KR101905095B1 - 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(martxvc) 단백질에 교차 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(martxvc) 단백질에 교차 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비브리오 콜레라 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 교차 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비브리오 콜레라균에 대한 고친화도의 특이적 결합능력으로 높은 감수성, 특이성 및 민감도를 가지는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 비브리오 콜레라의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 단일클론항체 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물, 이를 이용한 비브리오 콜레라 진단용 키트, 이를 이용하여 비브리오 콜레라를 검출하는 방법 및 비브리오 콜레라 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVC) 단백질에 교차 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 {Cross-reactive Monoclonal Antibody Binding to Vibrio cholreae MARTXVc Protein and Its use}
본 발명은 비브리오 콜레라 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 교차 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비브리오 콜레라균에 대한 고친화도의 특이적 결합능력으로 높은 감수성, 특이성 및 민감도를 가지는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 비브리오 콜레라의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 단일클론항체 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물, 이를 이용한 비브리오 콜레라 진단용 키트, 이를 이용하여 비브리오 콜레라를 검출하는 방법 및 비브리오 콜레라 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
콜레라는 개발도상국 뿐만 아니라 전세계의 대부분의 지역에서 주요한 질병으로 대두 되고 있다. 콜레라균 감염으로 인하여, 매년 전세계적으로 8,300,000건의 심한 설사를 동반한 콜레라가 보고되고 있으며 120,000 사망자를 야기 시키고 있다 (Harris J.B., Larocque R.C., Qadri F., Ryan E.T., Calderwood S.B. (2012). Lancet 379: 2466-76). 특히 많은 개발도상국에서 비브리오 콜레라균과 비브리오 패혈증균와 같이 오염된 음식물이나 물을 통해서 전파되는 장염 및 패혈증을 야기시키는 감염균의 제어를 위한 효과적인 위생조치가 현실적으로 어려움이 많다. 따라서 개발도상국뿐만 아니라 이들 나라로의 여행자들을 위해서 비브리오 패혈증균과 비브리오 콜레라균에 대하 효과적인 예방 백신, 치료제 및 진단 방법이 절실히 요구되고 있다.
실제로 비브리오 콜레라균의 감염에 의해서 야기되는 콜레라의 일반적인 치료는 보존적 치료와 항생제 치료가 있지만, 일부 감염에는 중증 콜레라로 발전해서 비브리오 패혈증 감염과 유사하게 높은 치사율을 나타내는 폐혈증을 유발한다. 하지만, 비브리오 콜레라균에 야기되는 중증 질환을 효율적으로 예방하고 치료할 수 있는 백신용 단일클론항체는 미미한 수준이다. 특히 비브리오 콜레라균의 독성인자인 MARTXVc을 표적으로 하는 백신용 단일클론항체는 개발되지 않았다.
따라서, 비브리오 폐혈증균과 비브리오 콜레라균에 교차반응을 보이면서 비슷한 경로로 감염되는 두 병원성 미생물의 감염에 대해서 탁월한 효과는 보이는 백신용 단일클론항체 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 해결하려는 과제는 비브리오 패혈증균의 예방과 치료효과가 우수한 단일클론항체 중 비브리오 콜레라균의 MARTXVc에 대하여 고친화도의 특이적 결합능력으로 비브리오 콜레라균과 그에 관련된 감염에 의해서 유발되는 질병의 우수한 억제 효과를 갖는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물, 이를 이용한 비브리오 콜레라 진단용 키트, 비브리오 콜레라 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 이를 이용한 비브리오 콜레라균을 검출하는 방법을 제공하는 하는 것이다.
본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
발명의 용어 "항체"는 비브리오 콜레라균 MARTXVc 단백질에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함하는 의미이다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv로 이루어진 군 중 하나의 형태이거나 완전한 항체 형태이다.
상기 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
또한, 상기 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 용어 "단일클론항체"는 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 대량 생산이 용이하고 다른 면역글로블린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
본 발명의 단일클론항체는 당해 기술분야에서 공지된 세포융합방법에 의해 생성된 하이브리도마 세포로부터 얻을 수 있다. 일반적으로 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이러한 두 가지 세포의 융합은 당업계에서 공지되어 있는 폴리에틸렌클리콜(polyethyleneglycol)을 이용하는 방법을 통해 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 후, 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 세포 융합에 사용되는 골수종 세포로는 마우스 유래의 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63Ag8.653, V653, S194, 랫트 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서 사용된 세포주는 골수종 세포 P3x63Ag8.653이다.
본 발명의 단일클론항체는 항원과 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화 (neutralization)시키며, 나아가 병원체와 병원체에 감염된 세포를 죽일 수 있다. 예를 들어, 비브리오 콜레라균의 MARTXVc를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 이에 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화할 수 있고, 항원과 결합된 항체는 보체를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 보체에 의하여 항원이 제거되도록 할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 항원에 결합하여 그 항원이 식균세포에 의하여 더욱 잘 잡아먹히게 만들 수도 있다. 또한, 단일클론항체가 결합되어 있는 항원 세포는 자연살해세포(NK cell)에 의해 보다 쉽게 살해당함으로써, 상기 단일클론항체를 면역반응을 통한 항원과 이 항원을 생성하는 비브리오 콜레라균의 제거에 이용할 수 있다. 따라서, 항체 자체만으로 면역반응을 통한 항원 및 비브리오 콜레라균의 제거와 감소의 결과를 기대할 수 있어 본 발명의 항체는 비브리오 콜레라균의 진단 또는 치료에 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 비브리오 콜레라 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
상기 단일클론항체는 서열목록 9의 MARTXVc 단백질의 3386 내지 4545번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수있다.
