KR102341804B1 - 황색포도상구균을 억제하는 항-IsaA F10 항체 및 이의 용도 - Google Patents

황색포도상구균을 억제하는 항-IsaA F10 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황색포도상구균을 억제하는 항-IsaA F10 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-IsaA F10 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-IsaA F10 항체는 황색포도상구균 성장을 억제하여 아토피 질환과 같은 피부 염증 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

황색포도상구균을 억제하는 항-IsaA F10 항체 및 이의 용도{Anti-IsaA F10 antibody inhibiting Staphylococcus aureus and use thereof}
본 발명은 황색포도상구균을 억제하는 항-IsaA F10 항체 및 이의 용도에 대한 것이다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람 양성균이며, 포자를 형성하지 않는 통성혐기성균으로, 주로 가축 분변, 염증 상처부위 혹은 사람의 손이 많이 닿는 조리도구 등에서 발견된다. 인간과 동물에 감염하여 수술 후 감염, 농양, 심장 내막염 및 독소 증후군 등의 심각한 질병을 유도하는 대표적인 병원성 세균이다. 황색포도상구균이 내는 TSST-1, EF, alpha, beta, delta 등의 독소는 심각한 식중독을 유발하기도 한다. 또한, 황색포도상구균 감염은 다양한 질환 또는 병태(condition)를 야기할 수 있으며, 이들 질환 또는 병태의 비-한정적 예로는 세균혈증, 연조직염, 눈꺼풀 감염, 식중독, 관절 감염, 피부 감염, 열상 피부 증후군, 독성 쇼크 증후군, 폐렴, 골수염, 심내막염, 수막염 및 농양 형성이 있다.
한편, 황색포도상구균은 병원내 감염을 일으키는 대표적인 세균으로 정상인이나 환경에서도 쉽게 발견되는 상재세균이다. 이 세균은 상처나 면역저하환자, 그리고 외과적 치료부위에 오염된 의료기구 등을 통하여 감염하여 항균제로 치료하기 어려운 내성을 가지고 화농성 질환을 일으킨다. 균의 특성상 의료기구나 비생물체의 표면에 고착하여 오랫동안 생존하고 있기 때문에 일반적인 세제나 알코올류로 완전히 제거가 어렵다. 이를 세균의 균막형성이라 하며 균막형성시 치료가 더욱 어렵고 항균제에도 보다 높은 저항성을 나타낸다. 인체 감염시 균막은 인체의 면역체계에 저항하며, 항균물질에 대한 저항성이 부유 상태의 500배에서 1000배 이상 증가하는 것으로 나타나 항균치료만으로는 효과적인 치료를 기대하기 힘들다. 뿐만 아니라 항균제 내성균의 출현 및 확산 문제가 매우 심각해서 현재까지 개발되어 사용되고 있는 거의 모든 종류의 항균치료제에 내성을 나타내는 슈퍼박테리아까지 출현하여, 항균제 이외의 대체치료제의 개발이 시급하고 절실하게 요구되고 있다. 그럼에도 불구하고, 황색포도상구균을 억제하는 항체에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이다.
미국공개특허 US 2017/0002063(2017.01.05 공개) 일본공개특허 2009-31009(2009.02.12 공개)
본 발명의 목적은 황색포도상구균을 억제하는 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 IsaA 항원 검출용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 억제용 항균 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물과, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 IsaA 항원 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 억제용 항균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 황색포도상구균을 억제하는 항-IsaA F10 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-IsaA F10 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-IsaA F10 항체는 황색포도상구균 성장을 억제하여 아토피 질환과 같은 피부 염증 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 항-IsaA scFv 항체 선별을 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 항-IsaA F10 scFv 항체의 민감도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 황색포도상구균을 이용한 항-IsaA F10 scFv 항체의 활성도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 세포투과성 항-IsaA F10 scFv 항체 단백질 정제 후 SDS-PAGE 분석법을 통해 크기 및 단백질 순도 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 세포투과성 항-IsaA F10 scFv 항체 단백질의 세포내 투과능을 웨스턴 블랏 분석법으로 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 세포투과성 항-IsaA F10 scFv 항체의 황색포도상구균에 대한 항균력을 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
한편, 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR들은 표 1에 기재하였다.
