HEPES: HEPES 50 mM (pH 7,4) Substrato de HRP: HEPES 50 mM (pH 7,4) 0,007% de H2O2 150 pM de Amplex Ultrared Substrato de AP: Dietanolamina 25 mM (pH 9,8) 2 mM de MgCl2 100 μL M de DiFMUP

Exemplo 3: Ilustração das curvas de calibração de BoNT/A em CBA-ELISA conforme o Exemplo 2 da presente invenção

[0086] Cultura celular e intoxicação com BoNT/A de células parentais SiMa foi realizada de acordo com o manual do fornecedor. Da mesma forma, cultivo de células e intoxicação com BoNT/A de neurônios derivados de células tronco pluripotentes induzidas humanas (iPS) (Cellular Dynamics) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante.

[0087] O ELISA foi realizado de acordo com o Exemplo 2. Como primeiro anticorpo de captura ligado especificamente ao SNAP- 25 não clivado e BoNT/A-clivado, o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) foi utilizado. Este anticorpo permite a detecção da quantidade total de SNAP-25 no interior das células. Como um segundo anticorpo de captura ligado especificamente ao sítio de clivagem do substrato de BoNT/A-clivado de SNAP-25, o clone do anticorpo monoclonal 202-5 da invenção (ver Exemplo 1) foi utilizado.

[0088] Os dois gráficos na Figura 2 mostram as curvas de calibração de BoNT/A obtidas. Eles demonstram a dependência entre, respectivamente, a concentração e a atividade de BoNT/A e o sinal de fluorescência determinado (RFU) para o substrato de HRP e o conteúdo de BoNT/A-clivado de SNAP-25 (valores de RFU não estão em branco-corrigidos, a fim de ilustrar os erros dos padrões individuais de BoNT/A). Mediante o aumento da concentração e da atividade, respectivamente, de BoNT/A, mais SNAP-25 é convertido pela Neurotoxina resultando num aumento do conteúdo de SNAP-25. A dependência do sinal de BoNT/A concentração/atividade de BoNT/A é ilustrado pelo uso de uma equação de 4 parâmetros. Exemplo 4: ELISA de atividade de Dupla-Fluorescência-CB-BoNT/A Fixação de células 1. Remover a solução meio/toxina. Adicionar 100 μL/poço de gelo-metanol frio (-20°C) e incubar durante 20 min a -20 °C. Nota: Execute todas as etapas subsequentes à temperatura ambiente. Após a fixação celular 1. Remover a solução de metanol e adicionar 100 μL/poço de tampão PBS. Para períodos mais longos (> 1 dia) deve-se adicionar 300 μL/poço de tampão PBS e selar as placas com parafilme. As placas devem ser guardada no refrigerador. 2. Remover o tampão PBS e lavar as células 3 vezes com 200 μL/poço de tampão PBS. Cada etapa deve ser realizada durante 1 minuto com agitação suave. 3. Remover o tampão PBS e adicionar 100 μL/poço de tampão de têmpera e incubar durante 20 minutos com agitação suave. 4. Remover o tampão de têmpera e lavar as células uma vez com 300 μL/poço de tampão PBS durante 3 minutos, sob agitação suave. 5. Remover o tampão de PBS, e adicionar 200 μL/poço de tampão de bloqueio e incubar durante 1 hora com agitação suave. 6. Remover o tampão de bloqueio e adicionar 100 μL da mistura de anticorpo primário (diluição de anticorpo em tampão de bloqueio) em cada poço. Incubar durante a noite (16-18h) com agitação suave. As células são incubadas simultaneamente com dois anticorpos primários: um anticorpo de camundongo específico para o substrato SNAP-25 BoNT/A-clivado e um anticorpo policlonal de coelho que reconhece SNAP-25 (anticorpo para a determinação da quantidade total de SNAP-25 para a normalização). 7. Remover a mistura de anticorpo primário e lavar as células 4 vezes com 200 μL de tampão PBS. Cada etapa deve ser realizada durante 3 minutos, com agitação suave. 8. Remover o tampão PBS, e adicionar 100 μL da mistura de anticorpo secundário: anticorpos secundários HRP-conjugado anti-camundongo e AP-conjugado anti-coelho (diluição de anticorpo em tampão de bloqueio) a cada poço e incubar durante 2,5-3 horas com agitação suave. 9. Remover a mistura de anticorpo secundário e lavar as células de 5 vezes com 200 μL/poço de tampão de PBS, seguido por uma etapa de lavagem com 300 μL/poço de tampão de HEPES. Cada etapa de lavagem deve ser realizada durante 3 minutos, com agitação suave. 10. Remover o tampão de HEPES da placa e adicionar 75 μL de um substrato fluorogênico para peroxidase de raiz forte (substrato de HRP) em cada poço. Incubar durante 50 minutos com agitação suave. Proteja as placas de luz direta. 11. Adicionar 75 μL de um substrato fluorogênico para a fosfatase alcalina (substrato de AP) em cada poço e incubar durante um período adicional de 50 minutos a com agitação suave. Proteja as placas de luz direta. 12. Ler as placas utilizando um leitor de placas de fluorescência: excitação a 540 nm; emissão a 600 nm. excitação a 360 nm; emissão a 450 nm. 13. Cálculo Para a normalização, o valor de RFU para SNAP-25 clivado (fluorescência a 600 nm) é normalizado para o RFU do total de SNAP-25 (450 nm) em cada poço. Para uma melhor ilustração de um diagrama de RFUs todos os valores são multiplicados por um fator de 1000, utilizando a equação a seguir: Subsequentemente os valores média para cada amostra ou padrão. Preparação do Reagente Tampão PBS (10 mM): Solução salina tamponada com 7,4) Tampão de têmpera: 0,6% de H2O2 em tampão PBS 10 Tampão de bloqueio: 2% de BSA em tampão PBS 10 mM (pH Tampão HEPES: HEPES 50 mM (pH 7,4) Substrato de HRP: HEPES 50 mM (pH 7,4) 0,007% de H2O2 150 pM de Amplex Ultrared Substrato de AP: Dietanolamina 25 mM (pH 9,8) 2 mM de MgCl2 100 μL M de DiFMUP