본 발명은 또한 상기 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 콜레라 예방제 또는 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 이용한 비브리오 콜레라 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공 할 수 있고, 자세하게는 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편를 포함하는 비브리오 콜레라 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 콜레라 치료제를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 본 발명의 단일클론항체는 비브리오 콜레라균의 중화능력을 나타내므로 항체 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 비브리오 콜레라 감염에 대한 예방 및 치료 조성물로 사용가능하다.
상기 비브리오 콜레라 치료제는 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 콜레라 감염에 대한 예방 및 치료용 약제학적 조성물일 수 있으며, 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001 ~ 100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 비브리오 패혈증의 감염을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
항체는 항체-치료제 결합체 형태로 생체내로 투입하여 박테리아 감염 치료에 이용할 수 있다. 치료제는 화학 치료제, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질 등을 포함한다. 항생제를 항체에 결합시키는 방법은, 예를 들면 문헌 G. Gregoriadies, ed., Academic Press London, (1979); Arnon et al., Recent Results in Cancer Res.,75: 236(1980); 및 Moolton et al., Immunolog. Res.,62:47(1982))에 기재되어 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편과 커플링 시키기기에 바람직한 약품은 항세균, 구충, 항진균 및 관련 약제들이고, 예를 들면 설폰아미드, 페니실린 및 세팔로스포린, 아미노글리코시드, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 피페라진, 클로로퀸, 디아미노피라딘, 메트로니아지드, 이소니아지드, 리팜핀, 스트렙토마이신, 설폰, 에리트로마이신, 폴리믹신, 나이스타틴, 암포테리신, 5-플루오로사이토신, 5-요오드-2'-데옥시우리딘, 1-아다만타아민, 아데닌 아라비노사이드, 암만니틴, 리바바린 및 아지도티미딘(AZT)이며, 바람직하게는 리바바린이다. 약제를 특이적 표적 부위로 표적화하는데 적당하고 바람직한 여러 가지 조건은 예를 들어 문헌 Trouet et al., Plenum Press, New York and London, 19-30(1982)에 보고되었다. 유효한 치료제를 미생물 항원에 대해 제조된 매우 특이성이 있는 항체를 사용하여 감염 병소에 직접 타겟팅하여 감염균을 선택적으로 죽임으로써 약품에 내성이 있는 감염을 치료할 때에 발생하는 많은 문제점을 해결할 수 있다. 또한 병소로 타겟팅된 약품은 감염 부위에서는 높은 농도로 약효를 상승시킬 수 있다.
상기 항체-치료제 결합체에서 치료제로 이용될 수 있는 면역조절제는 림포카인 및 사이토카인를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 비브리오 콜레라균의 MARTXVc 활성에 중요한 시스테인 단백질 분해효소의 활성을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편를 포함하는 비브리오 콜레라 예방, 치료 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공할 수 있다.
수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편를 포함하는 비브리오 콜레라 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 효소면역분석(ELISA) 키트 또는 샌드위치 ELISA 키트일 수 있다.
본 발명은 또한 하기와 같은 단계를 포함하는 비브리오 콜레라 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
(i) MARTXVc에 특이적으로 결합하는 상기 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편를 비브리오 콜레라가 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 접촉시키는 단계;
(ii) 항원-항체 복합체 형성을 통해 상기 생물학적 시료에서의 상기 단일클론항체 또는 이의 항체결합단편에 결합된 MARTXVc 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(iii) 상기 (ii) 단계에서 측정된 MARTXVc 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하여 대조군에 비해 상기 단백질의 발현 수준이 높으면 비브리오 콜레라 환자로 판정하는 단계;
상기 비브리오 콜레라가 포함된 시료는 사료, 물, 음식물, 의약품 및 화장품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또한 하기와 같은 단계를 포함하는 비브리오 콜레라를 검출하는 방법을 제공한다.
(i) MARTXVc에 특이적으로 결합하는 상기 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편를 비브리오 콜레라균의 오염이 의심되는 시료에 접촉시키는 단계; 및
(ii) 항원-항체 복합체 형성을 통해 상기 비브리오 콜레라가 포함된 시료에서 상기 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편에 결합된 MARTXVC 단백질의 존재 여부를 확인하는 단계.
상기 비브리오 콜레라균의 오염이 의심되는 시료는 사료, 물, 음식물, 의약품 및 화장품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 오염 의심되는 시료는 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 비브리오 폐혈증균과 비브리오 콜레라균에 교차반응을 보입니다. 따라서, 본 발명의 단일클론항체는 패혈증 및 콜레라에 모두 효과적으로 감염을 억제합니다. 본 발명의 단일클론항체는 비브리오 콜레라균 감염 마우스에 대해서 마우스 생존율 및 백신효과가 우수하여 비브리오 콜레라 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있습니다.
도 1는 다양한 기능적 도메인을 갖고 있는 비브리오 콜레라균 MARTXVc 전장을 나타내는 모식도이다. 모식도의 숫자는 MARTXVc 의 아미노산 번호를 나타낸다. 각각의 기능적 도메인은 다음과 같은 약자로 표시 되어 있다. ABH, α/β hydrolase domain; ACD, actin cross-linking domain; CPD, cysteine protease domain (시스테인 단백질 분해효소 도메인); CTR, C-terminal repeats; NTR, N-terminal repeats; RID, Rho inactivation domain.
도 2는 재조합 N-말단 6x-His tag을 가진 MARTXVc(3386-4545)을 도입된 재조합 MARTXVc(3386-4545)발현 벡터의 개열지도이다.
도 3는 재조합 C-말단 6x-His tag을 가진 MARTXVc(3391-3650)을 도입된 재조합 MARTXVc(3391-3650)발현 벡터의 개열지도이다.
