GR1010289B - Τοξοειδη πεπτιδια που προερχονται απο διαλυτη σε φαινολη μοδουλινη, τοξινη δελτα, υπεραντιγονα και συντηξεις αυτων - Google Patents

Abstract

Η παρούσα αποκάλυψη παρέχει ανοσογόνες συνθέσεις χρήσιμες στην πρόληψη και αγωγή της λοίμωξης από Staphylococcus aureus. Ειδικότερα, η αποκάλυψη παρέχει τοξίνη δέλτα και πεπτίδια μοδουλίνης διαλυτά σε φαινόλη καθώς και μεταλλαγμένες μορφές, θραύσματα, παραλλαγές ή παράγωγα αυτών. Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω πολυσθενή ολιγοπεπτίδια, πρωτεΐνες σύντηξης που περιλαμβάνουν δύο ή περισσότερες σταφυλοκοκκικές πρωτεΐνες, π.χ, DT, PSM, άλφα αιμολυσίνη, λευκοκιδίνη, υπεραντιγόνο, ή οποιαδήποτε θραύσματα, παραλλαγές, παράγωγα, ή μεταλλάγματα αυτών είναι συντηγμένα μεταξύ τους ως ένα ενιαίο πολυπεπτίδιο με οποιαδήποτε σειρά.

Description

Περιγραφή :

ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΤΗΝ ΚΑΤΑΧΩΡΗΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ ΠΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΑ

ΙΣΤΟΡΙΚΟ

[0001] To Staphylococcus aureus (SA) είναι ένα Gram θετικό ανθρώπινο παθογόνο που προκαλεί ένα ευρύ φάσμα λοιμώξεων από λοιμώξεις του δέρματος και των μαλακών ιστών (SSTI) έως απειλητική για τη ζωή σήψη και πνευμονία. Πρόκειται για μια από τις κύριες αιτίες λοιμώξεων που συνδέονται με νοσοκομεία και κοινότητες παγκοσμίως (Barrio, et al., 2006, Microbes Infect, 8 (8):2068-2074; Brown, et al., 2009 Clin Microbiol Infect, 15 (2): 156-164; Colin, et al. 1994, Infect Immun, 62 (8):3184-3188). To φάσμα των παθολογιών αντανακλά τις ποικίλες ικανότητες του SA να ξεφύγει από την ανοσολογική απόκριση χρησιμοποιώντας μια πληθώρα παραγόντων μολυσματικότητας: τις υπεραντιγονικές τοξίνες και τις τοξίνες που σχηματίζουν πόρους, την πηκτινάση, τον καψιδιακό πολυσακχαρίτη, τις προσκολλητίνες, τις πρωτεάσες, τις εξωπρωτεΐνες αδρανοποίησης του συμπληρώματος και άλλους τροποποιητές της έμφυτης απόκρισης (Barrio, et al., 2006, Microbes Infect, 8 (8):2068-2074; Deurenberg and Stobberingh, 2008, Infect Genet Evol, 8 (6):747-763).

[0002] Από την πρώτη εμφάνισή του τη δεκαετία του 1960, ο ανθεκτικός στη μεθικιλλίνη SA (MRSA) έχει καταστεί ενδημικός σε εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης σε παγκόσμια κλίμακα (Diep, et al., 2006, J Infect Dis, 193 (11): 1495-1503). Από τη δεκαετία του 1990, προέκυψαν στελέχη του MRS Α που σχετίζονται με την κοινότητα (CA-MRSA) και αποτελούν σημαντική παγκόσμια πρόκληση (Bassetti, et al., 2009, Int J Antimicrob Agents, 34 Suppl 1 :S 15- 19; Bradley, 2005, Semin Respir Crit Care Med, 26 (6):643-649; Chambers, 2005, N. Engl J Med, 352 (14): 1485- 1487.). Η αλφααιμολυσίνη (α-τοξίνη, Hla) είναι ένας σημαντικός παράγοντας μολυσματικότητας στην πνευμονία SA και SSTI (Bubeck Wardenburg and Schneewind, 2008, J Exp Med, 205 (2):287-294; Kennedy, et al., 2010, J Infect Dis, 202 (7): 1050-1058). Πρόσφατα, βραχέα κυτταρολυτικά πεπτίδια που είναι γνωστά ως μοδουλίνες διαλυτές σε φαινόλη (PSM) αναγνωρίστηκαν ως οι βασικοί παράγοντες μολυσματικότητας που λύουν τα ουδετερόφιλα, την κύρια γραμμή άμυνας έναντι του S. aureus (Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 (12): 1510-1514). Ένα άλλο σχετικό κυτταρολυτικά βραχύ πεπτίδιο του σταφυλόκοκκου είναι γνωστό ως αιμολυσίνη δέλτα ή τοξίνη δέλτα (δ τοξίνη), ο βασικός δείκτης του συστήματος ανίχνευσης σημάτων επικοινωνίας (agr) του S. aureus (Novick, et al., 1993, EMBO J, 12 (10):3967-3975). Μια πρόσφατη επιδημιολογική μελέτη σε μια ομάδα ασθενών με βακτηριαιμία SA παρουσιάζει αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της πιθανότητας σήψης και των προϋπάρχοντων αντισωμάτων έναντι Hla, PSM-a3, καθώς και δ-τοξίνης (Adhikari, et al., 2012, J Infect Dis, 206 (6):915-923).

[0003] Τα σταφυλοκοκκικά υπεραντιγόνα (SAg) προκαλούν μαζική απελευθέρωση κυτοκινών και χημειοκινών, αυξημένη έκφραση και ενεργοποίηση μορίων προσκόλλησης, αυξημένο πολλαπλασιασμό Τ-κυττάρων και τελικά απόπτωση/ανεργία Τ-κυττάρων. Αυτή η ακολουθία συμβάντων μπορεί να κορυφωθεί με το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας (TSS), μια κατάσταση απειλητική για τη ζωή (Todd, et al., 1978, Lancet, 2 (8100):1116-1118) που χαρακτηρίζεται από εξάνθημα, υπόταση, πυρετό και πολυσυστηματική δυσλειτουργία (Bohach, et al., 1990, Crit Rev Microbiol, 17 (4):251-272.). Μια σημαντική πρόκληση στην ανάπτυξη πολυσθενών εμβολίων για τον S. aureus που περιλαμβάνουν υπεραντιγόνα είναι ότι υπάρχουν περισσότερα από 20 διαφορετικά SAg και ένα ευρύ φάσμα μεταβλητότητας στην παρουσία SAg σε κλινικά απομονωμένα στελέχη επειδή τα περισσότερα SE βρίσκονται σε κινητά γενετικά στοιχεία, όπως πλασμίδια ή νησίδες παθογένειας (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Κ (sek), (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Q seq), σε λυσιγόνους φάγους (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη A (sea), ή κασέτες ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά, όπως SCCmec (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Η (seh) (Omoe, et al., 2002, J Clin Microbiol, 40 (3):857-862). Με βάση μια εκτεταμένη βιβλιογραφική ανασκόπηση που περιλαμβάνει πάνω από 6000 κλινικά απομονωμένα στελέχη, τα πιο αντιπροσωπευτικά υπεραντιγόνα (Sag) φαίνεται να είναι η τοξίνη 1 του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) και η (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη C (SEC), ακολουθούμενη από τη (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη A (SEA), τη (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη D (SED) και τη (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB). Πιο πρόσφατες μελέτες δείχνουν την εμφάνιση της (σταφυλοκοκκικής εντεροτοξίνης Κ (SEK) και της σταφυλοκοκκικής εντεροτοξίνης Q (SEQ), κυρίως λόγω κυκλοφορίας του κλώνου US300. Εξασθενημένα τοξοειδή υπεραντιγόνα για την (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη (SEA), τη (σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB) και την TSST-1 έχουν σχεδιαστεί και εξεταστεί σε ζωικά μοντέλα τοξικής καταπληξίας. Αυτές οι μεταλλαγμένες μορφές είναι ανεπαρκείς για τη δέσμευση στην πρωτεΐνη MHC τάξης Π και ως εκ τούτου στερούνται υπεραντιγονικής δραστικότητας (αντικείμενο διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας 6,713,284; 6,399,332; 7,087,235; 7,750,132; 7,378,257, και 8,067,202). Ένα απλοποιημένο εμβόλιο τοξοειδούς υπεραντιγόνου που είναι ικανό να επάγει αντισώματα ευρείας εξουδετέρωσης είναι συνεπώς ιδιαίτερα απαραίτητο και πρακτικό στη συμπερίληψη σε ένα πολυσθενές εμβόλιο του S. aureus.

[0004] Διαλυτές σε Φαινόλη μοδουλίνες (PSM) και Δέλτα- Αιμολυσίνη (δ-τοξίνη): Το S. aureus εκκρίνει τέσσερα βραχέα ( ~ 20 αμινοξέα, α-τύπου) και δύο μακρύτερα (~40 αμινοξέα, β-τύπου) κυτταρολυτικά πεπτίδια, γνωστά ως διαλυτές σε φαινόλη μοδουλίνες (PSM) (Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 (12): 1510-1514). Επιπλέον, το SA παράγει δτοξίνη, η οποία είναι παρόμοια με τις PSM α-τύπου. Αυτά τα γονίδια εκφράζονται σε όλα τα στελέχη S. aureus υπό τον έλεγχο του συστήματος agr (Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 (12):1510-1514). Πρόσφατα, εντοπίστηκε επίσης μια νέα PSM (PSM-mec) στο κινητό γενετικό στοιχείο ανθεκτικότητας στη σταφυλοκοκκική μεθικιλλίνη SCCmec (Chatterjee, et al., 2011, PLoS One, 6 (12):e28781; Kaito, et al., 2011, PLoS Pathog, 7 (2) :e 1001267) υποδηλώνοντας ότι η οριζόντια μεταφορά αυτών των τοξινών μπορεί να συμβάλει στη λοιμογόνο δράση του MRSA. Οι PSM είναι λυτικές ως προς τα ουδετερόφιλα, την πρώτη γραμμή άμυνας του ξενιστή έναντι του SA (Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 ( 12): 1510- 1514). Περαιτέρω, πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα επί της αιμολυτικής δράσης της β-αιμολυσίνης (Cheung, et al., 2012, Microbes Infect, 14 (4):380-386). Ένας βασικός ρόλος των PSM στην παθογένεση έχει αποδειχθεί σε μοντέλα βακτηριαιμίας και SSTI ποντικών χρησιμοποιώντας μεταλλαγές απαλοιφής (Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 ( 12) : 1510- 1514) . Επιπλέον, μια πρόσφατη έκθεση υποδεικνύει έναν βασικό ρόλο των PSM στο σχηματισμό βιοφίλμ (Periasamy, et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (4): 1281-1286). Μεταξύ των PSM, η PSM-a3 διαδραματίζει τον σημαντικότερο ρόλο στην παθογένεση του S. aureus (Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 ( 12): 1510- 1514).

[0005] Η δ-τοξίνη κωδικοποιείται από το γονίδιο hid που εδράζεται εντός του μεταγράψου RNAIII του τόπου agr. To RNAIII είναι ρυθμιστικό RNA που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του συστήματος ανίχνευσης σημάτων επικοινωνίας του SA για την έκφραση διαφόρων γονιδίων μολυσματικότητας (Novick, 2003, Mol Microbiol, 48 (6): 1429- 1449; Novick, et al., 1993, EMBO J, 12 (10):3967-3975). Με την αυξημένη έκφραση του RNAIII, το επίπεδο της εξωκυτταρικής δ-τοξίνης αυξάνεται φθάνοντας σχεδόν το μισό της ποσότητας των συνολικών εξωπρωτεϊνών στην στατική φάση (Kreger, et al., 1971, Infect Immun, 3 (3):449-465). Η μεταλλαγμένη μορφή hid<-/->του στελέχους CA-MRSA MW2 παρουσίασε εξασθενημένη μολυσματικότητα σε ένα μοντέλο βακτηριαιμίας ποντικού (Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 (12): 1510- 1514). Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε, επίσης, ότι η δ-τοξίνη αυξάνει τον αριθμό των κυττάρων/το εμβαδό της μοναδιαίας αποικίας αναστέλλοντας την εξάπλωση των αποικιών, οδηγώντας σε παχύτερη γιγαντιαία αποικία και προάγει την διαμερισματοποίηση των αποικιών του SA οδηγώντας σε αποτελεσματική αποικιοποίηση (Omae, et al., 2012, J Biol Chem, 287 (19): 15570-15579). Συνεπώς, η δτοξίνη φαίνεται να ρυθμίζει τη φυσική κατάσταση των αποικιών του SA. Η δ-τοξίνη διαδραματίζει, επίσης, σημαντικό ρόλο στη διαφυγή του S. aureus από τα φαγοενδοσώματα των ανθρώπινων επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων παρουσία βητατοξίνης (Giese, et al., 2011, Cell Microbiol, 13 (2):316-329) δρώντας ως συνδιεγέρτης της οξειδωτικής έκρηξης των ανθρώπινων ουδετερόφιλων (Schmitz, et al., 1997, J Infect Dis, 176 (6): 1531-1537).

[0006] Αλφα αιμολυσίνη (Hla) του S. aureus: Οι τοξίνες που σχηματίζουν πόρους σχηματίζουν πόρους ολιγομερούς βήτα βαρελιού στη πλασματική μεμβράνη και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξάπλωση και την επιβίωση των βακτηρίων, στην διαφυγή του ανοσοποιητικού συστήματος και στην καταστροφή των ιστών. Η αλφατοξίνη του SA (Hla) (Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991, Microbiol Rev, 55 (4):733-751) στοχεύει πολλά κύτταρα όπως λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα και ερυθροκύτταρα (Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991, Microbiol Rev, 55 (4):733-751; McElroy, et al., 1999, Infect Immun, 67 (10):5541-5544). Αρκετά αποδεικτικά στοιχεία επικυρώνουν την Hla ως κύριο στόχο εμβολίου για την πρόληψη της λοίμωξης ή των επιπλοκών του S. aureus: i) η hla κωδικοποιείται από έναν χρωμοσωμικό καθοριστή (Brown and Pattee, 1980, Infect Immun, 30 (l):36-42) και εκφράζεται στα περισσότερα απομονωμένα στελέχη του SA (Aarestrup, et al., 1999, APMIS, 107 (4):425-430;Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991, Microbiol Rev, 55 (4):733-751; Husmann, et al., 2009, FEBS Lett, 583 (2):337-344; Shukla, et al., 2010, J Clin Microbiol, 48 (10):3582-3592); ii) Μια μερικώς εξασθενημένη Hla (H35L) και αντισώματα έναντι της Hla προστατεύουν τα ποντίκια έναντι πνευμονίας και λοιμόξεων του δέρματος από SA (Kennedy, et al., 2010, J Infect Dis, 202 (7):1050-1058; Bubeck Wardenburg and Schneewind, 2008, J Exp Med, 205 (2):287-294; Ragle and Bubeck Wardenburg, 2009, J Infect Dis, 176 (6): 1531-1537); iii) Αντισώματα έναντι της H35L προστατεύουν τα ποντίκια από τοξίνες και προστατεύουν μερικώς έναντι βακτηριακής πρόκλησης (Menzies and Kernodle, 1996; Infect Immun, 64 (5): 1839-1841). Ενώ η μεταλλαγή Η35 καταργεί σε μεγάλο βαθμό τη λυτική δραστικότητα της Hla, μια σημειακή μεταλλαγή δεν θεωρείται επαρκώς ασφαλής για να αναπτυχθεί ως εμβόλιο για ανθρώπινη χρήση.

[0007] Το έγγραφο WO 2012/109167Α1 περιγράφει ένα ορθολογικά σχεδιασμένο μεταλλαγμένο εμβόλιο για την Hla που αναφέρεται ως ΑΤ62. Η ανοσοποίηση των ποντικών με ΑΤ62 προστατεύει τα ζώα έναντι θανατηφόρας σήψης και πνευμονίας από το S. aureus (Adhikari, et al., 2012, PLoS One, 7 (6):e38567). Περαιτέρω, αντισώματα που αναπτύχθηκαν έναντι ΑΤ62 προστάτευαν τα ποντίκια από τη θανατηφόρα σήψη που προκαλείται από το S. aureus (Adhikari, et al., 2012, PLoS One, 7 (6):e38567).

[0008] Λευκοκιδίνη Panton- Valentine (PVL): H PVL είναι μέλος μιας οικογένειας κυτταρολυτικών τοξινών δύο συστατικών γνωστών ως λευκοτοξίνες που παράγονται από αρκετές σειρές CA-MRSA (Diep and Otto, 2008, Trends Microbiol, 16 (8):361-369). Oi αιμολυσίνες και οι λευκοτοξίνες δύο συστατικών, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη σταφυλοκοκκική διαφυγή του ανοσοποιητικού συστήματος. Αυτές οι τοξίνες καταστρέφουν βασικά ανοσοκύτταρα και προκαλούν καταστροφή των ιστών, εξασθενίζοντας συχνά τον ξενιστή κατά τη διάρκεια του πρώτου σταδίου της λοίμωξης και προωθώντας τη διάδοση των βακτηρίων και την μεταστατική ανάπτυξη σε μακρινά όργανα. Τα δύο PVL συστατικά LukS-PV και LukF-PV εκκρίνονται ξεχωριστά και σχηματίζουν το οκταμερές σύμπλοκο σχηματισμού πόρων κατά τη δέσμευση του LukS-PV στον υποδοχέα του και την επακόλουθη δέσμευση του LukF-PV στο LukS-PV (Miles, et al., 2002, Protein Sci, 11 (4):894-902; Pedelacq, et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (4): 1281-1286). Οι στόχοι των PVL είναι πολυμορφοπύρηνα φαγοκύτταρα (ΡΜΝ), μονοκύτταρα και μακροφάγα. Επιδημιολογικά, η PVL σχετίζεται με πρωτογενείς λοιμώξεις του δέρματος, όπως η φουρουνκούλωση και η σοβαρή νεκρωτική πνευμονία που εξελίσσεται γρήγορα σε σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας. Ο ρόλος της PVL σε λοιμώξεις του δέρματος, των οστών και των πνευμόνων έχει αποδειχθεί σε ζωικά μοντέλα (Brown, et al., 2009 Clin Microbiol Infect, 15 (2): 156-164; Cremieux, et al., 2009, PLoS ONE, 4 (9):e7204; Diep, et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A, 107 (12):5587-5592; Tseng, et al., 2009 PLoS ONE, 4 (7):e6387; Varshney, et al., 2010, J Infect Dis l;201(l):92-6). To PVL-Θετικό CA-MRSA επηρεάζει υγιή παιδιά ή νεαρούς ενήλικες που δεν είχαν καμία πρόσφατη επαφή με εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης ούτε με τυχόν παράγοντα κινδύνου με θνησιμότητα έως και 75% (Gillet, et al., 2002, Lancet, 359 (9308):753-759; Lina, et al., 1999, Clin Infect Dis, 29 (5): 1128- 1132).

[0009] Η αίτηση PCT Υπ’ Ap. WO/2013/082558 αποκαλύπτει ορθολογικά σχεδιασμένες μεταλλαγμένες μορφές εμβολίου για LukS-PV και LukF-PV. Η ανοσοποίηση των ποντικών με αυτές τις μεταλλαγμένες μορφές προστατεύει τα ζώα έναντι θανατηφόρας σήψης του S. aureus (Adhikari, et al., 2013, PLoS One, 8 (6):e65384). Περαιτέρω, αντισώματα που αναπτύχθηκαν έναντι της μεταλλαγμένης μορφής LukS-PV προστάτευαν τα ποντίκια από τη θανατηφόρα σήψη που προκαλείται από το S. aureus (Karauzum, et al., 2013, PLoS ONE, 8 (6):e65384).

[0010] Εντεροτοξίνες του Staphylococcus aureus: Τα υπεραντιγόνα (SAg) αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια πυρετογόνων τοξινών που αποτελούνται από σταφυλοκοκκικές εντεροτοξίνες (SE) και την τοξίνη 1 του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) (Johns and Khan, 1988, J Bacteriol, 170 (9):4033-4039). Σε αντίθεση με τα συμβατικά αντιγόνα που υφίστανται πρωτεολυτική επεξεργασία από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και παρουσιάζονται ως σύμπλοκα MHC/πεπτιδίου σε Τ-κύτταρα, τα SAg διασυνδέουν TCR με MHC Τάξης II και ενεργοποιούν έως και 30% των Τ-κυττάρων (Choi, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A, 86 (22):8941-8; Marrack and Kappler, 1990, Science, 248 (4959): 1) οδηγώντας σε μαζική απελευθέρωση κυτοκινών και χημειοκινών, αυξημένη έκφραση καθώς και ενεργοποίηση μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, αυξημένο πολλαπλασιασμό Τ-κυττάρων και τελικά απόπτωση/ανεργία Τ-κυττάρων. Αυτή η ακολουθία συμβάντων μπορεί να κορυφωθεί με το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας (TSS), μια κατάσταση απειλητική για τη ζωή (Todd, et al., 1978, Lancet, 2 (8100):1116-1118) που χαρακτηρίζεται από εξάνθημα, υπόταση, πυρετό και πολυσυστηματική δυσλειτουργία (Bohach, et al., 1990, Crit Rev Microbiol, 17 (4):251-272). Τα αντισώματα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην προστασία έναντι του TSS (Bonventre, et al., 1984, J Infect Dis, 150 (5):662-666; Notermans, et al., 1983, J Clin Microbiol, 18 (5): 1055-1060), συνεπώς άτομα που δεν υφίστανται ορομετατραπή στην προσβλητική τοξίνη λόγω υποαντιδραστικών Τ-κυττάρων (Mahlknecht, et al., 1996, Hum Immunol, 45 (1):42-4) ή/και εξαρτώμενης από Τ-κύτταρα Β-κυτταρικής απόπτωσης (Hofer, et al., 1996, Proc Natl Acad Sci U S A, 93 (11):5425-5430) είναι πιο πιθανό να παρουσιάσουν επαναλαμβανόμενες εκρήξεις. Η κλωνική εξάλειψη των CD4 Τ-κυττάρων μπορεί περαιτέρω να μειώσει την αποτελεσματική απόκριση των αντισωμάτων σε άλλα αντιγόνα του S. aureus. Επιπλέον, σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις που δεν προκαλούν TSS τα SAg επιδρούν στη μολυσματικότητα των στελεχών του S. aureus μέσω επαγωγής μιας τοπικής υπερβολικής φλεγμονώδους απόκρισης. Έχουν αναπτυχθεί εξασθενημένες μεταλλαγμένες μορφές των SE και TSST-1 οι οποίες είναι ανεπαρκείς ως προς τη δέσμευση στα μόρια MHC-τάξης II. Αυτές οι μεταλλαγμένες μορφές μπορεί να χρησιμεύσουν ως εμβόλιο για λοιμώξεις από τον S. aureus καθώς και για το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας επάγοντας αντισώματα εξουδετέρωσης έναντι των υπεραντιγόνων.

[0011] Το έγγραφοWO 2000/02523 αποκαλύπτει ένα μόριο ανασυνδυασμένου DNA που περιλαμβάνει ένα ρεπλικόνιο VEE και μια αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί μεταλλαγμένες εξωτοξίνες Α και Β του Staphylococcus aureus. Το έγγραφο ΕΡ 2 011 877 αποκαλύπτει μεθόδους για την παροχή ενός διαμορφωτή σηματοδότησης Τ-κυττάρων σε ένα αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο. Η προσέγγιση στόχευσης που αποκαλύπτεται στο έγγραφο ΕΡ 2 011 877 χρησιμοποιεί το πρότυπο δέσμευσης του μείζονος συμπλόκου ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξης Π από ένα υπεραντιγόνο συζευγμένο με έναν διαμορφωτή της οδού σηματοδότησης Notch.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

[0012] Σε μία άποψη, η αποκάλυψη παρέχει ένα ανασυνδυασμένο πεπτίδιο το οποίο μπορεί να περιλαμβάνει ένα πεπτίδιο τοξίνης δέλτα του Staphylococcus aureus ή μια μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτού (DT), ένα διαλυτό σε φαινόλη πεπτίδιο μοδουλίνης του Staphylococcus aureus ή μια μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτού (PSM), ή μια σύντηξη ενός DT και ενός PSM, όπου το πεπτίδιο είναι εξασθενημένο σε σχέση με το άγριου τύπου DT, PSM ή και τα δύο και όπου το πεπτίδιο μπορεί να προκαλέσει ανοσολογική απόκριση έναντι του Staphylococcus aureus όταν χορηγηθεί σε ένα υποκείμενο. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, οι επιφανειοδραστικές ιδιότητες του DT, PSM ή και των δύο, μειώνονται, ενώ διατηρείται η ανοσογονικότητα. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η υδροφοβικότητα μειώνεται ενώ διατηρείται η αλφα-ελικοειδής δομή του πεπτιδίου. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα υδρόφοβο αμινοξύ που αντικαθίσταται με ένα λιγότερο υδρόφοβο αμινοξύ, για παράδειγμα, βαλίνη (V), λεύκινη (L), ισολευκίνη (I), φαινυλαλανίνη (F), ή μεθειονίνη (Μ) μπορεί να αντικατασταθεί με γλυκίνη ή αλανίνη.

[0013] Η αποκάλυψη παρέχει ένα DT που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων MAQDX5X6STX9GDXi2X13KWX16X17DTX20NKFTKK (SEQ ID NO: 39), όπου τουλάχιστον ένα από τα X Χ5, Χ6, Χ9, Χ12, Χ13, Χ16, Χ17, ή Χ20περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 1 και όπου το Χ5είναι ισολευκίνη (I), γλυκίνη (G) ή αλανίνη (Α), το Χ6είναι I, G, ή Α, το Χ9είναι I, G, ή Α, το Χ12είναι λεύκινη (L), G, ή V, το Χ13είναι βαλίνη (V), G, ή Α, το Χ16είναι I, G, ή Α, το Χ17είναι I, G, ή Α και το Χ2ο είναι V, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 2. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 4. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 3. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 5.

[0014] Η αποκάλυψη περαιτέρω παρέχει PSM που μπορεί να είναι PSMal, PSMa2, PSMα3, PSMα4, PSMβ1, PSMβ2, PSM-mec, ή οποιοσδήποτε συνδυασμός δύο ή περισσότερων PSM.

[0015] Η αποκάλυψη παρέχει μια μεταλλαγμένη μορφή PSMal που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων X1GX3X4AGX7X8KX10X11KSX14X15EQX18TGK (SEQ ID NO: 40), όπου τουλάχιστον ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15, ή Χ18περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 38 και όπου το Χ1είναι μεθειονίνη (Μ), G, ή Α, το Χ3είναι I, G, ή Α, το Χ4είναι I, G, ή Α, το Χ7είναι I, G, ή Α, το Xg είναι I, G, ή Α, το Χ10είναι V, G, ή Α, το Χπ είναι I, G, ή Α, το Χ14είναι L, G, ή Α, το Χ15είναι I, G, ή Α και το X18είναι F, G, ή A. Η αποκάλυψη παρέχει μια μεταλλαγμένη μορφή PSMa2 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων X1GX3X4AGX7X8KX10X11KGX14X15EKX18TGK (SEQ ID NO: 41), όπου τουλάχιστον ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, ή X18περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 12 και όπου το Χ1είναι Μ, G, ή Α, το Χ3είναι I, G, ή Α, το Χ4είναι I, G, ή Α, το Χ7είναι I, G, ή Α, το Xg είναι I, G, ή Α, το Χ10είναι F, G, ή Α, το Χ11είναι I, G, ή Α, το Χ14είναι L, G, ή Α, το Χ15είναι I, G, ή Α και το X18είναι F, G, ή A. Η αποκάλυψη παρέχει μια μεταλλαγμένη μορφή PSMα3 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων X1EX3X4AKX7X8KX10X11KDX14X15GKX18X19GNN (SEQ ID NO: 42), όπου τουλάχιστον ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χι4, X15, X18, ή Χ19περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 6 και όπου το Χι είναι Μ, G, ή Α, το Χ3είναι F, G, ή Α, το Χ4είναι V, G, ή Α, το Χ7είναι L, G, ή Α, το Xg είναι F, G, ή Α, το Χ10είναι F, G, ή Α, το Χ11είναι F, G, ή Α, το Χ14είναι L, G, ή Α, το X15είναι L, G, ή Α, το X19είναι F, G, ή Α και το Χ19είναι L, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 7. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 9. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 8. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 10. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 11. Η αποκάλυψη παρέχει μια μεταλλαγμένη μορφή PSMa4 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων X1AX3X4GTX7X8KX10X11KAX14X15DX17X18AK (SEQ ID NO: 43), όπου τουλάχιστον ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, Χ17, ή X18περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 14 και όπου το Χ1είναι Μ, G, ή Α, το Χ3είναι I, G, ή Α, το Χ4είναι V, G, ή Α, το Χ7είναι I, G, ή Α, το X8είναι I, G, ή Α, το Χ10είναι I, G, ή Α, το Χ11είναι I, G, ή Α, το Χ14είναι I, G, ή Α, το Χ15είναι I, G, ή Α, το Χ17είναι I, G, ή Α και το X18είναι F, G, ή A. Η αποκάλυψη παρέχει μια μεταλλαγμένη μορφή PSMβ1 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων MEGX4X5NAX8KDTX12TAAX16NNDGAKLGTSIVNIVENGVGLLSKLFGF (SEQ ID NO: 44), όπου τουλάχιστον ένα από τα Χ4, Χ5, X8, Χ12, ή Χ16περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 15 και όπου το Χ4είναι L, G, ή Α, το Χ5είναι F, G, ή Α, το Xg είναι I, G, ή Α, το Χ12είναι V, G, ή Α και το Χ16είναι I, G, ή A. Η αποκάλυψη παρέχει μια μεταλλαγμένη μορφή PSMβ2 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων MTGX4AEAX8ANTX12QAAQQHDSVKX23GTSIVDIVANGVGLLGKLFGF (SEQ ID NO: 45), όπου τουλάχιστον ένα από τα Χ4, X8, Χ12, ή Χ23περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 16 και όπου το Χ4είναι L, G, ή Α, το X8είναι I, G, ή Α, το Χ12είναι V, G, ή Α, και το Χ23είναι L, G, ή Α.

[0016] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο το οποίο περιλαμβάνει μια σύντηξη δύο ή περισσοτέρων πεπτιδίων που προέρχονται από Staphylococcus aureus, ή μεταλλαγμένων μορφών, θραυσμάτων, παραλλαγών, ή παραγώγων αυτών διατεταγμένων με οποιαδήποτε σειρά, όπου τα δύο ή περισσότερα πεπτίδια που προέρχονται από Staphylococcus aureus, ή μεταλλαγμένες μορφές, θραύσματα, παραλλαγές ή παράγωγα αυτών μπορεί να είναι τα ίδια ή διαφορετικά και όπου το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει δύο ή περισσότερα από: ένα άγριου τύπου DT, ή μεταλλαγμένο DT, π.χ., όπως περιγράφεται στο παρόν, ένα άγριου τύπου PSM, ή ένα μεταλλαγμένο PSM, π.χ. όπως περιγράφεται στο παρόν, ένα πολυπεπτίδιο άλφα αιμολυσίνης ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτού, ένα πολυπεπτίδιο λευκοκιδίνης ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτού, ή ένα πολυπεπτίδιο υπεραντιγόνου (SAg) ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτού.

[0017] Ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει ένα πολυπεπτίδιο άλφα αιμολυσίνης ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτού όπως η αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 46 (ΑΤ-62). Ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει μια υπομονάδα LukS-PV λευκοκιδίνης Panton-Valentine (PVL) όπως μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 90% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 47, μια υπομονάδα LukS-Mut9 (SEQ ID NO: 54), λευκοκιδίνης Panton-Valentine (PVL) όπως μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 90% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 48, μια υπομονάδα LukF-Mut-1 (SEQ ID NO: 55), ή ένα συνδυασμό αυτών. Ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει μια σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB) ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτής όπως μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 90% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 49, μια σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη A (SEA) ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτής όπως μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 90% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 50, μια σταφυλοκοκκική τοξίνη- 1 του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτής όπως μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 90% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 51, ή ένα συνδυασμό αυτών.

[0018] Ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει συνδέτες που συνδέουν τα δύο ή περισσότερα πεπτίδια που προέρχονται από Staphylococcus aureus ή μεταλλαγμένες μορφές, θραύσματα, παραλλαγές, ή παράγωγα αυτών που συνδέονται μέσω ενός συνδέτη. Ο συνδέτης μπορεί να περιλαμβάνει, π.χ., τουλάχιστον ένα, αλλά όχι περισσότερα από 50 αμινοξέα που επιλέγονται από την ομάδα που αποτελείται από γλυκίνη, σερίνη, αλανίνη και ένα συνδυασμό αυτών. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης ο συνδέτης περιλαμβάνει (GGGS)nή (GGGGS)n, όπου το η είναι ένας ακέραιος από 1 έως 10. Παραδειγματικά πολυσθενή ολιγοπεπτίδια που παρέχονται από την αποκάλυψη περιλαμβάνουν, χωρίς περιορισμό, την αλληλουχία αμινοξέων των SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, ή ένα συνδυασμό αυτών.

