JPH11113576A

JPH11113576A - 新規ｐｈｅＳ（アルファ）

Info

Publication number: JPH11113576A
Application number: JP9321885A
Authority: JP
Inventors: Deborah D Jaworski; デボラ・ディー・ジャウォルスキー; Elizabeth Jane Lawlor; エリザベス・ジェーン・ローラー; Won Min; ミン・ウォン
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 1999-04-27

Abstract

(57)【要約】【課題】ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドおよびそ
れをコードするポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】本発明は、ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペ
プチドおよびｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドをコー
ドしているＤＮＡ（ＲＮＡ）ならびに組み換え法による
かかるポリペプチドの製造方法を提供する。また、抗細
菌化合物のスクリーニングのためのｐｈｅＳ（アルフ
ァ）ポリペプチドの使用方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその製造
および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよび
アンタゴニストおよびそれらの使用に関する。詳細に
は、これらのおよびその他の点に関して、本発明は本明
細書で「ｐｈｅＳ（アルファ）」と称する、フェニルア
ラニルｔＲＮＡシンセターゼアルファサブユニットファ
ミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関
する。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトコッカス属は、医学上重要な
微生物の属であり、ヒトにおいていくつかのタイプの疾
病、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、
副鼻腔炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には髄膜炎
（例えば、脳脊髄液の感染）等の原因であることが知ら
れている。その単離は１００年以上も前であるので、ス
トレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptcoccus pne
umoniae）は魅力的な研究対象微生物の１つである。例
えば、ＤＮＡが実際に遺伝物質であるという我々の初期
の知識の多くは、この微生物を用いたGriffithおよびAv
ery、MacleodおよびMcCartyの研究に基づいて予想され
たものであった。エス・ニューモニアエ（S.pneumonia
e）に関する膨大な研究にもかかわらず、この微生物の
毒性に関する多くの疑問があった。ストレプトコッカス
の遺伝子および遺伝子産物を抗生物質の開発のための標
的として用いることが特に好ましい。ストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ感染の頻度は過去２０年間で飛躍的
に増大した。これは多剤耐性株の出現および免疫系が弱
体化した人々の増加による。標準的な抗生物質のいくつ
かまたはすべてに耐性であるストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエを単離することは、もはや異常なことではな
い。このことは、新規抗生物質およびこの生物に関する
新規診断方法の両方に対する必要性を生じさせた。

【０００３】ｔＲＮＡシンセターゼは以下のスキームに
従って、蛋白合成に主要な役割を果たす：酵素＋ＡＴＰ＋ＡＡ⇔酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ⇔酵素＋ＡＭＰ＋ＡＡ-ｔ
ＲＮＡ（ＡＡはアミノ酸である）この過程を阻害すると、荷電ｔＲＮＡのレベル低下を導
き、緊縮応答として知られているカスケード反応の引き
金となり、結果的に生体の休眠状態を誘導する。そのよ
うなものとして、細菌ｔ−ＲＮＡシンセターゼに対する
選択的阻害剤は抗菌剤としての潜在能力を有する。かか
る一例としてムピロシンがあり、それはイソロイシルｔ
−ＲＮＡシンセターゼの選択的阻害剤である。他のｔ−
ＲＮＡシンセターゼは、現在、使用可能な抗菌剤として
の試験中であり、シンセターゼの単離によりこの方法は
大いに利用しやすくなる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、化合物の抗
生物質活性をスクリーニングするために用いることがで
きる因子、ならびに感染、機能障害および疾患の病因に
おける役割を決定するためにも用いることができる因子
が必要とされている。また、感染、機能障害または疾患
の予防、改善または抑制に役割を果たすことができるこ
のような因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニスト
の同定および特徴づけも必要とされている。本発明のポ
リペプチドは、既知のバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）のフェニルアラニルｔＲＮＡシンセターゼ
アルファサブユニット蛋白に相同的なアミノ酸配列を有
する。

【０００５】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明の目的は、表１〜６の［配列番号：２］に示すア
ミノ酸配列とバチルス・ズブチリスのフェニルアラニル
ｔＲＮＡシンセターゼアルファサブユニット等のその他
の蛋白の既知アミノ酸配列との相同性により、新規ｐｈ
ｅＳ（アルファ）ポリペプチドとして同定されたポリペ
プチドを提供することである。本発明のさらなる目的
は、ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、特に本明細書においてｐｈｅＳ（アル
ファ）と称するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供することである。本発明のとりわけ好ましい
態様において、ポリヌクレオチドは、表１〜６の[配列
番号：１]に示す配列を含む新規ｐｈｅＳ（アルファ）
ポリペプチド、またはそれらの変種をコードする領域を
包含する。本発明の特に好ましい具体例において、ポリ
ペプチドは、表１〜６の［配列番号：１］に示す配列を
含むｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドをコードしてい
る領域を含み、それは全長の遺伝子またはその変種を包
含する。本発明の別のとりわけ好ましい態様において、
表１〜６の[配列番号：２]に示すアミノ酸配列を含む、
ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の新規ｐｈｅ
Ｓ（アルファ）蛋白、またはそれらの変種がある。本発
明のこの態様によれば、寄託株に含まれるストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ０１００９９３株により発現可
能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供
される。本発明のこの態様によれば、ｐｈｅＳ（アルフ
ァ）、とりわけストレプトコッカス・ニューモニアエの
ｐｈｅＳ（アルファ）をコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子が提供される。本発
明のさらなる態様は、生物学的、診断学的、予防的、臨
床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれら
を含有する組成物を包含する。

【０００６】本発明の別の態様によれば、治療的、予防
的目的で、とりわけ遺伝学的免疫において本発明のポリ
ヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様に
おけるとりわけ好ましい具体例は、ｐｈｅＳ（アルフ
ァ）の自然発生対立遺伝子変種およびそれによりコード
されるポリペプチドである。本発明のこの態様によれ
ば、本明細書でｐｈｅＳ（アルファ）と称するストレプ
トコッカス・ニューモニアエの新規ポリペプチド、なら
びに生物学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的
に有用なそれらの変種、およびこれらを含んでなる組成
物が提供される。本発明のとりわけ好ましい具体例は、
ｐｈｅＳ（アルファ）遺伝子の自然発生対立遺伝子によ
りコードされるｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドの変
種である。本発明のこの態様における好ましい具体例に
おいて、前述のｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドの製
造方法が提供される。本発明の別の態様によれば、例え
ば抗体等の抗菌物質として有用な、このようなポリペプ
チドに対する阻害物質が提供される。

【０００７】本発明のこの態様における１の好ましい態
様によれば、ｐｈｅＳ（アルファ）発現の評価、および
疾病の処置、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄
膜炎、副鼻腔炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には髄
膜炎（例えば、脳脊髄液の感染）の処置、遺伝学的変種
のアッセイ、ならびに生物にｐｈｅＳ（アルファ）ポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドを投与して細菌（詳細
にはストレプトコッカス・ニューモニアエ細菌）に対す
る免疫学的応答の生起のための製品、組成物および方法
が提供される。

【０００８】本発明のこの態様および他の態様における
１の好ましい具体例によれば、ｐｈｅＳ（アルファ）ポ
リヌクレオチド配列に、とりわけ厳密な条件でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドが提供される

【０００９】本発明のこの態様における１の好ましい具
体例において、ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドに対
する抗体が提供される。本発明の他の具体例において、
本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合し、
あるいはそれらと相互作用し、さらにはそれらの活性を
阻害またが活性化する方法が提供される。該方法は、化
合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の結
合または他の相互作用を可能にする条件下で、本発明ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドをスクリーニングす
べき化合物と接触させて化合物に対する結合または他の
相互作用を評価すること（かかる結合または相互作用
は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと化合物との
結合または相互作用に応答した検出可能なシグナルを提
供しうる第２の成分に関連したものである）；次いで、
化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの結合
または相互作用から生じたシグナルの存在または不存在
を検出することにより、化合物がポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと結合または相互作用して、その活性を
活性化または阻害するかどうかを決定することを特徴と
する。

