CN117396181A

CN117396181A - 抗-IsaA F10抗体的预防和改善特应性皮肤炎的用途

Info

Publication number: CN117396181A
Application number: CN202180098625.4A
Authority: CN
Inventors: 罗喜俊; 李允淑; 刘帝沃; 李光淳
Original assignee: Harwood Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Hawu Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2024-01-12

Abstract

本发明涉及抗‑IsaA F10抗体的预防和改善特应性皮肤炎的用途，更详细而言，本发明涉及包括特定序列的重链CDR和轻链CDR的抗‑IsaA F10抗体或其抗原结合片段的预防和改善特应性皮肤炎的用途。所述抗‑IsaA F10抗体有望抑制金黄色葡萄球菌的生长，从而能够有效地应用于改善或治疗诸如特应性疾病之类的皮肤炎症。

Description

抗-IsaA F10抗体的预防和改善特应性皮肤炎的用途

技术领域

本发明涉及一种抗-IsaA F10抗体的预防和改善特应性皮肤炎的用途。

背景技术

特应性皮肤炎(AD：atopic dermatitis)是与严重的瘙痒、干燥一同伴有皮肤病变中的红斑、浮肿以及苔藓化之类的临床症状的严重且慢性复发的炎症性皮肤疾病。特应性皮肤炎的病因机制尚未完全查明，但广为人知的是，由于对环境内过敏原过敏的免疫反应(过敏反应)，在皮肤诱发慢性炎症反应而产生特应性皮肤炎。此外，特应性皮肤炎是在哮喘和过敏性疾病的发展之前产生的慢性炎症疾病，其症状根据趋化因子的浓度、量变或活性程度而存在差异，也指Th2类型的淋巴细胞侵入病变部(lesional skin)的现象。

据悉，目前世界人口的0.5～1％，尤其，在儿童的情况下，有5～10％受特应性皮肤炎困扰，并且其发病和恶化很大程度上是由环境因子引起的。作为其示例，特应性皮肤炎的发病频率与暴露于室内尘螨的量有关，并且还与特应性皮肤炎的重症度表现出显著的相关关系是广为人知的。此外，广为人知的是，通过减少对环境内室内尘螨的暴露能够降低特应性皮肤炎的重症度。除此之外，特应性皮肤炎被视为是因干燥的皮肤、与正常人相比易感皮肤瘙痒的特性、细菌/病毒/霉菌等引起的感染、情绪因素、环境因素等相互综合作用而产生的。近几十年间，特应性皮肤炎的发病率正在上升，并且目前在韩国的患者数量也在大幅增加。

以往，作为特应性皮肤炎的治疗剂最广泛使用的主要是诸如类固醇、抗组胺剂、抗生素等治疗剂。其中，类固醇是治疗支气管哮喘等炎症性疾病中最广泛使用的治疗剂，但至今为止，类固醇在体内反应的机制也尚不清楚。

因此，诸如类固醇之类的特应性皮肤炎的治疗剂因各种副作用而呈逐渐被限制使用的趋势，并且正需要一种对特应性皮肤炎有效果且没有副作用的新概念的特应性皮肤炎的治疗剂。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供一种包含抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物、用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物以及用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种包含对所述抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段进一步结合TAT肽的融合抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物、用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物以及用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物、用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物以及用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物，其作为有效成分而包含抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

此外，本发明提供用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物、用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物以及用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物，其作为有效成分而包含由序列编码7表示的TAT肽进一步结合于抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的融合抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

技术效果

本发明涉及抗-IsaA F10抗体的预防和改善特应性皮肤炎的用途，更详细而言，本发明涉及包括特定序列的重链CDR和轻链CDR的抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的预防和改善特应性皮肤炎的用途。所述抗-IsaA F10抗体有望抑制金黄色葡萄球菌的生长，从而能够有效地应用于改善或治疗诸如特应性疾病之类的皮肤炎症。

附图说明

图1示出了利用共聚焦显微镜获得的细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv抗体蛋白的细胞内渗透能力的结果。

图2示出了细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv抗体的针对金黄色葡萄球菌的抗菌力。

图3示出了利用金黄色葡萄球菌的细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv抗体对细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达的抑制程度。

图4示出了利用金黄色葡萄球菌的细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv抗体对最上位细胞因子TSLP和趋化因子TARC mRNA表达的抑制程度。