또한, 본 발명에 사용된 TAT 펩타이드의 아미노산 서열은 "YGRKKRRQRRR" (서열번호 7)이고, TAT 펩타이드의 염기서열은 "TAT GGC CGC AAA AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC" (서열번호 8)이다.
본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IsaA에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 IsaA 항원 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "IsaA 항원"은 면역원성 포도상구균성 항원 A(immunodominant staphylococcal antigen A; IsaA)를 의미하는 것으로, IsaA는 높은 면역원성, 비공유성으로 세포벽에 결합하는 용해성 트랜스글리코실레이즈(transglycosylase)이다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 억제용 항균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 유효성분 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 조성물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 항- IsaA scFv 항체 선별
1. bio-panning 시행
7.6 × 109의 다양성을 가지는 OPAL library를 이용하여 bio-panning을 수행하였다. Epoxy magnetic bead에 10 μg의 IsaA 항원을 고정시키고 input phage를 반응시켰다. 항원과 반응한 phage를 용출(elution)하여 output titer를 측정하였다. 매 횟수마다 input과 output titer를 측정하여 bio-panning의 정보를 획득하고 정상적으로 시행되고 있는지를 확인하였다. 매 횟수마다 input phage는 1 × 1012 cfu/mL ≥의 phage를 사용하였다. output은 1차 - 6.5 × 106, 2차 - 1.13 × 104, 3차 - 4.21 × 107 cfu/mL으로 측정되었다. 따라서 bio-panning이 정상적으로 진행되었다는 것을 확인할 수 있었다.
2. ELISA 분석
고민감도, 고특이성 항체의 선별을 위해 ELISA 분석법을 수행하였다. 확보한 phage를 대장균에 감염시켜 항생제가 첨가된 LB plate에 도말하였다. 16 시간 동안 30℃ 배양기에서 배양한 후 생성된 콜로니를 랜덤하게 채집하였다. 각 콜로니를 LB 배지에 접종하여 배양한 후 IPTG를 처리하여 scFv 항체를 발현시키고 대장균을 용해(lysis)하여 수용성 분획(soluble fraction)을 취하여 ELISA를 수행하였다. 먼저, 50 ng의 IsaA 항원을 96-well ELISA plate에 고정시키고, 3% BSA가 함유된 PBS로 블락킹(blocking) 하였다. 1 시간 후, 위에서 얻은 세포 용해물(cell lysate)을 처리하여 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 3회 씻어준 후 블락킹 용액(blocking solution)에 HRP-conjugated anti-HA 항체를 1:1000으로 희석하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 5회 씻어준 후 TMB substrate로 발색시켜 ELISA reader로 항원에 결합된 scFv 항체를 측정하였다. 96개의 항체를 분석하였고 OD 0.4를 양성 가이드라인(positive guideline), 0.1을 음성 가이드라인(negative guideline)으로 임의로 정하여 10종을 선별하였다(도 1).
< 실시예 2> 항- IsaA scFv 항체 서열 분석
ELISA 분석을 통하여 선별된 IsaA scFv 10종의 양성 클론(positive clone)에 대하여 서열분석(sequencing)을 통해 개별적 클론(clone)을 선별하였다. 앞서 선별한 양성 클론 중에 중복되는 클론이 존재할 가능성이 있기 때문에 서열분석이 필요하였다. 서열 분석 결과, 10 종의 양성 클론 중 7종이 개별적인 클론임을 확인하였다.