【００１０】本発明の別の態様によれば、各々好ましい
静菌性または殺菌性をも有するｐｈｅＳ（アルファ）ア
ゴニストおよびアンタゴニストを提供する。

【００１１】本発明のさらなる態様において、ｐｈｅＳ
（アルファ）ポリヌクレオチドまたはｐｈｅＳ（アルフ
ァ）ポリペプチドを含有する、細胞または多細胞生物へ
の投与用の組成物が提供される。開示した本発明の意図
および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載
および本明細書のその他の部分の知見により、当業者に
容易に明らかとなろう。

【００１２】用語集以下の定義は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来ポリヌクレオチド配列により
形質転換もしくはトランスフェクションされた、または
形質転換もしくはトランスフェクションされ得る細胞で
ある。

【００１３】「同一性」とは、当該分野に周知であるよ
うに、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二
つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
あり、配列を比較して決定する。当該分野において、
「同一性」とは、場合によってはこのような配列の鎖の
適合性により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌク
レオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一
性」および「類似性」は共に既知の方法により容易に算
出できる（Computational Molecular Biology，Lesk,A.
M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、
ニューヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics an
d Genome Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク、1993年；Computer Analysis of S
equence Data，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,
H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994
年；Sequence Analysis in Molecular Biology，von He
inje,G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSeque
nce Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.
編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年）。二つの配列の同一性および類似性を測定する方法
は多くあるが、両用語共当業者に周知である（Sequence
Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、ア
カデミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Prim
er，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン
・プレス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo,H.
およびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（19
88））。配列間の同一性または類似性を測定するために
通常用いられる方法はCarillo,H.およびLipman,D.，SIA
M J.Applied Math.，48:1073（1988）等に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適
合するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムで
組み立てられる。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic A
cids Research12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、お
よびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-41
0（1990）））等があるが、これらに限定するものでは
ない。BLAST XプログラムはNCBIおよびその他の供給源
より公に入手可能である（BLAST Manual、Altschul,S.
ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メリーランド州20894；Alts
chul,S.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（1990））。一
例として、配列番号：１のリファレンスヌクレオチド配
列に対して、例えば少なくとも９５％の同一性を有する
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを挙げる
と、そのポリヌクレオチドが配列番号：１のリファレン
スヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個ごとに５個
までの点突然変異を含みうることを除き、そのポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列はリファレンス配列と同一
である。言い換えると、リファレンスヌクレオチド配列
に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチドを有
するポリヌクレオチドを得るためには、リファレンス配
列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレ
オチドと置換していてもよく、あるいはリファレンス配
列中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが
リファレンス配列に挿入されたものであってもよい。リ
ファレンス配列のこれらの変異は、リファレンスヌクレ
オチド配列の５’または３’末端位置に存在していても
よく、あるいはそれらの末端位置の間のいずれかの位置
に存在していてもく、リファレンス配列のヌクレオチド
に散在していてもよく、あるいはリファレンス配列内の
１個またはそれ以上の一連の群となっていてもよい。同
様に、配列番号：２のリファレンスアミノ酸配列に対し
て少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配
列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプ
チド配列が配列番号：２のリファレンスアミノ酸配列の
アミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含
みうることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は
リファレンス配列と同一である。言い換えると、リファ
レンスアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であ
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、
リファレンス配列中のアミノ酸の５％までが置換または
他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいはリファレ
ンス配列中の全アミノ酸のうち５％までの数のアミノ酸
がリファレンス配列中に挿入されたものであってもよ
い。リファレンス配列におけるこれらの変化は、リファ
レンスアミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置
に存在してもよく、あるいはそれらの末端間のいずれか
の位置に存在してもよく、リファレンス配列中に散在し
ていてもよく、あるいはリファレンス配列内で１個また
はそれ以上の一連の群をなしていてもよい。

【００１４】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化させるもしくは取り除
く、またはその両方を行ったことを意味する。例えばポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生
存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同
一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共
存する物質から分離されている場合は、本明細書に用い
る用語である、「単離」がなされている。

【００１５】「ポリヌクレオチド」とは、修飾されてい
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡも
しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および
二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常的には二本鎖
もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合
物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を
意味するが、これに限定するものではない。さらに、本
明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤ
ＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意
味する。そのような領域における鎖は同一の分子または
異なる分子からのものでよい。この領域は一つまたはそ
れ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つ
かの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の
一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書
で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたは
それ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤＮＡまた
はＲＮＡ等を含む。このように、安定性またはその他の
理由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本
明細書で意図する用語である「ポリヌクレオチド」であ
る。さらに、イノシン等の通常的でない塩基、またはト
リチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは
（二つの例だけをを示す）、本明細書で用いる用語であ
る、ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。本明細
書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌク
レオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修
飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば単細胞
および複合細胞等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡ
の化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、し
ばしばオリゴヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチ
ドを包含する。

【００１６】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾したペプチド結合により互いに結合している２個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋
白を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味す
る。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコードされた
アミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプ
チド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾
のような天然の工程により修飾されたものが含まれる
が、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾され
る。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細
な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されてお
り、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾は該
ポリペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度
で存在し得ることは理解されよう。また、該ポリペプチ
ドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾に
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形成、
ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキ
シル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、
ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水
分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残
基のガンマ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボ
シル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような
トランスファーＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸の添加、
ならびにユビキチネーションなどがある。例えばProtei
ns-Structure and Molecular Properties、第２版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）およびPosttranslational Covalent Modificat
ion of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレ
ス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslationa
l Protein Modifications ：Perspective and Prospect
s、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（1
990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttransl
ational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.
663:48-62（1992）を参照されたい。ポリペプチドは分
岐または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。
環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後
の自然発生プロセッシングの結果であり、同様に全く合
成的な方法で合成できる。

【００１７】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参
照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に差
異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に
非常に類似しており、多くの領域で同一であるように限
定される。変種および対照ポリペプチドは、１またはそ
れ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こる
ことにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または挿
入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコードされ
たものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のような
天然発生のものでよいか、または天然に発生することが
知られていない変種でよい。ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの非天然発生変種は、突然変異技術、直接的
合成、および当業者に既知のその他の組換え技術により
製造できる。

【００１８】発明の詳細な説明本発明は以下により詳細に記載する、新規ｐｈｅＳ（ア
ルファ）ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関す
る。特に、本発明は、バチルス・ズブチリスのフェニル
アラニルｔＲＮＡシンセターゼアルファサブユニットポ
リペプチドにアミノ酸配列の相同性という点で関連して
いる、ストレプトコッカス・ニューモニアエの新規ｐｈ
ｅＳ（アルファ）のポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドに関する。本発明は特に表１〜６の［配列番号：１］
および［配列番号：２］に各々示すヌクレオチドおよび
アミノ酸配列を有するｐｈｅＳ（アルファ）、ならびに
寄託株中のＤＮＡのｐｈｅＳ（アルファ）ヌクレオチド
配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列に関す
る。