图5示出了细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv抗体的皮肤细胞治愈促进效果。

最佳实施方式

本发明提供一种用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物，其作为有效成分而包含抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

此外，本发明提供一种用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物，其作为有效成分而包含由序列编码7表示的TAT肽进一步结合于抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的融合抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

除了有效成分之外，所述化妆品组合物还可以包含诸如稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料之类的常规辅助剂以及载体。

所述化妆品组合物的剂型可以制备为本领域通常制备的任何剂型，可以具有选自由皮肤外用软膏、霜、柔软化妆水、营养化妆水、面膜、精华素、生发水、洗发水、润发素、护发素、头发护理剂、凝胶、润肤乳、柔肤乳、爽肤水、紧肤水、护肤水、乳液、保湿乳、营养水、按摩霜、营养霜、眼霜、保湿霜、手霜、粉底、营养精华素、防晒、肥皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、润肤露及沐浴露组成的组中的剂型，但不限于此。这些各种剂型的组合物可以含有对该剂型进行制剂化所需要的适当的各种基础原料和添加物，本领域技术人员可以容易地选择这些成分的种类和量。

在所述剂型是糊剂、霜剂或凝胶的情况下，动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等可以用作载体组分。

在所述剂型为粉末剂或喷雾剂的情况下，可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸三钙或聚酰胺粉末作为载体组分，尤其，当剂型为喷雾剂时，可以附加地包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚之类的推进剂。

在所述剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体组分，例如有，水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。

在所述剂型为悬浮液的情况下，可以利用诸如水、乙醇或丙二醇之类的液态稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯之类的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等作为载体组分。

此外，本发明提供一种用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物，其作为有效成分而包含抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

此外，本发明提供一种用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物，其作为有效成分而包含由序列编码7表示的TAT肽进一步结合于抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的融合抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

所述保健食品组合物可以以粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆、饮料或丸剂的形态被提供，所述保健食品组合物除了作为有效成分的根据本发明的组合物之外，还可以与其他食品或食品添加物一同使用，并且可以根据通常的方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据其使用目的(例如预防、保健或用于治疗的处理)而适当地确定。

所述保健食品组合物中含有的抗体或其抗原结合片段的有效剂量可以遵照所述药学组合物的有效剂量来使用，但在以健康及卫生为目的或以健康调理为目的而长期摄取的情况下，可以按上述范围以下的量使用，但由于有效成分在安全性方面没有任何问题，确实也可以以上述范围以上的量使用。

所述保健食品的类型没有特别限制，其示例可以为肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食类、饼干类、披萨、方便面、其他面条类、口香糖类、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、功能饮料、酒精饮料以及维生素复合剂等。

此外，本发明提供一种用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物，其作为有效成分而包含抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

此外，本发明提供一种用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物，其作为有效成分而包含由序列编码7表示的TAT肽进一步结合于抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的融合抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段包括：轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

本发明的药物组合物可以附加地包含药剂学上可接受的载体，所述药剂学上可接受的载体作为制剂时通常使用的载体，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限于此。除了上述组分之外，本发明的药物组合物还可以进一步包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

本发明的药物组合物可以口服给药或非口服给药，在非口服给药的情况下，药物组合物可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻腔内给药、肺内给药以及直肠内给药等方式进行给药。在口服给药的情况下，由于蛋白质或肽会被消化，因此口服用组合物可以以涂敷活性药剂或防止在胃中分解的方式进行剂型化，本发明的组合物可以通过能够使活性物质向靶细胞移动的任意装置来给药。

本发明的药物组合物的合适剂量根据诸如制剂化方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度和反应敏感性之类的因素而不同，并且普通熟练的医生可以容易地确定和开出对期望的治疗或预防有效的剂量。

本发明的药学组合物可以根据本发明所属技术领域中具备普通知识的技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而制备成单位容量形态或制备成装入多容量容器内。此时，剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浓缩剂、散剂、栓剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，并且还可以进一步包括分散剂或稳定剂。

本发明的组合物可以作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂组合而给药，并且可以与现有治疗剂一起按序地或同时给药。

另外，利用由序列编码1至序列编码6表示的氨基酸组成的CDR记载于表1中。

此外，本发明中所使用的TAT肽的氨基酸序列为“YGRKKRRQRRR”(序列编码7)，TAT肽的碱基序列为“TAT GGC CGC AAA AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC”(序列编码8)。