[0019] Οποιοδήποτε πεπτίδιο ή ολιγοπεπτίδιο παρέχεται από την αποκάλυψη μπορεί περαιτέρω να περιλαμβάνει ένα ετερόλογο πεπτίδιο ή πολυπεπτίδιο που περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, μια ετικέτα His, μια ετικέτα ουβικιτίνης, μια ετικέτα NusA, μια επικράτεια δέσμευσης χιτίνης, μια ετικέτα Β, μια ετικέτα HSB, πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), μια πρωτεΐνη δέσμευσης καλμοδουλίνης (CBP), μια πρωτεΐνη δέσμευσης γαλακτόζης, μια πρωτεΐνη δέσμευσης μαλτόζης (ΜΒΡ), επικράτειες δέσμευσης κυτταρίνης (CBD), μια ετικέτα αβιδίνης/στρεπταβιδίνης/Strep, trpE, ακετυλοτρανσφεράση χλωραμφαινικόλης, 1acZ (β-γαλακτοσιδάση), ένα πεπτίδιο FLAG™, μια ετικέτα S, μια ετικέτα Τ7, ένα θραύσμα οποιουδήποτε από τα ετερόλογα πεπτίδια, ή έναν συνδυασμό δύο ή περισσοτέρων από τα ετερόλογα πεπτίδια. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το ετερόλογο πεπτίδιο ή πολυπεπτίδιο περιλαμβάνει ένα ανοσογόνο, έναν επίτοπο Τ-κυττάρων, έναν επίτοπο Β -κυττάρων, ένα θραύσμα αυτού, ή ένα συνδυασμό αυτών.

[0020] Οποιοδήποτε πεπτίδιο ή ολιγοπεπτίδιο παρέχεται από την αποκάλυψη μπορεί περαιτέρω να περιλαμβάνει έναν ανοσογόνο υδατάνθρακα, π.χ., έναν σακχαρίτη. Ο ανοσογόνος υδατάνθρακας μπορεί να είναι ένας καψιδιακός πολυσακχαρίτης ή ένας επιφανειακός πολυσακχαρίτης. Ο ανοσογόνος υδατάνθρακας μπορεί να περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, τον καψιδιακό πολυσακχαρίτη (CP) οροτύπου 5 (CP5), τον CP8, την πολυ-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (PNAG), την πολυ-Ν-ηλεκτρινυλογλυκοζαμίνη (PNSG), το τειχοϊκό οξύ (WTA), το λιποτειχοϊκό οξύ (LTA), ένα θραύσμα οποιουδήποτε από τους ανοσογόνους υδατάνθρακες και ένα συνδυασμό δύο ή περισσότερων από τους ανοσογόνους υδατάνθρακες. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, ο ανοσογόνος υδατάνθρακας είναι συζευγμένος με το ολιγοπεπτίδιο.

[0021] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει ένα νουκλεϊκό οξύ οποιουδήποτε πεπτιδίου ή ολιγοπεπτιδίου παρέχεται στο παρόν και οποιοδήποτε συνδυασμό αυτών. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυνουκλεοτίδιο μπορεί να περιλαμβάνει περαιτέρω ένα ετερόλογο νουκλεϊκό οξύ, π.χ., έναν υποκινητή λειτουργικά συνδεδεμένο με το νουκλεϊκό οξύ που κωδικοποιεί το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, PSM, ή οποιονδήποτε συνδυασμό αυτών. Η αποκάλυψη παρέχει έναν φορέα ο οποίος περιλαμβάνει το πολυνουκλεοτίδιο που παρέχεται από την αποκάλυψη, π.χ., ένα πλασμίδιο. Η αποκάλυψη παρέχει ένα κύτταρο ξενιστή που περιλαμβάνει έναν φορέα που παρέχεται από την αποκάλυψη. Το κύτταρο ξενιστής μπορεί να είναι π.χ., ένα βακτήριο, π.χ., Escherichia coli, ένα κύτταρο εντόμου, ένα κύτταρο θηλαστικού ή ένα φυτικό κύτταρο.

[0022] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο παραγωγής ενός πολυσθενούς ολιγοπεπτιδίου, DT, PSM, ή οποιουδήποτε συνδυασμού αυτών όπως παρέχεται στο παρόν, που περιλαμβάνει καλλιέργεια του κυττάρου ξενιστή οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 61 έως 63 και ανάκτηση του ολιγοπεπτιδίου DT, PSM, ή οποιουδήποτε συνδυασμού αυτών.

[0023] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω μια σύνθεση η οποία περιλαμβάνει οποιοδήποτε πεπτίδιο, ολιγοπεπτίδιο, ή συνδυασμό αυτών που παρέχεται από την αποκάλυψη και έναν φορέα. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης η σύνθεση περιλαμβάνει περαιτέρω ένα ανοσοενισχυτικό το οποίο μπορεί να είναι, μεταξύ άλλων, στυπτηρία, υδροξείδιο του αργιλίου, φωσφορικό αργίλιο, ή ένα ανοσοενισχυτικό με βάση λιπίδια A γλυκοπυρανοζυλίου. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης η σύνθεση περιλαμβάνει περαιτέρω ένα ανοσογόνο το οποίο μπορεί να είναι, μεταξύ άλλων, ένα βακτηριακό αντιγόνο όπως μια τοξίνη που σχηματίζει πόρους, ένα υπεραντιγόνο, μια πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας, ένα θραύσμα οποιουδήποτε από τα βακτηριακά αντιγόνα, ή ένα συνδυασμός δύο ή περισσοτέρων βακτηριακών αντιγόνων.

[0024] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο επαγωγής ανοσολογικής απόκρισης ξενιστή έναντι του Staphylococcus aureus η οποία περιλαμβάνει τη χορήγηση σε ένα υποκείμενο που έχει ανάγκη ανοσολογικής απόκρισης μιας αποτελεσματικής ποσότητας της σύνθεσης της αποκάλυψης. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η ανοσολογική απόκριση είναι μια απόκριση αντισωμάτων, μια έμφυτη απόκριση, μια χυμική απόκριση, μια κυτταρική απόκριση και ένα συνδυασμός δύο ή περισσοτέρων ανοσολογικών αποκρίσεων. Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο πρόληψης ή αγωγής μιας σταφυλοκοκκικής, στρεπτοκοκκικής, ή εντεροκοκκικής ασθένειας ή λοίμωξης σε ένα υποκείμενο που περιλαμβάνει τη χορήγηση στο υποκείμενο που έχει ανάγκη αυτής της σύνθεσης της αποκάλυψης. Η λοίμωξη μπορεί να είναι π.χ., τοπική ή συστηματική λοίμωξη του δέρματος, των μαλακών ιστών, του αίματος, ή ενός οργάνου, ή μπορεί να είναι αυτοάνοσου χαρακτήρα. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η ασθένεια είναι μια αναπνευστική νόσος, π.χ., πνευμονία. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η ασθένεια είναι η σήψη.

[0025] Ένα υποκείμενο που υποβάλλεται σε αγωγή με τις μεθόδους της αποκάλυψης μπορεί να είναι ένα θηλαστικό, π.χ., ένας άνθρωπος, βοοειδές ή κυνοειδές. Η σύνθεση μπορεί να χορηγηθεί στο υποκείμενο μέσω ενδομυϊκής ένεσης, ενδοδερμικής ένεσης, ενδοπεριτοναϊκής ένεσης, υποδόριας ένεσης, ενδοφλέβιας ένεσης, από του στόματος χορήγησης, χορήγησης εκ του βλεννογόνου, ενδορινικής χορήγησης, ή πνευμονικής χορήγησης.

[0026] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο παραγωγής ενός εμβολίου έναντι της λοίμωξης από τον S. aureus που περιλαμβάνει: απομόνωση ενός πεπτιδίου ή ολιγοπεπτιδίου όπως παρέχεται από αυτή την αποκάλυψη, ή οποιουδήποτε συνδυασμού αυτών και το συνδυασμό του πεπτιδίου, ολιγοπεπτιδίου, ή οποιουδήποτε συνδυασμού αυτών με ένα ανοσοενισχυτικό.

ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΣΧΗΜΑ ΤΩΝ/ΣΧΕΔΤΩΝ

[0027]

Σχήμα 1: Α) Αναπαράσταση ελικοειδούς τροχού των PSM-a1-4, ΡSΜ-β1&2 και της δτοξίνης που δείχνει τις υδρόφοβες και υδρόφιλες επιφάνειες. Β) Στρατηγικές μεταλλαγών για την δ-τοξίνη και PSM-a3. Τα αμινοξέα L και V, συντηρημένα σε υδρόφοβες όψεις, αντικαθίστανται είτε με ala (Α) είτε με G1y (G) μεμονωμένα ή σε συνδυασμό (g1y-a1a). Η προβλεπόμενη μείωση της υδροφοβικότητας και της υδρόφοβης ροπής παρουσιάζεται για κάθε μεταλλαγμένη μορφή. Τα πολικά αμινοξέα αναπαρίστανται με κόκκινο (D, Ε: -φορτίο) και με μπλε (R, Κ: φορτίο), τα πολικά αμινοξέα με ροζ/ιώδες (Q, Ν, Τ), τα υδρόφοβα με κίτρινο (F, L, I) και αυτά που δεν διαταράσσουν την υδροφοβικότητα σημειώνονται με γκρι (Α) ή με πράσινο (Ρ) σε σχέση με την αρωματική πλευρική τους αλυσίδα. Γ) Αναπαράσταση ελικοειδούς τροχού του PSM-mec που δείχνει τις υδρόφοβες και υδρόφιλες επιφάνειες.

Σχήμα 2: Δοκιμασία τοξικότητας μεταλλαγμένων μορφών τοξίνης δέλτα. Εξετάστηκαν WT και μεταλλαγμένες μορφές σε συγκέντρωση 12.5 μg/ml σε διαφορετικό % RBC αλόγου. Τα OD της αιμόλυσης μετρήθηκαν στα 416 nm.

Σχήμα 3: Η μεταλλαγμένη μορφή DT-a1a2 είναι εξαιρετικά εξασθενημένη διατηρώντας παράλληλα τη δέσμευση στα ανθρώπινα αντισώματα εξουδετέρωσης (σύγκριση της 3<ης>και 7<ης>ράβδου).

Σχήμα 4: Δοκιμασία τοξικότητας μεταλλαγμένων μορφών PSM. Εξετάστηκαν WT και μεταλλαγμένες μορφές σε διαφορετική συγκέντρωση σε διαφορετικό 5 % RBC αλόγου. Τα OD της αιμόλυσης μετρήθηκαν στα 416 nm.

Σχήμα 5: Α) Σχηματική αναπαράσταση των τριών πρωτεϊνών σύντηξης που παράγονται με εύκαμπτους συνδέτες (G4S, που συμβολίζονται με L) και με μια ετικέτα 6xHis. Β) Σχηματική αναπαράσταση της δευτεροταγούς δομής του κατασκευάσματος AT62-DTPSM. Γ) Υποψήφια πεπτίδια εκφράστηκαν σε Ε. coli και εξετάστηκαν με στύπωμα Western με τη χρήση ενός ειδικού για ΑΤ62 mAb. Λωρίδες 1 και 2: AT62 DT PSM, 3 και 4: AT62 PSM, 5 και 6: AT62 DT (παρουσιάζονται δύο κλώνοι για κάθε κατασκεύασμα).

Σχήμα 6: Απόκριση αντισωμάτων ποντικών ανοσοποιη μενών με AT62-PSM και ΑΤ62-DT έναντι πεπτιδίων άγριου τύπου ή πλήρους μήκους άλφα αιμολυσίνης (Hla).

Σχήμα 7: Α) Σχηματική αναπαράσταση τριών πρωτεϊνών σύντηξης: ΑΤ-62, rSEB και DT που παράγονται με εύκαμπτους συνδέτες (G4S, που συμβολίζονται με L).

Σχήμα 8: Ανθρώπινα αντισώματα για SEA, SEB και TSST-1 καθαρίστηκαν μέσω συγγένειας από ανθρώπινο IVIG και χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες εξουδετέρωσης τοξινών με ανθρώπινα PBMC έναντι των S Ag που φαίνονται στους άξονες X. Ο άξονας Υ δείχνει τη γραμμομοριακή αναλογία αντισώματος προς τοξίνη που απαιτείται για 50% αναστολή της υπεραντιγονικής δραστικότητας του αντίστοιχου SAg στον άξονα X. Το πάνελ με τίτλο Κοκτέιλ δείχνει τη δραστικότητα του συνδυασμού των τριών αντισωμάτων. Να σημειωθεί ότι η χαμηλότερη γραμμομοριακή αναλογία υποδεικνύει υψηλότερη δραστικότητα εξουδετέρωσης προς την αντίστοιχη τοξίνη.

ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ

[0028] Η εφεύρεση ορίζεται από τις συνημμένες αξιώσεις. Οποιαδήποτε υλοποίηση δεν εμπίπτει στο πεδίο των συνημμένων αξιώσεων δεν αποτελεί μέρος της εφεύρεσης.

I. Ορισμοί

[0029] Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο όρος «ένας» ή «μία» οντότητα αναφέρεται σε μία ή περισσότερες από αυτές τις οντότητες- για παράδειγμα, «ένα πολυνουκλεοτίδιο», εννοείται ότι αναπαριστά ένα ή περισσότερα πολυνουκλεοτίδια. Ως εκ τούτου, οι όροι «ένας» (ή «μία»), «ένας ή περισσότερου) και «τουλάχιστον ένας» μπορεί να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά στο παρόν.

[0030] Επιπλέον, ο όρος «ή/και» όπου χρησιμοποιείται στο παρόν πρέπει να εννοηθεί ως συγκεκριμένη αποκάλυψη καθενός από τα δύο συγκεκριμένα χαρακτηριστικά ή συστατικά το ένα με ή χωρίς το άλλο. Συνεπώς, ο όρος «ή/καυ> όπως χρησιμοποιείται σε μια φράση όπως «Α ή/και Β» στο παρόν προορίζεται να περιλαμβάνει τα «Α και Β», «Α ή Β», «Α» (μεμονωμένα) και «Β» (μεμονωμένα). Παρομοίως, ο όρος «ή/και» όπως χρησιμοποιείται σε μια φράση όπως «Α, Β, ή/και Γ» προορίζεται να περιλαμβάνει κάθε μία από τις ακόλουθες υλοποιήσεις της αποκάλυψης: A, Β και Γ· A, Β, ή Γ· Α ή Γ· Α ή Β· Β ή Γ· Α και Γ· Α και Β· Β και Γ· Α (μεμονωμένα)· Β (μεμονωμένα)- και Γ (μεμονωμένα).

[0031] Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, όλοι οι τεχνικοί και επιστημονικοί όροι που χρησιμοποιούνται στο παρόν έχουν την ίδια σημασία όπως κοινώς κατανοείται από κάποιον με τη συνήθη εμπειρία στην τεχνική με την οποία σχετίζεται αυτή η αποκάλυψη. Για παράδειγμα, το Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press και το Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, παρέχουν στον ειδικό ένα γενικό λεξικό πολλών από τους όρους που χρησιμοποιούνται σε αυτή την αποκάλυψη.

[0032] Οι μονάδες, τα προθέματα και τα σύμβολα σημειώνονται με την αποδεκτή μορφή αυτών στο Διεθνές Σύστημα Μονάδων (SI). Τα αριθμητικά εύρη περιλαμβάνει τους αριθμούς που ορίζουν το εύρος. Εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, οι αλληλουχίες αμινοξέων γράφονται από αριστερά προς τα δεξιά σε προσανατολισμό αμινο- προς καρβοξυ-.

[0033] Όπου περιγράφονται οι υλοποιήσεις της αποκάλυψης με τον όρο «περιλαμβάνει», παρέχονται επίσης και άλλες ανάλογες υλοποιήσεις της αποκάλυψης που περιγράφονται με όρους «που αποτελείται από» ή/και «που αποτελείται ουσιαστικά από».

[0034] Τα αμινοξέα αναφέρονται στο παρόν με τα κοινώς γνωστά σύμβολα τριών γραμμάτων τους ή με τα σύμβολα ενός γράμματος που συνιστώνται από την Επιτροπή Βιοχημικής Ονοματολογίας IUPAC-IUB. Τα νουκλεοτίδια, επίσης, αναφέρονται με τους κοινώς αποδεκτούς κωδικούς ενός γράμματος αυτών.

[0035] Οι όροι «νουκλεϊκό οξύ» ή «θραύσμα νουκλεϊκού οξέος» αναφέρονται σε οποιοδήποτε ένα ή περισσότερα τμήματα νουκλεϊκού οξέος, π.χ., θραύσματα DNA ή RNA, παρόντα σε ένα πολυνουκλεοτίδιο ή κατασκεύασμα. Δύο ή περισσότερα νουκλεϊκά οξέα της αποκάλυψης μπορεί να είναι παρόντα σε ένα ενιαίο πολυνουκλεοτιδικό κατασκεύασμα, π.χ., σε ένα μεμονωμένο πλασμίδιο ή σε ξεχωριστά (μη ταυτόσημα) πολυνουκλεοτιδικά κατασκευάσματα, π.χ., σε ξεχωριστά πλασμίδια. Περαιτέρω, οποιοδήποτε νουκλεϊκό οξύ ή θραύσμα νουκλεϊκού οξέος μπορεί να κωδικοποιεί ένα μεμονωμένο πολυπεπτίδιο, π.χ., ένα μεμονωμένο αντιγόνο, κυτοκίνη ή ρυθμιστικό πολυπεπτίδιο, ή μπορεί να κωδικοποιεί περισσότερα από ένα πολυπεπτίδια, π.χ., ένα νουκλεϊκό οξύ μπορεί να κωδικοποιεί δύο ή περισσότερα πολυπεπτίδια. Επιπλέον, ένα νουκλεϊκό οξύ μπορεί να κωδικοποιεί ένα ρυθμιστικό στοιχείο όπως έναν υποκινητή ή έναν τερματιστή της μεταγραφής, ή μπορεί να κωδικοποιεί ένα εξειδικευμένο στοιχείο ή μοτίβο ενός πολυπεπτιδίου ή πρωτεΐνης, όπως ένα εκκριτικό πεπτίδιο σήμα ή μια λειτουργική επικράτεια.

[0036] Ο όρος «πολυνουκλεοτίδιο» προορίζεται να περιλάβει ένα μοναδικό νουκλεϊκό οξύ ή θραύσμα νουκλεϊκού οξέος καθώς επίσης και πολλά νουκλεϊκά οξέα ή θραύσματα νουκλεϊκών οξέων και αναφέρεται σε ένα απομονωμένο μόριο ή κατασκεύασμα, π.χ., ένα ιικό γονιδίωμα (π.χ., ένα μη-μολυσματικό ιικό γονιδίωμα), ένα αγγελιοφόρο RNA (mRNA), ένα πλασμιδικό DNA (pDNA), ή παράγωγα του pDNA (π.χ., μικροκυκλικό DNA όπως περιγράφεται στο (Darquet, Α-Μ et al., Gene Therapy 4:1341-1349, 1997) που περιλαμβάνει ένα πολυνουκλεοτίδιο. Ένα πολυνουκλεοτίδιο μπορεί να παρέχεται σε γραμμική (π.χ., mRNA), κυκλική (π.χ. πλασμίδιο), ή διακλαδισμένη μορφή, καθώς και σε δίκλωνες ή μονόκλωνες μορφές. Ένα πολυνουκλεοτίδιο μπορεί να περιλαμβάνει ένα συμβατικό φωσφοδιεστερικό δεσμό ή έναν μη συμβατικό δεσμό (π.χ., έναν αμιδικό δεσμό, όπως αυτός που ανευρίσκεται στα πεπτιδικά νουκλεϊκά οξέα (ΡΝΑ)).

[0037] Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος «πολυπεπτίδιο» προορίζεται να συμπεριλάβει ένα μοναδικό «πολυπεπτίδιο» καθώς επίσης και ένα πλήθος «πολυπεπτιδίων» και περιλαμβάνει οποιαδήποτε αλυσίδα ή αλυσίδες δύο ή περισσοτέρων αμινοξέων. Συνεπώς, όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ένα «πεπτίδιο», ένα «ολιγοπεπτίδιο», ένα «διπεπτίδιο», ένα «τριπεπτίδιο», μια «πρωτεΐνη», μια «αλυσίδα αμινοξέων», μια «αλληλουχία αμινοξέων», μια «πεπτιδική υπομονάδα», ή οποιοσδήποτε άλλος όρος χρησιμοποιείται για να αναφέρεται σε μια αλυσίδα ή αλυσίδες δύο ή περισσοτέρων αμινοξέων, συμπεριλαμβάνεται στον ορισμό ενός «πολυπεπτιδίου» (αν και καθένας από αυτούς τους όρους μπορεί να έχει μια πιο ειδική έννοια) και ο όρος «πολυπεπτίδιο» μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί, ή εναλλακτικά με οποιονδήποτε από αυτούς τους όρους. Ο όρος περιλαμβάνει περαιτέρω πολυπεπτίδια τα οποία έχουν υποβληθεί σε μετά- μεταφραστικές τροποποιήσεις, για παράδειγμα, γλυκοζυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση, αμιδίωση, παραγωγοποίηση από γνωστές προστατευτικές/παρεμποδιστικές ομάδες, πρωτεολυτική διάσπαση, ή τροποποίηση με μη φυσικά απαντώμενα αμινοξέα.

[0038] Οι όροι «τοξίνη δέλτα» ή «DT» όπως χρησιμοποιούνται στο παρόν και εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, περιλαμβάνουν πεπτίδια άγριου τύπου τοξίνης δέλτα καθώς και μεταλλαγμένες μορφές, θραύσματα, παραλλαγές ή παράγωγα αυτών. Οι όροι «διαλυτή σε φαινόλη μοδουλίνη», «PSM», PSMa1, PSMa2, PSMa3, PSMa4, PSMβ1, ΡSΜβ2 και PSM-mec όπως χρησιμοποιούνται στο παρόν και εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, περιλαμβάνουν πεπτίδια άγριου τύπου διαλυτής σε φαινόλη μοδουλίνης καθώς και μεταλλαγμένες μορφές, θραύσματα, παραλλαγές ή παράγωγα αυτών. Με τον όρο «αντίστοιχο DT άγριου τύπου» ή «αντίστοιχο PSM άγριου τύπου» εννοείται το φυσικό πεπτίδιο DT ή PSM από το οποίο προέκυψε η μεταλλαγμένη πεπτιδική υπομονάδα.

[0039] Ο όρος «πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο» όπως χρησιμοποιείται στο παρόν αναφέρεται σε μια πρωτεΐνη σύντηξης που περιλαμβάνει δύο ή περισσότερες σταφυλοκοκκικές πρωτεΐνες, π.χ., DT, PSM, άλφα αιμολυσίνη, λευκοκιδίνη, υπεραντιγόνο, ή οποιαδήποτε θραύσματα, παραλλαγές, παράγωγα, ή μεταλλάγματα αυτών είναι συντηγμένα μεταξύ τους ως ένα ενιαίο πολυπεπτίδιο με οποιαδήποτε σειρά. Ένα ολιγοπεπτίδιο μπορεί να περιλαμβάνει άλλα ετερόλογα πεπτίδια όπως περιγράφεται αλλού στο παρόν. Άλλα πεπτίδια που συμπεριλαμβάνονται σε ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο που παρέχεται στο παρόν περιλαμβάνουν διάφορες άλλες σταφυλοκοκκικές τοξίνες ή μεταλλαγμένες μορφές, θραύσματα, παραλλαγές, ή παράγωγα αυτών, που περιγράφονται αλλού στο παρόν ή στις Δημοσιεύσεις PCT Υπ’ Αρ. WO 2012/109167Α1 και WO 2013/082558 Α1.

[0040] Αυτή η αποκάλυψη παρέχει ειδικά πεπτίδια DT και PSM καθώς επίσης και πολυσθενή ολιγοπεπτίδια που μπορεί, αλλά όχι απαραίτητα, να περιλαμβάνουν είτε άγριου τύπου είτε μεταλλαγμένα DT, PSM, είτε οποιονδήποτε συνδυασμό αυτών. Η συλλογή των πεπτιδίων και των ολιγοπεπτιδίων που παρέχονται από την αποκάλυψη αναφέρεται συλλογικά στο παρόν ως ένα «πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM», ή ένα «πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, PSM, ή οποιοσδήποτε συνδυασμός αυτών». Αυτές οι συλλογικές αναφορές εννοείται ότι περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, οποιοδήποτε πεπτίδιο ή ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν, ή δύο, τρία, τέσσερα, ή περισσότερα πεπτίδια ή ολιγοπεπτίδια όπως παρέχονται στο παρόν.

[0041] Οι όροι «θραύσμα», «μετάλλαγμα», «παράγωγο», ή «παραλλαγή» όταν αναφέρονται σε ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM της παρούσας αποκάλυψης περιλαμβάνουν οποιοδήποτε πολυπεπτίδιο το οποίο διατηρεί τουλάχιστον κάποια ανοσογονικότητα ή την αντιγονικότητα της πρωτεΐνης ή των πρωτεϊνών προέλευσης. Θραύσματα πολυσθενών ολιγοπεπτιδίων, DT ή/και PSM όπως περιγράφονται στο παρόν περιλαμβάνουν πρωτεολυτικά θραύσματα, θραύσματα απαλοιφής ή θραύσματα που εμφανίζουν αυξημένη διαλυτότητα κατά τη διάρκεια της έκφρασης, του καθαρισμού ή/και της χορήγησης σε ένα ζώο. Θραύσματα πολυσθενών ολιγοπεπτιδίων, DT ή/και PSM όπως περιγράφονται στο παρόν περιλαμβάνουν περαιτέρω πρωτεολυτικά θραύσματα ή θραύσματα απαλοιφής που παρουσιάζουν μειωμένη παθογονικότητα ή τοξικότητα όταν χορηγούνται σε ένα υποκείμενο. Τα πολυπεπτιδικά θραύσματα περιλαμβάνουν περαιτέρω οποιοδήποτε τμήμα του πολυπεπτιδίου το οποίο περιλαμβάνει ένα αντιγονικό ή ανοσογόνο επίτοπο του πολυπεπτιδίου προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων γραμμικών καθώς και τρισδιάστατων επιτόπων.

[0042] Ένα «επιτοπικό θραύσμα» ενός πολυπεπτιδίου είναι ένα τμήμα του πολυπεπτιδίου που περιέχει ένα επίτοπο. Ένα «επιτοπικό θραύσμα» μπορεί, αλλά δεν χρειάζεται, να περιέχει μια αλληλουχία αμινοξέων πέρα από έναν ή περισσότερους επιτόπους.

[0043] Ο όρος «παραλλαγή», όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, αναφέρεται σε ένα πολυπεπτίδιο το οποίο διαφέρει από το αναφερόμενο πολυπεπτίδιο λόγω υποκαταστάσεων, απαλοιφών, ενθέσεων ή/και τροποποιήσεων αμινοξέων. Οι μηφυσικώς απαντώμενες παραλλαγές μπορεί να παραχθούν χρησιμοποιώντας τεχνικές μεταλλαξιγένεσης γνωστές στην τεχνική. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, τα παραλλαγμένα πολυπεπτίδια διαφέρουν από μια αναγνωρισμένη αλληλουχία με υποκατάσταση, απαλοιφή ή προσθήκη τριών αμινοξέων ή λιγότερων. Τέτοιες παραλλαγές μπορεί γενικά να ταυτοποιηθούν με τροποποίηση μιας πολυπεπτιδικής αλληλουχίας και αξιολόγηση των αντιγονικών ή παθογόνων ιδιοτήτων του τροποποιημένου πολυπεπτιδίου χρησιμοποιώντας, για παράδειγμα, τις αντιπροσωπευτικές διαδικασίες που περιγράφονται στο παρόν. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, παραλλαγές ενός πολυσθενούς ολιγοπεπτιδίου, DT, ή/και PSM σχηματίζουν ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο το οποίο είναι λιγότερο τοξικό από το σύμπλοκο άγριου τύπου.

[0044] Οι παραλλαγές πολυπεπτιδίων που αποκαλύπτονται στο παρόν παρουσιάζουν ταυτότητα αλληλουχίας τουλάχιστον περίπου 85%, 90%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ή 99.9% με το αναγνωρισμένο πολυπεπτίδιο. Οι παραλλαγές πολυπεπτιδίων μπορεί να περιλαμβάνουν συντηρητικές ή μη συντηρητικές υποκαταστάσεις αμινοξέων, απαλοιφές ή ενθέσεις. Οι παραλλαγές μπορεί να περιλαμβάνουν πολυσθενή ολιγοπεπτίδια, DT, ή/και PSM ταυτόσημα με τις διάφορες σταφυλοκοκκικές πρωτεΐνες άγριου τύπου εκτός από τουλάχιστον 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ή περισσότερες υποκαταστάσεις αμινοξέων, συμπεριλαμβανομένων των ειδικών μεταλλαγών που περιγράφονται αλλού στο παρόν, όπου οι υποκαταστάσεις καθιστούν το σύμπλοκο λιγότερο τοξικό από ένα αντίστοιχο σύμπλοκο πρωτεΐνης άγριου τύπου. Τα παράγωγα πολυσθενών ολιγοπεπτιδίων, DT ή/και PSM όπως περιγράφονται στο παρόν είναι πολυπεπτίδια τα οποία έχουν τροποποιηθεί έτσι ώστε να επιδεικνύουν επιπλέον χαρακτηριστικά τα οποία δεν απαντώνται στο φυσικό πολυπεπτίδιο. Παραδείγματα περιλαμβάνουν τις πρωτεΐνες σύντηξης. Το ανάλογο είναι μια άλλη μορφή ενός πολυσθενούς ολιγοπεπτιδίου, DT, ή/και PSM που περιγράφεται στο παρόν. Ένα παράδειγμα είναι μια πρόδρομη πρωτεΐνη που μπορεί να ενεργοποιηθεί με διάσπαση της προπρωτεΐνης ώστε να παραχθεί ένα δραστικό ώριμο πολυπεπτίδιο.

[0045] Οι παραλλαγές μπορεί επίσης, ή εναλλακτικά, να περιέχουν και άλλες τροποποιήσεις, όπου, για παράδειγμα, ένα πολυπεπτίδιο μπορεί να συζευχθεί ή να συνδεθεί, π.χ., να συντηχθεί με μια ετερόλογη αλληλουχία αμινοξέων, π.χ., μια αλληλουχία σήματος (ή οδηγού) στο Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης η οποία συνμεταφραστικά ή μετά- μεταφραστικά κατευθύνει τη μεταφορά της πρωτεΐνης. Το πολυπεπτίδιο μπορεί, επίσης, να συζευχθεί ή να παραχθεί συνδεδεμένο με έναν συνδέτη ή μια άλλη αλληλουχία για λόγους ευκολίας σύνθεσης, καθαρισμού ή ταυτοποίησης του πολυπεπτιδίου (π.χ., 6-His), ή για ενίσχυση της δέσμευσης του πολυπεπτιδίου σε ένα στερεό υπόστρωμα. Γ ια παράδειγμα, το πολυπεπτίδιο μπορεί να συζευχθεί ή να συνδεθεί σε μια περιοχή Fc ανοσοσφαιρίνης. Το πολυπεπτίδιο μπορεί, επίσης, να συζευχθεί ή να συνδεθεί σε μια αλληλουχία που προσδίδει ή ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση στο πολυπεπτίδιο (π.χ., έναν επίτοπο Τ-κυττάρων, έναν επίτοπο Β-κυττάρων, μια κυτοκίνη, μια χημειοκίνη, κλπ.) ή/και ενισχύει την πρόσληψη ή/και την επεξεργασία του πολυπεπτιδίου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα ή άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Το πολυπεπτίδιο μπορεί επίσης να συζευχθεί ή να συνδεθεί με άλλα πολυπεπτίδια/επιτόπους από το Staphylococcus sp. ή/και από άλλα βακτήρια ή/και άλλους ιούς για να δημιουργηθεί μια υβριδική ανοσογόνος πρωτεΐνη που μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με διάφορα ανοσοενισχυτικά μπορεί να προκαλέσει προστατευτική ανοσία σε άλλους παθογόνους οργανισμούς. Το πολυπεπτίδιο μπορεί, επίσης, να συζευχθεί ή να συνδεθεί με τμήματα τα οποία προσδίδουν μεγαλύτερη σταθερότητα ή βελτιώνουν την ημιζωή, όπως, μεταξύ άλλων, αλβουμίνη, περιοχή Fc ανοσοσφαιρίνης, πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) και τα συναφή. Το πολυπεπτίδιο μπορεί, επίσης, να συζευχθεί ή να συνδεθεί με τμήματα (π.χ., ανοσογόνους υδατάνθρακες, π.χ., έναν καψιδιακό πολυσακχαρίτη ή ένα επιφανειακό πολυσακχαρίτη) από το Staphylococcus sp. ή/και από άλλα βακτήρια ή/και άλλους ιούς για τη δημιουργία μιας τροποποιημένης ανοσογόνου πρωτεΐνης η οποία μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με ένα ή περισσότερα ανοσοενισχυτικά μπορεί να ενισχύσει και/ή να δράσει συνεργιστικά στην προστατευτική ανοσία. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το πολυπεπτίδιο που περιγράφεται στο παρόν περιλαμβάνει περαιτέρω έναν ανοσογόνο υδατάνθρακα. Σε μία υλοποίηση της αποκάλυψης, ο ανοσογόνος υδατάνθρακας είναι ένας σακχαρίτης.

