ES2837699T3 - Medios y métodos para la determinación de la actividad biológica de BoNT/E en células - Google Patents

Abstract

El uso de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E, en donde el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de CDR-L1 como se muestra en SEQ ID NO. 15, CDR-L2 como se muestra en SEQ ID NO. 16, CDR-L3 como se muestra en SEQ ID NO. 17, CDR-H1 como se muestra en SEQ ID NO. 18, CDR-H2 como se muestra en SEQ ID NO. 19 y CDR-H3 como se muestra en SEQ ID NO. 20, comprendidas por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que se depositó el 17 de diciembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso DSM ACC3261, para ensayos in vitro para medir la actividad biológica de BoNT/E.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios y métodos para la determinación de la actividad biológica de BoNT/E en células

La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 13.

La Clostridium botulinum y la Clostridium tetani producen neurotoxinas altamente potentes, es decir, toxinas botulínicas (BoNT) y toxina tetánica (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas clostridiales (CNT) se unen específicamente a las células neuronales e interrumpen la liberación de neurotransmisores. Cada toxina se sintetiza como una única proteína de cadena inactiva sin procesar de aproximadamente 150 kDa. El proceso postraduccional involucra la formación de puentes disulfuro, y una proteólisis limitada (que se interrumpe) por la(s) proteasa(s) bacteriana(s).

Alternativamente, las neurotoxinas clostridiales se pueden producir en células heterólogas, es decir, se producen de forma recombinante mediante la expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican para una neurotoxina en las células huésped apropiadas. Los métodos para la expresión recombinante de neurotoxinas clostridiales en E. coli son bien conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, los documentos WO 00/12728, WO 01/14570, WO 2006/076902 o WO 2013/091895. En determinados casos, las cadenas ligeras y pesadas se obtienen por separado, y después se reconstituyen in vitro; ver el documento WO 95/32738.

Además, las neurotoxinas clostridiales se han expresado en sistemas de expresión eucariotas, tales como Pichia pastoris, Pichia methanolica, S. cerevisiae, células de insectos y células de mamíferos; ver el documento WO 2006/017749.

En todos estos sistemas de expresión, se requiere una escisión proteolítica del precursor de la neurotoxina de cadena sencilla, ya sea por las enzimas de la célula huésped durante la fermentación, o mediante la adición de enzimas proteolíticas a la materia prima de la proteína aislada después de la fermentación, con el fin de generar la proteína de neurotoxina clostridial biológicamente activa final que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, que se unen mediante un enlace disulfuro.

La neurotoxina activa que consiste en dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada C-terminal de aproximadamente 100 kDa que se unen mediante un enlace disulfuro. Las CNT constan estructural y funcionalmente de tres dominios, es decir, la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que abarca el dominio de translocación (mitad N-terminal) y el dominio de unión al receptor (mitad C-terminal); ver, por ejemplo, Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. Las neurotoxinas botulínicas se sintetizan como complejos moleculares que comprenden la proteína de neurotoxina de 150 kDa y proteínas no tóxicas asociadas. Los tamaños de los complejos difieren en base a la cepa clostridial y los distintos serotipos de neurotoxina que varían desde 300 kDa, más de 500 kDa, y 900 kDa. Las proteínas no-tóxicas en estos complejos estabilizan la neurotoxina y la protegen contra la degradación; ver Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19 - S26.

La Clostridium botulinum secreta siete serotipos antigénicamente distintos que se designan de A a G de la neurotoxina botulínica (BoNT). Todos los serotipos, junto con la neurotoxina tetánica relacionada (TeNT) que se secreta por Clostridium tetani, son endoproteasas Zn2+ que bloquean la exocitosis sináptica mediante la escisión de las proteínas SNARE; ver Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. Las CNT causan la parálisis muscular flácida que se observa en el botulismo y el tétanos; ver Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

A pesar de sus efectos tóxicos, el complejo de toxina botulínica se ha usado como agente terapéutico en un gran número de enfermedades. La toxina botulínica serotipo A se aprobó para uso humano en los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento del estrabismo, el blefaroespasmo, y otros trastornos. Está disponible comercialmente como preparación de proteína de toxina botulínica A (BoNT/A), por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOX (Allergan, Inc.) o bajo el nombre comercial DYSPORT/RELOXIN (Ipsen, Ltd). Una preparación mejorada de toxina botulínica A libre de complejos está disponible comercialmente bajo el nombre comercial XEOMIN (Merz Pharmaceuticals, GmbH). Para aplicaciones terapéuticas, la preparación se inyecta directamente en el músculo a tratar. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo de proteínas y se produce el efecto farmacológico que se desea. El efecto de la toxina botulínica es sólo temporal, lo que es motivo para que se requiera administrar repetidamente la toxina botulínica para mantener el efecto terapéutico.

Las neurotoxinas clostridiales debilitan la fuerza muscular voluntaria y son una terapia efectiva para el estrabismo, la distonía focal, que incluye la distonía cervical, y el blefaroespasmo esencial benigno. Se ha demostrado adicionalmente que alivian el espasmo hemifacial, y la espasticidad focal, y, además, que son efectivos en un amplio intervalo de otras indicaciones, tales como trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección cosmética de arrugas; ver Jost 2007, Drugs 67, 669.

Durante el proceso de producción de las neurotoxinas clostridiales, la determinación cualitativa y cuantitativa de dichas neurotoxinas, así como también el control de calidad de los polipéptidos de neurotoxinas biológicamente activas es de particular importancia. Además, las agencias gubernamentales sólo aceptan ensayos de actividad de la toxina botulínica simples, confiables, y validados. En la actualidad, el bioensayo LD⁵⁰ de ratón, una prueba de letalidad, sigue siendo el "estándar de oro" que se usa por los productores farmacéuticos para analizar la potencia de sus preparaciones; ver Arnon y otros, (2001), JAMA 285, 1059-1070. Sin embargo, en años recientes, se ha realizado un esfuerzo considerable para buscar enfoques alternativos para aliviar la necesidad de pruebas en animales y todas las desventajas, costos, y preocupaciones éticas asociadas con este tipo de ensayos en base a animales. Además, las agencias regulatorias involucran a las compañías farmacéuticas para aplicar el principio de las "tres R" a las pruebas de potencia de las neurotoxinas botulínicas: "Reducir, Refinar, Reemplazar'; ver Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313. Como consecuencia, se han desarrollado sistemas de prueba en base a células con el fin de proporcionar alternativas razonables a los métodos que usan animales vivos. Sin embargo, hasta el momento sólo están disponibles unos pocos sistemas de prueba celulares para la determinación de la actividad biológica de las neurotoxinas que han demostrado ser suficientemente sensibles a los polipéptidos de las neurotoxinas. Estos sistemas de prueba en base a células incluyen el uso de neuronas primarias aisladas de embriones de roedores que se diferencian in vitro (Pellett y otros (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392), son células madre pluripotentes inducidas por diferenciación neuronal (Whitemarsh y otros, (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), y un subclon de la línea celular SiMa (documento WO 2010/105234 A1).

Sin embargo, el aislamiento de neuronas primarias requiere la de la muerte de animales y es trabajoso y consume tiempo. Adicionalmente, los sistemas de prueba que usan diferentes neuronas primarias muestran grandes variaciones. De manera similar, la generación de células madre pluripotentes inducidas por diferenciación neuronal es difícil y consume tiempo. Además, el almacenamiento de tales células es muy problemático. Los ensayos que usan líneas celulares tumorales con frecuencia no son lo suficientemente sensibles a BoNT. Además, se requieren protocolos de diferenciación complejos para dichas líneas celulares tumorales que resulta en grandes variaciones y/o altas tasas de fallo de los ensayos que usan dichas líneas de células.

Los ensayos para determinar la actividad biológica de las neurotoxinas clostridiales que se describen en la técnica incluyen análisis de transferencia Western en el que la actividad de la neurotoxina se cuantifica mediante la cantidad de sustrato de neurotoxina que se escinde en los lisados celulares. En otros ensayos, la actividad de las neurotoxinas clostridiales se mide mediante un ELISA sándwich de electroquimioluminiscencia (ECL); ver el documento WO 2009/114748 A1. También en este caso, la actividad biológica de la neurotoxina clostridial se determina mediante la detección del sustrato de neurotoxina clostridial que se escinde después del aislamiento del lisado celular. Adicionalmente, el sustrato de neurotoxina se debe concentrar en ambos ensayos. Jones y otros (Journal of Immunological Methods 329, p. 92-101, 2007) describen el desarrollo de inmunoensayos de endopeptidasa SNAP-25 mejorados para las toxinas botulínicas de tipo A y E. Fernandez-Salas y otros (PLOS ONE 7, p. E49516, 2012) describen un ensayo de potencia específico en base a células del serotipo A de neurotoxina botulínica para reemplazar el bioensayo en ratón.

A la luz de lo anterior, son altamente deseables sistemas de prueba adicionales para la determinación de la actividad polipeptídica de neurotoxina aceptable para las agencias gubernamentales y/o que proporcionen una alternativa a los sistemas de prueba en base a animales.

Por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención se puede ver como la provisión de medios y métodos que cumplen con las necesidades que se mencionan anteriormente. El problema técnico se resuelve mediante las modalidades que se caracterizan en las reivindicaciones y más abajo en la presente descripción.

La presente invención se refiere, en un primer aspecto, al uso de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E, en donde el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de CDR-L1 como se muestra en SEQ ID NO. 15, CDR-L2 como se muestra en SEQ ID NO. 16, CDR-L3 como se muestra en SEQ ID NO. 17, CDR-H1 como se muestra en SEQ ID NO. 18, CDR-H2 como se muestra en SEQ ID NO. 19 y CDR-H3 como se muestra en SEQ ID NO. 20, comprendidas por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que se depositó el 17 de diciembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso DSM ACC3261, para ensayos in vitro para medir la actividad biológica de BoNT/E. En una modalidad preferida del uso de la invención, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 ("C-NEIDTQNRQIDR") o SEQ ID NO: 2 ("NEIDTQNRQIDR"). En otra modalidad preferida del uso de la invención, el anticuerpo comprende la región VH como se muestra en SEQ ID NO. 22 y la región VL como se muestra en SEQ ID NO. 21 que se compone por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que se depositó el 17 de diciembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso DSM ACC3261.

La presente descripción proporciona un nuevo anticuerpo que se une específicamente al sitio de escisión del SNAP-25 escindido por BoNT/E, es decir, SNAP-25 escindido por BoNT/E. Además, la descripción proporciona la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000, que produce el anticuerpo monoclonal de la descripción que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E. Esta línea celular de hibridoma se ha depositado por el solicitante bajo el Tratado de Budapest el 17 de diciembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania bajo el número de acceso DSM ACC3261. Como es conocido en la técnica, SNAP-25 es un sustrato de, entre otros, la neurotoxina BoNT/E. SNAP-25 tiene una longitud total de 206 residuos de aminoácidos. El sitio de escisión de BoNT/E en SNAP-25 se posiciona entre Arginina (R) 180 e Isoleucina (I) 181, también denominado como "R¹⁸⁰I". Por consiguiente, la escisión de SNAP-25206 mediante BoNT/E revela dos fragmentos, es decir, un fragmento N-terminal de los residuos de aminoácidos de 1 a 180, en lo sucesivo también denominado como "producto de escisión de SNAP-25180" y un fragmento C-terminal de los residuos de aminoácidos de 181 a 206. El anticuerpo de la descripción se ha generado y caracterizado como se describe en los siguientes Ejemplos. Brevemente, se ha producido un anticuerpo monoclonal de ratón mediante la inmunización de ratones con el péptido "C-NEIDTQNRQIDR-OH" (SEQ ID NO: 1) que se acopla a una proteína de inmunización. Los datos mostrados indican que este anticuerpo detecta específicamente el producto de escisión de SNAP-25180. Por tanto, este anticuerpo es particularmente adecuado para ensayos para medir la actividad biológica de BoNT/E mediante la detección de SNAP-25 escindido por BoNT/E. Específicamente, se puede usar como segundo anticuerpo de captura para el método de la invención que permite determinar la actividad biológica de BoNT/E directamente en células, debido a su alta afinidad y especificidad por el producto de escisión de SNAP-25180, en relación con el sustrato sin escindir de SNAP-25206. Tal anticuerpo aún no está disponible comercialmente. Adicionalmente se concibe en la presente descripción un antisuero o un anticuerpo policlonal que se puede generar, por ejemplo, al acoplar el péptido "C-NEIDTQNRQIDR-OH" (SEQ ID NO: 1) a una proteína de inmunización y especies de inmunización que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, conejo, cabra, caballo, burro, ratón, rata, o llama.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula que se genera por un sistema inmunológico que se produce en respuesta a un antígeno particular que se une específicamente a ese antígeno, e incluye tanto anticuerpos de origen natural como anticuerpos de origen no natural. Un "anticuerpo", como se usa en la presente descripción, abarca un anticuerpo monoclonal, un antisuero o anticuerpo policlonal, un anticuerpo de cadena sencilla, un dímero o multímero, un anticuerpo quimerizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de cadena sencilla biespecífico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo sintético, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo bifuncional, un anticuerpo asociado a células como un receptor de Ig, un anticuerpo lineal, un diacuerpo, un minicuerpo, o un fragmento de cualquiera de dichos anticuerpos. Los fragmentos de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, Fv, o scFv, o derivados que se modifican químicamente de cualquiera de estos fragmentos. Los anticuerpos se pueden producir mediante el uso de métodos que se describen en la técnica; ver, por ejemplo, Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante las técnicas que se describen originalmente en Kohler 1975, Nature 256, 495, y Galfre 1981, Meth. Enzymol. 73, 3. Dichas técnicas comprenden la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo que se derivan de mamíferos inmunizados. Los anticuerpos se pueden mejorar adicionalmente mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial como se emplea en el sistema Biacore se puede usar para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fagos que se unen al epítopo; ver, por ejemplo, Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol. Methods 183, 7. Los anticuerpos como se usan en la presente descripción también comprenden equivalentes funcionales de anticuerpos, es decir, agentes que son capaces de unirse específicamente al epítopo(s) que se desea o partes del sustrato de SNAP-25 escindido por BoNT/E. En un aspecto, tales equivalentes funcionales comprenden proteínas de unión que se unen específicamente al SNAP-25 escindido por BoNT/E o dominios del mismo que son capaces de mediar dicha unión específica. Un anticuerpo como se usa en la presente descripción puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa que comprende los dominios VH y VL, así como también un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3, o un fragmento inmunológicamente activo de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, tal como, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')², un fragmento Fc, un fragmento Fd, o un fragmento Fv. Un anticuerpo se puede derivar de cualquier especie de vertebrado (por ejemplo, humano, mono, cabra, caballo, burro, ratón, rata, conejo, o pollo), y puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, o IgA), clase (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, o IgM) o subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2). Para la descripción general sobre la estructura de anticuerpos de origen natural, anticuerpos de origen no natural, y fragmentos de unión a compuestos antigénicos de los mismos, se hace referencia, por ejemplo, a Plueckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); Borrabeck, Antibody Engineering 2a ed. (Prensa de la Universidad de Oxford). Los anticuerpos de origen natural son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 000 Dalton, que se componen por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.

