JP6522075B2 - 免疫基盤ボツリヌス毒素血清ａ型活性アッセイ - Google Patents

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Description

本発明は、免疫基盤ボツリヌス毒素血清Ａ型活性アッセイに関する。
本特許出願は３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）に準じて２００８年３月１４日出願の米国仮特許出願第６１／０３６７２３号に対する優先権を主張し、それをその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする。
例えばボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇならびに破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）のようなクロストリジウム毒素がニューロン伝達を阻止する能力は多様な治療的および美容的適用において活用されており、例えば非特許文献１を参照されたい。医薬組成物として市販により入手可能なクロストリジウム毒素には、例えばBOTOX（登録商標）（Allergan, Inc., Irvine, CA）、DYSPORT（登録商標）／RELOXIN（登録商標）、（Ipsen Ltd., Slough, England）、PURTOX（登録商標）（Mentor Corp., Santa Barbara, CA）、XEOMIN（登録商標）（Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Germany）、NEURONOX（登録商標）（Medy−Tox, Inc., Ochang−myeon, South Korea）、ＢＴＸ−Ａ（Biogen−tech Ltd., University, Yantai, Shandong, China）のようなＢｏＮＴ／Ａ調製物；および例えばMYOBLOC（登録商標）／NEUROBLOC（登録商標）（Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, CA）のようなＢｏＮＴ／Ｂ調製物が含まれる。実例としてはBOTOX（登録商標）は現在米国において痙性斜頸に関連する頭部位置異常および頸部疼痛の重篤度を低下させるための成人の痙性斜頸の処置；局所薬で十分に管理がされない重篤な原発性腋窩多汗症の処置；ならびに１２歳以上の患者における良性本態性眼瞼痙攣または第ＶＩＩ神経傷害を含むジストニアに関連する斜視および眼瞼痙攣の処置に関して承認されている。
現在のところ致死試験であるマウスＬＤ５０バイオアッセイは依然その調製物の効力を表現するために全ての製薬業者により使用される「ゴールドスタンダード」である。非特許文献２。実際に、医薬製剤のラベルの単位はマウスＬＤ５０単位であり、そして統計的に有用なＬＤ５０データを生成するために必要な動物の数は多い。マウスＬＤ５０バイオアッセイの有利な点は、例えば軽鎖酵素活性のみを測定するインビトロアッセイのような単にこの中毒過程の一部のみに関する活性を決定する代わりに、ボツリヌス毒素取り込みに必要な工程を全て測定するということである（例えば細胞表面受容体への毒素結合、毒素−受容体複合体の内部移行、細胞質への軽鎖転位置、基質の軽鎖切断）。不幸にもマウスＬＤ５０バイオアッセイは、多数の実験動物が必要とされるための高い操作コスト、全てのＢｏＮＴ血清型が同じ測定可能なエンドポイントを引き起こすであろうから、特異性の欠如、および大きな動物群を使用しない場合の不正確さの潜在を含む多くの欠点に悩まされる。加えて動物保護団体が動物試験を低減し、そしてさらに重要なことには製品リリースのためのマウスＬＤ５０バイオアッセイを替えるように米国（ＦＤＡ／ＮＩＣＥＡＴＭ／ＩＣＣＶＡＭ）および欧州（ＭＨＲＡおよびＥＤＱＭ）の監督官庁、ならびにボツリヌス神経毒生成物を製造する製薬会社に圧力をかけている。監督官庁は製薬会社に、ボツリヌス神経毒の効力試験に対する３つの「Ｒ」原理：低減する（Reduce）、洗練する（Refine）、置き換える（Replace）；を適用するように約束させている。「ボツリヌス毒素Ａ型の効力試験に対する３つのＲの適用における進歩」非特許文献３。近年では、プロトコールを標準化し、そしてアッセイあたりにより少ない動物を使用してさらに一貫したデータを生成するために、マウスＬＤ５０バイオアッセイを低減および洗練するいくつかの工程が既に採用されている。
William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin（Slack, Inc., 2004） S. S. Arnon et al., JAMA 285：1059−1070（2001） D. Straughan, Altern. Lab. Anim. 34（3）：305−313（2006）
故に、かかる非動物基盤のアッセイにより動物試験の必要性が軽減され、そしてこの型の動物基盤のアッセイに随伴される全ての不利な点、経費および倫理的な問題が軽減されるので、ボツリヌス毒素取り込みに必要な全ての工程の完全性を評価することができる、簡単で、信頼性のある、検証された、そして行政機関が受け入れ可能なボツリヌス毒素活性アッセイは有意に価値のあるものであろう。
本明細書は例えば医薬品および食品産業のような種々の産業に有用なボツリヌス毒素Ａの活性を検定するための新規組成物、細胞および方法を提供し、そして同様に関係する有利な点を提供する。かかる組成物、細胞および方法は生存動物または生存動物から取られた組織を使用しないが、神経毒作用に必要な工程を全て評価することができる。
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕ａ．ＢｏＮＴ／Ａにより切断可能である配列番号：５を含むヒトＳＮＡＰ−２５の少なくとも一部から本質的になるＳＮＡＰ−２５ポリペプチドを発現する確立された細胞株からの細胞を、ＢｏＮＴ／Ａを含むことが疑われる被験試料と接触させること、
ここで該確立された細胞株は、配列番号：３８のカルボキシル末端グルタミンを含むＳＮＡＰ−２５切断生成物を生じるようにＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；
ｂ．該細胞からＳＮＡＰ−２５切断生成物を単離すること；
ｃ．ＳＮＡＰ−２５切断生成物を固相支持体に連結された抗ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、
ここで該抗ＳＮＡＰ−２５抗体は、０．４５０ｎＭ未満の平衡解離定数で配列番号：３８のカルボキシ末端アミノ酸配列を含むエピトープに結合し、該抗ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：５を含むインタクトなＳＮＡＰ−２５ポリペプチドのエピトープに関して１ｘ１０１Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有する；
ｄ．抗ＳＮＡＰ−２５抗体および配列番号：３８のカルボキシル末端アミノ酸配列を含むＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；
ｅ．被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ａ−ｄを行うこと、
ここで陰性対照試料は、バッファ、またはＢｏＮＴ／Ａ活性を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに
ｇ．工程ｄで検出された被験試料の抗体−抗原複合体の量を工程ｅにおいて検出された陰性対照試料の抗体−抗原複合体の量と比較すること、
ここで陰性対照試料における抗体−抗原複合体の量よりも多い抗体−抗原複合体の量は、被験試料におけるＢｏＮＴ／Ａ活性の存在を示す；
の工程を含んでなる、試料中のボツリヌス神経毒血清Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）活性を検出する方法、
〔２〕抗体−抗原複合体の存在の検出がサンドイッチイムノアッセイの使用により行われる〔１〕に記載の方法、
〔３〕該確立された細胞株がＳｉｍａ細胞株（ＤＳＭＺ番号１６４）に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕該確立された細胞株がＮｅｕｒｏ−２ａ細胞株（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−１３１ＴＭ）に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔５〕(i)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９５（ＣＤＲ１）、配列番号：９９（ＣＤＲ２）および配列番号：１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０３（ＣＤＲ１）、配列番号：１０８（ＣＤＲ２）および配列番号：１１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
(ii)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９３（ＣＤＲ１）、配列番号：９６（ＣＤＲ２）および配列番号：１００（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０５（ＣＤＲ１）、配列番号：１１０（ＣＤＲ２）および配列番号：１１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
(iii)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９３（ＣＤＲ１）、配列番号：９７（ＣＤＲ２）および配列番号：１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０４（ＣＤＲ１）、配列番号：１０９（ＣＤＲ２）および配列番号：１１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
(iv)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）および配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０７（ＣＤＲ１）、配列番号：１１２（ＣＤＲ２）および配列番号：１１７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
(v)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）および配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１１１（ＣＤＲ２）および配列番号：１１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、または
(vi)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９３（ＣＤＲ１）、配列番号：９７（ＣＤＲ２）および配列番号：１００（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１１１（ＣＤＲ２）および配列番号：１１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
〔１〕〜〔４〕いずれかに記載の方法
に関する。
本発明により、免疫基盤ボツリヌス毒素血清Ａ型活性アッセイが提供され得る。
図１は中枢および抹消ニューロンにおける神経伝達物質放出およびクロストリジウム毒素中毒の現行のパラダイムの概略図を示す。図１Ａは中枢および抹消ニューロンの神経伝達物質放出メカニズムに関する概略図を示す。放出過程を２つの工程を含んでなるように記載することができる：１）小胞ドッキング、ここで神経伝達物質分子を含有する小胞結合ＳＮＡＲＥタンパク質は細胞膜に位置する膜結合ＳＮＡＲＥタンパク質と会合する；および２）神経伝達物質放出、ここで小胞は細胞膜と融合し、そして神経伝達物質分子はエキソサイトーシスによって排出される。 図１Ｂは中枢および抹消ニューロンにおける破傷風およびボツリヌス毒素活性の中毒メカニズムの概略図を示す。この中毒過程を４つの工程を含んでなるように記載することができる：１）受容体結合、ここでクロストリジウム毒素はクロストリジウム受容体複合体に結合し、そして中毒過程を開始する；２）複合体内部移行、ここで毒素結合後、毒素／受容体系複合体を含有する小胞はエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる；３）軽鎖転位置、ここで小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含んでなるチャネルポアの形成、クロストリジウム毒素重鎖からの軽鎖の分離、および軽鎖の放出を含む複数の事象が生じると考えられる；ならびに４）酵素による標的修飾、ここでクロストリジウム毒素の軽鎖は例えばＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンのようなその標的ＳＮＡＲＥ基質をタンパク質分解により切断し、それにより小胞ドッキングおよび神経伝達物質放出を防御する。 図２はウェスタンブロット分析による４つの細胞株におけるＢｏＮＴ／Ａ取り込みの比較を示す。図２Ａは細胞株を処理するために使用されたＢｏＮＴ／Ａの量に基づいて検出されたＳＮＡＰ−２５切断生成物のグラフを示す。４パラメーターロジスティックモデルを用いてSigmaPlotでデータを分析し、そして各細胞株に関してＥＣ５０値を得た。検出されたＳＮＡＰ−２５切断生成物シグナルのランキングは：ＳｉＭａ＞＞Ｎｅｕｒｏ−２ａ＞ＬＡ１−５５ｎ＞ＰＣ１２であった。図２Ｂは３００ｐＭ対０ｐＭおよび１.２ｐＭ対０ｐＭでの生シグナルのシグナル対ノイズ比がアッセイに関して計算されたことを示す。ＳｉＭａ細胞は最高のシグナル対ノイズ比および最低のＥＣ５０値を生じた。 図３は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法において有用な確立された細胞株のための細胞分化培地の最適化を示す。 図４は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法において有用な確立された細胞株を含んでなる細胞のための細胞分化時間の最適化を示す。 図５は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法において有用な確立された細胞株を含んでなる細胞のＢｏＮＴ／Ａ処理の最適化を示す。結果により、試験されたいずれかのＢｏＮＴ／Ａ処理で２ｐＭ未満のＥＣ５０が達成されたことが示される。 図６は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法の感度を示す。結果により、細胞によるＢｏＮＴ／Ａの取り込みには、バックグラウンドを超えた有意量のＳＮＡＰ−２５切断生成物を生成する前に１分未満しかかからなかったことが示される。 図７は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法の特異性を示す。結果により、本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法はＢｏＮＴ／Ａ中毒に関与する全ての工程を測定できることが示される。 図８は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を用いてＢｏＮＴ／Ａ複合体で処理された分化型ＳｉＭａ細胞の用量応答曲線を示す。 図９は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を用いてＢｏＮＴ／Ａの医薬品を処方するための免疫基盤ＢｏＮＴ／Ａ活性アッセイの結果を示す。 図１０は本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を用いたヒト血清中のα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の検出を示す。
［詳細な説明］
本明細書は試料中の活性なＢｏＮＴ／Ａの存在または不在を決定するため、およびＢｏＮＴ／Ａ調製物の活性／効力を決定するための新規アッセイを提供する。本明細書にて開示される新規の細胞基盤のアッセイは、アッセイが試料中のピコモル濃度量のＢｏＮＴ／Ａを検出することを可能にする細胞、試薬および検出方法に頼る。本明細書に開示される細胞基盤のアッセイは動物毒性研究に関する必要性を低減し、しかも多機能ＢｏＮＴ／Ａ、すなわち毒素の結合および細胞取り込み、細胞サイトゾルへの転位置、およびプロテアーゼ活性を分析するのに役立つ。さらに後記で論じるように、新規方法および組成物は粗製およびバルク試料ならびに高度に精製された二鎖毒素および処方された毒素生成物を分析するために使用することができ、そしてさらに自動ハイスループットアッセイ形式で扱いやすい。
故に本明細書に開示される１つの態様はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成するための組成物を提供する。組成物はアジュバントおよびＳＮＡＰ−２５抗原、ＳＮＡＰ−２５抗原に連結された担体またはＳＮＡＰ−２５抗原に連結された可動性スペーサーに連結された担体を含む組成物を含んでなることができ、ここで可動性リンカーはＳＮＡＰ−２５抗原と担体の間に介在する。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する免疫応答を誘発する任意のおよび全てのＳＮＡＰ−２５抗原が、限定するものではないが、天然発生ＳＮＡＰ−２５から誘導されるＳＮＡＰ−２５抗原、非天然発生ＳＮＡＰ−２５から誘導されるＳＮＡＰ−２５抗原、およびＳＮＡＰ−２５、天然発生ＳＮＡＰ−２５または非天然発生ＳＮＡＰ−２５からのＳＮＡＰ−２５の免疫反応生フラグメントを含んでなるＳＮＡＰ−２５抗原を含むＳＮＡＰ−２５抗原として有用であり得ることが想定される。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成するために有用なＳＮＡＰ−２５抗原には限定するものではないが、限定するものではないが配列番号：３８を含む担体ペプチドに連結されたカルボキシル化されたＣ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５ペプチドを含んでなるＳＮＡＰ−２５抗原が含まれる。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を作成するために有用なその他の組成物には限定するものではないが、カルボキシル化されたＣ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原に連結された可動性リンカーに連結された担体を含んでなる組成物が含まれ、ここで可動性リンカーはＳＮＡＰ−２５抗原と担体の間に介在する。限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、フロイント完全および不完全アジュバントを含む任意のおよび全てのアジュバントがかかる組成物において有用であり得ることが想定される。
本明細書に開示される別の態様は、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する方法を提供する。この方法の態様は（ａ）本明細書において開示される組成物を動物に投与すること；（ｂ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体生成細胞を含有する試料を動物から収集すること；および（ｃ）試料からα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離すること；の工程を含んでなる。開示された方法はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体、またはＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体のいずれかを作成するために有用である。
本明細書に開示されるさらに別の態様はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を提供する。かかるα−ＳＮＡＰ−２５抗体は天然発生および非天然発生抗体、ならびにモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはポリクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体の双方を含む。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体として有用なモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体には限定するものではないが、ハイブリドーマ細胞株１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２から生成されたモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体が含まれる。
本明細書に開示されるなお別の態様はＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法を提供する。この方法の態様は（ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること；ならびに（ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなる。工程ｃのα−ＳＮＡＰ−２５抗体は場合によっては固相支持体に連結され得る。
本明細書に開示されるなお別の態様はＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法を提供する。この方法の態様は（ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること；ならびに（ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなる。工程ｃのα−ＳＮＡＰ−２５抗体は場合によっては固相支持体に連結され得る。
本明細書に開示されるさらなる態様は哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法を提供する。この方法の態様は（ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；（ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること；（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；（ｆ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ａ−ｅを繰り返すこと；ならびに（ｇ）工程（ｅ）で検出された抗体−抗原複合体の量を工程（ｆ）で検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、ここで工程（ｆ）で検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程（ｅ）で検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；の工程を含んでなる。工程ｄのα−ＳＮＡＰ−２５抗体は場合によっては固相支持体に連結されていてよい。工程ｆにおける対照試料はまた陰性対照試料に加えて陽性対照試料を含むこともできる。
ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、クロストリジウム・バラティ（Clostridium baratii）およびクロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）により生成されるクロストリジウム毒素はヒトおよびその他の哺乳動物の治療的および美容的処置において最も広く用いられているものである。ボツリヌス菌の株は７つの抗原的に区別されるボツリヌス毒素の血清型（ＢｏＮＴ）を生成し、それはヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／ＥおよびＢｏＮＴ／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１およびＢｏＮＴ／Ｄ）または土壌から単離されたもの（ＢｏＮＴ／Ｇ）におけるボツリヌス症激増を調査することにより同定されている。７つ全てのボツリヌス毒素血清型は類似の構造および生物学的特性を有するが、各々はまた例えば異なる薬理学的特性のような異種性の特徴をも表示する。対照的に、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）は破傷風菌の均一の群により生成される。クロストリジウムの２つのその他の種、クロストリジウム・バラティおよびクロストリジウム・ブチリクムもまた各々ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｅに類似する毒素を生成する。
クロストリジウム毒素は各々およそ１５０ｋＤの一本鎖ポリペプチドとして翻訳され、それは引き続いて例えば内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼまたは環境において生成される天然発生プロテアーゼのような天然発生プロテアーゼによりジスルフィドループ内でタンパク質分解切断により切断される。この翻訳後プロセシングにより、単一のジスルフィド結合および非共有結合性相互作用により一緒に維持されるおよそ５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）およびおよそ１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含んでなる二鎖分子を生じる。各成熟二鎖分子は３つの機能的に区別されるドメイン：１）神経伝達物質放出装置のコア構成要素を特異的にターゲティングする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含有するメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣに位置する酵素ドメイン；２）細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのＬＣの放出を促進するＨＣ（ＨＮ）のアミノ末端側の半分内に含有される転位置ドメイン；および３）標的細胞の表面に位置する受容体複合体に対する毒素の結合活性および結合特異性を決定するＨＣ（ＨＣ）のカルボキシル末端側の半分内に見出される結合ドメイン；を含んでなる。
３つの機能的ドメインの結合、転位置および酵素活性は全て毒性のために必要である。この過程の全ての詳細は依然正確には解っていないが、クロストリジウム毒素がニューロンに侵入し、そして神経伝達物質放出を阻止する全体的な細胞中毒メカニズムは血清型またはサブタイプに関わらず類似する。出願人は以下の記載により限定されることを決して望まないが、中毒メカニズムを少なくとも４つの工程を含んでなるように記載することができる：１）受容体結合；２）複合体内部移行；３）軽鎖転位置；および４）酵素による標的修飾（図１）。クロストリジウム毒素のＨＣドメインが、標的細胞の細胞膜表面に位置する毒素特異的受容体系に結合したときにその過程は開始される。受容体複合体の結合特異性は、明確にクロストリジウム毒素受容体複合体を含んでなると思われるガングリオシドおよびタンパク質受容体の具体的な組み合わせにより一部では達成されると考えられる。一度結合すると、毒素／受容体複合体はエンドサイトーシスにより内部移行し、そして内部移行した小胞は特異的な細胞内経路に分類される。転位置工程は小胞区画の酸性化により誘発されると思われる。この工程は疎水性を増大し、ポア形成を促進し、そして毒素の重および軽鎖の分離を促進する重要なｐＨ依存性構造再構成を開始するようである。一度分離されると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼは細胞内小胞からサイトゾルへ放出され、そこでそれは神経伝達物質放出装置のコア構成要素を特異的にターゲティングすると思われる。これらのコアタンパク質、小胞随伴膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム随伴タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）およびシンタキシンはシナプス小胞ドッキングおよび神経末端での融合に必要であり、そして可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成する。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅはカルボキシル末端領域でＳＮＡＰ−２５を切断して、各々９個または２６個のアミノ酸フラグメントを放出し、そしてＢｏＮＴ／Ｃ１はまたカルボキシル末端近くでＳＮＡＰ−２５を切断して８個のアミノ酸フラグメントを放出する。ボツリヌス血清型ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風毒素はＶＡＭＰの保存された中心部分で作用し、そしてＶＡＭＰのアミノ末端部分をサイトゾルに放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は細胞質膜表面近くの単一の部位でシンタキシンを切断する。シナプス性ＳＮＡＲＥの選択的タンパク質分解はクロストリジウム毒素によりインビボで引き起こされる神経伝達物質放出の遮断を説明する。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は種々の非ニューロン型のエキソサイトーシスに共通する；これらの細胞では、ニューロンと同様に軽鎖ペプチダーゼ活性はエキソサイトーシスを阻止し、例えば「どのようにボツリヌスおよび破傷風神経毒が神経伝達物質放出を遮断するか」Yann Humeau et al., Biochimie. 82（5）：427−446（2000）；「ボツリヌスおよび破傷風神経毒：構造、機能および治療的利用性」Kathryn Turton et al., Trends Biochem. Sci. 27（11）：552−558（2002）；「ニューロンにおける破傷風およびボツリヌス神経毒の行程」Giovanna Lalli et al. Trends Microbiol. 11（9）：431−437（2003）を参照されたい。
本開示の態様は一部ではＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成するための組成物を含んでなる。本開示のその他の態様は一部ではＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成するための免疫応答誘起組成物を含んでなる。本明細書で使用される際には「免疫応答誘起組成物」なる用語はＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなる組成物を指し、それは動物に投与された場合、ＳＮＡＰ−２５抗原に対する免疫応答を刺激し、それによりＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する。「免疫応答」なる用語は動物の免疫系による免疫応答誘起組成物に対する任意の応答を指す。免疫応答の実例には、限定するものではないが、例えばＣＤ８＋ＣＴＬの抗原特異的誘起を含むＣＴＬ応答、Ｔ細胞増殖応答およびサイトカイン放出を含むヘルパーＴ細胞応答、ならびに例えば抗体生成応答を含むＢ細胞応答のような、細胞ならびに局所性および全身性液性免疫が含まれる。「免疫応答を誘起する」なる用語は免疫応答誘起組成物または免疫応答誘起組成物をコードするポリヌクレオチドの投与をさし、ここで免疫応答は影響を受ける、すなわち刺激、開始または誘起される。
組成物はＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなる。本明細書で使用される際には「抗原」なる用語は免疫応答を引き出す分子を指し、そして限定するものではないが、ペプチド、多糖類および例えばリポタンパク質および糖脂質のような脂質の抱合体を含む。本明細書で使用される際には「ＳＮＡＰ−２５抗原」なる用語は免疫応答を引き出すことができるＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有する任意の抗原を指す。免疫応答誘起組成物において使用されるＳＮＡＰ−２５抗原は配列が実質的に独特であるために十分に大きくなければならず、故にＳＮＡＰ−２５以外の抗原に対して交差反応性である抗体を生成する可能性を低減する。加えて免疫応答誘起組成物において使用されるＳＮＡＰ−２５抗原は実質的にＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に対してのみ免疫応答を誘発するために十分に小型でなければならず、故にＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５をＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を欠如するＳＮＡＰ−２５と区別することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する可能性が増大する。さらに再現性よく選択的である良好な収率で、そしてそれは高度に感受性のアッセイの設計を可能にするために許容されるアビディティーで結合する単一のアミノ酸配列のα−ＳＮＡＰ−２５抗体を作成することも非常に望ましい。
ＳＮＡＰ−２５に存在するＢｏＮＴ／Ａ切断部位を取り囲む配列はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’として示され、Ｐ１−Ｐ１’は切断可能結合を表す。ＢｏＮＴ／Ａによる切断時に、生成された得られた切断生成物はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列を含むフラグメントおよびＰ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’を含むフラグメントを含んでなる。故に本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５」なる用語はそのカルボキシル末端アミノ酸としてＰ１残基を有する任意のＳＮＡＰ−２５を指す。例えばヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号：５）のＱ１９７−Ｒ１９８はＢｏＮＴ／Ａ切断部位に関するＰ１−Ｐ１’切断可能結合を表す。そのように「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５」はそのカルボキシル末端アミノ酸でグルタミンを有する任意のＳＮＡＰ−２５切断生成物であり、ここでグルタミンは切断可能結合のＱ１９７を表す。別の実例として、トルペド・マルモラータ（Torpedo marmorata）ＳＮＡＰ−２５のＫ２０４−Ｈ２０５（配列番号：１６）はＢｏＮＴ／Ａ切断部位に関するＰ１−Ｐ１’切断可能結合を表す。そのように「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端リジンを有するＳＮＡＰ−２５」はそのカルボキシル末端アミノ酸でリジンを有する任意のＳＮＡＰ−２５切断生成物であり、ここでリジンは切断可能結合のＫ２０４を表す。
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原を修飾して、ＳＮＡＰ−２５抗原、ハプテンまたは、修飾を随伴しない場合に免疫原性、非免疫原性もしくは弱い免疫原性である任意のその他の抗原性化合物の免疫原性を増強することができる。この実施態様の態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原の切断可能結合からのカルボキシル末端Ｐ１残基をカルボキシル化することができる。カルボキシル化により２つの点でＳＮＡＰ−２５抗原の望ましい免疫原特性が増大する。第１に荷電したアミノ酸は免疫原性を増強するので、カルボキシル末端残基へのＣＯＯ−基の付加はＳＮＡＰ−２５抗原の全体的な免疫原性を増大するであろう。第２に、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基は切断時に荷電した状態であるので、カルボキシル末端残基へのＣＯＯ−基の付加は、本明細書に開示されるα−ＳＮＡＰ−２５抗体が結合するように設計された実際の抗原をより良好に擬似するであろう。
この実施態様の態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原を例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）または多重付着ペプチド（multiple attachment peptide）（ＭＡＰ）のような担体タンパク質に付着させるのに適合したアミノ酸の付加により、ＳＮＡＰ−２５抗原からのアミノ末端残基を修飾することができる。例えば担体タンパク質ＫＬＨを抱合するためにシステイン残基をアミノ末端で置き換えることができる。
故に実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は例えば少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０アミノ酸長でよい。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は例えば多くても５、多くても６、多くても７、多くても８、多くても９、多くても１０、多くても１１、多くても１２、多くても１３、多くても１４、多くても１５、多くても１６、多くても１７、多くても１８、多くても１９、多くても２０、多くても２５または多くても３０アミノ酸長でよい。さらに別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は例えば７−１２アミノ酸の間、１０−１５アミノ酸の間または１３−１８アミノ酸の間でよい。
別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３２を含んでなる。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：１４７または配列番号：１４８を含んでなる。さらなる実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３８を含んでなる。
なお別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３９を含んでなる。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４を含んでなる。さらなる実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：４５を含んでなる。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する免疫応答を誘発する任意のおよび全てのＳＮＡＰ−２５抗原がＳＮＡＰ−２５抗原として有用であり得ると想定される。故に配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：１４７または配列番号：１４８を含んでなるアミノ酸配列バリアントは、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する免疫応答を誘発するためのＳＮＡＰ−２５抗原として有用であり得る。故に実施態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：１４７または配列番号：１４８を含んでなるＳＮＡＰ−２５抗原に対する少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５個のアミノ酸置換、欠失または付加を置換することができる。さらに別の実施態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：１４７または配列番号：１４８を含んでなるＳＮＡＰ−２５抗原に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し得る。
担体を随伴しない場合に免疫原性、非免疫原性または弱い免疫原性であるＳＮＡＰ−２５抗原の免疫原性を増強するために、１つまたはそれより多い担体をＳＮＡＰ−２５抗原に連結できるということは想定される。非限定例には例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）または多重付着ペプチド（ＭＡＰ）が含まれる。当分野において周知であるように、抗原を担体に結合することにより非抗原性または弱い抗原性の抗原を抗原性にすることができる。種々のその他の担体および抗原を担体に結合する方法は当分野において周知である。例えばHarlow and Lane, supra, 1998a；Harlow and Lane, supra, 1998b；およびDavid W. Waggoner, Jr.ら、「免疫原性増強担体およびその組成物ならびに同一物を使用する方法」米国特許出願公開第２００４／００５７９５８号（２００４年３月２５日）参照。エピトープを融合タンパク質として発現することによりエピトープを作成することもできる。ポリペプチド融合体を発現するための方法は、例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology（Supplement 47）, John Wiley & Sons, New York（1999）に記載されるように当業者に周知である。ＳＮＡＰ−２５抗原のカルボキシル終端はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でなければならないので、担体はＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ端に連結されていなければならない。
可動性リンカーを随伴しない場合に免疫原性、非免疫原性または弱い免疫原性であるＳＮＡＰ−２５抗原の免疫原性を増強するために、１つまたはそれより多い可動性スペーサーをＳＮＡＰ−２５抗原に連結できるということは想定される。可動性スペーサーはＳＮＡＰ−２５抗原の全体的なペプチド長を増大し、そして可動性を提供し、それによりＳＮＡＰ−２５抗原の免疫細胞への適切な提示を促進する。非限定例としては、組成物はＳＮＡＰ−２５抗原を免疫細胞により良好に提示するために１つまたはそれより多い可動性スペーサーに直列に連結されたＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなることができ、それにより免疫応答を促進する。
ペプチドを含んでなる可動性スペーサーは少なくとも１アミノ酸長であり、そして例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはセリンのような短い側鎖Ｒ基を伴う非荷電アミノ酸を含んでなる。故に実施態様では、可動性スペーサーは例えば少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０アミノ酸長でよい。別の実施態様では、可動性スペーサーは例えば少なくとも１、多くても２、多くても３、多くても４、多くても５、多くても６、多くても７、多くても８、多くても９または多くても１０アミノ酸長でよい。さらに別の実施態様では、可動性スペーサーは例えば１−３アミノ酸の間、２−４アミノ酸の間、３−５アミノ酸の間、４−６アミノ酸の間または５−７アミノ酸の間でよい。可動性スペーサーの非限定例には、例えばＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号：５５）およびＧＧＧＧＳ（配列番号：５６）のようなＧスペーサーまたはＡＡＡ、ＡＡＡＡ（配列番号：５７）およびＡＡＡＡＶ（配列番号：５８）のようなＡスペーサーが含まれる。可動性スペーサーは融合タンパク質としてＳＮＡＰ−２５抗原にフレーム内で連結される。
前記で論じたように、可動性スペーサーを一部ではＳＮＡＰ−２５抗原の全体的なペプチド長を増大するために使用する。例えば５−１０アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は、３−５アミノ酸可動性スペーサーをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ端に連結することにより増大したその全体的な長さを有し得る。別の実例としては、５−１０アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は４−６アミノ酸可動性スペーサーをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ端に連結することにより増大したその全体的な長さを有し得る。別の実例としては、５−１０アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は７−１０アミノ酸可動性スペーサーをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ端に連結することにより増大したその全体的な長さを有し得る。別の実例としては、７−１２アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は１−３アミノ酸可動性スペーサーをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ端に連結することにより増大したその全体的な長さを有し得る。別の実例としては、７−１２アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は４−６アミノ酸可動性スペーサーをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ端に連結することにより増大したその全体的な長さを有し得る。可動性スペーサーにより提供された増大した長さにより、小型サイズのＳＮＡＰ−２５抗原の選択が可能になり、それによりＳＮＡＰ−２５抗原が実質的にＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に対してのみ免疫応答を誘発する見込みが増大し、故にＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５をＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を欠如するＳＮＡＰ−２５と区別することができるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する可能性が増大する。
本明細書に開示される組成物は場合によっては本明細書に開示されるＳＮＡＰ−２５抗原および１つまたはそれより多いアジュバントを含んでなることができるということは想定される。本明細書で使用される際には「アジュバント」なる用語は、ＳＮＡＰ−２５組成物を参照して使用される場合、ＳＮＡＰ−２５抗原に対する免疫応答を増大または多様化する任意の物質または物質の混合物を指す。アジュバントは例えば免疫化の数または保護免疫に必要な抗原の量を低減するために役立つ。免疫応答誘起組成物におけるアジュバントの使用は周知である。これらのアジュバントの主な目的は免疫応答の増大を可能にすることである。非限定的なアジュバントには、例えばリポソーム、限定するものではないが、例えばフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）；フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）のようなフロイント型のアジュバントを含む油相；例えばサポニン類のようなサポゲニン配糖体；カルボポール；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ムラミルジペプチドまたは「ＭＤＰ」として一般的に公知）；およびリポ多糖類（ＬＰＳ）が含まれる。かかるアジュバントは一般には水相を伴うエマルジョンの形態で使用されるか、またはさらに一般的には水不溶性無機塩からなってよい。これらの無機塩は例えば水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、水酸化鉄コロイド、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムからなってよい。水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）は一般的に使用されるアジュバントである。現在では、ヒトにおいて使用するための唯一のＦＤＡ承認アジュバントはアルミニウム塩（アラム）であり、それは抗原の沈澱により抗原を「貯留する」ために使用される。前記で提供されたアジュバントは単に実例である。実際にはアジュバントが免疫応答を誘起するために欠くことができない特徴を満足する限り、任意のアジュバントを本明細書に開示されるＳＮＡＰ−２５組成物において使用できる。
本明細書に開示される担体はまたアジュバントとしても作用し得る。特異的アジュバントならびに作成および使用の方法が例えばGupta et al. Vaccine, 11：993−306（1993）；Arnon, R.（Ed.）Synthetic Vaccines 1：83−92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.,（1987）；および「免疫原性増強担体およびその組成物ならびに同一物を使用する方法」David W. Waggoner, Jr.ら、米国特許出願公開第２００４／００５７９５８号（２００４年３月２５日）に記載される。さらなるアジュバントにはChapter 7 （pp 141−227）「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」（eds. Powell, M. F. and Newman, M. J.）Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Plenum Press（New York）に記載される任意の化合物が含まれる。この概論からの実例には、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびMontanide 720が含まれる。ポリイノシン：シトシン（ポリＩ：Ｃ）のような分子またはＣｐＧモチーフを含有するプラスミドＤＮＡをアジュバントとしてマイクロ粒子に被包された抗原と組み合わせて投与することもできる。別の実例では、アジュバントはリステリオリシン、ストレプトリシンまたはその混合物のような、抗原性化合物の細胞の細胞質への侵入を促進する薬剤である。