在发明中，术语“抗体”是指起到特异性地识别抗原的受体作用的蛋白分子，其包括在免疫学上与特定抗原具有反应性的免疫球蛋白分子，作为其示例，可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、全长抗体(full-length antibody)以及抗体片段的全部。此外，所述术语“抗体”可以包括二价的(bivalent)或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体或四抗体。

在本发明中，术语“单克隆抗体”是指从实质上相同的抗体群中获得的由单分子组成的抗体分子，与多克隆抗体能够结合在多个表位(epitope)的情况不同地，这种单克隆抗体对特定表位表现出单一结合性及亲和性。在本发明中的术语“全长抗体”是指具有两条整体长度的轻链和两条整体长度的重链的结构，其中每条轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)及伊普西龙(ε)类型，并且具有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)及阿尔法2(α2)作为亚类(subclass)。轻链的恒定区具有卡帕(κ)和拉姆达(λ)类型。IgG的亚型(subtype)，包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。

在本发明中，术语“重链”可以包括全长重链及其片段这两者，所述全长重链及其片段包括包含具有足以用于对抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列的可变区VH以及三个恒定区CH1、CH2以及CH3。此外，在本发明中，术语“轻链”可以包括全长轻链及其片段两者，所述全长轻链及其片段包括包含具有足以用于对抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列的可变区VL以及恒定区CL。

在本发明中，术语“片段”、“抗体片段”以及“抗原结合片段”是指具有抗体的抗原结合功能的本发明的抗体的任意片段且能够互换使用。示例性的抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv等，但不限于此。

发明的实施形态

以下将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

<实施例1>抗-IsaA scFv抗体的筛选

1.执行生物淘选(bio-panning)

利用具有7.6×10⁹的多样性的OPAL数据库(library)执行了生物淘选(bio-panning)。将10μg的IsaA抗原固定于环氧基磁珠(Epoxy magnetic bead)，并使输入噬菌体(input phage)进行了反应。将与抗原反应的噬菌体(phage)洗脱(elution)，并测量了输出滴度(output titer)。通过测量每次的输入(input)和输出(output)滴度(titer)来获取生物淘选(bio-panning)的信息并确认了是否正常执行。每次的输入噬菌体(input phage)使用了≥1×10¹²cfu/mL的噬菌体(phage)。测量到的输出(output)在第一次为-6.5×10⁶cfu/mL，在第二次为-1.13×10⁴cfu/mL，在第三次为-4.21×10⁷cfu/mL。因此，可以确认生物淘选(bio-panning)正常进行。

2.ELISA分析

为了筛选高敏感度、高特异性抗体而执行了ELISA分析法。利用获得的噬菌体(phage)感染大肠杆菌，并涂抹于添加有抗生素的LB板(plate)。在30℃的培养器中培养16小时后，随机采集了所生成的菌落。将各个菌落接种到LB培养基并培养后，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)处理来表达scFv抗体，并裂解(lysis)大肠杆菌来提取可溶性组分(soluble fraction)，从而执行了ELISA。首先，将50ng的IsaA抗原固定于96-孔(well)ELISA板(plate)，并用含有3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行了封闭(blocking)。1小时后，处理上面获得的细胞裂解产物(cell lysate)并在37℃下反应了2小时。用含有0.1％吐温(Tween)20的PBS对板(plate)进行三次洗涤后，在封闭溶液(blockingsolution)中以1:1000稀释HRP缀合的抗HA(HRP-conjugated anti-HA)抗体，并在常温下反应了1小时。用含有0.1％吐温20的PBS对板(plate)进行五次洗涤后，用TMB底物(substrate)显色，并用ELISA读取器(reader)测量了与抗原结合的scFv抗体。分析了96种抗体，并任意地将光密度值(OD)0.4确定为阳性参考线(positive guideline)，将光密度值(OD)0.1确定为阴性参考线(negative guideline)而筛选了10种抗体。

<实施例2>抗-IsaA scFv抗体的序列分析

对通过ELISA分析筛选出的IsaA scFv的10种阳性克隆(positive clone)进行序列分析(sequencing)而筛选了单独的克隆(clone)。由于在先筛选的阳性克隆中可能存在重复的克隆，因此需要序列分析。根据序列分析结果确认，10种阳性克隆中有7种是单独的克隆。