El sitio completo de reconocimiento de antígeno y unión al antígeno está contenido dentro de los dominios variables del anticuerpo, es decir, el fragmento Fv. Este fragmento incluye un dímero de un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) en asociación estrecha, no covalente. Cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR), que adoptan en gran medida una configuración de hoja beta, que se conectan por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja beta. Cada región hipervariable comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región determinante de complementariedad (CDR). En conjunto, es la configuración tridimensional de las seis regiones CDR (tres regiones CDR en la cadena ligera, es decir, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 y tres regiones CDR en la cadena pesada, es decir, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) que define un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL que confiere especificidad de unión al antígeno. Ver, por ejemplo, Cyrus Chothia, y otros, Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions, Nature 342 (6252): 877-883 (1989); Elvin A. Kabat y otros. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991). Los dominios constantes del anticuerpo no se involucran directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo.

"Unión selectiva" o "unión específica" como se usa en la presente descripción significa que el anticuerpo de la presente descripción se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E pero no reacciona de forma cruzada en un grado significativo con el SNAP-25 sin escindir, o con otros polipéptidos en general. La especificidad del epítopo es una característica importante del anticuerpo de la presente descripción. El anticuerpo de la descripción se une específicamente a un epítopo que consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. La unión específica se puede probar mediante varias técnicas bien conocidas que incluyen, por ejemplo, estudios de competencia. Otra característica importante es la sensibilidad del anticuerpo. La sensibilidad debe ser, en un aspecto de la descripción, de manera que al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % del SNAP-25 escindido por BoNT/E que se compone por una muestra o célula esté unido. La sensibilidad se puede probar mediante técnicas bien conocidas. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones operativas y óptimas de ensayo para cada determinación mediante el empleo de experimentación de rutina. Las técnicas convencionales para estudios de unión incluyen radioinmunoensayo, ELISA, diálisis de equilibrio, microcalorimetría isotérmica, ensayos BIACORE® (razonamiento de plasmón de superficie, SPR) u otros métodos de adsorción de superficie. El sistema BIACORE® SPR mide la interacción anticuerpo-antígeno. La respuesta SPR refleja un cambio en la concentración de masa en la superficie del detector cuando los analitos se unen o se disocian. En base a SPR, las mediciones BIACORE® en tiempo real monitorean las interacciones directamente a medida que ocurren, ver BIAapplications Handbook, versión AB (reimpreso en 1998), código BIACORE® número: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versión AB (reimpreso en 1998), código BIACORE® número: BR-1001-84. Las propiedades de unión tales como la sensibilidad de un anticuerpo de la presente descripción se pueden, en principio, determinar mediante estudios de unión mediante el uso de un antígeno inmovilizado tal como un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 ("NEIDTQNRQIDR") (el ligando) que se presenta en una superficie del sensor. El anticuerpo a probar (el analito) se proporcionará en la fase móvil, es decir, en una solución. En algunos casos, el antígeno se une indirectamente a la superficie a través de la unión a otra molécula inmovilizada que se denomina como la "molécula de captura". Cuando el anticuerpo se inyecta en un pulso discreto a través de la superficie con los antígenos inmovilizados, se pueden subdividir tres fases esencialmente: (i) asociación del anticuerpo con el antígeno durante la inyección de la muestra; (ii) equilibrio o estado estacionario durante la inyección de la muestra, donde la velocidad de unión del anticuerpo se equilibra mediante la disociación del complejo anticuerpo-antígeno; (iii) disociación del anticuerpo de la superficie durante el flujo del tampón. Se entenderá que tal ensayo se puede realizar alternativamente con anticuerpos inmovilizados a investigar y una solución que contiene antígeno como la fase móvil. Las fases de asociación y disociación proporcionan información sobre la cinética de la interacción analitoligando (ka y kd, las tasas de formación y disociación del complejo, kd/ka=KD). La fase de equilibrio proporciona información sobre la afinidad de la interacción analito-ligando (KD). Por consiguiente, "unión selectiva" o "unión específica" como se usa en la presente descripción incluye propiedades de unión tales como, por ejemplo, afinidad de unión, especificidad de unión, y avidez de unión; ver, por ejemplo, David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, págs. 240 (1998). La afinidad de unión se refiere al período de tiempo en que el anticuerpo reside en su sitio de unión al epítopo, y se puede ver como la fuerza con la que un anticuerpo se une a su epítopo. La afinidad de unión se puede describir como la constante de equilibrio de disociación (KD) de un anticuerpo, que se define como la relación Kd/Ka en el equilibrio. Ka es la constante de velocidad de asociación del anticuerpo y Kd es la constante de velocidad de disociación del anticuerpo. La afinidad de unión se determina tanto por la asociación como por la disociación y, por sí solas, ni la alta asociación ni la baja disociación pueden asegurar una alta afinidad. La constante de velocidad de asociación (Ka), o constante de velocidad de asociación (Kon), mide el número de eventos de unión por unidad de tiempo, o la propensión del anticuerpo y el antígeno a asociarse de forma reversible en su complejo anticuerpo-antígeno. La constante de velocidad de asociación se expresa en M'1 s-1, y se simboliza de la siguiente manera: [Ab] x [Ag] x Kon. Mientras más grande es la constante de velocidad de asociación, más rápido se une el anticuerpo a su antígeno, o es más alta la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno. La constante de velocidad de disociación (Kd), o constante de velocidad de disociación (Koff), mide la propensión del número de eventos de disociación por unidad de tiempo de un complejo anticuerpo-antígeno que se separa (disocia) de forma reversible en las moléculas que lo componen, es decir, el anticuerpo y el antígeno. La constante de velocidad de disociación se expresa en s-1, y se simboliza de la siguiente manera: [Ab Ag] x Koff. Mientras más pequeña es la constante de velocidad de disociación, más fuerte se une el anticuerpo a su antígeno, o es más alta la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno. La constante de equilibrio de disociación (KD) mide la velocidad a la que la formación de nuevos complejos anticuerpo-antígeno es igual a la velocidad a la que los complejos anticuerpo-antígeno se disocian en equilibrio. La constante de equilibrio de disociación se expresa en M, y se define como Koff/Kon = [Ab] * [Ag] / [Ab+Ag], donde [Ab] es la concentración molar del anticuerpo, [Ag] es la concentración molar del antígeno, y [Ab+Ag] es la concentración molar del complejo anticuerpo-antígeno, donde todas las concentraciones son de tales componentes cuando el sistema está en equilibrio. Mientras más pequeña es la constante de equilibrio de disociación, más fuerte se une el anticuerpo a su antígeno, o es más alta la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno.

Un antígeno diana tal como el sustrato SNAP-25 de BoNT/E generalmente tiene uno o más sitios de unión, también denominados epítopos, que son reconocidos por el sitio de unión del antígeno que se forma por CDR del anticuerpo. Como se usa en la presente descripción, un "epítopo" es sinónimo de "determinante antigénico" y se refiere al sitio en un antígeno diana, tal como, por ejemplo, un péptido, polipéptido, polisacárido o molécula que contiene lípidos, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T o de interactuar con una molécula de cualquier otra manera. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. La "unión específica" como se hace referencia en la presente descripción se puede probar mediante varias técnicas bien conocidas que incluyen, por ejemplo, experimentos de competencia y transferencias Western. Un epítopo como se usa de acuerdo con la descripción se refiere al determinante antigénico en el SNAP-25 que se escinde BoNT/E, que se puede localizar cerca, adyacente a o en el sitio de escisión de BoNT/E de SNAP-25 que se reconoce por el anticuerpo. Como se usa en la presente descripción, el término "específicamente" significa selectivamente y se refiere a tener un único efecto o influencia o reaccionar de una sola manera o con una sola cosa. Como se usa en la presente descripción, el término "se une específicamente" o "se une selectivamente" cuando se hacen en referencia a un anticuerpo o proteína de unión o dominio de unión, se refiere a la unión discriminatoria del anticuerpo o proteína/dominio de unión del epítopo diana que se indica de manera que el anticuerpo o la proteína/dominio de unión no reacciona sustancialmente de forma cruzada con epítopos no diana. El tamaño mínimo de un epítopo peptídico, como se define en la presente descripción, es de aproximadamente cinco residuos de aminoácidos, y un epítopo peptídico comprende típicamente al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, o al menos 30 residuos de aminoácidos. Un epítopo peptídico puede ser un epítopo lineal o discontinuo. Un epítopo discontinuo comprende residuos de aminoácidos que no son adyacentes en la estructura primaria del péptido pero que se unen en un epítopo por medio de la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del péptido. Además, también se observa que un epítopo puede comprender una parte de una molécula distinta de una secuencia de aminoácidos tal como, por ejemplo, un resto de carbohidrato, un resto lipídico como glicolípidos o lipoproteínas, o un resto de aminoácido que se modifica químicamente como un aminoácido fosforilado.

En otro aspecto del anticuerpo policlonal o monoclonal de la descripción, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que consiste en un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 ("C-NEIDTQNRQIDR-OH"). Preferentemente, el anticuerpo de la descripción reconoce y se une específicamente al epítopo SNA-P-25169-180 "NEIDTQNRQIDR" mostrado en SEQ ID NO: 2 y/o a SⁿA^p-25180, es decir, SNAP-25 escindido por BoNT/E. Con mayor preferencia, los anticuerpos de la descripción reconocen y se unen específicamente al epítopo SNAP-25170-180 "EIDTQNRQIDR" mostrado en SEQ ID NO: 3 y/o al SnAp-25180, al epítopo SNAP-25171-180 "IDTQNRQIDR" de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4 y/o al SNAP-25180, al epítopo SNAp-25172-180 "DTQNRQIDR" mostrado en SEQ ID NO: 5 y/o al SNAP-25180, al epítopo SNAP-25173-180 "TQNRQIDR" mostrado en SEQ ID NO: 6 y/o al SNAP-25180, al epítopo SNAP-25174-180 "^q N^rQIDR" mostrado en SEQ ID NO: 7 y/o al SNAP-25180, o al epítopo SNAP-25175-180 "NrQiDR" mostrado en SEQ ID NO: 8 y/o al SNAP-25180.

En un aspecto del anticuerpo monoclonal de la descripción, el anticuerpo monoclonal se produce por la línea celular de hibridoma pCNEl 32-7-1, 3614-000 que se ha depositado por el solicitante bajo el Tratado de Budapest el 17 de diciembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania bajo el número de acceso DSM ACC3261.

En un aspecto adicional del anticuerpo policlonal o monoclonal de la descripción, el anticuerpo tiene una constante de equilibrio de disociación para SNAP-25 escindido por BoNT/E de menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM, menos de 1 nM o preferentemente menos de 0,5 nM.

En otro aspecto adicional del anticuerpo policlonal o monoclonal de la descripción, la constante de equilibrio de disociación del anticuerpo para SNAP-25 escindido por BoNT/E es al menos 10 veces, al menos 50 veces o preferentemente al menos 100 veces mayor que para SNAP-25 que no se escinde por BoNT/E, es decir, SNAP-25 sin escindir.