故に実施態様では、ＳＮＡＰ−２５組成物は担体ペプチドに連結されたカルボキシル化されたカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなる。この実施態様の態様では、カルボキシル化されたカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：１４７または配列番号：１４８を含んでなる。この実施態様の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３８を含んでなる。この実施態様の態様では、担体ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）または多重付着ペプチド（ＭＡＰ）である。
別の実施態様では、ＳＮＡＰ−２５組成物は担体ペプチドに連結されたカルボキシル化されたカルボキシル末端リジンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなる。この実施態様の態様では、カルボキシル化されたカルボキシル末端リジンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４を含んでなる。この実施態様の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：４５を含んでなる。この実施態様の態様では担体ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）または多重付着ペプチド（ＭＡＰ）である。
なお別の実施態様では、ＳＮＡＰ−２５組成物は１つまたはそれより多い可動性リンカーおよび担体ペプチドに連結されたカルボキシル化されたＣ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなり、ここで可動性リンカーはＳＮＡＰ−２５抗原と担体ペプチドの間に介在する。この実施態様の態様では、カルボキシル化されたカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：１４７または配列番号：１４８を含んでなる。別の実施態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：４６を含んでなる。この実施態様の態様では担体ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）または多重付着ペプチド（ＭＡＰ）である。この実施態様の態様では、可動性リンカーはＧスペーサーまたはＡスペーサーである。
さらに別の実施態様では、ＳＮＡＰ−２５組成物は可動性リンカーおよび担体ペプチドに連結されたカルボキシル化されたＣ末端リジンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなり、ここで可動性リンカーはＳＮＡＰ−２５抗原と担体ペプチドの間に介在する。この実施態様の態様では、カルボキシル化されたカルボキシル末端リジンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４を含んでなる。この実施態様の別の態様ではＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号：４７を含んでなる。この実施態様の態様では担体ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）または多重付着ペプチド（ＭＡＰ）である。この実施態様の態様では可動性リンカーはＧスペーサーまたはＡスペーサーである。
本開示の態様は一部ではＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成するための方法を含んでなる。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を当分野において周知である多様な方法により生成することができる。抗体を作成および使用し、ならびに検出し、そして抗体結合特異性、結合アフィニティーおよび結合アビディティーを測定するための具体的なプロトコールは当分野において公知である。例えばANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL（Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998a）；およびUSING ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL：PORABLE PROTOCOL No. I（Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998b）；Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2001；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 2004；「治療用ポリペプチド、同一物をコードする核酸および使用の方法」David Andersonら、米国特許第７０３４１３２号（２００５年４月２５日）；および「ＣＴＬＡ４に対する抗体」Beatriz M. Carrenoら、米国特許第７０３４１２１号（２００６年４月２５日）参照。
非限定例としては、例えばウサギ、ヤギ、マウスまたは別の哺乳動物のような動物に本明細書において開示される組成物の１回またはそれより多い注射で注射することにより、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を生成することができる。別の非限定例としては、本明細書において開示される組成物の１回またはそれより多い注射で例えば鶏卵のような卵を注射することにより、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を生成することができる。固定された抗原を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または細胞基盤の活性アッセイを用いるような標準的な技術により免疫された動物における抗体力価を経時的にモニタリングすることができる。所望によりＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体に関するポリクローナル抗体を哺乳動物（例えば血液から）単離し、そしてＩｇＧ分画を得るためにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのような周知の技術により、または抗体を生成するために使用されるペプチドに対するアフィニティー精製によりさらに精製することができる。
別の非限定例としては、ハイブリドーマ法を用いてＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を生成することができる。例えばChapter 6 Monoclonal Antibodies, pp. 196−244, Harlow & Lane, supra, 1998a；およびChapter 7 Growing Hybridomas, pp. 245−282, Harlow & Lane, supra, 1998a；およびGoding, pp. 59−103, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, Academic Press,（1986）参照。この方法では、例えばマウス、ハムスターまたは別の適切な宿主動物のような宿主動物は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に特異的に結合するであろうα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成するかまたは生成することが可能であるリンパ球を引き出すために、典型的には本明細書に開示されるＳＮＡＰ−２５抗原の１回またはそれより多い注射を経験する。固定された抗原または細胞基盤の活性アッセイを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いるような標準的な技術により、免疫された動物における抗体力価を経時的にモニタリングすることができる。これに代えて、適当な細胞培養系を用いてリンパ球をインビトロで免疫することができる。免疫後の適切な時間に、例えば抗体力価が最高であるときに、抗体生成細胞を動物から単離する。一般には、ヒト起源の細胞が望ましい場合は抹消血リンパ球を、または非ヒト哺乳動物原が望ましい場合は脾臓細胞もしくはリンパ節細胞を使用する。ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用して単離された抗体生成細胞を不死細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を形成する。不死化細胞株は通常形質転換された哺乳動物細胞、とりわけげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。典型的にはネズミ骨髄腫細胞株を適切に免疫されたマウスから採取された脾細胞と融合してハイブリドーマを生成する。好ましい不死細胞株はヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含有する培養培地に鋭敏であるマウス骨髄腫細胞株である。多くの骨髄腫細胞株、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８.６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系のいずれかを標準的な技術により融合パートナーとして使用することができる。次いで未融合のまたは非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させる（未融合脾細胞は形質転換されていないので、数日後に死亡する）ＨＡＴ培地を使用して融合の結果であるハイブリドーマ細胞を選択する。次いでハイブリドーマ細胞が成長する培養培地をＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在に関して検定することができる。例えば免疫沈降アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビボ結合アッセイにおいて、または細胞基盤の活性アッセイにおいてα−ＳＮＡＰ−２５陽性培地を使用してハイブリドーマ上澄を、スクリーニングすることができる。かかる技術およびアッセイは当分野において公知である。例えばChapter 11 Immunoprecipitation, pp. 421−470, Harlow & Lane, supra, 1998a；Chapter 12 Immunoblotting, pp. 471−510, Harlow & Lane, supra, 1998a；Chapter 14 Immunoassays, pp. 553−612, Harlow & Lane, supra, 1998a参照。次いでさらなる研究を行って、抗体はまたＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を欠如するＳＮＡＰ−２５に対して非反応性であるかどうかを決定することができる。α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合アフィニティーを例えばScatchard分析により決定することもできる。例えば「リガンド：リガンド結合系の特徴付けのための多目的コンピューター研究法」Peter J. Munson and David Rodbard, Anal. Biochem. 107（1）：220−239（1980）参照。望ましいハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈手順を用いて望ましいモノクローナル抗体を発現するクローンの細胞株が得られるまで、単一細胞に由来するクローンを単離する。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に関して十分に選択的であり、そして十分に高いアビディティーで結合するこれらの抗体を選び、さらに特徴付けおよび研究する。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を調製するための別の代替は、例えば抗体ファージディスプレイライブラリーのような組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーをＳＮＡＰ−２５ペプチドでスクリーニングすることにより、そしてＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーを作成およびスクリーニングするためのキットは例えば組換えファージ抗体系（Amersham GE Healthcare, Piscataway, NJ）；およびSurfZAP（商標）ファージディスプレイキット（Stratagene, La Jolla, CA）のように市販により入手可能である。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの作成およびスクリーニングに有用な方法および試薬の実例を例えばLadnerら、米国特許第５２２３４０９号；Borrebaeckら、米国特許第５７１２０８９号；Griffithsら、米国特許第５８８５７９３号；Griffithsら、米国特許第５９６２２５５号；McCaffertyら、米国特許第５９６９１０８号；Griffithsら、米国特許第６０１０８８４号；Jespersら、米国特許第６０１７７３２号；Borrebaeckら、米国特許第６０２７９３０号；Johnsonら、米国特許第６１４０４７１号；McCaffertyら、米国特許第６１７２１９７号（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）において見出すことができる。
本開示の態様は一部ではα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体生成細胞を含有する試料を収集することを含んでなる。本明細書で使用される際には「α−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体生成細胞を含有する試料」なる用語はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する少なくとも１つのα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含有するか、または潜在的に含有する任意の生物学的物質を指す。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含有できる、限定するものではないが、血液、血漿、血清およびリンパ液を含む任意のおよび全ての試料を、この方法において使用することができるということは想定される。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成することが可能な、限定するものではないが、ＣＤ８細胞、ＣＴＬ細胞、ヘルパーＴ細胞およびＢ細胞を含む任意の細胞を、この方法において使用することができるということも想定される。種々の周知の方法を用いてα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体生成細胞を含有する試料を個体から収集することができ、例えばHarlow & Lane, supra, 1998a；およびHarlow & Lane, supra, 1998bを参照されたい。類似して、種々の周知の方法を用いて、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離するために試料を加工することができる。単離されるべき抗体の型に基づいて試料を収集するための手順を選択することができる。非限定例としては、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を単離する場合、適切な試料はかかるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含有する血液試料でよいが、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を単離する場合、適切な試料は脾臓細胞またはハイブリドーマのようなα−ＳＮＡＰ−２５抗体生成細胞でよい。
本開示の態様は一部ではＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を試料から単離することを含んでなる。例えばＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体またはＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のようなかかるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離する方法は当業者に周知である。例えばHarlow and Lane, supra, 1998a；およびHarlow and Lane, supra, 1998b参照。例えばかかるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を例えば一次的には免疫血清のＩｇＧ分画を提供する、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーのような周知の技術により試料から単離することができる。引き続いて、またはこれに代えて、特異的なＳＮＡＰ−２５抗原をカラムまたは磁性ビーズに固定してＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を培養培地または腹水から、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離することができる。
故に実施態様では、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する方法は工程（ａ）担体ペプチドに連結されたカルボキシル化されたＣ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなる組成物を動物に投与すること；（ｂ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体生成細胞を含有する試料を動物から収集すること；および（ｃ）試料からα−ＳＮＡＰ−２５抗体構成要素を単離すること；を含んでなる。この実施態様の態様では、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体はポリクローナル抗体である。この実施態様の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体はモノクローナル抗体である。この実施態様のさらなる態様では、生成されるＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体はＩｇＧサブタイプである。この実施態様のその他の態様では、ＳＮＡＰ−２５組成物はさらに例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のようなアジュバントを含んでなる。
別の実施態様では、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成する方法は工程（ａ）可動性リンカーおよび担体ペプチドに連結されたカルボキシル化されたＣ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５ペプチドを含んでなる組成物を動物に投与すること、ここで可動性リンカーはＳＮＡＰ−２５ペプチドと担体ペプチドの間に介在する；（ｂ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体生成細胞を含有する試料を動物から収集すること；ならびに（ｃ）試料からα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離すること；を含んでなる。この実施態様の態様では、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体はポリクローナル抗体である。この実施態様の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体はモノクローナル抗体である。この実施態様のさらなる態様では、生成されるＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体はＩｇＧサブタイプである。この実施態様のその他の態様では、ＳＮＡＰ−２５組成物はさらに例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のようなアジュバントを含んでなる。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合する単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んでなる。本明細書で使用される際には「単離された」なる用語はヒトの介入を用いることによりその天然の環境から分子を分離することを指す。本明細書で使用される際には「抗体」なる用語は特定の抗原に応答して作られた免疫系により作成された、その抗原に特異的に結合する分子を指し、そして天然発生抗体および非天然発生抗体の双方を含む。本明細書で使用される際には「α−ＳＮＡＰ−２５」なる用語は「抗ＳＮＡＰ−２５」と同義であり、そしてＳＮＡＰ−２５抗原に結合する抗体を指す。例えば抗体は、フラグメントが望ましい生物学的活性を呈する限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、多特異的抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、Ｉｇ受容体様の細胞結合抗体、線状抗体、ダイアボディーまたはミニボディー、および同一物の一本鎖誘導体でよい。抗体はＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、または例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメントのような、全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントを含んでなる全長免疫グロブリン分子でよい。抗体を任意の脊椎動物種（例えばヒト、ヤギ、ウマ、ロバ、ネズミ、ラット、ウサギまたはニワトリ）から誘導することができ、そして任意の型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、クラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）またはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものでよい。天然発生抗体、非天然発生抗体およびその抗原性化合物−結合フラグメントの構造に関する一般の開示に関しては、例えばPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer−Verlag, New York, pp. 269−315（1994）；Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed.（Oxford University Press 1995）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。
天然発生抗体は通常約１５０,０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重および軽鎖はまた規則的に間隔をあけて配置された鎖内ジスルフィド橋を有する。各重鎖は一方の端で可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の端で可変ドメイン（ＶＬ）およびそのもう一方の端で定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖可変ドメインとの間のインターフェースを形成すると考えられる。
完全な抗原認識および抗原結合部位は抗体の可変ドメイン、すなわちＦｖフラグメント内に含有される。このフラグメントは堅固な非共有結合性会合の１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のダイマーを含む。各ドメインは４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでなり、それは大部分はβシート立体配置をとり、３つの超可変領域により接続され、それはβシート構造を接続するループを形成し、そしてβシート構造の一部を形成する場合もある。各超可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）に相当するアミノ酸配列を含んでなる。集合的にはそれは抗原−結合特異性を付与するＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を定義する６つのＣＤＲ領域の三次元立体配置である。例えば「免疫グロブリン超可変領域の立体構造」Cyrus Chothia, et al., Nature 342（6252）：877−883（1989）；「免疫学的に興味深いタンパク質の配列」Elvin A. Kabat, et al, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.（1991）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）。抗体の定常ドメインは直接的に抗体を抗原に結合するのに関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を呈する。
標的抗原は一般にはエピトープとも称される１つまたはそれより多い結合部位を有し、それはＣＤＲにより形成される抗原結合部位により認識される。本明細書で使用される際には「エピトープ」は「抗原性決定基」と同義であり、そして免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な、またはそうでなければ分子と相互作用する例えばペプチド、多糖類または脂質含有分子のような標的抗原上の部位を指す。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は異なる構造を有する。故に１つの抗原は１を超える対応する抗体を有し得る。
ポリクローナル抗体とは特定の抗原に結合することが可能な少なくとも２種の抗体を含有する抗体分子の異種性集団を指す。定義によれば、ポリクローナル抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに結合する２つの異なる抗体を含む。本明細書で使用される際には「（複数の）モノクローナル抗体」なる用語は特定の抗原に結合することが可能な１種のみの抗体含有する、抗体分子の実質的に同種性の集団を指し、すなわち集団を含んでなる個々の抗体は微量で存在し得る可能な天然発生変異体を除いて同一である。定義によれば、モノクローナル抗体は単一のエピトープに結合する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して指向する。さらにポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はその他の抗体と夾雑しないで合成され得るという点で有利である。「モノクローナル」なる修飾語句は、実質的に同種の抗体の集団から得られているような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするとは解釈されるべきではない。例えば本開示に従って使用するためのモノクローナル抗体を、最初にKohler et al., Nature 256：495（1975）により記載されたハイブリドーマ法により作成できるか、または組換えＤＮＡ法により作成できる（例えば：米国特許第４８１６５６７号；米国特許第５８０７７１５号参照）。例えばClackson et al., Nature, 352：624−628（1991）；Marks et al., J. Mol. Biol. 222：581−597（1991）に記載される技術を用いてモノクローナル抗体をファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
故に実施態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなる。この実施態様の態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：８０または配列番号：８２である。この実施態様の別の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０または配列番号：９２である。
別の実施態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、ＣＤＲ３領域または任意のその組み合わせを含んでなる。この実施態様の態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ１領域は配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：９５、配列番号：１１８、配列番号：１１９または配列番号：１２０である。この実施態様の別の態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ２領域は配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１２１、配列番号：１２２または配列番号：１２３である。この実施態様のなお別の態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ３領域は配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２または配列番号：１２４である。
別の実施態様ではα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、ＣＤＲ３領域、またはその任意の組み合わせを含んでなる。この実施態様の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ１領域は配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１２５、配列番号：１２６、配列番号：１２７、配列番号：１２８または配列番号：１２９である。この実施態様の別の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ２領域は配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１または配列番号：１１２である。この実施態様のなお別の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ３領域は配列番号：１１３、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６または配列番号：１１７である。
なお別の実施態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５を含んでなるエピトープに特異的に結合する。この実施態様の態様では、エピトープは配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：１４７または配列番号：１４８を含んでなる。この実施態様の態様では、エピトープは配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４を含んでなる。
前記で開示されるように、ＳＮＡＰ−２５に存在するＢｏＮＴ／Ａ切断部位を取り囲む配列はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’と示され、Ｐ１−Ｐ１’は切断可能結合を表す。ＢｏＮＴ／Ａによる切断時に、結果的に生成された切断生成物はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列を含むフラグメントおよびＰ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’を含むフラグメントを含んでなる。本明細書で使用される際には「ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体」なる用語はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列を含んでなる任意のＳＮＡＰ−２５切断生成物フラグメントに選択的に結合するが、Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’配列を含んでなる任意のＳＮＡＰ−２５切断生成物フラグメントまたはＢｏＮＴ／Ａ切断部位のインタクトなＰ１−Ｐ１’切断可能結合を有する任意のＳＮＡＰ−２５には結合しないα−ＳＮＡＰ−２５抗体を指す。本明細書で使用される際には「α−ＳＮＡＰ−２５１９７抗体」なる用語は配列番号：５のグルタミン１９７に相当するカルボキシル末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する抗体を指す。本明細書で使用される際には「α−ＳＮＡＰ−２５２０４抗体」なる用語は配列番号：１６のリジン２０４に相当するカルボキシル末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する抗体を指す。
本明細書で使用される際には「選択的」なる用語は唯一の方式でまたは唯一のものとの独特な効果または影響または反応を有することを指す。本明細書で使用される際には「選択的に結合する」なる用語は、抗体を参照する場合、抗体が非標的エピトープと実質的に交差反応しないような、指示された標的エピトープへの抗体の識別力のある結合を指す。本明細書で定義されるような最小サイズのペプチドエピトープは約５個のアミノ酸であり、そしてペプチドエピトープは典型的には少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０個のアミノ酸を含んでなる。ペプチドエピトープは非連続的でよく、すなわちそれはペプチドの一次構造において隣接しないが、ペプチドの二次、三次または四次構造により一緒にエピトープになるアミノ酸残基を含んでなる。さらにエピトープは例えば炭水化物部分、リポタンパク質もしくは糖脂質様の脂質部分、またはリン酸化されたアミノ酸様の化学的に修飾されたアミノ酸部分のようなアミノ酸配列以外の分子の一部を含んでなり得ることも留意される。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０個のアミノ酸を含んでなる、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができる。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、多くても５、多くても６、多くても７、多くても８、多くても９、多くても１０、多くても１５または多くても２０個のアミノ酸を含んでなる、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができる。
選択的結合には例えば結合アフィニティー、結合特異性および結合アビディティーのような結合特性が含まれる。David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, pp. 240（1998）参照。結合アフィニティーとは、抗体がそのエピトープ結合部位に留まる時間の長さを指し、そして抗体がそのエピトープに結合する強さと見なすことができる。結合アフィニティーを抗体の平衡解離定数（ＫＤ）と記載することができ、それは平衡時のＫｄ／Ｋａ比として定義される。ここでＫａは抗体の会合速度定数であり、そしてｋｄは抗体の解離速度定数である。結合アフィニティーは会合および解離双方により決定され、そして高い会合でも低い解離でも単独では高アフィニティーを確実にすることはできない。会合速度定数（Ｋａ）または結合速度定数（on−rate constant）（Ｋｏｎ）は単位時間あたりの結合事象の数、または抗体および抗原がその抗体−抗原複合体に可逆的に会合する傾向を測定する。会合速度定数はＭ−１ｓ−１で表現され、そして以下のとおりに記号で表される：［Ａｂ］×［Ａｇ］×Ｋｏｎ。会合速度定数が大きいほど、抗体はその抗原により迅速に結合するか、または抗体と抗原との間の結合アフィニティーがより高くなる。解離速度定数（Ｋｄ）または分離速度定数（off−rate constant）（Ｋｏｆｆ）は単位時間あたりの解離事象の数、抗体−抗原複合体がその構成分子、すなわち抗体および抗原に可逆的に分離（解離）する傾向を測定する。解離速度定数はｓ−１で表現され、そして以下のとおりに記号で表される：［Ａｂ＋Ａｇ］×Ｋｏｆｆ。解離速度定数が小さいほど、抗体はその抗原により強固に結合するか、または抗体と抗原との間の結合アフィニティーがより高くなる。平衡解離定数（ＫＤ）は、形成された新しい抗体−抗原複合体が、抗体−抗原複合体が平衡して解離する速度に等しいその速度を測定する。平衡解離定数はＭで表現され、そしてＫｏｆｆ／Ｋｏｎ＝［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ＋Ａｇ］（式中、［Ａｂ］は抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は抗原のモル濃度であり、そして［Ａｂ＋Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、ここで全ての濃度は、系が平衡にある場合のかかる構成要素のものである。平衡解離定数が小さいほど、抗体はその抗原により強固に結合するか、または抗体と抗原との間の結合アフィニティーがより高くなる。
故に実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは例えば１×１０５Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０６Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０７Ｍ−１ｓ−１未満、または１×１０８Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有し得る。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは例えば１×１０５Ｍ−１ｓ−１を超える、１×１０６Ｍ−１ｓ−１を超える、１×１０７Ｍ−１ｓ−１を超える、または１×１０８Ｍ−１ｓ−１を超える会合速度定数を有し得る。別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは１×１０５Ｍ−１ｓ−１から１×１０８Ｍ−１ｓ−１、１×１０６Ｍ−１ｓ−１から１×１０８Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１から１×１０７Ｍ−１ｓ−１、または１×１０６Ｍ−１ｓ−１から１×１０７Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数を有し得る。
別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは１×１０−３ｓ−１未満、１×１０−４ｓ−１未満または１×１０−５ｓ−１未満の解離速度定数を有し得る。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは例えば１.０×１０−４ｓ−１未満、２.０×１０−４ｓ−１未満、３.０×１０−４ｓ−１未満、４.０×１０−４ｓ−１未満、５.０×１０−４ｓ−１未満、６.０×１０−４ｓ−１未満、７.０×１０−４ｓ−１未満、８.０×１０−４ｓ−１未満または９.０×１０−４ｓ−１未満の解離速度定数を有し得る。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは例えば１×１０−３ｓ−１を超える、１×１０−４ｓ−１を超えるまたは１×１０−５ｓ−１を超える解離速度定数を有し得る。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは例えば１.０×１０−４ｓ−１を超える、２.０×１０−４ｓ−１を超える、３.０×１０−４ｓ−１を超える、４.０×１０−４ｓ−１を超える、５.０×１０−４ｓ−１を超える、６.０×１０−４ｓ−１を超える、７.０×１０−４ｓ−１を超える、８.０×１０−４ｓ−１を超える、または９.０×１０−４ｓ−１を超える解離速度定数を有し得る。
別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは０.５００ｎＭ未満の平衡解離定数を有し得る。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは例えば０.５００ｎＭ未満、０.４５０ｎＭ未満、０.４００ｎＭ未満、０.３５０ｎＭ未満、０.３００ｎＭ未満、０.２５０ｎＭ未満、０.２００ｎＭ未満、０.１５０ｎＭ未満、０.１００ｎＭ未満または０.０５０ｎＭ未満の平衡解離定数を有し得る。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは０.５００ｎＭを超える平衡解離定数を有し得る。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは例えば０.５００ｎＭを超える、０.４５０ｎＭを超える、０.４００ｎＭを超える、０.３５０ｎＭを超える、０.３００ｎＭを超える、０.２５０ｎＭを超える、０.２００ｎＭを超える、０.１５０ｎＭを超える、０.１００ｎＭを超える、または０.０５０ｎＭを超える平衡解離定数を有し得る。
なお別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーは、インタクトなＳＮＡＰ−２５に関して例えば１×１００Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０１Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０２Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０３Ｍ−１ｓ−１未満、または１×１０４Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有し得る。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合アフィニティーはインタクトなＳＮＡＰ−２５に関して例えば多くても１×１００Ｍ−１ｓ−１、多くても１×１０１Ｍ−１ｓ−１、多くても１×１０２Ｍ−１ｓ−１、多くても１×１０３Ｍ−１ｓ−１または多くても１×１０４Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数を有し得る。
結合特異性はそのエピトープを含有する分子と、そのエピトープを含有しない分子との間で識別する抗体の能力である。結合特異性を測定する１つの方式は、そのエピトープを含有しない分子に関する抗体のＫｏｎ会合速度に相対して、そのエピトープを含有する分子に関する抗体のＫｏｎ会合速度を比較することである。例えばＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに関するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の会合速度定数（Ｋａ）を、例えばＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を欠如するＳＮＡＰ−２５エピトープまたはＢｏＮＴ／Ａ切断部位のインタクトな−Ｐ１’切断可能結合を有するＳＮＡＰ−２５エピトープのような、そのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に相対して比較することである。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、その（複数の）エピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に関して例えば１×１００Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０１Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０２Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０３Ｍ−１ｓ−１未満、または１×１０４Ｍ−１ｓ−１未満の、会合速度定数（Ｋａ）を有する。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、その（複数の）エピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に関して例えば多くても１×１００Ｍ−１ｓ−１、多くても１×１０１Ｍ−１ｓ−１、多くても１×１０２Ｍ−１ｓ−１、多くても１×１０３Ｍ−１ｓ−１または多くても１×１０４Ｍ−１ｓ−１の、会合速度定数（Ｋａ）を有する。
この実施態様のなおさらなる態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、そのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に相対して、そのエピトープに関して例えば少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、または少なくとも９倍多い会合速度定数（Ｋａ）を有する。この実施態様のさらなる態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、そのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に相対して、そのエピトープに関して例えば少なくとも１０倍多い、少なくとも１００倍多い、少なくとも１,０００倍多いまたは少なくとも１０,０００倍多い会合速度定数（Ｋａ）を有する。この実施態様のなおその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、そのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に相対して、そのエピトープに関して例えば多くても１倍多い、多くても２倍多い、多くても３倍多い、多くても４倍多い、多くても５倍多い、多くても６倍多い、多くても７倍多い、多くても８倍多い、または多くても９倍多い会合速度定数（Ｋａ）を有する。この実施態様のなおその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、そのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に相対して、そのエピトープに関して例えば多くても１０倍多い、多くても１００倍多い、多くても１,０００倍多い、または多くても１０,０００倍多い会合速度定数（Ｋａ）を有する。
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合特異性を、例えばＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を欠如するＳＮＡＰ−２５エピトープまたはＢｏＮＴ／Ａ切断部位のインタクトなＰ１−Ｐ１’切断可能結合を有するＳＮＡＰ−２５エピトープのような、そのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に相対して、かかるα−ＳＮＡＰ−２５抗体がそのＳＮＡＰ−２５エピトープを識別することができる比として特徴付けすることもできる。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、そのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に相対して、そのＳＮＡＰ−２５エピトープに関して例えば少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６４：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１または少なくとも４０：１の結合特異性比を有する。この実施態様のなおその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を欠如するＳＮＡＰ−２５に相対して、そのＳＮＡＰ−２５エピトープに関して例えば少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１または少なくとも４０：１の結合特異性比を有する。この実施態様のさらにその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位のインタクトなＰ１−Ｐ１’切断可能結合を有するＳＮＡＰ−２５に相対して、そのＳＮＡＰ−２５エピトープに関して例えば少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６４：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１または少なくとも４０：１の結合特異性比を有する。
結合アビディティーは機能的アフィニティーとしても公知であり、多価抗体とその抗原との間の機能的結合力の合計を指す。抗体分子は１を超える結合部位を有し得て（例えばＩｇＧに関して２個、ＩｇＭに関して１０個）、そして多くの抗原は１を超える抗原性部位を含有する。抗体の結合アビディティーは個々の抗体結合部位の結合アフィニティーに依存するが、全ての抗体−抗原相互作用は抗体が完全に解離するために同時に破壊されなければならないので、結合アビディティーは結合アフィニティーよりも大きい。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体はその抗体に関する任意のおよび全てのエピトープに選択的に結合することができるということは想定される。