【００１９】ｐｈｅＳ（アルファ）ポリヌクレオチドお
よびポリペプチド配列

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【００２０】寄託物ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３株
を含む寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イ
ンダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテ
ッド（ＮＣＩＭＢ）、２３ストリート、マッカードライ
ブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに、
１９９６年４月１７日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７９４が付与された。イー・コリ（E.coli）中のストレ
プトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３ＤＮＡラ
イブラリーも同様にＮＣＩＭＢに寄託され、受託番号４
０８００を付与された。寄託したストレプトコッカス・
ニューモニアエ株は本明細書では「寄託株」または「寄
託株のＤＮＡ」と称する。寄託物質はｐｈｅＳ（アルフ
ァ）遺伝子の全長を含有する。寄託株中に含まれるポリ
ヌクレオチド配列、ならびにそれによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列は、本明細書のいずれの記載
との矛盾に際しても支配的である。寄託は、特許手続き
上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条
件下でなされている。特許が発行されると何らの制限ま
たは条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託は当業
者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２
条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であ
ることを承認するものではない。寄託物を製造、使用ま
たは販売するためにはライセンスが必要であるが、その
ようなライセンスはここでは賦与されていない。

【００２１】ポリペプチド本発明のポリペプチドには、表１〜６の[配列番号：２]
のポリペプチド、ならびに表１〜６の[配列番号：２]の
ポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリ
ペプチド、好ましくは表１〜６の[配列番号：２]のポリ
ペプチドに少なくとも８０％の同一性を有するポリペプ
チド、およびさらに好ましくは表１〜６の[配列番号：
２]のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（さら
に好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリ
ペプチド、なおさらに好ましくは表１〜６の[配列番
号：２]のポリペプチドに少なくとも９５％の類似性
（なおさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を
有するポリペプチドなどがあり、また通常少なくとも３
０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個の
アミノ酸を含むようなポリペプチド部分を有する、この
ようなポリペプチドの部分なども含まれる。また本発明
は、表６の（Ｄ）に示す式で表されるポリペプチドを包
含し、式中、アミノ末端においてＸは水素であり、カル
ボキシル末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ₁
およびＲ₂はいずれかのアミノ酸残基であり、ｎは１な
いし１０００または２０００の整数である。Ｒ基により
示されるアミノ酸残基の鎖はヘテロポリマーであっても
ホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロポリマ
ーであり、Ｒは１よりも大である。

【００２２】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｐｈ
ｅＳ（アルファ）ポリペプチドでは、フラグメントは
「独立して存在（free standing）」しているか、また
は一部分もしくは領域を形成するより大きなポリペプチ
ド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続
した領域として、単一のより大きなポリペプチドに含ま
れる。好ましいフラグメントは、アミノ末端を含む残基
の一連の連続（すなわち連続領域、部分または部位）も
しくはカルボキシル末端を含む残基の一連の連続の欠
損、または一つはアミノ末端を含み、一つはカルボキシ
ル末端を含む残基の二つの一連の連続の欠損を除いた、
例えば表１〜６の[配列番号：２]のアミノ酸配列を有す
る切断されたポリペプチド、またはそれらの変種を包含
する。宿主、とりわけストレプトコッカス・ニューモニ
アエにおける、本発明のポリペプチドの切断形態もまた
好ましい。また、構造的または機能的属性により特徴づ
けられたフラグメント、例えばアルファーヘリックスお
よびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよ
びベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領
域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性
領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、
可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原
性指標領域を含むフラグメントなどがある。

【００２３】ｐｈｅＳ（アルファ）の活性を媒介する、
生物学的に活性な領域もまた好ましく、類似の活性もし
くは改善された活性のある、または望ましくない活性を
減じたフラグメント等がある。動物、とりわけヒトにお
いて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれ
る。特に好ましいのは、ストレプトコッカス・ニューモ
ニアエの生存にとり必須の機能を付与し、あるいは個
体、詳細にはヒトにおいて疾病を開始させまたは維持す
る能力を付与する酵素の受容体またはドメインを含むフ
ラグメントである。本発明ポリペプチドのフラグメント
である変種を、ペプチド合成による対応全長ポリペプチ
ドの製造に用いてもよい。それゆえ、これらの変種を、
本発明の全長のポリペプチドの製造のための中間体とし
て用いてもよい。

【００２４】ポリヌクレオチド本発明の別の態様は、表１〜６の[配列番号：２]の推定
アミノ酸配列を有するｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチ
ドをコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにそれら
に、およびそれらの変種に密接に関連したポリヌクレオ
チドを提供する。本明細書に提供する情報を用いて、例
えば表１〜６の[配列番号：１]に示すポリヌクレオチド
配列のような、ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドをコ
ードする本発明のポリヌクレオチドを、例えば出発物質
としてストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９
９３細胞からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニン
グおよび配列決定するために用いるような標準的なクロ
ーニングおよびスクリーニングを用いて得ることがで
き、次いでクローン全長を得ることができる。例えば、
表１〜６の[配列番号：１]に示す配列のような本発明の
ポリヌクレオチド配列を得るために、大腸菌または幾分
異なる適切な宿主におけるストレプトコッカス・ニュー
モニアエ０１００９９３細胞の染色体ＤＮＡのクローン
の典型的なライブラリーを、部分的配列に由来の、好ま
しくは１７量体またはそれ以上の長さの放射性標識化オ
リゴヌクレオチドにてプローブする。プローブのＤＮＡ
に同一であるＤＮＡを担うクローンは厳密な条件を用い
て区別できる。オリジナルの配列から設計した配列決定
プライマーでこのように同定した個々のクローンを配列
決定することにより、次に両方向で配列が伸長できるよ
うになり、全遺伝子配列を決定できる。このような配列
決定は便宜的にプラスミドクローンから調製した変性二
本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な技法については、
Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およびSambrookら、Molecula
r Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。（Screening By Hybridization 1.90お
よびSequencing Denatured Double-Stranded DNA Templ
ates 13.70参照）。本発明の説明のために、表１〜６の
[配列番号：１]に示すポリヌクレオチドは、ストレプト
コッカス・ニューモニアエ０１００９９３に由来するＤ
ＮＡライブラリーで発見された。

【００２５】このように得られたＤＮＡ配列を表１〜６
の[配列番号：１]に示す。これは当該分野で周知のアミ
ノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有す
る、表１〜６の[配列番号：２]に示すものとほぼ同数の
アミノ酸残基を有する蛋白をコードする読み枠を含有す
る。配列番号：１のヌクレオチド番号１から１０４４ま
でのポリヌクレオチドは配列番号：２のポリペプチドを
コードする。停止コドンは配列番号：１のヌクレオチド
番号１０４５から始まる。本発明のｐｈｅＳ（アルフ
ァ）は、寄託株のｐｈｅＳ（アルファ）をコードするＤ
ＮＡの配列決定の結果により示されるように、フェニル
アラニルｔＲＮＡシンセターゼアルファサブユニットフ
ァミリーのその他の蛋白に構造的に関連している。該蛋
白は、既知蛋白のうち、バチルス・ズブチリスのフェニ
ルアラニルｔＲＮＡシンセターゼアルファサブユニット
蛋白に最大の相同性を示す。表１〜６の［配列番号：
２］のｐｈｅＳ（アルファ）は、バチルス・スブチリス
由来のフェニルアラニルｔＲＮＡシンセターゼアルファ
サブユニットポリペプチドに対して、その全長にわたり
約６２％の同一性および約７６％の類似性を有する。

【００２６】本発明の配列はまた、表１〜６の[配列番
号：１]のコーディング配列に全長にわたり同一であっ
てもよい。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれ
らのフラグメントのコーディング配列、ならびに単独で
その他のコーディング配列を有する読み枠の成熟ポリペ
プチドまたはフラグメントのコーディング配列、例えば
リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配
列をコードするコーディング配列をも提供する。ポリヌ
クレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シ
グナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻
訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ
ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コ
ーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するの
ではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のある好ま
しい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（キアゲン・インコーポレーティッド）に提供されるよ
うなヘキサ−ヒスチジンペプチド（Gentzら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載される）
またはＨＡタグ（Wilsonら、Cell，37:767（1984））で
ある。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子お
よび遺伝子発現を調節する天然の配列をも含むが、これ
らに限定するものではない。