[0046] Ο όρος «σακχαρίτης» σε όλη την έκταση αυτής της προδιαγραφής μπορεί να υποδεικνύει πολυσακχαρίτη ή ολιγοσακχαρίτη και περιλαμβάνει και τα δύο. Οι πολυσακχαρίτες της αποκάλυψης μπορεί να απομονωθούν από βακτήρια και μπορεί να αλλάξουν μέγεθος με γνωστές μεθόδους. Για παράδειγμα, οι πολυσακχαρίτες πλήρους μήκους μπορεί να «αλλάξουν μέγεθος» (π.χ., το μέγεθος τους μπορεί να μειωθεί με διάφορες μεθόδους όπως κατεργασία με όξινη υδρόλυση, κατεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου, αλλαγή μεγέθους με EMULSIFLEX® ακολουθούμενη από επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου για την παραγωγή θραυσμάτων ολιγοσακχαριτών ή μικρορευστοποίηση). Οι πολυσακχαρίτες μπορεί αλλάξουν μέγεθος ώστε να μειωθεί το ιξώδες σε δείγματα πολυσακχαριτών ή/και να βελτιωθεί η ικανότητα φιλτραρίσματος για συζευγμένα προϊόντα. Οι ολιγοσακχαρίτες έχουν χαμηλό αριθμό επαναλαμβανόμενων μονάδων ( π.χ ., 5-30 επαναλαμβανόμενες μονάδες) και είναι συνήθως υδρολυμένοι πολυσακχαρίτες. Οι πολυσακχαρίτες της αποκάλυψης μπορεί να παραχθούν με ανασυνδυασμό.

[0047] Τα καψιδιακά αντιγόνα του S. aureus συνδέονται με την επιφάνεια, περιορίζονται στην αντιγονική ειδικότητα και είναι εξαιρετικά συντηρημένα μεταξύ των κλινικά απομονωμένων στελεχών. Σε μία υλοποίηση της αποκάλυψης, ο ανοσογόνος υδατάνθρακας της αποκάλυψης είναι ένας καψιδιακός πολυσακχαρίτης (CP) του S. aureus. Σε μία υλοποίηση της αποκάλυψης, ένας καψιδιακός σακχαρίτης μπορεί να είναι ένας πολυσακχαρίτης πλήρους μήκους, ωστόσο σε άλλες υλοποιήσεις της αποκάλυψης μπορεί να είναι μία μονάδα ολιγοσακχαρίτη, ή μια αλυσίδα σακχαριτών επαναλαμβανόμενων μονάδων ολιγοσακχαριτών μικρότερη του φυσικού μήκους. Μελέτες οροτύπησης σταφυλοκοκκικών απομονωμένων στελεχών έχουν αποκαλύψει αρκετούς υποθετικούς καψιδιακούς οροτύπους, όπου οι τύποι 5 και 8 (CP5 και CP8) είναι οι πλέον διαδεδομένοι μεταξύ απομονωμένων στελεχών από κλινικές λοιμώξεις, αντιπροσωπεύοντας περίπου 25% και 50% των απομονωμένων στελεχών που ανακτώνται από τον άνθρωπο (O'Riordan and Lee, Clinical Microbiology Reviews, January 2004, p. 218-234, Vol. 17, No. 1; Poutrel and Sutra, J Clin Microbiol. 1993 Feb;31(2):467-9). Τα ίδια απομονωμένα στελέχη ανακτήθηκαν, επίσης, από πουλερικά, αγελάδες, άλογα και χοίρους (Tollersrud et al., J Clin Microbiol. 2000 Aug;38(8):2998-3003; Cunnion KM et al., Infect Immun. 2001 Nov;69(ll):6796-803). Οι καψιδιακοί πολυσακχαρίτες τύπου 5 και 8 που καθαρίζονται από τα πρωτότυπα στελέχη Reynolds και Becker, αντίστοιχα, είναι δομικά πολύ παρόμοιοι μεταξύ τους και με το καψίδιο που παράγεται από το στέλεχος Τ, που περιγράφεται προηγουμένως από τους Wu και Park (Wu and Park. 1971. J. Bacteriol. 108:874-884). Ο τύπος 5 έχει τη δομή (→ 4)-3-O-Acβ-D-ManΝΑcΑ-(1→)4)-α-L-FucΝΑc-(1→3)-β-D-FucΝΑc-(1→)n(Fournier, J. M., et al., 1987. Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 138:561-567; Moreau, M., et al., 1990. Carbohydr. Res. 201:285-297) και ο τύπος 8 έχει τη δομή (→ 3)-4-O-Ac-β-D-ManNAcA-(1→ 3)-a-L-FucNAc-(1→ 3)-β-D-FucNAc-(1→ )n(Fournier, J. M., et al., 1984. Infect.

Immun. 45:87-93). Οι πολυσακχαρίτες τύπου 5 και 8 διαφέρουν μόνο στους δεσμούς μεταξύ των σακχάρων και στις θέσεις Ο-ακετυλίωσης των καταλοίπων μαννοσαμινουρονικού οξέος, αλλά είναι ορολογικά διακριτοί.

[0048] Οι τύποι 5 και 8 CP συζευγμένοι με έναν αποτοξινωμένο ανασυνδυασμένο φορέα εξωτοξίνης A Pseudomonas aeruginosa αποδείχτηκε ότι είναι εξαιρετικά ανοσογόνοι και προστατευτικοί σε ένα μοντέλο ποντικού (A Fattom et al., Infect Immun. 1993 March; 61(3): 1023-1032; A Fattom et al., Infect Immun. 1996 May; 64(5): 1659-1665) και η παθητική μεταφορά των ειδικών για CP5 αντισωμάτων από τα ανοσοποιημένα ζώα οδήγησε σε προστασία έναντι συστηματικής λοίμωξης σε ποντίκια (Lee et al., Infect Immun. 1997 October; 65(10): 4146-4151) και έναντι ενδοκαρδίτιδας σε αρουραίους που έχουν προκληθεί με S. Aureus οροτύπου 5 (Shinefield Η et al., Ν Engl J Med. 2002 Feb 14;346(7):491-6). Χρησιμοποιήθηκε δισθενές συζευγμένο εμβόλιο CP5 και CP8 (StaphVAX®, Nabi Biopharmaceutical) που παρείχε 75% προστασία σε ποντίκια έναντι πρόκλησης με S. aureus. Το εμβόλιο έχει εξεταστεί σε ανθρώπους (Fattom Al et al., Vaccine. 2004 Feb 17;22(7):880-7; Maira-Litran T et al., Infect Immun. 2005 Oct;73(10):6752-62). Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το ανασυνδυασμένο πεπτίδιο ή το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο της αποκάλυψης συνδυάζεται ή συζεύγνυται με έναν ανοσογόνο υδατάνθρακα (π.χ., CP5, CP8, ένα θραύσμα CP ή έναν συνδυασμό αυτών).

[0049] Ανοσοποίηση με πολυ-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (PNAG) (McKenney D. et al., Science. 1999 May 28;284(5419): 1523-7) ή πολυ-Ν-ηλεκτρινυλογλυκοζαμίνη (PNSG) (Tuchscherr LP. et al., Infect Immun. 2008 Dec;76(12):5738-44. Epub 2008 Sep 22), και τα δύο επιφανειακά αντιγόνα του S. aureus, έχει δειχθεί ότι οδηγούν τουλάχιστον σε μερική προστασία έναντι πρόκλησης με S. aureus σε πειραματικά ζωικά μοντέλα. Η PNSG αναγνωρίστηκε ως η χημική μορφή του καψιδιακού πολυσακχαρίτη/προσκολλητίνης (PS/A) του S. epidermidis που εμπλέκεται στην προσκόλληση αρνητικών στην πηκτινάση σταφυλόκοκκων (CoNS) σε βιοϋλικά, χρησιμεύει ως καψίδιο για στελέχη CoNS που εκφράζουν PS/A και αποτελεί στόχο για προστατευτικά αντισώματα. Η PNSG παράγεται, επίσης, από τον S. aureus, όπου αποτελεί έναν περιβαλλοντικά ρυθμιζόμενο, in vivo εκφραζόμενο πολυσακχαρίτη επιφάνειας και χρησιμεύει με παρόμοιο τρόπο ως στόχος για προστατευτική ανοσία (McKenney D. et al., J. Biotechnol. 2000 Sept 29;83(l-2): 37-44). Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, ο ανοσογόνος υδατάνθρακας είναι ένας επιφανειακός πολυσακχαρίτης, π.χ., πολυ-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (PNAG), πολυ-Ν-ηλεκτρινυλογλυκοζαμίνη (PNSG), ένα θραύσμα επιφανειακού πολυσακχαρίτη ή ένας συνδυασμός αυτών.

[0050] Το τειχοϊκό οξύ (WTA) είναι ένας σημαντικός πολυσακχαρίτης που εκφράζεται ευρέως σε στελέχη S. aureus (Neuhaus, F.C. and J. Baddiley, Microbiol Mol Biol Rev, 2003. 67(4):686-723) και οι αντιοροί έναντι του WTA έχει αποδειχθεί ότι προκαλούν οψωνοφαγοκυτταρική θανάτωση μεμονωμένα και παρουσία συμπληρώματος ((Thakker, Μ., et al., Infect Immun, 1998. 66(11):5183-9) και Fattom et al, US Patent 7,754,225). To WTA συνδέεται με πεπτιδογλυκάνες και προεξέχει διαμέσου του κυτταρικού τοιχώματος καθιστώντας το εμφανώς εκτεθειμένο σε μη ενθυλακωμένα στελέχη όπως το USA300 που είναι υπεύθυνο για τις περισσότερες περιπτώσεις κοινοτικά αποκτούμενου MRSA (CA MRSA) στις ΗΠΑ (Hidron, Α.Ι., et al., Lancet Infect Dis, 2009. 9(6):384-92).

[0051] To λιποτειχοϊκό οξύ (LTA) είναι ένα συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των θετικών κατά Gram βακτηρίων, π.χ., Staphylococcus aureus. To LTA μπορεί να δεσμευθεί μη ειδικά σε κύτταρα στόχους μέσω μεμβρανικών φωσφολιπιδίων, ή ειδικά σε CD14 και σε υποδοχείς τύπου Toll. Το δεσμευμένο στο στόχο LTA μπορεί να αλληλεπιδράσει με τα κυκλοφορούντα αντισώματα και να ενεργοποιήσει τον καταρράκτη του συμπληρώματος για να οδηγήσει σε ένα φαινόμενο παθητικής ανοσολογικής θανάτωσης. Προκαλεί, επίσης, την απελευθέρωση από τα ουδετερόφιλα και τα μακροφάγα αντιδραστικών ριζών οξυγόνου και αζώτου, όξινων υδρολασών, εξαιρετικά κατιονικών πρωτεϊνασών, βακτηριοκτόνων κατιονικών πεπτιδίων, αυξητικών παραγόντων και κυτταροτοξικών κυτοκινών, τα οποία μπορεί να δράσουν συνεργιστικά για την ενίσχυση της κυτταρικής βλάβης.

[0052] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, ένας επιφανειακός πολυσακχαρίτης συνδυάζεται ή συζεύγνυται με ένα πολυπεπτίδιο της αποκάλυψης. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, ο επιφανειακός πολυσακχαρίτης είναι π.χ., η πολυ-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (PNAG), η πολυ-Ν-ηλεκτρινυλογλυκοζαμίνη (PNSG), το τειχοϊκό οξύ (WTA), το λιποτειχοϊκό οξύ (LPA), ένα θραύσμα οποιουδήποτε από τους εν λόγω πολυσακχαρίτες επιφάνειας, ή ένας συνδυασμός δύο ή περισσοτέρων από τους εν λόγω πολυσακχαρίτες επιφάνειας.

[0053] Ο όρος «ταυτότητα αλληλουχίας» όπως χρησιμοποιείται στο παρόν αναφέρεται σε μια σχέση μεταξύ δύο ή περισσοτέρων πολυνουκλεοτιδικών αλληλουχιών ή μεταξύ δύο ή περισσοτέρων πολυπεπτιδικών αλληλουχιών. Όταν μια θέση σε μία αλληλουχία καταλαμβάνεται από την ίδια βάση νουκλεϊκού οξέος ή αμινοξέος στην αντίστοιχη θέση της αλληλουχίας σύγκρισης, οι αλληλουχίες λέγεται ότι είναι «ταυτόσημες» σε αυτή τη θέση. Το ποσοστό «ταυτότητας αλληλουχίας» υπολογίζεται με τον προσδιορισμό του αριθμού των θέσεων στις οποίες εμφανίζεται η ταυτόσημη βάση νουκλεϊκού οξέος ή το αμινοξύ και στις δύο αλληλουχίες για να δώσει τον αριθμό των «ταυτόσημων» θέσεων. Ο αριθμός των «ταυτόσημων» θέσεων διαιρείται στη συνέχεια με τον συνολικό αριθμό των θέσεων στο παράθυρο σύγκρισης και πολλαπλασιάζεται με το 100 για να δώσει το ποσοστό της «ταυτότητας αλληλουχίας». Το ποσοστό της «ταυτότητας αλληλουχίας» προσδιορίζεται συγκρίνοντας δύο βέλτιστα στοιχισμένες αλληλουχίες σε ένα παράθυρο σύγκρισης και ένα ομόλογο πολυπεπτίδιο από ένα άλλο απομονωμένο στέλεχος. Προκειμένου να γίνει η βέλτιστη στοίχιση των αλληλουχιών για σύγκριση, το τμήμα μιας πολυνουκλεοτιδικής ή πολυπεπτιδικής αλληλουχίας στο παράθυρο σύγκρισης μπορεί να περιλαμβάνει προσθήκες ή απαλοιφές που ονομάζονται κενά ενώ η αλληλουχία αναφοράς διατηρείται σταθερή. Η βέλτιστη στοίχιση είναι εκείνη η στοίχιση η οποία, ακόμη και με κενά, παράγει τον μεγαλύτερο δυνατό αριθμό «ταυτόσημων» θέσεων μεταξύ των αλληλουχιών αναφοράς και σύγκρισης. Η ποσοστιαία «ταυτότητα αλληλουχίας» μεταξύ δύο αλληλουχιών μπορεί να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας την έκδοση του προγράμματος «BLAST 2 Sequences» που διατίθεται από το Εθνικό Κέντρο Βιοτεχνολογικών Πληροφοριών από την 1η Σεπτεμβρίου 2004, το οποίο πρόγραμμα ενσωματώνει τα προγράμματα BLASTN (για σύγκριση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων) και BLASTP (για τη σύγκριση αλληλουχιών πολυπεπτιδίων), τα οποία προγράμματα βασίζονται στον αλγόριθμο των Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Όταν χρησιμοποιείται το πρόγραμμα «BLAST 2 Sequences», οι παράμετροι που ήταν προεπιλεγμένες από την 1η Σεπτεμβρίου 2004, μπορεί να χρησιμοποιηθούν για το μέγεθος λέξεων (3), την ποινή ανοίγματος κενού (11), την ποινή επέκτασης κενού (1), την μείωση του κενού (50), την αναμενόμενη τιμή (10) και κάθε άλλη απαιτούμενη παράμετρο που περιλαμβάνει, αλλά δεν περιορίζεται στην επιλογή μήτρας.

[0054] Ο όρος «επίτοκος», όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, αναφέρεται σε τμήματα ενός πολυπεπτιδίου που έχουν αντιγονική ή ανοσογόνο δραστικότητα σε ένα ζώο, για παράδειγμα σε ένα θηλαστικό, για παράδειγμα, σε έναν άνθρωπο. Ένας «ανοσογόνος επίτοπος», όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ορίζεται ως ένα τμήμα μιας πρωτεΐνης που προκαλεί ανοσολογική απόκριση σε ένα ζώο, όπως προσδιορίζεται με οποιαδήποτε μέθοδο γνωστή στην τεχνική. Ο όρος «αντιγονικός επίτοπος», όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ορίζεται ως ένα τμήμα μιας πρωτεΐνης στο οποίο ένα αντίσωμα ή υποδοχέας Τ-κυττάρου μπορεί να δεσμευθεί ανοσοεπιλεκτικά στο αντιγόνο του, όπως προσδιορίζεται με οποιαδήποτε μέθοδο γνωστή στην τεχνική. Η ανοσοειδική δέσμευση αποκλείει τη μηειδική δέσμευση αλλά δεν αποκλείει απαραίτητα την διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλα αντιγόνα. Ενώ όλοι οι ανοσογόνοι επίτοποι είναι αντιγονικοί, οι αντιγονικοί επίτοποι δεν χρειάζεται να είναι ανοσογόνοι.

[0055] Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, μια «κωδικοποιούσα περιοχή» είναι ένα τμήμα νουκλεϊκού οξέος το οποίο αποτελείται από κωδικόνια που μεταφράζονται σε αμινοξέα. Αν και ένα «κωδικόνιο λήξης» (TAG, TGA, ή ΤΑΑ) δεν μεταφράζεται σε αμινοξύ, μπορεί να θεωρηθεί ως τμήμα μιας κωδικοποιούσας περιοχής, αλλά τυχόν πλευρικές αλληλουχίες, για παράδειγμα υποκινητές, θέσεις δέσμευσης ριβοσώματος, μεταγραφικοί τερματιστές και τα συναφή, βρίσκονται εκτός της κωδικοποιούσας περιοχής.

[0056] Ο όρος «βελτιστοποίηση κωδικονίου» ορίζεται στο παρόν ως τροποποίηση μιας αλληλουχίας νουκλεϊκού οξέος για ενισχυμένη έκφραση στα κύτταρα του ξενιστή ενδιαφέροντος με αντικατάσταση τουλάχιστον ενός, περισσοτέρων του ενός, ή ενός σημαντικού αριθμού, κωδικονίων της φυσικής αλληλουχίας με κωδικόνια που χρησιμοποιούνται πιο συχνά ή πλέον συχνά στα γονίδια αυτού του ξενιστή. Διάφορα είδη παρουσιάζουν ιδιαίτερη μεροληψία για ορισμένα κωδικόνια ενός συγκεκριμένου αμινοξέος.

[0057] Οι όροι «σύνθεση» ή «φαρμακευτική σύνθεση» μπορεί να περιλαμβάνουν συνθέσεις που περιέχουν ανοσογόνα πολυπεπτίδια της αποκάλυψης μαζί με π.χ., ανοσοενισχυτικά ή φαρμακευτικώς αποδεκτούς φορείς, έκδοχα, ή αραιωτικά, τα οποία χορηγούνται σε ένα άτομο που ήδη πάσχει από λοίμωξη από S. aureus ή σε ένα άτομο που έχει ανάγκη ανοσοποίησης έναντι λοίμωξης από S. aureus.

[0058] Ο όρος «φαρμακευτικώς αποδεκτός» αναφέρεται σε συνθέσεις οι οποίες, εντός του πεδίου της ορθής ιατρικής κρίσης, είναι κατάλληλες για επαφή με τους ιστούς ανθρώπων και ζώων χωρίς υπερβολική τοξικότητα ή άλλες επιπλοκές ανάλογες με μια λογική αναλογία οφέλους/κινδύνου. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, τα πολυπεπτίδια, πολυνουκλεοτίδια, συνθέσεις και εμβόλια που περιγράφονται στο παρόν είναι φαρμακευτικώς αποδεκτά.

[0059] Μια «αποτελεσματική ποσότητα» είναι εκείνη η ποσότητα της οποίας η χορήγηση σε ένα άτομο, είτε σε μια εφάπαξ δόση είτε ως μέρος μιας σειράς, είναι αποτελεσματική για αγωγή ή πρόληψη. Μια ποσότητα είναι αποτελεσματική, για παράδειγμα, όταν η χορήγησή της οδηγεί σε μειωμένη επίπτωση λοίμωξης από S. aureus σε σχέση με ένα άτομο χωρίς αγωγή, όπως προσδιορίζεται π.χ., μετά από μόλυνση ή πρόκληση με μολυσματικό S. aureus, που περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, μειωμένη βακτηριαιμία, μειωμένη τοξαιμία, μειωμένη σηψαιμία, μειωμένα συμπτώματα, αυξημένη ανοσολογική απόκριση, τροποποιημένη ανοσολογική απόκριση, ή μειωμένο χρόνο ανάκτησης. Η ποσότητα αυτή ποικίλλει ανάλογα με την υγεία και τη φυσική κατάσταση του ατόμου που πρόκειται υποβληθεί σε αγωγή, την ταξινομική ομάδα του ατόμου που πρόκειται να υποβληθεί σε αγωγή (π.χ., άνθρωπος, πρωτεύον πέραν του ανθρώπου, πρωτεύον, κλπ.), την ικανότητα απόκρισης του ανοσοποιητικού συστήματος του ατόμου, το βαθμό της επιθυμητής αγωγής ή προστασίας, τη φαρμακοτεχνική μορφή του εμβολίου, την επαγγελματική εκτίμηση της ιατρικής κατάστασης και άλλους συναφείς παράγοντες. Αναμένεται ότι η αποτελεσματική ποσότητα θα εμπίπτει σε ένα σχετικά ευρύ φάσμα που μπορεί να προσδιοριστεί μέσω δοκιμών ρουτίνας. Συνήθως, μια εφάπαξ δόση είναι από περίπου 10 pg έως 10 mg/kg βάρους σώματος καθαρισμένου πολυπεπτιδίου ή μια ποσότητα ενός τροποποιημένου οργανισμού ή ιού φορέα, ή ένα θραύσμα ή υπόλειμμα αυτών, επαρκές για την παροχή συγκρίσιμης ποσότητας ανασυνδυασμένα εκφραζόμενου πολυσθενούς ολιγοπεπτιδίου DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν. Ο όρος «πεπτιδικό εμβόλιο» ή «εμβόλιο υπομονάδας» αναφέρεται σε μια σύνθεση που περιλαμβάνει ένα ή περισσότερα πολυπεπτίδια που περιγράφονται στο παρόν, τα οποία όταν χορηγούνται σε ένα ζώο είναι χρήσιμα για την διέγερση μιας ανοσολογικής απόκρισης έναντι της σταφυλοκοκκικής λοίμωξης (π.χ., S. aureus).

[0060] Ο όρος «υποκείμενο» σημαίνει οποιοδήποτε υποκείμενο, ιδιαίτερα ένα θηλαστικό, για το οποίο είναι επιθυμητή η διάγνωση, η πρόγνωση, η ανοσοποίηση, ή η θεραπεία. Τα θηλαστικά περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, ανθρώπους, κατοικίδια ζώα, εκτρεφόμενα ζώα, ζώα ζωολογικού κήπου όπως αρκούδες, ζώα αθλημάτων, ζώα συντροφιάς όπως σκύλοι, γάτες, ινδικά χοιρίδια, κουνέλια, αρουραίοι, ποντίκια, άλογα, βοοειδή, αρκούδες, αγελάδες- πρωτεύοντα όπως πίθηκοι, μαϊμούδες, ουραγκοτάγκοι και χιμπατζήδες- κυνοειδή όπως σκυλιά και λύκοι- αιλουροειδή όπως γάτες, λιοντάρια και τίγρεις- ιπποειδή όπως άλογα, γαϊδούρια και ζέβρες- ζώα παραγωγής τροφίμων όπως αγελάδες, χοίροι και πρόβατα- οπληφόρα όπως ελάφια και καμηλοπαρδάλεις- τρωκτικά όπως ποντίκια, αρουραίοι, χάμστερ και ινδικά χοιρίδια- και ούτω καθεξής. Σε μία υλοποίηση της αποκάλυψης, το υποκείμενο είναι ένας άνθρωπος.

[0061] Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ένα «υποκείμενο που έχει ανάγκη αυτής» αναφέρεται σε ένα άτομο για το οποίο είναι επιθυμητή η αγωγή, δηλαδή, η πρόληψη, η θεραπεία, η επιβράδυνση, ή η μείωση της σοβαρότητας των συμπτωμάτων της σταφυλοκοκκικής νόσου (π.χ., S. aureus), ή η μη επιδείνωση της νόσου που προκαλεί ο S. aureus για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, ή και τα δύο.

[0062] Οι όροι «εκκίνηση» ή «πρωτογενής» και «ενίσχυση» ή «ενισχύοντας» όπως χρησιμοποιούνται στο παρόν αναφέρονται στις αρχικές και επακόλουθες ανοσοποιήσεις, αντίστοιχα, δηλαδή, σύμφωνα με τους ορισμούς που αυτοί οι όροι έχουν κανονικά στην ανοσολογία. Ωστόσο, σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, π.χ., όπου το συστατικό εκκίνησης και το συστατικό ενίσχυσης βρίσκονται σε μια ενιαία φαρμακοτεχνική μορφή, οι αρχικές και επακόλουθες ανοσοποιήσεις δεν είναι απαραίτητες καθώς και οι δύο συνθέσεις «εκκίνησης» και «ενίσχυσης» χορηγούνται ταυτόχρονα.

Π. Τοξίνη Δέλτα και Πεπτίδια Διαλυτής σε Φαινόλη Μοδουλίνης και Πολυσθενή Ολιγοπεπτίδια

[0063] Αυτή η αποκάλυψη παρέχει ανασυνδυασμένες ολιγοπεπτιδικές πρωτεΐνες σύντηξης που αποτελούνται από πεπτιδικές υπομονάδες προερχόμενες από σταφυλοκοκκικές τοξίνες και υπεραντιγόνα. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, ένα ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν περιλαμβάνει ένα μεταλλαγμένο ή άγριου τύπου πεπτίδιο τοξίνης δέλτα (DT) ή ένα μεταλλαγμένο ή άγριου τύπου πεπτίδιο διαλυτής σε φαινόλη μοδουλίνης (PSM). To DT άγριου τύπου και οι έξι μορφές του PSM παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

[0064] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η αποκάλυψη παρέχει ένα ανασυνδυασμένο πεπτίδιο που περιλαμβάνει ένα πεπτίδιο τοξίνης δέλτα του Staphylococcus ή μια μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτού (DT)· ένα πεπτίδιο διαλυτής σε φαινόλη μοδουλίνης του Staphylococcus ή μια μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτού (PSM)· ή σύντηξη ενός DT και ενός PSM. Ένα DT ή ένα PSM όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να μεταλλαχθεί για να μειώσει την τοξικότητα, π.χ., οι επιφανειοδραστικές ιδιότητες αυτού, διατηρώντας παράλληλα την αντιγονικότητα. Κατά συνέπεια, ένα ανασυνδυασμένο DT, PSM, ή και τα δύο όπως παρέχεται από αυτή την αποκάλυψη μπορεί να εξασθενίσει σε σχέση με το DT, PSM, άγριου τύπου, ή και τα δύο και το πεπτίδιο μπορεί να προκαλέσει ανοσολογική απόκριση έναντι του Staphylococcus aureus όταν χορηγηθεί σε ένα υποκείμενο. Η αντιγονικότητα των DT και PSM μπορεί να βασίζεται στη διατήρηση της άλφαελικοειδούς δομής του πεπτιδίου, όπου οι επιφανειοδραστικές ιδιότητες μπορεί να βασίζονται στην τοξίνη που έχει υδρόφοβη όψη. Συνεπώς, σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η αποκάλυψη παρέχει ένα DT, ένα PSM ή και τα δύο, όπου η υδροφοβικότητα του πεπτιδίου είναι μειωμένη σε σχέση με το πεπτίδιο άγριου τύπου. Για παράδειγμα, η υδροφοβικότητα μπορεί να μειωθεί αντικαθιστώντας τουλάχιστον ένα, π.χ., ένα, δύο, τρία, τέσσερα, πέντε ή περισσότερα υδρόφοβα αμινοξέα που συνιστούν την υδρόφοβη όψη της τοξίνης με λιγότερο υδρόφοβα αμινοξέα. Τα υδρόφοβα αμινοξέα περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, βαλίνη (V), λεύκινη (L), ισολευκίνη (I), φαινυλαλανίνη (F) και μεθειονίνη (Μ). Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, ένα υδρόφοβο αμινοξύ αντικαθίσταται με ένα μικρό αμινοξύ που δεν αναμένεται να μεταβάλλει την άλφα ελικοειδή δομή του πεπτιδίου. Για παράδειγμα, το υδρόφοβο αμινοξύ μπορεί να αντικατασταθεί με αλανίνη (Α) ή γλυκίνη (G).

[0065] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η αποκάλυψη παρέχει ένα ανασυνδυασμένο πεπτίδιο που περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη DT, όπου η DT περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων: MAQDX5X6STX9GDX12X13KWX16X17DTX20NKFTKK (SEQ ID NO: 39) Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χ5, Χ6, Χ9, Χ12, Χ13, Χ16, Χ17, ή Χ20περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 1. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η DT δεν είναι άγριου τύπου DT. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ5μπορεί να είναι ισολευκίνη (I), γλυκίνη (G) ή αλανίνη (Α), το Χ6μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ9μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ12μπορεί να είναι λεύκινη (L), G, ή V, το Χ13μπορεί να είναι βαλίνη (V), G, ή Α, το Χ16μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ17μπορεί να είναι I, G, ή Α και το Χ20μπορεί να είναι V, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ5, Χ6, Χ9, Χ12, X13, Χ16, Χ17, ή Χ20είναι υποκατεστημένο σε σχέση με την SEQ ID NO: 1. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ5, Χ6, Χ9, Χ12, Χ13, Χ16, Χ17, ή Χ20είναι G ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το Χ12είναι το μόνο υποκατεστημένο αμινοξύ. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ12μπορεί να είναι G, και το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 2, ή το Χ12μπορεί να είναι A και το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 4. Σε μία άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα από τα Χ5, Χ6, Χ9, Χ12, Χ13, Χ16, Χ17, ή Χ20είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 2. Για παράδειγμα, τα Χ12και Χ20μπορεί να υποκατασταθούν και μπορεί να είναι G ή Α. Συνεπώς, σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το Χ12μπορεί να είναι ανεξάρτητα G ή Α και το Χ20μπορεί να είναι ανεξάρτητα G ή Α. Για παράδειγμα, η DT μπορεί να περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 3, ή την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 5. Άλλες υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

[0066] Σε μια άλλη άποψη, η αποκάλυψη παρέχει ένα ανασυνδυασμένο πεπτίδιο που περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη PSM, π.χ., μεταλλαγμένη PSMα1, PSMα2, PSMα3, PSMα4, PSMβ1, PSMβ2, PSM-mec, ή οποιονδήποτε συνδυασμό δύο ή περισσοτέρων PSM.