故に実施態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。この実施態様の態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、カルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体、またはカルボキシル末端リジンを有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。この実施態様のその他の態様ではα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：５のグルタミン１９７に相当するカルボキシル末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体、または配列番号：１６のリジン２０４に相当するカルボキシル末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。この実施態様のさらにその他の態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４、配列番号：１４７または配列番号：１４８のカルボキシル末端アミノ酸配列を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を含んでなる。本明細書に開示される免疫基盤の方法を、例えば真度、精度、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、範囲、特異性、選択性、直線性、耐久性および系の適合性を含むいくつかのパラメーターにより評価することができる。方法の真度は分析方法の正確さ、または測定された値と従来の真の値として認められた値もしくは認められた参照値との間の一致の近似性の測定である。方法の精度は均一な試料の複数回のサンプリングに手順を繰り返し適用した場合の、個々の試験結果の間の一致の程度である。そのように、精度は１）アッセイ内変動性；２）日内変動性（併行精度）；および３）日間変動性（室内再現精度）；および４）研究室間変動性（室間再現精度）；を評価する。変動係数（ＣＶ％）は観察されたまたは理論的平均値に相対して表現される精度の定量的測定値である。
本明細書に開示される免疫基盤の方法は、バックグラウンドを超えてＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５を含んでなるα−ＳＮＡＰ−２５抗体−抗原複合体の存在を検出できなければならない。方法の検出限界（ＬＯＤ）とは陰性対照またはブランクとは有意に異なるシグナルを上昇させる分析物の濃度を指し、バックグラウンドから区別することができる分析物の最低濃度を表す。
故に実施態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は、陰性対照またはブランクとは有意に異なる量でＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを検出することができる。この実施態様の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９００ｐｇ以下、８００ｐｇ以下、７００ｐｇ以下、６００ｐｇ以下、５００ｐｇ以下、４００ｐｇ以下、３００ｐｇ以下、２００ｐｇ以下、１００ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のさらなる態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９０ｐｇ以下、８０ｐｇ以下、７０ｐｇ以下、６０ｐｇ以下、５０ｐｇ以下、４０ｐｇ以下、３０ｐｇ以下、２０ｐｇ以下、１０ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のなおその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば０.９ｐｇ以下、０.８ｐｇ以下、０.７ｐｇ以下、０.６ｐｇ以下、０.５ｐｇ以下、０.４ｐｇ以下、０.３ｐｇ以下、０.２ｐｇ以下、０.１ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。
この実施態様の別の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下または１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下または１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のなおその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下または１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１,０００ｆＭ以下、９００ｆＭ以下、８００ｆＭ以下、７００ｆＭ以下、６００ｆＭ以下、５００ｆＭ以下、４００ｆＭ以下、３００ｆＭ以下、２００ｆＭ以下または１００ｆＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下または１０ｆＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１０ｆＭ以下、９ｆＭ以下、８ｆＭ以下、７ｆＭ以下、６ｆＭ以下、５ｆＭ以下、４ｆＭ以下、３ｆＭ以下、２ｆＭ以下または１ｆＭ以下のボツリヌス神経毒ＡのＬＯＤを有する。
定量限界（ＬＯＱ）は許容できるレベルの真度および精度で測定することができる試料または標本中の分析物の最低および最高濃度である。下の定量限界とは検出方法がバックグラウンドから一貫して測定することができる最低用量を指す。上の定量限界とは、シグナルの飽和を生じる前に、検出方法がバックグラウンドから一貫して測定することができる最高用量である。方法の直線性の範囲は下の定量限界と上の定量限界との間の区域である。直線性の範囲は上の定量限界から下の定量限界を減じることにより計算される。本明細書で使用される際には「下の漸近線に関するシグナル対ノイズ比」なる用語は、バックグラウンドシグナルにより除された、下の検出限界で方法において検出されたシグナルを指す。本明細書で使用される際には「上の漸近線に関するシグナル対ノイズ比」なる用語は、バックグラウンドシグナルにより除された、上の検出限界で方法において検出されたシグナルを指す。
故に実施態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は陰性対照またはブランクとは有意に異なる量でＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを検出することができる。この実施態様の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９００ｐｇ以下、８００ｐｇ以下、７００ｐｇ以下、６００ｐｇ以下、５００ｐｇ以下、４００ｐｇ以下、３００ｐｇ以下、２００ｐｇ以下、１００ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のさらなる態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９０ｐｇ以下、８０ｐｇ以下、７０ｐｇ以下、６０ｐｇ以下、５０ｐｇ以下、４０ｐｇ以下、３０ｐｇ以下、２０ｐｇ以下、１０ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のなおその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば０.９ｐｇ以下、０.８ｐｇ以下、０.７ｐｇ以下、０.６ｐｇ以下、０.５ｐｇ以下、０.４ｐｇ以下、０.３ｐｇ以下、０.２ｐｇ以下、０.１ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。
この実施態様の別の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下または１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下または１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のなおその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下または１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１,０００ｆＭ以下、９００ｆＭ以下、８００ｆＭ以下、７００ｆＭ以下、６００ｆＭ以下、５００ｆＭ以下、４００ｆＭ以下、３００ｆＭ以下、２００ｆＭ以下または１００ｆＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下または１０ｆＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。この実施態様のさらにその他の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は例えば１０ｆＭ以下、９ｆＭ以下、８ｆＭ以下、７ｆＭ以下、６ｆＭ以下、５ｆＭ以下、４ｆＭ以下、３ｆＭ以下、２ｆＭ以下または１ｆＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する。
開示された方法の態様を実行するために有用な免疫基盤のアッセイはわずか５０％の精度を有さなければならない。この実施態様の態様では、免疫基盤のアッセイはわずか５０％、わずか４０％、わずか３０％またはわずか２０％の精度を有する。この実施態様のその他の態様では、免疫基盤のアッセイはわずか１５％、わずか１０％またはわずか５％の精度を有する。この実施態様のその他の態様では、免疫基盤のアッセイはわずか４％、わずか３％、わずか２％またはわずか１％の精度を有する。
開示された方法の態様を実行するために有用な免疫基盤のアッセイは少なくとも５０％の正確性を有さなければならない。この実施態様の態様では、免疫基盤のアッセイは少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％の正確性を有する。この実施態様のその他の態様では、免疫基盤のアッセイは少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の正確性を有する。この実施態様のその他の態様では、免疫基盤のアッセイは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の正確性を有する。
本明細書に開示される免疫基盤の方法は統計的に有意である下の漸近線に関するシグナル対ノイズ比および統計的に有意である上の漸近線に関するシグナル対ノイズ比を有さなければならない。この実施態様の態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は下の漸近線に関して例えば少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１または少なくとも２０：１のシグナル対ノイズ比を有する。この実施態様のその他の態様では、免疫基盤の方法は上の漸近線に関して例えば少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも４５：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１または少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも５５０：１または少なくとも６００：１のシグナル対ノイズ比を有する。
方法の特異性は、例えば部分的に活性な、または不活性な分析物のようなその他の関連する構成要素の排除に重要な分析物を方法が測定する能力を定義する。方法の選択性は、分析方法が試料中の種々の物質を差別化する能力を記載する。方法の直線性は、試料中の分析物の濃度に比例して直接的であるか、または十分に定義された数学的変換により結果を引き出すその能力である。故に実施態様では、本明細書に開示される免疫基盤の方法は十分に活性なＢｏＮＴ／Ａを、十分に活性なＢｏＮＴ／Ａの活性の例えば７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下を有する部分的に活性なＢｏＮＴ／Ａと区別することができる。
方法の耐久性は、正常な（しかし変動する）試験条件下で同一の試料に関して得られた試験結果の室間再現精度である。手順の頑健性は、方法パラメーターにおける小さいが、慎重な変動により影響を受けずにあるその受容力の測定値であり、そして正常な利用におけるその信頼性の指標を提供する。故に耐久性は回避し難い変化を評価するが、頑健性は慎重な変化を評価する。耐久性および頑健性により評価される典型的なパラメーターには、凍結／解凍、インキュベーション時間、インキュベーション温度、試薬の寿命、試料調製物、試料貯蔵、細胞継代数、多くの毒素、精製間の変動性およびニッキング反応間の変動性の影響が含まれる。細胞基盤のアッセイに関する頑健性パラメーターには、細胞バンク（凍結の始め、中間および終わり）、細胞継代レベル、細胞播種密度、細胞ストック密度（培養何日か）、フラスコ中の細胞齢（播種までの待ち時間）、インキュベーション時間、様々なプレート、過量の血清、および試薬の供給源が含まれる。方法の系適合性は参照標準の分析による経時的な、試薬および装置の性能を含むアッセイ性能の決定である。設備、電子工学、アッセイ性能および分析されるべき試料が統合された系を構成するという事実を参照してＦＤＡの指導では系適合性が強調される。用量対応答の対数をプロットする場合、参照物質の連続希釈および試料の連続希釈が併行曲線を生じさせるはずである平行性に関して試験することにより、系適合性を評価することができる。
本開示の態様は一部では確立された細胞株からの細胞を含んでなる。本明細書で使用される際には「細胞」なる用語は、ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い任意の真核細胞、またはＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる任意の真核細胞を指す。細胞なる用語は例えばネズミ、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒト細胞のような種々の生物からの；例えばニューロン性および非ニューロン性のような種々の細胞型からの；細胞を包含し、そして同種の細胞集団、組織または生物から単離できるか、またはその一部でよい。本明細書で使用される際には「確立された細胞株」なる用語は「不死細胞株」または「形質転換された細胞株」と同義であり、そして生物、組織または器官供給源から誘導される細胞集団からの無制限な繁殖に関して選択された細胞の細胞培養物を指す。定義によれば、確立された細胞株は初代細胞の細胞培養物を除外する。本明細書で使用される際には「初代細胞」なる用語は新鮮な組織または器官から直接採取された細胞であり、そして無制限に繁殖する潜在能力を有さない。確立された細胞株は細胞の異種性集団または細胞の均一な集団を含んでなることができる。単一の細胞から誘導される確立された細胞株はクローン細胞株と称される。確立された細胞株は、その細胞が全体的な細胞メカニズム（それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断し、そしてＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の細胞内小胞から細胞質への転位置およびＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解による切断を包含する）を行うために細胞に必要な全ての構成要素を内因的に発現するものでよい。それに代えて、確立された細胞株は、その細胞が全体的な細胞メカニズム（それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断し、そしてＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の細胞内小胞から細胞質への転位置およびＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解による切断を包含する）を行うために外因性供給源から少なくとも１つの構成要素を導入されてしまっているものでよい。遺伝子操作された細胞株とも称されるかかる確立された細胞株からの細胞は例えば外因性ＦＧＦＲ２、外因性ＦＧＦＲ３、外因性ＳＶ２、外因性ＳＮＡＰ−２５または任意のその組み合わせを発現できる。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞を含んでなる。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い（複数の）細胞」、「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い（複数の）細胞」または「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの（複数の）細胞」なる用語は全体的な細胞メカニズム（それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断し、そしてＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の細胞内小胞から細胞質への転位置およびＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解による切断を包含する）を行うことができる（複数の）細胞を指す。定義によれば、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い（複数の）細胞は少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ａ受容体および少なくとも１つのＳＮＡＰ−２５基質を発現するか、または発現するように操作されなければならない。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる（複数の）細胞」または「ＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる確立された細胞株を含んでなる（複数の）細胞」なる用語は全体的な細胞メカニズム（それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断し、そしてＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の細胞内小胞から細胞質への転位置およびＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解による切断を包含する）を行うことができる細胞を指す。定義によれば、ＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる（複数の）細胞は少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ａ受容体および少なくとも１つのＳＮＡＰ−２５基質を発現するか、または発現するように操作されなければならない。
故に実施態様では、確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い。この実施態様の態様では、確立された細胞株からの細胞は例えば約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下または約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は例えば約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下または約１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い。さらにその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は例えば約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下または約１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い。なおその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は例えば約０.９ｐＭ以下、約０.８ｐＭ以下、約０.７ｐＭ以下、約０.６ｐＭ以下、約０.５ｐＭ以下、約０.４ｐＭ以下、約０.３ｐＭ以下、約０.２ｐＭまたは約０.１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い。本明細書で使用される際には「約」なる用語は、記述された項目、数、パーセンテージもしくは用語の値を適したものにする場合、記述された項目、パーセンテージ、パラメーターもしくは用語の値の＋または−１０％の範囲を指す。
別の実施態様では、確立された細胞株を含んでなる細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる。この実施態様の態様では、確立された細胞株を含んでなる細胞は例えば約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下または約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株を含んでなる細胞は約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下または約１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを取り込む能力を保有する。さらにその他の態様では、確立された細胞株を含んでなる細胞は約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下または約１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを取り込む能力を保有する。なおその他の態様では、確立された細胞株を含んでなる細胞は約０.９ｐＭ以下、約０.８ｐＭ以下、約０.７ｐＭ以下、約０.６ｐＭ以下、約０.５ｐＭ以下、約０.４ｐＭ以下、約０.３ｐＭ以下、約０.２ｐＭ以下または約０.１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを取り込む能力を保有する。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａを含んでなる。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ」なる用語は「ボツリヌス神経毒血清Ａ型」または「ボツリヌス神経毒Ａ型」と同義であり、そして天然発生ＢｏＮＴ／Ａまたはその非天然発生ＢｏＮＴ／Ａの双方を指し、そして約１５０ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ神経毒および関連する非毒素関連タンパク質（ＮＡＰ）、ならびに約１５０ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ神経毒単独を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ複合体を含む。ＢｏＮＴ／Ａ複合体の非限定例には、例えば９００ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ複合体、５００ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ複合体、３００ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ複合体が含まれる。約１５０ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ神経毒の非限定例には例えば配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４が含まれる。
本明細書で使用される際には「天然発生ＢｏＮＴ／Ａ」なる用語は、限定するものではないが、翻訳後修飾、選択的スプライシングされた転写物または自然突然変異から生成されるＢｏＮＴ／Ａアイソフォームならびに例えばＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ２サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ３サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ４サブタイプおよびＢｏＮＴ／Ａ５サブタイプのようなＢｏＮＴ／Ａサブタイプを含む天然発生過程により生成される任意のＢｏＮＴ／Ａを指す。天然発生ＢｏＮＴ／Ａには、限定するものではないが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、または配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３もしくは配列番号：４から例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上または１００個のアミノ酸を置換、欠失もしくは付加したものが含まれる。天然発生ＢｏＮＴ／Ａの市販により入手可能な医薬組成物には、限定するものではないが、BOTOX（登録商標）（Allergan, Inc., Irvine, CA）、DYSPORT（登録商標）／RELOXIN（登録商標）、（Ipsen Ltd., Slough, England）、PURTOX（登録商標）（Mentor Corp., Santa Barbara, CA）、XEOMIN（登録商標）（Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Germany）、NEURONOX（登録商標）（Medy−Tox, Inc., Ochang−myeon, South Korea）、ＢＴＸ−Ａが含まれる。
本明細書で使用される際には「非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ」なる用語は、限定するものではないが、無作為変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生成された改変されたアミノ酸配列を伴うＢｏＮＴ／Ａ、およびインビトロ化学合成により生成されたＢｏＮＴ／Ａを含む、その構造がヒトの用手操作を援用して修飾された任意のＢｏＮＴ／Ａを指す。非天然発生ＢｏＮＴ／Ａの非限定例は例えば「翻訳後修飾およびクロストリジウム神経毒」Steward, L.E.ら、米国特許第７２２３５７７号；「活性化可能なクロストリジウム毒素」Dolly, J.O.ら、米国特許第７４１９６７６号；「クロストリジウム神経毒組成物および修飾クロストリジウム神経毒」Steward, L.E.ら、米国特許出願公開第２００４／０２２０３８６号；「内因性クロストリジウム毒素受容体系に関して増強されたターゲティング能力を有する修飾クロストリジウム毒素」Steward, L.E.ら、米国特許出願公開第２００８／００９６２４８号；「クロストリジウム毒素標的細胞に関して改変されたターゲティング能力を有する修飾クロストリジウム毒素」Steward, L.E.ら、米国特許出願公開第２００８／０１６１５４３号；「クロストリジウム毒素標的細胞に関して増強された転位置能力および改変されたターゲティング活性を有する修飾クロストリジウム毒素」Steward, L.E.ら、米国特許出願公開第２００８／０２４１８８１号（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
故に実施態様では、検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性は天然発生ＢｏＮＴ／Ａに由来する。この実施態様の態様では、検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性はＢｏＮＴ／ＡアイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａサブタイプに由来する。この実施態様の態様では、検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４のＢｏＮＴ／Ａに由来する。この実施態様のその他の態様では、検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４と例えば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するＢｏＮＴ／Ａに由来する。この実施態様のその他の態様では、検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性はBOTOX（登録商標）、DYSPORT（登録商標）／RELOXIN（登録商標）、PURTOX（登録商標）、XEOMIN（登録商標）、NEURONOX（登録商標）またはＢＴＸ−Ａに由来する。
別の実施態様では、検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性は非天然発生ＢｏＮＴ／Ａに由来する。この実施態様のその他の態様では、検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４と例えば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａバリアントに由来する。この実施態様のその他の態様では検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の非隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａバリアントに由来する。この実施態様のなおその他の態様では検出されているＢｏＮＴ／Ａ活性は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａバリアントに由来する。
本開示の態様は一部ではＳＮＡＰ−２５を含んでなる。本明細書で使用される際には「ＳＮＡＰ−２５」なる用語はＢｏＮＴ／Ａにより優先的に切断される天然発生ＳＮＡＰ−２５または非天然発生ＳＮＡＰ−２５を指す。本明細書で使用される際には「優先的に切断される」なる用語は、ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ基質の切断速度が、ＢｏＮＴ／Ａによる任意のその他の基質の切断速度よりも少なくとも１桁高いことを指す。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ基質の切断速度はＢｏＮＴ／Ａによる任意のその他の基質の切断速度よりも少なくとも２桁高い、少なくとも３桁高い、少なくとも４桁高い、または少なくとも５桁高い。
本明細書で使用される際には「天然発生ＳＮＡＰ−２５」なる用語は、限定するものではないが、翻訳後修飾、選択的スプライシングされた転写物または自然突然変異から生成されるＳＮＡＰ−２５アイソフォームおよびＳＮＡＰ−２５サブタイプを含む天然発生過程により生成される任意のＳＮＡＰ−２５を指す。天然発生ＳＮＡＰ−２５には限定するものではないが、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３もしくは配列番号：２４、または配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３もしくは配列番号：２４から例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上のアミノ酸を置換、欠失または付加するものが含まれる。
本明細書で使用される際には「非天然発生ＳＮＡＰ−２５」なる用語は、限定するものではないが、無作為変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生成されたＳＮＡＰ−２５、およびインビトロ化学合成により生成されたＳＮＡＰ−２５を含む、その構造がヒトの用手操作を援用して修飾された任意のＳＮＡＰ−２５を指す。非天然発生ＳＮＡＰ−２５の非限定例は例えば「クロストリジウム毒素に関するＦＲＥＴプロテアーゼアッセイ」Steward, L.E.ら、米国特許第７３３２５６７号；「クロストリジウム毒素活性に関する親油性色素基盤のＦＲＥＴアッセイ」Fernandez−Salasら、米国特許出願公開第２００８／０１６０５６１号（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。非天然発生ＳＮＡＰ−２５は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４から例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上のアミノ酸を置換、欠失または付加できる。
故に実施態様では、ＳＮＡＰ−２５は天然発生ＳＮＡＰ−２５である。この実施態様の態様では、ＳＮＡＰ−２５はＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプである。この実施態様の態様では、天然発生ＳＮＡＰ−２５は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４の天然発生ＳＮＡＰ−２５である。この実施態様のその他の態様では、ＳＮＡＰ−２５は、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４と例えば少なくとも７０％のアミノ酸同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然発生ＳＮＡＰ−２５である。
別の実施態様では、ＳＮＡＰ−２５は非天然発生ＳＮＡＰ−２５である。この実施態様のその他の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４と例えば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する非天然発生ＳＮＡＰ−２５である。この実施態様のその他の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の非隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＳＮＡＰ−２５である。この実施態様のなおその他の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＳＮＡＰ−２５である。
ＳＮＡＰ−２５は内因性ＳＮＡＰ−２５または外因性ＳＮＡＰ−２５でよい。本明細書で使用される際には「内因性ＳＮＡＰ−２５」なる用語は、それが細胞のゲノム内で天然にコードされるので、ＳＮＡＰ−２５の外部供給源またはＳＮＡＰ−２５をコードする遺伝材料の外部供給源を必要とせずに細胞が生来的にＳＮＡＰ−２５を発現するように細胞に天然に存在するＳＮＡＰ−２５を指す。内因性ＳＮＡＰ−２５の発現は例えば細胞分化のような環境刺激を伴っても、または伴わなくてもよい。定義によれば、内因性ＳＮＡＰ−２５は天然発生ＳＮＡＰ−２５またはそのバリアントのみでよい。例えば以下の確立された細胞株は内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する：ＢＥ（２）−Ｍ１７、Ｋｅｌｌｙ、ＬＡ１−５５ｎ、Ｎ１Ｅ−１１５、Ｎ４ＴＧ３、Ｎ１８、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＮＧ１０８−１５、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃ。
本明細書で使用される際には「外因性ＳＮＡＰ−２５」なる用語は、ヒトの用手操作によりＳＮＡＰ−２５の外部供給源またはＳＮＡＰ−２５をコードする遺伝材料の外部供給源の導入を介して細胞において発現されるＳＮＡＰ−２５を指す。外因性ＳＮＡＰ−２５の発現は例えば細胞分化のような環境刺激を伴っても、または伴わなくてもよい。非限定例としては、確立された細胞株からの細胞はＳＮＡＰ−２５の一過性の、または安定したトランスフェクションにより外因性ＳＮＡＰ−２５を発現することができる。別の非限定例としては、確立された細胞株からの細胞はＳＮＡＰ−２５のタンパク質トランスフェクションにより外因性ＳＮＡＰ−２５を発現することができる。外因性ＳＮＡＰ−２５は天然発生ＳＮＡＰ−２５もしくはそのバリアント、または非天然発生ＳＮＡＰ−２５もしくはそのバリアントでよい。
故に実施態様では、確立された細胞株からの細胞は内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する。この実施態様の態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＳＮＡＰ−２５は天然発生ＳＮＡＰ−２５である。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＳＮＡＰ−２５は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４である。この実施態様のなおさらなる態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＳＮＡＰ−２５は例えばＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプのような天然発生ＳＮＡＰ−２５である。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＳＮＡＰ−２５は、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４と例えば少なくとも７０％のアミノ酸同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然発生ＳＮＡＰ−２５である。
別の実施態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して外因性ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。この実施態様の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４の天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。この実施態様のなおその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して例えばＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプのような天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。この実施態様のさらにその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４と例えば少なくとも７０％のアミノ酸同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。
実施態様の別の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して非天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４と例えば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する非天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４に相対して、例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の非隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。この実施態様のなおその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４に相対して、例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＳＮＡＰ−２５を発現するために操作される。
ＢｏＮＴ／Ａへの暴露の後にＢｏＮＴ／Ａ基質の切断を検出するアッセイを用いて、細胞が内因性または外因性ＳＮＡＰ−２５を発現しているかどうかを評価することができる。これらのアッセイではＳＮＡＰ−２５を発現する細胞においてＢｏＮＴ／Ａ処理の後にＳＮＡＰ−２５切断生成物の作成を検出する。特異的ウェスタンブロット分析の非限定例、ならびに十分に特徴付けされた試薬、条件およびプロトコールを、限定するものではないが、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ；Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA；Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL；Promega Corporation, Madison, WI；およびStratagene, Inc., La Jolla, CA.を含む商業用の製造供給元から容易に入手可能である。ＳＮＡＰ−２５切断に関するこれらのおよび類似のアッセイは、内因性または外因性ＳＮＡＰ−２５を発現する細胞を同定するのに有用であり得る。
非限定例としては、ＢｏＮＴ／Ａ ＳＮＡＰ−２５切断生成物またはＳＮＡＰ−２５の切断および未切断双方の形態を認識する抗体を使用するウェスタンブロット分析を用いてＢｏＮＴ／Ａの取り込みに関して検定することができる。これらのアッセイに有用なα−ＳＮＡＰ−２５抗体の実例には、限定するものではないが、α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体ＳＭＩ−８１（Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD）、マウスα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体ＣＩ７１.１（Synaptic Systems, Goettingen, Germany）、α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体ＣＩ７１.２（Synaptic Systems, Goettingen, Germany）、α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体ＳＰ１２（Abcam, Cambridge, MA）、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清（Synaptic Systems, Goettingen, Germany）、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清（Abcam, Cambridge, MA）およびα−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清Ｓ９６８４（Sigma, St Louis, MO）が含まれる。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａ受容体を含んでなる。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ受容体」なる用語は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒応答を引き出す様式でＢｏＮＴ／Ａと優先的に相互作用する天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体または非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体のいずれかを指す。本明細書で使用される際には「優先的に相互作用する」なる用語は、ＢｏＮＴ／Ａ受容体に関するＢｏＮＴ／Ａの平衡解離定数（ＫＤ）が、細胞表面の任意のその他の受容体に関するＢｏＮＴ／Ａのものよりも少なくとも１桁小さいことを指す。ＢｏＮＴ／Ａ−ＢｏＮＴ／Ａ受容体複合体がその構成要素分子、すなわちＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａ受容体に可逆的に分離（解離）する傾向を測定する平衡定数の具体的な型である平衡解離定数は、平衡時のＫＤ＝Ｋａ／Ｋｄとして定義される。会合定数（Ｋａ）はＫａ＝［Ｃ］／［Ｌ］［Ｒ］として定義され、そして解離定数（Ｋｄ）はＫｄ＝［Ｌ］［Ｒ］／［Ｃ］として定義され、ここで［Ｌ］はＢｏＮＴ／Ａのモル濃度に等しく、［Ｒ］はＢｏＮＴ／Ａ受容体のモル濃度であり、そして［Ｃ］はＢｏＮＴ／Ａ−ＢｏＮＴ／Ａ受容体複合体のモル濃度であり、そしてここで全ての濃度は系が平衡にあるときのかかる構成要素のものである。解離定数が小さいほど、ＢｏＮＴ／Ａはその受容体により強固に結合するか、またはＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ａ受容体との間の結合アフィニティーがより高くなる。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体に関するＢｏＮＴ／Ａの解離定数は、任意のその他の受容体に関するＢｏＮＴ／Ａのものよりも少なくとも２桁小さく、少なくとも３桁小さく、少なくとも４桁小さく、または少なくとも５桁小さい。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体と優先的に相互作用するＢｏＮＴ／Ａの結合アフィニティーは例えば５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下または１００ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体と優先的に相互作用するＢｏＮＴ／Ａの結合アフィニティーは例えば９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下または１０ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ中毒応答を引き出す」なる用語は、ＢｏＮＴ／Ａ受容体がＢｏＮＴ／Ａと相互作用して神経毒／受容体複合体を形成し、そして引き続きその複合体が細胞の細胞質へ内部移行する能力を指す。
本明細書で使用される際には「天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体」なる用語は、限定するものではないが、翻訳後修飾、選択的スプライシングされた転写物、または自然突然変異から生成されるＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォーム、およびＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプを含む天然発生過程により生成される任意のＢｏＮＴ／Ａ受容体を指す。天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体には、限定するものではないが、「ボツリヌス毒素スクリーニングアッセイ」Ester Fernandez−Salasら、米国特許出願公開第２００８／０００３２４０号；「ボツリヌス毒素スクリーニングアッセイ」Ester Fernandez−Salasら、米国特許出願公開第２００８／０１８２７９９号；「ＳＶ２はボツリヌス神経毒Ａに関するタンパク質受容体である」Min Dongら、Science（2006）；「シナプス性小胞タンパク質２Ｃはボツリヌス神経毒Ａの横隔神経への取り込みを媒介する」S. Mahrhold et al, FEBS Lett. 580（8）：2011−2014（2006）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるものような、芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、シナプス性小胞糖タンパク質２（ＳＶ２）およびＧＴ１ｂ様複合体ガングリオシドが含まれる。天然発生ＦＧＦＲ２には限定するものではないが、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９および配列番号：７０、または配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９および配列番号：７０から例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、もしくは１００個以上のアミノ酸を置換、欠失もしくは付加したものが含まれる。天然発生ＦＧＦＲ３には限定するものではないが、配列番号：２５、配列番号：２６および配列番号：２７、または配列番号：２５、配列番号：２６および配列番号：２７から例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、もしくは１００個以上のアミノ酸を置換、欠失もしくは付加したものが含まれる。天然発生ＳＶ２には限定するものではないが、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０および配列番号：３１、または配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０および配列番号：３１から例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、もしくは１００個以上のアミノ酸を置換、欠失もしくは付加したものが含まれる。
本明細書で使用される際には「非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体バリアント」なる用語は、限定するものではないが、無作為変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生成されたＢｏＮＴ／Ａ受容体、および化学合成により生成されたＢｏＮＴ／Ａ受容体を含む、ヒトの用手操作を援用して生成されたまたは設計された任意のＢｏＮＴ／Ａ受容体を指す。非天然発生ＢｏＮＴ／Ａバリアントの非限定例には、例えば保存ＢｏＮＴ／Ａ受容体バリアント、非保存ＢｏＮＴ／Ａ受容体バリアント、ＢｏＮＴ／Ａ受容体キメラバリアントおよび活性なＢｏＮＴ／Ａ受容体フラグメントが含まれる。
本明細書で使用される際には「非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体」なる用語は、限定するものではないが、無作為変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生成されたＢｏＮＴ／Ａ受容体、およびインビトロ化学合成により生成されたＢｏＮＴ／Ａ受容体を含む、その構造がヒトの用手操作を援用して修飾された任意のＢｏＮＴ／Ａ受容体を指す。非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体の非限定例は例えば「ボツリヌス毒素スクリーニングアッセイ」Ester Fernandez−Salasら、米国特許出願公開第２００８／０００３２４０号；「ボツリヌス毒素スクリーニングアッセイ」Ester Fernandez−Salasら、米国特許出願公開第２００８／０１８２７９９号（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０からの例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上のアミノ酸を置換、欠失または付加できる。