En otro aspecto del anticuerpo policlonal o monoclonal de la descripción, el anticuerpo comprende al menos una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) seleccionadas de CDR-L1 (SEQ ID NO. 15), CDR-L2 (SEQ ID NO. 16), CDR-L3 (SEQ ID NO. 17), CDR-H1 (SEQ ID NO. 18), CDR-H2 (SEQ ID NO. 19) y CDR-H3 (SEQ ID NO. 20) que se compone por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEl 32-7-1, 3614-000 que se deposita bajo el número de acceso DSM ACC3261. Preferentemente, el anticuerpo comprende dos, tres, cuatro, cinco o las seis CDR que se indican.

En otro aspecto adicional del anticuerpo policlonal o monoclonal de la descripción, el anticuerpo comprende el dominio VH o la región VH (SEQ ID NO. 22) y/o el dominio VL o la región VL (sEq ID NO. 21) que se compone por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que se deposita bajo el número de acceso DSM ACC3261.

En estos aspectos, la presente descripción se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente al sitio de escisión del SNAP-25 escindido por BoNT/E y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 22 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No.21, que se compone por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que se deposita bajo el número de acceso DSM ACC3261. Adicionalmente, la descripción abarca anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una, dos o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de dicha región(es) o dominio(s) variable(s) de cadena pesada y/o cadena ligera. Las secuencias correspondientes a la CDR-H1 (SEQ ID NO. 18), CDR-H2 (SEQ ID NO. 19) y CDR-H3 (SEQ ID NO. 20) y las secuencias correspondientes a la CDR-L1 (SEQ ID NO. 15), CDR-L2 (SEQ ID NO. 16) y CDR-L3 (SEQ ID NO. 17), respectivamente, se componen por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que se deposita bajo el número de acceso DSM ACC3261.

Preferentemente, el anticuerpo de la descripción es un anticuerpo monoclonal. Con mayor preferencia, el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal de ratón que se genera y caracteriza en los siguientes Ejemplos, es decir, el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que se deposita bajo el número de acceso DSM ACC3261. Las secuencias CDR, VH y VL que se mencionan anteriormente son las secuencias correspondientes a dicho anticuerpo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método in vitro para determinar directamente la actividad biológica de BoNT/E en células, que comprende las etapas de:

a) incubar células susceptibles a intoxicación por BoNT/E con BoNT/E por un tiempo y bajo condiciones que permiten que la BoNT/E ejerza su actividad biológica;

b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente;

c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a SNAP-25 sin escindir y escindido por BoNT/E, y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E, bajo condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo de captura a SNAP-25 sin escindir y escindido por BoNT/E y la unión del segundo anticuerpo de captura a SNAP-25 escindido por BoNT/E, en donde el segundo anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, para formar así primeros complejos de detección y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, para formar así segundos complejos de detección, y en donde el primer anticuerpo de detección es diferente del segundo anticuerpo de detección;

e) determinar la cantidad de los primeros y segundos complejos de detección de la etapa d); y

f) calcular la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en dichas células mediante los segundos complejos de detección,

para determinar de este modo la actividad biológica de dicha BoNT/E en dichas células.

En un aspecto del método de la invención, el segundo anticuerpo de captura que se usa en la etapa c) es el anticuerpo monoclonal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de la invención.

En el método de la invención, el SNAP-25 escindido por BoNT/E se puede detectar directamente en la(s) célula(s). Con este fin, las células que son susceptibles a la intoxicación por BoNT/E como se define con más detalle en otra parte en la presente descripción se incuban con un polipéptido de neurotoxina BoNT/E por un tiempo y bajo condiciones que permiten que el polipéptido de neurotoxina BoNT/E ejerza su actividad biológica. En una siguiente etapa, las células se fijan y, en dependencia del agente de fijación que se usa, se permeabilizan, por ejemplo, mediante la adición de un agente de fijación tal como metanol, etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los agentes de fijación que se mencionan. Opcionalmente, las células se pueden permeabilizar adicionalmente mediante el uso de al menos un detergente como se define en otra parte en la presente descripción, tal como Triton X-100, Tween 20, Saponina, Digitonina o n-Octil-p-glucopiranósido. El detergente puede estar comprendido en un tampón apropiado tal como PBS. Posteriormente, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente al sitio de escisión del SNAP-25 escindido por BoNT/E, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de captura al SNAP-25 sin escindir y escindido por BoNT/E y al segundo anticuerpo de captura para SNAP-25 escindido por BoNT/E. Los epítopos adecuados, los sitios de escisión de BoNT/E en SNAP-25 y los métodos para la generación de anticuerpos que se unen específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E se describen en otra parte en la presente descripción. Además, los presentes inventores han generado y caracterizado un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E, en los siguientes Ejemplos. Dicho anticuerpo tiene una alta especificidad de unión al producto de escisión de SNAP-25180 que permite el reconocimiento preferencial de este producto de escisión en relación con el sustrato sin escindir de SNAP-25206. El primer anticuerpo de captura es capaz de determinar el contenido o cantidad total del sustrato SNAP-25 de BoNT/E en las células, mediante la unión específica a un epítopo apropiado presente tanto en el SNAP-25 sin escindir por BoNT/E como en el escindido por BoNt /E. El segundo anticuerpo de captura reconoce y se une específicamente a un epítopo presente sólo en el SNAP-25 escindido por BoNT/E pero no en el SNAP-25 sin escindir. Alternativamente, las células se pueden poner en contacto con una mezcla de dichos primeros y segundos anticuerpos de captura, es decir, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura y al menos un segundo anticuerpo de captura simultáneamente, bajo las condiciones que se mencionan. En la siguiente etapa, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, que forma por tanto los primeros complejos de detección. En una etapa posterior, las células se ponen en contacto con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, para formar así segundos complejos de detección. Alternativamente, las células se pueden poner en contacto con una mezcla de dichos primeros y segundos anticuerpos de detección, es decir, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección y al menos un segundo anticuerpo de detección simultáneamente, bajo las condiciones que se mencionan. Alternativamente, las células que se permeabilizan se pueden poner en contacto con una mezcla de dichos primeros y segundos anticuerpos de captura y dichos primeros y segundos anticuerpos de detección simultáneamente, bajo las condiciones que se mencionan. En la siguiente etapa, se determinan las cantidades de los primeros y segundos complejos de detección. Finalmente, la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en dichas células se calcula por medio de los segundos complejos de detección. El término "calcular", como se usa de acuerdo con el método de la presente invención, se refiere a operaciones matemáticas que permiten determinar la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en la célula. Por lo tanto, la actividad biológica de BoNT/E se determina directamente en las células. Esto significa que ya no es necesaria la lisis de las células ni el aislamiento o la concentración del SNAP-25 escindido por BoNT/E de los lisados celulares, como en los métodos que se describen en la técnica. Adicionalmente, el método de la invención consume menos tiempo, es menos trabajoso y más preciso que, por ejemplo, los ensayos en base a FRET que se usan en la técnica.

El método de la invención se describe con más detalle en lo sucesivo. Para el cultivo celular, las células susceptibles a la intoxicación por polipéptido de neurotoxina BoNT/E como se define en la presente descripción, tales como células neuronales, células SiMa o neuronas que se derivan de células madre pluripotentes inducidas (iPS), se siembran primero en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las células SiMa se diferencian en un fenotipo neuronal, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos que se describen en el documento WO 2010/105234, y las neuronas que se derivan de iPS se diferencian en un fenotipo neuronal, por ejemplo, de acuerdo con los ensayos que se describen en el documento WO 2012/135621. Si es necesario, la sensibilidad, la homogeneidad respectiva de la sensibilidad de las células susceptibles al polipéptido de neurotoxina BoNT/E se podría optimizar mediante el uso de métodos de cultivo celular particulares como se describe en el documento WO 2015/124618. Después, las células se intoxican con un polipéptido de neurotoxina BoNT/E por aproximadamente 72 horas. En la etapa posterior, las células se fijan en la placa de microtitulación, antes del ensayo ELISA. Para fijar las células, por ejemplo, se puede añadir metanol helado (-20 °C) a las células por 20 minutos a -20 °C.

Para realizar el ensayo ELISA, primero se lavan las células. Como tampón de lavado, por ejemplo, se puede usar tampón PBS 10 mM (pH 7,4). Posteriormente, las proteasas endógenas se inactivan mediante un tampón de inactivación tal como H²O² al 0,6 % en PBS 10 mM (pH 7,4), seguido de otra etapa de lavado. En la siguiente etapa, los sitios de unión libres en la placa de microtitulación se bloquean mediante un tampón de bloqueo apropiado tal como, por ejemplo, BSA al 2 % en tampón PBS 10 mM (pH 7,4). Posteriormente, las células se lavan con tampón de lavado como se menciona anteriormente.

En la siguiente etapa, las células que se fijan y se permeabilizan se incuban, por ejemplo, con una mezcla de dos anticuerpos diferentes. La mezcla comprende un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E y un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al SNAP-25 escindido por BoNT/E, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente al sitio de escisión de BoNT/E en el SNAP-25 escindido por BoNT/E. Para este propósito, el anticuerpo monoclonal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 es particularmente adecuado. Dichos primeros y segundos anticuerpos de captura también se pueden aplicar posteriormente. Por ejemplo, el primer anticuerpo de captura se puede unir específicamente tanto a SNAP-25 sin escindir como escindido por BoNT/E, lo que permite por lo tanto la cuantificación de la cantidad total o contenido de SNAP-25, es decir, SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E, en las células. Adicionalmente, este primer anticuerpo de captura se puede usar para la normalización de la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en las células, tras la evaluación como se describe en la presente descripción. El segundo anticuerpo de captura se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E y permite por lo tanto la determinación y detección del SNAP-25 escindido por BoNT/E.

La siguiente detección del SNAP-25 total (sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E) y el SNAP-25 escindido por BoNT/E en el método de la invención se puede llevar a cabo directamente en la placa de microtitulación o placa de cultivo celular, es decir, dentro de las células. Ventajosamente, no es necesario por lo tanto preparar extractos celulares y aislar y/o concentrar el SNAP-25 escindido por BoNT/E del lisado celular en el método de la invención, como en los métodos que se describen en la técnica. Posteriormente, las células se lavan con el fin de eliminar el exceso de anticuerpo que no se une al antígeno respectivo. En la etapa posterior, las células que se permeabilizan se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección y al menos un segundo anticuerpo de detección. Dichos anticuerpos se pueden aplicar como una mezcla, es decir, simultáneamente, o posteriormente. El primer anticuerpo de detección se une específicamente al primer anticuerpo de captura. Por lo tanto, se forman los primeros complejos de detección. El primer anticuerpo de detección se puede dirigir contra las especies de las que se deriva el primer anticuerpo de captura. Por ejemplo, en caso de que el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) se use como primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E, un anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina se puede usar como primer anticuerpo de detección. El segundo anticuerpo de detección se une específicamente al segundo anticuerpo de captura. Por lo tanto, se forman segundos complejos de detección. El segundo anticuerpo de detección se puede dirigir contra las especies de las que se deriva el segundo anticuerpo de captura. Por ejemplo, en caso de que el anticuerpo monoclonal de ratón (AcM) que se genera y caracteriza en los siguientes Ejemplos se use como un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al SNAP-25 escindido por BoNT/E, un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) se puede usar como un segundo anticuerpo de detección. Está claro para los expertos en la técnica que el primer anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo de detección se conjugan con diferentes enzimas con el fin de permitir la detección específica del primer y segundo anticuerpo de captura respectivamente como se usa en el método de la invención. Por ejemplo, la detección en base a HRP como se describe en otra parte en la presente descripción se puede usar para SNAP-25 escindido por BoNT/E y la detección en base a fosfatasa alcalina para el SNAP-25 total (BoNT/E que se escinde y sin escindir BoNT-E). Posteriormente, las células se lavan nuevamente. En una etapa posterior, se añade un sustrato de HRP fluorogénico a las células. Como un sustrato de HRP, por ejemplo, se puede usar Amplex UltraRed (Invitrogen) que se excita a 540 nm y emite a 600 nm. La incubación con el sustrato de HRP se lleva a cabo por un tiempo suficiente para una conversión suficiente del sustrato por la peroxidasa de rábano picante. Posteriormente a la incubación con el sustrato HRP, por ejemplo, el sustrato AP DiFMUP (fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo; excitación 360 nm; emisión 450 nm) se puede añadir al sustrato HRP y las células se incuban con una mezcla de dichos dos sustratos. La incubación con dicho sustrato AP se lleva a cabo por un tiempo que permite una conversión suficiente del sustrato por la fosfatasa alcalina. Como es conocido en la técnica, un sustrato se debe convertir en una cantidad que sea suficiente de modo que la señal que se mide sea al menos tan alta como la media del valor del blanco más tres desviaciones estándar de la media, de acuerdo con la definición de límite de detección. El límite de detección se puede determinar como se describe en la literatura; ver, por ejemplo, Armbruster y Pry, Clinical Biochem. Rev. 2008, 29 (Suplemento 1): S49-S52. Debido a que el pH óptimo de la fosfatasa alcalina está en la región alcalina, el tampón de sustrato correspondiente es fuertemente alcalino. Si el sustrato de fosfatasa alcalina se añade al sustrato de HRP, la reacción de la peroxidasa de rábano picante se detiene por el pH alcalino y la fosfatasa alcalina convierte en DiFMUP. El sustrato de HRP que se convierte no se ve afectado por el pH alcalino. Finalmente, la fluorescencia de los dos sustratos se mide de la siguiente manera:

Amplex UltraRed: Excitación 540 nm; emisión 600 nm

DiFMUP Excitación 360 nm; emisión 450 nm

Como apreciarán los expertos en la técnica, sólo aquellos sustratos fluorogénicos son apropiados para la detección del primer y segundo anticuerpo de captura en el método de la invención que exhiben diferentes longitudes de onda de excitación/emisión de los sustratos que se usan. Solo en este caso, permiten la detección específica de cada antígeno, es decir, el SNAP-25 total (SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E) y el SNAP-25 escindido por BoNT/E. Por lo tanto, es posible cuantificar el contenido total de SNAP-25 y el contenido de SNAP-25 escindido por BoNT/E en cada pocillo o disco de cultivo de célula al mismo tiempo. A la luz de esto, es ventajosamente posible automatizar el método de la invención. Como se establece en otra parte en la presente descripción se concibe que los sustratos fluorogénicos que se eligen para el método de la invención exhiban un desplazamiento suficiente entre los espectros de excitación/emisión con el fin de permitir la detección específica del sustrato respectivo. Este requisito se cumple, por ejemplo, para el sustrato HRP Amplex y sus derivados y para el sustrato AP DiFMUP. Mientras que, en un caso óptimo, no existe superposición entre los espectros de excitación/emisión de los sustratos fluorogénicos que se usan, se ha experimentado que una superposición de hasta el 30 % en el área de pico de los espectros de excitación de los sustratos fluorogénicos que se usan es tolerable.

