KR102274841B1 - Snare 복합체를 억제하는 항-snap 25 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Snare 복합체를 억제하는 항-snap 25 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SNARE 복합체를 억제하는 항-SNAP 25 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-SNAP 25 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-SNAP 25 항체는 SNARE 복합체 형성을 억제하여 피부 주름 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

SNARE 복합체를 억제하는 항-SNAP 25 항체 및 이의 용도{Anti-SNAP 25 antibodies inhibiting SNARE complex and use thereof}
본 발명은 SNARE 복합체를 억제하는 항-SNAP 25 항체 및 이의 용도에 대한 것이다.
세포 내에서 일어나는 막융합은 SNARE(soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor)라고 하는 단백질들에 의해 일어난다. SNARE 단백질은 모든 종에 걸쳐 매우 잘 보존되어 있는 특정 단백질 군을 말하며, SNARE 복합체(complex)는 이 단백질들의 복합체를 의미한다. SNARE 단백질은 target (t-) SNARE와 vesicular (v-) SNARE로 나눌 수 있으며, t-SNARE는 presynaptic membrane에 존재하는 SNARE 단백질을 말하며, v-SNARE는 synaptic vesicle에 존재하는 SNARE 단백질을 일컫는다. t-SNARE는 Syntaxin 1A로 불리우는 막단백질(integral membrane protein)과 peripheral membrane protein인 SNAP 25(soluble NSF attachment protein of 25 kDa)으로 이루어지며 그 기능적 단위는 이의 복합체 (t-SNARE complex)로 생각되고 있다. v-SNARE는 vesicle-associated membrane protein 2 (VAMP2 또는 synaptobrevin)라는 막 단백질을 말한다. 이러한 SNARE 단백질들은 'SNARE core'라고 불리는 60~70 aa 정도의 부위를 가지고 있는데, 이 부위들이 서로 모여 SNARE 복합체라고 불리는 four-helical bundle을 형성하게 된다.
상기 SNARE 복합체와 관련된 연구가 활발하게 진행 중이지만, SNARE 복합체를 억제하는 항체에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이다.
한국등록특허 제10-1803201호(2017.11.23 등록) 한국공개특허 제10-2017-0140549호(2017.12.21 공개) 한국공개특허 제10-2017-0015845호(2017.02.09 공개) 한국공개특허 제10-2011-0001915호(2011.01.06 공개)
Toxicon. 2009 October; 54(5): 570-574
본 발명의 목적은 SNARE 복합체를 억제하는 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 SNAP 25 항원 검출용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 항산화용 화장료 조성물, 피부 주름 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물과, 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 SNAP 25 항원 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 SNARE 복합체를 억제하는 항-SNAP 25 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-SNAP 25 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-SNAP 25 항체는 SNARE 복합체 형성을 억제하여 피부 주름 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 항-SNAP 25 scFv 항체 선별을 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 세포투과성 항-SNAP 25 scFv 단백질의 정제 후 SDS-PAGE를 통해 크기 및 단백질 순도 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 세포투과성 항-SNAP 25 scFv 단백질의 SNARE 복합체 형성 저해능을 native-PAGE 분석을 통해 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 세포투과성 항-SNAP 25 scFv 단백질의 MMP-1 콜라겐 분해효소 활성억제결과를 나타낸 것이다.
도 5는 세포투과성 항-SNAP 25 scFv 단백질의 세포 투과능을 웨스턴 블랏법으로 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 세포투과성 항-SNAP 25 scFv 단백질의 돼지피부 투과능을 DAB 염색법으로 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
한편, 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR들은 표 1에 기재하였다.
또한, 본 발명에 사용된 TAT 펩타이드의 아미노산 서열은 "YGRKKRRQRRR" (서열번호 7)이고, TAT 펩타이드의 염기서열은 "TAT GGC CGC AAA AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC" (서열번호 8)이다.
본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SNAP 25에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 SNAP 25 항원 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 조성물은 SNARE 복합체 형성을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 조성물은 활성산소 생성을 억제할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 유효성분 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 조성물은 SNARE 복합체 형성을 억제할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 조성물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 조성물은 SNARE 복합체 형성을 억제할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 항-SNAP 25 scFv 항체 선별
1. bio-panning 시행
7.6 × 109의 다양성을 가지는 OPAL library를 이용하여 bio-panning을 수행하였다. Epoxy magnetic bead에 4 μg의 SNAP 25 항원을 고정시키고 input phage를 반응시켰다. 항원과 반응한 phage를 용출(elution)하여 output titer를 측정하였다. 매 횟수마다 input과 output titer를 측정하여 bio-panning의 정보를 획득하고 정상적으로 시행되고 있는지를 확인하였다. 매 횟수마다 input phage는 4 × 1012 cfu/mL ≥의 phage를 사용하였다. output은 1차 - 5 × 106, 2차 - 1.5 × 108, 3차 - 1.7 × 107 cfu/mL으로 bio-panning이 진행되는 것을 알 수 있었다.