[0067] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη PSMal που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων:

XIGX3X4AGX7X8KX10X11KSX14X15EQX18TGK (SEQ ID NO: 40) Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15, ή Χ18περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 38. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το PSMal δεν είναι PSMal άγριου τύπου. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ1μπορεί να είναι μεθειονίνη (Μ), G, ή Α, το Χ3μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ4μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ7μπορεί να είναι I, G, ή Α, το X8μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ10μπορεί να είναι V, G, ή Α, το Χ11μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ14μπορεί να είναι L, G, ή Α, το Χ15μπορεί να είναι I, G, ή Α και το X18μπορεί να είναι F, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15και X18είναι υποκατεστημένο σε σχέση με την SEQ ID NO: 38. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15, και X18είναι G ή Α. Σε μια άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα μεταξύ των Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, και X18είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 38. Διάφορες υποκαταστάσεις αμινοξέων σε PSMα1, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική, σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

[0068] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη PSMa2 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων:

X1GX3X4AGX7X8KX10Χ11KGX14Χ15EKX18TGK (SEQ ID NO: 41) Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15, ή X18περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 12. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η PSMα2 δεν είναι άγριου τύπου PSMα2. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ1μπορεί να είναι μεθειονίνη Μ, G, ή Α, το Χ3μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ4μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ7μπορεί να είναι I, G, ή Α, το X8μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ10μπορεί να είναι F, G, ή Α, το Χ11μπορεί να είναι I, G, ή Α, το 114μπορεί να είναι L, G, ή Α, το X15μπορεί να είναι I, G, ή Α και το X18μπορεί να είναι F, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15και X18είναι υποκατεστημένο σε σχέση με την SEQ ID NO: 12. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15, και X18είναι G ή Α. Σε μια άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα μεταξύ των Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, και X18είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 12. Διάφορες υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική, σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

[0069] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη PSMα3 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων:

X1EX3X4AKX7X8KX10X11KDX14X15GKX18X19GNN (SEQ ID NO: 42). Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χι, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, Χ18, ή Χ19περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 6. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η PSMα3 δεν είναι άγριου τύπου PSMα3. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ1μπορεί να είναι Μ, G, ή Α, το Χ3μπορεί να είναι F, G, ή Α, το Χ4μπορεί να είναι V, G, ή Α, το Χ7μπορεί να είναι L, G, ή Α, το X8μπορεί να είναι F, G, ή Α, το Χ10μπορεί να είναι F, G, ή Α, το Χπ μπορεί να είναι F, G, ή Α, το Χ14μπορεί να είναι L, G, ή Α, το Χ15μπορεί να είναι L, G, ή Α, το X18μπορεί να είναι F, G, ή Α, και το Χι9μπορεί να είναι L, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, Χ11, Χ14, X15, X18, και Χ19είναι υποκατεστημένο σε σχέση με την SEQ ID NO: 6. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14Χ15, Χ18και Χ19είναι G ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το Χ14είναι το μόνο υποκατεστημένο αμινοξύ. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ14μπορεί να είναι G, και το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 9, ή το Χ14μπορεί να είναι Α και το πεπτίδιο περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 7. Σε μία άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, X15, X18και Χ19είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 6. Για παράδειγμα, τα Χ4και Χ14μπορεί να υποκατασταθούν και μπορεί να είναι G ή Α. Συνεπώς, σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης το Χ4μπορεί να είναι ανεξάρτητα G ή Α και το Χ14μπορεί να είναι ανεξάρτητα G ή Α. Για παράδειγμα, η PSMα3 μπορεί να περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 8, την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 10, ή την αλληλουχία αμινοξέων της SEQ ID NO: 11. Άλλες υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

10070] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη PSMa4 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων:

X1AX3X4GTX7X8KX10X11KAX14X15DX17X18AK (SEQ ID NO: 43). Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χι, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, Χ17, ή Χ18περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 14. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η PSMα4 δεν είναι άγριου τύπου PSMα4. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ1μπορεί να είναι Μ, G, ή Α, το Χ3μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ4μπορεί να είναι V, G, ή Α, το Χ7μπορεί να είναι I, G, ή Α, το X8μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ10μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ11μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ14μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ15μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ17μπορεί να είναι I, G, ή Α και το X18μπορεί να είναι F, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, Χ17και X18είναι υποκατεστημένο σε σχέση με την SEQ ID NO: 14. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, Χ11, Χ14, X15, Χ17και X18είναι G ή Α. Σε μια άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα μεταξύ των Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, X11, Χ14, Χ15, Χ17και X18είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 14. Άλλες υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

[0071] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη ΡSΜβΙ που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων:

MEGX4X5NAX8KDTX12ΤAΑΧ16NNDGAKLGTSIVNIVENGVGLLSKLFGF (SEQ ID NO: 44). Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χ4, X5, X8, Χ12, ή Χ16περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 15. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η PSMβ1 δεν είναι άγριου τύπου ΡSΜβ1. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ4μπορεί να είναι L, G, ή Α, το Χ5μπορεί να είναι F, G, ή Α, το Χ8μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ12μπορεί να είναι V, G, ή Α και το Χ16μπορεί να είναι I, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ4, Χ5, Χ8, Χ12και Χ16είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ IDNO: 15. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ4, Χ5, X8, Χ12και Χ16είναι G ή Α. Σε μια άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα μεταξύ των Χ4, Χ5, X8, Χ12και Χ16είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 15. Άλλες υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

[0072] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη ΡSΜβ2 που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων:

MTGX4AEAX8ANTX12QAAQQHDSVKX23GTSIVDIVANGVGLLGKLFGF (SEQ ID NO: 45). Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χ4, X8, Χ12, ή Χ23περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 16. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η PSMβ2 δεν είναι άγριου τύπου ΡSΜβ2. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ4μπορεί να είναι L, G, ή Α, το Χ8μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ12μπορεί να είναι V, G, ή Α και το Χ23μπορεί να είναι L, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ4, Χ8, Χ12και Χ23είναι υποκατεστημένο σε σχέση με την SEQ ID NO: 16. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ4, Χ8, Χ12και Χ23είναι G ή Α. Σε μια άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα μεταξύ των Χ4, Χ8, Χ12και Χ23είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 16. Άλλες υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

[0073] Σε μία άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το πεπτίδιο περιλαμβάνει μια μεταλλαγμένη PSM-mec που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων:

MDX3TGX6X7TSX10X11DX13X14KTX17X18QAFG (SEQ ID NO: 53) Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, τουλάχιστον ένα από τα Χ3, Χ6, Χ7, Χ10, Χ11, Χ13, Χ14, Χ17, ή Χ18περιλαμβάνει μια υποκατάσταση αμινοξέος σε σχέση με την SEQ ID NO: 52. Συνεπώς, σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, η PSM-mec δεν είναι άγριου τύπου PSM-mec. Σύμφωνα με αυτή την άποψη της παρούσας αποκάλυψης, το Χ3μπορεί να είναι F, G, ή Α, το Χ6μπορεί να είναι V, G, ή Α, το X7μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ10μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ11μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ13μπορεί να είναι L, G, ή Α, το Χ14μπορεί να είναι I, G, ή Α, το Χ17μπορεί να είναι C, G, ή Α και το X18μπορεί να είναι I, G, ή Α. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, μόνο ένα μεμονωμένο αμινοξύ από τα Χ3, Χ6, Χ7, Χ10, Χ11, Χ13, Χ14, Χ17, ή Χ18είναι υποκατεστημένο σε σχέση με την SEQ ID NO: 52. Συνεπώς, μόνο ένα από τα Χ3, Χ6, Χ7, Χ10, Χ11, Χ13, Χ14, Χ17, ή X18είναι G ή Α. Σε μια άλλη άποψη της παρούσας αποκάλυψης, δύο αμινοξέα μεταξύ των Χ1, Χ3, Χ4, Χ7, X8, Χ10, Χ11, Χ14, Χ15, και X18είναι υποκατεστημένα σε σχέση με την SEQ ID NO: 52. Διάφορες υποκαταστάσεις αμινοξέων σε PSM-mec, είτε μεμονωμένες, είτε πολλαπλές υποκαταστάσεις, μπορεί εύκολα να οπτικοποιηθούν και να κατασκευαστούν από ένα άτομο της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική, σύμφωνα με αυτή την αποκάλυψη.

[0074] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει σύντηξη δύο ή περισσοτέρων, π.χ., δύο, τριών, τεσσάρων, πέντε, έξι, επτά, οκτώ, εννέα, δέκα ή περισσοτέρων πεπτιδίων που προέρχονται από Staphylococcus aureus, ή μεταλλαγμένων μορφών, θραυσμάτων, παραλλαγών ή παραγώγων αυτών διατεταγμένων με οποιαδήποτε σειρά. Τα δύο ή περισσότερα πεπτίδια που προέρχονται από Staphylococcus aureus, ή μεταλλαγμένες μορφές, θραύσματα, παραλλαγές, ή παράγωγα αυτών μπορεί να είναι ίδια ή διαφορετικά. Ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, δύο ή περισσότερα από:

α. μια DT άγριου τύπου, μια μεταλλαγμένη DT όπως περιγράφεται παραπάνω, ή οποιοδήποτε θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτών,

β. μια PSM άγριου τύπου, μια μεταλλαγμένη PSM όπως περιγράφεται παραπάνω, ή οποιοδήποτε θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτών,

γ. ένα πολυπεπτίδιο άλφα αιμολυσίνης ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτού, που περιλαμβάνει μεταξύ άλλων το ΑΤ-62 (SEQ ID NO: 46), ή άλλα πεπτίδια άλφα αιμολυσίνης όπως περιγράφεται αλλού στο παρόν και στη Δημοσίευση PCT Υπ’ Αρ. WO 2012/109167Α1,

δ. ένα πολυπεπτίδιο λευκοκιδίνης ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτού, που περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, μια υπομονάδα λευκοκιδίνης Panton- Valentine (PVL) LukS-PV που περιλαμβάνει μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 47, μια υπομονάδα λευκοκιδίνης Panton- Valentine (PVL) LukF-PV που περιλαμβάνει μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 48, ή έναν συνδυασμό αυτών, ή άλλων πεπτιδίων λευκοκιδίνης όπως περιγράφεται αλλού στο παρόν και στην Δημοσίευση PCT Υπ. Αρ’ WO 2013/082558, που περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, LukS-Mut9 (SEQ ID NO: 54) ή/και LukF-Mut-1 (SEQ ID NO: 55), ή

ε. ένα πολυπεπτίδιο υπεραντιγόνου (SAg) ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτού.

[0075] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, τα πεπτίδια που περιλαμβάνουν το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο μπορεί να συντηχθούν απευθείας μεταξύ τους. Σε άλλες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, τα πεπτίδια που περιλαμβάνουν το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο μπορεί να συνδεθούν μέσω ενός πεπτιδικού συνδέτη. Κατάλληλοι πεπτιδικοί συνδέτες μπορεί να επιλεγούν με βάση την ικανότητά τους να υιοθετούν μια εύκαμπτη, εκτεταμένη διαμόρφωση, ή μια δευτεροταγή δομή που μπορεί να αλληλεπιδρά με ενωμένους επιτόπους, ή με βάση την ικανότητά τους να αυξάνουν τη συνολική διαλυτότητα του πολυπεπτιδίου σύντηξης, ή με βάση την έλλειψη ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων ή αλληλεπιδράσεων με το νερό που επηρεάζουν τις ενωμένες πεπτιδικές περιοχές. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, ένας συνδέτης για χρήση σε ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει τουλάχιστον ένα, αλλά όχι περισσότερα από 50 αμινοξέα, π.χ., μικρά αμινοξέα που παρέχουν μια εύκαμπτη αλυσίδα, π.χ., γλυκίνη, σερίνη, αλανίνη, ή έναν συνδυασμό αυτών. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, ένας συνδέτης για χρήση σε ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο όπως παρέχεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει (GGGS)nή (GGGGS)n, όπου το η είναι ένας ακέραιος από 1 έως 10.

[0076] Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει ΑΤ-62 και DT, με οποιαδήποτε σειρά, όπου τα ΑΤ-62 και DT μπορεί να συντηχθούν μεταξύ τους μέσω μιας αλληλουχίας συνδέτη. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από AT62 DT (SEQ ID NO: 18), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 18.

[0077] Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει ΑΤ-62 και PSM, με οποιαδήποτε σειρά, όπου τα ΑΤ-62 και PSM μπορεί να συντηχθούν μεταξύ τους μέσω μιας αλληλουχίας συνδέτη. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από AT62 PSM (SEQ ID NO: 20), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 20.

[0078] Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει ΑΤ-62, DT και PSM, με οποιαδήποτε σειρά, όπου τα ΑΤ-62, DT και PSM μπορεί να συντηχθούν μεταξύ τους μέσω αλληλουχιών συνδέτη. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από AT62 DT PSM (SEQ ID NO: 22), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 22.

[0079] Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει ΑΤ-62 και μια ανασυνδυασμένη SEB ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτής, με οποιαδήποτε σειρά, όπου τα ΑΤ-62 και SEB μπορεί να συντηχθούν μεταξύ τους μέσω μιας αλληλουχίας συνδέτη. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από AT62_rSEB (SEQ ID NO: 23), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 23. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από rSEB_AT62 (SEQ ID NO: 26), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 26.

[0080] Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει ΑΤ-62, μια ανασυνδυασμένη SEB ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτής και DT, με οποιαδήποτε σειρά, όπου τα ΑΤ-62, SEB και DT μπορεί να συντηχθούν μεταξύ τους μέσω μιας αλληλουχίας συνδέτη. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από AT62_rSEB_DT (SEQ ID NO: 29), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 29.

[0081] Όπου το παρεχόμενο ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει ένα σταφυλοκοκκικό SAg ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτού, το SAg, μπορεί να περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, SEB, SEC1-3, SEE, SEH, SEI, SEK, TSST-1, SpeC, SED, SpeA, ή οποιαδήποτε μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτών, ή οποιονδήποτε συνδυασμό αυτών, με οποιαδήποτε σειρά. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει μια σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB) ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή ή παράγωγο αυτής. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η μεταλλαγμένη SEB είναι το εξασθενημένο τοξοειδές SEBL45R/Y89A/Y94A (SEQ ID NO: 49), ή ένα πολυπεπτίδιο που περιλαμβάνει μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 49. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει μια σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη A (SEA) ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτής. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η μεταλλαγμένη SEA είναι το εξασθενημένο τοξοειδές SEAL48R/D70R/Y92A (SEQ ID NO: 50), ή ένα πολυπεπτίδιο που περιλαμβάνει μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 50. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει μια σταφυλοκοκκική τοξίνη- 1 του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) ή μεταλλαγμένη μορφή, θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτής. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, η μεταλλαγμένη TSST-1 είναι το εξασθενημένο τοξοειδές TSST- 1L30R/D27A/I46A(SEQ ID NO: 51), ή ένα πολυπεπτίδιο που περιλαμβάνει μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 51.

[0082] Τα τοξοειδή SAg μπορεί να συνδεθούν μεταξύ τους με οποιαδήποτε σειρά, είτε με είτε χωρίς συνδέτες. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει SEBL45R/Y89A/Y94A («Β»), SEAL48R/D70R/Y92A(«Α») και TSST-

1L30R/D27A/I46A(«Τ»), με οποιαδήποτε σειρά, όπου τα τοξοειδή μπορεί να συντηχθούν μεταξύ τους μέσω αλληλουχιών συνδέτη. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από μια σύντηξη «ΒΑΤ» (SEQ ID NO: 32), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 32. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από μια σύντηξη «ΒΤΑ» (SEQ ID NO: 33), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 33. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από μια σύντηξη «ΑΒΤ» (SEQ ID NO: 34), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 34. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από μια σύντηξη «ΑΤΒ» (SEQ ID NO: 35), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 35. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από μια σύντηξη «TAB» (SEQ ID NO: 36), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 36. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται, ή συνίσταται ουσιαστικά από μια σύντηξη «ΤΒΑ» (SEQ ID NO: 37), ή ένα ολιγοπεπτίδιο που περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από μια αλληλουχία αμινοξέων τουλάχιστον 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ή 99% ταυτόσημη με την SEQ ID NO: 37.

[0083] Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει, συνίσταται ή συνίσταται ουσιαστικά από την αλληλουχία αμινοξέων των SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, ή ένα συνδυασμό αυτών.

[0084] Σε μια άλλη υλοποίηση της αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, μπορεί να προσαρτηθεί σε ένα ετερόλογο πολυπεπτίδιο. Μπορεί να χρησιμοποιηθούν διάφορα ετερόλογα πολυπεπτίδια, που περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, ένα Ν- ή C-τελικό πεπτίδιο που προσδίδει σταθερότητα, έκκριση, ή απλοποιημένο καθαρισμό, όπως μια ετικέτα εξα-ιστιδίνης, μια ετικέτα ουβικιτίνης, μια ετικέτα NusA, μια επικράτεια δέσμευσης χιτίνης, ompT, ompA, pelB, DsbA, DsbC, c-myc, KSI, πολυασπαρτικό οξύ, (A1a-Trp-Trp-Pro)n, πολυφαινυλαλανίνη, πολυκυστεΐνη, πολυαργινίνη, μια ετικέτα Β, μια ετικέτα HSB, πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), αιμοσυγκολλητίνη ιού της γρίπης (ΗΑI), μια πρωτεΐνη δέσμευσης καλμοδουλίνης (CBP), μια πρωτεΐνη δέσμευσης γαλακτόζης, μια πρωτεΐνη δέσμευσης μαλτόζης (ΜΒΡ), επικράτειες δέσμευσης κυτταρίνης (CBD), διυδροφολική αναγωγάση (DHFR), τρανσφεράση S-γλουταθειόνης (GST), στρεπτοκοκκική πρωτεΐνη G, σταφυλοκοκκική πρωτεΐνη A, T7gene10, ένα σύμπλοκο αβιδίνης/στρεπταβιδίνης/ετικέτας Step, trpE, ακετυλοτρανσφεράση χλωραμφαινικόλης, 1acZ (β-γαλακτοσιδάση), θειορεδοξίνη His-patch, θειορεδοξίνη, ένα πεπτίδιο FLAG™ (Sigma-Aldrich), μια ετικέτα S, ή μια ετικέτα Τ7. Βλέπε , π.χ., Stevens, R.C., Structure, 8:R177-R185 (2000). Τα ετερόλογα πολυπεπτίδια μπορεί, επίσης, να περιλαμβάνουν οποιεσδήποτε προηγούμενες ή/και πρόδρομες αλληλουχίες διευκολύνουν τη μεταφορά, τις μετατοπίσεις, την επεξεργασία ή/και τον καθαρισμό ενός πολυσθενούς ολιγοπεπτιδίου, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν από ένα κύτταρο ξενιστή ή οποιαδήποτε χρήσιμη ανοσογόνο αλληλουχία, που περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, αλληλουχίες που κωδικοποιούν έναν επίτοπο Τ-κυττάρων ενός μικροβιακού παθογόνου, ή άλλες ανοσογόνες πρωτεΐνες ή/και επιτόπους.

[0085] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM προσαρτημένο σε ένα ετερόλογο πολυπεπτίδιο, όπως περιγράφεται στο παρόν, μπορεί να περιλαμβάνει μια πεπτιδική αλληλουχία συνδέτη που συνδέει αλληλουχίες οι οποίες περιλαμβάνουν δύο ή περισσότερες πεπτιδικές περιοχές. Κατάλληλες αλληλουχίες πεπτιδικού συνδέτη μπορεί να επιλεγούν με βάση την ικανότητά τους να υιοθετούν μια εύκαμπτη, εκτεταμένη διαμόρφωση, ή μια δευτεροταγή δομή που μπορεί να αλληλεπιδρά με ενωμένους επιτόπους, ή με βάση την ικανότητά τους να αυξάνουν τη συνολική διαλυτότητα του πολυπεπτιδίου σύντηξης, ή με βάση την έλλειψη ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων ή αλληλεπιδράσεων με το νερό που επηρεάζουν τις ενωμένες πεπτιδικές περιοχές.

[0086] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το πολυδύναμο ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, απομονώνεται. Ένα «απομονωμένο» πολυπεπτίδιο είναι εκείνο το οποίο έχει απομακρυνθεί από το φυσικό του περιβάλλον. Ο όρος «απομονωμένο» δεν υποδηλώνει κάποιο συγκεκριμένο επίπεδο καθαρισμού. Πολυσθενή ολιγοπεπτίδια που παράγονται με ανασυνδυασμό, DT ή/και PSM όπως περιγράφονται στο παρόν, που εκφράζονται σε μη φυσικά κύτταρα ξενιστές, θεωρούνται απομονωμένα για τους σκοπούς της αποκάλυψης, όπως είναι το πολυπεπτίδιο το οποίο έχει διαχωριστεί, κλασματοποιηθεί, ή μερικώς ή ουσιαστικώς καθαριστεί με οποιαδήποτε κατάλληλη τεχνική συμπεριλαμβανομένης της διήθησης, της χρωματογραφίας, της φυγοκέντρησης και των συναφών.

[0087] Η παραγωγή πολυσθενών ολιγοπεπτιδίων, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, μπορεί να επιτευχθεί με καλλιέργεια ενός κυττάρου ξενιστή που περιλαμβάνει ένα πολυνουκλεοτίδιο το οποίο κωδικοποιεί λειτουργικά το πολυπεπτίδιο της αποκάλυψης και ανάκτηση του πολυπεπτιδίου. Ο προσδιορισμός των συνθηκών καλλιέργειας ενός τέτοιου κυττάρου ξενιστή και της έκφρασης του πολυνουκλεοτιδίου είναι γενικά ειδικός για το κύτταρο ξενιστή και για το σύστημα έκφρασης και εμπίπτει εντός της γνώσης κάποιου με εμπειρία στην τεχνική. Παρομοίως, κατάλληλες μέθοδοι για την ανάκτηση του πολυπεπτιδίου της αποκάλυψης είναι γνωστές στους ειδικούς και περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, χρωματογραφία, διήθηση, κατακρήμνιση, ή φυγοκέντρηση.

III. Πολυνουκλεοτίδια

[0088] Αποκαλύπτεται, επίσης, ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει ένα νουκλεϊκό οξύ το οποίο κωδικοποιεί ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται αλλού στο παρόν.

[0089] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν περιλαμβάνει περαιτέρω μη κωδικοποιούσες περιοχές όπως υποκινητές, χειριστές, ή τερματιστές της μεταγραφής όπως περιγράφεται αλλού στο παρόν. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, η αποκάλυψη κατευθύνεται προς το πολυνουκλεοτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν και περιλαμβάνει περαιτέρω ένα ετερόλογο νουκλεϊκό οξύ. Το ετερόλογο νουκλεϊκό οξύ μπορεί, σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, να κωδικοποιεί ένα ετερόλογο πολυπεπτίδιο συντηγμένο με το πολυπεπτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν. Για παράδειγμα, το απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να περιλαμβάνει επιπρόσθετες κωδικοποιούσες περιοχές που κωδικοποιούν π.χ., ένα ετερόλογο πολυπεπτίδιο συντηγμένο με το πολυπεπτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν, ή κωδικοποιούσες περιοχές που κωδικοποιούν ετερόλογα πολυπεπτίδια ξεχωριστά από το πολυπεπτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν όπως, επιλέξιμους δείκτες, πρόσθετα ανοσογόνα, ενισχυτές ανοσίας και τα συναφή.

[0090] Παρέχονται, επίσης, κατασκευάσματα έκφρασης, φορείς ή/και κύτταρα ξενιστές που περιλαμβάνουν τα πολυνουκλεοτίδια που περιγράφονται στο παρόν. Ένα παράδειγμα ενός απομονωμένου πολυνουκλεοτιδίου είναι ένα ανασυνδυασμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιέχεται σε έναν φορέα. Περαιτέρω παραδείγματα ενός απομονωμένου πολυνουκλεοτιδίου περιλαμβάνουν ανασυνδυασμένα πολυνουκλεοτίδια που διατηρούνται σε ετερόλογα κύτταρα ξενιστές ή καθαρισμένα (μερικώς ή ουσιαστικώς) πολυνουκλεοτίδια σε διάλυμα. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το πολυνουκλεοτίδιο είναι «ανασυνδυασμένο». Απομονωμένα πολυνουκλεοτίδια ή νουκλεϊκά οξέα σύμφωνα με την αποκάλυψη περιλαμβάνουν περαιτέρω τέτοια μόρια που παράγονται συνθετικά. Ο σχετικός βαθμός καθαρότητας ενός πολυνουκλεοτιδίου ή πολυπεπτιδίου που περιγράφεται στο παρόν προσδιορίζεται εύκολα με πολύ γνωστές μεθόδους.

[0091] Στο πλαίσιο της αποκάλυψης περιλαμβάνονται, επίσης, γενετικά τροποποιημένα πολυνουκλεοτίδια που κωδικοποιούν τα πολυσθενή ολιγοπεπτίδια, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν. Τροποποιήσεις νουκλεϊκών οξέων που κωδικοποιούν τα πολυσθενή ολιγοπεπτίδια, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, μπορεί εύκολα να επιτευχθούν από τους ειδικούς στην τεχνική, για παράδειγμα, με κατευθυνόμενη από ολιγονουκλεοτίδιο μεταλλαξιγένεση ειδικής θέσης ή με de novo σύνθεση νουκλεϊκού οξέος.

[0092] Ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης αποκαλύπτουν ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει ένα νουκλεϊκό οξύ το οποίο κωδικοποιεί ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, όπου η κωδικοποιούσα περιοχή που κωδικοποιεί το πολυπεπτίδιο έχει υποστεί βελτιστοποίηση κωδικονίου. Όπως εκτιμάται από κάποιον με τη συνήθη εμπειρία στην τεχνική, διάφορες κωδικοποιούσες περιοχές του νουκλεϊκού οξέος θα κωδικοποιούν το ίδιο πολυπεπτίδιο λόγω του εκφυλισμού του γενετικού κώδικα. Αποκλίσεις της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που περιλαμβάνουν τα κωδικόνια που κωδικοποιούν τα αμινοξέα οποιασδήποτε πολυπεπτιδικής αλυσίδας επιτρέπουν παραλλαγές στην αλληλουχία της κωδικοποιούσες περιοχής. Δεδομένου ότι κάθε κωδικόνιο αποτελείται από τρία νουκλεοτίδια και τα νουκλεοτίδια που περιέχουν DNA περιορίζονται σε τέσσερις ειδικές βάσεις, υπάρχουν 64 δυνατοί συνδυασμοί νουκλεοτιδίων, 61 από τους οποίους κωδικοποιούν αμινοξέα (τα υπόλοιπα τρία κωδικόνια κωδικοποιούν σήματα τερματισμού της μετάφρασης). Ο «γενετικός κώδικας» ο οποίος δείχνει ποια κωδικόνια κωδικοποιούν ποια αμινοξέα αναπαράγεται στο παρόν ως Πίνακας 2. Ως αποτέλεσμα, πολλά αμινοξέα ορίζονται από περισσότερα του ενός κωδικόνια. Για παράδειγμα, τα αμινοξέα αλανίνη και προλίνη κωδικοποιούνται από τέσσερις τριπλέτες, η σερίνη και η αργινίνη από έξι, ενώ η τρυπτοφάνη και η μεθειονίνη κωδικοποιούνται από μία μόνο τριπλέτα. Αυτός ο εκφυλισμός επιτρέπει η σύνθεση των βάσεων του DNA να ποικίλει εντός ευρέους φάσματος χωρίς να μεταβάλλεται η αλληλουχία αμινοξέων των πολυπεπτιδίων που κωδικοποιούνται από το DNA.

ΠΙΝΑΚΑΣ 2: Ο Πρότυπος Γενετικός Κώδικας

[0093] Θα πρέπει να εκτιμηθεί ότι οποιοδήποτε πολυνουκλεοτίδιο κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο σύμφωνα με την αποκάλυψη εμπίπτει εντός του πεδίου αυτής της αποκάλυψης, ανεξάρτητα από τα κωδικόνια που χρησιμοποιήθηκαν.

[0094] Πολλοί οργανισμοί εμφανίζουν μεροληψία ως προς τη χρήση συγκεκριμένων κωδικονίων για να κωδικοποιήσουν την ένθεση ενός συγκεκριμένου αμινοξέος σε μια αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η προτίμηση κωδικονίων ή η μεροληψία κωδικονίων και οι διαφορές στη χρήση κωδικονίων μεταξύ οργανισμών, διασφαλίζονται από τον εκφυλισμό του γενετικού κώδικα και είναι καλά τεκμηριωμένες μεταξύ πολλών οργανισμών.

[0095] Έχουν προταθεί διάφοροι παράγοντες που συμβάλλουν στην προτίμηση χρήσης κωδικονίων, συμπεριλαμβανομένης της μεταφραστικής επιλογής, της σύνθεσης GC, της μεταλλακτικής μεροληψίας που εξαρτάται από τον κλώνο, της συντήρησης αμινοξέων, της πρωτεϊνικής υδροπάθειας, της μεταγραφικής επιλογής και ακόμη και της σταθερότητας του RNA. Ένας παράγοντας που καθορίζει τη χρήση κωδικονίων είναι η μεταλλακτική μεροληψία που διαμορφώνει τη σύνθεση του γονιδιώματος GC. Αυτός ο παράγοντας είναι πιο σημαντικός σε γονιδιώματα με ακραία σύνθεση βάσεων: είδη με υψηλή περιεκτικότητα σε GC ( π.χ ., βακτήρια θετικά κατά Gram). Η μεταλλακτική μεροληψία είναι υπεύθυνη όχι μόνο για τη διαγενετική διαφορά στη χρήση κωδικονίων, αλλά και για τη μεροληψία χρήσης κωδικονίων εντός του ίδιου γονιδιώματος (Ermolaeva Μ, Curr. Issues Mol. Biol. 3(4):91-97, 2001).

[0096] Η μεροληψία κωδικονίων συσχετίζεται συχνά με την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης του αγγελιαφόρου RNA (mRNA), η οποία με τη σειρά της πιστεύεται ότι εξαρτάται, μεταξύ άλλων, από τις ιδιότητες των κωδικονίων που μεταφράζονται και τη διαθεσιμότητα συγκεκριμένων μορίων μεταφορικού RNA (tRNA). Η κυριαρχία επιλεγμένων tRNA σε ένα κύτταρο είναι γενικά μια αντανάκλαση των κωδικονίων που χρησιμοποιούνται συχνότερα για τη σύνθεση πεπτιδίων. Κατά συνέπεια, τα γονίδια μπορεί να προσαρμοστούν για τη βέλτιστη γονιδιακή έκφραση σε έναν δεδομένο οργανισμό με βάση τη βελτιστοποίηση κωδικονίου.

[0097] Η παρούσα αποκάλυψη παρέχει ένα πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει μια κωδικοποιούσα περιοχή βελτιστοποιημένου κωδικονίου η οποία κωδικοποιεί ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν. Η χρήση κωδικονίων προσαρμόζεται για βελτιστοποιημένη έκφραση σε ένα δεδομένο προκαρυωτικό ή ευκαρυωτικό κύτταρο ξενιστή. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης η χρήση κωδικονίων είναι προσαρμοσμένη για βελτιστοποιημένη έκφραση σε Ε. Coli.

[0098] Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης παρέχεται ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει την αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος της SEQ ID NO: 17, που κωδικοποιεί AT62 DT και βελτιστοποιήθηκε για έκφραση σε Ε. coli. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης παρέχεται ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει την αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος της SEQ ID NO: 19, που κωδικοποιεί AT62 PSM και βελτιστοποιήθηκε για έκφραση σε Ε. coli. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης παρέχεται ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει την αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος της SEQ ID NO: 21, που κωδικοποιεί AT62 DT PSM και βελτιστοποιήθηκε για έκφραση σε Ε. coli. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης παρέχεται ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει την αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος της SEQ ID NO: 25, που κωδικοποιεί AT62_rSEB και βελτιστοποιήθηκε για έκφραση σε Ε. coli. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης παρέχεται ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει την αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος της SEQ ID NO: 28, που κωδικοποιεί rSEB_ ΑΤ62 και βελτιστοποιήθηκε για έκφραση σε Ε. coli. Σε ορισμένες απόψεις της παρούσας αποκάλυψης παρέχεται ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο που περιλαμβάνει την αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος της SEQ ID NO: 31, που κωδικοποιεί AT62_rSEB και βελτιστοποιήθηκε για έκφραση σε Ε. coli.

[0099] Τα πολυνουκλεοτίδια με βελτιστοποίηση κωδικονίου παρασκευάζονται με ενσωμάτωση κωδικονίων που προτιμώνται για χρήση στα γονίδια ενός δεδομένου είδους εντός της αλληλουχίας DNA. Παρέχονται, επίσης, κατασκευάσματα πολυνουκλεοτιδική έκφρασης, φορείς, κύτταρα ξενιστές που περιλαμβάνουν πολυνουκλεοτίδια τα οποία περιλαμβάνουν κωδικοποιούσες περιοχές με βελτιστοποίηση κωδικονίου οι οποίες κωδικοποιούν ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν.

[0100] Λόγω του μεγάλου αριθμού γονιδιακών αλληλουχιών που είναι διαθέσιμες για μια ευρεία ποικιλία ζωικών, φυτικών και μικροβιακών ειδών, είναι δυνατόν να υπολογιστούν οι σχετικές συχνότητες της χρήσης κωδικονίων. Πίνακες χρήσης κωδικονίων είναι άμεσα διαθέσιμοι, για παράδειγμα, στη «Βάση Δεδομένων Χρήσης Κωδικονίων» που είναι διαθέσιμη στο htp://www.kazusa.or.jp/codon/ (επίσκεψη 12 Οκτωβρίου, του 2011) και αυτοί οι πίνακες μπορεί να προσαρμοστούν με διάφορους τρόπους. (Nakamura, Υ., et al., "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292, 2000).

[0101] Χρησιμοποιώντας διαθέσιμους πίνακες, κάποιος με τη συνήθη εμπειρία στην τεχνική μπορεί να εφαρμόσει τις συχνότητες σε οποιαδήποτε δεδομένη πολυπεπτιδική αλληλουχία και να παράγει ένα θραύσμα νουκλεϊκού οξέος μιας κωδικοποιούσας περιοχής με βελτιστοποίηση κωδικονίου η οποία κωδικοποιεί ένα επιθυμητό πολυπεπτίδιο, αλλά χρησιμοποιεί βέλτιστα κωδικόνια για ένα συγκεκριμένο είδος. Για παράδειγμα, σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, η κωδικοποιούσα περιοχή υφίσταται βελτιστοποίηση κωδικονίου για έκφραση σε Ε. Coli.

[0102] Υπάρχει διαθέσιμος ένας αριθμός επιλογών για τη σύνθεση κωδικοποιουσών περιοχών με βελτιστοποίηση κωδικονίου σχεδιασμένων με οποιαδήποτε από τις μεθόδους που περιγράφηκαν παραπάνω, χρησιμοποιώντας πρότυπους και συνήθεις μοριακούς βιολογικούς χειρισμούς καλά γνωστούς σε εκείνους με τη συνήθη εμπειρία στην τεχνική. Επιπλέον, η γονιδιακή σύνθεση είναι άμεσα διαθέσιμη στο εμπόριο.