【００２７】本発明の好ましい具体例は表１〜６の配列
番号：１に示すヌクレオチド１から１０４４までを含む
ポリヌクレオチドであり、それはｐｈｅＳ（アルファ）
ポリペプチドをコードしている。

【００２８】また本発明は、表４および５の（Ｃ）に示
す式で表されるポリペプチドを包含し、式中、分子の
５’末端においてＸは水素であり、３’末端においてＹ
は水素または金属であり、Ｒ₁およびＲ₂はいずれかのア
ミノ酸残基であり、ｎは１ないし１０００、２０００ま
たは３０００の整数である。Ｒ基により示されるアミノ
酸残基の鎖はヘテロポリマーであってもホモポリマーで
あってもよく、好ましくはヘテロポリマーであり、Ｒは
１よりも大である。

【００２９】本明細書で用いる「ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド」なる用語は、本発明のポリペプ
チド、とりわけ表１〜６の[配列番号：２]に示すアミノ
酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはストレプトコ
ッカス・ニューモニアエのｐｈｅＳ（アルファ）をコー
ドする配列を含有するポリヌクレオチド包含する。この
用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリペプチドを
コードする単一の連続領域または不連続領域（例えば組
み込まれたファージもしくは挿入配列または削除により
分断される）、さらにはコーディングおよび／または非
コーディング配列をも含有し得るポリヌクレオチドをも
包含する。

【００３０】本発明はさらに、表１〜６の[配列番号：
２]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種を
コードする、本明細書上述のポリヌクレオチドの変種に
関する。本発明の特に好ましい態様は、表１〜６の[配
列番号：２]に示すｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチド
のアミノ酸配列に幾つか、少しの、５〜１０、１〜６、
１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠損
または付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を
有するｐｈｅＳ（アルファ）変種をコードするポリヌク
レオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、ｐｈ
ｅＳ（アルファ）の特性および活性を変化しないサイレ
ント置換、付加および欠損である。

【００３１】本発明のさらに好ましい態様は、表１〜６
の[配列番号：２]に示すアミノ酸配列を有するｐｈｅＳ
（アルファ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、およびこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチドに対し、全長で少なくとも７０％同一であ
るポリヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポ
リヌクレオチドは、寄託株をコードするポリヌクレオチ
ド、およびそれらに相補的なポリヌクレオチドに対し、
全長で少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌク
レオチドである。この点に関して、全長で少なくとも９
０％同一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、
中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好
ましい。さらに少なくとも９５％の同一性を有するもの
の中でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中
でも少なくとも９８％および少なくとも９９％であるの
が特に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがよ
り好ましい。この点に関するとりわけ好ましい態様は、
さらに、表１〜６の[配列番号：１]のＤＮＡにコードさ
れる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能ま
たは活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドである。

【００３２】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ7.6）、５ｘデンハーツ溶液、１
０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変成
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中フィルターを洗浄するものである。ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambro
okら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第２章に実例が示されており、
その開示は本明細書において参考として全てを引用す
る。

【００３３】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列の
完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番
号：１に示す該ポリヌクレオチド配列の配列を有するプ
ローブでスクリーニングし、該ＤＮＡ配列を単離するこ
とにより得られるポリヌクレオチド配列を本質的に含む
ポリヌクレオチドをも提供する。このようなポリヌクレ
オチドを得るために有用なフラグメントには、例えば本
明細書の別の箇所に記載するプローブおよびプライマー
等がある。

【００３４】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ｐｈｅＳ（アルファ）をコードするｃＤ
ＮＡ全長およびゲノムクローンを単離するため、および
ｐｈｅＳ（アルファ）遺伝子に高度な配列類似性を有す
るその他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単
離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの
ハイブリダイゼーションプローブとして使用することが
できる。このようなプローブは通常少なくとも１５塩基
を含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３
０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有していてもよ
い。とりわけ好ましいプローブは少なくとも３０塩基を
有し、５０塩基以下である。例えばｐｈｅＳ（アルフ
ァ）遺伝子のコーディング領域は、配列番号：１に示す
既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを
合成し、スクリーニングすることにより単離できる。次
いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標
識化オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡま
たはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用い、
プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバー
を決定する。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、疾患とりわけヒトの疾患の処置法および診断法
の発見のために研究物質および材料として使用でき、と
りわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書で
さらに論じる。配列番号：１および／または２の配列由
来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチド
を本明細書記載の方法に使用してもよいが、好ましくは
ＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌクレオチ
ドが全てまたは一部が感染した組織に転写されるかどう
かを決定する。このような配列が、病因が達成した感染
のステージおよび感染の型の診断にも有用であることが
理解される。

【００３６】また本発明は、付加アミノ酸もしくはカル
ボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに内在す
るアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコー
ドできるポリペプチドも提供する（例えば成熟形態が一
つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このような配
列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッシングに
役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減期を延
長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイもしくは製
造のための蛋白の操作を容易にすることができる。一般
的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性酵素によ
りプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除かれる。１
またはそれ以上のプロ配列と融合したポリペプチドの成
熟形態を有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不活性形態
にできる。プロ配列が除去されると、このような不活性
前駆体が通常活性化される。プロ配列のいくつかまたは
全てを活性化の前に除去できる。通常、このような前駆
体はプロ蛋白と称される。要するに、本発明のポリヌク
レオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟蛋白
（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白のリーダ
ー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する成
熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１またはそ
れ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレ
プロ蛋白をコードでき、プロ配列は通常ポリペプチドの
活性および成熟形態を産み出すプロセッシング段階で除
去される。

【００３７】ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作する宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。無細胞翻訳系もまた、本発
明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いて、このよう
な蛋白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主
細胞は、遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことが
できる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例え
ば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology（1
986）；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory
Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実
験マニュアルに記載される方法により行うことができ、
例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス
ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック
導入および感染等がある。

【００３８】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セスおよび枯草菌（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞
例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillu
s）細胞；昆虫細胞例えばドロソフィラＳ２（Drosophil
aS2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細
胞；動物細胞例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色
腫細胞；ならびに植物細胞等がある。

【００３９】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入物
由来、酵母染色体要素由来、例えばバキュロウイルス、
パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシナウイルス、
アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスお
よびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、なら
びにそれらを組み合わせた物に由来するベクター、例え
ばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝学的エレメ
ント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミ
ド等がある。発現系の構築物には発現を制御および引き
起こす調節領域を含有できる。通常宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを、この点に関する発現に使用できる。周知のお
よび通常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配
列を発現系に挿入でき、例えばSambrookら、Molecular
Cloning，A Laboratory Manual（上述）に記載されてい
る。

【００４０】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、適当な
分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むことが
できる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的なも
のであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよい。

【００４１】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレク
チンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマトグ
ラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いるのが最も好ま
しい。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性
した場合、再び活性な立体配座にするために、蛋白再生
のための周知の技法を用いることができる。

【００４２】診断アッセイ本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のｐ
ｈｅＳ（アルファ）ポリヌクレオチドの使用にも関す
る。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｐｈ
ｅＳ（アルファ）の検出は、疾患の診断のための診断法
を提供する。真核生物（本明細書において「個体」とも
称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトがｐｈｅＳ（アル
ファ）遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法によ
りＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は、感染し
た個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨
および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接
的に検出するのに使用できるか、または分析の前にＰＣ
Ｒもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に
増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用
いることができる。増幅法を用いると、真核生物とりわ
け哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を、原核生
物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることがで
きる。対照配列の遺伝子型に比較した増幅産物の大きさ
の変化により、欠損および挿入を検出できる。点突然変
異は、増幅ＤＮＡを標識化ｐｈｅＳ（アルファ）ポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズすることにより同定で
きる。完全に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、ま
たは融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別で
きる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性物質を伴うまたは伴
わないゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の可動性
の変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡの
配列決定により検出できる。例えばMeyersら、Scienc
e，230:1242（1985）参照。特異的な位置での配列の変
化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ例えばＲＮアーゼ
およびＳ１保護または化学的切断法によっても明らかに
することができる。例えばCottonら、Proc.Natl.Acad.S
ci.,USA，85:4397-4401（1985）参照。