故に実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体は例えばＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２のような天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体はＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプである。この実施態様の態様では、天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０の天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。この実施態様のその他の態様ではＢｏＮＴ／Ａ受容体は、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０と例えば少なくとも７０％のアミノ酸同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。
別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体は例えば遺伝子操作されたＦＧＦＲ２、遺伝子操作されたＦＧＦＲ３または遺伝子操作されたＳＶ２のような非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。この実施態様のその他の態様ではＢｏＮＴ／Ａ受容体は、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０と例えば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。この実施態様のその他の態様ではＢｏＮＴ／Ａ受容体は、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の非隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。この実施態様のなおその他の態様ではＢｏＮＴ／Ａ受容体は、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。
ＢｏＮＴ／Ａ受容体は内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体でよい。本明細書で使用される際には「内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体」なる用語は、それが細胞のゲノム内で天然にコードされるので、ＢｏＮＴ／Ａ受容体の外部供給源またはＢｏＮＴ／Ａ受容体をコードする遺伝材料の外部供給源を必要とせずに細胞が生来的にＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するように細胞に天然に存在するＢｏＮＴ／Ａ受容体を指す。内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体の発現は例えば細胞分化またはプロモーター活性化のような環境刺激を伴っても、または伴わなくてもよい。例えば以下の確立された細胞株は少なくとも１つの内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する：ＢＥ（２）−Ｍ１７、Ｋｅｌｌｙ、ＬＡ１−５５ｎ、Ｎ１Ｅ−１１５、Ｎ４ＴＧ３、Ｎ１８、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＮＧ１０８−１５、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃ。内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体またはその天然発生バリアントのみでよい。
本明細書で使用される際には「外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体」なる用語は、ヒトの用手操作によりＢｏＮＴ／Ａ受容体の外部供給源またはＢｏＮＴ／Ａ受容体をコードする遺伝材料の外部供給源の導入を介して細胞において発現されたＢｏＮＴ／Ａ受容体を指す。外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体の発現は例えば細胞分化またはプロモーター活性化のような環境刺激を伴っても、または伴わなくてもよい。非限定例としては、確立された細胞株からの細胞は例えばＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２のようなＢｏＮＴ／Ａ受容体をコードするポリヌクレオチド分子の一過性の、または安定したトランスフェクションにより１つまたはそれより多い外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現することができる。別の非限定例としては、確立された細胞株からの細胞は、例えばＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２のようなＢｏＮＴ／Ａ受容体のタンパク質トランスフェクションにより１つまたはそれより多い外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現することができる。外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体もしくはその天然発生バリアント、または非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体もしくはその非天然発生バリアントでよい。
故に実施態様では、確立された細胞株からの細胞は内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。この実施態様の態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０である。この実施態様のなおさらなる態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は、例えばＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプのような天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞により発現される内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０と例えば少なくとも７０％のアミノ酸同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体である。
別の実施態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。この実施態様の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０の天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。この実施態様のなおその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して例えばＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプのような天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。この実施態様のさらにその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０と例えば少なくとも７０％のアミノ酸同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。
実施態様の別の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０と例えば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。この実施態様のその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の非隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。この実施態様のなおその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０に相対して例えば１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または１００個以上の隣接アミノ酸置換、欠失または付加を有する非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するために操作される。
別の実施態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して外因性ＦＧＦＲ２、外因性ＦＧＦＲ３、外因性ＳＶ２または任意のその組み合わせを発現するために操作される。この実施態様の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して天然発生ＦＧＦＲ２、天然発生ＦＧＦＲ３、天然発生ＳＶ２または任意のその組み合わせを発現するために操作される。この実施態様のなおその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して非天然発生ＦＧＦＲ２、非天然発生ＦＧＦＲ３、非天然発生ＳＶ２または任意のその組み合わせを発現するために操作される。この実施態様のさらにその他の態様では、確立された細胞株からの細胞は一過性に、または安定して天然発生ＦＧＦＲ２もしくは非天然発生ＦＧＦＲ２、天然発生ＦＧＦＲ３もしくは非天然発生ＦＧＦＲ３、天然発生ＳＶ２もしくは非天然発生ＳＶ２、または任意のその組み合わせを発現するために操作される。
毒素取り込みに関する直接的および間接的アッセイを含む常法により、１つまたはそれより多い内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞を同定することができる。ＢｏＮＴ／Ａ結合または取り込み特性を決定するアッセイを用いて、細胞がＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現しているかどうかを評価することができる。かかるアッセイには、限定するものではないが、例えば［１２５Ｉ］ＢｏＮＴ／Ａ、［１２５Ｉ］のような標識ＢｏＮＴ／Ａを使用する架橋アッセイが含まれ、例えば「クロストリジウムボツリヌスＣ型神経毒の様々な神経芽細胞腫細胞株への結合」Noriko Yokosawa et al., Infect. Immun. 57（1）：272−277（1989）；「ボツリヌスＣｌ、ＤおよびＥ型神経毒のニューロン細胞株およびシナプトソームへの結合」Noriko Yokosawa et al. Toxicon 29（2）：261−264（1991）；および「ラット脳シナプトソームにおけるクロストリジウムボツリヌスＢ型神経毒に関するタンパク質受容体の同定」Tei−ichi Nishiki et al., J. Biol. Chem. 269（14）：10498−10503（1994）を参照されたい。その他の非限定的なアッセイには、標識または未標識抗体を使用してＢｏＮＴ／Ａ結合を検出する免疫細胞化学アッセイ（例えば「クロストリジウムボツリヌスＣ型前駆体毒素のＨＴ−２９細胞への内部移行のための受容体およびトランスポーター」Atsushi Nishikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 319（2）：327−333（2004）参照）および標識または未標識抗体を使用して結合毒素を検出する免疫沈降アッセイ（例えば「腸上皮細胞および赤血球に関するクロストリジウムボツリヌスＣ型前駆体毒素の結合サブコンポーネントの分子特徴付け」Yukako Fujinaga et al., Microbiology 150（Pt 5）：1529−1538（2004）参照）が含まれる。これらのアッセイに有用な抗体には、限定するものではないが、ＢｏＮＴ／Ａに対して選択された抗体、例えばＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３もしくはＳＶ２のようなＢｏＮＴ／Ａ受容体に対して選択された抗体、および／または例えばＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３、ＧＱ１ｂもしくはＧＴ１ｂのようなガングリオシドに対して選択された抗体が含まれる。抗体が標識されている場合、当業者に周知の技術を用いて、ウェスタンブロット分析、抗体の細胞位置の直接顕微鏡的観察、洗浄工程、フローサイトメトリー、電気泳動またはキャピラリー電気泳動後の細胞または基質結合抗体の測定を含む種々の手段により分子の結合を検出することができる。抗体が未標識である場合、結合分子の間接的検出のための標識二次抗体を用いることができ、そして標識抗体に関するように検出を進めることができる。ＢｏＮＴ／Ａ取り込み特性または特徴を決定するこれらのおよび類似のアッセイが内因性または外因性またはＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞を同定するのに有用であり得るということは理解される。
ＢｏＮＴ／Ａへの暴露の後の分子の放出をモニタリングするアッセイを用いて、細胞が１つまたはそれより多い内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現しているかどうかを評価することもできる。これらのアッセイでは、ＢｏＮＴ／Ａ処理の後、ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現している細胞において分子の放出の阻止が生じるであろう。周知のアッセイには、ニューロンからの例えば［３Ｈ］ノルアドリナリンまたは［３Ｈ］ドーパミン放出のような放射標識カテコラミン放出の阻止を測定する（例えば「破傷風毒素およびボツリヌス毒素Ｆ型に感度が低いカルシウム依存性小胞伝達物質放出に関する証拠」A Fassio et al., Neuroscience 90（3）：893−902（1999）；および「カテコラミン放出のボツリヌス毒素Ｃ１およびＥに対する感度により容易に放出可能なプールに設定された小胞の選択的なターゲティングが示唆される」Sara Stigliani et al., J. Neurochem. 85（2）：409−421（2003）参照）または蛍光定量的な手順を用いてカテコラミン放出を測定する（例えば「エクトアクセプター（ecto−acceptors）に結合し、そして細胞内伝達物質放出を阻止する毒素誘導体により表されるボツリヌス神経毒Ａの内部移行における鎖間ジスルフィドまたその関与するチオールの役割」Anton de Paiva et al., J. Biol. Chem. 268（28）：20838−20844（1993）；「ボツリヌス毒素ＡまたはＢによる２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）またはシナプトブレビンの切断後のインタクトな、および透過処理されたクロム親和性細胞の明確なエキソサイトーシス応答」Gary W. Lawrence et al., Eur. J. Biochem. 236（3）：877−886（1996）；および「インタクトな、および透過処理されたクロム親和性細胞においてボツリヌス神経毒Ｃ１はシンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５の双方を切断する：カテコラミン放出のその遮断との相関」Patrick Foran et al., Biochemistry 35（8）：2630−2636（1996）参照）方法が含まれる。その他の非限定例には、例えば下垂体前葉細胞または卵巣細胞のような内分泌細胞からのホルモン放出の阻止を測定するアッセイが含まれる。分子放出に関するこれらのおよび類似のアッセイが内因性または外因性またはＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞を同定するのに有用であり得るということは理解される。
ＢｏＮＴ／Ａへの暴露の後にＢｏＮＴ／Ａ基質の切断を検出するアッセイを用いて、細胞が１つまたはそれより多い内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現しているかどうかを評価することもできる。これらのアッセイでは、ＢｏＮＴ／Ａ処理後、ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞においてＢｏＮＴ／Ａ基質切断生成物の作成またはインタクトなＢｏＮＴ／Ａ基質の消失を検出する。特異的ウェスタンブロット分析の非限定例、ならびに十分に特徴付けされた試薬、条件およびプロトコールを、限定するものではないが、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ；Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA；Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL；Promega Corporation, Madison, WI；およびStratagene, Inc., La Jolla, CA. を含む商業的な製造供給元から容易に入手可能である。ＢｏＮＴ／Ａ基質切断に関するこれらのおよび類似のアッセイは、内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞を同定するのに有用であり得る。
非限定例としては、ＢｏＮＴ／Ａ ＳＮＡＰ−２５切断生成物またはＳＮＡＰ−２５の切断および未切断双方の形態を認識する抗体を使用するウェスタンブロット分析を用いてＢｏＮＴ／Ａの取り込みに関して検定することができる。これらのアッセイに有用なα−ＳＮＡＰ−２５抗体の実例には、限定するものではないが、ＳＭＩ−８１α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体（Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD）、ＣＩ７１.１マウスα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体（Synaptic Systems, Goettingen, Germany）、ＣＩ７１.２α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体（Synaptic Systems, Goettingen, Germany）、ＳＰ１２α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体（Abcam, Cambridge, MA）、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清（Synaptic Systems, Goettingen, Germany）、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清Ｓ９６８４（Sigma, St Louis, MO）およびα−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清（Abcam, Cambridge, MA）が含まれる。
本開示の態様は、遺伝子用手操作または組換え操作を介して外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つもしくはそれより多い外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するように作られた細胞を提供する。遺伝子用手操作または組換え操作を介して外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つもしくはそれより多い外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するのに有用な細胞には、内因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つもしくはそれより多い内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現しても、またはしなくてもよいニューロン細胞および非ニューロン細胞が含まれる。かかる遺伝子用手操作または組換え操作された細胞は構成的、組織特異的、細胞特異的または誘導プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントまたは双方の制御下で外因性ＳＮＡＰ−２５および１つまたはそれより多い外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現できることはさらに理解される。外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つもしくはそれより多い外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するように細胞を遺伝子用手操作または組換え操作することができる限り、任意の細胞が有用であり、そしてＢｏＮＴ／Ａ中毒を起こすことが可能であることは理解される。
それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解により例えばＳＮＡＰ−２５、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２のようなＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために、細胞に必要な構成要素をコードする外因性ポリヌクレオチド分子を細胞へ導入するために有用な方法には、限定するものではないが、例えばリン酸カルシウム媒介、ジエチル−アミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン媒介、脂質媒介、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介、ポリリジン媒介およびポリブレン媒介のような化学媒介分配方法；例えばバイオリスティック粒子分配、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーションのような物理学媒介方法；ならびに例えばレトロウイルス媒介トランスフェクションのようなウイルス媒介分配方法が含まれ、例えば「クローン化された遺伝子の培養哺乳動物細胞への導入」Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. pp. 16.1−16.62（2001）；「哺乳動物細胞における外来遺伝子の移行および発現」Alessia Colosimo et al., Biotechniques 29（2）：314−318, 320−322, 324（2000）；「ニューロンへの遺伝子移入のための技術」Philip Washbourne & A. Kimberley McAllister, Philip Washbourne & A. Kimberley McAllister, Curr. Opin. Neurobiol. 12（5）：566−573（2002）；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, pp 9.16.4−9.16.11（2000）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。ポリヌクレオチド分子を細胞に導入するための具体的な方法の選択は一部では、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な構成要素を、細胞が一過性に、または安定して含有するかどうかに依存することは当業者には理解される。それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な構成要素をコードするポリヌクレオチド分子の非限定例は以下のとおりである：配列番号：１３０、配列番号：１３１、配列番号：１３２、配列番号：１３３、配列番号：１３４、配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７または配列番号：１３８のＦＧＦＲ２ポリヌクレオチド分子；配列番号：１３９、配列番号：１４０または配列番号：１４１のＦＧＦＲ３ポリヌクレオチド分子；配列番号：１４２、配列番号：１４３または配列番号：１４４のＳＶ２ポリヌクレオチド分子；および配列番号：１４５または配列番号：１４６のＳＮＡＰ−２５ポリヌクレオチド分子。
化学媒介分配方法は当業者に周知であり、そして例えば「リン酸カルシウムによる接着および懸濁細胞のトランスフェクション」Martin Jordan & Florian Worm, Methods 33（2）：136−143（2004）；「脳由来細胞へのプラスミド分配のためのポリエチレンイミン計画」Chun Zhang et al., Methods 33（2）：144−150（2004）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。かかる化学媒介分配方法を標準的な手順により調製することができ、そして市販により入手可能であり、例えばCellPhectトランスフェクションキット（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）；哺乳動物トランスフェクションキット、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥデキストラン（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）；Lipofectamine（商標）トランスフェクション試薬（Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA）；ExGen 500トランスフェクションキット（Fermentas, Inc., Hanover, MD）およびSuperFectおよびEffecteneトランスフェクションキット（Qiagen, Inc., Valencia, CA）を参照されたい。
物理学媒介方法は当業者に周知であり、そして例えば「バイオリスティックス技術を用いるニューロンにおけるプラスミド媒介遺伝子移入」Jeike E. Biewenga et al., J. Neurosci. Methods. 71（1）：67−75（1997）；「バイオリスティックおよびジオリスティックトランスフェクション：遺伝子銃を使用してＤＮＡおよび親油性色素を哺乳動物細胞に分配する」John O’Brien & Sarah C. R. Lummis, Methods 33（2）：121−125（2004）；「インビトロおよびインビボ電場媒介透過処理、遺伝子移入および発現」M. Golzio et al., Methods 33（2）：126−135（2004）；および「初代細胞への遺伝子移入のための新しい非ウイルス方法」Oliver Greschet al., Methods 33（2）：151−163（2004）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
ウイルス媒介分配方法は当業者に周知であり、そして例えば「アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター」Chooi M. Lai et al.,DNA Cell Biol. 21（12）：895−913（2002）；「アルファウイルス基盤発現ベクター：計画および適用」Ilya Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93（21）：11371−11377（1996）；「ＤＮＡの哺乳動物への分配のためのレンチウイルスベクター」Roland Wolkowicz et al., Methods Mol. Biol. 246：391−411（2004）；「バキュロウイルスベクター：新規哺乳動物細胞遺伝子分配ベヒクルおよびその適用」A. Huser & C. Hofmann, Am. J. Pharmacogenomics 3（1）：53−63（2003）；「哺乳動物細胞の形質導入のためのレトロウイルスおよびレンチウイルス基盤ベクターの一過性生成」Tiziana Tonini et al., Methods Mol. Biol. 285 ：141−148（2004）；「テトラサイクリン応答プロモーターによる真核細胞における遺伝子発現の厳格な制御」Manfred GossenおよびHermann Bujard、米国特許第５４６４７５８号；「遺伝子発現を調節するための方法」Hermann BujardおよびManfred Gossen、米国特許第５８１４６１８号；「昆虫ステロイドホルモン受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび同一物で形質転換された細胞」David S. Hogness、米国特許第５５１４５７８号；「昆虫エクジソン受容体をコードするポリヌクレオチド」David S. Hogness、米国特許第６２４５５３１号；「Ｃ末端ホルモン結合ドメイントランケーションを有するプロゲステロン受容体」Elisabetta Vegetoら、米国特許第５３６４７９１号；「変異したステロイドホルモン受容体、その使用のための方法および遺伝子治療のための分子スイッチ」Elisabetta Vegetoら、米国特許第５８７４５３４号（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。かかるウイルス媒介分配方法を標準的な手順により調製することができ、そして市販により入手可能であり、例えばViraPower（商標）アデノウイルス発現系（Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA）およびViraPower（商標）アデノウイルス発現系説明マニュアル２５−０５４３バージョンＡ、Invitrogen, Inc.（２００２年６月１５日）；ならびにAdEasy（商標）アデノウイルスベクター系（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）およびAdEasy（商標）アデノウイルスベクター系説明マニュアル０６４００４ｆ（Stratagene, Inc.）を参照されたい。さらにかかるウイルス媒介分配系を標準的な方法により調製することができ、そして市販により入手可能であり、例えばBD（商標）Tet−OffおよびTet−On遺伝子発現系（BD Biosciences−Clonetech, Palo Alto, CA）およびBD（商標）Tet−OffおよびTet−On遺伝子発現系ユーザーマニュアルＰＴ３００１−１（BD Biosciences Clonetech）（２００３年３月１４日）、GeneSwitch（商標）系（Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA）および哺乳動物細胞のためのGeneSwitch（商標）系Ａミフェプリストン調節発現系バージョンＤ、２５−０３１３（Invitrogen, Inc.）（２００２年１１月４日）；ViraPower（商標）レンチウイルス発現系（Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA）およびViraPower（商標）レンチウイルス発現系説明マニュアル２５−０５０１バージョンＥ（Invitrogen, Inc.）（２００３年１２月８日）；ならびにComplete Control（登録商標）レトロウイルス誘導哺乳動物発現系（Stratagene, La Jolla, CA）およびComplete Control（登録商標）レトロウイルス誘導哺乳動物発現系説明マニュアル０６４００５ｅを参照されたい。
故に実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な構成要素をコードするポリヌクレオチド分子を一過性に含有する。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な複数の構成要素をコードするポリヌクレオチド分子を一過性に含有する。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＳＶ２またはＳＮＡＰ−２５をコードするポリヌクレオチド分子を一過性に含有する。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、配列番号：１３０、配列番号：１３１、配列番号：１３２、配列番号：１３３、配列番号：１３４、配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７または配列番号：１３８のＦＧＦＲ２をコードするポリヌクレオチド分子を一過性に含有する。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、配列番号：１３９、配列番号：１４０または配列番号：１４１のＦＧＦＲ３をコードするポリヌクレオチド分子を一過性に含有する。この実施態様のなおその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、配列番号：１４２、配列番号：１４３または配列番号：１４４のＳＶ２をコードするポリヌクレオチド分子を一過性に含有する。この実施態様のなおその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、配列番号：１４５または配列番号：１４６のＳＮＡＰ−２５をコードするポリヌクレオチド分子を一過性に含有する。
別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な構成要素をコードするポリヌクレオチド分子を安定して含有する。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な複数の構成要素をコードするポリヌクレオチド分子を安定して含有する。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞はＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＳＶ２またはＳＮＡＰ−２５をコードするポリヌクレオチド分子を安定して含有する。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、配列番号：１３０、配列番号：１３１、配列番号：１３２、配列番号：１３３、配列番号：１３４、配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７または配列番号：１３８のＦＧＦＲ２をコードするポリヌクレオチド分子を安定して含有する。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は配列番号：１３９、配列番号：１４０または配列番号：１４１のＦＧＦＲ３をコードするポリヌクレオチド分子を安定して含有する。この実施態様のなおその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、配列番号：１４２、配列番号：１４３または配列番号：１４４のＳＶ２をコードするポリヌクレオチド分子を安定して含有する。この実施態様のなおその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い確立された細胞株からの細胞は、配列番号：１４５または配列番号：１４６のＳＮＡＰ−２５をコードするポリヌクレオチド分子を安定して含有する。
前記で言及したように、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解により例えば本明細書に開示されるＳＮＡＰ−２５、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２のようなＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な、外因性構成要素を細胞に導入することができる。かかる外因性構成要素を分配剤と共に細胞集団に導入するために有用な任意のおよび全ての方法は、この方法が所定の細胞集団内の細胞の少なくとも５０％に本明細書に開示される外因性構成要素を一過性に導入するという条件で有用であり得る。故にこの実施態様の態様は所定の細胞集団の例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解により例えば本明細書に開示されるＳＮＡＰ−２５、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２のようなＳＮＡＰ−２５基質を切断する全体的な細胞メカニズムを行うために細胞に必要な外因性構成要素を一過性に含有する細胞集団を含み得る。本明細書で使用される際には「分配剤」なる用語は、共有結合で連結された、非共有結合で連結された、または任意のその他の様式で随伴されたポリペプチドの細胞への内部移行を可能に、または増強する任意の分子を指す。故に「分配剤」なる用語は、限定するものではないが、タンパク質。ペプチド、ペプチド擬似物質、小型分子、ポリヌクレオチド分子、リポソーム、脂質、ウイルス、レトロウイルスおよび限定するものではないが、共有結合で、または非共有結合で連結された分子を細胞膜、細胞の細胞質または核に輸送する細胞を包含する。「分配剤」なる用語が受容体媒介エンドサイトーシスを介して機能する分配剤および受容体媒介エンドサイトーシスとは独立しているものを含む任意のメカニズムにより内部移行する分子を包含することはさらに理解される。
分配剤は例えば化学的抱合または遺伝子的に生成された融合タンパク質によるように、共有結合で連結されたＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＳＶ２またはＳＮＡＰ−２５様の構成要素の細胞取り込みを可能に、または増強する薬剤でもよい。分配剤に共有結合で連結する方法およびかかる薬剤を使用する方法は例えば「タンパク質形質導入系およびその使用方法」Steven F. Dowdy、国際公開第ＷＯ００／３４３０８号；「活性分子の細胞内アドレッシングのためのベクターとして使用することができるペプチド」Gerard ChassaingおよびAlain Prochiantz、米国特許第６０８０７２４号；「ＴＡＴ由来の輸送部分を含んでなる融合タンパク質」Alan Frankelら、米国特許第５６７４９８０号；「ＴＡＴ由来の輸送ポリペプチド抱合体」Alan Frankelら、米国特許第５７４７６４１号；「ＴＡＴ由来の輸送ポリペプチドおよび融合タンパク質」Alan Frankelら、米国特許第５８０４６０４号；「輸送タンパク質の使用」Peter F. J. O’Hareら、米国特許第６７３４１６７号；「生物学的に活性な分子の細胞への移入のための方法」Yao−Zhong LinおよびJack J. Hawiger、米国特許第５８０７７４６号；「生物学的に活性な分子の細胞への移入のための方法」Yao−Zhong LinおよびJack J. Hawiger、米国特許第６０４３３３９号；「細胞膜転位置活性を有するタンパク質の遺伝子操作のための配列および方法」Yao−Zhong Linら、米国特許第６２４８５５８号；「細胞膜転位置活性を有するタンパク質の遺伝子操作のための配列および方法」Yao−Zhong Linら、米国特許第６４３２６８０号；「生物学的に活性な分子の細胞への移入のための方法」Jack J. Hawigerら、米国特許第６４９５５１８号；「細胞膜転位置活性を有するタンパク質の遺伝子操作のための配列および方法」Yao−Zhong Linら、米国特許第６７８０８４３号；「生物学的膜をわたる輸送を増強するための方法および組成物」Jonathan B. RothbardおよびPaul A Wender、米国特許第６３０６９９３号；「生物学的膜をわたる輸送を増強するための方法および組成物」Jonathan B. RothbardおよびPaul A Wender、米国特許第６４９５６６３号；ならびに「タンパク質分配のための融合タンパク質」Pamela B. Davisら、米国特許第６２８７８１７号（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
分配剤はＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＳＶ２またはＳＮＡＰ−２５様の非共有結合で随伴された構成要素の細胞取り込みを可能に、または増強する薬剤でもよい。共有結合連結の不在下で機能する方法およびかかる薬剤を使用する方法は例えば「ペプチド媒介トランスフェクション剤および使用の方法」Gilles Divitaら、米国特許第６８４１５３５号；「細胞内タンパク質分配組成物および使用の方法」Philip L FelgnerおよびOlivier Zelphati、米国特許出願公開第２００３／０００８８１３号；ならびに「小型分子、タンパク質および核酸の細胞内分配」Michael Karas、米国特許出願公開第２００４／０２０９７９７号（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。かかるペプチド分配剤を標準的な方法により調製および使用することができ、そして市販により入手可能であり、例えばCHARIOT（商標）試薬（Active Motif, Carlsbad, CA）；BIO−PORTER（登録商標）試薬（Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA）、BIO TREK（商標）タンパク質分配試薬（Stratagene, La Jolla, CA）およびPRO−JECT（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL）を参照されたい。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料を含んでなる。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料」なる用語は活性なＢｏＮＴ／Ａを含有するかまたは潜在的に含有する任意の生物学的物質を指す。限定するものではないが、精製された、部分的に精製されたまたは未精製のＢｏＮＴ／Ａ；天然または非天然発生配列を有する組換え一本鎖または二鎖毒素；修飾されたプロテアーゼ特異性を有する組換えＢｏＮＴ／Ａ；改変された細胞特異性を有する組換えＢｏＮＴ／Ａ；バルクＢｏＮＴ／Ａ；例えばBOTOX（登録商標）、DYSPORT（登録商標）／RELOXIN（登録商標）、XEOMIN（登録商標）、PURTOX（登録商標）、NEURONOX（登録商標）、ＢＴＸ−Ａを含む処方されたＢｏＮＴ／Ａ生成物、および；例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳動物供給源からの細胞または粗製、分画化もしくは部分的に精製された細胞ライゼート；血液、血漿または血清；生の、調理された、部分的に調理されたまたは加工された食物；飲料；動物飼料；土壌試料；水試料；池底質；ローション；化粧品；ならびに臨床処方物を含む種々の試料を本明細書に開示される方法に従って検定することができる。試料なる用語は限定するものではないが、哺乳動物組織試料、ヒツジ、ウシおよびブタ組織試料のような家畜組織試料；霊長類組織試料；ならびにヒト組織試料を含む組織試料を包含することは理解される。かかる試料は限定するものではないが、乳児腸試料のような腸試料、および創傷から得られた組織試料を包含する。非限定例としては、ピコモル濃度量のＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法は、食物もしくは飲料試料中のＢｏＮＴ／Ａの存在もしくは活性を決定するために；例えばＢｏＮＴ／Ａに暴露された、または１つもしくはそれより多いボツリヌス症の病徴を有するヒトもしくは動物からの試料を検定するために；バルクＢｏＮＴ／Ａの生成および精製の間の活性を追跡するために；医薬用もしくは化粧用適用において使用される処方されたＢｏＮＴ／Ａ生成物を検定するために；またはα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して対象の血清を検定するために；有用であり得る。
故に実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料は任意の量のＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料である。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料は約１００ｎｇ以下、約１０ｎｇ以下、約１ｎｇ以下、約１００ｐｇ以下、約１０ｐｇ以下または約１ｐｇ以下のＢｏＮＴ／Ａを含んでなる。この実施態様のその他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料は約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約１００ｆＭ以下、約１０ｆＭ以下または約１ｆＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを含んでなる。
本開示の態様は一部では処理された細胞から、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離することを含んでなる。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素」なる用語は、ＳＮＡＰ−２５切断生成物を含有する細胞構成要素を指す。限定するものではないが、細胞溶解プロトコール、スピンカラム精製プロトコール、免疫沈降、アフィニティー精製およびタンパク質クロマトグラフィーを含む、ＳＮＡＰ−２５構成要素を富化または単離するために適当な任意の方法が有用であり得るということは想定される。
本開示の態様は一部では固相支持体に連結されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んでなる。本明細書で使用される際には「固相支持体」なる用語は「固相」と同義であり、そして本明細書において開示されるα−ＳＮＡＰ−２５抗体の固定のために使用することができる任意のマトリックスを指す。固相支持体の非限定例には、例えばチューブ；プレート；カラム；ピンまたは「ディップスティック」；磁性粒子、ビーズまたは例えばアガロース、セファロース、シリカおよびプラスチックのようなその他の球状もしくは繊維状のクロマトグラフィー媒質；ならびに例えばニトロセルロースおよびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）のようなシートまたは膜が含まれる。例えばガラス、炭素、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、ジアゾセルロースまたはデンプンのような多様な材料を使用して固相支持体を構築することができる。選択される固相支持体は、可溶性または未結合材料からそれを容易に分離させる物理学的特性を有し得て、そして一般に例えば過剰の試薬、反応副産物または溶媒のような未結合材料を（例えば洗浄、濾過、遠心等により）固相支持体結合アッセイ構成要素から分離またはそうでなければ除去することを可能にする。固相支持体の作成および使用の仕方の非限定例は例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual, supra,（2001）；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, supra,（2004）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出することを含んでなる。シグナル対ノイズ比がバックグラウンドシグナルからの、抗体−抗原複合体からのシグナルを統計的に有意な程度まで区別することができるという条件で、任意の検出系を使用してこの開示された免疫基盤の方法の態様を実行できるということは想定される。免疫基盤の検出系の非限定例には、ウェスタンブロッティングおよびドットブロッティング様の免疫ブロット分析、免疫沈降分析、酵素結合性免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）およびサンドイッチＥＬＩＳＡが含まれる。撮像またはリン光体撮像を伴うオートラジオグラフィー（ＡＵ）、化学発光（ＣＬ）、電気化学発光（ＥＣＬ）、生物発光（ＢＬ）、蛍光、共鳴エネルギー転移、平面偏光、比色分析またはフローサイトメトリー（ＦＣ）を用いてシグナルの検出を達成することができる。免疫基盤の検出系の記載は例えば「化学発光」Michael M.Rauhut, Kirk−Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology（Ed. Grayson, 3rd ed, John Wiley and Sons, 1985）；「電気化学発光の分析適用における最近の動向の概説」」A. W. Knight, Trends Anal. Chem. 18（1）：47−62（1999）；「化学分析における電気化学発光の最近の適用」K.A.Fahnrich et al. Talanta 54（4）：531−559（2001）；「分子クローニングにおいて一般的に使用される技術」pp. A8.1−A8−55（Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001）；「検出系」 pp. A9.1−A9−49（Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rded. 2001）；Electrogenerated Chemiluminescence（Ed. Allen J. Bard, Marcel Dekker, Inc., 2004）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に開示される。