< 실시예 3> 선별된 항- IsaA F10 scFv 항체 정제 및 민감도 분석
1. 항- IsaA F10 scFv 항체 정제
선별된 7종 중 항원 결합력이 가장 높은 항-IsaA F10 scFv 항체(표 1)를 정제하였다. 항-IsaA scFv 클론(F10)이 형질전환(transformation) 되어 있는 ER2738 E.coli cell을 500 mL의 SB media에 배양시킨 후 1 × TES buffer를 이용하여 세포를 용해(lysis) 시켰다. 세포 용해물(cell lysate)을 0.5 mL Ni bead에 반응시키고 이미다졸(imidazole)을 이용하여 용출(elution) 하였다.
Target Clone Light chain CDR sequence Heavy chain CDR sequence
CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
IsaA F10 TGSSSNIGNNNVN ANSQ GAWDSSLSAYV GYAMG VISSGGGST KVRRVFDY
2. 정제된 항- IsaA F10 scFv 항체의 민감도 분석
정제된 항-IsaA F10 scFv 항체의 민감도 분석을 시행하였다. 민감도 분석은 ELISA 분석법을 이용하였다. 우선 여러 농도의 IsaA 항원을 ELISA plate에 고정시킨 후 2 μg/mL의 항-IsaA F10 scFv 항체를 처리하였다. 분석은 1:1000으로 희석한 HRP-conjugated anti-HA 항체를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 항-IsaA F10 scFv 항체의 EC50은 0.822 μg/mL, LOD는 0.07 μg/mL로 분석되었다(도 2).
< 실시예 4> 황색포도상구균을 이용한 항- IsaA F10 scFv 항체의 활성도 분석
항-IsaA F10 scFv 항체의 실제 검체인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과의 반응성을 확인하기 위해 ELISA 분석법을 이용하였다. 박테리아 세포를 96-well plate에 각 well 당 101~106 개씩 분주하여 4℃에서 16 시간 부착시켰다. 부착된 박테리아 세포를 3% BSA가 포함된 PBS를 이용하여 블락킹(blocking)하고, 각 well에 정제한 항-IsaA F10 scFv 항체를 2 μg/mL로 처리한 후 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween20가 포함된 PBS로 세척하여 반응하지 않은 항체를 제거하고, HRP-conjugated anti-HA 항체를 1:1000 비율로 blocking solution에 희석하여 처리한 다음 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 후 TMB 기질 수용액을 이용하여 상온에서 15 분간 발색반응을 진행한 다음 2.5 N 황산용액을 첨가하여 반응을 종료 시키고 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 분석에서 음성대조구로 Lactobacillus rhamnosus를 이용하였다(도 3). 그 결과, 항-IsaA F10 scFv 항체는 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
< 실시예 5> 세포투과성 항- IsaA F10 scFv 항체 제작
1. TAT-항- IsaA F10 scFv DNA construct 제작
앞서 선별된 항-IsaA scFv를 primer를 이용하여 제한효소 사이트(restriction enzyme site)와 TAT을 삽입한 PCR 산물을 생산하였다. PCR 산물(insert)와 pET28a(+) vector를 EcoR I 1 μL, Xho I 1 μL 처리하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 정제하였다. 정제된 vector와 insert의 농도를 nanodrop으로 측정하고 vector와 insert의 비율별로 T4 ligase를 이용하여 상온에서 16 시간 동안 ligation을 진행하였다. Ligation이 끝난 후 DH5α에 형질전환 한 후 카나마이신이 첨가된 LB plate에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하고 다음 날 콜로니를 취하여 카나마이신이 첨가된 LB media에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 다음 날 insert가 삽입되었는지 확인하기 위해 플라스미드(plasmid)를 분리하여 Xho I과 EcoR I으로 절단(restriction)하고, 1% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
2. TAT-항- IsaA F10 scFv 항체 정제
클로닝 된 TAT-항-IsaA F10 scFv 항체 클론을 BL21(DE3) 대장균 숙주에 형질전환 시켰다. 형질전환체는 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 OD600 값이 0.6이 될 때까지 배양하고, 16℃에서 0.5 mM IPTG를 처리하여 발현 유도(induction) 하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 세포들을 lysis buffer(50 mM Tris-Hcl, pH 7.5, 150 mM NaCl)에 현탁한 후 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액을 얻었다. 유도 발현된 단백질만을 순수 분리 정제하기 위해 Ni-NTA에 친화력을 갖는 레진을 사용하였으며, 정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통하여 확인하였다(도 4).