2. ELISA 분석
고민감도, 고특이성 항체의 선별을 위해 ELISA 분석법을 수행하였다. 획득한 phage를 대장균에 감염시켜 항생제가 첨가된 LB plate에 도말하였다. 16 시간 동안 30℃ 인큐베이터에서 배양한 후 생성된 콜로니(colony)를 랜덤하게 채집하였다. 각 콜로니(colony)를 LB 배지에 넣어 배양한 후 IPTG를 처리하여 scFv를 발현시키고 대장균을 용해(lysis)하여 수용성 분획(soluble fraction)을 취하여 ELISA를 수행하였다. 먼저, 1 μg/mL의 SNAP 25 재조합 단백질을 96 well ELISA plate에 고정시키고, 1% BSA가 함유된 PBS로 블락킹(blocking)하였다. 1 시간 후, 위에서 얻은 세포 용해물(cell lysate)을 처리하여 4℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 3회 씻어준 후 블락킹 용액(blocking solution)에 HRP-conjugated anti-HA 항체를 1:1000으로 희석하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 5회 씻어준 후 TMB substrate로 발색시켜 ELISA reader로 항원에 결합된 scFv 항체를 측정하였다. 도 1은 SNAP 25를 이용하여 진행한 ELISA의 결과를 나타낸다. 288개의 항체를 분석하였고 OD 0.4를 양성 가이드라인(positive guideline), 0.1을 음성 가이드라인(negative guideline)으로 임의로 정하여 9종을 선별하였다(도 1).
< 실시예 2> 항-SNAP 25 scFv 항체 서열 분석
ELISA 분석을 통하여 선별된 항-SNAP 25 9종의 양성 클론(positive clone)에 대하여 서열분석(sequencing)을 통해 개별적 클론(clone)을 선별하였다. 앞서 선별한 양성 클론(positive clone) 중에 중복되는 클론(clone)이 존재할 가능성이 있기 때문에 서열분석이 필요하였다. 서열 분석 결과, 항-SNAP 25의 경우 9 종의 양성 클론(positive clone) 중에 6종이 개별적인 클론(clone)임을 확인하였다.
< 실시예 3> 세포투과성 항-SNAP 25 scFv 제작
1. TAT-항-SNAP 25 scFv construct 제작
앞서 선별된 1종의 항-SNAP 25 scFv (표 1)를 primer를 이용하여 제한효소 사이트(restriction enzyme site)와 TAT을 삽입한 PCR 산물을 생산하였다. 각 PCR 산물 30 μL에 완충액(buffer) 3.1 4 μL, Sal I 1 μL, Xho I 1 μL, 증류수 4 μL를 처리하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 DNA를 분리하여 vector에 삽입할 insert를 확보하였다. pET28a(+) vector는 DH5α competent cell에 형질전환(transformation) 한 후, 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB plate에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하고 다음 날 콜로니(colony)를 취하여 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB media에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 다음날 mini-prep kit를 이용하여 vector를 분리한 후 vector 30 μL 에 완충액 3.1 4 μL, Sal I 1 μL, Xho I 1 μL, CIP 1 μL, 증류수 3 μL를 처리하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 정제하였다. 정제된 vector와 insert의 농도를 nanodrop으로 측정하고 vector와 insert의 비율별로 T4 ligase를 이용하여 상온에서 16 시간 동안 ligation을 진행하였다. Ligation이 끝난 후 DH5α competent cell에 형질전환(transformation) 한 후 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB plate에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하고 다음 날 콜로니(colony)를 취하여 카나마이신이 첨가된 LB media에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 다음날 insert가 삽입되었는지 확인하기 위해 플라스미드(plasmid)를 분리하여 Sal I과 Xho I으로 절단(restriction)하고, 1% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
Target Clone Light chain CDR sequence Heavy chain CDR sequence
CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
SNAP 25 5 SVSSSNIGSNSVS SNTH GTWDYSLSA NYAMS AISSGGGNI KNRINFDY
2. TAT-항-SNAP 25 scFv 항체 정제
클로닝 된 TAT-항-SNAP 25 scFv 항체 클론을 BL21(DE3) 대장균 숙주에 형질전환 시켰다. 형질전환체는 카나마이신이 포함된 LB media에서 OD600 값이 0.6이 될 때까지 배양하고, 16℃에서 0.5 mM IPTG를 처리하여 발현 유도(induction) 하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 세포들을 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)에 현탁한 후 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액을 얻었다. Ni-NTA에 친화력을 갖는 레진을 사용하여 TAT-항-SNAP 25 scFv 단백질을 정제하였으며, SDS-PAGE 분석을 통하여 단백질의 크기가 약 30 kDa 임을 확인하였다(도 2).