サンドイッチＥＬＩＳＡ（またはサンドイッチイムノアッセイ）は抗原上の異なるエピトープに結合する２つの抗体に基づく方法である。目的の抗原に関して高い結合特異性を有する捕捉抗体は固体表面に結合している。次いで抗原を添加し、続いて検出抗体と称される第２の抗体を添加する。検出抗体は捕捉抗体とは異なるエピトープに抗原を結合する。それ故に抗原は２つの抗体の間で「サンドイッチされる」。抗原に関する抗体結合アフィニティーは通常イムノアッセイ感度の主な決定要因である。抗原濃度が増大するにつれて、検出抗体の量は増大して、測定される応答はより高度に至る。結合の程度を定量するために、例えば二次抗体およびレポーター基質に付着した酵素のような異なるレポーター系を使用することができ、ここで酵素反応は検出シグナルとして読み出しされる。作成されたシグナルは試料中に存在する標的抗原の量に比例する。結合事象を測定するために使用されるレポーター基質が検出形式を決定する。分光光度プレートリーダーを比色検出に使用する。さらにシグナルを増幅し、そして発光リーダーで読み取ることができる化学発光および電気化学発光基質が開発されている。レポーターはまた蛍光読み出しでもよく、ここでアッセイの酵素工程をフルオロフォアで置き換え、そして次いで蛍光リーダーを使用して読み出しを測定する。例外なくＭＳＤサンドイッチＥＬＩＳＡ−ＥＣＬ検出プラットフォーム（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）を含むＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを実施するために必要な試薬およびプロトコールは市販により入手可能である。
故に実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在の検出を、免疫ブロット分析、免疫沈降分析、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して実施することができる。この実施態様の態様では、ＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬもしくはＢＬ免疫ブロット分析、ＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬ、ＢＬもしくはＦＣ免疫沈降分析、ＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬ、ＢＬもしくはＦＣ ＥＬＩＳＡ、またはＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬ、ＢＬもしくはＦＣサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出を実施する。
シングルプレックスまたはマルチプレックス様式で本開示の態様を実行することができる。シングルプレックス様式で実行されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法は、α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在のみを検出するものである。マルチプレックス様式で実行されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法は、１つまたはそれより多い抗体−抗原複合体の存在を同時発生的に検出するものであり；その１つはα−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体であり；そして（複数の）その他のものは第２、第３、第４等の異なるタンパク質に対する抗体−抗原複合体である。例えば検出されるα−ＳＮＡＰ−２５／ＳＮＡＰ−２５抗体−抗原複合体の量を、第２のタンパク質に関して検出される抗体−抗原複合体の量に対して正規化することにより試料対試料変動性を最小化する内部対照として第２のタンパク質を使用することができる。そのように、第２のタンパク質は通常ハウスキーピングタンパク質のような、細胞により一貫して発現されるものである。有用な第２のタンパク質の非限定例には、例えばグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、シンタキシン、サイトカインが含まれる。マルチプレックス様式で免疫基盤のアッセイを実施する方法は例えば「マイクロアレイ形式のマルチプレックスサンドイッチアッセイ」U. B. Nielsen and B. H. Geierstanger, J. Immunol. Methods. 290（1−2）：107−120 （2004）；「抗体アレイを使用する定量的タンパク質プロファイリング」R. Barry and M, Soloviev, Proteomics, 4（12）：3717−3726（2004）；「マルチプレックス分子診断学およびエマージングマイクロアレイテクノロジーを用いるイムノアッセイ」M. M. Ling et al., Expert Rev Mol Diagn. 7（1）：87−98（2007）；「炎症および加齢研究におけるサイトカイン測定のためのＥＬＩＳＡおよびマルチプレックステクノロジー」S. X. Leng et al., J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63（8）：879−884（2008）（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
故に１つの実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を、α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在のみを検出することによりシングルプレックス様式で実行する。別の実施態様では、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を、α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物および例えばＧＡＰＤＨまたはシンタキシンのようなＳＮＡＰ−２５以外のタンパク質に対する少なくとも１つのその他の抗体−抗原複合体を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を同時発生的に検出することによりマルチプレックス様式で実行する。
本開示の態様は一部ではＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法を提供する。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性」なる用語は、その哺乳動物の免疫応答が直接的または間接的のいずれかで治療の有効性を低減するために、ＢｏＮＴ／Ａ治療に対して十分に応答しない、またはＢｏＮＴ／Ａ治療の有益な効果の低減を示す哺乳動物を意味する。有効性の低減の非限定例は、毒素の特異性または活性を低減または防御する様式でＢｏＮＴ／Ａ毒素に結合する、少なくとも１つのα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の哺乳動物における存在であろう。本明細書で使用される際には「ＢｏＮＴ／Ａ治療」なる用語は、ＢｏＮＴ／Ａ毒素を使用する神経調節を必要とする哺乳動物における何か望ましくないものを相殺する処置、療法、治癒、回復、リハビリテーションもしくは任意のその他の手段、または１回もしくはそれより多くの制御された用量の、医学的、治療的、治癒的、美容的、療法的もしくは任意のその他の有益な効果を有するＢｏＮＴ／Ａ毒素の医薬品、調製物もしくは混合物を哺乳動物に投与することを意味する。ＢｏＮＴ／Ａ治療は限定するものではないが、任意の担体または活性成分と組み合わされ、そして任意の投与経路により投与される任意の処方における任意の天然発生またはその修飾フラグメントの使用を包含する。実例としては周知のＢｏＮＴ／Ａ治療はBOTOX（登録商標）治療である。
本開示の態様は一部では、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られる被験試料を提供する。本明細書で使用される際には「被験試料」なる用語は、少なくとも１つのα−ＢｏＮＴ／Ａ抗体を含有するか、または潜在的に含有する任意の生物学的物質を指す。α−ＢｏＮＴ／Ａ抗体は抗ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体または抗ＢｏＮＴ／Ａ非中和抗体でよい。本明細書で使用される際には「抗ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体」なる用語は、生理学的条件下で毒素がＢｏＮＴ／Ａ治療におけるその効果を奏することを低減または防御するような様式でＢｏＮＴ／Ａ毒素の領域に結合するであろう任意のα−ＢｏＮＴ／Ａ抗体を意味する。本明細書で使用される際には「α−ＢｏＮＴ／Ａ非中和抗体」なる用語は、生理学的条件下でＢｏＮＴ／Ａ毒素の領域に結合するが、毒素がＢｏＮＴ／Ａ治療におけるその効果を奏することを防御しないであろう任意のα−ＢｏＮＴ／Ａ抗体を意味する。限定するものではないが、血液、血漿、血清およびリンパ液を含むα−ＢｏＮＴ／Ａ抗体を含有し得る任意のおよび全ての試料をこの方法において使用することができるということは想定される。加えて限定するものではないが、鳥類ならびにマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ロバ、ウシ、霊長類およびヒトを含む哺乳動物を含む、ＢｏＮＴ／Ａ毒素に対してα−ＢｏＮＴ／Ａ抗体を上昇させることが可能な任意のおよび全ての生物が試料のための供給源として役立ち得る。血液収集および血清調製のための具体的なプロトコールの非限定例は、例えばMarjorie Schaub Di Lorenzo & Susan King Strasinger, BLOOD COLLECTION IN HEALTHCARE（F.A. Davis Company, 2001）；およびDiana Garza & Kathleen Becan−McBride, PHLEBOTOMY HANDBOOK：BLOOD COLLECTION ESSENTIALS（Prentice Hall, 6th ed., 2002）に記載される。これらのプロトコールは日常的な手順であり、十分に当業者の、およびは本明細書の教示からの範囲内である。ＢｏＮＴ／Ａ毒素に対する暴露の前、単回のＢｏＮＴ／Ａ処置の後、多回のＢｏＮＴ／Ａ毒素処置の後、ＢｏＮＴ／Ａ治療に対する抵抗性の発症の前、またはＢｏＮＴ／Ａ治療に対する抵抗性の発症の後に生物から被験試料を入手することができる。
本開示の態様は一部では対照試料を提供する。本明細書で使用される際には「対照試料」なる用語は、被験試料の存在または不在が公知である任意の試料を意味し、そして陰性および陽性対照試料の双方を含む。α−ＢｏＮＴ／Ａ抗体の中和に関する陰性対照試料は、決してＢｏＮＴ／Ａに暴露されたことがなかった個体から入手することができ、そして限定するものではないが、被験試料を供給する同じ個体からからであるが、ＢｏＮＴ／Ａ治療を行う前に取られた試料；ＢｏＮＴ／Ａに決して暴露されたことがない異なる個体から取られた試料；ＢｏＮＴ／Ａに決して暴露されたことがない複数の異なる個体から取られたプールされた試料；を含み得る。α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体に関する陽性対照試料は、ＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を顕在化する個体から入手することができ、そして限定するものではないが、患者基盤の試験アッセイで試験して陽性である個体；インビボバイオアッセイで試験して陽性である個体；および超免疫性を示す個体、例えばＢｏＮＴ／Ａワクチン接種された個体を含む。
α−ＢｏＮＴ／Ａ抗体を試料から精製できることがさらに予見される。限定するものではないが、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含む種々の手順を用いて抗ＢｏＮＴ／Ａ抗体を試料から精製することができる。試料から抗体を精製するための具体的なプロトコールの非限定例は例えばANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL（Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998）；USING ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL：PORABLE PROTOCOL NO I（Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998）；およびMOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, supra,（2001）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。加えて、抗体精製方法ならびに十分に特徴付けされた試薬、条件およびプロトコールの非限定例は、限定するものではないが、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL；およびZymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CAを含む商業的な製造供給元から容易に入手可能である。これらのプロトコールは十分に当業者の範囲内である日常的な手順である。
故に実施態様では試料は血液を含んでなる。この実施態様の態様では試料はマウス血液、ラット血液、ヤギ血液、ヒツジ血液、ウマ血液、ロバ血液、ウシ血液、霊長類血液またはヒト血液を含んでなる。別の実施態様では試料は血漿を含んでなる。この実施態様の態様では被験試料はマウス血漿、ラット血漿、ヤギ血漿、ヒツジ血漿、ウマ血漿、ロバ血漿、ウシ血漿、霊長類血漿またはヒト血漿を含んでなる。別の実施態様では試料は血清を含んでなる。この実施態様の態様では試料はマウス血清、ラット血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ウマ血清、ロバ血清、ウシ血清、霊長類血清およびヒト血清を含んでなる。別の実施態様では試料はリンパ液を含んでなる。この実施態様の態様では試料はマウスリンパ液、ラットリンパ液、ヤギリンパ液、ヒツジリンパ液、ウマリンパ液、ロバリンパ液、ウシリンパ液、霊長類リンパ液またはヒトリンパ液を含んでなる。なお別の実施態様では試料は被験試料である。なお別の実施態様では試料は対照試料である。この実施態様の態様では対照試料は陰性対照試料または陽性対照試料である。
本開示の態様は一部では工程（ｄ）で検出されたＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５の量を工程（ｅ）で検出されたＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５の量と比較することを提供する。実施態様では被験試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量は、対照試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量と比較して高い。この実施態様の態様では、陽性対照試料と比較して、被験試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量が多いことは、哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性の低減または欠如を示す。この実施態様の別の態様では、陰性対照試料と比較して被験試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量が均等であることは、哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性の低減または欠如を示す。別の実施態様では、対照試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量と比較して、被験試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量が少ない。この実施態様の態様では、陽性対照試料と比較して、被験試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量が少ないかまたは均等であることは、哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性の増大または存在を示す。この実施態様の別の態様では、陰性対照試料と比較して、被験試料中のＳＮＡＰ−２５切断生成物の量が少ないことは、哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性の増大または存在を示す。
試料中のα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在を検出するのに適当な、例えば直線性アッセイ条件および非直線性アッセイ条件のような任意のおよび全てのアッセイ条件は本明細書に開示される方法において有用である。実施態様では、アッセイ条件は直線性である。この実施態様の態様では、ＢｏＮＴ／Ａのアッセイ量は過剰である。この実施態様の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａのアッセイ量は律速である。この実施態様の別の態様では、被験試料のアッセイ量は律速である。
本開示の態様をまた以下のようにも記載できる：
１. ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に連結された可動性リンカーに連結された担体を含んでなる組成物。
２. ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基がグルタミンまたはリジンである１の組成物。
３. ＳＮＡＰ−２５抗原が配列番号：１４７を含んでなる１の組成物。
４. 可動性リンカーおよびＳＮＡＰ−２５抗原アミノ酸配列が配列番号：３８または配列番号：４６である１の組成物。
５. ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
６. α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含まないエピトープに関して１×１０１Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有し；そしてα−ＳＮＡＰ−２５抗体がエピトープに関して０.４５０ｎＭ未満の平衡解離定数を有する５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
７. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：８０および配列番号：８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域；ならびに配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０および配列番号：９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域を有する５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
８. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号：９３のＶＨＣＤＲ１、配列番号：９４のＶＨＣＤＲ１、配列番号：９５のＶＨＣＤＲ１、配列番号：１１８のＶＨＣＤＲ１、配列番号：１１９のＶＨＣＤＲ１または配列番号：１２０のＶＨＣＤＲ１を含んでなる５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
９. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号：９６のＶＨＣＤＲ２、配列番号：９７のＶＨＣＤＲ２、配列番号：９８のＶＨＣＤＲ２、配列番号：９９のＶＨＣＤＲ２、配列番号：１２１のＶＨＣＤＲ２、配列番号：１２２のＶＨＣＤＲ２または配列番号：１２３のＶＨＣＤＲ２を含んでなる５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１０. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号：１００のＶＨＣＤＲ３、配列番号：１０１のＶＨＣＤＲ３、配列番号：１０２のＶＨＶＨＣＤＲ３または配列番号：１２４のＶＨＣＤＲ３を含んでなる５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１１. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号：１０３のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１０４のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１０５のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１０６のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１０７のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１２５のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１２６のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１２７のＶＬＣＤＲ１、配列番号：１２８のＶＬＣＤＲ１または配列番号：１２９のＶＬＣＤＲ１を含んでなる５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１２. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号：１０８のＶＬＣＤＲ２、配列番号：１０９のＶＬＣＤＲ２、配列番号：１１０のＶＬＣＤＲ２、配列番号：１１１のＶＬＣＤＲ２または配列番号：１１２のＶＬＣＤＲ２を含んでなる５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１３. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号：１１３のＶＬＣＤＲ３、配列番号：１１４のＶＬＣＤＲ３、配列番号：１１５のＶＬＣＤＲ３、配列番号：１１６のＶＬＣＤＲ３または配列番号：１１７のＶＬＣＤＲ３を含んでなる５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１４. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号：９３、配列番号：１２１および配列番号：１００を含んでなる重鎖可変領域；ならびに配列番号：１０５、配列番号：１１０および配列番号：１１５を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１５. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：１４７または配列番号：１４８のＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合する５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１６. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４のＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合する５の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
１７. （ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；ならびに（ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
１８. （ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に連結されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；ならびに（ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
１９. （ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に固定すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；ならびに（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
２０. （ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；ならびに（ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
２１. （ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に連結されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；ならびに（ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
２２. （ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる；（ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に固定すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；ならびに（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；の工程を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
２３. （ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；（ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；（ｆ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返すことであって、陰性対照試料はＢｏＮＴ／Ａおよび、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに（ｇ）工程ｅで検出された抗体−抗原複合体の量を工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、ここで工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程ｅで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；の工程を含んでなる哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法。
２４. （ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；（ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に連結されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；（ｆ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返すことであって、陰性対照試料はＢｏＮＴ／Ａおよび、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに（ｇ）工程ｅで検出された抗体−抗原複合体の量を工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、ここで工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程ｅで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；の工程を含んでなる哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法。
２５. （ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；（ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；（ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に固定すること；（ｅ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；（ｆ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；（ｇ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｆを繰り返すことであって、陰性対照試料はＢｏＮＴ／Ａおよび、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに（ｈ）工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量を工程（ｇ）で検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、ここで工程ｇで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程ｆで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；の工程を含んでなる哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法。
２６. （ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；（ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる；（ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；（ｆ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返すことであって、陰性対照試料はＢｏＮＴ／Ａおよび、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに（ｇ）工程ｅで検出された抗体−抗原複合体の量を工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、ここで工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程ｅで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；の工程を含んでなる哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法。
２７. （ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；（ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる；（ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に連結されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；（ｆ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返すことであって、陰性対照試料はＢｏＮＴ／Ａおよび、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに（ｇ）工程ｅで検出された抗体−抗原複合体の量を工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、ここで工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程ｅで検出された抗体−抗原複合体のより少ない量の検出はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；の工程を含んでなる哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法。
２８. （ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；（ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる；（ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；（ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に固定すること；（ｅ）ＳＮＡＰ−２５構成要素をα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合する；（ｆ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；（ｇ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｆを繰り返すことであって、陰性対照試料はＢｏＮＴ／Ａおよび、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに（ｈ）工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量を工程ｇで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、ここで工程ｇで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程ｆで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；の工程を含んでなる哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法。
２９. 細胞がＢｏＮＴ／Ａ約５００ｐＭ以下による、約４００ｐＭ以下による、約３００ｐＭ以下による、約２００ｐＭ以下による、約１００ｐＭ以下によるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い１７−２２および２３−２５の方法。
３０. 細胞が約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下まで、約３００ｐＭ以下まで、約２００ｐＭ以下まで、約１００ｐＭ以下までのＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができる２０−２２および２６−２８の方法。
３１. 試料が約１００ｎｇ以下、約１０ｎｇ以下、約１ｎｇ以下、１００ｆｇ以下、１０ｆｇ以下または１ｆｇ以下のＢｏＮＴ／Ａを含んでなる１７−２２の方法。
３２. 試料が約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約１００ｆＭ以下、約１０ｆＭ以下または約１ｆＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを含んでなる１７−２２の方法。
３３. α−ＳＮＡＰ−２５抗体が５−１６の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体である１７−２８の方法。
３４. 抗体−抗原複合体の存在が免疫ブロット分析、免疫沈降分析、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出される１７−２８の方法。
３５. 免疫基盤の方法が下の漸近線(the lower asymptote)に関して少なくとも３：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１または少なくとも１００：１のシグナル対ノイズ比を有する１７−２８の方法。
３６. 免疫基盤の方法が上の漸近線(the higher asymptote)に関して少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１または少なくとも６００：１のシグナル対ノイズ比を有する１７−２８の方法。
３７. 免疫基盤の方法が例えば少なくとも１００ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも５ｎｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも５０ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも５ｐｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも５０ｆｇ、少なくとも１０ｆｇまたは少なくとも５ｆｇのＥＣ５０活性を検出することができる１７−２８の方法。
３８. 免疫基盤の方法が例えば少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも５ｐＭ、少なくとも１００ｆＭ、少なくとも５０ｆＭ、少なくとも１０ｆＭ、少なくとも５ｆＭまたは少なくとも１ｆＭのＥＣ５０活性を検出することができる１７−２８の方法。
３９. 免疫基盤の方法が例えば１０ｐｇ以下、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する１７−２８の方法。
４０. 免疫基盤の方法が例えば１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下または１０ｆＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＤを有する１７−２８の方法。
４１. 免疫基盤の方法が例えば１０ｐｇ以下、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する１７−２８の方法。
４２. 免疫基盤の方法が例えば１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下または１０ｆＭ以下のＢｏＮＴ／ＡのＬＯＱを有する１７−２８の方法。
４３. 免疫基盤の方法が十分に活性なＢｏＮＴ／Ａを、十分に活性なＢｏＮＴ／Ａの活性の７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下を有する部分的に活性なＢｏＮＴ／Ａと区別することができる１７−２８の方法。
候補細胞株のスクリーニング
以下の実施例はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い、または本明細書に開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法に必要なＢｏＮＴ／Ａ取り込み受容力を有する確立された細胞株を同定する仕方を例証する。
１. 候補細胞株のストック培養物の成長
細胞株を成長させるために、試験中の細胞株からの適当な密度の細胞を適当な成長培地３０ｍＬ（表１参照）を含有する１６２ｃｍ２の組織培養フラスコに蒔き、そして３７℃のインキュベーター中５％または１０％二酸化炭素下で、細胞が望ましい密度に到達するまで成長させた。
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２. １ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａを使用する候補細胞株の単回用量スクリーニング
細胞基盤のアッセイの感度を改善するために試験される１つのパラメーターは、クロストリジウム神経毒を取り込み、そして基質表面に接着する良好な受容力を呈する適当な細胞株を同定することであった。最初に細胞株を、１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａを取り込むその能力および表面に付着するその能力に関して試験した。細胞株が１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａを取り込むことができるかどうかを決定するために、試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、適切な血清成長培地（表１）１ｍＬを含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた播種した。細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、細胞が望ましい密度に到達するまで成長させた（およそ１８から２４時間）。成長培地を各ウェルから吸引し、そして１）毒素を含有しない新鮮成長培地（未処理細胞株）または２）１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体を含有する新鮮成長培地（処置細胞株）のいずれかで置き換えた。一晩インキュベートした後、成長培地を吸引し、そして各ウェルを１×ＰＢＳ ２００μＬで濯ぐことにより細胞を洗浄した。細胞を採取するために、１×ＰＢＳを吸引し、２×ＳＤＳ負荷バッファー５０μＬを添加することにより細胞を溶解し、ライゼートを清浄な試験管に移し、そして試料を９５℃まで５分間加熱した。
ＳＮＡＰ−２５未切断基質およびＳＮＡＰ−２５切断生成物の双方の存在に関して検出するために、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析した。この分析では、採取された試料の１２μＬアリコートを変性還元条件下でNuPAGE（登録商標）Novex １２％Bis−Trisプレキャストポリアクリルアミドゲル（Invitrogen Inc., Carlsbad, CA）を使用してＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。分離されたペプチドをTrans−Blot（登録商標）ＳＤ半乾燥電気泳動トランスファーセル装置（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用してウェスタンブロッティングによりゲルからポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Invitrogen Inc., Carlsbad, CA）に移した。Tris緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭ ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール塩酸（Tris−ＨＣｌ）（ｐＨ７.４）、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２.７ｍＭ塩化カリウム）、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％脱脂粉乳を含有する溶液中、室温で２時間インキュベートすることによりＰＶＤＦ膜を遮断した。遮断された膜を１）一次抗体としてα−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体（ＳＭＩ−８１；Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD）の１：５,０００希釈；または２）一次抗体としてＳ９６８４ α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清（Sigma, St. Louis, MO）の１：５,０００希釈のいずれかを含有するＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）、２％ＢＳＡおよび５％脱脂粉乳中、４℃で一晩インキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナルおよびウサギポリクローナル抗体の双方はＳＮＡＰ−２５未切断基質およびＳＮＡＰ−２５切断生成物の双方を検出することができ、ＢｏＮＴ／Ａ取り込みの量を評価するためのパラメーターとして、各細胞株における全体的なＳＮＡＰ−２５発現およびＢｏＮＴ／Ａ処理後に切断されたＳＮＡＰ−２５のパーセントを評価することが可能になる。一次抗体でプロービングされたブロットをＴＢＳ、TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）で、各回１５分間で３回洗浄した。洗浄した膜を１）二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合されたヤギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンＧ、重および軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体（Zymed, South San Francisco, CA）の１：１０,０００希釈；または２）二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合されたヤギポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリンＧ、重および軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体（Zymed, South San Francisco, CA）の１：１０,０００希釈のいずれかを含有するＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）、２％ＢＳＡおよび５％脱脂粉乳中で室温で２時間インキュベートした。二次抗体でプロービングされたブロットをＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中、各回１５分間で３回洗浄した。標識ＳＮＡＰ−２５生成物のシグナル検出をECL Plus（商標）ウェスタンブロット検出系（GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を用いて可視化し、そして膜を撮像し、そして切断されたパーセントをTyphoon 9410変数形式撮像装置および撮像装置分析ソフトウェア（GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）で定量化した。ピクセルサイズ（１００から２００ピクセル）およびＰＭＴ電圧設定（３５０から６００、通常４００）の選択は個々のブロットに依存した。表２は１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａで処理したときにＳＮＡＰ−２５切断生成物が検出された細胞株を示す。以下の細胞株は１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａの取り込みおよび基質表面への適切な付着の双方を呈した：ＢＥ（２）−Ｍ１７、ＩＭＲ−３２、Ｋｅｌｌｙ、ＬＡ１−５５ｎ、Ｎ１Ｅ−１１５、Ｎ４ＴＧ３、Ｎ１８、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＮＧ１０８−１５、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃ。
細胞株が表面に付着できるかどうかを決定するために、試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、適切な成長培地（表１）１ｍＬを含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、細胞が望ましい密度に到達するまで成長させた（およそ１８から２４時間）。播種された細胞の全数に相対して、組織プレートの底部ウェル表面に接着した細胞のパーセンテージにより細胞付着を評価した。細胞株ＣＨＰ−１２６、ＩＭＲ−３２、ＬＡ−Ｎ−１、ＭＣ−ＩＸＣ、ＮＧ１１５−４０１Ｌ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃ、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１およびＳＫ−Ｎ−ＭＣは５０％未満の付着を呈したので（表２）、各細胞株は適当ではないと見なされた。試験された全てのその他の細胞株は適当な付着特徴を呈した（表２）。
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候補細胞株における神経毒取り込みに関する成長条件の評価
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高いかまたはＢｏＮＴ／Ａ取り込み受容力を有していることを最大化する確立された細胞株のための成長条件の決定の仕方を例証する。
１. 候補細胞株の神経毒取り込みに及ぼす細胞分化の効果
細胞分化が神経毒取り込みを改善したかどうかを決定するために、１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａの取り込みを呈する細胞株を血清不含培地に移して分化を誘起した。試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを伴う最小必須培地を含有する血清不含培地１ｍＬを含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ２から３日）インキュベートした。対照として、試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を適切な成長培地（表１）１ｍＬを含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの未分化対照細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、細胞が望ましい密度に到達するまで（およそ１８から２４時間）成長させた。分化型および未分化型対照培養物の双方からの培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）、０.１ｎＭ、０.３ｎＭまたは１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。一晩インキュベートした後、実施例１に記載されるように細胞を洗浄し、そして採取した。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、採取された試料を１２％２６ウェルCriterionゲル（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する以外は実施例１に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析し、そしてウサギポリクローナルα−ＳＮＡＰ−２５１９７抗体血清を一次抗体として使用した（実施例４参照）。表３は０.１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａで処理したときにＳＮＡＰ−２５切断生成物を呈した細胞株を示す。試験された細胞株のうち、ＳｉＭａおよびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞株のみが未分化状態で０.１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａの取り込みを呈した。しかしながら、ＳｉＭａおよびＮｅｕｒｏ−２ａに加えて、細胞株Ｎ１８、ＬＡ１−５５ｎ、ＰＣ１２およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ全てが分化した状態で０.１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａの取り込みを呈した。