Exemplo 5: Ilustração de curva de calibração de BoNT/A em CBA- ELISA de acordo com o Exemplo 4 da presente invenção

[0089] Cultura de células e intoxicação com BoNT/A de neurônios derivados de células tronco pluripotentes induzidas humanas (iPS) (Cellular Dynamics) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante.

[0090] O ELISA foi realizado de acordo com o Exemplo 4. Como o primeiro anticorpo de captura liga-se especificamente ao SNAP-25 não clivado e BoNT/A-clivado, o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) foi utilizado. Este anticorpo permite a detecção da quantidade total de SNAP-25 no interior das células. Como um segundo anticorpo de captura se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato SNAP-25 de BoNT/A-clivado, o clone de anticorpo monoclonal 20-2-5 da invenção (ver Exemplo 1) foi utilizado.

[0091] O gráfico mostrado na Figura 3 representa a curva de calibração de BoNT/A obtida. Ela mostra a dependência entre, respectivamente, a concentração e a atividade de BoNT/A e o sinal de fluorescência determinado (RFU) para o substrato de HRP e o conteúdo de SNAP-25 BoNT/A-clivado. Após o aumento da concentração e da atividade, respectivamente, de BoNT/A, mais SNAP-25 é convertido pela Neurotoxina resultando num aumento do conteúdo de SNAP-25 clivado. A dependência do sinal de concentração/atividade de BoNT/A é ilustrada pelo uso de uma equação de 4 parâmetros.