Como se reconocen adicionalmente por los expertos en la técnica, el método de la presente invención permite la detección y cuantificación directa del sustrato SNAP-25 que se escinde por el polipéptido de neurotoxina BoNT/E en las células, para determinar de este modo la actividad biológica de dicho polipéptido de neurotoxina BoNT/E en dichas células. Ventajosamente, el método de la invención no requiere la preparación de lisados o extractos celulares y el aislamiento o concentración del SNAP-25 escindido por BoNT/E de los lisados/extractos celulares, lo que es necesario para los métodos y ensayos conocidos en el Arte. Como consecuencia de esto, se puede ahorrar material de muestra. Adicionalmente, la preparación de la muestra y el número de muestras se pueden reducir mediante el método de la invención ya que la cantidad de SNAP-25 total y la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en la muestra se pueden determinar al mismo tiempo. En los ensayos que se describen en la técnica, las muestras se deben subdividir con el fin de detectar ambos antígenos, es decir, el sustrato de neurotoxina total y el sustrato de neurotoxina que se escinde, por separado entre sí. El método de la invención vuelve innecesaria la subdivisión de la muestra. Por lo tanto, se pueden evitar las heterogeneidades que resultan de la subdivisión de muestras se puede evitar y el material de muestra puede ahorrar. Además, los antígenos se pueden degradar en los ensayos que se describen en la técnica que pueden falsificar la detección del sustrato de neurotoxina que se escinde. Esto se debe a que en los ensayos que se describen en la técnica, las células se incuban con tampones de lisis que contienen detergente que, sin embargo, no son capaces de inactivar el polipéptido de neurotoxina u otras proteasas endógenas que resultan en la degradación del sustrato de neurotoxina tras un almacenamiento más prolongado de las muestras. Los tampones de lisis más fuertes no se pueden usar en el ELISA sándwich ECL que se describe en la técnica anterior debido al uso requerido del lisado celular en dicho ensayo. Esto se debe a que la agregación de los antígenos que se mencionan anteriormente puede resultar en una adsorción inespecífica de los antígenos a la superficie plástica de los discos de cultivo celular o placas de microtitulación, lo que a su vez impide la detección de los antígenos por los anticuerpos apropiados. Ya que los anticuerpos para la detección de los antígenos también entran en contacto con el lisado, los anticuerpos también se pueden agregar. En este caso, ya no es posible la detección fiable y precisa del antígeno. Los presentes inventores han experimentado tales reacciones de degradación mediante el uso de ensayos de transferencia Western para la detección de la actividad biológica de la actividad de la neurotoxina que se describe en la técnica. Tras un almacenamiento más prolongado de los lisados a -20 °C, en comparación con las muestras de lisados recientes, se ha descubierto que la señal de detección de SNAP-25 total se reduce fuertemente, que reduce por lo tanto la sensibilidad del sistema de prueba. Se ha descubierto por los presentes inventores que la degradación de SNAP-25 y/o la inestabilidad de las muestras se pueden evitar mediante la fijación directa de las células en la disco de cultivo celular debido a que tanto el sustrato SNAP-25 de neurotoxina BoNT/E como la neurotoxina BoNT/E u otras proteasas endógenas se inactivan inmediatamente por agregación en el disco de cultivo celular. Esto se puede alcanzar mediante el uso de, por ejemplo, la fijación de las células con metanol u otros fijadores o agentes de fijación conocidos en la técnica, tales como etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los mismos u otros agentes de fijación que se describen en la presente descripción. El análisis de la estabilidad de, por ejemplo, células SiMa parentales (células de neuroblastoma humano; DSMZ número: ACC 164) y neuronas que se derivan de iPS (Whitemarsh y otros (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35) mediante el uso de este método de fijación no reveló ninguna diferencia entre los discos de cultivo celular recientes y los que se almacenan siete días en el refrigerador.

Como se usa en la presente descripción, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen tanto referencias en singular como en plural a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. A modo de ejemplo, "una célula" se refiere a una o más de una célula.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" cuando califica un valor de un artículo, número, porcentaje o término establecido se refiere a un intervalo de más o menos 10 por ciento, 9 por ciento, 8 por ciento, 7 por ciento, 6 por ciento, 5 por ciento, 4 por ciento, 3 por ciento, 2 por ciento o 1 por ciento del valor del artículo, número, porcentaje, o término establecido. Se prefiere un intervalo de más o menos 10 por ciento.

Los términos "que comprende", "comprende" y "que se compone por" como se usan en la presente descripción son sinónimos de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen otros miembros, elementos o etapas del método adicionales que no se mencionan. Evidentemente, el término "que comprende" abarca el término "que consiste en". Más específicamente, el término "comprender", como se usa en la presente descripción, significa que la reivindicación abarca todos los elementos o etapas del método que se enumeran, pero también puede incluir, elementos o etapas del método adicionales sin nombre. Por ejemplo, un método que comprende las etapas a), b) y c) abarca, en su sentido más estricto, un método que consiste en las etapas a), b) y c). La frase "que consiste en" significa que la composición (o dispositivo, o método) tiene los elementos que se mencionan (o etapas) y nada más. Por el contrario, el término "comprende" también puede abarcar, un método que incluye etapas adicionales, por ejemplo, etapas d) y e), además de las etapas a), b) y c).

En caso de que se usen intervalos numéricos en la presente descripción tales como "en una concentración entre 1 y 5 micromolar", el intervalo incluye no solo 1 y 5 micromolar, pero también cualquier valor numérico entre 1 y 5 micromolar, por ejemplo, 2, 3 y 4 micromolar.

El término "in vitro", como se usa en la presente descripción, indica fuera del, o externo al cuerpo animal o humano. El término "in vitro" como se usa en la presente descripción se debe entender incluye "ex vivo". El término "ex vivo" se refiere típicamente a tejidos o células que se eliminan de un cuerpo animal o humano y se mantienen o se propagan fuera del cuerpo, por ejemplo, en un recipiente de cultivo. El término "in vivo" como se usa en la presente descripción indica dentro del o el interior del cuerpo animal o humano. Preferentemente, el método de la invención es un método in vitro.

El término "polipéptido de neurotoxina", como se usa en la presente descripción, indica neurotoxinas de Clostridium botulinum y Clostridium tetani, es decir, toxinas botulínicas (BoNT) y toxina tetánica (TeNT). Más específicamente, dicho término significa que el polipéptido de neurotoxina BoNT/E o el polipéptido BoNT/E-MDM2 si no se establece de cualquier otra manera. Los polipéptidos BoNT/E-MDM2 y las secuencias de ácido nucleico que los codifican se han definido y caracterizado en el documento WO 2013/068476. Por consiguiente, el polipéptido de neurotoxina y, en particular, su cadena ligera y su cadena pesada se pueden derivar de BoNT/E. En un aspecto, dicha cadena ligera y pesada del polipéptido de neurotoxina son la cadena ligera y la cadena pesada de una neurotoxina BoNT/E. En otro aspecto, el polinucleótido que codifica dicho polipéptido de neurotoxina comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 9 (secuencia de ácido nucleico que codifica para BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido BoNT/E-MDM2) o SEQ ID NO: 13 (secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido BoNT/E-MDM2). Además, se abarca, en un aspecto, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (polipéptido BoNT/E-MDM2) o SEQ ID NO: 14 (polipéptido BoNT/E-MDM2). Se abarca adicionalmente en un aspecto del método de la presente invención, un polipéptido de neurotoxina que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (polipéptido BoNT/E-MDM2) o SEQ ID NO: 14 (polipéptido BoNT/E-MDM2). En un aspecto adicional, la neurotoxina botulínica es una BoNT/E1 que se obtiene mediante el uso de la secuencia de ácido nucleico con codones optimizados que se describe en el documento WO 2014/068317.

En otro aspecto, dicho polinucleótido es una variante del polinucleótido que se menciona anteriormente que comprende una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos que en otro aspecto adicional pueden resultar en un polipéptido que tiene una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Además, una variante de polinucleótido de la descripción deberá comprender en otro aspecto una variante de secuencia de ácido nucleico que sea al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 9, 11 o 13, o una variante de secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que sea al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14. El término "idéntico" como se usa en la presente descripción se refiere a la identidad de secuencia que se caracteriza por la determinación del número de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de aminoácido en donde las secuencias se alinean de modo que se obtiene la equivalencia de más alto orden. Se puede calcular mediante el uso de técnicas publicadas o métodos codificados en programas de computadora tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN o FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Los valores de porcentaje de identidad, en un aspecto, se calculan sobre la secuencia de aminoácidos completa. Una serie de programas en base a una variedad de algoritmos está disponible para el trabajador experto para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente confiables. Para llevar a cabo las alineaciones de secuencia se puede usar el programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), que son parte del paquete de software GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, e E.UU. 53711). Los valores de identidad de secuencia que se mencionan anteriormente en porcentaje (%) se determinarán, en otro aspecto de la invención, mediante el uso del programa GAP sobre la región de secuencia completa con los siguientes ajustes: Peso de separación: 50, Peso de longitud: 3, Equivalencia promedio: 10000 e Incompatibilidad promedio: 0,000, que, a menos que se especifique de cualquier otra manera, siempre se deberán usar como ajustes estándar para alineamientos de secuencia. En un aspecto, cada uno de las variantes de polinucleótidos que se mencionan anteriormente codifican para un polipéptido que retiene una o más y, en otro aspecto, todas las propiedades biológicas del polipéptido de neurotoxina BoNT/E o el polipéptido BoNT/E-MDM2. Los expertos en la técnica apreciarán que la actividad biológica completa se mantiene sólo después de la activación proteolítica, aunque es concebible que el precursor sin procesar pueda ejercer algunas funciones biológicas o ser parcialmente activo. Las "propiedades biológicas" como se usan en la presente descripción se refieren a (a) unión al receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosómica hacia el citosol, y/o (d) escisión endoproteolítica de proteínas que se involucran en la fusión de la vesícula sináptica a la membrana. Los ensayos in vivo para evaluar la actividad biológica incluyen el ensayo LD50 de ratón y el ensayo de hemidiafragma de ratón ex vivo como describen por Pearce y otros (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) y Dressler y otros (Dressler 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). La actividad biológica se expresa comúnmente en unidades de ratón (MU). Como se usa en la presente descripción, 1 MU es la cantidad del componente neurotóxico, que mata al 50 % de una población específica de ratones después de la inyección intraperitoneal, es decir, la i.p. de ratón LD50. En un aspecto adicional, las variantes de polinucleótidos pueden codificar para neurotoxinas BoNT/E o polipéptidos BoNT/E-MDM2 que tienen propiedades biológicas que se mejoran o se alteran, por ejemplo, pueden comprender sitios de escisión que se mejoran para el reconocimiento de enzimas, se pueden mejorar para la unión al receptor, pueden tener una duración que se altera, por ejemplo, prolongada o reducida de la actividad biológica, o cualquier otra propiedad que se especifica anteriormente.

Por consiguiente, el término "actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina BoNT/E o un polipéptido de BoNT/E-MDM2" como se usa en la presente descripción significa que las propiedades biológicas características de un polipéptido de neurotoxina BoNT/E, es decir, (a) unión al receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosómica hacia el citosol, y/o (d) escisión endoproteolítica de proteínas que se involucran en la fusión de la vesícula sináptica a la membrana. Se concibe que el polipéptido de neurotoxina BoNT/E o el polipéptido BoNT/E-MDM2 como se usa en la presente descripción exhibe al menos una de las propiedades a) a d) que se mencionan anteriormente, preferentemente escisión endoproteolítica de proteínas que se involucran en la fusión de la vesícula sináptica a la membrana, o dos o tres o las cuatro propiedades biológicas que se enumeran de a) a d).