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２. 分化型候補細胞株の神経毒取り込みに及ぼすガングリオシド処理の効果
神経毒の低アフィニティー結合を改善する処理が神経毒取り込みを改善するかどうかを決定するために、１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａの取り込みを呈する分化型細胞株をガングリオシドＧＴ１ｂで処理した。試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ（Alexis Biochemicals, San Diego, CA）を伴うかまたは伴わない前記されたような血清不含培地を含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、前記されたような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまでインキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）、１.９ｐＭ、３.７ｐＭ、７.４ｐＭ、１４.８ｐＭ、２９.７ｐＭ、５９.４ｐＭ、１１８.８ｐＭ、２３７.５ｐＭ、５７４ｐＭ、９５０ｐＭおよび１９００ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮血清不含培地で置き換えた。細胞株を２４時間および４８時間の２つの異なる時間でインキュベートした。毒素のインキュベーションの後、実施例１に記載されるように細胞を洗浄し、そして採取した。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、採取された試料を１２％２６ウェルCriterionゲル（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する以外は実施例１に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析し、そしてウサギポリクローナルα−ＳＮＡＰ−２５１９７抗体血清を一次抗体として使用した（実施例４参照）。表４はＢｏＮＴ／Ａを取り込む分化型細胞株の能力に及ぼすガングリオシド処理の効果を示す。これらの結果により、ウェスタンブロットにおいてＳＮＡＰ−２５切断生成物の検出可能なバンドを生成する最低濃度のＢｏＮＴ／Ａが示される。
Figure 0006522075
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３. 候補細胞株の神経毒取り込みを増強した細胞分化特性を伴う血清不含培地の開発
細胞分化を誘起する処置改善が神経毒取り込みを改善できるかどうかを決定するために、ＳｉＭａ、Ｎｅｕｒｏ−２ａおよびＰＣ１２細胞株を種々の血清不含培地中で成長させて分化を誘起した。試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、種々の被験血清不含培地１ｍＬを含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。試験されたパラメーターは１）ＢｏＮＴ／Ａ取り込みに及ぼす異なる基礎培地の効果（ＭＥＭおよびＲＰＭＩ１６４９）；２）ＢｏＮＴ／Ａ取り込みに及ぼす神経栄養因子の存在または不在の効果（Ｎ２サプリメントおよびＢ２７サプリメント）；３）ＢｏＮＴ／Ａ取り込みに及ぼす分化因子の存在または不在の効果（レチノイン酸および神経成長因子）；および４）ＢｏＮＴ／Ａ取り込みに及ぼす血清の存在または不在の効果（血清不含培地および血清使用量低減培地）であった。対照として、試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を対照血清不含培地（最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）１ｍＬを含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ２から３日）インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）、０.００５ｐＭ、０.０１５ｐＭ、０.０５ｐＭ、０.１４ｐＭ、０.４２ｐＭ、１.２ｐＭ、３.７ｐＭ、１１ｐＭ、３３ｐＭ、１００ｐＭおよび３００ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮血清不含培地で置き換えた。加えて、分化型細胞をＢｏＮＴ／Ａで２４時間処理し、続いて培地交換し、そして新鮮培地中毒素を伴わずに４８時間インキュベートしてＳＮＡＰ−２５切断生成物の蓄積を可能にした。次いで実施例１に記載されるように細胞を洗浄し、そして採取した。
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ＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、採取された試料を１２％２６ウェルCriterionゲル（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する以外は実施例１に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析し、そしてα−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル血清を使用した（実施例４参照）。各細胞株に関して決定された、最も最適化された培地を表５に示す。表６は細胞株をこの最適化された血清不含培地で成長させたときに検出された最低量のＳＮＡＰ−２５切断生成物の最低量を示す。最適化された血清不含培地の使用により結果的にＬＡ１−５５ｎ、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＰＣ−１２およびＳｉＭａ細胞株において許容されるシグナル対ノイズ比を伴うＢｏＮＴ／Ａ活性シグナルが検出された（図２）。例えば最適化された分化条件により、ＳＮＡＰ−２５切断生成物検出において対照血清不含培地と比較して、Ｎｅｕｒｏ−２ａおよびＰＣ１２細胞に関して５倍、そしてＳｉＭａ細胞に関してほぼ５０倍の増大を招いた。加えてバリデーションを施せる頑健なアッセイを開発するために、下の漸近線に関して３：１、および上の漸近線に関して１０：１の最小シグナル対ノイズ比が必要とされる。１.２ｐＭ用量から検出されたシグナルを０ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａのバックグラウンドシグナルと比較した場合に、ＬＡ−１−５５ｎを除いて、全ての最適化された細胞株により、下の漸近線に関して少なくとも３：１のシグナル対ノイズ比が提供された（図２）。加えて３００ｐＭ用量からのシグナルを０ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａのバックグラウンドシグナルと比較した場合、全ての最適化された細胞株により、上の漸近線に関して少なくとも１００：１のシグナル対ノイズ比が提供された（図２）。これらの結果により、アッセイがｐＭ量のＢｏＮＴ／Ａの存在を検出していたので、これらの細胞株のいずれかを使用して本明細書に開示されるようなＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するための免疫基盤の方法を開発できることが示される。
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ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ １ 残基で遊離カルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の開発
以下の実施例はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の作成の仕方を例証する。
１. α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の作成
ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体を開発するために、１３−残基ペプチドＣＤＳＮＫＴＲＩＤＥＡＮＱＣＯＯＨ（配列番号：３８）をＳＮＡＰ−２５切断生成物抗原として設計した。このペプチドは可動性リンカー領域ならびにＫＬＨおよびカルボキシル化されたＣ末端グルタミン（配列番号：３８）を伴うヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号：５）のアミノ酸１８６−１９７に抱合するためのＮ末端システイン残基を含んでなる。選び抜かれた、独特なペプチド配列に対するモノクローナル抗体の作成により、密接に関係するアイソフォームのプールの中でタンパク質の特定の亜集団の同定を可能にするエピトープが制御される。Blast検索により、このペプチドがＳＮＡＰ−２５に対してのみ高い相同性を有し、そしてニューロン細胞においてその他のタンパク質との交差反応性の可能性がほとんどないことが示された。またコンピューターアルゴリズムを利用することにより配列を注意深く精査して、疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可動性の領域および好ましい二次構造、続いて選ばれたペプチド配列の相応しい配向および提示を決定した。ペプチドを合成し、そしてキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に抱合させて免疫原性を増大した。６匹のＢａｌｂ／ｃマウスをこのペプチドで免疫し、そして約８週のうちに３回の免疫の後、マウスを試験のために出血させた。４℃で６０分間インキュベートすることにより血液を凝固させた。凝固した血液を１０,０００×ｇ、４℃で１０分間遠心して細胞デブリをペレット化した。得られた血清を５０μＬアリコートに分注し、そして必要になるまで−２０℃で保存した。
本明細書に開示されるその他のＳＮＡＰ−２５抗原に基づいた類似の計画を用いて、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を開発した。例えば配列番号：３８のＳＮＡＰ−２５抗原の代わりに配列番号：４５のＳＮＡＰ−２５抗原をＫＬＨに抱合させることができる。別の実例としては、配列番号：３８のＳＮＡＰ−２５抗原からのヒトＳＮＡＰ−２５のアミノ酸１８６−１９７を配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４と置き換えることができる。
２. α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在に関するスクリーニング
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在を決定するために、抽出されたマウス血清を使用して比較ＥＬＩＳＡおよび細胞基盤の切断アッセイを実施した。比較ＥＬＩＳＡのために、２つの融合タンパク質を構築した：配列番号：４８のBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７および配列番号：４９のBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６。BirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７は、配列番号：５のアミノ酸１３４−１９７を含んでなるＳＮＡＰ−２５ペプチドにアミノ末端で連結された配列番号：５０の天然ビオチン化１６アミノ酸BirAペプチドを含んでなった。BirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６は配列番号：５のアミノ酸１３４−２０６を含んでなるＳＮＡＰ−２５ペプチドにアミノ末端で連結された配列番号：５０の天然ビオチン化１６アミノ酸BirAペプチドを含んでなった。これらの２つの基質を１×ＰＢＳに１０μｇ／ｍＬ BirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７およびBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６の濃度で懸濁した。適切な基質溶液およそ１００μＬを添加することにより、BirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７およびBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６を別個のプレートにコーティングし、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄されたプレートを、６匹の免疫マウス（マウス１、マウス２、マウス３、マウス４、マウス５およびマウス６）のうちの１匹から誘導された抗体含有血清の１：１０から１：１００希釈を含有する１×ＴＢＳ中０.５％ＢＳＡ中、３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体でプロービングされたプレートをＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬ中、各回５分間で４回洗浄した。洗浄されたプレートを、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合されたヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）の１：１０,０００希釈を含有する１×ＴＢＳ中、３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体でプロービングされたプレートをＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬ中４回洗浄した。標識ＳＮＡＰ−２５生成物の発色検出をImmunoPure TMB基質キット（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）を使用する発色検出により可視化した。BirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７コーティングされたプレートは黄色を発色したが、BirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６コーティングされたプレートは発色せず、それによりα−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を優先的に認識することが示された。結果により、免疫に使用された６匹のマウスのうち３匹のマウス（マウス２、マウス３およびマウス４）がより高い力価およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対するさらなる特異性を有した。
ＥＬＩＳＡ軽鎖活性アッセイを用いてこれらの結果を確認した。以下の基質溶液およそ１００μＬを添加することにより９６ウェルReacti−Bindストレプトアビジンコーティングされたプレート（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）を調製した：列Ａ−Ｃを１２の異なる濃度のBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７１００μＬでコーティングした；列Ｄ−Ｈを１０μｇ／ｍＬのBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６１００μＬでコーティングした。基質溶液を吸引し、そしてＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートを洗浄した。ＢｏＮＴ／Ａの希釈をＢｏＮＴ／Ａインキュベーションバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１％ウシ胎仔血清、１０μＭ ＺｎＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール）中３７℃で２０分間予備還元し、そして予備還元されたＢｏＮＴ／Ａ １００μＬを、基質でコーティングされたプレートに添加し、そして３７℃で９０分間インキュベートした。ＢｏＮＴ／Ａインキュベーションバッファーを吸引し、そしてＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各プレートを３回濯ぐことによりＢｏＮＴ／Ａ処理プレートを洗浄した。試験中の抗体含有血清の１：１０から１：１００希釈を含有する１×ＴＢＳ中０.５％ＢＳＡ中で、洗浄されたプレートを３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体でプロービングされたプレートをＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬ中、各回５分間で４回洗浄した。洗浄されたプレートを、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合されたヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）の１：１０,０００希釈を含有する１×ＴＢＳ中、３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体でプロービングされたプレートをＴＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬ中４回洗浄した。標識ＳＮＡＰ−２５生成物の発色検出をImmunoPure TMB基質キット（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）を使用する発色検出により可視化した。６匹全ての免疫マウス（マウス１、マウス２、マウス３、マウス４、マウス５およびマウス６）から誘導された抗体含有血清を使用して、ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物の存在と相関した黄色の発色がＢｏＮＴ／Ａ処理試料において検出されたが、未処理対照では検出されなかった。故に比較ＥＬＩＳＡ分析により、免疫に使用されたマウスのうち３匹のマウス（マウス２、マウス３およびマウス４）がより高い力価およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対するさらなる特異性を有した。
細胞基盤の切断アッセイに関しては、適当な密度のＰＣ１２細胞を、適切な血清培地（表１）３ｍＬを含有する６０ｍｍ２組織培養プレートに蒔いた。細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、細胞が適切な密度に到達するまで成長させた。室温で５分間インキュベートした、LipofectAmine 2000（Invitrogen Inc., Carlsbad, CA）１５μＬを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ還元血清培地２５０μＬを、ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現構築物（配列番号：５１）１０μｇを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ還元血清培地２５０μＬに添加することによりトランスフェクション溶液５００μＬを調製した。ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現構築物はｐＱＢＩ−２５発現ベクター（Qbiogene Inc., Carlsbad, CA）を含んでなり、そのプロモーターエレメントは配列番号：５２のＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されている。このトランスフェクション混合物を室温でおよそ２０分間インキュベートした。培地を新鮮な未補充培地で置き換え、そしてトランスフェクション溶液５００μＬを細胞に添加した。次いで細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下でおよそ６から１８時間インキュベートした。実施例２に記載されるように細胞を洗浄および採取した。ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物の存在を検出するために、使用された一次抗体が抗体含有血清の１：１,０００希釈であり、そして使用された二次抗体がマウスα−ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）の１：２０,０００希釈であった以外は実施例２に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析した。３匹のマウス（マウス２、マウス３およびマウス４）から誘導された抗体含有血清を使用して、ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に相当する単一のバンドがＢｏＮＴ／Ａ処理試料において検出されたが、未処理対照では検出されなかった。故に細胞基盤の切断アッセイにより、免疫に使用されたマウスのうち、３匹のマウス（マウス２、マウス３およびマウス４）がより高い力価およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対するさらなる特異性を有した。
３. ハイブリドーマの生成
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを作成するために、最終の「ブースター」免疫に引き続いて３日にマウス２から脾臓を採取し、そして標準的なハイブリドーマプロトコールを用いて脾臓細胞を骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３ Ａｇ８.６５３と融合させた。これらの細胞を５つの９６ウェルプレートに蒔き、そしてＨＡＴ培地を使用してハイブリッドを選択した。融合後８−１４日内に２つの別個のプレートにコーティングされたBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７およびBirA−HisTag（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６ペプチドを伴う比較ＥＬＩＳＡを用いておよそ４８０の親クローンの最初のスクリーニングを実施した。比較ＥＬＩＳＡにより、切断されたＳＮＡＰ−２５１９７に特異的な抗体を生成するハイブリドーマを同定するための迅速なスクリーニング方法が提供された。上位１８個のクローンを、前記された細胞基盤の切断アッセイを用いるさらなるスクリーニングおよびＬＣ／Ａトランスフェクトされた細胞の免疫染色に供した（表７）。
Figure 0006522075
クローン１Ｄ３、１Ｇ１０、２Ｅ２、３Ｃ１、３Ｃ３および３Ｅ８により生成された馴化培地は、ＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質に相対してＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に関して少なくとも４：１の比１９７／２０６を有する優先的な結合特異性を伴うα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んでなり、そして細胞基盤の切断アッセイおよびＧＦＰ−ＬＣ／ＡでトランスフェクトされたＰＣ１２細胞の免疫染色を用いてＳＮＡＰ−２５１９７−切断生成物を検出したので、これらのクローンを限界希釈によりさらにクローン化した。類似してクローン２Ｃ９、２Ｆ１１、３Ｇ２、４Ｄ１および４Ｇ６により生成された馴化培地は、ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に相対してＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質に関して少なくとも１.５：１の比２０６／１９７を有する優先的な結合特異性を伴うα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んでなり、そして細胞基盤の切断アッセイを用いてＳＮＡＰ−２５２０６−未切断生成物を検出したので、これらのクローンを限界希釈によりさらにクローン化した。これらの単一の細胞由来のクローンを比較ＥＬＩＳＡ、細胞基盤の切断および免疫染色を用いて再度スクリーニングして、そのアフィニティーおよび特異性を確認し、そして標準的な手順を用いて抗体をアイソタイプ分類した。クローン１Ｄ３Ｂ８（ＩｇＭ.ｋ）、１Ｇ１０Ａ１２（ＩｇＧ３.ｋ）、２Ｃ９Ｂ１０（ＩｇＧ３.ｋ）、２Ｅ２Ａ６（ＩｇＧ３.ｋ）、２Ｆ１１Ｂ６（ＩｇＭ.ｋ）、３Ｃ１Ａ５（ＩｇＧ２ａ.ｋ）および３Ｃ３Ｅ２（ＩｇＧ２ａ.ｋ）から腹水を生成した。クローン３Ｅ８はクローニング過程の間に抗体生成を停止し、そしてさらに評価できなかった。
４. α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合特異性の評価
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合特異性を評価するために、クローン１Ｄ３Ｂ８、１Ｇ１０Ａ１２、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、２Ｆ１１Ｂ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２由来の腹水を使用して、細胞基盤の活性アッセイ、免疫細胞化学および免疫沈降を用いてＳＮＡＰ−２５切断生成物を検出した。
細胞基盤の活性アッセイに関して、ウェスタンブロット分析によりα−ＳＮＡＰ−２５抗体含有腹水が未切断ＳＮＡＰ−２５２０６基質およびＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を検出する能力を分析することにより結合特異性を決定した。適当な密度のＰＣ１２細胞を、適切な血清培地３ｍＬを含有する６０ｍｍ２組織培養プレートに蒔き、３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、適切な細胞密度に到達するまで成長させ、そして前記されたようにｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現構築物を欠如するトランスフェクション溶液（トランスフェクトされていない細胞）、またはｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現構築物を含有するトランスフェクション溶液（トランスフェクトされた細胞）のいずれかでトランスフェクトした。実施例１に記載されるように細胞を洗浄および採取した。未切断ＳＮＡＰ−２５２０６基質およびＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物双方の存在を検出するために、使用された一次抗体がα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体含有腹水の１：１００希釈であり、そして使用された二次抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合されたα−マウスＩｇＧ（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）の１：２０,０００希釈であった以外は実施例１に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析した。加えて、３つの市販により入手可能なマウスα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を試験した。α−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＳＭＩ−８１（Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD）（製造者により未切断ＳＮＡＰ−２５２０６基質およびＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物の双方を検出することが示されている）を製造者の推奨に従って１５,０００希釈で使用した。α−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＭＣ−６０５０（Research & Diagnostic Antibodies, Las Vegas, NV）（製造者により未切断ＳＮＡＰ−２５２０６基質およびＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物の双方を検出することが示されている）を製造者の推奨に従って１：１００希釈で使用した。α−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＭＣ−６０５３（Research & Diagnostic Antibodies, Las Vegas, NV）（製造者によりＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物のみを検出することが示されている）を製造者の推奨に従って１：１００希釈で使用した。
表８はＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物のみを検出したα−ＳＮＡＰ−２５抗体含有腹水を示す。細胞基盤の切断アッセイにより、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２から生成された腹水は、ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に関して高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を合成し、ＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質に相対してこの切断生成物の選択的認識が可能になる。市販の抗体ＳＭＩ−８１はＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質を検出したが、ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物をわずかしか認識しなかった（表８）。驚くべきことに、市販の抗体ＭＣ−６０５０はＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質のみを検出し、そしてＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を認識し損なった（表８）。なおさらに驚くべきことに、市販の抗体ＭＣ−６０５０はＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質のみを検出し、そしてＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を認識し損なったにもかかわらず、製造者は、この抗体がＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を特異的に検出すると宣伝している（表８）。故にこの分析により、１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２はＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に関して適当な選択性を呈するが、１Ｇ１０Ａ１２および２Ｆ１１Ｂ６は呈さないことが示される。加えて、市販の抗体ＳＭＩ−８１、ＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３は全てＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を選択的に検出し損なったので、全て本出願で開示される免疫基盤の方法に不適当である。
免疫細胞化学分析のために、免疫染色によりα−ＳＮＡＰ−２５抗体含有腹水が未切断ＳＮＡＰ−２５２０６基質およびＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を検出する能力を分析することにより結合特異性を決定した。例えば「ボツリヌス神経毒の軽鎖における細胞膜局在シグナル」Ester Fernandez−Salas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 101（9）：3208−3213（2004）参照。前記されたように適当な密度のＰＣ１２細胞を蒔き、成長させ、そしてｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現構築物を欠如するトランスフェクション溶液（トランスフェクトされていない細胞）またはｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現構築物を含有するトランスフェクション溶液（トランスフェクトされた細胞）のいずれかでトランスフェクトした。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＡＦ５ｍＬ中、室温で３０分間固定した。固定された細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水中で洗浄し、１×ＰＢＳ中０.５％Triton（登録商標）X−100（ポリエチレングリコールオクチルフェノールエーテル）５ｍＬ中でインキュベートし、１×ＰＢＳで洗浄し、そしてメタノール５ｍＬ中−２０℃で６分間透過処理した。透過処理された細胞を１００ｍＭグリシン５ｍＬ中、室温で３０分間遮断し、１×ＰＢＳ中で洗浄し、そして１×ＰＢＳ中０.５％ＢＳＡ５ｍＬ中室温で３０分間遮断した。遮断された細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、そして試験中のクローン性ハイブリドーマ細胞株からの腹水の１：１０希釈を含有する１×ＰＢＳ中０.５％ＢＳＡ中、室温で２時間インキュベートした。一次抗体でプロービングされた細胞を１×ＰＢＳ中各回５分間で３回洗浄した。洗浄された細胞を二次抗体としてALEXA（登録商標）FLUOR568（Invitrogen Inc., Carlsbad, CA）に抱合されたヤギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンＧ、重および軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体の１：２００希釈を含有する１×ＰＢＳ中、室温で２時間インキュベートした。二次抗体でプロービングされた細胞を１×ＰＢＳ中各回５分間で３回洗浄した。洗浄された細胞を、VECTASHIELD（登録商標）封入剤（Vector Laboratories, Burlingame, CA）でマウントし、そしてカバーガラスを載せることにより顕微鏡試験用に調製した。Leica共焦点顕微鏡で、適切なレーザー設定を用いてシグナル検出の画像が得られた。表８はＳＮＡＰ−２５１９７−切断生成物を特異的に検出するα−ＳＮＡＰ−２５抗体含有腹水を示す。免疫細胞化学分析により、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２から生成された腹水が、ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に関して高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を合成し、ＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質に相対してこの切断生成物の優先的な認識を可能にすることが示された。
免疫沈降分析のために、プロテインＡ（HiTrap（商標）プロテインＡ ＨＰカラム、GE Healthcare, Amersham, Piscataway, NJ）精製されたα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体が未切断ＳＮＡＰ−２５２０６基質およびＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物を沈澱させる能力を分析することにより結合特異性を決定した。例えばChapter 8 Storing and Purifying Antibodies, pp. 309−311, Harlow & Lane, supra, 1998a参照。前記されたように適当な密度のＰＣ１２細胞を蒔き、成長させ、そしてｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ発現構築物（対照細胞；配列番号：５３）を含有するトランスフェクション溶液、またはｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現構築物（実験細胞）を含有するトランスフェクション溶液のいずれかでトランスフェクトした。ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ発現構築物は、そのプロモーターエレメントが配列番号：５４のＧＦＰをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されている発現ベクターを含んでなる。一晩インキュベートした後、成長培地を吸引し、そして各ウェルを１×ＰＢＳ ２００μＬで濯ぐことにより細胞を洗浄した。細胞を採取するために、ＰＢＳを吸引し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＤＴ、１０％グリセロール、１％Triton（登録商標）X−100（ポリエチレングリコールオクチルフェノールエーテル）および１×COMPLETE（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Applied Biosciences, Indianapolis, IN）を含んでなる免疫沈降溶解バッファーを添加し、そして４℃で１時間インキュベートすることにより細胞を溶解した。溶解した細胞を３,０００×ｇ、４℃で１０分間遠心して細胞デブリを除去し、そして上澄を清浄な管に移し、そしておよそ１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで希釈した。精製されたモノクローナル抗体およそ５μｇを希釈された上澄０.５ｍＬに添加し、そして４℃で２時間インキュベートした。一次抗体のインキュベーションの後、固定されたプロテインＧ（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）およそ５０μＬを希釈された上澄に添加し、そして４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降溶解バッファー０.５ｍＬを添加し、３００×ｇ、４℃で１分間遠心して固定されたプロテインＧをペレット化し、そして上澄をデカントすることによりインキュベートされた上澄を各回３０分間で３回洗浄した。洗浄の後、ペレットを１×ＳＤＳ負荷バッファー３０μＬ中に再懸濁し、そして試料を９５℃まで５分間加熱した。未切断ＳＮＡＰ−２５２０６基質およびＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物の双方の存在を検出するために、使用された一次抗体がα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体血清（実施例４参照）の１：１,０００希釈であり、そして使用された二次抗体がウサギα−ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）の１：２０,０００希釈であった以外は実施例１に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析した。表８は免疫沈降分析によりＳＮＡＰ−２５１９７−切断生成物を特異的に引き下げるα−ＳＮＡＰ−２５抗体含有腹水を示す。免疫沈降分析により、クローン２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５から生成された腹水がＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に関して高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を合成し、ＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質に相対してこの切断生成物の優先的な認識を可能にすることが示された。
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５. α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合アフィニティーの評価
ＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物またはＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質のいずれかに関して高い結合特異性を示すα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合アフィニティーを決定するために、BIAcore 3000装置でカルボキシメチルデキストラン（ＣＭ５）センサーチップ（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用して結合アフィニティーアッセイを実施した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％（容量／容量）界面活性剤Ｐ２０を含んでなるＨＢＳ−ＥＰバッファーで、２５℃、流速１０μＬ／分で実行した。配列番号：５のアミノ酸１３４−１９７（ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７）または配列番号：５のアミノ酸１３４−２０６（ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６）を含んでなるＳＮＡＰ−２５ペプチドを標準的なアミン結合を用いてＣＭ５センサーチップの表面に共有結合により付着させた。簡単には、０.２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび０.０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシイミドの混合物の７分注入によりＣＭ５チップを活性化し；次いでＳＮＡＰ−２５ペプチドを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.０）中、流速１０μＬ／分で２０分注入し；そして未反応のスクシイミドエステルを１Ｍ塩酸エタノールアミン（ｐＨ８.５）の７分注入により遮断した。チップ上に固定されたＳＮＡＰ−２５１３４−１９７またはＳＮＡＰ−２５１３４−２０６の量は応答単位の１００−１５０増大（約０.１０−０.１５ｎｇ／ｍｍ２）により反映された。クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２から生成された腹水または精製されたモノクローナル抗体のいずれかを含んでなる抗体試料、ならびに市販により入手可能なα−ＳＮＡＰ−２５抗体を、ＣＭ５チップの表面上を通過させて、会合時間１０分および解離時間２０分を可能にした。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２.５）の流速１５μＬ／分の１分注入による実行の間に表面を再生した。センサーグラム曲線はBIAevaluation3.0ソフトウェアを用いて１：１動力学的結合モデルに適合した。
結果により、２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５の双方がＳＮＡＰ−２５未切断基質を超えてＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に関して高度に特異的であったことが示される（表９）。ＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３の結合アフィニティーと比較した場合、１Ｄ３Ｂ６はこれらの市販の抗体に相対してＳＮＡＰ−２５切断生成物に関しておよそ１０倍高い平衡解離定数を有した（表９）。興味深いことに、２Ｅ２Ａ６のみがこれらの市販の抗体に相対してＳＮＡＰ−２５切断生成物に関してわずかに低い平衡解離定数を有した（０.４０５ｎＭ対０.４９７および０.５０８）（表９）。これらの市販のα−ＳＮＡＰ−２５抗体のいずれもＳＮＡＰ−２５切断生成物を選択的に認識しなかったが（表８）、約０.５ｎＭよりも低い平衡解離定数がかかる選択性を達成するためにある程度必須であると思われる。類似してＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３の結合アフィニティーと比較した場合、２Ｅ２Ａ６は約少なくとも１倍緩徐な分離速度（off rate）／解離定数（６.７４×１０−５対８.８２×１０−４ｓ−１および１.１８×１０−３ｓ−１）を有した（表９）。これはさらに、約８.８２×１０−４より緩徐な分離速度／解離定数が一部でＳＮＡＰ−２５切断生成物に関する選択的結合を達成するためにある程度必須であると思われること示唆する。この結果は５.７８×１０−５ｓ−１の分離速度／解離定数を有した１Ｄ３Ｂ８と一致する（表９）。
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６. 単離されたα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体からのエピトープのシークエンシング
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができる、単離されたα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のエピトープを決定するために、ハイブリドーマ１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２により生成されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖をコードするポリヌクレオチド分子をシークエンシングした。標準的なプロトコールを用いて各ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出および精製し、そしてオリゴｄＴアンチセンスプライマーまたは遺伝子特異的（ネズミＩｇＧ１ ＣＨおよびカッパＣＬ）アンチセンスプライマーのいずれかを使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ生成の後、特異的なネズミおよびヒト定常ドメインプライマーを使用してＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅して抗体のアイソタイプを決定した。ＶＨおよびＶＬ縮重プライマーを使用してｃＤＮＡから可変ドメインを増幅した。５’ＲＡＣＥのために、ホモポリマーｄＣＴＰテールをｃＤＮＡの３’末端に付加した。次いでオリゴｄＧセンスプライマーおよび遺伝子特異的（ＣＨ／ＫＣ）アンチセンスプライマーを用いて重および軽鎖を増幅した。ＰＣＲ生成物にはアンチセンスプライマーまでにシグナルペプチド、可変ドメインおよび定常ドメインの配列が含まれた。ＰＣＲ生成物をゲル精製して小型フラグメントを除去し、そしてシークエンシングのためにブラントまたはＴＡベクターにクローン化した。各鎖に関して５つの独立したクローンをシークエンシングし、そしてＶＨおよびＶＬ鎖のアラインメントおよびコンセンサス配列を決定した（表１０）。ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を決定するために用いられた方法は例えば「新規生理活性脂質誘導体ならびに同一物を作成および使用する方法」Roger A. Sabbadiniら、米国特許出願公開第２００７／０２８１３２０号；および「ファージ抗体ライブラリーを使用することにより評価されるようなボツリヌス神経毒Ａ型結合ドメインに対するネズミ体液性免疫応答の分子特徴付け」Peter Amersdorfer, et al., Infect. Immun. 65（9）：3743−3752（その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。加えて抗体の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖をシークエンシングし、そしてＣＤＲ領域を同定するために商業用サービスを利用でき、例えばFusion Antibodies Ltd., Northern Irelandを参照されたい。
本明細書に開示されるハイブリドーマにより生成されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ鎖を含んでなるポリヌクレオチド配列は以下のとおりである：１Ｄ３Ｂ８ＶＨ（配列番号：７１）、２Ｃ９Ｂ１０ＶＨ（配列番号：７３）、２Ｅ２Ａ６ＶＨ（配列番号：７５）、３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント１（配列番号：７７）、３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント２（配列番号：７９）、３Ｃ３Ｅ２ＶＨ（配列番号：８１）；１Ｄ３Ｂ８ＶＬ（配列番号：８３）、２Ｃ９Ｂ１０ＶＬ（配列番号：８５）、２Ｅ２Ａ６ＶＬ（配列番号：８７）、３Ｃ１Ａ５ＶＬ（配列番号：８９）および３Ｃ３Ｅ２ＶＬ（配列番号：９１）。本明細書に開示されるハイブリドーマにより生成されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ鎖を含んでなるアミノ酸配列は以下のとおりである：１Ｄ３Ｂ８ＶＨ（配列番号：７２）、２Ｃ９Ｂ１０ＶＨ（配列番号：７４）、２Ｅ２Ａ６ＶＨ（配列番号：７６）、３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント１（配列番号：７８）、３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント２（配列番号：８０）、３Ｃ３Ｅ２ＶＨ（配列番号：８２）；１Ｄ３Ｂ８ＶＬ（配列番号：８４）、２Ｃ９Ｂ１０ＶＬ（配列番号：８６）、２Ｅ２Ａ６ＶＬ（配列番号：８８）、３Ｃ１Ａ５ＶＬ（配列番号：９０）および３Ｃ３Ｅ２ＶＬ（配列番号：９２）。ハイブリドーマ１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２により生成されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬＣＤＲドメインを含んでなるアミノ酸配列を表１０に示す。