IV. Φορείς και Συστήματα Έκφρασης

[0103] Αποκαλύπτεται περαιτέρω ένας φορέας που περιλαμβάνει το πολυνουκλεοτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν. Ο όρος «φορέας», όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, αναφέρεται π.χ., σε οποιοδήποτε αριθμό νουκλεϊκών οξέων εντός των οποίων μπορεί να εισαχθεί μια επιθυμητή αλληλουχία, π.χ., με περιοριστική πέψη και συνένωση, για τη μεταφορά μεταξύ διαφορετικών γενετικών περιβαλλόντων ή για την έκφραση σε ένα κύτταρο ξενιστή. Οι φορείς νουκλεϊκού οξέος μπορεί να είναι DNA ή RNA. Οι φορείς περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, πλασμίδια, φάγους, φαγομίδια, βακτηριακά γονιδιώματα και ιικά γονιδιώματα. Ένας φορέας κλωνοποίησης είναι κάποιος ο οποίος είναι ικανός να αντιγράφει σε ένα κύτταρο ξενιστή και ο οποίος χαρακτηρίζεται περαιτέρω από μία ή περισσότερες θέσεις περιοριστικών ενδονουκλεασών στις οποίες ο φορέας μπορεί να κοπεί με καθορισμένο τρόπο και στις οποίες η επιθυμητή αλληλουχία DNA μπορεί να συνενωθεί έτσι ώστε ο νέος ανασυνδυασμένος φορέας να διατηρήσει την ικανότητα αντιγραφής του στο κύτταρο ξενιστή. Στην περίπτωση των πλασμιδίων, η αντιγραφή της επιθυμητής αλληλουχίας μπορεί να λάβει χώρα πολλές φορές καθώς το πλασμίδιο αυξάνεται σε αριθμό αντιγράφων εντός του βακτηρίου ξενιστή ή μόνο μία φορά ανά ξενιστή πριν αναπαραχθεί ο ξενιστής με μίτωση. Στην περίπτωση του φάγου, η αντιγραφή μπορεί να λάβει χώρα ενεργητικά κατά τη διάρκεια μιας λυτικής φάσης ή παθητικά κατά τη διάρκεια μιας λυσιγόνου φάσης. Ορισμένοι φορείς είναι ικανοί αυτόνομης αντιγραφής σε ένα κύτταρο ξενιστή στο οποίο εισάγονται. Άλλοι φορείς ενσωματώνονται εντός του γονιδιώματος ενός κυττάρου ξενιστή αμέσως μετά την εισαγωγή τους στο κύτταρο ξενιστή και συνεπώς αντιγράφονται μαζί με το γονιδίωμα του ξενιστή.

[0104] Οποιοσδήποτε από μια ευρεία ποικιλία κατάλληλων φορέων κλωνοποίησης γνωστών στην τεχνική και διατιθέμενων στο εμπόριο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί με κατάλληλους ξενιστές. Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος «πλασμίδιο» αναφέρεται σε ένα κυκλικό, δίκλωνο κατασκεύασμα αποτελούμενο από γενετικό υλικό (δηλαδή, νουκλεϊκά οξέα), στο οποίο το γενετικό υλικό είναι εξωχρωμοσωμικό και σε ορισμένες περιπτώσεις αντιγράφεται αυτόνομα. Ένα πολυνουκλεοτίδιο που περιγράφεται στο παρόν μπορεί να βρίσκεται σε ένα κυκλικό ή γραμμικό πλασμίδιο ή σε οποιοδήποτε άλλο είδος φορέα. Διαδικασίες για την ένθεση μιας νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σε έναν φορέα, π.χ., έναν φορέα έκφρασης και μετασχηματισμός ή διαμόλυνση σε ένα κατάλληλο κύτταρο ξενιστή και καλλιέργεια υπό συνθήκες κατάλληλες για έκφραση είναι γενικά γνωστές στην τεχνική.

[0105] Η αποκάλυψη παρέχει περαιτέρω έναν φορέα που περιλαμβάνει μια αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος που κωδικοποιεί ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης ο φορέας είναι ένας φορέας έκφρασης ικανός να εκφράζει το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν σε ένα κατάλληλο κύτταρο ξενιστή. Ο όρος «φορέας έκφρασης» αναφέρεται σε έναν φορέα που είναι ικανός να εκφράζει το πολυπεπτίδιο που περιγράφεται στο παρόν, δηλαδή, η αλληλουχία του φορέα περιέχει τις ρυθμιστικές αλληλουχίες που απαιτούνται για τη μεταγραφή και μετάφραση ενός πολυπεπτιδίου, που περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, υποκινητές, χειριστές, θέσεις λήξης της μεταγραφής, θέσεις δέσμευσης ριβοσωμάτων και τα συναφή. Ο όρος «έκφραση» αναφέρεται στη βιολογική παραγωγή ενός προϊόντος που κωδικοποιείται από μια κωδικοποιούσα αλληλουχία. Στις περισσότερες περιπτώσεις μια αλληλουχία DNA, συμπεριλαμβανομένης της κωδικοποιούσας αλληλουχίας, μεταγράφεται για να σχηματίσει ένα αγγελιαφόρο-RNA (mRNA). Το αγγελιαφόρο RNA, στη συνέχεια, μεταφράζεται για να σχηματίσει ένα πολυπεπτιδικό προϊόν που έχει σχετική βιολογική δραστικότητα. Επίσης, η διαδικασία της έκφρασης μπορεί να περιλαμβάνει περαιτέρω στάδια επεξεργασίας στο προϊόν RNA της μεταγραφής, όπως μάτισμα για την απομάκρυνση των εσονίων ή/και μετά- μεταφραστική επεξεργασία ενός πολυπεπτιδικού προϊόντος.

[0106] Τα συστήματα φορέα-ξενιστή περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, συστήματα όπως συστήματα βακτηρίων, θηλαστικών, ζυμομυκήτων, εντόμων ή φυτικών κυττάρων, είτε in vivo, π.χ. σε ένα ζώο είτε in vitro, π.χ., σε βακτήρια ή σε κυτταρικές καλλιέργειες. Η επιλογή ενός κατάλληλου ξενιστή θεωρείται ότι εμπίπτει εντός του πεδίου των ειδικών στην τεχνική από τις στο παρόν διδαχές. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το κύτταρο ξενιστής είναι ένα βακτήριο, π.χ., Ε. coli.

[0107] Τα κύτταρα ξενιστές είναι γενετικά τροποποιημένα (μολυσμένα, υπό μεταγωγή, μετασχηματισμένα, ή διαμολυσμένα) με φορείς της αποκάλυψης. Συνεπώς, μια άποψη της αποκάλυψης απευθύνεται σε ένα κύτταρο ξενιστή που περιλαμβάνει έναν φορέα ο οποίος περιέχει το πολυνουκλεοτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν. Το τροποποιημένο κύτταρο ξενιστής μπορεί να καλλιεργηθεί σε συμβατικά θρεπτικά μέσα τροποποιημένα όπως είναι κατάλληλο για την ενεργοποίηση των υποκινητών, την επιλογή μετασχηματισμένων στελεχών ή την ενίσχυση των πολυνουκλεοτιδίων. Οι συνθήκες καλλιέργειας, όπως η θερμοκρασία, το pH και τα συναφή, είναι εκείνες που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως για το κύτταρο ξενιστή που επιλέχθηκε για έκφραση και θα είναι προφανείς στον έμπειρο τεχνικό. Ο όρος «διαμόλυνση», όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, αναφέρεται σε οποιαδήποτε διαδικασία με την οποία τα ευκαρυωτικά κύτταρα οδηγούνται στην αποδοχή και ενσωμάτωση στο γονιδίωμά τους απομονωμένου DNA, που περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, DNA στη μορφή πλασμιδίου. Ο όρος «μετασχηματισμός», όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, αναφέρεται σε οποιαδήποτε διαδικασία με την οποία τα βακτηριακά κύτταρα οδηγούνται στην αποδοχή και ενσωμάτωση στο γονιδίωμά τους απομονωμένου DNA, που περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, DNA στη μορφή πλασμιδίου.

[0108] Συστήματα βακτηριακού φορέα έκφρασης ξενιστή περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, ένα προκαρυωτικό σύστημα ( π.χ ., Ε. Coli ), μετασχηματισμένο με ανασυνδυασμένο DNA βακτηριοφάγου, DNA πλασμιδίου ή κοσμιδίου. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, τα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται με Ε. Coli χρησιμοποιούν το καθοδηγούμενο από τον υποκινητή Τ7 σύστημα που ρυθμίζεται από την πρωτεΐνη LacI μέσω επαγωγής IPTG. Ένας μεγάλος αριθμός κατάλληλων φορέων είναι γνωστός σε εκείνους με εμπειρία στην τεχνική και είναι εμπορικά διαθέσιμοι. Οι ακόλουθοι βακτηριακοί φορείς παρέχονται εν είδει παραδείγματος: pΕΤ (Novagen), pΕΤ28, pBAD, pTrcHIS, pBR322, pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK243-3, pDR540, pBR322, pPSlO, RSF1010, pRIT5 (Pharmacia); pCR (Invitrogen); pLex (Invitrogen), και παράγωγα πλασμιδίου pUC.

[0109] Ένας κατάλληλος φορέας έκφρασης περιέχει ρυθμιστικές αλληλουχίες οι οποίες μπορεί να συνδέονται λειτουργικά σε μια εισαχθείσα νουκλεοτιδική αλληλουχία που κωδικοποιεί το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν. Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος «ρυθμιστικές αλληλουχίες» σημαίνει νουκλεοτιδικές αλληλουχίες οι οποίες είναι απαραίτητες ή ευνοούν τη μεταγραφή μιας εισαχθείσας αλληλουχίας που κωδικοποιεί ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν από ένα κύτταρο ξενιστή ή/και οι οποίες είναι απαραίτητες ή ευνοϊκές για τη μετάφραση από ένα κύτταρο ξενιστή του προκύπτοντος μεταγραφή ματος στο επιθυμητό πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM. Οι ρυθμιστικές αλληλουχίες περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, αλληλουχίες 5' όπως χειριστές, υποκινητές και αλληλουχίες δέσμευσης ριβοσωμάτων και αλληλουχίες 3' όπως σήματα πολυαδενυλίωσης ή τερματιστές της μεταγραφής. Οι ρυθμιστικές αλληλουχίες μπορεί, επίσης, να περιλαμβάνουν αλληλουχίες ενισχυτών ή ανοδικές αλληλουχίες ενεργοποιητών.

[0110] Γενικά, οι βακτηριακοί φορείς θα περιλαμβάνουν αρχές έναρξης της αντιγραφής και επιλέξιμους δείκτες, π.χ., γονίδια ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη, τετρακυκλίνη, καναμυκίνη της Ε. Coli, επιτρέποντας τον μετασχηματισμό του κυττάρου ξενιστή και έναν υποκινητή που προέρχεται από ένα εξαιρετικά εκφραζόμενο γονίδιο για να κατευθύνει της μεταγραφή μιας καθοδικά δομικής αλληλουχίας. Κατάλληλοι υποκινητές περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, τον υποκινητή Τ7, τον υποκινητή λάμδα (λ), τον υποκινητή Τ5 και τον υποκινητή lac, ή υποκινητές που προέρχονται από οπερόνια που κωδικοποιούν γλυκολυτικά ένζυμα όπως κινάση 3-φωσφογλυκερίνης (PGK), όξινη φωσφατάση, ή πρωτεΐνες θερμικού σοκ, ή επαγώγιμους υποκινητές όπως κάδμιο (pcad) και βήτα-λακταμάση (pbla).

[0111] Μόλις επιλεχθεί ένας φορέας έκφρασης, το πολυνουκλεοτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να κλωνοποιηθεί καθοδικά του υποκινητή, για παράδειγμα, σε μια περιοχή πολυσυνδέτη. Ο φορέας μετασχηματίζεται σε ένα κατάλληλο βακτηριακό στέλεχος και το DNA παρασκευάζεται χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές. Ο προσανατολισμός και η αλληλουχία DNA του πολυνουκλεοτιδίου καθώς και όλα τα άλλα στοιχεία που περιλαμβάνονται στον φορέα, επιβεβαιώνονται χρησιμοποιώντας χαρτογράφηση περιορισμού, ανάλυση αλληλουχίας DNA ή/και ανάλυση PCR. Τα βακτηριακά κύτταρα που φέρουν το σωστό πλασμίδιο μπορεί να αποθηκευτούν ως τράπεζες κυττάρων.

V. Ανοσογόνες και Φαρμακευτικές Συνθέσεις

[0112] Περαιτέρω αποκαλύπτονται συνθέσεις, π.χ., ανοσογόνες ή φαρμακευτικές συνθέσεις που περιέχουν μια αποτελεσματική ποσότητα του πολυσθενούς ολιγοπεπτιδίου, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή ένα πολυνουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί το πολυπεπτίδιο της αποκάλυψης. Οι συνθέσεις όπως περιγράφονται στο παρόν μπορεί περαιτέρω να περιλαμβάνουν επιπρόσθετα ανοσογόνα συστατικά, π.χ., όπως ένα πολυσθενές εμβόλιο, καθώς επίσης και φορείς, έκδοχα ή ανοσοενισχυτικά.

[0113] Οι συνθέσεις όπως περιγράφονται στο παρόν μπορεί να τυποποιηθούν σύμφωνα με γνωστές μεθόδους. Κατάλληλες μέθοδοι παρασκευής περιγράφονται, για παράδειγμα, στο Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). Η σύνθεση μπορεί να βρεθεί σε μια πληθώρα μορφών, συμπεριλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, ενός υδατικού διαλύματος, ενός γαλακτώματος, ενός πηκτώματος, ενός εναιωρήματος, μιας λυοφιλοποιημένης μορφής, ή οποιασδήποτε άλλης μορφής γνωστής στην τεχνική. Επιπλέον, η σύνθεση μπορεί να περιέχει φαρμακευτικώς αποδεκτά πρόσθετα που περιλαμβάνουν, για παράδειγμα, αραιωτικά, συνδετικά, σταθεροποιητές και συντηρητικά. Μόλις τυποποιηθούν, οι συνθέσεις της αποκάλυψης μπορεί να χορηγηθούν απευθείας στο υποκείμενο. Τα υποκείμενα που πρόκειται να υποβληθούν σε αγωγή μπορεί να είναι ζώα- συγκεκριμένα, μπορεί να υποβληθούν σε αγωγή ανθρώπινα υποκείμενα.

[0114] Οι φορείς που μπορεί να χρησιμοποιηθούν με τις συνθέσεις της αποκάλυψης είναι πολύ γνωστοί στην τεχνική και περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, π.χ., θυρεοσφαιρίνη, αλβουμίνες όπως αλβουμίνη ανθρώπινου ορού, τοξοειδές του τετάνου και πολυαμινοξέα όπως πολυ-Ε-λυσίνη, πολυ-Ε-γλουταμικό οξύ, πυρηνική πρωτεΐνη του ιού της γρίπης, του ιού της ηπατίτιδας Β και τα συναφή. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια πληθώρα υδατικών φορέων, π.χ., νερό, ρυθμιστικό νερό, 0.8% φυσιολογικός ορός, 0.3% γλυκίνη, υαλουρονικό οξύ και τα συναφή. Οι συνθέσεις μπορεί να αποστειρωθούν με συμβατικές, πολύ γνωστές τεχνικές αποστείρωσης, ή μπορεί να αποστειρωθούν με διήθηση. Μια προκύπτουσα σύνθεση μπορεί να συσκευαστεί για χρήση ως έχει, ή να λυοφιλοποιηθεί, ενώ το λυοφιλοποιημένο παρασκεύασμα συνδυάζεται με ένα αποστειρωμένο διάλυμα πριν από τη χορήγηση. Οι συνθέσεις μπορεί να περιέχουν φαρμακευτικώς αποδεκτές βοηθητικές ουσίες, κατά περίπτωση, για την προσέγγιση των φυσιολογικών συνθηκών, όπως παράγοντες ρύθμισης του pH και ρυθμιστικοί παράγοντες, παράγοντες ρύθμισης της τονικότητας, παράγοντες διαβροχής και τα συναφή, για παράδειγμα οξικό νάτριο, γαλακτικό νάτριο, χλωριούχο νάτριο, χλωριούχο κάλιο, χλωριούχο ασβέστιο, μονολαυρική σορβιτάνη, ελαϊκή τριαιθανολαμίνη, κλπ.

[0115] Ορισμένες συνθέσεις όπως περιγράφονται στο παρόν περιλαμβάνουν περαιτέρω ένα ή περισσότερα ανοσοενισχυτικά, μια ουσία που προστίθεται σε μια ανοσογόνο σύνθεση, για παράδειγμα, ενισχύει, διατηρεί, εντοπίζει, ή διαμορφώνει την ανοσολογική απόκριση σε ένα ανοσογόνο. Ο όρος «ανοσοενισχυτικά» αναφέρεται σε οποιοδήποτε υλικό το οποίο έχει την ικανότητα (1) να μεταβάλλει ή να αυξάνει την ανοσολογική απόκριση σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο ή (2) να αυξάνει ή να ενισχύει το αποτέλεσμα ενός φαρμακολογικού παράγοντα. Οποιαδήποτε ένωση η οποία μπορεί να αυξήσει την έκφραση, την αντιγονικότητα ή την ανοσογονικότητα του πολυπεπτιδίου είναι ένα πιθανό ανοσοενισχυτικά. Ο όρος «ανοσογόνος φορέας» όπως χρησιμοποιείται στο παρόν αναφέρεται σε ένα πρώτο τμήμα, π.χ., ένα πολυπεπτίδιο ή θραύσμα, παραλλαγή, ή παράγωγο αυτού το οποίο ενισχύει την ανοσογονικότητα ενός δεύτερου πολυπεπτιδίου ή θραύσματος, παραλλαγής, ή παραγώγου αυτού.

[0116] Μια μεγάλη ποικιλία υλικών έχει αποδειχθεί ότι έχει ανοσοενισχυτική δραστικότητα μέσω ποικίλων μηχανισμών. Για παράδειγμα, η αύξηση της χυμικής ανοσίας εκδηλώνεται συνήθως με μια σημαντική αύξηση στον τίτλο των αντισωμάτων που δημιουργούνται έναντι του αντιγόνου και μια αύξηση της δραστικότητας των Τ-κυττάρων που εκδηλώνεται συνήθως με αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ή κυτταρική κυτταροτοξικότητα, ή έκκριση κυτοκινών. Ένα ανοσοενισχυτικά μπορεί, επίσης, να μεταβάλλει ή να τροποποιήσει την ανοσολογική απόκριση, για παράδειγμα, με μεταβολή μιας αρχικά χυμικής ή Th2απόκρισης σε μια αρχικά κυτταρική, ή Thi απόκριση. Οι ανοσολογικές αποκρίσεις σε ένα δεδομένο αντιγόνο μπορεί να εξεταστούν με διάφορες ανοσολογικές δοκιμασίες πολύ γνωστές στους ειδικούς στην τεχνική ή/και που περιγράφονται αλλού στο παρόν.

[0117] Ένας μεγάλος αριθμός ανοσοενισχυτικών είναι γνωστά σε άτομα με τη συνήθη εμπειρία στην τεχνική και περιγράφονται σε πολυάριθμες αναφορές. Τα ανοσοενισχυτικά που μπορεί να χρησιμοποιηθούν σε συνθέσεις που περιγράφονται στο παρόν περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων: αδρανείς φορείς, όπως στυπτηρία, μπεντονίτη, λάτεξ και ακρυλικά σωματίδια- ατελές ανοσοενισχυτικό του Freund, πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund- άλατα με βάση το αργίλιο όπως το υδροξείδιο του αργιλίου- Alhydrogel (Α1(ΟΗ3))- φωσφορικό αργίλιο (Α1ΡO4)- άλατα με βάση το ασβέστιο- πυρίτιοοποιοδήποτε βιολογικό πρόσδεμα (προσδέματα) TLR- IDC-1001 (επίσης γνωστό ως GLA-SE- σταθερό γαλάκτωμα ανοσοενισχυτικού με βάση λιπίδια γλυκοπυρανοζυλίου (Coler et al., PLoS One, 2010. 5(10): p. e13677; Coler et al., PLoS One, 2011. 6(1): p. e16333); CpG (Mullen et al., PLoS One, 2008. 3(8): p. e2940), ή οποιονδήποτε συνδυασμό αυτών. Η ποσότητα του ανοσοενισχυτικού, ο τρόπος τυποποίησής του και ο τρόπος με τον οποίο χορηγούνται όλες οι παράμετροι ανευρίσκονται ικανοποιητικά εντός της αρμοδιότητας του ατόμου της συνήθους εμπειρίας στην τεχνική.

[0118] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, μια σύνθεση της αποκάλυψης περιλαμβάνει περαιτέρω ένα λιπόσωμα ή άλλο σωματιδιακό φορέα, που μπορεί να χρησιμεύσει π.χ., στην σταθεροποίηση της φαρμακοτεχνικής μορφής, στη στόχευση της φαρμακοτεχνικής μορφής σε έναν συγκεκριμένο ιστό, όπως λεμφοειδή ιστό, ή στην αύξηση της ημιζωής της πολυπεπτιδικής σύνθεσης. Τέτοιοι σωματιδιακοί φορείς περιλαμβάνουν γαλακτώματα, αφρούς, μικκύλια, αδιάλυτες μονοστιβάδες, υγρούς κρυστάλλους, διασπορές φωσφολιπιδίων, ελασματοειδείς στρώσεις, iscom και τα συναφή. Σε αυτά τα παρασκευάσματα, το πολυπεπτίδιο που περιγράφεται στο παρόν μπορεί να ενσωματωθεί ως μέρος ενός λιποσώματος ή άλλου σωματιδίου, ή μπορεί να χορηγηθεί σε συνδυασμό με ένα λιπόσωμα. Τα λιποσώματα για χρήση σύμφωνα με την αποκάλυψη μπορεί να σχηματιστούν από πρότυπα λιπίδια σχηματισμού κυστιδίων, τα οποία γενικά περιλαμβάνουν ουδέτερα και αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια και στερόλη, όπως χοληστερόλη. Μια σύνθεση που περιλαμβάνει ένα λιπόσωμα ή άλλο σωματιδιακό εναιώρημα καθώς και το πολυπεπτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να χορηγηθεί ενδοφλέβια, επιτόπια, τοπικά, κτλ σε μια δόση η οποία ποικίλλει ανάλογα, μεταξύ άλλων, με τον τρόπο χορήγησης, με το πολυπεπτίδιο που παρέχεται και το στάδιο της νόσου που υποβάλλεται σε αγωγή.

[0119] Για στερεές συνθέσεις μπορεί να χρησιμοποιηθούν συμβατικοί μη τοξικοί στερεοί φορείς οι οποίοι περιλαμβάνουν, για παράδειγμα, μαννιτόλη, λακτόζη, άμυλο, στεατικό μαγνήσιο, σακχαρίνη νατρίου, τάλκη, κυτταρίνη, γλυκόζη, σακχαρόζη, ανθρακικό μαγνήσιο φαρμακευτικού βαθμού και τα συναφή. Για χορήγηση από του στόματος, σχηματίζεται μια φαρμακευτικώς αποδεκτή μη τοξική σύνθεση με ενσωμάτωση οποιουδήποτε από τα φυσιολογικά χρησιμοποιούμενα έκδοχα, όπως εκείνων των φορέων που απαριθμήθηκαν προηγουμένως και γενικά 10-95% του δραστικού συστατικού, δηλαδή, του πολυπεπτιδίου όπως περιγράφεται στο παρόν, συχνά σε συγκέντρωση από 25%-75%.

[0120] Για χορήγηση με αερόλυμα ή εκ του βλεννογόνου, το πολυπεπτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να παρέχεται σε λεπτοδιαμερισμένη μορφή, προαιρετικά μαζί με ένα επιφανειοδραστικό και προωθητικό ή/και βλεννοπροσκολλητικό μέσο, π.χ., χιτοζάνη. Το επιφανειοδραστικό μέσο πρέπει, φυσικά, να είναι φαρμακευτικώς αποδεκτό και σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης να είναι διαλυτό στο προωθητικό μέσο. Αντιπροσωπευτικοί τέτοιοι παράγοντες είναι οι εστέρες ή μερικοί εστέρες λιπαρών οξέων που περιέχουν από 6 έως 22 άτομα άνθρακα, όπως καπροϊκό, οκτανοϊκό, λαυρικό, παλμιτικό, στεατικό, λινολεϊκό, λινολενικό, ολεστερικό και ελαϊκό οξύ με μια αλειφατική πολυϋδρική αλκοόλη ή τον κυκλικό ανυδρίτη αυτής. Μπορεί να χρησιμοποιηθούν μικτοί εστέρες, όπως μικτά ή φυσικά γλυκερίδια. Το επιφανειοδραστικό μέσο μπορεί να συνιστά 0.1%-20% κατά βάρος της σύνθεσης, σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης 0.25-5% κατά βάρος. Την ισορροπία της σύνθεσης την δίνει συνήθως το προωθητικό μέσο, αν και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας ψεκαστήρας στον οποίο δεν είναι απαραίτητο το προωθητικό μέσο και τα άλλα ποσοστά προσαρμόζονται αναλόγως. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, τα ανοσογόνα πολυπεπτίδια μπορεί να ενσωματωθούν σε ένα αεροδυναμικά ελαφρύ σωματίδιο, όπως εκείνα τα σωματίδια που περιγράφονται στο Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Υπ’ Αρ. 6,942,868 ή στην Αίτηση του Διπλώματος Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Υπ’ Αρ. 2005/0008633. Μπορεί επίσης να συμπεριληφθεί ένας φορέας, π.χ., λεκιθίνη για ενδορινική χορήγηση.

[0121] Η αποκάλυψη απευθύνεται, επίσης, σε μια μέθοδο παραγωγής της σύνθεσης σύμφωνα με την αποκάλυψη. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, η μέθοδος παραγωγής της σύνθεσης περιλαμβάνει (α) την απομόνωση ενός πολυπεπτιδίου σύμφωνα με την αποκάλυψη και (β) την προσθήκη ενός ανοσοενισχυτικού, φορέα ή/και εκδόχου στο απομονωμένο πολυπεπτίδιο. Ορισμένες υλοποιήσεις αποκαλύπτουν περαιτέρω συνδυασμό του πολυπεπτιδίου με άλλα σταφυλοκοκκικά αντιγόνα.

[0122] Ορισμένες ενσωματώσεις της αποκάλυψης περιλαμβάνουν ένα πολυσθενές εμβόλιο. Ένα πολυσθενές εμβόλιο της παρούσας αποκάλυψης μπορεί να περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή ένα πολυνουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT ή/και PSM και ένα ή περισσότερα πρόσθετα ανοσογόνα συστατικά. Τέτοια συστατικά μπορεί να είναι πρόσθετα ανοσογόνα του ίδιου μολυσματικού παράγοντα, π.χ., του S. aureus, ή από άλλους σταφυλόκοκκους, ή μπορεί να είναι ανοσογόνα που προέρχονται από άλλους μολυσματικούς παράγοντες οι οποίοι μπορεί να χορηγούνται αποτελεσματικά, βολικά, ή οικονομικά μαζί. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, μπορεί να συνδυαστεί με άλλες τοξίνες ή άλλα εμβόλια με βάση μολυσματικά συστατικά για να κατασκευαστεί ένα πολυσθενές εμβόλιο με ευρεία βάση τοξινών ικανό να στοχεύει πολλαπλούς βακτηριακούς μολυσματικούς καθοριστές. Σε άλλες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να συντηχθεί με άλλους ανοσογόνους, βιολογικώς σημαντικούς, ή προστατευτικούς επιτόπους που περιέχουν πολυπεπτίδια ώστε να παραχθεί ένα πολυσθενές εμβόλιο με μια μονή αλυσίδα και να προκληθεί ανοσολογική απόκριση έναντι πολλαπλών αντιγόνων. Σε μια άλλη ακόμη υλοποίηση της αποκάλυψης, το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, μπορεί να συντηχθεί με έναν ή περισσότερους επιτόπους Τ-κυττάρων ώστε να προκληθεί Τ-κυτταρική ανοσία.

VI. Μέθοδοι Αγωγή/Πρόληψης και Σχήματα

[0123] Παρέχεται, επίσης, μια μέθοδος αγωγής ή πρόληψης μιας λοίμωξης από Staphylococcus, π.χ., λοίμωξη από S. aureus ή αγωγή ή πρόληψη μιας ασθένειας που προκαλείται από Staphylococcus, π.χ., S. aureus σε ένα υποκείμενο, η οποία περιλαμβάνει τη χορήγηση σε ένα υποκείμενο που έχει ανάγκη αυτής μιας σύνθεσης όπως περιγράφεται στο παρόν που περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή πολυνουκλεοτίδια, φορείς, ή κύτταρα ξενιστές που κωδικοποιούν αυτά. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, το υποκείμενο είναι ένα ζώο, π.χ., ένα σπονδυλωτό, π.χ., ένα θηλαστικό, π.χ., ένας άνθρωπος. Ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης περιλαμβάνουν μια μέθοδο επαγωγής ανοσολογικής απόκρισης έναντι ενός στελέχους S. aureus που περιλαμβάνει τη χορήγηση σε ένα υποκείμενο που έχει ανάγκη της εν λόγω ανοσολογικής απόκρισης μιας αποτελεσματικής ποσότητας μιας σύνθεσης που περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή πολυνουκλεοτίδια, φορείς, ή κύτταρα ξενιστές που κωδικοποιούν αυτά.

[0124] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, ένα υποκείμενο δέχεται χορήγηση μιας σύνθεσης που περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή πολυνουκλεοτίδια, φορείς, ή κύτταρα ξενιστές που κωδικοποιούν τα ίδια προφυλακτικά, π.χ., ως προφυλακτικό εμβόλιο, για την καθιέρωση ή ενίσχυση της ανοσίας στο Staphylococcus, π.χ., S. aureus, σε ένα υγιές ζώο πριν από τη δυνητική ή πραγματική έκθεση στον Staphylococcus, π.χ., S. aureus ή μείωση ενός συμπτώματος που σχετίζεται με το Staphylococcus, αποτρέποντας έτσι την ασθένεια, ανακουφίζοντας από τα συμπτώματα, μειώνοντας τα συμπτώματα, ή μειώνοντας τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων της νόσου. Σε μία υλοποίηση της παρούσας αποκάλυψης η ασθένεια είναι μια αναπνευστική νόσος, π.χ., πνευμονία. Άλλες ασθένειες ή παθήσεις που υποβάλλονται σε αγωγή ή πρόληψη περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, βακτηριαιμία, σηψαιμία, δερματικές λοιμώξεις, λοιμώξεις από τραύμα, ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις οστών και αρθρώσεων, οστεομυελίτιδα, ή/και μηνιγγίτιδα. Μία ή περισσότερες συνθέσεις, πολυπεπτίδια, πολυνουκλεοτίδια, φορείς ή κύτταρα ξενιστές όπως περιγράφονται στο παρόν μπορεί, επίσης, να χρησιμοποιηθούν για την αγωγή ενός υποκειμένου που έχει ήδη εκτεθεί σε Staphylococcus, π.χ., S. aureus, ή ήδη πάσχει από ένα σύμπτωμα σχετικό με Staphylococcus για περαιτέρω διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος του ζώου, μειώνοντας ή εξαλείφοντας έτσι τα συμπτώματα που σχετίζονται με αυτή την έκθεση. Όπως ορίζεται στο παρόν, η «αγωγή ενός ζώου» αναφέρεται στη χρήση μίας ή περισσοτέρων συνθέσεων, πολυπεπτιδίων, πολυνουκλεοτιδίων, φορέων, ή κυττάρων ξενιστών της αποκάλυψης για την πρόληψη, θεραπεία, καθυστέρηση, ή μείωση της σοβαρότητας των συμπτωμάτων του S. aureus σε ένα ζώο ή/και τη μη επιδείνωση των συμπτωμάτων του S. aureus για μια συγκεκριμένη χρονική περίοδο. Δεν απαιτείται καμία σύνθεση, πολυπεπτίδιο, πολυνουκλεοτίδιο, φορέας, ή κύτταρο ξενιστής όπως περιγράφεται στο παρόν να παρέχει πλήρη προστασία έναντι μιας σταφυλοκοκκικής λοίμωξης ή πλήρη θεραπεία ή εξάλειψη όλων των συμπτωμάτων που σχετίζονται με το Staphylococcus.

[0125] Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, «ένα υποκείμενο που έχει ανάγκη θεραπευτικής ή/και προληπτικής ανοσίας» αναφέρεται σε ένα υποκείμενο στο οποίο είναι επιθυμητή η αγωγή, δηλαδή, η πρόληψη, η θεραπεία, η επιβράδυνση, ή η μείωση της σοβαρότητας των συμπτωμάτων που σχετίζονται με το Staphylococcus, ή η μη επιδείνωση των συμπτωμάτων που σχετίζονται με το Staphylococcus για μια καθορισμένη χρονική περίοδο. Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, «ένα υποκείμενο που έχει ανάγκη ανοσολογικής απόκρισης» αναφέρεται σε ένα υποκείμενο για το οποίο είναι επιθυμητή μια ανοσολογική απόκριση (αποκρίσεις) έναντι μιας ασθένειας που σχετίζεται με το Staphylococcus.