Claims (15)

1. Método para determinação direta da atividade biológica de um polipeptídeo Neurotoxina em células, caracterizado por compreender as etapas de: a) incubar as células suscetíveis a intoxicação por Neurotoxina com um polipeptídeo Neurotoxina por um tempo e sob condições que permitam que o polipeptídeo Neurotoxina exerça a sua atividade biológica; b) fixar as células e, opcionalmente, permeabilizar as células com um detergente; c) pôr as células em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura de ligação específica a um substrato não clivado e clivado por Neurotoxina e com pelo menos um segundo anticorpo de captura de ligação específica ao sítio de clivagem do substrato clivado por Neurotoxina, sob condições que permitam a ligação dos referidos anticorpos de captura aos referidos substratos; d) pôr as células em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de detecção de ligação específica ao primeiro anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do referido primeiro anticorpo de detecção ao referido primeiro anticorpo de captura, formando assim os primeiros complexos de detecção, e pelo menos um segundo anticorpo de detecção de ligação específica ao segundo anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do referido segundo anticorpo de detecção ao referido segundo anticorpo de captura, formando assim os segundos complexos de detecção, em que o primeiro anticorpo de detecção e o segundo anticorpo de detecção estão conjugados com enzimas diferentes; e) determinar a quantidade de primeiro e segundo complexos de detecção da etapa d), e f) calcular a quantidade de substrato clivado pelo referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células por meio dos segundos complexos de detecção, determinando assim a atividade biológica do referido polipeptídeo Neurotoxina nas referidas células.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é um método de fluorescência.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo Neurotoxina é BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o substrato é VAMP/Sinaptobrevina, SNAP-25 ou Sintaxina.

5. Método, de acordo com qualquer uma das revindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as células são células neuronais ou células neuronais diferenciadas selecionadas a partir do grupo consistido em: células neuronais primárias, células tumorais que são capazes de se diferenciarem para células neuronais tais como células de neuroblastoma, células P19 ou neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (IPS).

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que fixar as células é realizado pela adição de um agente de fixação selecionado a partir do grupo consistindo em: metanol, etanol, acetona, formaldeído ou misturas dos mesmos.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo de captura de ligação específica ao substrato não clivado e clivado pela Neurotoxina permite a determinação da quantidade de substrato de Neurotoxina total nas células.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro anticorpo de captura de ligação específica ao substrato não clivado e clivado pela Neurotoxina é o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 S9684, o anticorpo policlonal de coelho anti-SNAP-25 PA5-19708 (Anticorpos Pierce), ou o anticorpo policlonal de coelho antiSNAP-25 PA5-19701 (Anticorpos Pierce).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo de captura é um anticorpo compreendendo uma CDRH1, CDRH2 e CDRH3 como apresentadas em SEQ ID NOs. 20 a 22 e uma CDRL1, CDRL2 e CDRL3 como apresentadas em SEQ ID NOs. 23 a 25 ou anticorpo monoclonal de camundongo MC-6053 (R&D Systems).

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou segundo anticorpo de captura é imobilizado.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo de detecção é um anticorpo conjugado com fosfatase alcalina (AP), um anticorpo conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) ou um anticorpo conjugado a um corante fluorescente.

12. Método, de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo de detecção é um anticorpo conjugado com fosfatase alcalina (AP), um anticorpo conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP), um anticorpo conjugado com glicose oxidase, um anticorpo conjugado com tirosinase ou um anticorpo de β-Galactosidase.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o substrato HRP é Amplex UltraRed, 10-Acetil-3,7-Di-hidroxi-fenoxazina (ADHP) ou ácido 3-(4-Hidroxifenil)propiônico (HPPA).

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o substrato AP é um derivado de 4-metilumbeliferil fosfato tal como 6,8-Difluoro- 4-metilumbeliferil fosfato (DiFMUP), ou fluoresceína (FDP).

15. Kit para realização do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14 caracterizado por compreender: a) uma combinação de um primeiro anticorpo de captura, um segundo anticorpo de captura, um primeiro anticorpo de detecção e um segundo anticorpo de detecção, em que o referido segundo anticorpo de captura é um anticorpo compreendendo uma CDRH1, CDRH2 e CDRH3 como apresentadas em SEQ ID NOs. 20 a 22 e uma CDRL1, CDRL2 e CDRL3 como mostradas em SEQ ID NOs. 23 a 25 e em que a referida combinação permite a realização dos métodos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14; b) meios para calcular a quantidade do substrato clivado pela referida Neurotoxina baseado nas quantidades do primeiro e segundo complexos de detecção determinadas pela combinação de acordo com a); e c) instruções para realização do referido método.