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本明細書に開示されるハイブリドーマにより生成されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨＣＤＲドメインバリアントを含んでなるアミノ酸配列の非限定例には、１Ｄ３Ｂ８に関してはＶＨＣＤＲ１バリアント配列番号：１１８；２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント２に関してはＶＨＣＤＲ１バリアント配列番号：１１９；３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント１および３Ｃ３Ｅ２に関してはＶＨＣＤＲ１バリアント配列番号：１２０；１Ｄ３Ｂ８および２Ｅ２Ａ６に関してはＶＨＣＤＲ２バリアント配列番号：１２１；２Ｃ９Ｂ１０および３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント２に関してはＶＨＣＤＲ２バリアント配列番号：１２２；３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント１および３Ｃ３Ｅ２に関してはＶＨＣＤＲ２バリアント配列番号：１２３；１Ｄ３Ｂ８および２Ｃ９Ｂ１０に関してはＶＨＣＤＲ３バリアントＭＤＹ；２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント２に関してはＶＨＣＤＲ３バリアントＭＧＹ；ならびに３Ｃ１Ａ５ＶＨバリアント１および３Ｃ３Ｅ２に関してはＶＨＣＤＲ３バリアント配列番号：１２４が含まれる。本明細書に開示されるハイブリドーマにより生成されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＬＣＤＲドメインバリアントを含んでなるアミノ酸配列の非限定例には、１Ｄ３Ｂ８に関してはＶＬＣＤＲ１バリアント配列番号：１２５；２Ｃ９Ｂ１０に関してはＶＬＣＤＲ１バリアント配列番号：１２６；２Ｅ２Ａ６に関してはＶＬＣＤＲ１バリアント配列番号：１２７；３Ｃ１Ａ５に関してはＶＬＣＤＲ１バリアント配列番号：１２８；３Ｃ３Ｅ２に関してはＶＬＣＤＲ１バリアント配列番号：１２９；１Ｄ３Ｂ８に関してはＶＬＣＤＲ２バリアントＫＶＳ；２Ｃ９Ｂ１０に関してはＶＬＣＤＲ２バリアントＮＡＫ；２Ｅ２Ａ６に関してはＶＬＣＤＲ２バリアントＬＶＳ；３Ｃ１Ａ５に関してはＶＬＣＤＲ２バリアントＹＡＴ；および３Ｃ３Ｅ２に関してはＶＬＣＤＲ２バリアントＹＡＳが含まれる。
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ １ 残基で遊離カルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の開発
以下の実施例はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の作成の仕方を例証する。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を開発するために、１０−残基ペプチドＣＧＧＧＲＩＤＥＡＮＱ（配列番号：４６）をＳＮＡＰ−２５切断生成物抗原として設計した。このペプチドはＫＬＨに抱合するためのＮ末端システイン残基、ヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号：５）のアミノ酸１９１−１９７に連結された可動性スペーサーであるＧスペーサー（ＧＧＧ）を含んでなり、そしてカルボキシル化されたＣ末端グルタミンを有する。Blast検索により、このペプチドがＳＮＡＰ−２５に対してのみ高い相同性を有し、そしてニューロン細胞においてその他のタンパク質との交差反応性の可能性がほとんどないことが示された。またコンピューターアルゴリズムを利用することにより配列を注意深く精査して、疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可動性の領域および好ましい二次構造、続いて選ばれたペプチド配列の相応しい配向および提示を決定した。ペプチドを合成し、そしてキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に抱合させて免疫原性を増大した。動物を免疫する前に、細胞ライゼートに存在するタンパク質に対して免疫反応性を有さなかった動物を同定するために、ナイーブなウサギを最初に候補細胞株からの細胞ライゼートに対してウェスタンブロットでスクリーニングした。２匹のプレスクリーニングされたウサギをこのペプチドで免疫し、そして約８週のうちに３回の免疫の後、ウサギを試験のために出血させた。４℃で６０分間インキュベートすることにより血液を凝固させた。凝固した血液を１０,０００×ｇ、４℃で１０分間遠心して細胞デブリをペレット化した。得られた血清試料を５０μＬアリコートに分注し、そして必要になるまで−２０℃で保存した。
本明細書に開示されるその他のＳＮＡＰ−２５抗原に基づく類似の計画を用いて、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのＰ１残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を開発する。例えば配列番号：４６のＳＮＡＰ−２５抗原の代わりに、配列番号：４７のＳＮＡＰ−２５抗原をＫＬＨに抱合させることができる。別の実例としては、配列番号：３８のＳＮＡＰ−２５抗原からのヒトＳＮＡＰ−２５のアミノ酸１９１−１９７を、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３または配列番号：４４、配列番号：１４７または配列番号：１４８と置き換えることができる。
２. α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の存在に関するスクリーニング
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の存在を決定するために、実施例３に記載されるように抽出されたウサギ血清を使用して比較ＥＬＩＳＡおよび細胞基盤の切断アッセイを実施した。双方のウサギからの血清はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を含有した。α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体をＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３と称した。
３. α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の精製
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を精製するために、配列番号：４６のＳＮＡＰ−２５抗原を含有するアフィニティーカラムを使用して、ウサギ血清からＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３抗体を精製した。
４. α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の結合特異性の評価
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の結合特異性を評価するために、実施例３に記載されるように細胞基盤の活性アッセイ、免疫細胞化学および免疫沈降を用いて精製されたＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を使用して切断生成物を検出した。細胞基盤の切断アッセイ、免疫細胞化学分析および免疫沈降分析全てにより、ＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体が未切断ＳＮＡＰ−２５と交差反応しないことが示された。故にＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３の双方がＳＮＡＰ−２５１９７切断生成物に関して高い結合特異性を有し、ＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質に相対してこの切断生成物の優先的な認識を可能にする。実施例３に記載されるようにBiAcoreにおいてＳＰＲを用いて抗原に関するアフィニティーを決定することができる。
サンドイッチＥＬＩＳＡのための構成要素および条件調製
以下の実施例はＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を使用してＳＮＡＰ−２５切断生成物を検出することにより、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を行うために有用なサンドイッチＥＬＩＳＡを実施するために必要な構成要素および条件を同定および調製する仕方を例証する。
１. ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からの細胞ライゼートの調製
分析用のＢｏＮＴ／Ａ処理された細胞ライゼートを得るために、Ｎｅｕｒｏ−２ａのストック培養物から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する血清不含培地５０ｍＬを含有するＴ１７５フラスコに播種した。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ２から３日）インキュベートした。対照として、Ｎｅｕｒｏ−２ａのストック培養物から適当な密度の細胞を適切な成長培地（表１）５０ｍＬを含有するＴ１７５フラスコに播種した。これらの未分化対照細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、細胞が５０％コンフルエンスに到達するまで（およそ１８時間）成長させた。分化型および未分化型対照培養物の双方からの培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）または１０ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。一晩インキュベートした後、細胞を洗浄し、そして新たに調製されたTriton X−100溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Triton X−100）中４℃で３０分間一定の攪拌を行いながら溶解することにより細胞を採取した。溶解した細胞を４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心して、ベンチトップ遠心を使用してデブリを排除した。細胞ライゼートのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定した。
２. サンドイッチＥＬＩＳＡ構成要素の調製および同定
適切な捕捉抗体−検出抗体対を同定するために、１１個の異なるα−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体および７個の異なるα−ＳＮＡＰ−２５検出抗体を含んでなる２６個の異なる組み合わせの捕捉および検出抗体対でＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析を行った（表１２）。使用したα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、本明細書において開示される２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５ α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体、本明細書において開示されるＳＭＩ−８１、ＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３ α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体、本明細書において開示されるＮＴＰ２３ α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体、Ｓ９６８４ α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体（Sigma, St. Louis, MO）、Ｈ−５０ α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）、Ｃ−１８ α−ＳＮＡＰ−２５ヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）、Ｎ−１９ α−ＳＮＡＰ−２５ヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）、ならびにＳＰ１２ α−ＳＮＡＰ−２５マウスポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）であった。
捕捉抗体溶液を調製するために、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５からの腹水に含有されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体、ならびにα−ＳＮＡＰ−２５ ＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３モノクローナル抗体を標準的なプロテインＡ精製プロトコールを用いて精製した。全てのその他のα−ＳＮＡＰ−２５抗体を精製された抗体として購入した。
検出抗体溶液を調製するために、適切なα−ＳＮＡＰ−２５抗体を製造者の説明書に従って（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）ルテニウム（ＩＩ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホナート）ＮＨＳエステル標識試薬（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）に抱合させた。蒸留水で再構成されたMSD SULFO−TAG（商標）ストック溶液３０μＬを２ｍｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体２００μＬに添加し、そして反応物を暗中室温で２時間インキュベートすることにより抱合反応を実施した。標準的なスピンカラムプロトコールを用いて標識された抗体を精製し、そして標準的な比色タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。分光光度計を使用してα−ＳＮＡＰ−２５抗体／MSD SULFO−TAG（商標）抱合体の吸光度を４５５ｎｍで測定してリットルあたりのモル濃度を決定した。検出抗体溶液を必要になるまで４℃で保存した。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的である捕捉抗体を含んでなる固相支持体を調製するために、適切なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体溶液（１×ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ）およそ５μＬを９６ウェルMSD High Bindプレートの各ウェルに添加し、そして生物学的安全キャビネット内で２−３時間空気乾燥させて溶液を液体蒸発させる。次いで２％Amersham遮断試薬（GE Life Sciences, Piscataway, NJ）および１０％ヤギ血清（VWR, West Chester, PA）を含んでなる遮断バッファー１５０μＬを室温で２時間添加することにより、捕捉抗体結合ウェルを遮断した。遮断されたプレートを密閉し、そして必要になるまで４℃で保存した。
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析により切断されたＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、保存されたプレートからの遮断バッファーをウェルから吸引し、前記されたようにＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼート２５μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェル３回を洗浄した。洗浄後、１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中２％Amersham遮断試薬を含んでなる５μｇ／ｍＬ検出抗体溶液２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで３回洗浄した。洗浄後、１×リードバッファー（Read Buffer）（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）１５０μＬを各ウェルに添加し、そしてSECTOR（商標）Imager 6000イメージリーダー（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）を使用してプレートを読み取った。各抗体対に関して１０ｎＭ用量で得られたシグナルを、各抗体対に関して０ｎＭ用量で得られたシグナルにより除することにより比を計算した（表１２）。これらの結果により、試験された抗体対の２６個の異なる組み合わせの中で３個の抗体対のみが試験された高用量に関して１０：１を超えるシグナル対ノイズ比を有した：第１対（２Ｅ２Ａ６マウスｍＡｂおよびＳ９６８４ウサギｐＡｂ）、第４対（３Ｃ１Ａ５マウスｍＡｂおよびＳ９６８４ウサギｐＡｂ）および第１８対（Ｓ９６８４ウサギｐＡｂおよび２Ｅ２Ａ６マウスｍＡｂ）。さらなるアッセイ開発のために第１抗体対を選んだ。
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３. 細胞分化条件の最適化
サンドイッチＥＬＩＳＡ検出系を用いる場合にＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い細胞を含んでなる細胞株に関する最適な分化条件を決定するために、種々の細胞培養培地および分化時間の長さの双方を試験した。
最適な分化培地を決定するために、ＳｉＭａ細胞株から適当な密度の細胞を、以下の培地および分化サプリメント：１）ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ）；２）ＲＰＭＩ−１６４０、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメントおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ；３）最小必須培地、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメントおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ；ならびに４）ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＢＳＡ、１×Ｎ２サプリメント、１×ＮＧＦサプリメントおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ；のうちの１つを１ｍＬ含有する、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた２４ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ３日）インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）、０.２ｐＭ、２ｐＭまたは２０ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。一晩処理した後、細胞を洗浄し、毒素を伴わずにさらに２日間インキュベートしてＳＮＡＰ−２５基質の切断を可能にし、そしてセクション１にて前記されたように採取した。細胞ライゼートのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定した。ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によるＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在の検出を、第１抗体対を使用して前記されたように実施した。実施例１にて論じられたように、未分化型細胞は分化型細胞ほど効果的に毒素を取り込まなかった。ＢｏＮＴ／Ａ取り込みおよび結果的にＳＮＡＰ−２５切断を増大するために最も効果的な分化培地は培地３（ＭＥＭ＋Ｎ２＋Ｂ２７）、続いて培地２（ＲＰＭＩ−１６４０＋Ｎ２＋Ｂ２７）、および培地４（ＲＰＭＩ−１６４０＋Ｎ２＋ＮＧＦ＋ＢＳＡ）（図３）。培地２中で培養された細胞は、その他の培地と比較して、ＳＮＡＰ−２５のさらなる切断を招いた。
最適な分化時間を決定するために、ＳｉＭａ細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含有する血清不含培地１００μＬを含有する、ポリ−Ｄ−リジンコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。６時間、２４時間、４８時間および７２時間試験する分化時間経過を得るために細胞を異なる４日に蒔き、そして３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下でインキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）、０.１ｐＭ、０.２ｐＭ、０.４ｐＭ、０.８ｐＭ、１.６ｐＭ、３.１ｐＭ、６.２５ｐＭ、１２.５ｐＭまたは２５ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。一晩処理した後、細胞を洗浄し、毒素を伴わずにさらに２日間インキュベートしてＳＮＡＰ−２５基質の切断を可能にし、そしてセクション１にて前記されたように採取した。採取した後、細胞ライゼートのタンパク質濃度およびＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によるＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在の検出を前記されたように実施した。次いでＥＣＬ撮像装置から得られた生データをSigmaPlot v.9.0に移し、そして４パラメーターロジスティック適合を用いて用量−応答曲線を定義した。データをプロットする場合に、４パラメーターロジスティック関数に用いられる制約はなかった。以下の分析を用いてグラフレポートを作成した：Ｒ２（相関係数）、ａ（データセットに関して最大）、ｂ（傾き）およびＸ０±ＳＥ（ＥＣ５０値±標準誤差）。結果により、４８−７２時間分化した細胞で２ｐＭ未満のＥＣ５０値を達成できることが示された（図４）。分化の４８時間から７２時間の間の分化型細胞を使用でき、細胞の性能における有意な変化を伴わないという知見はアッセイの頑健性を強調した。４８時間未満の分化時間は処方された生成物のピコモル濃度の試験に適当ではないかもしれないが、これらの短い分化時間はバルク原薬試験には十分鋭敏である。
４. ＢｏＮＴ／Ａ処理時間の最適化
ＢｏＮＴ／Ａで処理される必要のある細胞株からの細胞に最適な時間の長さを決定するために、種々の長さのＢｏＮＴ／Ａ処理時間を試験した。ＳｉＭａ細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含有する血清不含培地１００μＬを含有する、ポリ−Ｄ−リジンコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を蒔き、そして３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ３日）インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そしてＲＰＭＩ１６４０成長培地中０（未処理試料）、０.１ｐＭ、０.２ｐＭ、０.４ｐＭ、０.８ｐＭ、１.６ｐＭ、３.１ｐＭ、６.３ｐＭ、１２.５ｐＭまたは２５ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で３検体ずつ置き換えて、全用量−応答を作成した。５つの異なる長さのＢｏＮＴ／Ａ処理計画を実施した：１）ＢｏＮＴ／Ａ ６時間処理、細胞の除去および洗浄、ＢｏＮＴ／Ａを伴わずに１８時間の細胞のインキュベーション、ならびにセクション１にて前記されたような細胞の採取；２）ＢｏＮＴ／Ａ ２４時間処理、細胞の除去および洗浄、ならびにセクション１にて前記されたような細胞の採取；３）ＢｏＮＴ／Ａ ２４時間処理、細胞の除去および洗浄、ＢｏＮＴ／Ａを伴わずに２４時間の細胞のインキュベーション、ならびにセクション１にて前記されたような細胞の採取；４）ＢｏＮＴ／Ａ ２４時間インキュベーション、細胞の除去および洗浄、ＢｏＮＴ／Ａを伴わずに４８時間の細胞のインキュベーション、ならびにセクション１にて前記されたような細胞の採取；ならびに５）ＢｏＮＴ／Ａ ２４時間インキュベーション、細胞の除去および洗浄、ＢｏＮＴ／Ａを伴わずに７２時間の細胞インキュベーション、ならびにセクション１にて前記されたような細胞の採取。採取した後、細胞ライゼートのタンパク質濃度、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＮＡＰ−２５切断生成物の検出を実施し、そして前記されたようにＥＣ５０を計算した。結果により、試験されたいずれかのＢｏＮＴ／Ａ処理で２ｐＭ未満のＥＣ５０値を達成できることが示される（図５）。興味深いことに、２４時間＋２４時間、２４時間＋４８時間および２４時間＋７３時間のＢｏＮＴ／Ａ処理計画により本質的に同じＥＣ５０値、各々１.０ｐＭ、１.１ｐＭおよび０.９ｐＭを生じた。６時間＋１８時間および２４時間＋０時間のＢｏＮＴ／Ａ処理計画に関して生じたＥＣ５０値は各々１.７ｐＭおよび１.６ｐＭであった。得られたシグナルの量は低いが、これらの結果により、６時間から２４時間の間のＢｏＮＴ／Ａ処理時間、加えて１日から３日の処理後インキュベーションを用いて、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するために十分であるＥＣ５０を生じ、そしてアッセイの全体的な時間経過において柔軟性を与えることができることが示される。
５. ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法の感度
本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法の感度を評価するために、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い細胞によるＢｏＮＴ／Ａ取り込みのタイミングを決定した。ＳｉＭａ細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２０μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含有する血清不含培地１００μＬを含有する、ポリ−Ｄ−リジンコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ３日）インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、１ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体を含有する新鮮培地で置き換え、そしてＢｏＮＴ／Ａ処理細胞を、０分（神経毒を添加し、そして次に即座に除去した）、５分、１０分、２０分、３０分および６０分の６つの異なる時点でインキュベートした。ＢｏＮＴ／Ａを伴わない（０ｎＭ）培地の陰性対照を使用した。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、そしてセクション１にて前記されたように採取した。採取の後、細胞ライゼートのタンパク質濃度、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＮＡＰ−２５切断生成物の検出を実施し、そして前記されたようにＥＣ５０を計算した。結果により、バックグラウンドを超える有意な量のＳＮＡＰ−２５切断生成物を生成する前に、細胞によるＢｏＮＴ／Ａの取り込みに１分未満しかかからないことが示された（図６）。
６. ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法の特異性
本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法の特異性を評価するために、部分的に不活化されたＢｏＮＴ／Ａを除外してＢｏＮＴ／Ａを正確に区別する、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い細胞の受容力を決定した。ＳｉＭａ細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含有する血清不含培地１００μＬを含有する、ポリ−Ｄ−リジンコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ３日）インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして１）０（未処理試料）、０.０３ｐＭ、０.１ｐＭ、０.３１ｐＭ、０.９３ｐＭ、２.７８ｐＭ、８.３３ｐＭおよび２５ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体；２）０、０.１４ｎＭ、０.４１ｎＭ、１.２３ｎＭ、３.７ｎＭ、１１.１１ｎＭ、３３.３３ｎＭおよび１００ｎＭ 不活性ＢｏＮＴ／Ａ（ｉＢｏＮＴ／Ａ）；または３）０、０.１４ｎＭ、０.４１ｎＭ、１.２３ｎＭ、３.７ｎＭ、１１.１１ｎＭ、３３.３３ｎＭおよび１００ｎＭ ＬＨＮ／Ａフラグメントのいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。ｉＢｏＮＴ／Ａは神経毒のメタロプロテアーゼ活性を完全に不活化する軽鎖の亜鉛結合ドメインに変異を含有し、例えば「ボツリヌス神経毒Ａの軽鎖の発現および精製：単一の変異が重鎖との再構成後のＳＮＡＰ−２５のその切断および神経毒性を無効にする」Liqing Zhou, et al., Biochemistry 34：15175−15181（1995）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。ＬＨＮ／Ａフラグメントは結合ドメインを欠如するが、インタクトな転位置ドメインおよび軽鎖を含有し、例えば「組換え毒素フラグメント」Clifford C. Shoneら、米国特許第６４６１６１７号（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。２４時間の処理の後、細胞を洗浄し、毒素を伴わずにさらに２日間インキュベートしてＳＮＡＰ−２５基質の切断を可能にし、そしてセクション１にて前記されたように採取した。採取した後、細胞ライゼートのタンパク質濃度、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＮＡＰ−２５切断生成物の検出を実施し、そして前記されたようにＥＣ５０を計算した。結果により、ｉＢｏＮＴ／ＡおよびＬＨＮ／Ａ（ＥＣ５０＞１００ｎＭ）に関する細胞の結合アフィニティーはＢｏＮＴ／Ａ（ＥＣ５０＝１.６ｐＭ）に関する結合アフィニティーよりも少なくとも６０,０００低いことが示される（図７）。試験された全濃度のｉＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞においてＳＮＡＰ−２５切断生成物は検出されなかった。最高用量のＬＨＮ／Ａフラグメントで処理された細胞において低量のＳＮＡＰ−２５切断生成物が検出されたが、この活性は転位置ドメインの活性によるこのフラグメントの非特異的取り込みによるものである。故に結果により、本明細書において開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法は、それによりＢｏＮＴ／Ａがタンパク質分解によりＳＮＡＰ−２５基質を切断し、そしてＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の細胞内小胞から細胞質への転位置およびＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解による切断を包含する中毒過程に関与する全ての工程を測定できることが示される。
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法
以下の実施例は、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を使用してＳＮＡＰ−２５切断生成物を検出することによりＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を例証する。
ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からライゼートを調製するために、確立された細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含有する血清不含培地１００μＬを含有する９６ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた（実施例１および２参照）。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ３日）インキュベートした。分化型細胞からの培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）、０.０３ｐＭ、０.１ｐＭ、０.３ｐＭ、０.９ｐＭ、２.８ｐＭ、８.３ｐＭおよび２５ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。２４時間の処理の後、細胞を洗浄し、そして毒素を伴わずにさらに２日間インキュベートした。実施例５に記載されるように細胞を採取した。
α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液を調製するために、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ２Ａ６からの腹水に含有されるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を標準的なプロテインＡ精製プロトコールを用いて精製した。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Sigma, St. Louis, MO）を製造者の説明書に従って（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）ルテニウム（ＩＩ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホナート）ＮＨＳエステル標識試薬（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）に抱合させた。抱合反応、標識されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体の精製、濃度決定および保存は実施例５に記載されるとおりであった。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的である捕捉抗体を含んでなる固相支持体を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体２Ｅ２Ａ６溶液（１×ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ）およそ５μＬを９６ウェルMSD High Bindプレートの各ウェルに添加し、そして生物学的安全キャビネット内で２−３時間空気乾燥させて溶液を液体蒸発させた。次いで捕捉抗体結合ウェルを遮断し、そしてＢｏＮＴ／Ａ活性を直接検出するために使用した。
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によりＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、保存されたプレートからの遮断バッファーをウェルから吸引し、ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼート２５μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェルを３回洗浄した。洗浄後、１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中２％Amersham遮断試薬を含んでなる５μｇ／ｍＬ検出抗体溶液２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで３回洗浄した。洗浄後、１×リードバッファー（Read Buffer）（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）１５０μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートをSECTOR（商標）Imager 6000イメージリーダー（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）を使用して読み取った。収集されたデータを分析し、そして実施例５に記載されるようにＥＣ５０を計算した。代表的な結果を図８に示す、これらの結果により、下の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約１５：１から約２０：１および上の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約２０：１から約５００：１でＥＣ５０のＢｏＮＴ／Ａ代表値１.０ｐＭが検出される（約０.３ｐＭから約２.０ｐＭの範囲）ことが示された。
ＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法
以下の実施例はＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによるＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を使用してＳＮＡＰ−２５切断生成物を検出することによりＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を例証する。
細胞からのライゼートをＢｏＮＴ／Ａで処理し、そしてα−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液を実施例６に記載されるように調製した。
α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Sigma, St. Louis, MO）を製造者の説明書に従って（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合させた。１ｍｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体５００μＬを、凍結乾燥活性化ペルオキシダーゼを含有するバイアルに添加し、構成要素を混合し、そして次にシアノ水素化ホウ素ナトリウム１０μＬを添加することにより抱合反応を実施した。この反応混合物をドラフト内で室温で１時間インキュベートした。反応をクエンチした後、標準的なスピンカラムプロトコールを用いて標識された抗体を精製し、そして標準的な比色タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。分光光度計を使用してα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体／ＨＲＰ抱合体の吸光度を４５５ｎｍで測定してリットルあたりのモル濃度を決定した。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を必要になるまで４℃で保存した。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的であるα−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体を含んでなる固相支持体を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体２Ｅ２Ａ６溶液（１×ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）およそ１００μＬを９６ウェルGreinerホワイトプレートの各ウェルに添加し、そして４℃でプレートを一晩インキュベートし、そして次に過剰の抗体溶液を捨てた。次いで２％Amersham遮断試薬（GE Life Sciences, Piscataway, NJ）および１０％ヤギ血清（VWR, West Chester, PA）を含んでなる遮断バッファー１５０μＬを室温で１時間添加することにより、捕捉抗体結合ウェルを遮断した。遮断バッファーを捨て、そしてプレートをペーパータオル上でひっくり返し、そして軽くたたくことによりブロット乾燥した。次いで捕捉抗体結合ウェルを遮断し、そしてＢｏＮＴ／Ａ活性を直接検出するために使用した。
ＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によりＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼート５０μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを５００ｒｐｍで回転している振盪機上で４℃で２−４時間から一晩インキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.０５％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェルをを洗浄した。洗浄後、１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中２％Amersham遮断試薬を含んでなる１ｍｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体／ＨＲＰ検出抗体溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを６５０ｒｐｍで回転している振盪機上で室温で１時間インキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.０５％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで３回洗浄した。洗浄後、SuperSignal ELISA Pico １：１混合物（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL）１００μＬを各ウェルに添加し、そしてルミノメーター（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して３９５ｎｍで読み取った。収集されたデータを分析し、そして実施例５に記載されるようにＥＣ５０を計算した。これらの結果により、下の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約１５：１から約２０：１および上の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約２０：１から約５００：１でＥＣ５０のＢｏＮＴ／Ａ代表値１.０ｐＭが検出される（約０.３ｐＭから約２.０ｐＭの範囲）ことが示された。
マルチプレックスＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法
以下の実施例はＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体および異なるタンパク質に関する第２の抗体対を使用してＳＮＡＰ−２５切断生成物を検出することによりＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するマルチプレックス免疫基盤の方法を例証する。
１. 第２のタンパク質に関する捕捉抗体−検出抗体対の調製および同定
分析のための未処理細胞ライゼートを得るために、ＳｉＭａ細胞のストック培養物から適当な密度の細胞を、１×ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１００単位／１００μｇペニシリン−ストレプトマイシンを含有する成長培地４０ｍＬを含有するＴ１７５フラスコに播種した。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、細胞がおよそ７０−９０％コンフルエントになるまでインキュベートした。細胞を洗浄し、そして新たに調製されたTriton X−100溶解バッファー（２０ｍＭ Tris（ｐＨ７.５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０.００１Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび１％Triton−X−100）中４℃でおよそ３０分間一定の攪拌を行いながら溶解することにより細胞を採取した。溶解した細胞を３３００−３３３０×ｇ、８℃で４０分間遠心して、ベンチトップ遠心を用いてデブリを排除した。
第２のタンパク質のための適切な捕捉抗体−検出抗体対を同定するために、５つの異なるタンパク質からなる捕捉および検出抗体対の２１個の異なる組み合わせにおいてＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析を行った（表１３）。使用された抗体はα−シンタキシン１Ａ−ＨＰＣマウスモノクローナル抗体Ｓ０６６４（Sigma, St. Louis, MO）、α−ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ３７４（Chemicon, Temecula, CA）、α−シンタキシン１ウサギポリクローナル抗体Ｓ１１７２−１（Sigma, St. Louis, MO）、α−ＧＡＰＤＨウサギポリクローナル抗体２２７５−ＰＣ−１（R & D Systems, Minneapolis, MN）、α−シンタキシン２ウサギポリクローナル抗体Ｓ５６８７（Sigma, St. Louis, MO）、α−ヒトシンタキシン２マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ２９３６（R & D Systems, Minneapolis, MN）、α−マウスシンタキシン２ヤギポリクローナル抗体ＡＦ２５６８（Sigma, St. Louis, MO）、α−シンタキシン２ウサギポリクローナル抗体ＡＢ５５９６（Sigma, St. Louis, MO）、α−シンタキシン１ウサギポリクローナル抗体Ｓ１１７２−２（Sigma, St. Louis, MO）、α−ｈ、ｍ、ｒアクチンヒツジポリクローナル抗体ＡＦ４０００（R & D Systems, Minneapolis, MN）、α−ベータアクチンマウスモノクローナル抗体Ａ１９７８（Sigma, St. Louis, MO）、α−ベータマウスポリクローナル抗体アクチンＡ２２２８（Sigma, St. Louis, MO）、マウスα−ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体Ｇ８７９５（Sigma, St. Louis, MO）、α−ＧＡＰＤＨウサギポリクローナル抗体Ｇ９５９５（Sigma, St. Louis, MO）であった。
第２のタンパク質捕捉抗体溶液を調製するために、モノクローナル抗体を精製された抗体として購入した。第２のタンパク質検出抗体溶液を調製するために、適切な抗体を製造者の説明書に従って（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）ルテニウム（ＩＩ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホナート）ＮＨＳエステル標識試薬（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）に抱合させた。蒸留水で再構成されたMSD SULFO−TAG（商標）ストック溶液３０μＬを２ｍｇ／ｍＬポリクローナル抗体２００μＬに添加し、そして反応物を暗中室温で２時間インキュベートすることにより抱合反応を実施した。標準的なスピンカラムプロトコールを用いて標識された抗体を精製し、そして標準的な比色タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。分光光度計を使用して抗体／MSD SULFO−TAG（商標）抱合体の吸光度を４５５ｎｍで測定してリットルあたりのモル濃度を決定した。検出抗体溶液を必要になるまで４℃で保存した。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的である捕捉抗体を含んでなる固相支持体を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体２Ｅ２Ａ６溶液（１×ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ）およそ５μＬを９６ウェルMSD High Bindプレートの各ウェルに添加し、そして生物学的安全キャビネット内で２−３時間空気乾燥させて溶液を液体蒸発させ、そして次にプレートを密閉し、そして必要になるまで４℃で保存した。次いで３％ＢＳＡ（Pierce, Rockford, IL）、１０％ヤギ血清（Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA）および０.０５％TWEEN−20 ＰＢＳ中Difco １％脱脂乳（BD BioSciences Franklin Lakes, NJ）を含んでなる遮断バッファー１５０μＬを室温で１−２時間添加することにより、乾燥した捕捉抗体結合ウェルを遮断した。