【００４３】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担う細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出できる。例え
ば、ＲＴＰＣＲは突然変異を検出するために用いること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもまた同じ目的で、ＰＣＲまたはＲＴＰ
ＣＲに用いることができる。例を挙げると、ｐｈｅＳ
（アルファ）をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライ
マーは、突然変異を同定および分析するのに用いること
ができる。典型的なプライマーの例を下表７に示す。

【００４４】

【表７】

【００４５】これらのプライマーは個体に由来するサン
プルから単離したｐｈｅＳ（アルファ）ＤＮＡを増幅す
るのに用いることができる。本発明はまた５'および／
または３'末端から１、２、３または４ヌクレオチド除
去したプライマーをも提供する。該プライマーは感染し
た個体から単離した遺伝子を増幅するために用いること
ができ、該遺伝子は次いでＤＮＡ配列を調べるための種
々の技法に供することができる。このように、ＤＮＡ配
列における突然変異を検出し、感染の診断および感染性
物質のセロタイピングまたは分類に使用することができ
る。

【００４６】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはストレプトコッカス・ニューモニ
アエによる感染、および最も好ましくは中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、副鼻腔炎、膿胸および心内
膜炎、最も詳細には髄膜炎（例えば、脳脊髄液の感染）
等の疾患の診断方法を提供し、表１〜６の[配列番号：
１]の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上
昇を、個体由来のサンプルから決定することを含む。ｐ
ｈｅＳ（アルファ）ポリヌクレオチドの発現の増加また
は低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で
周知の方法の任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰ
ＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび
その他のハイブリダイゼーション法を用いて測定でき
る。

【００４７】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
た、ｐｈｅＳ（アルファ）蛋白の過剰発現を検出するた
めの本発明診断アッセイは、例えば感染の存在を検出す
るために用いることができる。宿主由来のサンプル中の
ｐｈｅＳ（アルファ）蛋白のレベルを決定するために用
いることができるアッセイ技法は、当業者に周知であ
る。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセ
イ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および
ＥＬＩＳＡアッセイ等がある。

【００４８】抗体本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫
特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルお
よびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体
およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現
ライブラリーの産物等のＦａｂフラグメント等がある。
本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプ
チドまたはエピトープが付いたフラグメント、アナログ
または細胞を、好ましくはヒトはでない動物に、通常の
実験法を用いて投与することにより得ることができる。
連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する、当
業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を調製す
ることができる。実例としては、Kohler，G.およびMils
tein,C.，Nature，256:495-497（1975）；Kozborら、Im
munology Today，4:72（1983）；Coleら、Monoclonal A
ntibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.、77-
96頁（1985）に記載されるような種々の技法がある。一
本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４
９４６７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する一
本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジ
ェニックマウスまたはその他の生物例えばその他の哺乳
動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いること
ができる。

【００４９】別法としてファージディスプレイ技法を、
抗Ｆｂｐを有することにつきスクリーニングしたヒトの
リンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリーか
ら、または元来のライブラリーからのポリペプチドに対
する結合活性を有する抗体遺伝子を選別するために利用
できる。（McCafferty,J.ら、Nature 348:552-554（199
0）；Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783（199
2））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング
（chain shuffling）により改善することもできる（Cla
ckson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。

【００５０】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。

【００５１】上述の抗体はポリペプチドを発現するクロ
ーンを単離または同定するために用いることができ、親
和性クロマトグラフィーにより精製することができる。
従って、とりわけｐｈｅＳ（アルファ）に対する抗体
を、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結膜炎、肺
炎、菌血症、髄膜炎、副鼻腔炎、膿胸および心内膜炎、
最も詳細には髄膜炎（例えば、脳脊髄液の感染）等の疾
患の処置に用いることができる。

【００５２】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
にまで高められた場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用で干渉する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物における抗体を上昇させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。

【００５３】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫化
するための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプ
チドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合するこ
とにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモ
シアニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結
合することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリ
ペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等
価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。

【００５４】抗体またはそれらの変種を、個体における
免疫原性を減じるために修飾するのが好ましい。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒ
ト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来の抗
体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植さ
れており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525（19
86）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273（199
1）に記載されている。本発明のポリヌクレオチドを遺
伝学的免疫化において使用する場合、例えば直接的なプ
ラスミドＤＮＡの筋肉への注射（Wolffら、Hum.Mol.Gen
et.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとのＤＮＡ複合体の
送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リン
酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、P
NAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム中へ
のＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。

【００５５】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子本発明のポリペプチドはまた、例えば細胞、無細胞調製
物、化学的ライブラリー、および天然の産生物の混合物
中の、小さな分子の基質およびリガンドの結合を評価す
るために用いることもできる。これらの基質およびリガ
ンドは天然の基質およびリガンドでよく、または構造的
もしくは機能的な擬似物質でもよい。例えばColigan
ら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章（19
91）参照。

【００５６】本発明はまたｐｈｅＳ（アルファ）ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニス
ト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物を同定す
るための、化合物のスクリーニング方法をも提供する。
例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニ
ングするために、ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドを
含む、合成反応混合物、細胞コンパートメント、例えば
膜、細胞表面膜もしくは細胞壁、またはそれらのいずれ
かの調製物、およびこのようなポリペプチドの標識化基
質またはリガンドを、ｐｈｅＳ（アルファ）アゴニスト
またはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下また
は不在下で、インキュベーションする。候補分子がｐｈ
ｅＳ（アルファ）ポリペプチドにアゴナイズまたは拮抗
する能力は、標識化リガンドの結合の低下またはこのよ
うな基質からの産生物の産生の低下に反映される。結合
しても影響を及ぼさない分子、すなわちｐｈｅＳ（アル
ファ）の効果を誘起しない分子は、最も良好なアンタゴ
ニストとなるであろう。結合性が良好で、基質からの生
成物の生成速度を高める分子はアゴニストである。基質
からの生成物の生成速度またはレベルはリポーターシス
テムを用いることにより増強できる。この点に関して有
用なリポーターシステムには、産生物に転換される比色
標識化基質、ｐｈｅＳ（アルファ）活性の変化に反応す
るリポーター遺伝子、および当該分野で周知の結合アッ
セイ等があるが、これらに限定するものではない。

【００５７】ｐｈｅＳ（アルファ）アンタゴニストのア
ッセイの他の例は競争アッセイであり、競争阻害アッセ
イに適した条件下で、ｐｈｅＳ（アルファ）および潜在
的なアンタゴニストをｐｈｅＳ（アルファ）結合分子、
組換えｐｈｅＳ（アルファ）結合分子、天然基質もしく
はリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と混
合する。ｐｈｅＳ（アルファ）を例えば放射活性または
比色化合物により標識化し、結合分子に結合した、また
は産生物に変換したｐｈｅＳ（アルファ）分子の数を正
確に決定し、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。潜在的なアンタゴニストには、本発明のポリペプチ
ドに結合し、それによりその活性を阻害し、消滅させる
小さい有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体な
どがある。潜在的アンタゴニストはまた、結合分子の同
一部位に結合する、正確に関連した蛋白または抗体のよ
うな小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば
ｐｈｅＳ（アルファ）誘起活性を誘起しない結合分子で
あってよく、それによりｐｈｅＳ（アルファ）を結合か
ら排除して、ｐｈｅＳ（アルファ）の作用を妨げる。潜
在的なアンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に
結合し、およびそれを占領し、それにより細胞性結合分
子への結合を防御して、正常の生物学的活性を防御する
小さな分子等がある。小さな分子の例としては、小さな
有機分子、ペプチド、ペプチド様分子等があるが、これ
らに限定するものではない。その他の潜在的なアンタゴ
ニストにはアンチセンス分子等がある（これらの分子に
ついての記載に関してはOkano,J.，Neurochem.56:560
（1991）；Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhi
bitors of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラ
ートン、フロリダ州（1988）参照）。好ましい潜在的ア
ンタゴニストには、ｐｈｅＳ（アルファ）関連化合物お
よびｐｈｅＳ（アルファ）変種等がある。本明細書に示
す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化合物の発見および開発に使
用してもよい。コードされている蛋白は、発現される
と、抗細菌剤のスクリーニングのための標的として使用
されうる。さらに、コードされている蛋白のアミノ末端
領域または各ｍＲＮＡのシャイン−ダルガノ配列または
他の翻訳容易化配列をコードしているＤＮＡ配列を用い
てアンチセンス配列を構築し、目的コーディング配列の
発現を制御することもできる。