도 4는 정제된 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650)을 SDS-PAEG로 확인한 전기영동의 결과이다. (A)정제된 재조합 MARTXVc(3386-4545)을 나타낸다. (레인 1: 대조군 대장균의 추출물, 레인 2: MARTXVc(3386-4545)의 대장균 추출물, 레인 3: 정제된 MARTXVc(3386-4545)). (B) 정제된 재조합 MARTXVc(3391-3650)을 나타낸다. (레인 1: 대조군 대장균의 추출물, 레인 2: MARTXVc(3391-3650)의 대장균 추출물, 레인 3: 정제된 MARTXVc(3391-3650)). 화살표는 정제된 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질의 위치를 나타낸다.
도 5는 비브리오 콜레라 MARTXVc에 대한 교차반응을 나타내는 단일클론항체의 비브리오 콜레라 감염에 대한 억제 효과를 실험동물의 생존율로 나타낸 결과 그래프이다. 음성 대조군으로 13RA, 14NS1 (West nile virus에 대한 단일클론항체), PBS (Phosphate Buffer Saline; 인산완충용액)이 사용되었다.
도 6는 실시예 9에서 비브리오 콜레라균에 대한 감염억제효과 조사를 위해서 사용한 단일클론항체(21RA, 24RA, 46RA, 14NS1)와 Biotin-축합 21RA의 경쟁적 결합 분석에 대한 결과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 7는 비브리오 콜레라 감염 억제 단일클론항체가 MARTXVc의 활성에 중요한 시스테인 단백질 분해효소 도메인(Cysteine Poretease Domain; CPD로 명명함)에 미치는 영향을 나타낸 데이터이다. 비브리오 콜레라 감염 억제 단일클론항체 21RA, 24RA, 46RA가 각각 레인 3, 레인 4, 레인 5에 첨가 되었다. 레인 1과 레인 2는 단일클론항체가 첨가 되지 않았다. 이노시톨 헥사키스포스페이트 (inositol hexakisphosphate; InsP6로 명명함)는 시스테인 단백질 분해효소 활성에 필요한 자극인자(stimulator)로 사용되었으며, "-"와 "+"는 각각 InsP6의 비첨가(레인 1)와 첨가(레인 2, 레인 3, 레인 4, 및 레인 5) 후 효소 활성을 조사한 것을 나타낸다. 레인 1은 음성 대조군이고, 레인 2는 양성 대조군이다. (MAb: 단일클론항체, FL: CPD활성을 갖는 정제된 재조합 MARTXVc(3391-3650) 단백질, P: 시스테인 단백질 분해 효소 활성에 생성된 분해 절편.)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 비브리오 콜레라균의 재조합 MARTXVc 합성을 위한 올리고 뉴클레오타이드 합성
NheI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 4개의 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다. 또한 VC-3386F 올리고 뉴클레오타이드와 VC-3650R는 재조합 MARTXVc의 정제 과정 중 히스티딘-결합 레진을 이용한 크로마토그래프에 의한 정제과정을 추가 포함하기 위하여 6개의 히스티딘(6x-His tag)을 포함하고 있다.
VC-3386F:5'-ACATCATATGCATCATCATCATCATCATGGTTTGTCCAGCAGTGCAAGTG-3'(서열번호: 1, 전방 프라이머)
VC-4545R:5'-CTCCTCGAGTTACACCATCAATCCTTTTTTGTGAACCAC-3' (서열번호: 2, 후방 프라이머)
VC-3391F:5'-GAATTCCATATGGCAAGTGTAGATGAAGA-3'(서열번호: 3, 전방 프라이머)
VC-3650R:5'-CTCCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGAATACCGTTGCGAATACGTTCATCCTTGG-3' (서열번호: 4, 후방 프라이머)
상기 뉴클레오티드를 후속하는 비브리오 콜레라균 MARTXVc 유전자의 증폭 (하기 실시예 2) 및 재조합 MARTXVc 단백질 생산을 위한 재조합벡터의 제조에 이용하였다.
실시예 2: 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction (PCR))
중합효소 및 상기 실시예 1에서 합성한 전방 프라이머(서열번호 1) 및 후방 프라이머(서열번호 2)를 혼합한 반응용액에 도 1에서 나타낸 다양한 기능적 도메인을 갖고 있는 비브리오 콜레라균 MARTXVc 전장 DNA(서열번호 5, 1,3638bp)-(NCBI accession No. AF119150)를 주형 (template)으로 혼합하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 비브리오 콜레라균 MARTXVc 의 아미노산 서열 3386부터 4545부분을 증폭(MARTXVc(3386-4545)로 명명함)하였다.
또한, 중합효소 및 상기 실시예 1에서 합성한 전방 프라이머(서열번호 3) 및 후방 프라이머(서열번호 4)를 혼합한 반응용액에 비브리오 콜레라균 MARTXVc 전장 DNA(서열번호 5, 1,3638bp)-(NCBI accession No. AF119150)를 주형 (template)으로 혼합하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 비브리오 콜레라균 MARTXVc 의 아미노산 서열 3391부터 3650부분을 증폭(MARTXVc(3391-3650)로 명명함)하였다.
서열번호 6는 전장 비브리오 콜레라균 MARTXVc의 아미노산 서열-(NCBI accession No. AAD21057.1)이다. 중합효소연쇄반응을 위하여 써멀 싸이클러(Thermalcycler(PTC-100), MJ Research. Inc, 미국)를 사용하였으며 94℃에서 3분간 사전변성(predenaturation) 시킨 후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 1분간 결합(annealing) 및 72℃에서 4분간 연장(extension)을 30회 반복 실시하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 다음 중합효소와 비특이적 증폭산물을 제거하기 위해 아가로즈 겔에서 전기영동 후 원하는 증폭산물 밴드 부위를 조각내어 겔 추출 키트(Geneall, 한국)를 이용하여 정제하였다.