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によりタンパク質の存在を検出するために、保存されたプレートからの遮断バッファーをウェルから吸引し、前記されたようにＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼート２５μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェルを３回洗浄した。洗浄後、前記されたような遮断バッファー中に再懸濁された５μｇ／ｍＬの適切な第２のタンパク質検出抗体溶液２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを室温で約１時間振盪しながらインキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２５０μＬで３回洗浄した。洗浄後、１×リードバッファー（Read Buffer）（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）１５０μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートをSECTOR（商標）Imager 6000イメージリーダー（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）を使用して読み取った。各抗体対に関して未処理細胞ライゼートから得られたシグナルを、各抗体対に関して溶解バッファー対照（０ｎＭ用量）に関して得られたシグナルにより除することにより比を計算した（表１３）。これらの結果により、試験された抗体対の２１個の異なる組み合わせの中で２個の抗体対のみが試験された高用量に関して１０：１を超えるシグナル対ノイズ比を有した：第１６対 α−ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ３７４およびα−ＧＡＰＤＨウサギポリクローナル抗体ＲＤＳ２２７５−ＰＣ−１；ならびに第２１対：α−ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ３７４およびα−ＧＡＰＤＨウサギポリクローナル抗体Ｇ９５４５。α−ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ３７４およびα−ＧＡＰＤＨウサギポリクローナル抗体Ｇ９５４５対をマルチプレックスＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡに関する第２タンパク質捕捉抗体−検出抗体対として選択した。
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２. マルチプレックスＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法
分析のためのＢｏＮＴ／Ａ処理細胞ライゼートを得るために、ＳｉＭａ細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する血清不含培地を含有するポリ−Ｄ−リジン９６−ウェルプレートに播種した。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ３日）インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして０（未処理試料）、０.６７単位／ｍＬ、２.３５単位／ｍＬ、８.２３単位／ｍＬ、２８.８２単位／ｍＬ、１０１単位／ｍＬ、３５３単位／ｍＬ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。２４時間の処理の後、細胞を洗浄し、毒素を伴わずにさらに２日間インキュベートした。細胞を洗浄し、採取し、そしてセクション１にて前記されたように加工した。
α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液およびα−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を実施例７に記載されるように調製した。α−ＧＡＰＤＨ捕捉抗体溶液を調製するために、α−ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体マウスＭＡＢ３７４（Chemicon, Temecula, CA）を前記のセクション１に記載されるように調製した。α−ＧＡＰＤＨ検出抗体溶液を調製するために、α−ＧＡＰＤＨウサギポリクローナル抗体Ｇ９５４５（Sigma, St. Louis, MO）を製造者の説明書に従って（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）ルテニウム（ＩＩ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホナート）ＮＨＳエステル標識試薬（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）に抱合させた。抱合反応、標識されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体の精製、濃度決定および保存は前記のセクション１に記載されたとおりであった。
α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体およびα−ＧＡＰＤＨ捕捉抗体を含んでなる固相支持体を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液（１×ＰＢＳ中４５μｇ／ｍＬ）およそ２.５ｎＬおよびα−ＧＡＰＤＨ捕捉抗体溶液（１×ＰＢＳ中１２０μｇ／ｍＬ）２.５ｎＬをロボットシステムを用いてマルチプレックス形式の９６ウェルMSD High Bindプレートの各ウェルに添加した。生物学的安全キャビネット内で少なくとも２−３時間空気乾燥させて溶液を液体蒸発させた。次いで捕捉抗体結合ウェルを遮断し、そしてＢｏＮＴ／Ａ活性およびＧＡＰＤＨタンパク質を直接検出するために使用した。
マルチプレックスＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、保存されたプレートからの遮断バッファーをウェルから吸引し、前記されたようにＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼート２５μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェルを３回洗浄した。洗浄後、前記されたような５μｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液２５μＬおよび５μｇ／ｍＬ α−ＧＡＰＤＨ検出抗体２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを室温で約１時間振盪しながらインキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２５０μＬで３回洗浄した。洗浄後、１×リードバッファー（Read Buffer）（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）１５０μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートをSECTOR（商標）Imager 6000イメージリーダー（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）を使用して読み取った。収集されたデータを分析し、そしてＰＬＡ２.０ソフトウェア（Stegmann Systems, GmbH, Germany）を使用した以外は実施例５に記載されるように正規化されたデータから相対効力を計算する。
比較として、シングルプレックスＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施例６に記載されるようにＳＮＡＰ−２５切断生成物の検出をも実施した。
結果により、シングルプレックスＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡから得られたＳＮＡＰ−２５データにより、またはマルチプレックスＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡから得られた非正規化ＳＮＡＰ−２５データから、用量−応答曲線に適合しなかった１つの異常値試料が表されることが示された。しかしながら、ＳＮＡＰ−２５データのＧＡＰＤＨデータに対する正規化により、良好な曲線適合が示され、そして効力が予期された値により近似した。
マルチプレックスＥＣサンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法
以下の実施例はＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体および異なるタンパク質に関する第２の抗体対を使用してＳＮＡＰ−２５切断生成物を検出することによりＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するマルチプレックス免疫基盤の方法を例証する。
ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からライゼートを実施例６に記載されるように調製した。α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液およびα−ＳＮＡＰ−２５固相支持体を実施例７に記載されるように調製した。
α−ＧＡＰＤＨ捕捉抗体溶液を調製するために、α−ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体ＭＡＢ３７４（Millipore, Billerica, MA）を精製された抗体として購入した。α−ＧＡＰＤＨ検出抗体溶液を調製するために、α−ＧＡＰＤＨポリクローナル抗体Ｇ９５４５（Sigma, St. Louis, MO）を製造者の説明書に従って（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合させた。抱合反応、濃度決定および保存は実施例７に記載されたとおりであった。
第２のタンパク質に特異的な第２の捕捉抗体を含んでなる固相支持体を調製するために、１μｇ／ｍｌα−ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体ＭＡＢ３７４を含んでなるモノクローナル抗体溶液およそ１００μＬを９６ウェルGreinerホワイトプレートの各ウェルに添加し、そして４℃で一晩インキュベートし、そして次に過剰の抗体溶液を捨てた。次いで２％Amersham遮断試薬（GE Life Sciences, Piscataway, NJ）および１０％ヤギ血清（VWR, West Chester, PA）を含んでなる遮断バッファー１５０μＬを室温で１時間添加することにより、α−ＧＡＰＤＨ捕捉抗体結合ウェルを遮断した。遮断バッファーを捨て、そしてプレートをペーパータオル上でひっくり返し、そして軽くたたくことによりブロット乾燥した。次いで捕捉抗体結合ウェルを遮断し、そしてＢｏＮＴ／Ａ活性を直接検出するために使用した。
マルチプレックスＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によりＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からの細胞ライゼート５０μＬをα−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体固相支持体およびα−ＧＡＰＤＨ捕捉抗体固相支持体の各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを５００ｒｐｍで回転している振盪機上で４℃で２−４時間から一晩インキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.０５％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェルを３回洗浄した。洗浄後、１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中２％Amersham遮断試薬を含んでなる検出抗体溶液１００μＬおよび１ｍｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体／ＨＲＰを、α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体固相支持体の各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを６５０ｒｐｍで回転している振盪機上で室温で１時間インキュベートした。類似して１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中２％Amersham遮断試薬を含んでなる検出抗体溶液１００μＬおよび０.２５ｍｇ／ｍＬ α−ＧＡＰＤＨ Ｇ９５４５ポリクローナル抗体／ＨＲＰ（Sigma Co., St Louis, MO）を、α−ＧＡＰＤＨ捕捉抗体固相支持体の各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを室温で６５０ｒｐｍで回転している振盪機上に室温で１時間置いた。検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.０５％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで３回洗浄した。洗浄後、SuperSignal ELISA Pico １：１混合物（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL）１００μＬを各ウェルに添加し、ルミノメーター（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して３９５ｎｍで読み取った。収集されたデータを分析し、そして実施例５に記載されるようにＥＣ５０を計算した。結果により、検出されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体−抗原複合体の量に関して収集されたデータポイントは、検出されたα−ＧＡＰＤＨ抗体−抗原複合体の量に対して正規化された後に良好に適合し、それによりさらに正確な読みを生じることが示された。これらの結果により、下の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約１５：１から約２０：１および上の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約２０：１から約５００：１でＥＣ５０のＢｏＮＴ／Ａ代表値１.０ｐＭが検出される（約０.３ｐＭから約２.０ｐＭの範囲）ことが示された。
類似の設計を、同じα−ＧＡＰＤＨ抗体対を伴うＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基でカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を使用してＳＮＡＰ−２５切断生成物を検出することによりＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するマルチプレックス免疫基盤の方法に用いることができる。
ピコモル濃度量のＢｏＮＴ／Ａを検出するための免疫基盤の方法
以下の実施例はピコモル濃度量の、例えばBOTOX（登録商標）、DYSPORT（登録商標）／RELOXIN（登録商標）、PURTOX（登録商標）、XEOMIN（登録商標）、NEURONOX（登録商標）またはＢＴＸ−ＡのようなＢｏＮＴ／Ａ医薬品を検出することができるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法を実施する仕方を例証する。
１. ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＢｏＮＴ／Ａを検出する免疫基盤の方法
ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からライゼートを調製するために、確立された細胞株からおよそ５０,０００から１５０,０００セルを、最小必須培地、アール塩を伴う２ｍＭ GlutaMAX（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含有する血清不含培地１００μＬを含有する９６ウェル組織培養ポリ−Ｄ−リジンプレートのウェルに蒔いた（実施例１および２参照）。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ２から３日）インキュベートした。分化型細胞からの培地を各ウェルから吸引し、そして塩化ナトリウム不含溶液で再構成された０（未処理試料）、０.０３ｐＭ、０.１ｐＭ、０.３ｐＭ、０.９ｐＭ、２.８ｐＭ、８.３ｐＭもしくは２５ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ医薬品；または塩化ナトリウム不含溶液で再構成された０（未処理試料）、０.７単位／ｍＬ、２.１単位／ｍＬ、６.２単位／ｍＬ、１８.５単位／ｍＬ、５５.６単位／ｍＬ、１６６.７単位／ｍＬもしくは５００単位／ｍＬ ＢｏＮＴ／Ａ医薬品のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。ＢｏＮＴ／Ａ医薬品は塩化ナトリウムを含有するので、培養培地へのその添加は、細胞生存性に有害である高張培地を招いた。高張の問題を免れるために、塩化ナトリウムを伴わずに作成されたＭＥＭ培地２００μＬを使用してＢｏＮＴ／Ａ医薬品を再構成して、最終濃度２５ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ（５００単位／ｍＬ）が得られた。希釈を、用いられた最高濃度（２５ｐＭまたは５００単位／ｍＬ）で存在する賦形剤の量に対応させるために、使用された培地に塩化ナトリウムを添加することにより、全濃度に関して用量−応答曲線に沿ってマトリックスを一定に保った。２４時間の処理の後、細胞を洗浄し、そして毒素を伴わずにさらに２日間インキュベートした。細胞を採取するために培地を吸引し、１×ＰＢＳで洗浄し、そして５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Triton X−100を含んでなる溶解バッファーを各ウェルに添加することにより溶解し、そしてプレートを５００ｒｐｍで回転している振盪機上で４℃で３０分間インキュベートした。プレートを４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心して、細胞デブリをペレット化し、そして上澄を捕捉抗体コーティングされた９６ウェルプレートに移して検出工程を実施した。
α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液、およびＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的である捕捉抗体を含んでなる固相支持体を実施例６に記載されるように調製した。
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によりＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、保存されたプレートから遮断バッファーを吸引し、ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼート２５μＬを各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で２時間または２４時間のいずれかでインキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェルを３回洗浄した。洗浄後、１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中２％Amersham遮断試薬を含んでなる５μｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２検出抗体溶液２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで３回洗浄した。洗浄後、プレートを加工し、収集されたデータを分析し、そして実施例５に記載されるようにＥＣ５０を計算した。これらの結果により、下の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約１５：１から約２０：１および上の漸近線に関するシグナル対ノイズ比約２０：１から約５００：１でＥＣ５０のＢｏＮＴ／Ａ代表値１.０ｐＭが検出された（約０.３ｐＭから約２.０ｐＭの範囲）（図９）。この方法を実施例８に記載されるようにマルチプレックス様式で実施することもできる。
２. ＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＢｏＮＴ／Ａを検出する免疫基盤の方法
ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼートおよびα−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液を実施例６に記載されるように調製する。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液およびＳＮＡＰ−２５切断生成物に特異的である捕捉抗体を含んでなる固相支持体を実施例７に記載されるように調製する。
ＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によりＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からのライゼート２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを５００ｒｐｍで回転している振盪機上で４℃で２時間または２４時間のいずれかでインキュベートした。細胞ライゼートを吸引し、そして１×ＰＢＳ、０.０５％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで各ウェルを３回濯ぐことによりプレートウェルを３回洗浄する。洗浄後、１×ＰＢＳ、０.１％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中２％Amersham遮断試薬を含んでなる１ｍｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体／ＨＲＰ検出抗体溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、そして密閉されたプレートを６５０ｒｐｍで回転している振盪機上で室温で１時間インキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、ウェルを１×ＰＢＳ、０.０５％TWEEN−20（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）２００μＬで３回洗浄する。洗浄後、SuperSignal ELISA Pico １：１混合物（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL）１００μＬを各ウェルに添加し、ルミノメーター（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して３９５ｎｍで読み取る。収集されたデータを分析し、そして実施例５に記載されるようにＥＣ５０を計算する。この方法を実施例８に記載されるようにマルチプレックス様式で実施することもできる。
α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を検出する免疫基盤の方法
以下の実施例はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在を検出することができる免疫基盤の方法を実施する仕方を例証する。
ＢｏＮＴ／Ａは現在、筋肉運動亢進、眼科、胃腸管、泌尿器科および化粧品を含む広範囲の医療適用に使用されている。ＢｏＮＴ／Ａの長期間処置を繰り返すと、患者は毒素に対するα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を発達させて、免疫抵抗性に至り得る。α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体はＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨＣ）および／または転位置ドメイン（ＨＮ）に結合することにより、毒素のニューロン細胞への取り込みを停止させることによりＢｏＮＴ／Ａ活性を阻止する。いくつかの研究により、ジストニアに関してＢｏＮＴ／Ａの処方で繰り返し処置された患者の５−１０％までが、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を発達させることによる免疫抵抗性を有することが示唆されている。患者の血液中のα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在を決定するための確立されたアッセイは、マウス保護アッセイ（ＭＰＡ）である。現在はＢｏＮＴ／Ａはマウスへの注射の前に患者の血清と共にインキュベートされる。抗体の存在は、動物における神経毒に対する応答の低下により顕在化される。ＭＰＡはビボ基盤のアッセイであるので、それが細胞基盤のアッセイで置き換えられると、費用および時間がさらに効率的になるであろう。
α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在を検出するために、本明細書に開示されるＢｏＮＴ／Ａ活性を決定する免疫基盤の方法を用いることができる。１つの方式はウェスタンブロット検出法を用いて、種々の濃度のＢｏＮＴ／Ａでの処理の後に存在するＳＮＡＰ−２５切断生成物の量を決定することであり、もう１つの方式はＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ検出法を用いることであった。
α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体および、α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を欠如することが解っている陰性対照試料を含んでなる試料を調製するために、異なる個体の血液から血清を単離した。免疫が減衰している個体をナイーブな個体と称した。免疫を獲得している個体を免疫された個体と称した。血液を凝固促進剤（BD Biosciences, Bedford, MA）の入った血清管に入れた。血液を１,０００×ｇ、４℃で１０分間遠心することにより血清が得られた。２人のドナーの血清が得られた：一方の固体はＢｏＮＴ／Ａに対して免疫されたが、他方はされなかった。
ＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理された細胞からライゼートを調製するために、ＳｉＭａ細胞を実施例６に記載されるようにポリ−Ｄ−リジン９６ウェルプレートに播種し、そして分化させた。血清不含培地を使用して２.５倍増でヒト血清を１：１００−１：１５２,０００に連続希釈した。ＢｏＮＴ／ＡをＳｉＭａ培養培地０.５ｍＬ中１０ｐＭの濃度で懸濁した。ＢｏＮＴ／Ａおよびα−ＢｏＮＴ／Ａ抗体を含有する培地を混合し、そして室温で１５分間または１時間インキュベートした。ヒト血清を伴うＢｏＮＴ／Ａで細胞を２時間処理し、続いて新鮮成長培地中１５時間インキュベートした。細胞をまたさらなるインキュベーション時間なしに１５時間処理した。
ウェスタンブロット分析によりＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、培地を各ウェルから吸引し、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷バッファー５０μＬに懸濁し、そして次に９５℃まで５分間加熱した。１２％２６ウェルCriterionゲル（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用して採取された試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する以外は実施例１に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析し、そしてウサギポリクローナルα−ＳＮＡＰ−２５１９７抗体血清を一次抗体として使用した（実施例４参照）。結果により、陰性対照試料と比較した場合、被験試料はＳＮＡＰ２５の切断低減を招いたことが示され、それにより免疫された個体からの血清がα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有したことが実証される。
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによりＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、培地を各ウェルから除去し、そして細胞を実施例５に記載されるように溶解した。α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液およびα−ＳＮＡＰ−２５固相支持体を実施例７に記載されるように調製した。上澄をα−ＳＮＡＰ−２５固相支持体に移し、そしてＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを実施例５に詳記されるように実施した。収集されたデータを分析し、そしてＥＣ５０がＢｏＮＴ／Ａの活性をその最大の１／２まで阻止するために必要な血清希釈であり、そして血清の最高希釈で得られたＳＮＡＰ−２５切断生成物シグナルを最低血清希釈で得られたシグナルで除することにより、最大シグナル（シグナルＭａｘ）の最小シグナル（シグナルＭｉｎ）に対する比が得られた以外は実施例５に記載されるようにＥＣ５０を計算した。
結果により、ヒト血清におけるα−ＢｏＮＴ／Ａ中和の存在を検出できることが示される。免疫された個体からの血清中でインキュベートされたＢｏＮＴ／Ａ複合体の活性は血清希釈が低下するのにつれて低下したが、一方ナイーブな血清の存在は試験されたどの希釈でもアッセイに及ぼす影響力はなかった。処方されたＢｏＮＴ／Ａ医薬品、バルクＢｏＮＴ／Ａ複合体または精製された神経毒を使用してこのアッセイを実施することができる。
操作された細胞を使用してＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する免疫基盤の方法
以下の実施例はＢｏＮＴ／Ａ受容体をコードするポリヌクレオチド分子を確立された細胞株からの細胞に導入して、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性をさらに改善するか、またはＢｏＮＴ／Ａ取り込み受容力を改善する仕方を例証する。
外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を確立された細胞株を含んでなる細胞に導入するために、カチオン性脂質法により配列番号：５９のＦＧＦＲ２をコードする配列番号：１３０のポリヌクレオチド分子、または配列番号：２５のＦＧＦＲ３をコードする配列番号：１３９のポリヌクレオチド分子を含んでなる発現構築物を確立された細胞株からの細胞にトランスフェクトした。適当な密度（約５×１０６セル）の確立された細胞株からの細胞を、完全培養培地５ｍＬを含有する１００ｍｍ組織培養皿に蒔き、そして３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、細胞がトランスフェクションに適切な密度に到達するまで成長させる。室温で５分間インキュベートされたLipofectAmine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA）６０μＬを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ還元型血清培地１.５ｍＬを、ＦＧＦＲ２もしくはＦＧＦＲ３をコードする発現構築物２４μｇ、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする対照発現構築物を含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ還元型血清培地１.５ｍＬに添加することによりトランスフェクション溶液３ｍＬを調製する。このトランスフェクション混合物を室温でおよそ３０分間インキュベートした。完全培地をトランスフェクション溶液３ｍＬで置き換え、そして細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下でおよそ８時間インキュベートする。トランスフェクション培地を新鮮完全培地３ｍＬで置き換え、そして細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下でおよそ２４時間インキュベートする。培地を、およそ１ｍＭ Ｇ４１８（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含有する新鮮完全培地３ｍＬで置き換える。細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下でおよそ１週間インキュベートし、古い培地を、０.５ｍＭ Ｇ４１８を含有する新鮮完全培養培地で置き換える。一度抗生物質抵抗性コロニーが確立されると、抵抗性コロニーを、およそ０.５ｍＭ Ｇ４１８を補充した新鮮完全培養培地を含有する新しい１００ｍｍ培養プレートに、これらの細胞が６から２０×１０５セル／ｍＬの密度に到達するまで再度蒔く。
ＢｏＮＴ／Ａ受容体の過剰発現がＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する細胞感受性を改善したか、またはＢｏＮＴ／Ａ取り込み受容力を改善したかどうかを決定するために、様々な用量のＢｏＮＴ／Ａ複合体で処理された細胞を使用して用量−応答曲線を作成した。ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞からライゼートを調製するために、確立されたトランスフェクトされた細胞株からの適当な密度の細胞を、適切な血清不含培地（表５）１００μＬを含有する９６ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中５％二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで（およそ３日）インキュベートした。分化型細胞からの培地を各ウェルから吸引し、そしてＳｉＭａまたはＰＣ１２トランスフェクトされた細胞株を含んでなる細胞に関しては０（未処理試料）、０.０１ｎＭ、０.０４ｎＭ、０.１２ｎＭ、０.３７ｎＭ、１.１ｎＭ、３.３ｎＭおよび１０ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体；ならびにＮｅｕｒｏ−２ａトランスフェクトされた細胞株を含んでなる細胞に関しては０（未処理試料）、０.１４ｎＭ、０.４０ｎＭ、１.２ｎＭ、３.７ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭおよび１００ｎＭ ＢｏＮＴ／Ａ複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。細胞をＢｏＮＴ／Ａ含有培地で６時間処理し、続いて新鮮培地を伴って１５時間インキュベートし、そして２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷バッファー４０μｌを添加し、そしてプレートを９５℃まで５分間加熱することにより採取した。
ＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在を検出するために、１２％２６ウェルCriterionゲル（Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用して採取された試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する以外は実施例１に記載されるように、各採取された試料からのアリコートをウェスタンブロットにより分析し、そして以下の一次抗体を使用した：１：１,０００希釈のウサギポリクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体血清（実施例４）（ＡＧＮ、ポリクローナル抗体）、１：５００希釈のα−ＦＧＦＲ２ウサギポリクローナルＣ−１７（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）または１：５００希釈のα−ＦＧＦＲ３ウサギポリクローナルＣ−１５（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）。各試料からの目的のタンパク質の強度をImage Quant（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を用いて計算し、そして細胞株の各々に関するＥＣ５０をSigmaPlotソフトウェアを用いて推定した。
結果により、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３でトランスフェクトされた細胞は、ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞よりもさらにＢｏＮＴ／Ａに対して鋭敏であり、そしてまた高レベルのＳＮＡＰ−２５切断を示したことが示される（表１４）。ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３を過剰発現する細胞に関するＥＣ５０値は、ＧＦＰを過剰発現する細胞により呈されるＥＣ５０値よりも低く、それはＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３の導入がＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する細胞感受性を改善したか、またはＢｏＮＴ／Ａ取り込み受容力を改善したことを示している。
Figure 0006522075
 ＳＮＡＰ−２５切断生成物の存在に関する検出を実施例６−１０に記載されるようにサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施することもできる。
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］担体、少なくとも３個のアミノ酸を含んでなる可動性リンカーおよび配列番号：１４８を含んでなるＳＮＡＰ−２５抗原を含んでなる組成物。
［２］可動性リンカーおよびＳＮＡＰ−２５抗原アミノ酸配列が配列番号：３８である［２］に記載の組成物。
［３］単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し；
α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含まないエピトープに関して１×１０１Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有し；そして
α−ＳＮＡＰ−２５抗体がそのエピトープに関して０.４５０ｎＭ未満の平衡解離定数を有する；
単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
［４］エピトープが配列番号：３２である［３］に記載の単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
［５］ａ）配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：８０または配列番号：８２を含んでなる重鎖可変領域；および
ｂ）配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０または配列番号：９２を含んでなる軽鎖可変領域；
を含んでなる単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
［６］ａ）配列番号：９３、配列番号：１２１または配列番号：１００を含んでなる重鎖可変領域；および
ｂ）配列番号：１０５、配列番号：１１０または配列番号：１１５を含んでなる軽鎖可変領域；
を含んでなる単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
［７］少なくとも配列番号：１００のＶＨＣＤＲ３、配列番号：１０１のＶＨＣＤＲ３または配列番号：１０２のＶＨＣＤＲ３を含んでなる単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体。
［８］ａ）確立された細胞株からの細胞をＢｏＮＴ／Ａを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞は約５００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；
ｂ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；
ｃ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に連結されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、
ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含まないＳＮＡＰ−２５からのエピトープに関して１×１０１Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有し；そしてα−ＳＮＡＰ−２５抗体はエピトープに関して０.４５０ｎＭ未満の平衡解離定数を有する；
ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること、
ここで抗体−抗原複合体による検出はＢｏＮＴ／Ａ活性の指標である；
の工程を含んでなるＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
［９］ＳＮＡＰ−２５切断生成物がＳＮＡＰ−２５１９７である［８］に記載の方法。
［１０］抗体−抗原複合体の存在がサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出される［８］に記載の方法。
［１１］方法が下の漸近線で少なくとも３：１のシグナル対ノイズ比および上の漸近線で少なくとも１０：１のシグナル対ノイズ比を有する［８］に記載の方法。
［１２］試料が多くても１００ｐＭのＢｏＮＴ／Ａを含んでなる［８］に記載の方法。
［１３］確立された細胞株からの細胞が約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い［８］に記載の方法。
［１４］方法がシングルプレックス様式またはマルチプレックス様式で実施される［８］に記載の方法。
［１５］ａ）α−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にＢｏＮＴ／Ａを添加すること；
ｂ）確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高い；
ｃ）処理された細胞からＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなるＳＮＡＰ−２５構成要素を単離すること；
ｄ）ＳＮＡＰ−２５構成要素を固相支持体に連結されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させること、ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体は；
ここでα−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含まないＳＮＡＰ−２５からのエピトープに関して１×１０１Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有し；そしてα−ＳＮＡＰ−２５抗体はそのエピトープに関して０.４５０ｎＭ未満の平衡解離定数を有する；
ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；
ｆ）被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返すこと、陰性対照試料はＢｏＮＴ／Ａ、およびα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに
ｇ）工程ｅで検出された抗体−抗原複合体の量を工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、
ここで工程ｆで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程ｅで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の存在の指標である；
の工程を含んでなる哺乳動物におけるＢｏＮＴ／Ａ免疫抵抗性を決定する方法。

Claims (3)

  1. ａ．ＢｏＮＴ／Ａにより切断可能であるＳＮＡＰ−２５を発現する確立された細胞株からの細胞を、ＢｏＮＴ／Ａを含むことが疑われる被験試料と接触させること、
    ここで該確立された細胞株は、配列番号：３８のカルボキシル末端グルタミンを含むＳＮＡＰ−２５切断生成物を生じるようにＢｏＮＴ／Ａ中毒に感受性が高く、該確立された細胞株が、Ｓｉｍａ細胞株（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ １６４）またはＮｅｕｒｏ−２ａ細胞株（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−１３１ ＴＭ ）に由来する；
    ｂ．該細胞からＳＮＡＰ−２５切断生成物を単離すること；
    ｃ．ＳＮＡＰ−２５切断生成物を固相支持体に連結された抗ＳＮＡＰ−２５抗体と接触させること、
    ここで該抗ＳＮＡＰ−２５抗体は、０．４５０ｎＭ未満の平衡解離定数で配列番号：３８のカルボキシル末端アミノ酸配列を含むエピトープに結合し、該抗ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：５を含むインタクトなＳＮＡＰ−２５ポリペプチドのエピトープに関して１ｘ１０１Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数を有する；
    ｄ．抗ＳＮＡＰ−２５抗体および配列番号：３８のカルボキシル末端アミノ酸配列を含むＳＮＡＰ−２５切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること；
    ｅ．被験試料の代わりに陰性対照試料で工程ａ−ｄを行うこと、
    ここで陰性対照試料は、バッファ、またはＢｏＮＴ／Ａ活性を含有しないことが解っている血清を含んでなる；ならびに
    ｇ．工程ｄで検出された被験試料の抗体−抗原複合体の量を工程ｅにおいて検出された陰性対照試料の抗体−抗原複合体の量と比較すること、
    ここで陰性対照試料における抗体−抗原複合体の量よりも多い抗体−抗原複合体の量は、被験試料におけるＢｏＮＴ／Ａ活性の存在を示す；
    の工程を含んでなる、試料中のＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法。
  2. 抗体−抗原複合体の存在の検出がサンドイッチイムノアッセイの使用により行われる請求項１に記載の方法。
  3. (i)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９５（ＣＤＲ１）、配列番号：９９（ＣＤＲ２）および配列番号：１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０３（ＣＤＲ１）、配列番号：１０８（ＣＤＲ２）および配列番号：１１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
    (ii)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９３（ＣＤＲ１）、配列番号：９６（ＣＤＲ２）および配列番号：１００（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０５（ＣＤＲ１）、配列番号：１１０（ＣＤＲ２）および配列番号：１１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
    (iii)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９３（ＣＤＲ１）、配列番号：９７（ＣＤＲ２）および配列番号：１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０４（ＣＤＲ１）、配列番号：１０９（ＣＤＲ２）および配列番号：１１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
    (iv)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）および配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０７（ＣＤＲ１）、配列番号：１１２（ＣＤＲ２）および配列番号：１１７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
    (v)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）および配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１１１（ＣＤＲ２）および配列番号：１１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、または
    (vi)該抗ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：９３（ＣＤＲ１）、配列番号：９７（ＣＤＲ２）および配列番号：１００（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１１１（ＣＤＲ２）および配列番号：１１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、
    請求項１または２に記載の方法。
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