【００５８】また本発明は、感染の続発症に関与する病
因および哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害
するための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまた
は阻害物質の使用を提供する。とりわけ本発明の分子
を、細菌とりわけグラム陽性細菌の内在デバイス上の哺
乳動物細胞外マトリックス蛋白、または創傷の細胞外マ
トリックス蛋白への付着の防御；例えば哺乳動物チロシ
ンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入
を媒介するｐｈｅＳ（アルファ）蛋白の阻害（Rosenshi
neら、Infect.Immun.60:2211（1992））；哺乳動物細胞
外マトリックス蛋白および組織損傷を媒介する細菌性ｐ
ｈｅＳ（アルファ）蛋白間の細菌付着の阻害；内在デバ
イスの埋め込みまたはその他の外科的手技により開始し
た感染における病因の通常の進行の防御に使用すること
ができる。

【００５９】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、
副鼻腔炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には髄膜炎
（例えば、脳脊髄液の感染）等の抑制および処置に用い
てもよい。ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyl
ori）細菌（本明細書ではエイチ・ピロリという）は世
界人口の３分の１以上のヒトの胃に感染しており、胃ガ
ン、潰瘍および胃炎を引き起こす（International Agen
cy for Research on Cancer,Lyon,France;http://www.u
icc.ch/ecp/ccp2904.htm）。そのうえ、最近、Internat
ional Agency for Research on Cancerは、エイチ・ピ
ロリと胃のアデノカルシノーマとの因果関係を認識し、
当該細菌をＩ群の癌原性細菌と分類定義した。本発明に
より提供されるスクリーニングを用いて見いだされる本
発明の好ましい抗菌化合物（ｐｈｅＳ（アルファ）のア
ゴニストおよびアンタゴニスト）、詳細には広スペクト
ル抗生物質は、エイチ・ピロリ感染に処置に有用なはず
である。かかる処置は、エイチ・ピロリにより誘導され
る癌の出現、例えば胃腸のカルシノーマの出現を減少さ
せるはずである。また、かかる処置は胃潰瘍および胃炎
を治癒するはずである。

【００６０】ワクチン本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘起する方法に関し、その方法には個体に
ｐｈｅＳ（アルファ）、またはそれらのフラグメントも
しくは変種を個体に接種し、該個体が感染とりわけ細菌
感染、特にストレプトコッカス・ニューモニアエ感染か
ら防御する抗体および／またはＴ細胞を十分に産生させ
ることを含む。さらに、免疫学的応答により細菌複製を
遅らせる方法も提供される。本発明のまた別の態様は、
個体中に疾病がすでに確立されているか否かにかかわら
ず、ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドまたはそのフラ
グメントもしくは変種を発現させるための核酸ベクター
を送達して、インビボでｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプ
チドまたはそれらのフラグメントもしくは変種を発現さ
せて、該動物を疾患から保護する抗体および／またはＴ
細胞免疫応答を生じさせる免疫学的反応を誘起するこ
と、例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ
細胞の応答を生じさせる免疫学的反応を誘起することを
特徴とする、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する
方法に関する。遺伝子投与の１の方法は、微粒子上のコ
ーティングとなった遺伝子を加速して所望細胞中に導入
すること、あるいは他の方法による。かかる核酸ベクタ
ーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮ
Ａハイブリッドを含んでいてもよい。

【００６１】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、ｐｈｅＳ（アルファ）またはコードされている蛋白
に対する免疫学的反応を該宿主に誘起する免疫学的組成
物に関し、その組成物は組換えｐｈｅＳ（アルファ）ま
たはコードされている蛋白を含み、該ｐｈｅＳ（アルフ
ァ）の抗原をコードし発現するＤＮＡ、またはそれによ
りコードされる蛋白を含む。免疫学的応答を治療的また
は予防的用いてもよく、免疫学的応答は抗体免疫または
細胞免疫（例えば、ＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生
じるもの）の形態であってもよい。

【００６２】ｐｈｅＳ（アルファ）またはそれらのフラ
グメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋
白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋
白を産生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合
できる。このように融合した組換え蛋白には、さらに抗
原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ（He
mophilus influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーター
ガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化し
て、それらの産生および精製を促進する比較的大きな共
存蛋白等が含まれるのがより好ましい。さらに、共存蛋
白は免疫系において普遍的な刺激を提供するという意味
で、アジュバントとして作用することができる。共存蛋
白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシル末端のどち
らかに付着できる。

【００６３】本発明は、組成物、とりわけワクチン組成
物、および本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドおよび免疫刺激ＤＮＡ配列を含む方法を提供し、Sato
Y.ら、Science 273:352(1969)に記載されている。

【００６４】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエに感染した動物モデルにおける、このよう
な遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌細胞
表面蛋白の非可変領域をコードすることが示されてい
る、記載したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらの
フラグメントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ
予防的または治療的免疫反応を生じることができる蛋白
エピトープを同定するのに有用である。この研究は、哺
乳動物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフ
ィロコッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療
的処置の開発のために、感染に抵抗し一掃するのに成功
した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗
体を引き続き調製することを可能にすると思われる。

【００６５】ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織へ
の付着を阻害することにより、細菌の侵入に対して保護
する特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のた
めの抗原として使用することができる。組織損傷の例と
しては、例えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、
または内在デバイスの埋め込みにより、引き起こされた
皮膚または結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳
腺、尿道または膣の創傷等がある。

【００６６】本発明にはまた免疫原性組換え蛋白を適切
な担体と共に含むワクチン処方を包含する。蛋白は胃で
分解するので、非経口的例えば皮下、筋肉内、静脈内ま
たは皮膚内等に投与するのが好ましい。非経口投与に適
した処方には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および処方を
個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含有し
ていてもよい、水性または非水性無菌注射液；および懸
濁化剤または増粘剤を含有していてもよい、水性または
非水性無菌懸濁液等がある。処方は単位投与または多回
投与用容器、例えばシールしたアンプルおよびバイアル
に入れてよく、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に無菌
液体担体の添加のみを必要とする。ワクチン処方は処方
の免疫原性を高めるアジュバント系をも含有でき、例え
ば水中油系または当該分野で周知のその他の系等があ
る。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実
験法により容易に決定できる。本発明は特定のｐｈｅＳ
（アルファ）蛋白に関して記載したが、これは天然に存
在する蛋白および、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に
影響しない付加、欠失または置換を施した類似の蛋白の
フラグメントを包含することが理解されよう。

【００６７】組成物、キットおよび投与本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明のポリペプチドは非無
菌もしくは無菌担体と、または細胞、組織もしくは生物
に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬的
担体と組み合わせて用いることができる。このような組
成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明
ポリペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦
形剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ールおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適したものにすべ
きである。本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分
を１またはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器
を含んでなる診断用および医薬用パックおよびキットに
も関する。