Los aspectos de la presente descripción comprenden, en parte, una célula de una línea celular establecida. Como se usa en la presente descripción, el término "célula" se refiere a cualquier célula eucariota susceptible a la intoxicación por un polipéptido de neurotoxina BoNT/E o un polipéptido BoNT/E-MDM2 o cualquier otra célula eucariota que pueda captar un polipéptido de neurotoxina BoNt /E o un polipéptido BoNT/E-MDM2. El término célula abarca células de una variedad de organismos, tales como, por ejemplo, células murinas, de rata, porcinas, bovinas, equinas, de primates y humanas; de una variedad de tipos de células tales como, por ejemplo, neuronales y no neuronales; y se pueden aislar de o ser parte de una población de células, tejido u organismo heterogéneos. Como se usa en la presente descripción, el término "línea celular establecida" es sinónimo de "línea celular inmortal" o "línea celular transformada" y se refiere a un cultivo celular seleccionadas para la propagación indefinida a partir de una población de células que se derivan de una fuente de un organismo, tejido u órgano. Por definición, una línea celular establecida excluye un cultivo celular de células primarias. Como se usa en la presente descripción, el término "células primarias" son células que se cosechan directamente de tejidos u órganos frescos y no tienen el potencial de propagarse indefinidamente. Por ejemplo, se pueden usar células neuronales primarias en el método de la invención. Una línea celular establecida puede comprender una población heterogénea de células o una población uniforme de células. Una línea celular establecida derivada de una sola célula se denomina línea celular clonal. Una línea celular establecida puede ser una cuyas células se expresan de forma endógena todos los componentes necesarios para que las células experimenten el mecanismo celular general mediante el cual un polipéptido de neurotoxina, tal como BoNT/E, que escinde proteolíticamente un sustrato, tal como SNAP-25, y abarca la unión de una neurotoxina a un receptor de neurotoxina, tal como BoNT/E a un receptor de BoNT/E, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la neurotoxina BoNT/E desde una vesícula intracelular hacia el citoplasma y la escisión proteolítica del sustrato SNAP-25 de neurotoxina BoNT/E. Alternativamente, una línea celular establecida puede ser una a cuyas células se le han introducido de una fuente exógena al menos un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular general mediante el cual una neurotoxina, tal como BoNT/E, que escinde proteolíticamente un sustrato, tal como SNAP-25, y abarca la unión de una neurotoxina a un receptor, tal como BoNT/E a un receptor de BoNT/E, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la neurotoxina BoNT/E de una vesícula intracelular hacia el citoplasma y la escisión proteolítica del sustrato SNAP-25 de neurotoxina BoNT/E. También denominada como línea celular modificada genéticamente, las células de dicha línea celular establecida pueden, por ejemplo, expresar un FGFR2 exógeno, un FGFR3 exógeno, un SV2 exógeno, un sustrato SNAP-25 de neurotoxina exógeno, o cualquier combinación de los mismos.

El término "célula(s) susceptibles a la intoxicación por neurotoxina BoNT/E", como se indica en la presente descripción, significa que una célula puede experimentar los mecanismos celulares generales mediante los cuales un polipéptido de neurotoxina BoNT/E escinde el sustrato SNAP-25 de neurotoxina BoNT/E y abarca la unión de la neurotoxina BoNT/E a un receptor de BoNT/E, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la neurotoxina BoNT/E desde una vesícula intracelular hacia el citoplasma y la escisión proteolítica del sustrato SNAP-25 de neurotoxina BoNT/E. Los ensayos para determinar la actividad biológica de polipéptidos de neurotoxina BoNT/E son bien conocidos en la técnica y también se describen en otra parte en la presente descripción; ver, por ejemplo, Pellett y otros (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392; Whitemarsh y col. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35. Por consiguiente, una "célula susceptible a la intoxicación por Neurotoxina BoNT/E" como se usa en la presente descripción significa que es una célula sensible a neurotoxina BoNT/E. El término que se menciona comprende una célula o una línea celular, por ejemplo, una célula primaria aislada o una línea celular de la misma o una célula de una línea celular establecida o una línea celular establecida, por ejemplo, células tumorales o líneas celulares tumorales que son capaces de diferenciarse en células neuronales, tales como células de neuroblastoma o líneas celulares de neuroblastoma como se define en otra parte en la presente descripción. Por ejemplo, dicha línea celular de neuroblastoma puede ser una línea celular SiMa que está disponible comercialmente en DSMZ (ACC 164). Los clones específicos de la línea celular SiMa se describen además en el documento WO 2010/105234. Otras líneas celulares de neuroblastoma que se pueden usar en el método de la invención se pueden obtener de ATCC o DSMZ, con los siguientes números ATCC o DSMZ: Línea celular N1E-115 bajo CRL-2263, línea celular Neuro2a bajo CCL-131, línea celular SH-SY5Y bajo CRL-2266, línea celular PC12 bajo CRL-1721, línea celular MHH-NB-11 bajo ACC 157 (DSMZ) y línea celular SK-N-BE(2) bajo CRL-2271. Otras células tumorales que son susceptibles a la intoxicación por neurotoxina son las células P-19 (línea celular de carcinoma embrionario murino) (DSMz número ACC 316). Además, dentro de las células susceptibles a la intoxicación por neurotoxinas con BoNT/E están las neuronas que se derivan de células madre pluripotentes inducidas (iPS), preferiblemente las neuronas que se derivan de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPS); ver, por ejemplo, Whitemarsh y otros (2012), loc. cit. Tales neuronas que se derivan de iPS humanas también están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Cellular Dynamics. Los métodos para generar células iPS se describen, por ejemplo, en Yu y otros (Science, 8 de mayo de 2009; 324 (5928): 797-801. Epub 2009), documentos WO 2011/056971 y WO 2011/025852. En algunos aspectos, las iPS se diferencian en neuronas mediante el uso de métodos adecuados, por ejemplo, aquellos que se describen en el documento WO 2012/135621 y las solicitudes de patente de los Estados Unidos US 2010/0279403 y US 2010/0216181.

El término "fijar las células" o "fijación de células" significa fijar las células mediante el uso de métodos que se describen en la técnica. Generalmente, la fijación es un proceso químico mediante el que los tejidos biológicos se preservan de la descomposición, que evita por lo tanto la autolisis. La fijación pone fin a cualquier reacción bioquímica en curso, y también puede aumentar la resistencia mecánica o la estabilidad de los tejidos que se tratan. La fijación conserva una muestra de material biológico tal como un tejido o células lo más cerca posible de su estado natural en el proceso de preparación de dicho tejido o células para su examen o análisis. Con este fin, un fijador actúa usualmente para desactivar las biomoléculas intrínsecas, particularmente las enzimas proteolíticas, que de cualquier otra manera digieren o dañan la muestra. Adicionalmente, un fijador protege típicamente una muestra del daño extrínseco. Los fijadores son tóxicos para la mayoría de los microorganismos comunes, lo que incluye las bacterias que pueden existir en un tejido o cultivo celular o que de cualquier otra manera puede colonizar el tejido o cultivo celular que se fija. Además, muchos fijadores alteran químicamente el material que se fija para hacerlo menos apetecible, ya sea indigerible o tóxico para los microorganismos oportunistas. Finalmente, los fijadores a menudo alteran las células o tejidos a nivel molecular para aumentar su resistencia mecánica o estabilidad. Este aumento de resistencia y rigidez puede ayudar a conservar la morfología tal como la forma y la estructura de la muestra a medida que se procesa para su análisis posterior. Es evidente para los expertos en la técnica que la elección del fijador y el protocolo de fijación puede depender de las etapas de procesamiento adicionales y los análisis finales que se planean. Por ejemplo, la inmunohistoquímica usa anticuerpos que se unen específicamente a una proteína diana específica, el antígeno. La fijación prolongada puede enmascarar químicamente estas dianas y prevenir la unión de anticuerpos. En estos casos, por ejemplo, se puede usar un método de fijación rápida mediante el uso de formalina fría. Alternativamente, las células se pueden fijar mediante la adición de metanol helado (-20 °C). Además de aldehídos tales como formaldehído o glutaraldehído y alcoholes como etanol o metanol, agentes oxidantes, fijador de efecto protector de solvente orgánico mediado por tampón de ácido glutámico HEPES (HOPE), acetona, o mezclas de los mismos, tal como una mezcla de metanol y acetona, metanol y etanol, paraformaldehído y Triton X-100, o paraformaldehído y metanol, se pueden usar en protocolos de fijación. En un aspecto del método de la invención, la fijación de las células se lleva a cabo mediante la adición de un agente de fijación seleccionado del grupo que consiste en: metanol, etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los mismos. Para asegurar y/o apoyar el libre acceso del anticuerpo a su antígeno, las células pueden, opcionalmente, permeabilizarse mediante el uso de un tampón de permeabilización apropiado que comprenda al menos un detergente, tal como Triton X-100. Un tampón de permeabilización que se puede usar en el método de la invención es, por ejemplo, Triton X-100 al 0,5 % en tampón PBS 10 mM. En otros aspectos del método de la invención, las células se pueden permeabilizar mediante el uso de un tampón de permeabilización tal como PBS que comprende al menos un detergente seleccionado de Tween 20, saponina, digitonina o n-octil-p-glucopiranósido. En otros aspectos, se pueden usar mezclas de dos o más de los detergentes que se mencionan en la presente descripción en dicho tampón de permeabilización. En general, las fuerzas y los tiempos de fijación son considerablemente más cortos para las células que para las secciones de tejido más gruesas y estructuralmente complejas. Para la inmunocitoquímica, la preparación de la muestra implica esencialmente fijar las células diana al portaobjetos, disco de cultivo celular o placa de microtitulación. La fijación perfecta inmovilizaría los antígenos, mientras que retiene la arquitectura celular y subcelular auténtica y permite el acceso sin obstáculos de los anticuerpos a todas las células y compartimentos subcelulares. Se usan comúnmente amplios intervalos de fijadores como se ejemplifican anteriormente, y la elección correcta del método dependerá de la naturaleza del antígeno que se examina y de las propiedades del anticuerpo que se usa. Los métodos de fijación se dividen generalmente en dos clases: solventes orgánicos y reactivos de reticulación. Los solventes orgánicos tales como alcoholes y acetona eliminan los lípidos y deshidratan las células, mientras que precipitan las proteínas en la arquitectura celular. Los reactivos de reticulación tal como el paraformaldehído forman puentes intermoleculares, normalmente a través de grupos amino libres, que crean por tanto una red de antígenos que se unen. Los agentes de reticulación conservan la estructura celular mejor que los solventes orgánicos, pero pueden reducir la antigenicidad de algunos componentes celulares y, a menudo requieren la adición de una etapa de permeabilización como se indica anteriormente, para permitir el acceso del anticuerpo a la muestra. La fijación con ambos métodos puede desnaturalizar los antígenos proteicos y, por esta razón, los anticuerpos que se preparan contra las proteínas que se desnaturalizan pueden ser más útiles para la tinción celular. El método de fijación apropiado se debe ser elegido de acuerdo con la aplicación pertinente. Los métodos de fijación de células se describen bien en la técnica y por tanto son conocidos por los expertos en la técnica; ver, por ejemplo, Methods in cell biology, Volumen 37: Antibodies in cell biology; editado por David J. Asai; 1993, Academic Press Inc.

El término "poner en contacto" como se usa de acuerdo con el método de la invención significa poner las células y los anticuerpos respectivos en proximidad física para permitir la interacción física y/o química. Las condiciones adecuadas que permiten tal interacción específica son bien conocidas por el experto en la técnica. Evidentemente, dichas condiciones dependerán de los anticuerpos y de las células a aplicar en el método de la presente invención y se pueden adaptar de forma rutinaria por el experto en la técnica. Además, un tiempo que sea suficiente para permitir la interacción también se puede determinar por el trabajador experto sin más dilación. Se debe entender que entre las etapas individuales de poner en contacto las células y los anticuerpos respectivos que se mencionan en el método de la presente invención, se pueden realizar etapas de lavado con el fin de obtener las condiciones adecuadas para el contacto. Por ejemplo, después de poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura específicamente para el sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 escindido por BoNT/E en la etapa c) del método de la invención, se puede incorporar una etapa de lavado para eliminar la solución restante y/o el exceso del primer y segundo anticuerpo de captura, antes de aplicar el primer anticuerpo de detección y/o el segundo anticuerpo de detección. De manera similar, después de poner las células en contacto con el primer y/o segundo anticuerpo de detección en el método de la invención, se puede incluir una etapa de lavado. Un tampón de lavado apropiado es, por ejemplo, tampón PBS 10 mM (pH 7,4). Más específicamente, el término "poner en contacto" que se usa en la presente descripción, se refiere a poner las células en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente a SNAP-25 que se escinden de BoNT/E, bajo condiciones que permiten la unión de dichos anticuerpos de captura a dicho SNAP-25, en la etapa c) del método de la invención. El primer y segundo anticuerpo de captura se pueden aplicar a las células simultáneamente, por ejemplo, como una mezcla, o posteriormente. "Poner en contacto" se refiere adicionalmente a poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, y al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, en la etapa d) del método de la invención. Por lo tanto, se forman primeros y segundos complejos de detección. Alternativamente, los primeros y segundos anticuerpos de detección también se pueden aplicar posteriormente.