< 실시예 4> 세포투과성 항-SNAP 25 scFv의 세포독성 시험
TAT-항-SNAP 25 scFv 항체에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, 포유류 신경 세포인 PC12 세포를 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 TAT-항-SNAP 25 scFv 항체를 농도별로 처리한 다음 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. MTT{3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide} 용액을 처리하여 배양한 다음 배양액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 넣고 충분히 혼합한 뒤 570 nm에서 ELISA Reader system으로 흡광도를 측정하였으며, 그 값은 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, TAT-항-SNAP 25 scFv를 0.01, 0.1, 1, 10, 50, 100 ppm 농도로 처리했을 때, 100 ppm 농도까지 포유류 신경 세포의 세포모양 변형 및 세포생존율의 변화가 거의 없음을 확인하였다. 따라서, TAT-항-SNAP 25 scFv의 100 ppm 농도까지는 세포 독성이 없는 물질임을 알 수 있었다.
실시예4
TAT-항-SNAP 25
농도 (ppm) 평균 오차
0 100.0 2.4
0.01 104.7 1.3
0.1 96.1 4.1
1 116.1 6.9
10 140.9 7.9
50 137.1 2.7
100 136.4 8.7
< 실시예 5> 세포투과성 항-SNAP 25 scFv의 SNARE 복합체 형성 억제능 실험
TAT-항-SNAP 25 scFv 항체의 SNARE 복합체 형성 억제 여부를 확인하기 위해, native-PAGE 분석을 수행하였다. SNARE 단백질인 SNAP25, Syntaxin 1A와 VAMP2 단백질 (LSbio사)을 각각 1:1:1의 농도 (1 μg)로 혼합했을 경우 형성되는 복합체가 TAT-항-SNAP 25 scFv 항체의 첨가에 의해 억제되는지를 확인하였다. 각각의 단백질 1 μg 넣고 TAT-항-SNAP 25 scFv 항체 각각을 농도별 (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 20 μg)로 처리한 후 충분히 혼합한 다음 4℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 종료되면 샘플 완충액을 넣어 반응을 정지시킨 후 10% native-PAGE 상에서 SNARE 복합체 형성여부를 확인하였다(도 3). 그 결과, TAT-항-SNAP 25 scFv는 SNARE 복합체 형성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
< 실시예 6> 세포투과성 항-SNAP 25 scFv의 MMP -1 발현억제 평가
TAT-항-SNAP 25 scFv에 대하여, 콜라겐 생성에 미치는 영향을 알아보고자 Real Time PCR 방법을 사용하여 TAT-항-SNAP 25 scFv에 의한 MMP-1 활성 억제효능을 실험하였다. 포유류 신경 세포인 PC12 세포를 37℃, CO2인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 자외선조사기기(UV irradiator system)를 이용하여 UVA를 조사하였다. 그 후, TAT-항-SNAP 25 scFv 항체 10 ppm과 양성대조구로서 adenosine 100 ppm을 처리한 다음 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양 후 세포를 TRIzol 300 μL로 모아 1.5 mL tube에 옮기고, chloroform 50 μL를 첨가한 다음 혼합하여 상온에 5분간 방치한다. 이후 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 새로운 tube로 옮기고 동량의 2-propanol과 섞어 상온에서 5분간 방치한 다음 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리한다. 원심분리 후 2-propanol은 버리고 75% 에탄올 300 μL를 첨가하여 4℃, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 75% 에탄올은 버리고 RNA pellet은 상온에서 말려 남아있는 에탄올을 제거한다. Pellet에 DEPC가 처리된 정제수 30 μL를 넣어 녹인 후 260 nm에서 정량한다. RT-PCR은 1 μg의 total RNA와 TOPscript RT dry mix를 이용하여 수행하였다. Real Time PCR에 사용된 MMP-1과 GAPDH는 마크로젠에서 합성하여 사용하였으며 염기서열은 아래 표 3에 나타내었다. TOPrealTM Qpcr 2X PreMIX를 이용하여 Real Time PCR을 실시하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, TAT-항-SNAP 25 scFv는 자외선에 의해 증가된 주름 생성의 원인이 되는 MMP-1 콜라겐 분해효소를 억제하였다. TAT-항-SNAP 25 scFv 10 ppm 처리 시 대조구 100 ppm을 처리한 것과 비슷한 효과를 나타내었다.