[0126] Η αγωγή με φαρμακευτικές συνθέσεις που περιλαμβάνουν μια ανοσογόνο σύνθεση, πολυπεπτίδιο ή πολυνουκλεοτίδιο όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να λάβει χώρα ξεχωριστά ή σε συνδυασμό με άλλες αγωγές, κατά περίπτωση.

[0127] Σε θεραπευτικές εφαρμογές, μια σύνθεση, πολυπεπτίδιο ή πολυνουκλεοτίδιο της αποκάλυψης χορηγείται σε έναν ασθενή σε μια ποσότητα επαρκή ώστε να προκαλέσει αποτελεσματική έμφυτη, χυμική ή/και κυτταρική απόκριση στο πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT ή/και PSM για να θεραπεύσει ή τουλάχιστον μερικώς να αναστείλει τα συμπτώματα ή τις επιπλοκές.

[0128] Μια ποσότητα επαρκής για να επιτευχθεί αυτό ορίζεται ως «θεραπευτικά αποτελεσματική δόση» ή «μοναδιαία δόση». Οι ποσότητες που είναι αποτελεσματικές για αυτή τη χρήση θα εξαρτηθούν, π.χ., από τη σύνθεση του πολυπεπτιδίου ή του πολυνουκλεοτιδίου, τον τρόπο χορήγησης, το στάδιο και τη σοβαρότητα της νόσου που υποβάλλεται σε αγωγή, το βάρος και τη γενική κατάσταση της υγείας του ασθενούς και την κρίση του συνταγογραφούντος ιατρού. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, μια δόση εκκίνησης ακολουθείται από μια δόση ενίσχυσης για μια χρονική περίοδο.

[0129] Σε εναλλακτικές υλοποιήσεις της αποκάλυψης, γενικά σε ανθρώπους χορηγείται μια αρχική ανοσοποίηση (δηλαδή για θεραπευτική ή προφυλακτική χορήγηση) που ακολουθείται από δοσολογική ενίσχυση στο ίδιο εύρος δόσεων σύμφωνα με ένα σχήμα ενίσχυσης για μια περίοδο εβδομάδων έως μηνών ανάλογα με την απόκριση και την πάθηση του ασθενούς με μέτρηση της απόκρισης αντισωμάτων ή Τ λεμφοκυττάρων στο αίμα του ασθενούς.

[0130] Τα πολυπεπτίδια και οι συνθέσεις όπως περιγράφονται στο παρόν μπορεί γενικά να χρησιμοποιηθούν σε σοβαρές καταστάσεις ασθένειας, δηλαδή, σε καταστάσεις απειλητικές για τη ζωή ή δυνητικά απειλητικές για τη ζωή. Σε τέτοιες περιπτώσεις, ενόψει της ελαχιστοποίησης των ξένων ουσιών και της σχετικής μη τοξικής φύσης των πολυπεπτιδίων, είναι δυνατόν και μπορεί να θεωρηθεί επιθυμητό από τον θεράποντα ιατρό να χορηγηθεί ουσιαστικά περίσσεια αυτών των πολυπεπτιδικών συνθέσεων.

[0131] Για θεραπευτική χρήση, η χορήγηση μπορεί να ξεκινήσει από το πρώτο σημείο λοίμωξης από τον S. aureus ή από παράγοντες κινδύνου. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, η αρχική δόση ακολουθείται από δόσεις ενίσχυσης έως ότου, π.χ., τα συμπτώματα ουσιαστικά να υποχωρήσουν και για μια περίοδο αμέσως μετά. Σε συχνή λοίμωξη, μπορεί να απαιτούνται δόσεις φόρτωσης που ακολουθούνται από δόσεις ενίσχυσης.

[0132] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, η σύνθεση όπως περιγράφεται στο παρόν παρέχεται σε ένα υποκείμενο με μεθόδους που περιγράφονται στο παρόν, επιτυγχάνοντας με τον τρόπο αυτό μια αποτελεσματική ανοσολογική απόκριση ή/και μια αποτελεσματική θεραπευτική ή προληπτική ανοσολογική απόκριση. Οποιοσδήποτε τρόπος χορήγησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί εφόσον ο τρόπος καταλήγει στην παροχή ή/και την έκφραση του επιθυμητού πολυπεπτιδίου στον επιθυμητό ιστό, σε μια ποσότητα επαρκή ώστε να προκληθεί ανοσολογική απόκριση στον Staphylococcus, π.χ., S. aureus ή/και να προκληθεί μια προφυλακτικώς ή θεραπευτικώς αποτελεσματική ανοσολογική απόκριση στον Staphylococcus, π.χ., στον S. aureus, σε ένα ζώο που έχει ανάγκη από μια τέτοια απόκριση. Σύμφωνα με τις αποκαλυπτόμενες μεθόδους, μια σύνθεση που περιγράφεται στο παρόν μπορεί να χορηγηθεί με χορήγηση εκ του βλεννογόνου, διαδερμική χορήγηση, υποδόρια ένεση, ενδοφλέβια ένεση, από του στόματος χορήγηση, πνευμονική χορήγηση, ενδομυϊκή (i.m.) χορήγηση, ή μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης. Άλλες κατάλληλες οδοί χορήγησης περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, ενδοτραχειακή, διαδερμική, ενδοφθάλμια, ενδορινική, μέσω εισπνοής, εντός κοιλότητας, εντός πόρου {π.χ., στο πάγκρεας) και ενδοπαρεγχυματική χορήγηση (δηλαδή, σε οποιονδήποτε ιστό). Η διαδερμική χορήγηση περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, ενδοδερμική {π.χ., στο δέρμα ή την επιδερμίδα), διαμέσου του δέρματος (π.χ., διαδερμική) και διαβλεννογονική χορήγηση (δηλαδή, εντός ή διαμέσου του δέρματος ή του ιστού του βλεννογόνου). Η χορήγηση εντός κοιλοτήτων περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, χορήγηση εντός της στοματικής, κολπικής, ορθικής, ρινικής, περιτοναϊκής, ή εντερικής κοιλότητας καθώς επίσης και ενδορραχιαία (δηλαδή, στη σπονδυλική στήλη), ενδοκοιλιακή (δηλαδή, στις κοιλίες του εγκεφάλου ή τις καρδιακές κοιλίες), ενδο-αρτηριακή (δηλαδή, στον καρδιακό κόλπο) και υπαραχοειδή (δηλαδή στους υπαραχνοειδείς χώρους του εγκεφάλου) χορήγηση.

[0133] Οποιοσδήποτε τρόπος χορήγησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί εφόσον ο τρόπος καταλήγει στην παροχή ή/και την έκφραση του επιθυμητού πολυπεπτιδίου σε μια ποσότητα επαρκή ώστε να προκληθεί ανοσολογική απόκριση στον Staphylococcus, π.χ., S. aureus ή/και να προκληθεί μια προφυλακτικώς ή θεραπευτικώς αποτελεσματική ανοσολογική απόκριση στον Staphylococcus, π.χ., στον S. Aureus,, σε ένα ζώο που έχει ανάγκη μιας τέτοιας απόκρισης. Η χορήγηση όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να πραγματοποιείται π.χ., με ένεση βελόνας, ή άλλη παροχή ή συσκευή γνωστή στην τεχνική.

[0134] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, μια σύνθεση που περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή πολυνουκλεοτίδια, φορείς, ή κύτταρα ξενιστές που κωδικοποιούν τα ίδια, διεγείρει μια απόκριση αντισωμάτων ή μια κυτταρομεσολαβούμενη ανοσολογική απόκριση επαρκή για την προστασία ενός ζώου έναντι του Staphylococcus, π.χ., μιας λοίμωξης από S. aureus. Σε άλλες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, μια σύνθεση που περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή πολυνουκλεοτίδια, φορείς, ή κύτταρα ξενιστές που κωδικοποιούν τα ίδια, διεγείρει τόσο μια χυμική όσο και μια κυτταρομεσολαβούμενη απόκριση, ο συνδυασμός των οποίων είναι επαρκής για την προστασία ενός ζώου έναντι του Staphylococcus, π.χ., μιας λοίμωξης από S. aureus. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, μια σύνθεση που περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή πολυνουκλεοτίδια, φορείς, ή κύτταρα ξενιστές που κωδικοποιούν τα ίδια, διεγείρει περαιτέρω μια έμφυτη, αντισωμάτων ή/και κυτταρική ανοσολογική απόκριση.

[0135] Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, μια σύνθεση που περιλαμβάνει ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, DT, ή/και PSM όπως περιγράφεται στο παρόν, ή πολυνουκλεοτίδια, φορείς, ή κύτταρα ξενιστές που κωδικοποιούν τα ίδια, μπορεί να επάγει αποκρίσεις αντισωμάτων στον S. aureus. Σε ορισμένες υλοποιήσεις της αποκάλυψης, τα συστατικά που επάγουν αποκρίσεις Τ-κυττάρων ( π.χ ., επίτοποι Τ-κυττάρων) συνδυάζονται με συστατικά όπως τα πολυπεπτίδια που περιγράφονται στο παρόν τα οποία επάγουν κυρίως μια αντίδραση αντισωμάτων.

[0136] Αποκαλύπτεται περαιτέρω μια μέθοδος για τη δημιουργία, την ενίσχυση, ή τη διαμόρφωση μιας προστατευτικής ή/και θεραπευτικής ανοσολογικής απόκρισης έναντι λοίμωξης από τον S. aureus σε ένα υποκείμενο, που περιλαμβάνει τη χορήγηση στο υποκείμενο που έχει ανάγκη θεραπευτικής ή/και προληπτικής ανοσίας μίας ή περισσοτέρων από τις συνθέσεις όπως περιγράφεται στο παρόν.

[0137] Οι συνθέσεις όπως περιγράφονται στο παρόν μπορεί να χορηγηθούν σε ένα ζώο οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής του ζώου στο οποίο χορηγούνται. Στους ανθρώπους, η χορήγηση της σύνθεσης όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί και συχνά συμβαίνει επωφελώς ενώ χορηγούνται και άλλα εμβόλια, π.χ., ως ένα πολυσθενές εμβόλιο όπως περιγράφεται αλλού στο παρόν.

[0138] Επιπλέον, η σύνθεση όπως περιγράφεται στο παρόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οποιοδήποτε επιθυμητό σχήμα ανοσοποίησης ή χορήγησης- π.χ., σε μια εφάπαξ χορήγηση ή εναλλακτικά ως μέρος περιοδικών σχημάτων εμβολιασμού όπως ετήσιων εμβολιασμών, ή όπως σε ένα σχήμα εκκίνησης-ενίσχυσης στο οποίο η σύνθεση ή το πολυπεπτίδιο ή το πολυνουκλεοτίδιο της αποκάλυψης χορηγείται είτε πριν είτε μετά τη χορήγηση του ίδιου ή διαφορετικού πολυπεπτιδίου ή πολυνουκλεοτιδίου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το πρωτόκολλο εκκίνησης-ενίσχυσης είναι συχνά κατάλληλη μέθοδος χορήγησης εμβολίων. Σε ένα πρωτόκολλο εκκίνησης-ενίσχυσης, μία ή περισσότερες συνθέσεις όπως περιγράφονται στο παρόν μπορεί να χρησιμοποιηθούν σε ένα σχήμα «εκκίνησης-ενίσχυσης». Ένα παράδειγμα σχήματος «εκκίνησης-ενίσχυσης» μπορεί να ανευρεθεί στο Yang, Ζ. et al. J. Virol. 77:799-803, 2002.

[0139] Οι λοιμώξεις που υποβάλλονται σε αγωγή περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, τοπική ή συστηματική λοίμωξη του δέρματος, των μαλακών ιστών, του αίματος, ή ενός οργάνου ή μια αυτοάνοση νόσο. Συγκεκριμένες ασθένειες ή παθήσεις που υποβάλλονται σε αγωγή ή πρόληψη περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, αναπνευστικά νοσήματα, π.χ., πνευμονία, σηψαιμία, δερματικές λοιμώξεις, λοιμώξεις από τραύμα, ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις οστών και αρθρώσεων, οστεομυελίτιδα, ή/και μηνιγγίτιδα.

[0140] Ένας αριθμός ζωικών μοντέλων για τη λοίμωξη από S. aureus είναι γνωστός στην τεχνική και μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τις μεθόδους που αποκαλύπτονται στο παρόν χωρίς υπερβολικό πειραματισμό. Για παράδειγμα, ένα μοντέλο χάμστερ πνευμονίας με ανθεκτικότητα στη μεθικιλλίνη του Staphylococcus aureus (MRSA) έχει περιγράφει για την εξέταση αντιμικροβιακών ουσιών. (Verghese A. et al., Chemotherapy. 34:497-503 (1988), Kephart PA. et al. J Antimicrob Chemother. 21:33-9, (1988)). Περαιτέρω, περιγράφεται ένα μοντέλο πνευμονίας που προκαλείται από S. aureus σε ενήλικα, ανοσοεπαρκή ποντίκια C57BL/6J, το οποίο μιμείται στενά τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά της πνευμονίας σε ανθρώπους ασθενείς. (Bubeck-Wardenburg J. et al., Infect Immun. 75:1040-4 (2007)). Επιπρόσθετα, η μολυσματικότητα έχει εξεταστεί σε ένα μοντέλο αρουραίου πνευμονίας από το S. aureus όπως περιγράφεται στο McElroy et al. (McElroy MC. et al., Infect Immun. 67:5541-4 (1999)). Τέλος, έχει καθιερωθεί σε πρόβατα ένα προτυποποιημένο και αναπαραγώγιμο μοντέλο σηπτικής πνευμονίας που προκαλείται από MRSA για την αξιολόγηση νέων θεραπειών. (Enkhbaatar Ρ. et al., Shock. 29(5):642-9 (2008)).

[0141] Η πρακτική της αποκάλυψης θα χρησιμοποιήσει, εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, συμβατικές τεχνικές κυτταρικής βιολογίας, κυτταρικών καλλιεργειών, μοριακής βιολογίας, διαγονιδιακής βιολογίας, μικροβιολογίας, ανασυνδυασμένου DNA και ανοσολογίας, οι οποίες εμπίπτουν στην τεχνογνωσία της τεχνικής. Τέτοιες τεχνικές εξηγούνται πλήρως στη βιβλιογραφία. Βλέπε , για παράδειγμα, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Υπ’ Αρ.: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); και στο Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).

[0142] Πρότυπα έργα αναφοράς που περιγράφουν γενικές αρχές ανοσολογίας περιλαμβάνουν Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology, 6th ed. London: Mosby (2001)· Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed.

5, Elsevier Health Sciences Division (2005); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988).

Παραδείγματα

[0143] Παραδείγματα που δεν εμπίπτουν στο πεδίο των συνημμένων αξιώσεων δεν αποτελούν μέρος της εφεύρεσης.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 1: Δημιουργία εξασθενημένων μεταλλαγμένων μορφών δ-τοξίνης και PSMα3.

[0144] Τα ολιγοπεπτίδια δ-τοξίνης και τα PSM απαιτούν μια αμφίφιλη α-ελικοειδή δομή για να επιδείξουν επιφανειοδραστικές ιδιότητες (Omae, et al., 2012, J Biol Chem, 287 (19):15570-15579; Wang, et al., 2007, Nat Med, 13 ( 12): 1510- 1514). Αυτά τα πεπτίδια αποτελούνται από μια υδρόφοβη και μια υδρόφιλη επιφάνεια όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α για τα τέσσερα ολιγοπεπτίδια PSM-α, τα δύο ολιγοπεπτίδια PSM-β και το ολιγοπεπτίδιο δ-τοξίνης. Αυτά τα πεπτίδια αποτελούνται από μια υδρόφοβη και μια υδρόφιλη επιφάνεια όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α για τα τέσσερα ολιγοπεπτίδια PSM-a, τα δύο ολιγοπεπτίδια PSM-β και το ολιγοπεπτίδιο δ-τοξίνης. Η υδρόφοβη όψη του PSM-mec φαίνεται στο Σχήμα 1Α (υδρόφοβη όψη που φαίνεται στο κάτω μισό των κυκλικών εικόνων των πεπτιδίων). Τα πεπτίδια παρουσιάζονται στον Πίνακα 3, με τα κατάλοιπα υδρόφοβης όψης υπογραμμισμένα.

[0145] Οι δομές ελικοειδούς τροχού που παρουσιάζονται στο Σχήμα 1 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Heliquest (heliquest.ipmc.cnrs.fr) για τον καθορισμό και την εμφάνιση ιδιοτήτων όπως η υδροφοβικότητα και η υδρόφοβη ροπή και το καθαρό φορτίο (z) (Gautier, et al., 2008, Bioinformatics, 24 (18):2101 -2102). Οι μεταλλαγές που διαταράσσουν την ελικοειδή δομή μπορεί να εξαλείψουν τις επιφανειοδραστικές ιδιότητες (Omae, et al., 2012, J Biol Chem, 287 (19): 15570-15579) αλλά θα μπορούσαν επίσης και να μειώσουν την ισχύ του εμβολίου της μεταλλαγμένης μορφής. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε μεταλλαγμένες μορφές ελαχιστοποιώντας τη διάσπαση της α-έλικας και διατηρώντας την ανοσογονικότητα των πεπτιδίων. Για την εξάλειψη των επιφανειοδραστικών ιδιοτήτων αντικαταστήσαμε αρκετά αμινοξέα στην υδρόφοβη όψη των PSMα3 και δ-τοξίνης με λιγότερο υδρόφοβα αμινοξέα όπως η αλανίνη και η γλυκίνη. Το μοντέλο προβλέπει ότι αυτά τα μικρά αμινοξέα δεν θα αλλάξουν δραστικά την πρωτεϊνική δομή αλλά θα μειώσουν σημαντικά την υδροφοβικότητα ( Σχήμα 1Β). Εισαγάγαμε μεταλλαγές σε δύο κατάλοιπα στην υδρόφοβη όψη τόσο του PSMα3 (V4 και L 14) όσο και της δ-τοξίνης (L12 και V20). Οι μεταλλαγμένες μορφές παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.

ΠΙΝΑΚΑΣ 4: ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΕΝΩΝ ΤΟΞΙΝΩΝ

[0146] Κατασκευάσαμε μονά και διπλά μεταλλαγμένες μορφές αντικαθιστώντας αυτά τα δύο αμινοξέα είτε με αλανίνη είτε με γλυκίνη είτε και με τις δύο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, τα μεταλλαγμένα κατασκευάσματα έχουν μειωμένη υδροφοβικότητα και υδρόφοβη ροπή σε σύγκριση με την τοξίνη άγριου τύπου όπως αναλύθηκε από το πρόγραμμα Heliquest (Gautier, et al., 2008, Bioinformatics, 24 (18):2101-2102) . Παρόμοιες μεταλλαγμένες μορφές μπορεί να παραχθούν με περαιτέρω μεταλλαγές στην υδρόφοβη όψη ως επιπρόσθετα δυνητικά εξασθενημένα τοξοειδή.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 2: Αξιολόγηση της εξασθένησης των μεταλλαγμένων μορφών δτοξίνης και PSMα3

[0147] Οι μεταλλαγές ala1, ala2 και gly2 ενσωματώθηκαν στην αλληλουχία της τοξίνης δέλτα και οι μεταλλαγμένες μορφές εξετάστηκαν ως προς τη λυτική δραστικότητα σε σχέση με τα ερυθρά αιμοσφαίρια αλόγου (HRBC) με την ακόλουθη μέθοδο. Δοκιμασία τοξικότητας χρησιμοποιώντας αίμα αλόγου: 5 ml αίματος αλόγου φυγοκεντρήθηκε στις 2,000 RPM για 10 λεπτά στους 20 °C. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το ίζημα πλύθηκε μία φορά με 15 ml PBS. Το απαιτούμενο ποσοστό των κυττάρων RBC αλόγου παρασκευάστηκε σε PBS με επαναιώρηση του ιζήματος (wt/vol). 100 μl των διαφόρων ολιγοπεπτιδίων προστέθηκαν σε 100 μl RBC αλόγου (διαφορετικό ποσοστό κατά περίπτωση) σε πλάκα αραίωσης ELISA και έπειτα οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 °C για 45 λεπτά. Οι πλάκες, στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκαν και 100 μl του υπερκείμενου μεταφέρθηκαν σε μια νέα πλάκα ELISA NUNC. Η απορρόφηση στο υπερκείμενο προσδιορίστηκε με αναγνώστη πλακών VersamaxTM (Molecular Devices CA) στα 416 nm. Η οπτική πυκνότητα του υπερκειμένου αντανακλά τον βαθμό αιμόλυσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων που προκαλείται από την τοξίνη.

[0148] Δοκιμασία εξουδετέρωσης: Για την εξουδετέρωση, αραιωμένα δείγματα ορού προστέθηκαν σε 50 μl των διαφόρων ολιγοπεπτιδίων (12.5 μg/ml), επωάστηκαν 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια προστέθηκαν 100 μΐ 5% RBC αλόγου. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 °C για 45 λεπτά. Οι πλάκες στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και 100 μl του υπερκείμενου μεταφέρθηκαν σε νέα πλάκα ELISA NUNC. Η απορρόφηση στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε με αναγνώστη πλακών VersamaxTM (Molecular Devices CA) στα 416 nm.

[0149] Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, οι μεταλλαγμένες μορφές τοξινών δέλτα ala1 (L12A), ala2 (L12A/V20A) και gly2 (L12G/V20G) ήταν πλήρως εξασθενημένες. Για να ελεγχθεί το εάν οι μεταλλαγμένες μορφές διατηρούν τους επιτόπους εξουδετέρωσης, εξετάσαμε την μεταλλαγμένη μορφή της τοξίνης δέλτα -ala2 ως προς τη δέσμευση σε ανθρώπινα αντισώματα εξουδετέρωσης σε μια ομάδα ανθρώπινων ορών υψηλού τίτλου που παράγεται με διαλογή μεμονωμένων φυσιολογικών ορών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η τοξικότητα των τοξινών δέλτα μπορεί να εξουδετερωθεί αποτελεσματικά με αραίωση 1:450 της ομάδας ανθρώπινου ορρού. Η τοξίνη δέλτα -ala2 δεν προκάλεσε σημαντική λύση των κυττάρων ούτε άλλαξε την τοξικότητα της τοξίνης δέλτα όταν συνδυάστηκαν η τοξίνη και η μεταλλαγμένη μορφή. Ωστόσο, η προ-επώαση με την τοξίνη δέλτα ala2 (22.5 μg/ml) μείωσε σημαντικά την ικανότητα εξουδετέρωσης των ανθρώπινων ορών ( Σχήμα 3, σύγκριση 3<ης>και 7<ης>ράβδου) προς τοξίνη δέλτα (11.25 μg/ml). Δεδομένου ότι η διπλάσια περίσσεια μεταλλαγμένης μορφής μπορεί να μειώσει σημαντικά την ικανότητα εξουδετέρωσης των ορών κατά ~50% δείχνει ότι η εξασθενημένη μεταλλαγμένη μορφή διατηρεί την ικανότητα να δεσμεύεται σε αντισώματα εξουδετέρωσης που υπάρχουν στον ανθρώπινο ορό.

[0150] Παρασκευάσαμε, επίσης, μεταλλαγμένες μορφές στις θέσεις V4 και L15 του PSMα3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 , η μεταλλαγμένη μορφή και των δύο αυτών θέσεων από PSM σε γλυκίνη (PSM-gly2: V4A/L15A) εξασθένησε έντονα την τοξίνη ενώ οι άλλες μεταλλαγές εμφάνισαν μερική εξασθένιση.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 3: Δημιουργία κατασκευασμάτων συντηξης του ΑΤ62 με τοξίνη δέλτα και PSM

[0151] Το εμβόλιο ΑΤ62 έδειξε αποτελεσματικότητα όταν εξετάστηκε σε διαφορετικά ζωικά μοντέλα (Adhikari, et al., 2012, PLoS One, 7 (6):e38567). Δημιουργήσαμε τρεις πρωτεΐνες σύντηξης με ΑΤ62 ως την πυρηνική υπομονάδα συντηγμένη σε PSMα3, δτοξίνη, ή και τα δύο χρησιμοποιώντας έναν εύκαμπτο συνδέτη (GGGGS- δηλαδή G4S) που πλαισιώνεται από μια C-τελική 6xHis (Σχήμα 5Α&Β). Παρασκευάστηκαν οι αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων υπέστησαν βελτιστοποίηση κωδικονίου για έκφραση σε Ε. Coli και οι τρεις πρωτεΐνες σύντηξης παρήχθησαν σε μικρή κλίμακα. Η ειδικότητα και το μέγεθος των κατασκευασμάτων επιβεβαιώθηκαν με στύπωμα Western με ΑΤ62 ειδικά αντισώματα (6C12) (Σχήμα 5Γ). Οι αλληλουχίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 5. Σε κάθε περίπτωση, το ολιγοπεπτίδιο ΑΤ62 είναι απλά υπογραμμισμένο, η τοξίνη δέλτα είναι διπλά υπογραμμισμένη και το PSM PSMα3 έχει διακεκομμένη υπογράμμιση. Περιγράφονται, επίσης, επιπρόσθετες πρωτεΐνες σύντηξης που περιλαμβάνουν την ΑΤ62 και την σταφυλοκοκκική εξωτοξίνη Β (SEB)

ΠΙΝΑΚΑΣ 5 ΟΛΙΓΟΠΕΠΤΙΔΙΑ ΣΥΝΤΗΞΗΣ ME ΑΤ62

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 4: Ανοσογονικότητα των κατασκευασμάτων σύντηξης

[0152] Η ανοσογονικότητα δύο εκ των κατασκευασμάτων σύντηξης (AT62 DT και AT62 PSM) μαζί με τον μάρτυρα (ΑΤ62 ΑΑ) εξετάστηκε σε ποντίκια Swiss Webster σε ομάδες των 4, 4 και 8 ποντικών, αντίστοιχα. Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν υποδόρια με τις πρωτεΐνες (10 pg) μαζί με ανοσοενισχυτικό (Σύστημα Sigma Adj- ένα ανοσοενισχυτικό με βάση το MPL) (5 pg) τρεις φορές σε διαστήματα δύο εβδομάδων (ημέρες 0, 14 & 28). Μετά την τρίτη ανοσοποίηση, τα ποντίκια ενισχύθηκαν με το αντίστοιχο πεπτίδιο δ-τοξίνης ή PSMa3 (10 μg) και τα δείγματα ορού που συλλέχθηκαν από τα ποντίκια εξετάστηκαν ως προς τη δέσμευση στο αντιγόνο χρησιμοποιώντας ELISA όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Adhikari, et al., 2012, PLoS One, 7 (6):e38567). Εν συντομία, πλάκες των 96 φρεατίων επικαλύφθηκαν με 100 ng/φρεάτιο τοξίνης άλφα πλήρους μήκους (List Biological Laboratories, Campbell, CA), PSMα3, ή τοξίνης δέλτα όλη τη νύκτα στους 4 °C. Οι πλάκες παρεμποδίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Starting Block (Thermo Scientific) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν 1:100 χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα Starting Block ως αραιωτικό. Οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές και εφαρμόστηκαν αραιώσεις δειγμάτων στα 100 μl/φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για μία ώρα σε RT και πλύθηκαν τρεις φορές πριν την εφαρμογή του συζεύγματος, κατσίκας αντι-ποντικού IgG (H&L)-HRP (υπεροξειδάση χρένου) σε ρυθμιστικό Starting Block. Οι πλάκες επωάστηκαν για μία ώρα σε RT, πλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και επωάστηκαν με ΤΜΒ (3,3',5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνη) για την ανίχνευση HRP για 30 λεπτά. Η οπτική πυκνότητα στα 650 nm μετρήθηκε με τη χρήση συσκευής ανάγνωσης πλακών Versamax™ (Molecular Devices CA).

[0153] Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα κατασκευάσματα σύντηξης AT62-PSM και AT62-DT εμφάνισαν ισχυρή απόκριση αντισωμάτων σε άλφα αιμολυσίνη που έδειξε ότι το ΑΤ62 διατηρούσε την ανοσογονικότητα του στο πλαίσιο του κατασκευάσματος σύντηξης. Η απόκριση στα πεπτίδια PSMa3 και δ-τοξίνης ανιχνεύθηκε, επίσης, αν και σε χαμηλότερο επίπεδο. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι είναι δυνατή η επαγωγή απόκρισης αντισωμάτων και στα δύο συστατικά.

[0154] Τα ακόλουθα πρόσθετα κατασκευάσματα θα κατασκευαστούν και θα δοκιμασθούν:

• Σύντηξη μιας μεμονωμένης PSMa3 ή δ-τοξίνης ή 2, 3, 4, 5 ή 6 διαδοχικών επαναλήψεων PSMα3 ή δ-τοξίνης (άγριου τύπου ή οποιωνδήποτε μεταλλαγμένων μορφών) στοΝ- ή C-τελικό άκρο των μεταλλαγμένων μορφών εξασθενημένου LukS-PV όπως περιγράφεται στο έγγραφο PCT/US 12/67483.

· Σύντηξη μιας μεμονωμένης PSMα3 ή δ-τοξίνης ή 2, 3, 4, 5 ή 6 διαδοχικών επαναλήψεων PSMα3 ή δ-τοξίνης (άγριου τύπου ή οποιωνδήποτε μεταλλαγμένων μορφών) στο Ν- ή C-τελικό άκρο των εξασθενημένων εμβολίων υπεραντιγόνου SΕBL45R/Y89A/Y94A,SEAL48R/D70R/Y92A, ή TSST- 1L30R/D27A/I46A -• Σύντηξη μιας μεμονωμένης PSMα3 ή δ-τοξίνης ή 2, 3, 4, 5 ή 6 διαδοχικών επαναλήψεων PSMα3 ή δ-τοξίνης (άγριου τύπου ή οποιωνδήποτε μεταλλαγμένων μορφών) μαζί με το AT 62 σε οποιοδήποτε από τα εξασθενημένα εμβόλια υπεραντιγόνων SΕBL45R/Y89A/Y94A,SEAL48R/D70R/Y92A,ή TSST- 1L30R/D27A/I46A -

[0155] Ένα παράδειγμα τριών δυνητικών κατασκευασμάτων σύντηξης παρουσιάζεται σχηματικά στο Σχήμα 7.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 5: Μεταλλαγμένη μορφή τριπλής σύντηξης σταφυλοκοκκικών τοξοειδών υπεραντιγόνων

[0156] Το πλέον διαδεδομένα υπεραντιγόνα του S. aureus (Sag) είναι τα SEB, SEC, SEA και TSST-1. Ανασυνδυασμένα εμβόλια για SEB, SEA και TSST-1 (αντικείμενα των Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ 6,713,284; 6,399,332; 7,087,235; 7,750,132; 7,378,257 και 8,067,202) αναπτύχθηκαν και εξετάστηκαν ξεχωριστά ως προς την προστατευτική αποτελεσματικότητά τους σε μοντέλα συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (Bavari, et al., 1996, J Infect Dis,; Bavari and Ulrich, 1995, Infect Immun, 63 (2):423-429; Boles, et al., 2003 Clin Immunol, 108 ( 1):51 -59; Boles, et al., 2003, Vaccine, 21 (21-22):2791-2796; Ulrich, et al., 1998, Vaccine, 16 ( 19): 1857- 1864). Ενώ τα SAg διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις επιπλοκές της νόσου που προκαλείται από SA, ένα σημαντικό εμπόδιο στην ανάπτυξη εμβολίων με βάση τα SAg είναι το γεγονός ότι υπάρχουν >20 παραλλαγές αυτών των τοξινών σε διάφορα στελέχη SA.

[0157] Αξιολογήσαμε την ικανότητα των ανθρώπινων αντισωμάτων σε SEB, SEA και TSST-1 να εξουδετερώνουν ένα ευρύ φάσμα Sag του S. aureus, με τις ακόλουθες μεθόδους.

[0158] Καθαρισμός συγγένειας των ανθρώπινων αντισωμάτων αντι-SAg. Τα SEA, SEB και TSST-1 συζεύχθηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης (1 mg SAg ανά 1 mL όγκου σφαιριδίου) μιας στήλης Aminolink® συν ακινητοποίησης (Thermo Scientific, Rockford, IL) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ο καθαρισμός συγγένειας των ειδικών αντισωμάτων από IVIG (Omrix Biopharmaceuticals, Nes-Ziona, Israel) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις: 50 mL IVIG επωάστηκαν με σφαιρίδια συζευγμένα με τοξίνη για 1 ώρα και 30 λεπτά σε RT με ήπια ταλάντωση, φυγοκεντρήθηκαν, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και προστέθηκαν 50 mL πρόσφατα παρασκευασμένου IVIG που επωάστηκαν με τα σφαιρίδια για άλλη 1 ώρα και 30 λεπτά. Η έκλουση πραγματοποιήθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα HC1 γλυκίνης pH 2.5. Για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών, τα κλάσματα που εκλούστηκαν συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης, που περιείχε (0.1 Μ Tris) pH 9 για να δώσουν ένα τελικό pH μεταξύ 6-7. Η συγκέντρωση των καθαρισμένων με συγγένεια αντισωμάτων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία BCA.