De acuerdo con el método de la presente invención, el "primer anticuerpo de captura" se une específicamente a un epítopo que se compone por el sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E. SNAP-25 es un sustrato conocido de BoNT/E. Dicho primer anticuerpo de captura permite la determinación de la cantidad total, es decir, el contenido completo de SNAP-25 en las células ya que se une específicamente a un epítopo disponible tanto en SNAP-25 sin escindir como en SNAP-25 que se escinde de BoNT-E. Para BoNT/E, un epítopo que se posiciona en N-terminal al sitio de escisión de BoNT/E (Arg (R) 180 - Ile (I) 181), es decir, entre los residuos de aminoácidos 1 y 180 de SNAP-25 se puede usar para la primera captura de anticuerpos.

En un aspecto del método de la invención, SNAP-25 es SNAP-25A o B humano o un homólogo, parálogo u ortólogo del mismo de rata, ratón, bovino, Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea, Macaca mulatta (Rhesus macaque), Pan troglodytes o Aplysia. Las secuencias de aminoácidos correspondientes de SNAP-25 murino y humano son mostradas, por ejemplo, en el número de acceso de UniProt P60879 y P60880, respectivamente. SNAP-25 se puede usar como una molécula o polipéptido de ácido nucleico natural, recombinante, exógeno o endógeno. Los sitios de escisión de BoNT/E en las proteínas SNAP-25 que se indican anteriormente se describen, por ejemplo, en el documento EP 1926744 B1.

Ejemplos de anticuerpos apropiados que se pueden usar como primeros anticuerpos de captura en el método de la invención incluyen, por ejemplo, el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) (Fernandez-Salas E, Wang J, Molina Y, Nelson JB, Jacky BPS, y otros (2012) Botulinum Neurotoxin Serotype a Specific Cell-Based Potency Assay to Replace the Mouse Bioassay. PLoS On E 7(11): e49516. doi:10.1371/journal.pone.0049516), el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19708 (Pierce Antibodies), el anticuerpo monoclonal de conejo anti-SNAP25 ab108990 (Abcam), o el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19701 (Pierce Antibodies)

En otro aspecto del método de la invención, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E puede tener una constante de velocidad de asociación de, por ejemplo, menos de 1 * 105 M 'V , menos de 1 * 106 M 'V , menos de 1 * 107 M 'V o menos de 1 * 108 M 'V . En otro aspecto, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E puede tener una constante de velocidad de asociación de, por ejemplo, más de 1 * 105 M 'V 1, más de 1 * 106 M 'V 1, más de 1 * 107 M 'V 1 o más de 1 * 108 M 'V 1. En un aspecto adicional, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E puede tener una constante de velocidad de disociación de, por ejemplo, menos de 1 x 10-3 s-1, menos de 1 * 10-4 s-1, menos de 1 * 10-5 s-1 o menos de 1 * 10-6 s-1. En otro aspecto adicional, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 sin escindir por BoNT/E y escindido por BoNT/E puede tener una constante de velocidad de disociación de, por ejemplo, más de 1 x 10-3 s-1, más de 1 * 10-4 s-1, más de 1 * 10-5 s-1 o más de 1 * 10-6 s-1. Como es conocido en la técnica, la constante de velocidad de asociación es una constante que se usa para caracterizar la rapidez con la que el anticuerpo se une a su diana. La constante de velocidad de disociación es una constante que se usa para caracterizar la rapidez con la que el anticuerpo se disocia de su diana.

En un aspecto adicional, el primer anticuerpo de captura se usa para la normalización del SNAP-25 escindido por BoNT/E en la célula.

En un aspecto adicional del método de la invención, el segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al SNAP-25 escindido por BoNT/E es un anticuerpo monoclonal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. Por consiguiente, las definiciones y modalidades con respecto al anticuerpo de la descripción aplican mutatis mutandis al segundo anticuerpo de captura que se usa en el método de la presente invención.

El término "primer anticuerpo de detección" como se usa en la presente descripción es un anticuerpo que se une específicamente al primer anticuerpo de captura. Dicho primer anticuerpo de detección permite la detección específica del primer anticuerpo de captura. Al medir la cantidad de primer anticuerpo de detección unido, se puede determinar ya que la cantidad de primeros complejos de detección, ya que la cantidad de primer anticuerpo de detección unido en el primer complejo de detección se correlaciona con la cantidad de primer anticuerpo de captura (y por consiguiente la cantidad total de SNAP-25, es decir, SNAP-25 que se escinde y sin escindir de BoNT/E) que se compone por el primer complejo de detección. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo específico de especie apropiado como primer anticuerpo de detección: si se ha usado un anticuerpo de ratón como primer anticuerpo de captura, dicho primer anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo anti-ratón que se une específicamente al anticuerpo de ratón. El primer anticuerpo de detección puede ser, por ejemplo, un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) o un anticuerpo conjugado con un tinte de fluorescencia. La conjugación de enzimas con anticuerpos, por ejemplo, mediante el uso de glutaraldehído es bien conocida en la técnica.

Los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) se han usado para cuantificar un amplio intervalo de compuestos y patógenos por casi 40 años. Inicialmente, se usó radiactividad para cuantificar los ensayos, pero los radioinmunoensayos (RIA) se han reemplazado por ensayos que usan enzimas para obtener resultados colorimétricos. Recientemente, se han desarrollado nuevos sustratos para producir productos fluorescentes y luminiscentes. El principio básico de los nuevos ensayos sigue siendo el mismo que el de los ensayos colorimétricos: el sustrato se convierte en un compuesto medible mediante la actividad enzimática de las proteínas conjugadas con un anticuerpo, lo que confiere especificidad.

Los conjugados enzimáticos que se usan comúnmente en ELISA son fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Por consiguiente, en un aspecto, el primer anticuerpo de detección se puede, por ejemplo, conjugar con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Ejemplos adicionales de conjugados enzimáticos que se pueden usar como un primer anticuerpo de detección en el método de la invención incluyen glucosa oxidasa que usa glucosa como sustrato, tirosinasa que convierte el sustrato 1-(4-Metil-cumarin-7-il)-3-(4-hidroxifenil)urea) (PAP-AMC) (Stratis Avrameas, Immunochemistry, Volumen 6, Número 1, Enero 1969, Páginas 43-48, IN9-IN11, 49-52) o pgalactosidasa que convierte el sustrato 6,8-difluoro-4-metil-umbeliferil p-d-galactopiranósido (DiFMUG) (Gee y otros, Analytical Biochemistry, Volumen 273, Edición 1, Agosto de 1999, páginas 41-48). Tras la adición de un sustrato, dicho sustrato se convierte por la enzima en una forma detectable. Por ejemplo, la fosfatasa alcalina cataliza la escisión de ésteres de ácido fosfórico. Si se usa un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) como primer anticuerpo de detección, un sustrato apropiado tal como un derivado de 4-metilumbeliferilfosfato, por ejemplo, 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilfosfato (DiFMUP), o difosfato de fluoresceína (FDP). El 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilfosfato (DiFMUP) se convierte por la AP en una forma detectable, es decir, el producto fluorogénico 6,8-difluoro-4-metilumbeliferona. Dicho sustrato se proporciona, por ejemplo, por Molecular Probes. Las intensidades de fluorescencia de este producto de reacción de DiFMUP se pueden medir mediante el uso de máximos de excitación/emisión de aproximadamente 358/450 nm. Los sustratos adicionales que se pueden usar para este propósito son 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il) fosfato (DDAO-fosfato; Invitrogen), difosfato de fluoresceína (FDP; Sigma Aldrich) o fosfato de 4-metilumbeliferilo (MUP; Invitrogen). El fosfato DDAO se convierte por la AP en el producto fluorogénico dimetilacridinona (DDAO), que tiene un máximo de excitación/emisión de aproximadamente 646/659 nm. Si se usa FDP como sustrato para la AP, el producto de reacción es fluoresceína, que tiene un máximo de excitación/emisión de aproximadamente 490/514 nm. Para MUP, el producto de la reacción correspondiente es 4-metilumbeliferona (7-hidroxi-4-metilcumarina), que tiene un máximo de excitación/emisión de aproximadamente 360/449 nm. Todos estos sustratos también están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Molecular Probes. Alternativamente, se puede usar peroxidasa de rábano picante como conjugado enzimático en el primer anticuerpo de detección del método de la invención. La peroxidasa de rábano picante (HRP) cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H²O²) a agua (H²O). En presencia de sustratos específicos, que actúan como donantes de hidrógeno, la acción de HRP convierte las moléculas incoloras o no fluorescentes en restos coloreados y/o fluorescentes respectivamente. Por ejemplo, Amplex® Red (Life Technologies) es un sustrato para su uso con ensayos que contienen HRP. Amplex Red, en presencia de la enzima peroxidasa, reacciona con H²O² en una estequiometría 1:1 para producir resorufina, un compuesto fluorescente rojo que tiene un máximo de absorción y emisión de fluorescencia de 563 nm y 587 nm, respectivamente. Otro ejemplo de sustrato HRP es Amplex® UltraRed (Life Technologies). Se ha reportado que el reactivo Amplex® UltraRed (excitación/emisión de ~ 570/585 nm) mejora tras el rendimiento del reactivo Amplex® Red, que ofrece una fluorescencia más brillante y una sensibilidad que se potencia en una base por mol en peroxidasa de rábano picante o peroxidasa de rábano picante acoplada con ensayos de enzimas. La fluorescencia del reactivo Amplex® UltraRed oxidado (reactivo Amplex® UltroxRed) también es menos sensible al pH, y el sustrato y su producto de oxidación exhiben una mayor estabilidad que el reactivo Amplex® Red en presencia de peróxido de hidrógeno (H²O²) o tioles tal como ditiotreitol (DTT). Los sustratos de HRP adicionales apropiados que se pueden usar en el método de la invención incluyen, por ejemplo, 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP; AnaSpec) o ácido 3-(4-hidroxifenil) propiónico (HPPA; AnaSpec) (Tuuminen y otros 1991, J. Immunoassay 12, 29-46).

Alternativamente, el primer anticuerpo de detección puede llevar un marcador detectable apropiado que permite la detección del primer anticuerpo de captura. El marcaje se puede realizar mediante métodos directos o indirectos. El marcaje directo implica la unión del marcador directamente (de forma covalente o no covalente) al primer anticuerpo de detección. El mareaje indirecto involucra la unión (covalente o no covalente) de un agente que se une específicamente al primer anticuerpo de detección y que lleva un marcador detectable. Tal agente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo secundario (de más alto orden) que se une específicamente al primer anticuerpo de detección. En tal caso el anticuerpo secundario se acoplará a un marcador detectable. Se entenderá que se pueden usar anticuerpos adicionales de más alto orden además de la detección del primer complejo de detección. Los anticuerpos de más alto orden se usan a menudo para aumentar la señal. Los anticuerpos adecuados de más alto orden también pueden incluir el bien conocido sistema estreptavidina-biotina (Vector Laboratories, Inc.), y el bien conocido Dako LSAB™2 y LSAB™ (estreptavidina-biotina marcada), o Dako PAP (Peroxidasa Anti- Peroxidasa). En un aspecto adicional, dicho marcador del primer anticuerpo de detección es un tinte fluorescente, es decir, el primer anticuerpo se conjuga con un tinte fluorescente. En este caso, la fluorescencia se puede medir directamente mediante un lector de fluorescencia. Los marcadores fluorescentes típicos incluyen proteínas fluorescentes tales como GFP y sus derivados, tintes Cy tales como Cy3 o Cy5, rojo Texas, fluoresceína, y los tintes Alexa, por ejemplo, Alexa 568.