【００６８】本発明のポリペプチドおよびその他の化合
物は、単独でまたは治療用化合物等のその他の化合物と
組み合わせて用いることができる。医薬組成物は任意の
有効な、利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、
経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、また
は皮膚内の経路で投与できる。治療において、または予
防として、活性物質を注射用組成物として、例えば、好
ましくは等張の、無菌水性分散物として個体に投与でき
る。あるいはまた、組成物は局所適用用、例えば軟膏、
クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、洗口
剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびにエア
ロゾール等の形態に処方でき、適当な慣用的な添加物、
例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟
膏およびクリームには軟化剤を含有してよい。このよう
な局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例えばク
リームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタノー
ルまたはオレイルアルコールを含有してよい。このよう
な担体は重量で処方の約１％から約９８％でよく、より
通常には重量で処方の約８０％までにする。哺乳動物と
りわけヒトに投与するために、活性物質の1日あたりの
投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであ
り、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。医者はあらゆる
場合、個体に最も適した実際の投与量を決定し、年齢、
体重および特に個体の反応性に応じて変化させる。上述
の投与量は、平均的なケースの典型例である。もちろ
ん、高量および低量の範囲が適合する個々の例もあり、
これらは本発明の範囲内である。

【００６９】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するデバイスである。
このようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペ
ースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液
シャント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（co
ntinuous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰ
Ｄ）カテーテル等がある。本発明の組成物を注射により
投与し、内在デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に
対する全身的な効果を得ることができる。手術後、デバ
イスが体内に在る時間中、処置を続けてよい。さらに、
任意の外科的手技の手術中に広げるカバーに用いて、細
菌性創傷感染、とりわけストレプトコッカス・ニューモ
ニアエの創傷感染を防御するために用いることができ
る。

【００７０】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトは、菌血症を生み出し得る歯科的処置の前に、抗生
物質予防法を考慮されるべきであると考える。遅延性の
重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合併
症であり、有意性のある羅病率および死亡率を伴う。従
って、この場合、予防的な抗生物質の代わりに、活性物
質の用途を拡張することが可能である。

【００７１】上述の治療に加え、本発明の組成物は一般
的に創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露した
マトリックス蛋白に細菌が付着するのを防ぎ、歯科治療
において抗生物質の予防法に代わって、またはそれと組
み合わせて、予防的に使用できる。

【００７２】あるいはまた、本発明の組成物は挿入直前
に、内在デバイスを浸すために使用できる。活性物質は
創傷または内在デバイスを浸すために１μｇ／ｍｌから
１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組
成物は便宜的に注射可能な形態にする。便宜的なアジュ
バントは免疫反応を高めるために用いることができる。
ワクチン化に適した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ
／ｋｇであり、このような投与量は１〜３週間隔で１〜
３回投与するのが好ましい。提示した投与量範囲では、
本発明の化合物で、適切な個体への投与を妨げるよう
な、不利な毒性効果は観察されない。本明細書に開示の
各文献を、参照により本明細書に記載されているものと
みなす。

【００７３】

【実施例】以下の実施例は、詳細に記載したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドはイー・コリにおけるストレプトコッカス・ニューモ
ニアエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入
手した。重複するストレプトコッカス・ニューモニアエ
のＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンから
の配列決定データを、配列番号：１の隣接ＤＮＡ配列を
構築するために使用した場合もある。ライブラリーは通
常の方法、例えば以下の方法１および２により製造でき
る。全細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニ
アエ０１００９９３より、標準法に準じて単離し、二つ
の方法のどちらかによりサイズ分画する。

【００７４】方法１標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
をニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまで
の大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよび
ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、次
いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を感染さ
せる。ライブラリーは標準法により増幅する。方法２全細胞性ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒ
ｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にク
ローニングするための一連のフラグメントを適切に生じ
る制限酵素一つでまたはこれを組み合わせたもので部分
的加水分解し、このようなフラグメントを標準法に準じ
てサイズ分画化する。ＥｃｏＲＩリンカーはＤＮＡおよ
びフラグメントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断した
ベクターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライ
ブラリーをパッケージングし、およびパッケージングし
たライブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを
標準法により増幅する。

【００７５】実施例２：ｐｈｅＳ（アルファ）の特徴付
け酵素により媒介される放射性標識アミノ酸のｔＲＮＡ中
への取り込みをアミノアシル化法により測定することが
でき、該方法は、ｔＲＮＡおよびＡＴＰ存在下で放射性
標識アミノ酸からトリクロロ酢酸沈殿した放射活性とし
てアミノ酸−ｔＲＮＡを測定するものである（Hughes
J.,Mellows G.and Soughton S,1980,FEBSLetters,122:3
22-324）。かくして、対照に対するトリクロロ酢酸沈殿
放射活性の減少によりフェニルアラニルｔＲＮＡシンセ
ターゼの阻害剤を検出することができる。別法として、
ｔＲＮＡシンセターゼにより触媒される部分ＰＰｉ／Ａ
ＴＰ交換反応（ＰＰｉからの放射性標識ＡＴＰの生成を
測定）を用いてフェニルアラニルｔＲＮＡシンセターゼ
阻害剤を検出することもできる（Calender R & Berg P,
1966,Biochemistry,5,1681-1690）。

【００７６】

【配列表】

【００７７】（１）一般的情報：（ｉ）出願人：ジャノウスキ，デボラローラー・エリザベスワン・ミン（ｉｉ）発明の名称：新規ｐｈｅＳ（アルファ）（ｉｉｉ）配列の数：４（ｖｉ）連絡先：（Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション（Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番（Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア（Ｄ）州名：ペンシルベニア（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体タイプ：ディスケット（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル（Ｃ）作動システム：ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：Windowsバージョン２.０用FastSE
Q （ｖｉ）本願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：１９９７年１０月１７日（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：（Ａ）氏名：ジミ，エドワード・アール（Ｂ）登録番号：３８８９１（Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ３１４５７−６／
１（ｘｉ）テレコミュニケーションの情報：（Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８（Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０（Ｃ）テレックス：

【００７８】（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０４７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGTCAACTA TTGAAGAACA ATTAAAAGCG CTTCGCGAAG AAACGCTGAC TAGCTTGAAG 60 CAGATTACTG CTGGAAATGA AAAAGAGATG CAAGATTTGC GTGTCTCTGT CCTTGGTAAA 120 AAGGGTTCGC TTACTGAAAT CCTCAAAGGG ATGAAAGATG TTTCTGCTGA GATGCGTCCA 180 ATCATCGGGA AACACGTCAA TGAAGCTCGT GATGTCTTGA CAGCTGCTTT TGAAGAAACA 240 GCTAAGCTCT TGGAAGAAAA GAAAGTCGCG GCTCAACTGG CTAGCGAGAG TATCGATGTG 300 ACGCTTCCAG GTCGTCCAGT TGCGACTGGT CACCGTCACG TTTTGACACA AACCAGTGAA 360 GAAATCGAAG ATATCTTCAT CGGTATGGGT TATCAAGTCG TGGATGGTTT TGAAGTGGAG 420 CAAGACTACT ATAACTTTGA ACGTATGAAC CTTCCAAAAG ACCACCCAGC TCGTGATATG 480 CAGGATACTT TCTATATCAC TGAAGAAATC TTGCTCCGTA CCCACACGTC TCCAGTTCAG 540 GCACGTGCTA TGGATGCCCA TGATTTTTCT AAAGGTCCTT TGAAGATAAT CTCGCCAGGG 600 CGTGTCTTCC GTCGCGATAC GGACGATGCG ACCCACAGTC ACCAATTCCA CCAAATCGAA 660 GGCTTGGTAG TTGGGAAAAA TATCTCTATG GCTGATCTTC AAGGAACGCT TCAGTTGATT 720 GTCCAAAAAA TGTTTGGTGA AGAGCGTCAA ATTCGTTTGC GTCCATCTTA CTTCCCATTC 780 ACAGAGCCAT CTGTTGAGGT GGATGTTTCT TGCTTCAAAT GTGGTGGAGA AGGCTGTAAC 840 GTATGTAAGA AAACAGGTTG GATCGAAATT ATGGGGGCCG GTATGGTTCA CCCACGTGTC 900 CTTGAAATGA GTGGTATCGA TGCGACTGTA TACTCTGGCT TTGCCTTTGG TCTTGGACAA 960 GAGCGTGTAG CTATGCTCCG TTATGGAATC AACGATATCC GTGGATTCTA CCAAGGAGAT 1020 GTCCGCTTCT CAGAACAGTT TAAATAA 1047