< 실시예 6> 세포투과성 항- IsaA F10 scFv 항체의 세포 투과 분석
TAT-항-IsaA F10 scFv 항체의 세포 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 분석법을 이용하였다. 인간 피부 세포를 6-well 플레이트에 1 × 106 개로 분주한 후 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 함유하는 RPMI 배지를 넣고 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다. 배양 후 FBS가 포함되지 않은 1.5 mL의 신선한 배양액으로 교체하고 여러 농도의 TAT-항-IsaA F10 scFv를 처리하였다. 처리 1 시간 뒤, 세포를 PBS로 충분히 세척한 다음 회수하여 TAT-항-IsaA F10 scFv의 세포 내 투과된 정도를 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다. 세포 내 투과된 TAT-항-IsaA F10 scFv가 정확한 위치(크기)에서 확인되는지를 알아보기 위하여, 순수 정제된 TAT-항-IsaA F10 scFv 항체(Control)도 함께 전기영동하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, TAT-항-IsaA F10 scFv는 농도 의존적으로 세포 내 투과가 효과적으로 일어났음을 확인하였다.
< 실시예 7> 세포투과성 항- IsaA F10 scFv 세포독성 시험
TAT-항-IsaA F10 scFv 항체에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, 인간 피부 세포를 96-well 플레이트에 well 당 1 × 104 개로 분주한 후 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다. 24 시간 후, TAT-항-IsaA F10 scFv를 농도별로 처리한 다음 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양이 끝난 후 MTT{3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide} 용액을 넣고 3 시간 동안 반응시킨 다음 배양액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100 μL씩 넣어주었다. 15 분간 흔들어 준 다음 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, TAT-항-IsaA F10 scFv를 0.1, 1, 10, 50, 100, 200 ppm 농도로 처리했을 때, 200 ppm 농도까지 세포모양 변형 및 세포 생존율의 변화가 거의 없음을 확인하였다. 따라서, TAT-항-IsaA F10 scFv 항체의 200 ppm 농도까지는 세포 독성이 없는 물질임을 알 수 있었다.
TAT-항- IsaA F10 scFv
농도 (ppm) 평균 오차
0 100.00 0.396
0.1 102.55 2.479
1 103.15 1.697
10 102.80 9.219
50 95.61 2.118
100 101.87 2.242
200 105.86 3.197
< 실시예 8> 세포투과성 항- IsaA F10 scFv의 황색포도상구균 항균력 시험
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 성장에 대한 TAT-항-IsaA F10 scFv 항체의 효과를 알아보았다. 균주를 TSB 배지(Tryptic soy broth)에 접종하여 OD 0.1이 될 때까지 배양한 후 100ppm의 TAT-항-IsaA F10 scFv 항체를 처리하였다. 37℃에서 24 시간 배양하면서 시간대별로 600 nm에서 흡광도를 측정하여, 황색포도상구균의 성장능을 조사하였다. 음성대조구로 Lactobacillus rhamnosus를 이용하였다. TAT-항-IsaA F10 scFv는 황색포도상구균의 성장을 저해하는 것을 확인하였다(도 6).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> HAUUL BIO <120> Anti-IsaA F10 antibody inhibiting Staphylococcus aureus and use thereof <130> DP-2019-0269 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <400> 1 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asn Val Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 <400> 2 Ala Asn Ser Gln 1 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 <400> 3 Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <400> 4 Gly Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 <400> 5 Val Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 <400> 6 Lys Val Arg Arg Val Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 8 tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgc 33

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-IsaA F10 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  4. 제3항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현벡터로 형질전환되어 분리된 세포.
  6. 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 IsaA 항원 검출용 조성물.
  7. 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물.
  8. 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 억제용 항균 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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