El "segundo anticuerpo de detección" como se usa en la presente descripción es un anticuerpo que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura. El segundo anticuerpo de detección se puede, por ejemplo, conjugar con una enzima tal como la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa o tirosinasa. Por consiguiente, en un aspecto, el segundo anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), un anticuerpo conjugado con glucosa oxidasa o un anticuerpo conjugado con tirosinasa. Dicho segundo anticuerpo de detección permite la detección específica del segundo anticuerpo de captura. Al medir la cantidad del segundo anticuerpo de detección que se une con la cantidad de los segundos complejos de detección ya que la cantidad de segundo anticuerpo de detección unido en el segundo complejo de detección se correlaciona con la cantidad de segundo anticuerpo de captura (y por consiguiente la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E) que se compone por el segundo complejo de detección. Por ejemplo, si se ha usado un anticuerpo de ratón como segundo anticuerpo de captura, se puede usar un anticuerpo anti-ratón como segundo anticuerpo de detección. El segundo anticuerpo de detección puede llevar una enzima como se ha expuesto anteriormente o un marcador tal como un tinte fluorescente (es decir, el segundo anticuerpo de detección está conjugado con un tinte fluorescente) como se menciona en otra parte de este documento con respecto al primer anticuerpo de detección. En un aspecto del método de la invención, la enzima conjugada con el primer anticuerpo de detección difiere de la enzima conjugada con el segundo anticuerpo de detección con el fin de permitir la detección específica del primer y segundo anticuerpo de captura respectivos en el método de la invención. Por ejemplo, si el primer anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con AP, el segundo anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) o viceversa. Adicionalmente, los espectros de excitación/emisión de los sustratos fluorogénicos de AP y HRP no se superponen sustancialmente, pero difieren entre sí, es decir, muestran un cambio claro para permitir la distinción de las intensidades de fluorescencia que se generan por el producto respectivo. Por ejemplo, DiFMUP exhibe excitación/emisión a ~ 358/450 nm, mientras que Amplex UltraRed exhibe una excitación/emisión de -570/585 nm, lo que permite por lo tanto mediciones precisas de las intensidades de fluorescencia que se generan mediante la conversión de dichos sustratos fluorogénicos por la enzima respectiva. En un aspecto adicional, el anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) se usa como un primer anticuerpo de detección para el antígeno que está presente en exceso en la célula, es decir, para la medición de la cantidad total (que se escinde y sin escindir de BoNT/E) de SNAP-25, en la célula. El anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) se usa como segundo anticuerpo de detección para el antígeno que está presente en la célula en una cantidad menor, es decir, para la medición de la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E, en la célula. Como es conocido en la técnica, los sustratos de HRP son más sensibles que los sustratos de AP, lo que significa que se pueden detectar cantidades menores de analitos. Si un anticuerpo de HRP se usa como anticuerpo secundario para la detección de SNAP-25 escindido por BoNT/E, se pueden detectar cantidades menores de SNAP-25 que se escinden de BoNT/E. A su vez, se pueden determinar cantidades menores de BoNT/E, lo que aumenta por lo tanto la sensibilidad del ensayo. Debido a que el anticuerpo de AP mide la cantidad total de SNAP-25 en la célula, no se requiere una alta sensibilidad para el sustrato, debido al exceso de analito.

El término "al menos" como se usa en la presente descripción tal como, por ejemplo, "al menos un primer anticuerpo de captura" significa que además de un anticuerpo que se une específicamente al sustrato sin escindir y escindido por BoNT/E, uno o más anticuerpos adicionales con la especificidad que se menciona se pueden usar en el método de la invención. De manera similar, "al menos un segundo anticuerpo de captura" significa que además de un anticuerpo de la descripción que se une específicamente al sitio de escisión del SNAP-25 escindido por BoNT/E, uno o más anticuerpos adicionales con la especificidad que se menciona se pueden usar en el método de la invención. Adicionalmente, uno o más primeros anticuerpos de detección que se unen específicamente al primer anticuerpo de detección (o primeros anticuerpos de detección) se pueden usar en el método de la invención. De manera similar, uno o más segundos anticuerpos de detección que se unen específicamente al segundo anticuerpo de detección (o segundos anticuerpos de detección) se pueden usar en el método de la invención.

El término "primer complejo de detección" se refiere a un complejo que comprende un primer anticuerpo de captura y un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al SNAP-25 sin escindir y escindido por BoNT/E, lo que permite por lo tanto la determinación del contenido total de SNAP-25 en la célula. La cantidad de primer complejo de detección se puede medir mediante la determinación de la cantidad de primer anticuerpo de detección que se une específicamente. Esto se puede alcanzar en dependencia de la naturaleza de la enzima o del marcador del primer anticuerpo de detección, por ejemplo, mediante la medición de la intensidad de la fluorescencia.

El término "segundo complejo de detección" se refiere a un complejo que comprende el segundo anticuerpo de captura y el segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al sitio de escisión del SNAP-25 escindido por BoNT/E, lo que permite por lo tanto la determinación del contenido de SNAP-25 escindido por BoNT/E en la célula. La cantidad de segundo complejo de detección se puede medir mediante la determinación de la cantidad de segundo anticuerpo de detección que se une específicamente. Esto se puede alcanzar en dependencia de la naturaleza de la enzima o del marcador del segundo anticuerpo de detección, por ejemplo, mediante la medición de la intensidad de la fluorescencia.

Se prevé que en lugar del análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), se puede usar cualquier sistema de detección para practicar aspectos del método de la invención, con la condición de que la relación señal/ruido pueda distinguir en un grado estadísticamente significativo la señal de los complejos de anticuerpo-antígeno que se forman a partir de la señal de fondo. Los ejemplos no limitantes de sistemas de detección en base a inmunología incluyen análisis de inmunotransferencia, como Transferencia western y puntual, análisis de inmunoprecipitación, y ELISA sándwich. La detección de la señal se puede alcanzar mediante el uso de autorradiografía con imágenes o imágenes de fósforo (AU), bioluminiscencia (BL), fluorescencia, transferencia de energía de resonancia, polarización plana, colorimétrica, o citometría de flujo (FC). Las descripciones de los sistemas de detección en base a inmunología se describen, por ejemplo, en Commonly Used Techniques in Molecular Cloning, págs. A8.1-A8-55 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3. sup.rd ed. 2001); Detection Systems, págs. A9.1-A9-49 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3. sup.rd ed. 2001).

En un aspecto del método de la invención, el método es un método de fluorescencia.

En un aspecto adicional, las células, anticuerpos tales como el anticuerpo de la descripción, polipéptidos de neurotoxina tales como BoNT/E y sustratos de neurotoxina tales como SNAP-25 o cualquier otro producto como se hace referencia en la presente descripción son células aisladas, anticuerpos, polipéptidos de neurotoxina, sustratos de neurotoxina o productos, respectivamente. Como se usa en la presente descripción, el término "aislado", tal como un anticuerpo aislado, se refiere a una molécula que se separa de su entorno natural mediante el uso de intervención humana.

En un aspecto del método de la invención, el polipéptido de neurotoxina BoNT/E comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de aminoácidos como es mostrada en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14; y b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14.

En un aspecto adicional del método de la invención, las células son células neuronales o células diferenciadas neuronales seleccionadas del grupo que consiste en: células neuronales primarias, células tumorales que son capaces de diferenciarse en células neuronales tales como células de neuroblastoma, células P19 o neuronas que se derivan de células madre pluripotentes inducidas (iPS).

En otro aspecto adicional del método de la invención, la fijación de las células se lleva a cabo mediante la adición de un agente de fijación seleccionado del grupo que consiste en: metanol, etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los mismos.

En otro aspecto del método de la invención, dicho primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato sin - escindir y escindido por BoNT/E es el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684, el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19708 (Pierce Antibodies), el anticuerpo monoclonal de conejo anti-SNAP25 ab108990 (Abcam) o el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19701 (Pierce Antibodies).

En un aspecto del método de la invención, el primer anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) o un anticuerpo conjugado con un tinte de fluorescencia.

En un aspecto del método de la invención, el segundo anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), un anticuerpo conjugado con glucosa oxidasa, un anticuerpo conjugado con tirosinasa o un anticuerpo con p-galactosidasa. Preferentemente, el segundo anticuerpo de detección es diferente del primer anticuerpo de detección.

En un aspecto adicional del método de la invención, el sustrato de HRP es Amplex UltraRed, 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP) o ácido 3-(4-hidroxifenil) propiónico (HPPA).

En otro aspecto adicional del método de la invención, en donde el sustrato de AP es un derivado de 4metilumbeliferilfosfato tal como 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilfosfato (DiFMUP), o difosfato de fluoresceína (FDP).

La invención también se relaciona con un kit para llevar a cabo el método de la invención, que comprende:

a) una distribución de un primer anticuerpo de captura, un segundo anticuerpo de captura que es un anticuerpo monoclonal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un primer anticuerpo de detección y un segundo anticuerpo de detección, en donde dicha distribución permite llevar a cabo los métodos de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12;

b) los medios para calcular la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en base a las cantidades de los primeros y segundos complejos de detección que se determinan por la distribución de acuerdo con a); e

c) instrucciones para llevar a cabo dicho método.

El término "kit", como se usa en la presente descripción, se refiere a una colección de los medios o reactivos de la presente invención que se mencionan anteriormente que pueden o no empaquetarse juntos. Los componentes del kit pueden comprender viales que se separan (es decir, como un kit de partes separadas) o que se proporcionan en un solo vial. Además, se debe entender que el kit de la presente invención se debe usar para practicar el método al que se hace referencia anteriormente en la presente descripción. En un aspecto, se concibe que todos los componentes se proporcionen de una manera lista para el uso para practicar el método al que se hace referencia en la presente descripción. En un aspecto adicional, el kit contiene instrucciones para llevar a cabo dicho método. Las instrucciones se pueden proporcionar por un manual de usuario en papel o de forma electrónica. Por ejemplo, el manual puede comprender instrucciones para interpretar los resultados que se obtienen cuando se llevan a cabo los métodos que se mencionan anteriormente mediante el uso del kit de la presente invención.

Finalmente, la descripción se refiere en otro aspecto a un método para la fabricación de un producto que se formula de neurotoxina BoNT/E o un producto de neurotoxina BoNT/E-MDM2 para su uso en aplicaciones farmacéuticas o cosméticas, que comprenden (i) determinar la actividad biológica de una neurotoxina BoNT/E o polipéptido de neurotoxina BoNT/E-MDM2 mediante el método de la invención y (ii) formular la neurotoxina BoNT/E o el polipéptido de neurotoxina BoNT/E-MDM2 para su uso en aplicaciones farmacéuticas o cosméticas de modo que un producto que se formula de neurotoxina BoNT/E o un producto de neurotoxina BoNT/E-MDM2 se obtenga. La neurotoxina BoNT/E o el polipéptido de neurotoxina BoNT/E-MDM2 se pueden formular en un producto de neurotoxina BoNT/E o un producto de neurotoxina de BoNT/E-MDM2 mediante varias técnicas que dependen de los propósitos de aplicación que se desean que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido de neurotoxina BoNT/E (biológicamente activo) se puede usar en combinación con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables como una composición farmacéutica. El portador(es) farmacéuticamente aceptable(s) debe ser aceptable en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de los mismos. El portador farmacéutico que se emplea puede incluir un sólido, un gel, o un líquido. Los portadores sólidos ilustrativos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Los portadores líquidos ilustrativos son glicerol, solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, varios tipos de agentes humectantes, y similares. Los portadores adecuados comprenden aquellos que se mencionan anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. En un aspecto, la composición farmacéutica se puede disolver en un diluyente antes de la administración. El diluyente también se selecciona de modo que no afecte a la actividad biológica del polipéptido de neurotoxina BoNT/E o BoNT/E-MDM2. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada o solución salina fisiológica. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares. Por tanto, el producto que se formula de neurotoxina BoNT/E o el producto de neurotoxina BoNT/E-MDM2 puede estar presente, en un aspecto, en forma líquida o liofilizada. En un aspecto, puede estar presente junto con glicerol, estabilizadores de proteínas (HSA) o estabilizadores no proteicos tales como polivinilpirrolidona (PVP), ácido hialurónico o aminoácidos libres. En un aspecto, los estabilizadores no proteicos adecuados se describen en los documentos WO 2005/007185 o WO 2006/020208. En un aspecto, la actividad biológica que se determina de acuerdo con la etapa (i) mediante el método de la invención corresponde a una actividad polipeptídica de neurotoxina BoNT/E o neurotoxina BoNT/E-MDM2 de 25, 50, 75, 100, 125, 150 o 200 U (unidades de ratón LD50). El producto que se formula de neurotoxina BoNT/E o el producto de neurotoxina BoNT/E-MDM2 se puede usar para terapia humana o animal de varias enfermedades o trastornos en una dosis terapéuticamente efectiva o con fines cosméticos.