프라이머 서열
MMP-1 정방향 5'-ACGCAGATTTAGCCTCCGAA-3'
역방향 5'-TGACTTGGTAATGGGTTGCC-3'
GAPDH 정방향 5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'
역방향 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'
< 실시예 7> 세포투과성 항-SNAP 25 scFv의 세포 및 피부 투과 분석
1. TAT-항-SNAP 25 scFv의 세포 투과 분석
TAT-항-SNAP 25 scFv의 세포 투과를 확인하기 위하여, PC12 세포를 6-well 플레이트에서 배양한 뒤 FBS가 포함되지 않은 1.5 mL의 신선한 배양액으로 교체하고 여러 농도의 TAT-항-SNAP 25 scFv를 처리하였다. 처리 1시간 뒤, 세포를 PBS로 충분히 세척한 다음 회수하여 TAT-항-SNAP 25 scFv의 세포 내 투과된 정도를 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다. 세포 내 투과된 TAT-항-SNAP 25 scFv가 정확한 위치(크기)에서 확인되는지를 알아보기 위하여, 순수 정제된 TAT-항-SNAP 25 scFv (Control)도 함께 전기영동하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, TAT-항-SNAP 25 scFv는 농도 의존적으로 세포 내 투과가 효과적으로 일어났음을 확인하였다.
2. TAT-항-SNAP 25 scFv의 피부 투과 분석
TAT-항-SNAP 25 scFv의 피부 투과를 확인하기 위하여, 돼지 피부를 사용하여 조직염색으로 확인하였다. 돼지 피부에 TAT-항-SNAP 25 scFv 10 μg을 처리하고 37℃, CO2 인큐베이터에서 16시간 배양하였다. 돼지 피부를 4% 포름알데하이드로 고정시킨 뒤 파라핀 블록을 제조하였으며, 마이크로톰을 이용하여 5 μm로 조직을 절제하였다. 그 후, 슬라이드 위에 조직을 마운팅한 다음 파라핀을 제거하고, 수화과정을 거친 후 조직 절편을 30분간 블락킹하였다. 블락킹이 끝난 조직에 anti-His HRP antibody를 상온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 씻어준 다음 DAB-chromogen 용액에 5분간 반응시킨 후 H&E 염색기법으로 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 도 6은 항-SNAP 25 scFv과 TAT-항-SNAP 25 scFv의 피부 투과력을 비교한 결과이다. 항-SNAP 25 scFv는 돼지 피부 조직 내로 전혀 전달되지 않음에 반해, TAT-항-SNAP 25 scFv는 효율적인 피부 전달 능력을 가짐을 확인할 수 있었다.
< 실시예 8> 세포투과성 항-SNAP 25 scFv의 활성 산소 억제 효과 실험
TAT-항-SNAP 25 scFv 항체의 세포 내 활성산소(ROS) 저해효과를 확인하기 위해, 포유류 신경 세포인 PC12 세포에 TAT-항-SNAP 25 scFv 항체를 처리 후 세포내 활성산소 함량을 형광염색법을 이용하여 측정하였다. 96-well 플레이트에 접종된 PC12 세포를 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양한 후 TAT-항-SNAP 25 scFv 항체 (10, 20, 50, 100 ppm)를 처리하였다. 2 시간 동안 배양 후 각 well에 0.2 mM 과산화수소를 첨가한 다음 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 20 μM carboxy-H2DCF-DA를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 충분히 세척한 후 100 μL PBS를 재 첨가한 다음 ELISA Reader system을 이용하여 485/525 nm에서 형광을 측정하였으며, 그 값은 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, TAT-항-SNAP 25 scFv는 ROS 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
시료 농도
(ppm)		 ROS (fold of control)
non treat control 0.2 mM H2O2
평균 오차 평균 오차
TAT-항-SNAP 25 scFv 0 1.000 0.136 1.485 0.097
10 0.800 0.140 1.079 0.101
20 0.857 0.071 1.069 0.185
50 0.723 0.084 0.937 0.095
100 0.649 0.039 0.861 0.059
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> HAUUL BIO <120> Anti-SNAP 25 antibodies inhibiting SNARE complex and use thereof <130> DP-2019-0235 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <400> 1 Ser Val Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 <400> 2 Ser Asn Thr His 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 <400> 3 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <400> 4 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 <400> 5 Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Ile 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 <400> 6 Lys Asn Arg Ile Asn Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 8 tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgc 33

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-SNAP 25 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  4. 제3항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현벡터로 형질전환되어 분리된 세포.
  6. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 SNAP 25 항원 검출용 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 SNARE 복합체 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 활성산소 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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