[0159] Δοκιμασία εξουδετέρωσης τοξίνης in vitro. Μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος απομονώθηκαν από ηπαρινισμένο αίμα ταυτοποιημένων υγιών ανθρωπίνων δοτών με φυγοκέντρηση διαβάθμισης φικόλης όπως περιγράφεται αλλού (Berthold, 1981, Blut, 43 (6):367-371). Τα απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος πλύθηκαν δύο φορές με PBS, καταψύχθηκαν σε 10% DMSO σε αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό εμβρύου μόσχου (HI-FBS) όλη τη νύκτα στους -80 °C και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο μέχρι περαιτέρω χρήση. Για τη δοκιμασία, τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640, συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), μη βασικά αμινοξέα, πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη. Τα κύτταρα απαριθμήθηκαν με αποκλεισμό Trypan blue και ρυθμίσθηκαν σε 2χ10<6>κύτταρα/ml. 75 μl αυτού του κυτταρικού εναιωρήματος (1.5χ10<5>κύτταρα) με βιωσιμότητα >95% προστέθηκαν στα φρεάτια μίας πλάκας 96 φρεατίων που περιείχε μίγματα αντισώματος/αντιγόνου εις διπλούν ως εξής: 37.5 μl των καθαρισμένων με συγγένεια αντι-SEA, -SEB, - TSST-1, σε ημιλογαριθμικές αραιώσεις (0.02-20 μg/ml) ή IVIG σε ημιλογαριθμικές αραιώσεις (2.5- 2500 μg/ml) IVIG και 37.5 μl ενός παρασκευάσματος 1 ng/ml είτε SEB, SEC1-3, SEE, SEH, SEI, SEK, TSST-1, SpeC, είτε 2 ng/ml SED, είτε 3 ng/ml SpeA. Για να εξεταστεί η συνεργιστική δραστικότητα των καθαρισμένων πολυκλωνικών Ab, χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός αντι-SEA, -SEB και -TSST-1 σε μια ημιλογαριθμική αραίωση που κυμαίνεται από 0.02 έως 20 μg/ml και η ίδια ποσότητα τοξίνης όπως παραπάνω. Τα φρεάτια που περιείχαν μέσο μόνο με τοξίνη χρησιμέυσαν ως θετικοί μάρτυρες. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 °C σε ατμόσφαιρα 5% CO2-95% αέρα για 48 ώρες. Οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν στα 1600xg για 10 λεπτά, τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση ΙΕΝγ (pg/ml), προσδιορίστηκε με ELISA (Ανθρώπινη IFN-γάμμα DuoSet, R&D Systems, Minneapolis, ΜΝ) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι πλάκες αναγνώστηκαν στα 450 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλακών Versamax και τα δεδομένα μεταφέρθηκαν και αναλύθηκαν στο Excel. Τα φρεάτια θετικού μάρτυρα θεωρήθηκε ότι έχουν 0% αναστολή ΙΕΝγ και η αναστολή της παραγωγής ΙΕΝγ παρουσία αντισωμάτων που είχαν καθαριστεί με συγγένεια υπολογίστηκε ως η διαφορά της συγκέντρωσης ΙΕΝγ μεταξύ του θετικού μάρτυρα και του δείγματος. Η τιμή IC50(η γραμμομοριακή συγκέντρωση των αντισωμάτων που απαιτήθηκε για να επιτευχθεί η 50% αναστολή της παραγωγής ΙΕΝγ) για τους παράγοντες εξουδετέρωσης (καθαρισμένα αντισώματα ή IVIG) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα 4-παραμετρικό λογιστικό μοντέλο (εξίσωση 205, XLfit έκδοση 5.2).

[0160] Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8, ανθρώπινα αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια (από IVIG) σε καθεμία από αυτές τις τρεις τοξίνες παρείχαν ισχυρή εξουδετέρωση προς την ομόλογη τοξίνη και μεταβαλλόμενο βαθμό διασταυρούμενης εξουδετέρωσης για διάφορα άλλα SAg. Ωστόσο, ένα κοκτέιλ των τριών ανθρώπινων αντισωμάτων οδήγησε σε αξιοσημείωτη διεύρυνση της δραστικότητας της διασταυρούμενης εξουδετέρωσης.

[0161] Λαμβάνοντας υπόψιν αυτά τα αποτελέσματα, νέες συντήξεις των τριών τοξοειδών υπεραντιγόνων: οι μεταλλαγμένες μορφές SEBL45R/Y89A/Y94A,

SEAL48R/D70R/Y92Aκαι TSST-1L30R/D27A/I46Aεκφράστηκαν ως μεμονωμένα μόρια σε ένα προκαρυωτικό ξενιστή, π.χ., Ε. coli. Τέτοιες πρωτεΐνες σύντηξης μπορεί να είναι ανώτερες από τα μεμονωμένα συστατικά όχι μόνο λόγω της ευκολίας κατασκευής αλλά και επειδή μπορεί να ενισχύσουν την εκδήλωση διασταυρούμενα αντιδραστικών αντισωμάτων μεταξύ διαφόρων υπεραντιγόνων καθώς οι συνηθισμένοι επίτοποι που συνενώθηκαν σε ένα μεμονωμένο μόριο μπορεί να δράσουν με ανοσοεπικρατή τρόπο. Πρέπει να κατασκευαστούν οι ακόλουθες πρωτεΐνες σύντηξης.

[0162] Μια σύντηξη των μεταλλαγμένων μορφών SEBL45R/Y89A/Y94A, SEAL48R/D70R/Y92A και ΤSSΤ-1L30R/D27Α/Ι46Ασε μία από τις ακόλουθες σειρές με έναν κοινά χρησιμοποιούμενο συνδέτη (L) όπως, μεταξύ άλλων, με έναν συνδέτη που περιλαμβάνει μία ή περισσότερες επαναλήψεις τεσσάρων γλυκινών και μίας σερίνης:

<■>Σύντηξη ΒΑΤ: SΕΒL45R/Y89A/Y94A-L-SΕAL48R/D70R/Y92A-L-TSSΤ-1L30R/D27A/I46A

<■>Σύντηξη ΒΤΑ :SEBL45R/Y89A/Y94A-L-TSST- 1L30R/D27A/I46A-L-SEAL48R/D70R/Y92A

<■>Σύντηξη ABT:SEAL48R/D70R/Y92A-L-SEBL45R/Y89A/Y94A-L-TSST- 1L30R/D27A/I46A

<■>Σύντηξη ΑΤΒ :SEAL48R/D70R/Y92A-L-TSST- 1L30R/D27A/146A-L-SEBL45R/Y89A/Y94A

<■>Σύντηξη TAB :TSST- 1L30R/D27A/I46A-L-SEAL48R/D70R/Y92A-L-SEBL45R/Y89A/Y94A

<■>Σύντηξη ΤΒΑ :TSST- 1L30R/D27A/I46A-L-SEBL45R/Y89A/Y94A-L-SEAL48R/D70R/Y92A

[0163] Αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 6

ΠΙΝΑΚΑΣ 6: ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΣΥΝΤΗΞΗΣ SAG.

ΚΑΤΑΧΩΡΗΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ

[0164]

<110> Aman, Mohammad J

Adhikari, Rajan P

Karauzum, Hatice P

Shulenin, Sergey

Holtsberg, Frederick W

<120> ΤΟΞΟΕΙΔΗ ΠΕΠΤΙΔΙΑ ΠΟΥ ΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΔΙΑΛΥΤΗ ΣΕ

ΦΑΙΝΟΛΗ ΜΟΔΟΥΛΙΝΗ, ΤΟΞΙΝΗ ΔΕΛΤΑ, ΥΠΕΡ ΑΝΤΙΓΟΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΗΞΕΙΣ

ΑΥΤΩΝ

<130> 57783-132959

<150> US 61/836,959

<151> 2013-06-19

<160> 55

<170> Patentln έκδοση 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

MetAla Gin Asp lie lie Ser Thr lie Gly Asp LeuVal Lys Trp lie 1 5 10 15

lie Asp ThrVal Asn LysPhe Thr Lys Lys

20 25

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 2

Met Ala Gin Asp lie lie Ser Thr lie Gly Asp Ala Val Lys Trp lie 1 5 10 15

lie Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys

20 25

<210> 3

<21 1> 26

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 3

Met Ala Gin Asp lie lie Ser Thr lie Gly Asp Ala Val Lys Trp lie 1 5 10 15

lie Asp Thr Ala Asn Lys Phe Thr Lys Lys

20 25

<210> 4

<21 1> 26

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 4

Met Ala Gin Asp lie lie Ser Thr lie Gly Asp Gly Val Lys Trp lie 1 5 10 15

lie Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys

20 25

<210> 5

<21 1> 26

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 5

Met Ala Gin Asp lie lie Ser Thr 1 5

lie Asp Thr Gly Asn Lys Phe Thr 20

<210> 6

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 6

Met Glu Phe Val Ala Lys Leu Phe 1 5

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 7

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 7

Met Glu Phe Val Ala Lys Leu Phe 1 5

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 8

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

lie Gly Asp Gly Val Lys Trp lie

10 15

Lys Lys

25

Lys Phe Phe Lys Asp Leu Leu Gly

10 15

Lys Phe Phe Lys Asp Ala Leu Gly

10 15<400> 8

Met Glu Phe Ala Ala Lys Leu Phe 1 5

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 9

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 9

Met Glu Phe ValAla Lys Leu Phe 1 5

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 10

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223> συνθετική

<400> 10

Met Glu Phe Gly Ala Lys Leu Phe 1 5

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 11

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

Lys Phe Phe Lys Asp Ala Leu Gly 10 15

Lys Phe Phe Lys Asp Gly Leu Gly

10 15

Lys Phe Phe Lys Asp Gly Leu Gly

10 15<400> 11

Met Glu Phe Gly Ala Lys Leu Phe 1 5

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 12

<21 1> 21

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 12

Met Gly lie lie Ala Gly lie lie 1 5

Lys Phe Thr Gly Lys

20

<210> 13

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 13

Met Glu Phe Val Ala Lys Leu Phe 1 5

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 14

<21 1> 20

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 14

Met Ala lie Val Gly Thr lie lie 1 5

Iie Phe Ala Lys

20

<210> 15

<21 1> 44

Lys Phe Phe Lys Asp Ala Leu Gly

10 15

Lys Phe lie Lys Gly Leu lie Glu

10 15

Lys Phe Phe Lys Asp Leu Leu Gly

10 15

Lys lie lie Lys Ala lie lie Asp

10 15<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 15

Met Glu Gly Leu Phe Asn Ala lie Lys Asp Thr Val Thr Ala Ala lie 1 5 10 15

Asn Asn Asp Gly Ala Lys Leu Gly Thr Ser lie Val Asn lie Val Glu

20 25 30

Asn Gly Val Gly Leu Leu Ser Lys Leu Phe Gly Phe

35 40

<210> 16

<21 1> 44

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 16

Met Thr Gly Leu Ala Glu Ala lie Ala Asn Thr Val Gin Ala Ala Gin 1 5 10 15

Gin His Asp Ser Val Lys Leu Gly Thr Ser lie Val Asp lie Val Ala

20 25 30

Asn Gly Val Gly Leu Leu Gly Lys Leu Phe Gly Phe

35 40

<210> 17

<21 1> 354

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223> συνθετική

<400> 17

atggcggata gcgacatcaa catcaaaacg ggtactacgg acattggcag caatacgacc 60 gtcaagaccg gtgatctggt cacctatgac aaagagaatg gtatgcacaa aaaggtgttt 120 tacagcttca ttgatgacaa aaatcacaac aagaagctgt tggttattcg taccaaaggc 180 accattgccg gtggtggcgg ttccggcggt ggcggtagca tggcacagga catcatctct 240 accatcggcg atctggtgaa atggatcatt gataccgtta acaagttcac gaaaaagcat 300 catcaccatc accactgata actcgagcac caccaccacc accactgaga tccg 354 <210> 18

<21 1> 104

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 18

Ala Asp Ser Asp Iie Asn Iie Lys Thr Sly Thr Thr Asp Iie Gly Ser 1 5 10 15

Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30

Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe lie Asp Asp Lys Asn His 35 40 45

Asn Lys Lys Leu Leu Val lie Arg Thr Lys Gly Thr lie Ala Gly Gly 50 55 60

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gin Asp lie lie Ser Thr 65 70 75 80

lie Gly Asp Leu Val Lys Trp lie lie Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr

85 90 95

Lys Lys His His His His His His

100

<210> 19

<21 1> 311

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 19

atggcggata gcgacatcaa catcaaaacg ggtactacgg acattggcag caatacgacc 60 gtcaagaccg gtgatctggt cacctatgac aaagagaatg gtatgcacaa aaaggtgttt 120 tacagcttca ttgatgacaa aaatcacaac aagaagctgt tggttattcg taccaaaggc ISO accattgccg gtggtggcgg ctccggtggc ggtggttcta tggaatttgt tgcaaagctg 240 ttcaaattct ttaaggatct gctgggtaaa ttcctgggca acaaccatca tcaccatcac 300 cactgataac t 311 <210> 20

<21 1> 101

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 20

Met Ala Asp Ser Asp lie Asn lie Lys Thr Gly Thr Thr Asp lie Gly 1 5 10 15

Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu

20 25 30

Asn Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe lie Asp Asp Lys Asn

35 40 45

His Asn Lys Lys Leu Leu Val lie Arg Thr Lys Gly Thr lie Ala Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Glu Phe Val Ala Lys Leu

65 70 75 80

Phe Lys Phe Phe Lys Asp Leu Leu Gly Lys Phe Leu Gly Asn Asn His

85 90 95

His His His His His

100

<210> 21

<21 1> 387

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 21

atggcggata gcgacatcaa catcaaaacg ggtactacgg acattggcag caatacgacc 60

gtcaagaccg gtgatctggt cacctatgac aaagagaatg gtatgcacaa aaaggtgttt 120

tacagcttca ttgatgacaa aaatcacaac aagaagctgt tggttattcg taccaaaggc 180

accattgccg gtggtggtgg ttctatggcg caggacatca tttccacgat cggcgatctg 240

gttaaatgga tcatcgacac cgtgaacaag tttaccaaga aaggtggtgg cggtagcatg 300

gaatttgttg caaaactgtt caaattcttt aaggatctgc tgggcaagtt cctgggcaac 360

aatcatcatc accatcacca ctgataa 387

<210> 22

<21 1> 127

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 22

Met Ala Asp Ser Asp lie Asn lie Lys Thr Gly Thr Thr Asp lie Gly 1 5 10 15

Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu

20 25 30

Asn Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe lie Asp Asp Lys Asn

35 40 45

His Asn Lys Lys Leu Leu Val lie Arg Thr Lys Gly Thr lie Ala Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Met Ala Gin Asp lie lie Ser Thr lie Gly Asp Leu

65 70 75 80

Val Lys Trp lie lie Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Ser Met Glu Phe Val Ala Lys Leu Phe Lys Phe Phe Lys Asp

100 105 110

Leu Leu Gly Lys Phe Leu Gly Asn Asn His His His His His His

115 120 125

<210> 23

<21 1> 312

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 23

Met Ala Asp Ser Asp lie Asn lie Lys Thr Gly Thr Thr Asp lie Gly 1 5 10 15

Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu 20 25 30

Asn Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe lie Asp Asp Lys Asn 35 40 45

His Asn Lys Lys Leu Leu Val lie Arg Thr Lys Gly Thr lie Ala Gly 50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys 65 70 75 80

Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn

85 90 95

Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His Val Ser Ala lie Asn Val Lys 100 105 110

Ser lie Asp Gin Phe Arg Tyr Phe Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp 115 120 125

Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys 130 135 140

Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala 145 150 155 160

Asn Ala Tyr Tyr Gin Cys Ala Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn

165 170 175

Ser His Gin Thr Asp Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 180 185 190

Glu His Asn Gly Asn Gin Leu Asp Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg 195 200 205

Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn 210 215 220

Lys Lys Lys Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr 225 230 235 240

Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu

245 250 255

Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp 260 265 270

Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met 275 280 285

Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu 290 295 300

Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys

305 310

<210> 24

<21 1> 948

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 24

catatggcag attctgatat taatattaaa accggtacta cagatattgg aagcaatact GO acagtaaaaa caggtgattt agtcacttat gataaagaaa atggcatgca caaaaaagta 120 ttttatagtt ttatcgatga taaaaatcat aataaaaaac tgctagttat tagaacgaaa 180 ggtaccattg ctgggggagg ggggagcggg ggagggggga gcgagagtca accagatcct 240 aaaccagatg agttgcacaa atcgagtaaa ttcactggtt tgatggaaaa tatgaaagtt 300 ttgtatgatg ataatcatgt atcagcaata aacgttaaat ctatagatca gtttcgttac 360 tttgacttaa tatattctat taaggacact aagttaggga attatgataa tgttcgagtc 420 gaatttaaaa acaaagattt agctgataaa tacaaagata aatacgtaga tgtgtttgga 480 gctaatgcgt attatcaatg tgcgttttct aaaaaaacga atgatattaa ttcgcatcaa 540 actgacaaac gaaaaacttg tatgtatggt ggtgtaactg agcataatgg aaaccaatta 600 gataaatata gaagtattac tgttcgggta tttgaagatg gtaaaaattt attatctttt 660 gacgtacaaa ctaataagaa aaaggtgact gctcaagaat tagattacct aactcgtcac 720 tatttggtga aaaataaaaa actctatgaa tttaacaact cgccttatga aacgggatat 780 attaaattta tagaaaatga gaatagcttt tggtatgaca tgatgcctgc accaggagat 840 aaatttgacc aatctaaata tttaatgatg tacaatgaca ataaaatggt tgattctaaa 900 gatgtgaaga ttgaagttta tcttacgaca aagaaaaagt gaggatcc 948 <210> 25

<21 1> 948

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 25

catatggcag actcggacat caacatcaaa acgggcacga cggacattgg ctcaaacacg 60 acggtgaaaa cgggcgacct ggtgacctac gacaaagaaa acggcatgca taaaaaagtg 120 ttttatagct tcatcgatga caaaaaccac aacaaaaaac tgctggtcat tcgtaccaag 180 ggtacgatcg caggtggtgg tggttctggc ggtggtggta gtgaatccca gccggacccg 240 aaaccggacg aactgcataa aagctctaaa tttaccggcc tgatggaaaa tatgaaagtg 300 ctgtatgatg acaaccacgt gtcagccatt aatgttaaat cgatcgatca attccgttat 360 ttcgacctga tttactcaat caaagatacc aaactgggca actatgacaa tgtgcgcgtt 420 gaattcaaaa acaaagatct ggcagacaaa tacaaagata aatacgtcga cgtgttcggt 480 gcgaatgcct attaccagtg cgctttcagc aagaaaacca acgatatcaa ctctcatcaa 540 accgacaaac gtaaaacgtg tatgtatggc ggtgtgaccg aacacaacgg caatcagctg 600 gataaatacc gtagtatcac ggttcgcgtc tttgaagatg gtaaaaacct gctgtccttc 660 gatgtccaga ccaacaagaa aaaagtgacg gcacaagaac tggattatct gacccgccat 720 tacctggtta aaaacaaaaa actgtacgaa ttcaacaact caccgtatga aacgggctac 780 atcaaattca tcgaaaacga aaactcgttc tggtacgata tgatgccggc cccgggcgat 840 aaattcgacc agtccaaata tctgatgatg tacaatgata acaaaatggt tgactccaaa 900 gatgtgaaaa tcgaagttta cctgacgacg aaaaaaaaat aaggatcc 948 <210> 26

<21 1> 312

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 26

Met Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser 1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn

20 25 30

His Val Ser Ala Iie Asn Val Lys Ser Iie Asp Gin Phe Arg Tyr PHe

35 40 45

Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn

50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp

65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gin Cys Ala Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn Ser His Gin Thr Asp Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gin Leu Asp 115 120 125

Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu 130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gin Glu 145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu 180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys 195 200 205

Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val 210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Ser Asp lie Asn

245 250 255

lie Lys Thr Gly Thr Thr Asp lie Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr 260 265 270

Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn Gly Met His Lys Lys Val 275 280 285

Phe Tyr Ser Phe lie Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys Leu Leu Val 290 295 300

lie Arg Thr Lys Gly Thr lie Ala

305 310

<210> 27

<21 1> 948

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 27

catatggaga gtcaaccaga tcctaaacca gatgagttgc acaaatcgag taaattcact €0

ggtttgatgg aaaatatgaa agttttgtat gatgataatc atgtatcagc aataaacgtt 120 aaatctatag atcagtttcg ttactttgac ttaatatatt ctattaagga cactaagtta 180 gggaattatg ataatgttcg agtcgaattt aaaaacaaag atttagctga taaatacaaa 240 gataaatacg tagatgtgtt tggagctaat gcgtattatc aatgtgcgtt ttctaaaaaa 300 acgaatgata ttaattcgca tcaaactgac aaacgaaaaa cttgtatgta tggtggtgta 360 actgagcata atggaaacca attagataaa tatagaagta ttactgttcg ggtatttgaa 420 gatggtaaaa atttattatc ttttgacgta caaactaata agaaaaaggt gactgctcaa 480 gaattagatt acctaactcg tcactatttg gtgaaaaata aaaaactcta tgaatttaac 540 aactcgcctt atgaaacggg atatattaaa tttatagaaa atgagaatag cttttggtat 600 gacatgatgc ctgcaccagg agataaattt gaccaatcta aatatttaat gatgtacaat 660 gacaataaaa tggttgattc taaagatgtg aagattgaag tttatcttac gacaaagaaa 720 aaggggggag gggggagcgg gggagggggg agcgcagatt ctgatattaa tattaaaacc 780 ggtactacag atattggaag caatactaca gtaaaaacag gtgatttagt cacttatgat 840 aaagaaaatg gcatgcacaa aaaagtattt tatagtttta tcgatgataa aaatcataat 900 aaaaaactgc tagttattag aacgaaaggt accattgctt gaggatcc 948 <210> 28

<21 1> 948

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 28

catatggaaa gccaaccgga cccgaaaccg gacgaactgc ataaaagctc aaaattcacg 60 ggcctgatgg aaaacatgaa agtgctgtac gacgataacc atgtcagtgc aattaatgtg 120 aaatccatcg atcagtttcg ttatttcgac ctgatttact caatcaaaga taccaaactg 180 ggcaactatg acattgtgcg cgttgaattc aaaaacaaag atctggcaga caaatacaaa 240 gataaatacg tcgacgtgtt cggtgcgaat gcctattacc agtgcgcttt cagcaagaaa 300 accaacgata ttaattcgca tcaaaccgac aaacgtaaaa cgtgtatgta tggcggtgtc 360 accgaacaca acggcaatca actggataaa taccgtagca tcacggttcg cgtctttgaa 420 gatggtaaaa acctgctgtc tttcgacgtg cagaccaaca agaaaaaagt tacggcgcaa 480 gaactggatt atctgacccg ccattacctg gttaaaaaca aaaaactgta cgaattcaac 540 aactcaccgt atgaaacggg ctacatcaaa ttcatcgaaa acgaaaactc gttctggtac 600 gatatgatgc cggccccggg cgataaattc gaccagagta aatacctgat gatgtacaac 660 gataacaaaa tggtggattc caaagacgtg aaaattgaag tttatctgac caccaagaaa 720

aaaggtggtg gtggtagcgg tggtggtggt agcgccgatt ctgacattaa catcaaaacc 780 ggcaccacgg atatcggttc taataccacg gttaaaaccg gcgatctggt cacgtatgac 840 aaagaaaacg gtatgcacaa aaaagtgttt tattccttca ttgacgacaa aaatcacaac 900 aaaaaactgc tggttatccg cacgaaaggc accatcgcat aaggatcc 948 <210> 29

<21 1> 338

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 29

Met Ala Asp Ser Asp lie Asn lie Lys Thr Gly Thr Thr Asp lie Gly 1 5 10 15

Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu 20 25 30

Asn Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe lie Asp Asp Lys Asn 35 40 45

His Asn Lys Lys Leu Leu Val lie Arg Thr Lys Gly Thr lie Ala Gly 50 55 60

Gly Gly Gly Ser Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His 65 70 75 80

Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr

85 90 95

Asp Asp Asn His Val Ser Ala lie Asn Val Lys Ser lie Asp Gin Phe 100 105 110

Arg Tyr Phe Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn 115 120 125

Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys 130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gin 145 150 155 160

Cys Ala Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Iie Asn Ser His Gin Thr Asp

165 170 175 Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn

180 185 190

Gin Leu Asp Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly

195 200 205

Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr

210 215 220

Ala Gin Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys

225 230 235 240

Lys Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys

245 250 255

Phe Iie Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro

260 265 270

Gly Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn

275 280 285

Lys Met Val Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu Val Tyr Leu Thr Thr

290 295 300

Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gin Asp lie lie Ser Thr

305 310 315 320

lie Gly Asp Leu Val Lys Trp lie lie Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr

325 330 335

Lys Lys

<210> 30

<21 1> 1026

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 30

catatggcag attctgatat taatattaaa accggtacta cagatattgg aagcaatact 60 acagtaaaaa caggtgattt agtcacttat gataaagaaa atggcatgca caaaaaagta 120 ttttatagtt ttatcgatga taaaaatcat aataaaaaac tgctagttat tagaacgaaa 180 ggtaccattg ctgggggagg ggggagcgag agtcaaccag atcctaaacc agatgagttg 240 cacaaatcga gtaaattcac tggtttgatg gaaaatatga aagttttgta tgatgataat 300 catgtatcag caataaacgt taaatctata gatcagtttc gttactttga cttaatatat 360 tctattaagg acactaagtt agggaattat gataatgttc gagtcgaatt taaaaacaaa 420 gatttagctg ataaatacaa agataaatac gtagatgtgt ttggagctaa tgcgtattat 480 caatgtgcgt tttctaaaaa aacgaatgat attaattcgc atcaaactga caaacgaaaa 540 acttgtatgt atggtggtgt aactgagcat aatggaaacc aattagataa atatagaagt 600 attactgttc gggtatttga agatggtaaa aatttattat cttttgacgt acaaactaat 660 aagaaaaagg tgactgctca agaattagat tacctaactc gtcactattt ggtgaaaaat 720 aaaaaactct atgaatttaa caactcgcct tatgaaacgg gatatattaa atttatagaa 780 aatgagaata gcttttggta tgacatgatg cctgcaccag gagataaatt tgaccaatct 840 aaatatttaa tgatgtacaa tgacaataaa atggttgatt ctaaagatgt gaagattgaa 900 gtttatctta cgacaaagaa aaagggggga ggggggagca tggcacaaga tatcatttca 960 acaatcggtg acttagtaaa atggattatc gacacagtga acaaattcac taaaaaatga 1020 ggatcc 1026 <210> 31

<21 1> 1026

<212> DNA

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 31

catatggcag atagcgacat caacatcaag acgggcacga cggacattgg ctcaaacacg 60 acggtgaaaa cgggtgacct ggttacctac gataaagaaa acggcatgca taagaaggtg 120 ttttattctt tcatcgatga caaaaaccac aataaaaagc tgctggttat tcgtaccaag 180 ggtacgattg cgggcggtgg cggtagtgaa tcccagccgg acccgaaacc ggacgaactg 240 cataagagct ctaaatttac cggcctgatg gaaaatatga aagtgctgta tgatgacaac 300 cacgtctcag ccattaatgt gaaatcgatc gatcaatttc gttatttcga cctgatttac 360 agcatcaagg ataccaaact gggcaactac gacaatgtgc gcgttgaatt taaaaacaag 420 gatctggcag acaaatataa ggataaatac gtcgacgtgt ttggtgcgaa tgcctattac 480 cagtgcgctt tcagtaaaaa gaccaacgat atcaactccc atcaaaccga caagcgtaaa 540 acgtgtatgt atggcggtgt caccgaacac aacggcaatc agctggataa ataccgttca 600 atcacggttc gcgtctttga agatggtaaa aacctgctgt cgttcgatgt tcagaccaat 660 aaaaagaaag tcacggcaca agaactggat tatctgaccc gccattacct ggttaagaac 720 aagaagctgt acgaattcaa caacagtccg tatgaaacgg gctacatcaa gttcatcgaa 780 aacgaaaaca gcttctggta cgatatgatg ccggcaccgg gtgataagtt cgaccagagc 840 aagtacctga tgatgtacaa cgataacaag atggttgatt ctaaggacgt gaaaatcgaa 900 gtttatctga ccacgaagaa aaagggcggt ggcggtagca tggctcaaga tattatctct 960 accatcggtg acctggtgaa gtggattatt gacacggtga acaagtttac gaagaaatga 1020 ggatcc 1026 <210> 32

<21 1> 675

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 32

Met Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser 1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn 20 25 30

His Val Ser Ala lie Asn Val Lys Ser lie Asp Gin Phe Arg Tyr Phe 35 40 45

Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn 50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp 65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gin Cys Ala Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn Ser His Gin Thr Asp Lys Arg Lys 100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gin Leu Asp 115 120 125

Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu 130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gin Glu 145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175 Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu 180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys 195 200 205

Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val 210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu Iie Asn Glu Lys Asp Leu Arg

245 250 255

Lys Lys Ser Glu Leu Gin Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gin lie 260 265 270

Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp 275 280 285

Gin Phe Arg Gin His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His 290 295 300

Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Arg Phe Asp Ser Lys Asp lie Val 305 310 315 320

Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly

325 330 335

Tyr Gin Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly 340 345 350

Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val 355 360 365

Pro lie Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gin Asn Thr Val Pro Leu Glu 370 375 380

Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu 385 390 395 400

Gin Ala Arg Arg Tyr Leu Gin Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp

405 410 415

Val Phe Asp Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu lie Val Phe His Thr Ser 420 425 430

Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gin Gly Gin Tyr 435 440 445

Ser Asn Thr Leu Leu Arg lie Tyr Arg Asp Asn Lys Thr lie Asn Ser 450 455 460

Glu Asn Met His lie Asp lie Tyr Leu Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Gly 465 470 475 480

Ser Ser Thr Asn Asp Asn lie Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser

485 490 495

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly 500 505 510

Ser Met Arg lie Lys Asn Thr Asp Gly Ser lie Ser Leu lie Ala Phe 515 520 525

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp 530 535 540

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gin His Thr Ser Glu Gly Thr 545 550 555 560

Tyr lie His Phe Gin lie Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

565 570 575

Thr Pro lie Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser 580 585 590

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gin Leu Ala lie Ser 595 600 605

Thr Leu Asp Phe Glu lie Arg His Gin Leu Thr Gin lie His Gly Leu 610 615 620

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys lie Thr Met Asn 625 630 635 640

Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

645 650 655

Thr Glu Lys Pro Pro lie Asn lie Asp Glu lie Lys Thr lie Glu Ala 660 665 670

Glu lie Asn

675

<210> 33

<21 1> 675

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 33

Met Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser 1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn 20 25 30

His Val Ser Ala lie Asn Val Lys Ser lie Asp Gin Phe Arg Tyr Phe 35 40 45

Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn 50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp 65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gin Cys Ala Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn Ser His Gin Thr Asp Lys Arg Lys 100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gin Leu Asp 115 120 125

Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu 130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gin Glu 145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu 180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys 195 200 205

Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val 210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Ser Thr Asn Asp Asn lie Lys Asp Leu Leu Asp Trp

245 250 255

Tyr Ser Ser Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn 260 265 270

Ser Arg Gly Ser Met Arg Iie Lys Asn Thr Asp Gly Ser lie Ser Leu 275 280 285

Iie Ala Phe Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu 290 295 300

Lys Val Asp Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gin His Thr Ser 305 310 315 320

Glu Gly Thr Tyr Iie His Phe Gin lie Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu

325 330 335

Lys Leu Pro Thr Pro Iie Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly 340 345 350

Lys Asp Ser Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gin Leu 355 360 365

Ala lie Ser Thr Leu Asp Phe Glu lie Arg His Gin Leu Thr Gin Iie 370 375 380

His Gly Leu Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys Iie 385 390 395 400

Thr Met Asn Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe

405 410 415

Glu Tyr Asn Thr Glu Lys Pro Pro Iie Asn Iie Asp Glu Iie Lys Thr 420 425 430

Iie Glu Ala Glu Iie Asn Gly Gly Gly Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu 435 440 445

Iie Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gin Gly Thr Ala 450 455 460

Leu Gly Asn Leu Lys Gin lie Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr 465 470 475 480

Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gin Phe Arg Gin His Thr Ile Leu Phe

485 490 495

Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Arg 500 505 510

Phe Asp Ser Lys Asp lie Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp 515 520 525

Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gin Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn 530 535 540

Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg 545 550 555 560

Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro lie Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys

565 570 575

Gin Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val 580 585 590

Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Arg Arg Tyr Leu Gin Glu Lys 595 600 605

Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gin Arg Gly 610 615 620

Leu Iie Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu 625 630 635 640

Phe Gly Ala Gin Gly Gin Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Iie Tyr Arg

645 650 655

Asp Asn Lys Thr Iie Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu 660 665 670

Tyr Thr Ser

675

<210> 34

<21 1> 675

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 34

Met Glu Lys Ser Glu Glu Iie Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser 1 5 10 15

Glu Leu Gin Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gin lie Tyr Tyr Tyr 20 25 30

Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gin Phe Arg 35 40 45

Gin His Thr lie Leu Fhe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr 50 55 60

Asn Asp Leu Leu Val Arg Fhe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr 65 70 75 80

Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gin Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Thr Fro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 100 105 110

Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Fro lie Asn 115 120 125

Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gin Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys 130 135 140

Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Arg 145 150 155 160

Arg Tyr Leu Gin Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Fhe Asp

165 170 175

Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro 180 185 190

Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gin Gly Gin Tyr Ser Asn Thr 195 200 205

Leu Leu Arg Iie Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Iie Asn Ser Glu Asn Met 210 215 220

His lie Asp Iie Tyr Leu Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 225 230 235 240

Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys Phe Thr

245 250 255

Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His Val Ser 260 265 270

Ala Iie Asn Val Lys Ser Iie Asp Gin Phe Arg Tyr Phe Asp Leu Ile 275 280 285

Tyr Ser Iie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val Arg Val 290 295 300

Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys Tyr Val 305 310 315 320

Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gin Cys Ala Phe Ser Lys Lys

325 330 335

Thr Asn Asp lie Asn Ser His Gin Thr Asp Lys Arg Lys Thr Cys Met 340 345 350

Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gin Leu Asp Lys Tyr Arg 355 360 365

Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu Ser Phe 370 375 380

Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp Tyr 385 390 395 400

Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu Phe Asn

405 410 415

Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe lie Glu Asn Glu Asn 420 425 430

Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gin 435 440 445

Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp Ser Lys 450 455 460

Asp Val Lys Iie Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys Gly Gly Gly 465 470 475 480 Ser Ser Thr Asn Asp Asn Iie Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser

485 490 495

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly 500 505 510

Ser Met Arg lie Lys Asn Thr Asp Gly Ser Iie Ser Leu lie Ala Phe 515 520 525

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp 530 535 540

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gin His Thr Ser Glu Gly Thr 545 550 555 560

Tyr Iie His Phe Gin Iie Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

565 570 575

Thr Pro Iie Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser 580 585 590

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gin Leu Ala lie Ser 595 600 605

Thr Leu Asp Phe Glu Iie Arg His Gin Leu Thr Gin Iie His Gly Leu 610 615 620

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys Iie Thr Met Asn 625 630 635 640

Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

645 650 655

Thr Glu Lys Pro Pro Iie Asn Iie Asp Glu Iie Lys Thr Iie Glu Ala 660 665 670

Glu lie Asn

675

<210> 35

<21 1> 675

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 35

Met Glu Lys Ser Glu Glu lie Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser 1 5 10 15

Glu Leu Gin Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gin lie Tyr Tyr Tyr 20 25 30

Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gin Phe Arg 35 40 45

Gin His Thr lie Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr 50 55 60

Asn Asp Leu Leu Val Arg Phe Asp Ser Lys Asp lie Val Asp Lys Tyr 65 70 75 80

Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gin Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 100 105 110

Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro lie Asn 115 120 125

Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gin Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys 130 135 140

Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Arg 145 150 155 160

Arg Tyr Leu Gin Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp

165 170 175

Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu lie Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro 180 185 190

Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gin Gly Gin Tyr Ser Asn Thr 195 200 205

Leu Leu Arg lie Tyr Arg Asp Asn Lys Thr lie Asn Ser Glu Asn Met 210 215 220

His lie Asp lie Tyr Leu Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr 225 230 235 240

Asn Asp Asn lie Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser Gly Ser Asp

245 250 255 Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Sly Ser Met Arg 260 265 270

Iie Lys Asn Thr Asp Gly Ser lie Ser Leu Iie Ala Phe Pro Ser Pro 275 280 285

Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp Leu Asn Thr 290 295 300

Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gin His Thr Ser Glu Gly Thr Tyr Iie His 305 310 315 320

Phe Gin Iie Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro Thr Pro Iie

325 330 335

Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser Pro Leu Lys 340 345 350

Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gin Leu Ala lie Ser Thr Leu Asp 355 360 365

Phe Glu lie Arg His Gin Leu Thr Gin lie His Gly Leu Tyr Arg Ser 370 375 380

Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys lie Thr Met Asn Asp Gly Ser 385 390 395 400

Thr Tyr Gin Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn Thr Glu Lys

405 410 415

Pro Pro lie Asn lie Asp Glu lie Lys Thr lie Glu Ala Glu lie Asn 420 425 430

Gly Gly Gly Ser Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His 435 440 445

Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr 450 455 460

Asp Asp Asn His Val Ser Ala lie Asn Val Lys Ser lie Asp Gin Phe 465 470 475 480

Arg Tyr Phe Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn

485 490 495

Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys 500 505 510 Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Sly Ala Asn Ala Tyr Tyr Sin 515 520 525

Cys Ala Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn Ser His Gin Thr Asp 530 535 540

Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn 545 550 555 560

Gin Leu Asp Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly

565 570 575

Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr 580 585 590

Ala Gin Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys 595 600 605

Lys Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Iie Lys 610 615 620

Phe Iie Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro 625 630 635 640

Gly Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn

645 650 655

Lys Met Val Asp Ser Lys Asp Val Lys Iie Glu Val Tyr Leu Thr Thr 660 665 670

Lys Lys Lys

675

<210> 36

<21 1> 675

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 36

Met Ser Thr Asn Asp Asn Iie Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser 1 5 10 15

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly 20 25 30 Ser Met Arg Iie Lys Asn Thr Asp Gly Ser Iie Ser Leu Iie Ala Phe 35 40 45

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp 50 55 60

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gin His Thr Ser Glu Gly Thr 65 70 75 80

Tyr Iie His Phe Gin lie Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

85 90 95

Thr Pro Iie Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser 100 105 110

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gin Leu Ala lie Ser 115 120 125

Thr Leu Asp Phe Glu Iie Arg His Gin Leu Thr Gin Iie His Gly Leu 130 135 140

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys lie Thr Met Asn 145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Pro lie Asn lie Asp Glu Iie Lys Thr Iie Glu Ala 180 185 190

Glu Iie Asn Gly Gly Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu lie Asn Glu Lys 195 200 205

Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gin Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu 210 215 220

Lys Gin Iie Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu 225 230 235 240

Ser His Asp Gin Phe Arg Gin His Thr Iie Leu Phe Lys Gly Phe Phe

245 250 255

Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Arg Phe Asp Ser Lys 260 265 270

Asp Iie Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala 275 280 285

Tyr Ala Sly Tyr Sin Cys Ala Sly Sly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys 290 295 300

Met Tyr Sly Sly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu 305 310 315 320

Lys Lys Val Pro lie Asn Leu Trp Leu Asp Sly Lys Sin Asn Thr Val

325 330 335

Pro Leu Slu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gin Glu 340 345 350

Leu Asp Leu Gin Ala Arg Arg Tyr Leu Sin Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr 355 360 365

Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu lie Val Phe 370 375 380

His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gin 385 390 395 400

Gly Gin Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg lie Tyr Arg Asp Asn Lys Thr

405 410 415

lie Asn Ser Slu Asn Met His lie Asp lie Tyr Leu Tyr Thr Ser Gly 420 425 430

Gly Gly Gly Ser Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His 435 440 445

Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr 450 455 460

Asp Asp Asn His Val Ser Ala lie Asn Val Lys Ser lie Asp Gin Phe 465 470 475 480

Arg Tyr Phe Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn

485 490 495

Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys 500 505 510

Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gin 515 520 525

Cys Ala Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn Ser His Gin Thr Asp 530 535 540

Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn 545 550 555 560

Gin Leu Asp Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly

565 570 575

Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr 580 585 590

Ala Gin Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys 595 600 605

Lys Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys 610 615 620

Phe lie Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro 625 630 635 640

Gly Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn

645 650 655

Lys Met Val Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu Val Tyr Leu Thr Thr 660 665 670

Lys Lys Lys

675

<210> 37

<21 1> 675

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 37

Met Ser Thr Asn Asp Asn lie Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser 1 5 10 15

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly 20 25 30

Ser Met Arg lie Lys Asn Thr Asp Gly Ser lie Ser Leu lie Ala Phe 35 40 45

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp 50 55 60

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gin His Thr Ser Glu Gly Thr 65 70 75 80

Tyr lie His Phe Gin lie Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

85 90 95

Thr Pro lie Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser 100 105 110

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gin Leu Ala lie Ser 115 120 125

Thr Leu Asp Phe Glu lie Arg His Gin Leu Thr Gin lie His Gly Leu 130 135 140

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys lie Thr Met Asn 145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Pro lie Asn lie Asp Glu lie Lys Thr lie Glu Ala 180 185 190

Glu lie Asn Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro 195 200 205

Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met 210 215 220

Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His Val Ser Ala lie Asn Val Lys Ser 225 230 235 240

lie Asp Gin Phe Arg Tyr Phe Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr

245 250 255

Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp 260 265 270

Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn 275 280 285

Ala Tyr Tyr Gin Cys Ala Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn Ser 290 295 300

His Gin Thr Asp Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu 305 310 315 320

His Asn Gly Asn Gin Leu Asp Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val

325 330 335

Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys 340 345 350

Lys Lys Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu 355 360 365

Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr 370 375 380

Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met 385 390 395 400

Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met

405 410 415

Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu Val 420 425 430

Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys Gly Gly Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu 435 440 445

lie Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gin Gly Thr Ala 450 455 460

Leu Gly Asn Leu Lys Gin lie Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr 465 470 475 480

Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gin Phe Arg Gin His Thr lie Leu Phe

485 490 495

Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Arg 500 505 510

Phe Asp Ser Lys Asp lie Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp 515 520 525

Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gin Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn 530 535 540

Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg 545 550 555 560 Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro lie Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys

565 570 575

Gin Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val 580 585 590

Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Arg Arg Tyr Leu Gin Glu Lys 595 600 605

Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gin Arg Gly 610 615 620

Leu lie Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu 625 630 635 640

Phe Gly Ala Gin Gly Gin Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg lie Tyr Arg

645 650 655

Asp Asn Lys Thr lie Asn Ser Glu Asn Met His lie Asp lie Tyr Leu 660 665 670

Tyr Thr Ser

675

<210> 38

<21 1> 21

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 38

Met Gly lie lie Ala Gly lie lie Lys Val lie Lys Ser Leu lie Glu 1 5 10 15

Gin Phe Thr Gly Lys

20

<210> 39

<21 1> 26

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<22 1 > ΠΑΡΑΛΛΑΓΉ

<222> (5).. (5)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (6)..(6)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (9).. (9)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (12)..(12)

<223> το Xaa είναι λεύκινη, γλυκίνη, ή αλανίνη <220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (13)..(13)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1 > ΠΑΡΑΛΛΑΓΉ

<222> (16)..(16)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (17)..(17)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (20).. (20)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 39

MetAla Gin Asp XaaXaa Ser Thr XaaGly Asp XaaXaaLys Trp Xaa 1 5 10 15

XaaAsp ThrXaa Asn Lys Phe Thr Lys Lys

20 25

<210> 40

<21 1> 21

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (1)..(1)

<223> το Xaa είναι μεθειονίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (3).. (3)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1 > ΠΑΡΑΛΛΑΓΉ

<222> (4).. (4)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (7)..(7)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (8).. (8)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (10)..(10)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221 > ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (11)..(11)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (14)..(14)

<223> το Xaa είναι λεύκινη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (15)..(15)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (18)..(18)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 40

Xaa Gly XaaXaa Ala Gly Xaa XaaLys XaaXaa Lys Ser XaaXaa Glu 1 5 10 15

Gin Xaa Thr Gly Lys

20

<210> 41

<211> 21

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (1)..(1)

<223> το Xaa είναι μεθειονίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (3).. (3)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη <220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (4).. (4)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1 > ΠΑΡΑΛΛΑΓΉ

<222> (7).. (7)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (8)..(8)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (10)..(10)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (11)..(11)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (14)..(14)

<223> το Xaa είναι λεύκινη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (15)..(15)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (18)..(18)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 41

Xaa Gly XaaXaa Ala Gly Xaa XaaLys XaaXaa Lys Gly Xaa XaaGlu 1 5 10 15

Lys Xaa Thr Gly Lys

20

<210> 42

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (1)..(1)

<223> το Xaa είναι μεθειονίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη <220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (3).. (3)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221 > ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (4).. (4)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (7)..(7)

<223> το Xaa είναι λεύκινη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (8).. (8)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (10)..(10)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη <220>

<22 1> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (11)..(11)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη <220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (14)..(14)

<223> το Xaa είναι λευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (15)..(15)

<223> το Xaa είναι λευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221 > ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (18)..(18)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> ΠΑΡΑΛΛΑΓΗ

<222> (19)..(19)

<223> το Xaa είναι λευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 42

XaaGlu Xaa XaaAla Lys Xaa XaaLys Xaa Xaa Lys Asp XaaXaa Gly 1 5 10 15

Lys Xaa XaaGly Asn Asn

<210> 43

<211> 20

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<221> misc-feature

<222> (1)..(1)

<223> το Xaa είναι μεθειονίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (3)..(3)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (4).. (4)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (7).. (7)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη <220>

<221> misc-feature

<222> (8).. (8)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (10)..(10)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (11)..(11)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (14)..(14)

<223 > το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (15)..(15)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> misc-feature

<222> (18)..(18)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 43

XaaAla XaaXaa Gly ThrXaa Xaa Lys XaaXaa Lys Ala XaaXaa Asp 1 5 10 15

Xaa XaaAla Lys

20

<210> 44

<21 1> 44

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (4).. (4)

<223> το Xaa είναι λεύκινη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (5).. (5)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (8).. (8)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (12)..(12)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (16)..(16)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 44

Met Glu Gly XaaXaaAsn Ala Xaa Lys Asp ThrXaa ThrAla Ala Xaa 1 5 10 15

Asn Asn Asp GlyAla Lys Leu Gly ThrSer lie Val Asn lie Val Glu 20 25 30

Asn Gly Val Gly LeuLeu Ser Lys Leu Phe Gly Phe

35 40

<210> 45

<21 1> 44

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (4).. (4)

<223> το Xaa είναι λευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (8)..(8)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (12)..(12)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (23).. (23)

<223> το Xaa είναι λευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 45

Met Thr Gly XaaAla Glu Ala Xaa Ala Asn Thr Xaa Gin Ala Ala Gin 1 5 10 15

Gin His Asp SerVal Lys XaaGly Thr Ser lie Val Asp lie Val Ala 20 25 30

Asn Gly Val Gly LeuLeu Gly Lys Leu Phe Gly Phe

35 40

<210> 46

<21 1> 62

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 46

Ala Asp Ser Asp lie Asn lie Lys 1 5

Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp 20

Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr 35 40

Asn Lys Lys Leu Leu Val lie Arg

50 55

<210> 47

<21 1> 284

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus Thr Gly Thr Thr Asp lie Gly Ser

10 15

Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 25 30

Ser Phe lie Asp Asp Lys Asn His

45

Thr Lys Gly Thr lie Ala

60

<400> 47

Asp Asn Asn lie Glu Asn lie Gly Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Arg 1 5 10 15

Thr Glu Asp Thr Ser Ser Asp Lys Trp Gly Val Thr Gin Asn lie Gin 20 25 30

Phe Asp Phe Val Lys Asp Lys Lys Tyr Asn Lys Asp Ala Leu lie Leu 35 40 45

Lys Met Gin Gly Phe lie Asn Ser Lys Thr Thr Tyr Tyr Asn Tyr Lys 50 55 60

Asn Thr Asp His lie Lys Ala Met Arg Trp Pro Phe Gin Tyr Asn lie 65 70 75 80

Gly Leu Lys Thr Asn Asp Pro Asn Val Asp Leu lie Asn Tyr Leu Pro

85 90 95

Lys Asn Lys lie Asp Ser Val Asn Val Ser Gin Thr Leu Gly Tyr Asn 100 105 110

lie Gly Gly Asn Phe Asn Ser Gly Pro Ser Thr Gly Gly Asn Gly Ser 115 120 125

Phe Asn Tyr Ser Lys Thr lie Ser Tyr Asn Gin Gin Asn Tyr lie Ser 130 135 140

Glu Val Glu His Gin Asn Ser Lys Ser Val Gin Trp Gly lie Lys Ala 145 150 155 160

Asn Ser Phe lie Thr Ser Leu Gly Lys Met Ser Gly His Asp Pro Asn

165 170 175

Leu Phe Val Gly Tyr Lys Pro Tyr Ser Gin Asn Pro Arg Asp Tyr Phe 180 185 190

Val Pro Asp Asn Glu Leu Pro Pro Leu Val His Ser Gly Phe Asn Pro 195 200 205

Ser Phe lie Ala Thr Val Ser His Glu Lys Gly Ser Gly Asp Thr Ser 210 215 220

Glu Phe Glu lie Thr Tyr Gly Arg Asn Met Asp Val Thr His Ala Thr 225 230 235 240

Arg Arg Thr Thr His Tyr Gly Asn Ser Tyr Leu Glu Gly Ser Arg lie

245 250 255

His Asn Ala Phe Val Asn Arg Asn Tyr Thr Val Lys Tyr Glu Val Asn 260 265 270

Trp Lys Thr His Glu lie Lys Val Lys Gly His Asn

275 280

<210> 48

<21 1> 301

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 48

Ala Gin His lie Thr Pro Val Ser Glu Lys Lys Val Asp Asp Lys lie 1 5 10 15

Thr Leu Tyr Lys Thr Thr Ala Thr Ser Asp Ser Asp Lys Leu Lys lie 20 25 30

Ser Gin lie Leu Thr Phe Asn Phe lie Lys Asp Lys Ser Tyr Asp Lys 35 40 45

Asp Thr Leu lie Leu Lys Ala Ala Gly Asn lie Tyr Ser Gly Tyr Thr 50 55 60

Lys Pro Asn Pro Lys Asp Thr lie Ser Ser Gin Phe Tyr Trp Gly Ser 65 70 75 80

Lys Tyr Asn lie Ser lie Asn Ser Asp Ser Asn Asp Ser Val Asn Val

85 90 95

Val Asp Tyr Ala Pro Lys Asn Gin Asn Glu Glu Phe Gin Val Gin Gin 100 105 110

Thr Val Gly Tyr Ser Tyr Gly Gly Asp lie Asn lie Ser Asn Gly Leu 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Asn Gly Ser Lys Ser Phe Ser Glu Thr lie Asn Tyr 130 135 140

Lys Gin Glu Ser Tyr Arg Thr Ser Leu Asp Lys Arg Thr Asn Phe Lys 145 150 155 160

Lys lie Gly Trp Asp Val Glu Ala His Lys lie Met Asn Asn Gly Trp

165 170 175

Gly Pro Tyr Gly Arg Asp Ser Tyr His Ser Thr Tyr Gly Asn Glu Met 180 185 190

Phe Leu Gly Ser Arg Gin Ser Asn Leu Asn Ala Gly Gin Asn Phe Leu 195 200 205

Glu Tyr His Lys Met Pro Val Leu Ser Arg Gly Asn Phe Asn Pro Glu 210 215 220

Phe lie Gly Val Leu Ser Arg Lys Gin Asn Ala Ala Lys Lys Ser Lys 225 230 235 240

lie Thr Val Thr Tyr Gin Arg Glu Met Asp Arg Tyr Thr Asn Phe Trp

245 250 255

Asn Gin Leu His Trp lie Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Glu Asn Arg Ala 260 265 270

Thr His Thr Ser lie Tyr Glu Val Asp Trp Glu Asn His Thr Val Lys 275 280 285

Leu lie Asp Thr Gin Ser Lys Glu Lys Asn Pro Met Ser

290 295 300

<210> 49

<21 1> 240

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 49

Met Glu Ser Gin Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser 1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn 20 25 30

His Val Ser Ala lie Asn Val Lys Ser lie Asp Gin Phe Arg Tyr Phe 35 40 45

Asp Leu lie Tyr Ser lie Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn 50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp 65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gin Cys Ala Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp lie Asn Ser His Gin Thr Asp Lys Arg Lys 100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gin Leu Asp 115 120 125

Lys Tyr Arg Ser lie Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu 130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gin Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gin Glu 145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu 180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys 195 200 205

Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val 210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys lie Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 240 <210> 50

<21 1> 232

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 50

Glu Lys Ser Glu Glu lie Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu 1 5 10 15

Leu Gin Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gin lie Tyr Tyr Tyr Asn

20 25 30

Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gin Phe Arg Gin 35 40 45

His Thr lie Leu Fhe Lys Gly Fhe Fhe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn 50 55 60

Asp Leu Leu Val Arg Fhe Asp Ser Lys Asp lie Val Asp Lys Tyr Lys 65 70 75 80

Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gin Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Thr Fro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu 100 105 110

His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Fro lie Asn Leu 115 120 125

Trp Leu Asp Gly Lys Gin Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr 130 135 140

Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Arg Arg 145 150 155 160

Tyr Leu Gin Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Fhe Asp Gly

165 170 175

Lys Val Gin Arg Gly Leu lie Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser 180 185 190

Val Asn Tyr Asp Leu Fhe Gly Ala Gin Gly Gin Tyr Ser Asn Thr Leu 195 200 205

Leu Arg lie Tyr Arg Asp Asn Lys Thr lie Asn Ser Glu Asn Met His 210 215 220

lie Asp lie Tyr Leu Tyr Thr Ser

225 230

<210> 51

<21 1> 195

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 51

Met Ser Thr Asn Asp Asn lie Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser 1 5 10 15

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly 20 25 30

Ser Met Arg lie Lys Asn Thr Asp Gly Ser lie Ser Leu lie Ala Phe 35 40 45

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp 50 55 60

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gin His Thr Ser Glu Gly Thr 65 70 75 80

Tyr lie His Phe Gin lie Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

85 90 95

Thr Pro lie Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser 100 105 110

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gin Leu Ala lie Ser 115 120 125

Thr Leu Asp Phe Glu lie Arg His Gin Leu Thr Gin lie His Gly Leu 130 135 140

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys lie Thr Met Asn 145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Pro lie Asn lie Asp Glu lie Lys Thr lie Glu Ala 180 185 190

Glu lie Asn

195

<210> 52

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 52

MetAsp Fhe Thr GlyVal lie Thr Ser lie lie Asp Leu lie Lys Thr 1 5 10 15

Cys lie Gin Ala Fhe Gly

20

<210> 53

<21 1> 22

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (3)..(3)

<223> το Xaa είναι φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (6).. (6)

<223> το Xaa είναι βαλίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (7).. (7)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (10)..(10)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (11)..(11)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<221> Παραλλαγή

<222> (13)..(13)

<223> το Xaa είναι λεύκινη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (14)..(14)

<223 > το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (17)..(17)

<223> το Xaa είναι κυστεΐνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<220>

<22 1> Παραλλαγή

<222> (18)..(18)

<223> το Xaa είναι ισολευκίνη, γλυκίνη, ή αλανίνη

<400> 53

Met AspXaa ThrGly Xaa Xaa Thr SerXaa XaaAsp XaaXaaLys Thr

1 5 10 15

Xaa XaaGin Ala Phe Gly

20

<210> 54

<21 1> 284

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 54

Asp Asn Asn lie Glu Asn He Gly Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Arg 1 5 10 15

Thr Glu Asp Thr Ser Ser Asp Lys Trp Gly Val Phe Gin Asn lie Gin 20 25 30

Phe Asp Phe Val Lys Asp Lys Lys Tyr Asn Lys Asp Ala Leu H e Leu 35 40 45

Lys Met Gin Gly Phe lie Asn Ser Lys Thr Thr Tyr Tyr Asn Tyr Lys 50 55 60

Asn Thr Asp His H e Lys Ala Met Arg Trp Pro Phe Gin Tyr Asn He 65 70 75 80

Gly Leu Lys Thr Asn Asp Pro Asn Val Asp Leu lie Asn Tyr Leu Pro

85 90 95

Ala Asn Lys lie Asp Ser Val Asn Val Ser Gin Thr Leu Gly Tyr Asn 100 105 110

lie Gly Gly Asn Phe Asn Ser Gly Pro Ser Thr Gly Gly Asn Gly Ser 115 120 125

Phe Asn Tyr Ser Lys Thr He Ser Tyr Asn Gin Gin Asn Tyr H e Ser 130 135 140

Glu Val Glu His Gin Asn Ser Lys Ser Val Gin Trp Gly He Lys Ala 145 150 155 160

Asn Ser Phe lie Thr Ser Leu Gly Lys Met Ser Gly His Asp Pro Asn

165 170 175

Leu Phe Val Gly Tyr Lys Pro Tyr Ser Gin Asn Pro Arg Asp Tyr Phe 180 185 190 Val Pro Asp Asn Glu Leu Pro Pro Leu Val His Ser Gly Phe Asn Pro 195 200 205

Ala Phe lie Ala Thr Val Ser His Glu Lys Gly Ser Gly Asp Thr Ser 210 215 220

Glu Phe Glu lie Thr Tyr Gly Arg Asn Met Asp Val Thr His Ala Thr 225 230 235 240

Arg Arg Thr Thr His Tyr Gly Asn Ser Tyr Leu Glu Gly Ser Arg lie

245 250 255

His Asn Ala Phe Val Asn Arg Asn Tyr Thr Val Lys Tyr Glu Val Asn 260 265 270

Trp Lys Thr His Glu lie Lys Val Lys Gly His Asn

275 280

<210> 55

<21 1> 301

<212> PRT

<213> Τεχνητή

<220>

<223 > συνθετική

<400> 55

Ala Gin His lie Thr Pro Val Ser Glu Lys Lys Val Asp Asp Lys lie 1 5 10 15

Thr Leu Tyr Lys Thr Thr Ala Thr Ser Asp Ser Asp Lys Leu Lys lie 20 25 30

Ser Gin lie Leu Thr Phe Asn Phe lie Lys Asp Lys Ser Tyr Asp Lys 35 40 45

Asp Thr Leu lie Leu Lys Ala Ala Gly Asn lie Tyr Ser Gly Tyr Thr 50 55 60

Lys Pro Asn Pro Lys Asp Thr lie Ser Ser Gin Phe Tyr Trp Gly Ser 65 70 75 80

Lys Tyr Asn lie Ser lie Asn Ser Asp Ser Asn Asp Ser Val Asn Val

85 90 95

Val Asp Tyr Ala Pro Ala Asn Gin Asn Glu Glu Phe Gin Val Gin Gin 100 105 110 Thr Val Gly Tyr Ser Tyr Gly Gly Asp lie Asn lie Ser Asn Gly Leu 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Asn Gly Ser Lys Ser Phe Ser Glu Thr lie Asn Tyr 130 135 140

Lys Gin Glu Ser Tyr Arg Thr Ser Leu Asp Lys Arg Thr Asn Phe Lys 145 150 155 160

Lys lie Gly Trp Asp Val Glu Ala His Lys lie Met Asn Asn Gly Trp

165 170 175

Gly Pro Tyr Gly Arg Asp Ser Tyr His Ser Thr Tyr Gly Asn Glu Met 180 185 190

Phe Leu Gly Ser Arg Gin Ser Asn Leu Asn Ala Gly Gin Asn Phe Leu 195 200 205

Glu Tyr His Lys Met Pro Val Leu Ser Arg Gly Asn Phe Asn Pro Glu 210 215 220

Phe lie Gly Val Leu Ser Arg Lys Gin Asn Ala Ala Lys Lys Ser Lys 225 230 235 240

lie Thr Val Thr Tyr Gin Arg Glu Met Asp Arg Tyr Thr Asn Phe Trp

245 250 255

Asn Gin Leu His Trp lie Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Glu Asn Arg Ala 260 265 270

Thr His Thr Ser lie Tyr Glu Val Asp Trp Glu Asn His Thr Val Lys 275 280 285

Leu lie Asp Thr Gin Ser Lys Glu Lys Asn Pro Met Ser

290 295 300

Claims (9)

Α Ξ Ι Ω Σ Ε Ι Σ

1. Ένα πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο, που περιλαμβάνει μια σύντηξη τριών ή περισσοτέρων πολυπεπτιδίων υπεραντιγόνου (SAg) που προέρχονται από Staphylococcus aureus διατεταγμένων με οποιαδήποτε σειρά, όπου το πολυσθενές ολιγοπεπτίδιο περιλαμβάνει:

(α) ένα εξασθενημένο τοξοειδές σταφυλοκοκκικής εντεροτοξίνης Β (SEB) που περιλαμβάνει τη SEQ ID NO: 49,

(β) ένα εξασθενημένο τοξοειδές σταφυλοκοκκικής εντεροτοξίνης A (SEA) που περιλαμβάνει τη SEQ ID NO: 50 και

(γ) ένα εξασθενημένο τοξοειδές σταφυλοκοκκικής τοξίνης- 1 του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) που περιλαμβάνει τη SEQ ID NO: 51.

2. Το ολιγοπεπτίδιο της αξίωσης 1 , όπου τα πολυπεπτίδια SAg που προέρχονται από το Staphylococcus aureus που συνδέονται μέσω συνδετών, περιλαμβάνει προαιρετικά (GGGS)n ή (GGGGS)n, όπου το η είναι ακέραιος από 1 έως 10.

3. Το ολιγοπεπτίδιο οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 2, που περιλαμβάνει την αλληλουχία αμινοξέων των SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, ή ένα συνδυασμό αυτών.

4. Το ολιγοπεπτίδιο οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3, που περιλαμβάνει περαιτέρω ένα ετερόλογο πεπτίδιο ή πολυπεπτίδιο ή/και έναν ανοσογόνο υδατάνθρακα, (α) όπου το ετερόλογο πεπτίδιο ή πολυπεπτίδιο περιλαμβάνει μια ετικέτα His, μια ετικέτα ουβικιτίνης, μια ετικέτα NusA, μια επικράτεια δέσμευσης χιτίνης, μια ετικέτα Β, μια ετικέτα HSB, πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), μια πρωτεΐνη δέσμευσης καλμοδουλίνης (CBP), μια πρωτεΐνη δέσμευσης γαλακτόζης, μια πρωτεΐνη δέσμευσης μαλτόζης (ΜΒΡ), επικράτειες δέσμευσης κυτταρίνης (CBD), μια ετικέτα αβιδίνης/στρεπταβιδίνης/Strep, trpE, ακετυλοτρανσφεράση χλωραμφαινικόλης, lacZ (βγαλακτοσιδάση), ένα πεπτίδιο FLAG™, μια ετικέτα S, μια ετικέτα Τ7, ένα ανοσογόνο, έναν επίτοπο Τ-κυττάρων, έναν επίτοπο Β -κυττάρων, ένα θραύσμα οποιουδήποτε από τα ετερόλογα πεπτίδια, ή έναν συνδυασμό δύο ή περισσοτέρων από τα ετερόλογα πεπτίδιαή

(Β) όπου ο ανοσογόνος υδατάνθρακας είναι ένας σακχαρίτης, ένας καψιδιακός πολυσακχαρίτης, ένας πολυσακχαρίτης επιφάνειας, ένας καψιδιακός πολυσακχαρίτης (CP) οροτύπου 5 (CP5), ένας CP8, μια πολυ-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (PNAG), μια πολυ-Ν-ηλεκτρινυλογλυκοζαμίνη (PNSG), ένα τειχοϊκό οξύ (WTA), ένα λιποτειχοϊκό οξύ (LTA), ένα θραύσμα οποιουδήποτε από τους ανοσογόνους υδατάνθρακες, ή ένας συνδυασμός δύο ή περισσοτέρων από τους ανοσογόνους υδατάνθρακες.

5. Ένα απομονωμένο πολυνουκλεοτίδιο το οποίο περιλαμβάνει ένα νουκλεϊκό οξύ που κωδικοποιεί το ολιγοπεπτίδιο οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3.

6. Ένας φορέας ή κύτταρο ξενιστής ο οποίος περιλαμβάνει το πολυνουκλεοτίδιο της αξίωσης 5.

7. Μια μέθοδος παραγωγής ενός πολυσθενούς ολιγοπεπτιδίου, το οποίο περιλαμβάνει καλλιέργεια του κυττάρου ξενιστή της αξίωσης 6 και ανάκτηση του ολιγοπεπτιδίου

8. Μια σύνθεση που περιλαμβάνει το ολιγοπεπτίδιο οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 4, έναν φορέα και προαιρετικά περιλαμβάνει περαιτέρω ένα ανοσοενισχυτικό ή/και ένα ανοσογόνο:

(α) όπου το ανοσοενισχυτικό είναι προαιρετικά στυπτηρία, υδροξείδιο του αργιλίου, φωσφορικό αργίλιο, ή ένα ανοσοενισχυτικό με βάση λιπίδια A γλυκοπυρανοζυλίου- και

(β) όπου το ανοσογόνο είναι προαιρετικά ένα βακτηριακό αντιγόνο το οποίο επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από μια τοξίνη που σχηματίζει πόρους, ένα υπεραντιγόνο, μια πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας, ένα θραύσμα οποιουδήποτε από τα βακτηριακά αντιγόνα και έναν συνδυασμό δύο ή περισσοτέρων βακτηριακών αντιγόνων.

9. Το ολιγοπεπτίδιο οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 4, για χρήση

(α) στην επαγωγή μιας ανοσολογικής απόκρισης ξενιστή έναντι του Staphylococcus aureus σε ένα υποκείμενο που έχει ανάγκη της ανοσολογικής απόκρισηςή

(β) στην πρόληψη ή την αγωγή μιας σταφυλοκοκκικής νόσου ή λοίμωξης σε ένα υποκείμενο.