실시예 3: 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 발현 벡터의 제작
도 2와 도 3의 개열 지도를 갖는 재조합 MARTXVc 플라스미드 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 정제된 N-말단에 poly his tag 서열인 CATCATCATCATCATCAT(6x-His tag)을 삽입한 MARTXVc(3386-4545)의 증폭산물을 NdeI (Fermentas, 캐나다)과 XhoI (Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 또한, 상기 실시예 2에서 정제된 C-말단에 poly his tag 서열인 CATCATCATCATCATCAT(6x-His tag)을 삽입한 MARTXVc(3391-3650)의 증폭산물을 NdeI (Fermentas, 캐나다)과 XhoI (Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 이들 각각의 절단된 단편과 NdeI과 XhoI으로 절단된 pRSET-A 벡터는 상기 실시예 2에서 이용된 겔 추출 키트 (Geneall, 한국)를 이용하여 정제한 후 정제된 MARTXVc 유전자 단편 1 μg과 pRSET-A 단편 30 ng을 혼합하고, 10배 농도의 접합 농축액(10 mM DTT, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 600 mM Tris-HCl(pH7.5) 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (ligase, Takara) 10 단위(unit)를 가하여 전체 부피를 10 ㎕로 조정하고 상온에서 16시간 반응시켜, pRSET-A 벡터에 MARTXVc(3386-4545) (6x-His + 서열번호 7)가 삽입된 6,308bp의 도 2의 개열지도를 갖는 환형 플라스미드 (pRSET-HIS/MARTXVc(3386-4545)로 명명)와 pRSET-A 벡터에 MARTXVc(3391-3650) (서열번호 8 + 6x-His)가 삽입된 3,608bp의 도 3의 개열지도를 갖는 환형 플라스미드를 (pRSET-MARTXVc(3391-3650)/HIS로 명명) 제조하였다. 다음 플라스미드를 증폭하고, pRSET-HIS/MARTXVc(3386-4545)와 pRSET-MARTXVc(3391-3650)/HIS만을 순수분리하기 위해 대장균 DH5α(Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 형질전환 된 대장균으로부터 재조합 pRSET-HIS/MARTXVc(3386-4545)와 pRSET-MARTXVc(3391-3650)/HIS을 재추출한 후 DNA 염기서열 분석과 제한효소를 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 pRSET-HIS/MARTXVc(3386-4545)와 pRSET-MARTXVc(3391-3650)/HIS에서 비브리오 콜레라균 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 유전자의 존재 유무를 각각 확인하였다.
실시예 4: 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질의 발현
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 MARTXVc 벡터 pRSET-HIS/MARTXVc(3386-4545)와 pRSET-MARTXVc(3391-3650)/HIS의 각각의 발현을 위해 대장균 BL21(DE3)/pLyS (Invitrogen, 미국)에 각각 삽입하였다. 형질전환된 대장균을 37℃ 진탕 배양기에서 4시간 배양한 후 1 mM IPTG을 첨가하여 다시 3시간을 더 배양하였다. 이렇게 배양한 형질전환된 대장균을 8,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후, 대장균침전물은 용출완충액(300 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10% glycerol, 0.1% Tween-20)으로 현탁하였다. 단백질 추출을 위해 현탁한 대장균침전물을 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 원심분리에 의해 상등의 단백질 추출액을 수집하였다.
실시예 5: 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질의 정제
재조합 MARTXVc(3386-4545) 제조용 벡터 pRSET-HIS/MARTXVc(3386-4545)으로 형질전환된 대장균과 MARTXVc(3391-3650) 제조용 벡터 pRSET-MARTXVc(3391-3650)/HIS으로 형질전환된 대장균에서 상기 실시예 4의 방법으로 각각 단백질을 추출한 후, Ni-NTA크로마토그래피 (Qiagen, 미국)를 제조자의 지시에 따라 단백질 추출액으로부터 각각의 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질을 1차적으로 정제하였다. Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 1차 정제한 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질을 각각 겔 여과 액체크로마토그래피(size exclusion-FPLC) (GE Healthcare, 미국)을 이용하여 2차적으로 순수 정제하여 재조합 MARTXVc(3386-4545)단백질(6x-His tag + 서열번호 9)과 MARTXVc(3391-3650)단백질(서열번호 10 + 6x-His tag )을 각각 생산하였다. 정제 양상과 정제 효율은 SDS-PAGE를 수행하여 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4A와 도 4B는 각각 정제된 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650)을 나타낸다. 도 4A와 4B에서 각각 레인 1은 대조군 대장균의 추출물이고, 레인 2는 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650)의 대장균 추출물을 나타내며, 레인 3은 정제된 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질을 보여준다. 화살표는 정제된 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 4A와 4B의 각각 레인 3에서는 정제된 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질은 98%의 순도를 보였다.
실시예 6: 단일클론항체의 복수(ascites) 생산 및 정제
단일클론항체의 복수 생산을 위하여, 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 배양하여 프리스텐(Sigma, 미국)으로 프라이밍(priming)한 BALB/C (암컷, 8 주령) 마우스의 복강내에 1 × 106세포/㎖의 농도로 0.5 ㎖ 주입하고, 마우스의 복강내에 복수가 생성되면 채취하였다. 수확한 복수를 1500 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 수확하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.
또한, 단일클론항체의 정제를 위해서는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 37℃, 5% 탄산가스 항온기에서 배양 후, 상등액에서 항체를 정제하였다. 항체의 정제는 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(Peptron, 한국)를 이용하였으며, 실험과정은 제조사의 방법에 따라 수행하였다.
실시예 7: 단일클론항체의 비브리오 콜레라균 MARTXVc 단백질에 대한 교차반응 분석 및 항원결정기 분석
진단, 예방용 및 치료용 단일클론항체의 선별에 유용한 정보로 사용되는 단일클론항체의 교차반응 분석 및 항원결정기 분석은 실시예 5에서 확인한 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650)의 단편과 ELISA법에 의해 수행되었다.