【００７９】（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３４８アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Ser Thr Ile Glu Glu Gln Leu Lys Ala Leu Arg Glu Glu Thr Leu 1 5 10 15 Thr Ser Leu Lys Gln Ile Thr Ala Gly Asn Glu Lys Glu Met Gln Asp 20 25 30 Leu Arg Val Ser Val Leu Gly Lys Lys Gly Ser Leu Thr Glu Ile Leu 35 40 45 Lys Gly Met Lys Asp Val Ser Ala Glu Met Arg Pro Ile Ile Gly Lys 50 55 60 His Val Asn Glu Ala Arg Asp Val Leu Thr Ala Ala Phe Glu Glu Thr 65 70 75 80 Ala Lys Leu Leu Glu Glu Lys Lys Val Ala Ala Gln Leu Ala Ser Glu 85 90 95 Ser Ile Asp Val Thr Leu Pro Gly Arg Pro Val Ala Thr Gly His Arg 100 105 110 His Val Leu Thr Gln Thr Ser Glu Glu Ile Glu Asp Ile Phe Ile Gly 115 120 125 Met Gly Tyr Gln Val Val Asp Gly Phe Glu Val Glu Gln Asp Tyr Tyr 130 135 140 Asn Phe Glu Arg Met Asn Leu Pro Lys Asp His Pro Ala Arg Asp Met 145 150 155 160 Gln Asp Thr Phe Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Leu Leu Arg Thr His Thr 165 170 175 Ser Pro Val Gln Ala Arg Ala Met Asp Ala His Asp Phe Ser Lys Gly 180 185 190 Pro Leu Lys Ile Ile Ser Pro Gly Arg Val Phe Arg Arg Asp Thr Asp 195 200 205 Asp Ala Thr His Ser His Gln Phe His Gln Ile Glu Gly Leu Val Val 210 215 220 Gly Lys Asn Ile Ser Met Ala Asp Leu Gln Gly Thr Leu Gln Leu Ile 225 230 235 240 Val Gln Lys Met Phe Gly Glu Glu Arg Gln Ile Arg Leu Arg Pro Ser 245 250 255 Tyr Phe Pro Phe Thr Glu Pro Ser Val Glu Val Asp Val Ser Cys Phe 260 265 270 Lys Cys Gly Gly Glu Gly Cys Asn Val Cys Lys Lys Thr Gly Trp Ile 275 280 285 Glu Ile Met Gly Ala Gly Met Val His Pro Arg Val Leu Glu Met Ser 290 295 300 Gly Ile Asp Ala Thr Val Tyr Ser Gly Phe Ala Phe Gly Leu Gly Gln 305 310 315 320 Glu Arg Val Ala Met Leu Arg Tyr Gly Ile Asn Asp Ile Arg Gly Phe 325 330 335 Tyr Gln Gly Asp Val Arg Phe Ser Glu Gln Phe Lys 340 345

【００８０】（２）配列番号：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： ATGTCAACTA TTGAAGAACA ATTA 24

【００８１】（２）配列番号：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： TTATTTAAAC TGTTCTGAGA AGCG 24

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/00 9/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ０７Ｋ 14/315 // Ｃ０７Ｋ 14/315 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＥＤ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:46） (72)発明者エリザベス・ジェーン・ローラーアメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マルバーン、ラップ・ロード260番 (72)発明者ミン・ウォンアメリカ合衆国19422ペンシルベニア州ブルー・ベル、センテンニアル・ドライブ 302番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号：２のアミノ酸を含む
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対し
て少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド；（ｂ）寄託株のストレプトコッカス・ニューモニアエ
（Streptococcus pneumoniae）中に含まれるｐｈｅＳ
（アルファ）遺伝子により発現されるのと同じ成熟ポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少
なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくと
も７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドコ
ードしているポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドに対して相補的であるポリヌクレオチド；（ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドの少なくとも１５個の一連の塩基を含むポリヌクレオ
チドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含
む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求
項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】配列番号：１に示す核酸配列を含む、請
求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号：１に示すヌクレオチド１から
１０４４を含む、請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードする、請求項２記載のポリヌクレオチ
ド。
【請求項７】請求項１記載のポリヌクレオチドを含む
ベクター。
【請求項８】請求項７記載のベクターを含む宿主細
胞。
【請求項９】該ＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドを請求項８記載の宿主細胞から発現させることを特徴
とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】該ポリペプチドまたはフラグメントの
生成に十分な条件下で請求項８記載の宿主を培養するこ
とを特徴とする、ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドま
たはフラグメントの製造方法。
【請求項１１】配列番号：２のアミノ酸配列に対して
少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチド。
【請求項１２】配列番号：２に示すアミノ酸を含むポ
リペプチド。
【請求項１３】請求項１１記載のポリペプチドに対す
る抗体。
【請求項１４】請求項１１記載のポリペプチドの活性
または発現を阻害するアンタゴニスト。
【請求項１５】治療上有効量の請求項１１記載のポリ
ペプチドの個体への投与を特徴とする、ｐｈｅＳ（アル
ファ）ポリペプチドを必要とする個体の処置方法。
【請求項１６】治療上有効量の請求項１４記載のアン
タゴニストの個体への投与を特徴とする、ｐｈｅＳ（ア
ルファ）ポリペプチドの阻害を必要とする個体の処置方
法。
【請求項１７】個体における請求項１１記載のポリペ
プチドの発現または活性に関連する疾病の診断方法であ
って、（ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
すること；および／または（ｂ）個体由来の試料中の該ポリペプチドの存在または
量を分析すること；を特徴とする診断方法。
【請求項１８】請求項１１記載のポリペプチドと相互
作用し、活性を阻害または活性化する化合物の同定方法
であって；化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可
能にする条件下で、ポリペプチドをスクリーニングすべ
き化合物と接触させて化合物の相互作用を評価すること
（かかる相互作用は、ポリペプチドと化合物との相互作
用に応答した検出可能なシグナルを提供しうる第２の成
分に関連したものである）；次いで、化合物とポリペプ
チドとの相互作用から生じたシグナルの存在または不存
在を検出することにより、化合物がポリペプチドと相互
作用して、その活性を活性化または阻害するかどうかを
決定することを特徴とする方法。
【請求項１９】哺乳動物における免疫学的反応を誘起
する方法であって、該動物を疾患から防御する抗体およ
び／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分な請求項
１１記載のｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドまたはそ
のフラグメントもしくは変種を該哺乳動物に接種するこ
とを特徴とする方法。
【請求項２０】哺乳動物における免疫学的反応を誘起
する方法であって、請求項１１記載のｐｈｅＳ（アルフ
ァ）ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種
を発現させるための核酸ベクターを送達し、インビボで
ｐｈｅＳ（アルファ）ポリペプチドまたはそれらのフラ
グメントもしくは変種を発現させて、該動物を疾患から
保護する抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせ
る免疫学的反応を誘起することを特徴とする方法。