La enfermedad o trastorno como se hace referencia en la presente descripción se selecciona del grupo que consiste en fuerza muscular voluntaria, distonía focal, que incluye distonía cervical, craneal y blefaroespasmo esencial benigno, espasmo hemifacial y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis y corrección cosmética de arrugas, blefaroespasmo, distonía oromandibular, tipo de apertura de la mandíbula, tipo de cierre de la mandíbula, bruxismo, síndrome de Meige, distonía lingual, apraxia del párpado, distonía cervical de apertura, antecolis, retrocolis, laterocolis, tortícolis, distonía faríngea, distonía de tipo laríngea, distonía espasmódica/abductora disfonía/tipo abductor, disnea espasmódica, distonía de las extremidades, distonía del brazo, distonía específica de la tarea, calambre del escritor, calambres del músico, calambre del golfista, distonía de las piernas, aducción del muslo, abducción del muslo flexión de la rodilla, extensión de la rodilla, flexión del tobillo, extensión del tobillo, equinovaro, deformidad distonía del pie, dedo estriado, flexión del dedo, extensión del dedo, distonía axial, síndrome de pisa, distonía de la danza del vientre, distonía segmentaria, hemidistonía, distonía generalizada, distonía en lubag, distonía en degeneración corticobasal, distonía en lubag, distonía tardía, distonía en ataxia espinocerebelosa, distonía en enfermedad de Parkinson, distonía en enfermedad de Huntington, distonía en enfermedad de Huntington-Spatz, discinesias inducidas/distonía inducida por dopa, discinesias tardías/distonía tardía, discinesias/distonías paroxísticas, mioclonías palatinas kinesiogénicas no kinesiogénicas inducidas por acción, mioclonías mioclónicas, rigidez, calambres musculares benignos, temblor hereditario de la barbilla, actividad de los músculos de la mandíbula espasmódica, miopatía branquial hipertrófica, hipertrofia maseterina, hipertrofia tibial anterior, nistagmo, oscilopsia, parálisis de la mirada supranuclear, epilepsia, parcial continua, planificación de la operación de tortícolis espasmódica, parálisis de las cuerdas vocales abductoras, disfonía mutacional recalcitrante, disfonía esofágica superior, distorsión de los pliegues vocales granulomatosa, síndrome de la Tourette, mioclono del oído medio, cierre protector de la laringe, poslaringectomía, fallo del habla, ptosis protectora, disfunción del esfínter entropión de Odii, pseudoacalasia, no calsia, trastornos motores esofágicos, vaginismo, temblor por inmovilización posoperatoria, disfunción vesical, discinesias de reinervación, hoyuelos mentalis, síndrome de persona rígida, hiperplasia prostática tetánica, adipositas, tratamiento parálisis cerebral infantil estrabismo, paralítico mixto concomitante, después de cirugía de desprendimiento de retina, después de cirugía de cataratas, en afaquia estrabismo miosítico, estrabismo miopático, desviación vertical disociada adjunto a la cirugía de estrabismo, esotropía, exotropía, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glándulas exocrinas, síndrome de Frey, síndrome de lágrimas de cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea plantar palmar axilar, hipersalivación relativa en ictus, en Parkinson, en esclerosis lateral amiotrófica, condiciones espásticas, en cefalitis y mielitis procesos autoinmunes, esclerosis múltiple, mielitis transversa, síndrome de Devic, infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fúngicas, en paraparesia espástica hereditaria síndrome posapopléctico infarto hemisférico, infarto del tronco encefálico, infarto medular, en traumatismos del sistema nervioso central, lesiones hemisféricas, lesiones de tronco encefálico, lesión medular, en hemorragia del sistema nervioso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea, hemorragia subdural, hemorragia intraespinal, en neoplasias, tumores hemisféricos, tumores de tronco encefálico, tumor medular y vaginismo. Se selecciona un uso cosmético entre el tratamiento o la reducción de arrugas como patas de gallo o GFL, fruncir el ceño, asimetrías faciales.

La Figura muestra:

Figura 1: Diagrama que representa el modo de acción del ensayo en base a células de la invención. Las células susceptibles a la intoxicación por BoNT/E se siembran en placas de pocillos múltiples, posteriormente, las células se intoxican con BoNT/E y después de un período de intoxicación dado las células se fijan. El anticuerpo específico para SNAP-25 escindido por BoNT/E y el anticuerpo específico para SNAP-25 sin escindir se unen a los sitios de unión específicos en SNAP-25. Mediante el uso de anticuerpos secundarios específicos anti-huésped acoplados a enzimas, estos eventos de unión se pueden usar para generar señales medibles que se correlacionan con la concentración de SNAP-25 escindido por BoNT/E y la cantidad total de SNAP-25 dentro del pocillo. Con el aumento de la concentración de BoNT/E, la cantidad que se mide de SNAP-25 que se escinde aumenta, lo que resulta en una ganancia de señal.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al sitio de escisión del sustrato SNaP-25 escindido por BoNT/E

Se han generado anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente al sitio de escisión del sustrato SNAP-25 escindido por BoNT/E mediante el uso de la técnica estándar de hibridoma. Con este fin, se han inmunizado ratones Balb/c (hembras, 8 semanas) con el péptido "C-NEIDTQNRQIDR-OH" (SEQ ID NO: 1). El residuo de cisteína N-terminal no se deriva de la secuencia de aminoácidos de SNAP-25, pero se ha introducido para unir el péptido a la hemocianina de lapa californiana (KLH). Se han obtenido células de hibridoma mediante la fusión de células de bazo de ratón con la línea celular de mieloma SP2/0-Ag14 (SP2/0) que se compra de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivo Celular (DSMZ GmbH, Braunschweig, ACC 146); ver también Hemmerlein y otros, Molecular Cancer 2006, 5, 41. Los anticuerpos que se unen específicamente al sitio de escisión del sustrato SNAP-25 escindido por BoNT/E se cribaron en ELISA. Los clones que se obtienen se han seleccionado con respecto a su especificidad y afinidad por SNAP-25 escindido por BoNT/E. Como control negativo, los clones que se han probado no se unen a SNAP-25206 sin escindir. Como resultado, se encontró que el anticuerpo monoclonal de ratón que se produce por el hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 era altamente específico para SNAP-25 escindido por BoNT/E, sin reactividad cruzada detectable con SNAP25206 en ELISA y T ransferencias Western.

La línea celular de hibridoma pCNEI 32-7-1, 3614-000 que produce el anticuerpo monoclonal de la descripción que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E se ha depositado por el solicitante bajo el Tratado de Budapest el 17 de diciembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania bajo el número de acceso DSM ACC3261. Las secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de este anticuerpo monoclonal son mostradas en las SEQ ID NO. 18, 19 y 20, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de este anticuerpo monoclonal son mostrados en las SEQ ID NO. 15, 16 y 17, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la región VH de este anticuerpo monoclonal se representa en SEQ ID NO. 22, y la secuencia de aminoácidos de la región VL de este anticuerpo monoclonal es mostrado en SEQ ID NO. 21.

Ejemplo 2: ELISA de actividad de doble fluorescencia-CB-BoNT/E

Fijación de células

1. Eliminar la solución de medio/toxina. Añadir 100 pl/pocillo de metanol helado (-20 °C) e incubar por 20 min a -20 °C.

Nota: Realizar todas las etapas posteriores a temperatura ambiente.

Después de la fijación de células:

1. Eliminar la solución de metanol y añadir 100 pl/pocillo de tampón PBS. Para un almacenamiento más prolongado (> 1 día) se deben añadir 300 pl/pocillo de tampón PBS y sellar las placas con parafilm. Las placas se deben almacenar en el refrigerador.

2. Eliminar el tampón PBS y lavar las células 3 veces con 300 pl/pocillo de tampón PBS. Cada etapa se debe realizar por 1 minuto con agitación suave.

3. Eliminar el tampón PBS y añadir 100 pl/pocillo de tampón de inactivación e incubar por 20 minutos con agitación suave.

4. Eliminar el tampón de inactivación y lavar las células una vez con 300 pl/pocillo de tampón PBS por 3 minutos bajo agitación suave.

5. Eliminar el tampón PBS y, añadir 200 pl/pocillo de tampón de bloqueo e incubar por 1 hora con agitación suave.

6. Eliminar el tampón de bloqueo y añadir 100 pl de la mezcla de anticuerpos primarios (dilución de anticuerpos en tampón de bloqueo) a cada pocillo. Incubar durante la noche (16-18 h) con agitación suave. Las células se incuban simultáneamente con dos anticuerpos primarios: un anticuerpo de ratón específico para SNAP25 escindido por BoNT/E y un anticuerpo de conejo policlonal que reconoce SNAP-25 (anticuerpo para determinar la cantidad total de SNAP-25 para la normalización).

7. Eliminar la mezcla de anticuerpos primarios y lavar las células 4 veces con 300 pl de tampón PBS. Cada etapa se debe realizar por 3 minutos con agitación suave.

9. Eliminar el tampón PBS y añadir 100 pl de la mezcla de anticuerpos secundarios: anticuerpos secundarios anti­ ratón conjugados con HRP y anti-conejo conjugados con AP (dilución de anticuerpos en tampón de bloqueo) a cada pocillo e incubar por 2,5-3 horas con agitación suave.

10. Eliminar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las células 6 veces con 300 pl/pocillo de tampón HEPES. Cada etapa de lavado se debe realizar por 3 minutos con agitación suave.

11. Eliminar el tampón HEPES de la placa y añadir 75 pl de un sustrato fluorogénico para peroxidasa de rábano picante (sustrato de HRP) a cada pocillo. Incubar por 50 minutos con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.

12. Añadir 75 pl de un sustrato fluorogénico para fosfatasa alcalina (sustrato de AP) a cada pocillo e incubar por 50 minutos adicionales a temperatura ambiente con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.

13. Leer las placas mediante el uso de un lector de placas de fluorescencia:

excitación a 540 nm; emisión a 600 nm.

excitación a 360 nm; emisión a 450 nm.

15. Cálculo

Para la normalización, el valor de RFU para SNAP-25 escindido por BoNT/E (fluorescencia a 600 nm) se normaliza a RFU de SNAP-25 total (450 nm) en cada pocillo. Para una mejor ilustración de las RFU en un diagrama todos los valores se multiplican por un factor de 1000 mediante el uso de la siguiente ecuación:

RFU (600 nm)

----- - ------ —x 1000

RFU (450 nm)

Posteriormente los valores de RFU que resultan se promedian para cada estándar o muestra.

Preparación de reactivos

Tampón PBS (10 mM):

Solución salina tamponada con fosfato (Sigma, # P5368) (pH 7,4)

Tampón de inactivación:

H²O² al 0,6 % en tampón PBS 10 mM (pH 7,4)

Tampón de bloqueo:

BSA al 2 % en tampón PBS 10 mM (pH 7,4)

Tampón HEPES:

HEPES 50 mM (pH 7,4)

Sustrato de HRP:

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. El uso de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E, en donde el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de CDR-L1 como se muestra en SEQ ⁱD NO. 15, CDR-L2 como se muestra en SEQ ID NO. 16, CDR-L3 como se muestra en SEQ ID NO. 17, CDR-H1 como se muestra en SEQ ID NO. 18, CDR-H2 como se muestra en SEQ ID NO. 19 y CDR-H3 como se muestra en SEQ ID NO. 20, comprendidas por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEl 32-7-1, 3614-000 que se depositó el 17 de diciembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso DSM ACC3261, para ensayos in vitro para medir la actividad biológica de BoNT/E.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 ("C-NEIDTQNRQIDR") o SEQ ID NO: 2 ("NEIDTQNRQIDR").

3. El uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende la región VH como se muestra en SEQ ID NO. 22 y la región VL como se muestra en SEQ ID NO. 21 comprendidas por el anticuerpo monoclonal que se produce por la línea celular de hibridoma pCNEl 32-7-1, 3614-000 que se depositó el 17 de diciembre de 2014 en DSM^z - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso DSM ACC3261.

4. Un método in vitro para determinar directamente la actividad biológica de BoNT/E en células, que comprende las etapas de:

a) incubar las células susceptibles a intoxicación por BoNT/E con BoNT/E por un tiempo y bajo condiciones que permitan que la BoNT/E ejerza su actividad biológica;

b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente;

c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a SNAP-25 sin escindir y escindido por BoNT/E, y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente a SNAP-25 escindido por BoNT/E, bajo condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo de captura a SNAP-25 sin escindir y escindido por BoNT/E y la unión del segundo anticuerpo de captura a SNAP-25 escindido por BoNT/E, en donde el segundo anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, para formar así primeros complejos de detección y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, para formar así segundos complejos de detección, y en donde el primer anticuerpo de detección es diferente del segundo anticuerpo de detección;

e) determinar la cantidad de los primeros y segundos complejos de detección de la etapa d); y

f) calcular la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en dichas células mediante los segundos complejos de detección,

para determinar de este modo la actividad biológica de dicha BoNT/E en dichas células.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la BoNT/E comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO. 12 o SEQ ID NO: 14; y b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO. 12 o SEQ ID NO: 14.

6. El método de la reivindicación 4 o 5, en donde las células son células neuronales o células diferenciadas neuronales seleccionadas del grupo que consiste en: células neuronales primarias, células tumorales que son capaces de diferenciarse en células neuronales tales como células de neuroblastoma, células P19 o neuronas que se derivan de células madre pluripotentes inducidas (IPS).

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la fijación de las células se lleva a cabo mediante la adición de un agente de fijación seleccionado del grupo que consiste en: metanol, etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los mismos.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde dicho primer anticuerpo de captura que se une específicamente al SNAP-25 sin escindir y escindido por BoNT/E es el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684, el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19708 (Pierce Antibodies), el anticuerpo monoclonal de conejo anti-SNAP25 ab108990 (Abcam), o el anticuerpo policlonal de conejo anti SNAP25 PA5-19701 (Pierce Antibodies).

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el primer anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) o un anticuerpo conjugado con un tinte de fluorescencia.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde el segundo anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), un anticuerpo conjugado con glucosa oxidasa, un anticuerpo conjugado con tirosinasa o un anticuerpo con 13-galactosidasa.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde el sustrato de HRP es Amplex UltraRed, 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP) o ácido 3-(4-hidroxifenil) propiónico (HPPA).

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en donde el sustrato de AP es un derivado de 4-metilumbeliferilfosfato tal como 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilfosfato (DiFMUP) o difosfato de fluoresceína (FDP).

13. Un kit para llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, que comprende:

a) una distribución de un primer anticuerpo de captura, un segundo anticuerpo de captura que es un anticuerpo monoclonal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un primer anticuerpo de detección y un segundo anticuerpo de detección, en donde dicha distribución permite llevar a cabo los métodos de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12;

b) los medios para calcular la cantidad de SNAP-25 escindido por BoNT/E en base a las cantidades de los primeros y segundos complejos de detección que se determinan por la distribución de acuerdo con a); e c) instrucciones para llevar a cabo dicho método.