정제된 재조합 MARTXVc(3386-4545)와 MARTXVc(3391-3650) 단백질을 각각 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 2 ㎍/㎖ 희석한 다음, Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 각각의 재조합 단백질을 코팅하였다. 각각의 재조합 단백질이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블로킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이적 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론항체를 포함한 용액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체(1: 2,000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음, 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, 다시 세척완충용액으로 3회 세척하고, 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine)(Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 다음, 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
하기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 비브리오 패혈증 RtxA1에 대한 단일클론항체 37개중 29개(1RA, 2RA, 3RA, 7RA, 11RA, 12RA, 13RA, 14RA, 16RA, 20RA, 21RA, 23RA, 24RA, 26RA, 27RA, 28RA, 29RA, 32RA, 38RA, 40RA, 41RA, 42RA, 44RA, 45RA, 46RA, 47RA, 48RA, 50RA, 52RA) 비브리오 콜레라균 MARTXVc(3386-4545) 항원에 결합하는 교차반응을 보였으며, 이중 4개(3RA, 21RA, 24RA, 46RA)는 시스테인 단백질 분해효소 도메인 (Cysteine Protease Domain; CPD로 명명함) 부분인 MARTXVc(3391-3650) 항원에 결합하였다.
따라서, 본 발명을 통해 비브리오 콜레라균의 MARTXVc에 교차반응하는 단일클론항체를 확보 할 수 있었고 이들의 항원결정기를 분석 할 수 있었다. 이와 같은 단일클론항체들은 비브리오 콜레라균의 예방 및 치료용 단일클론항체 및 비브리오 콜레라균의 항원진단제 개발뿐만 아니라, 단일클론항체를 이용한 비브리오 콜레라균에 대한 다양한 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
단일클론항체 비브리오
패혈증균
(V. vulnificus)		 비브리오 콜레라균
(V. cholerae)
감염된 쥐의
생존율(%) 		MARTXVc
(3386-4545)		 MARTXVc
(3391-3650)		 감염된 쥐의
생존율(%)
PBS (대조군) 30 - - 25
14NS1 (대조군) 33 - - 30 (PUR)
1RA 20 +++ - .
2RA 60 +++ - .
3RA 70* ++ +++ .
4RA 50 - - .
5RA 60 - - .
7RA 40 +++ - .
8RA 30 - - .
9RA 20 - - .
10RA 20 - - .
11RA 80* +++ - .
12RA 60 +++ - .
13RA 100* +++ - 30 (PUR)
14RA 50 +++ - .
16RA 40 ++ - .
19RA 70* - - .
20RA 30 +++ - .
21RA 100* +++ +++ 100* (PUR)
22RA 30 - - .
23RA 20 +++ - .
24RA 100* ++ +++ 100* (PUR)
26RA 30 +++ - .
27RA 30 +++ - .
28RA 30 +++ - .
29RA 50 +++ - .
30RA 50 - - .
32RA 30 +++ - .
38RA 40 +++ - .
40RA 30 +++ - .
41RA 50 ++ - .
42RA 70* +++ - .
44RA 60 +++ - .
45RA 90* +++ - 60* (ASC)
46RA 90* +++ +++ 100* (PUR)
47RA 90* +++ - 100* (PUR)
48RA 40 + - .
50RA 100* ++ - 82* (PUR)
52RA 60 + - .
실시예 8: 야생종 비브리오 콜레라균의 배양
야생종 비브리오 콜레라균주 Vibrio cholerae O1 biotype E1 Tor strain N16961 (Lin W, Fullner KJ, Clayton R, et al. Proc Natl Acad Sci USA 96: 1071-1076, 1999)를 LB(Luria-Bertani; Difco Co.) 배지에 접종한 후, 37℃ 진탕 배양기에서 16시간 배양하였다. 이 배양액의 1/200을 다시 LB 배지에 접종한 후, 37℃ 진탕 배양기에서 4시간 동안 본 배양을 수행하였다.
실시예 9: 비브리오 콜레라균 MARTXVc에 교차 반응을 보이는 단일클론항체의 비브리오 콜레라균 감염에 대한 감염억제 효과.
비브리오 콜레라균 MARTXVc에 교차 반응을 보이는 단일클론항체의 비브리오 콜레라균 감염에 대한 감염억제 효과를 확인하기 위해서, CD1(암컷, 8 주령) 마우스에 실시예 6에서 얻은 각각의 단일클론항체(13RA, 21RA, 24RA, 45RA, 46RA, 47RA, 50RA, 14NS1)를 200㎕/mouse(복수로 얻은 단일클론항체; 표1에서 “ASC”로 표시)나 1 ㎎/mosue(정제된 단일클론항체; 표1에서 “PUR” 표시)을 복강으로 투여하고, 4시간 30분 후에 실시예 8에서 배양한 야생종 비브리오 콜레라균 8 × 106 CFU(colony forming unit)을 복강으로 투여하고, 감염된 쥐의 생존율을 96시간 동안 관찰하였다. 그 결과를 표 1 및 도 5에 나타내었다.
그 결과 21RA, 24RA, 46RA, 47RA을 투여 받은 쥐들은 비브리오 콜레라균 감염에 100% 생존율을 보였고, 45RA을 투여 받은 쥐들은 60%의 유효한 생존율을 보였다. 하지만, 음성 대조군으로 사용한 13RA, 14NS1 (West nile virus에 대한 단일클론항체), PBS (Phosphate Buffer Saline; 인산완충용액) 은 25-30%의 낮은 생존율을 보였다.
실시예 10: 단일클론항체들간의 경쟁적 결합 분석
MARTXVc(3391-3650)을 인식하는 21RA 단일클론항체와 실시예 9에서 비브리오 콜레라 감염억제효과를 나타내는 2개(24RA와 46RA)의 단일클론항체와 결합부위가 상이한지를 알아보기 위해서, Biotin로 표지(labeling)된 21RA(Biotin-축합 21RA로 명명)을 이용하여, 단일클론항체들간의 경쟁적 결합 분석을 수행하였다.
Biotin-축합 21RA을 생성하기 위해서, 실시예 6에서 정제한 21RA와 항체 Biotin labeling kit(FluoReporter Biotin-XX Protein labelling kit, Molecular Probes, 미국)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였으며, Biotin-축합 21RA을 생성 하였다.
단일클론항체 21RA와 2개(24RA와 46AR)의 단일클론항체들간의 경쟁적 결합분석을 위하여, 실시예 5에서 정제된 재조합 MARTXVc(3391-3650)와 Biotin-축합 21RA을 이용한 경쟁적 ELISA을 수행하였다.
실시예 5에서 정제된 재조합 MARTXVc(3391-3650) 단백질을 탄산염 완충액 (carbonate buffer, pH 9.4)으로 2 ㎍/㎖로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 55 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 재조합 MARTXVc(3391-3650) 단백질을 코팅하였다. 재조합 단백질을 코팅한 각 웰에 1% BSA가 포함된 블로킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이적 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론항체를 포함한 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음, 4 ㎍/㎖의 Biotin-축합 21RA을 15 ㎕씩 추가로 첨가하고 4℃에서 1 시간 반응시켰다. 그 후, 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하고, HRP(Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, 다시 세척완충용액으로 3회 세척하고 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine)(Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 각각의 단일클론항체가 존재할 때의 Biotin-축합 21RA 결합 강도를 %로 나타내었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 결과적으로 Biotin-축합 21RA는 2개(24RA와 46RA)의 단일클론항체와 재조합 MARTXVc(3391-3650)단백질에 경쟁적 결합을 하지 않았다. 또한 Biotin-축합 21RA는 음성대조군으로 사용된 14NS1과 PBS와 MARTXVc(3391-3650)단백질에 경쟁적 결합을 하지 않았다.
따라서, 단일클론항체 21RA는 24RA와 46RA 단일클론항체와 서로 다른 부위에 결합함을 나타낸다.
실시예 11: 비브리오 콜레라 감염 억제 단일클론항체가 MARTXVc의 시스테인 단백질 분해효소 도메인(Cysteine Poretease Domain; CPD로 명명함)에 미치는 영향 분석
본 발명의 비브리오 콜레라 감염에 억제 효과를 보이는 단일클론항체의 작용 기작을 밝히기 위해서 CPD을 포함하고 있는 MARTXVc(3391-3650)을 이용해서 단일클론항체가 MARTXVc의 CPD 활성에 미치는 영향을 분석 하였다.
먼저, 실시예 5에서 정제한 재조합 MARTXVc(3391-3650) 단백질과 실시예 6에서 정제된 단일클론항체를 각각 반응 튜브에 4 μM씩 첨가하고, CPD 활성인자인 이노시톨 헥사키스포스페이트(inositol hexakisphosphate; InsP6로 이하에서 명명함, Sigma-Aldrich, 미국)가 포함된 반응액(60 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH7.4), 250 mM sucrose, 0.05 μM InsP6)을 혼합하여 전체부피를 50㎕로 조정하였다. 그 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 50㎕의 SDS 로딩버퍼(loading buffer; 100 mM Tris-HCl (pH6.8), 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)을 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 반응 후 SDS-PAGE와 코마시 염색(Coomassie straining)을 통하여 25 kDa의 분해 절편들의 생성 유무를 통하여 효소 활성도를 측정하였다.
음성 대조군으로는 CPD 활성인자인 InsP6와 단일클론항체를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실험을 수행하였다. 양성 대조군으로는 InsP6는 첨가하고 단일클론항체를 참가하지 않은 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 7의 레인 1의 음성 대조군은 CPD 활성을 나타내지 않는 것을 확인하였고, 레인 2의 양성 대조군에는 CPD 활성을 보이는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, 도 7의 레인 3에서 나타난 바와 같이 21RA 단일클론항체는 CPD 활성을 억제하지 않은 반면, 레일 4와 5에서 보여는 주는 바와 같이 24RA와 46RA 단일클론항체는 CPD 활성을 억제함을 확인 했다.
즉, 본 발명에 따른 비브리오 콜레라 감염 억제 효과를 보이는 24RA와 46RA 단일클론항체는 CPD 활성을 억제하므로 써 비브리오 콜레라에 대한 감염 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00310BP 20140109 한국세포주연구재단 KCLRFBP00394BP 20170124
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Cross-reactive Monoclonal Antibody Binding to Vibrio cholreae MARTXVc Protein and Its use <130> 1061922 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC-3386F <400> 1 acatcatatg catcatcatc atcatcatgg tttgtccagc agtgcaagtg 50 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC-4545R <400> 2 ctcctcgagt tacaccatca atcctttttt gtgaaccac 39 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC-3391F <400> 3 gaattccata tggcaagtgt agatgaaga 29 <210> 4 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC-3650 <400> 4 ctcctcgagc taatgatgat gatgatgatg aataccgttg cgaatacgtt catccttgg 59 <210> 5 <211> 13638 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Whole DNA sequence of Vibrio cholreae MARTXVc <400> 5 atgggaaaac cattttggag aagtgttgaa tacttcttca caggaaacta ttccgccgac 60 gatggaaaca 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tcgacagcct agagagtaaa 3420 tctcaagctg cgatcagcat ggcgtggtca gacgtggttc acaaaaaagg attgatggtg 3480 taa 3483 <210> 8 <211> 780 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Vibrio cholreae MARTXVc(3391-3650) <400> 8 gcaagtgtag atgaagacct agatcaacaa gggttggata ccacatcaac caaggatcaa 60 ggtatctcaa ataagaatga tcatctgcaa gtggtggata gtaaagaagc attagcggat 120 ggaaaaatac tccataatca aaatgttaat agctggggcc cgattacggt tacaccaacg 180 acagatggtg gtgaaacccg cttcgacggt caaatcatcg ttcaaatgga aaacgacccg 240 gtagtagcaa aagcggcagc caatttagca ggtaaacatg ctgaaagcag tgtggtggtg 300 cagctcgatt cagacggcaa ctatcgcgtg gtgtatggcg atccgtcaaa actggatgga 360 aagctacgtt ggcagttggt ggggcatggt cgcgaccact cagaaactaa caatactcgc 420 ttaagtggtt acagtgccga tgagttggcc gtgaaattgg ccaagttcca acagtcgttt 480 aatcaagccg aaaacatcaa caacaaaccg gatcacatca gtattgttgg ttgttctttg 540 gtgagtgacg acaagcaaaa aggctttggt catcagttta ttaacgcgat ggatgcgaat 600 ggtcttcgtg tcgatgtctc tgttcgtagt tctgaactgg ccgtagacga ggcgggacgt 660 aagcatacca aggacgcgaa tggcgattgg gttcaaaagg cagaaaacaa caaagtttcg 720 ctaagctggg acgcgcaagg tgaagttgtt gccaaggatg aacgtattcg caatggtatt 780 780 <210> 9 <211> 1160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence of Vibrio cholreae MARTXVc(3386-4545) <400> 9 Gly Leu Ser Ser Ser Ala Ser Val Asp Glu Asp Leu Asp Gln Gln Gly 1 5 10 15 Leu Asp Thr Thr Ser Thr Lys Asp Gln Gly Ile Ser Asn Lys Asn Asp 20 25 30 His Leu Gln Val Val Asp Ser Lys Glu Ala Leu Ala Asp Gly Lys Ile 35 40 45 Leu His Asn Gln Asn Val Asn Ser Trp Gly Pro Ile Thr Val Thr Pro 50 55 60 Thr Thr Asp Gly Gly Glu Thr Arg Phe Asp Gly Gln Ile Ile Val Gln 65 70 75 80 Met Glu Asn Asp Pro Val Val Ala Lys Ala Ala Ala Asn Leu Ala Gly 85 90 95 Lys His Ala Glu Ser Ser Val Val Val Gln Leu Asp Ser Asp Gly Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Val Tyr Gly Asp Pro Ser Lys Leu Asp Gly Lys Leu Arg 115 120 125 Trp Gln Leu Val Gly His Gly Arg Asp His Ser Glu Thr Asn Asn Thr 130 135 140 Arg Leu Ser Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Leu Ala Val Lys Leu Ala Lys 145 150 155 160 Phe Gln Gln Ser Phe Asn Gln Ala Glu Asn Ile Asn Asn Lys Pro Asp 165 170 175 His Ile Ser Ile Val Gly Cys Ser Leu Val Ser Asp Asp Lys Gln Lys 180 185 190 Gly Phe Gly His Gln Phe Ile Asn Ala Met Asp Ala Asn Gly Leu Arg 195 200 205 Val Asp Val Ser Val Arg Ser Ser Glu Leu Ala Val Asp Glu Ala Gly 210 215 220 Arg Lys His Thr Lys Asp Ala Asn Gly Asp Trp Val Gln Lys Ala Glu 225 230 235 240 Asn Asn Lys Val Ser Leu Ser Trp Asp Ala Gln Gly Glu Val Val Ala 245 250 255 Lys Asp Glu Arg Ile Arg Asn Gly Ile Ala Glu Gly Asp Ile Asp Leu 260 265 270 Ser Arg Ile Gly Val Asn Asn Val Asp Glu Pro Ala Arg Gly Ala Ile 275 280 285 Gly Asp Asn Asn Asp Val Phe Asp Ala Pro Glu Lys Arg Lys Pro Glu 290 295 300 Thr Glu Val Ile Ala Asn Ser Ser Ser Ser Asn Gln Phe Ser Tyr Ser 305 310 315 320 Gly Asn Ile Gln Val Asn Val Gly Glu Gly Glu Phe Thr Ala Val Asn 325 330 335 Trp Gly Thr Ser Asn Val Gly Ile Lys Val Gly Thr Gly Gly Phe Lys 340 345 350 Ser Leu Ala Phe Gly Asp Asn Asn Val Met Val His Ile Gly 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Phe 770 775 780 Leu Arg Asn Ser Gly His Leu Gln Gly Asp Gly Asp Ile Asn Ile Ser 785 790 795 800 Leu Gly Asn Tyr Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asp Gly Lys Asp Leu Gly 805 810 815 Ala Tyr Leu Gly Asp Asn Asn Asn Phe Trp Gly Gly Arg Gly Asp Asp 820 825 830 Val Phe Tyr Ala Thr Gly Lys Ser Asn Ile Phe Thr Gly Gly Glu Gly 835 840 845 Asn Asp Met Gly Val Leu Met Gly Arg Glu Asn Met Met Phe Gly Gly 850 855 860 Asp Gly Asn Asp Thr Ala Val Val Ala Gly Arg Ile Asn His Val Phe 865 870 875 880 Leu Gly Ala Gly Asp Asp Gln Ser Phe Val Phe Gly Glu Gly Gly Glu 885 890 895 Ile Asp Thr Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Val Val Thr Ser Gly Asn Phe 900 905 910 Asn Arg Val Asp Thr Gly Asp Asp Gln Asp Tyr Ser Val Thr Ile Gly 915 920 925 Asn Asn Asn Gln Val Glu Leu Gly Ala Gly Asn Asp Phe Ala Asn Ile 930 935 940 Phe Gly Asn Tyr Asn Arg Ile Asn Ala Gly Ala Gly Asn Asp Val Val 945 950 955 960 Lys Leu Met Gly Tyr His Ala Val Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp 965 970 975 His Leu Ile Ala Thr Ala Ile Ser Lys Phe Ser Gln Phe Asn Gly Gly 980 985 990 Glu Gly Arg Asp Leu Met Val Leu Gly Gly Tyr Gln Asn Thr Phe Lys 995 1000 1005 Gly Gly Thr Asp Val Asp Ser Phe Val Val Ser Gly Asp Val Ile Asp 1010 1015 1020 Asn Leu Val Glu Asp Ile Arg Ser Glu Asp Asn Ile Val Phe Asn Gly 1025 1030 1035 1040 Ile Asp Trp Gln Lys Leu Trp Phe Glu Arg Ser Gly Tyr Asp Xaa Lys 1045 1050 1055 Leu Ser Ile Leu Arg Asp Pro Ser Asn Asp Ser Asp Gln Ser Lys Phe 1060 1065 1070 Glu His Ile Gly Ser Val Thr Phe Ser Asp Tyr Phe Asn Gly Asn Arg 1075 1080 1085 Ala Gln Val Val Ile Gly Met Ser Glu Lys Asp Leu Ser Gly Glu Arg 1090 1095 1100 Glu Tyr Thr Met Leu Ser Asp Ser Ala Ile Asp Ala Leu Val Gln Ala 1105 1110 1115 1120 Met Ser Gly Phe Glu Pro Gln Ala Gly Asp Asn Gly Phe Ile Asp Ser 1125 1130 1135 Leu Glu Ser Lys Ser Gln Ala Ala Ile Ser Met Ala Trp Ser Asp Val 1140 1145 1150 Val His Lys Lys Gly Leu Met Val 1155 1160 <210> 10 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence of Vibrio cholreae MARTXVc(3391-3650) <400> 10 Ala Ser Val Asp Glu Asp Leu Asp Gln Gln Gly Leu Asp Thr Thr Ser 1 5 10 15 Thr Lys Asp Gln Gly Ile Ser Asn Lys Asn Asp His Leu Gln Val Val 20 25 30 Asp Ser Lys Glu Ala Leu Ala Asp Gly Lys Ile Leu His Asn Gln Asn 35 40 45 Val Asn Ser Trp Gly Pro Ile Thr Val Thr Pro Thr Thr Asp Gly Gly 50 55 60 Glu Thr Arg Phe Asp Gly Gln Ile Ile Val Gln Met Glu Asn Asp Pro 65 70 75 80 Val Val Ala Lys Ala Ala Ala Asn Leu Ala Gly Lys His Ala Glu Ser 85 90 95 Ser Val Val Val Gln Leu Asp Ser Asp Gly Asn Tyr Arg Val Val Tyr 100 105 110 Gly Asp Pro Ser Lys Leu Asp Gly Lys Leu Arg Trp Gln Leu Val Gly 115 120 125 His Gly Arg Asp His Ser Glu Thr Asn Asn Thr Arg Leu Ser Gly Tyr 130 135 140 Ser Ala Asp Glu Leu Ala Val Lys Leu Ala Lys Phe Gln Gln Ser Phe 145 150 155 160 Asn Gln Ala Glu Asn Ile Asn Asn Lys Pro Asp His Ile Ser Ile Val 165 170 175 Gly Cys Ser Leu Val Ser Asp Asp Lys Gln Lys Gly Phe Gly His Gln 180 185 190 Phe Ile Asn Ala Met Asp Ala Asn Gly Leu Arg Val Asp Val Ser Val 195 200 205 Arg Ser Ser Glu Leu Ala Val Asp 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  3. 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열목록 9의 MARTXVc 단백질의 3386 내지 4545번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라 예방제.
  4. 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열목록 9의 MARTXVc 단백질의 3386 내지 4545번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라 치료제.
  5. 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열목록 9의 MARTXVc 단백질의 3386 내지 4545번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 비브리오 콜레라 시스테인 단백질 분해효소의 활성을 억제하는, 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열목록 9의 MARTXVc 단백질의 3386 내지 4545번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 콜레라 진단 키트.
  9. (i) 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열목록 9의 MARTXVc 단백질의 3386 내지 4545번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 콜레라가 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 접촉시키는 단계;
    (ii) 항원-항체 복합체 형성을 통해 상기 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편에 결합된 MARTXVc 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (iii) 상기 (ii) 단계에서 측정된 MARTXVc 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하여 대조군에 비해 상기 단백질의 발현 수준이 높으면 콜레라 환자로 판정하는 단계;
    를 포함하는 콜레라 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비브리오 콜레라가 포함된 시료는 사료, 물, 음식물, 의약품 및 화장품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 콜레라 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. (i) 수탁번호 KCLRF-BP-00310 또는 KCLRF-BP-00394인 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(MARTXVc) 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열목록 9의 MARTXVc 단백질의 3386 내지 4545번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 비브리오 콜레라균의 오염이 의심되는 시료에 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 항원-항체 복합체 형성을 통해 상기 비브리오 콜레라균이 포함된 시료에서 상기 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편에 결합된 MARTXVc 단백질의 존재 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 비브리오 콜레라균을 검출하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 비브리오 콜레라균이 포함된 시료는 사료, 물, 음식물, 의약품 및 화장품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 비브리오 콜레라균을 검출하는 방법.
KR1020170031908A 2017-03-14 2017-03-14 비브리오 콜레라균 엠에이알티엑스 브이씨(martxvc) 단백질에 교차 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 KR101905095B1 (ko)

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