<实施例3>经筛选的抗-IsaA F10 scFv抗体的纯化及敏感度分析

1.抗-IsaA F10 scFv抗体的纯化

从经筛选的7种中纯化了抗原结合力最高的抗-IsaA F10 scFv抗体(表1)。在500mL的SB培养基(media)中培养具有抗-IsaA scFv克隆(F10)被转化(transformation)的ER2738大肠杆菌细胞(E.coli cell)之后，利用1×TES缓冲液裂解(lysis)细胞。使细胞裂解产物(cell lysate)在0.5mL的镍磁珠(Ni bead)反应并利用咪唑(imidazole)进行了洗脱(elution)。

[表1]

<实施例4>细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv抗体的制备

1.TAT-抗-IsaA F10 scFv DNA构建(construct)制备

针对在先筛选的抗-IsaAscFv利用引物(primer)生产了插入限制性内切酶位点(restriction enzyme site)和TAT的PCR产物。用1μL的EcoR I、1μL的Xho I处理PCR产物(insert)和pET28a(+)载体(vector)，并在37℃下反应1小时后进行了纯化。利用纳米棒(nanodrop)测量经纯化的载体(vector)和插入物(insert)的浓度，并在常温下利用T4连接酶(ligase)按照载体(vector)与插入物(insert)的比率进行了16小时的连接反应(ligation)。连接反应(Ligation)结束后，在DH5α中进行转化之后，涂抹在添加有卡那霉素的LB板(plate)，并在37℃下培养16小时，次日取出菌落，接种到添加有卡那霉素的LB培养基(media)，并在37℃下培养了16小时。次日，为了确认是否插入了插入物(insert)，分离质粒(plasmid)，用Xho I和EcoR I进行酶切(restriction)，并通过在1％琼脂糖凝胶(agarose gel)进行电泳来确认条带。

2.TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体的纯化

将经克隆的TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体克隆转化到了BL21(DE3)大肠杆菌宿主。转化体在包含卡那霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀值达到0.6为止，在16℃下用0.5mM的IPTG进行处理来进行了表达诱导(induction)。将通过离心分离培养液获得的细胞悬浮在裂解缓冲液(lysis buffer)(50mM的Tris-Hcl，pH 7.5、150mM的NaCl)中，然后利用超声波研磨机破碎后进行离心分离，从而获得了上清液。为了仅纯分离纯化经诱导表达的蛋白质，使用了对Ni-NTA具有亲和力的树脂，并通过SDS-PAGE分析确认了经纯化的蛋白质。

<实施例5>细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv抗体的细胞渗透分析

为了确认TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体的细胞渗透，采用了免疫荧光法。在用0.1％明胶涂布1小时的10mm盖玻片(coverslip)将人类皮肤细胞按1×10⁵个进行分株后，放入含有10％胎牛血清(FBS：fetal bovine serum)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)的RPMI培养基，保持37℃并在包含5％二氧化碳的培养器中进行了培养。培养后，更换为不包含FBS的1.5mL的新鲜的培养液，用50ppm的TAT-抗-IsaA F10 scFv进行处理。处理12小时后，将细胞固定于固定液，用5％FBS封闭，并利用抗-His-FITC抗体进行了免疫反应。用TAT-抗-IsaAF10 scFv(绿色)染色后，通过共聚焦显微镜(confocal microscope)进行了确认。如图1所示，确认TAT-抗-IsaA F10 scFv发生了细胞内渗透。

<实施例6>细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv的细胞毒性测试

为了了解TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体的细胞毒性，将人类皮肤细胞在96-孔(well)板以每孔(well)1×10⁴个进行分株后，保持37℃，在包含5％二氧化碳的培养器中进行了培养。24小时后，按不同浓度处理TAT-抗-IsaA F10scFv，然后在相同条件下进行了追加的培养。培养结束后，放入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT：3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)溶液进行3小时的反应，然后去除培养液，各加入100μL的二甲基亚砜(DMSO：Dimethyl sulfoxide)。摇晃15分钟后，用ELISA读取器(reader)在570nm处测量了吸光度。如表2所示，当用TAT-抗-IsaA F10scFv以0.01ppm、0.1ppm、1ppm、10ppm、50ppm、100ppm的浓度进行处理时，确认了到100ppm的浓度为止，几乎没有细胞形状变形和细胞生存率的变化。因此，可知，TAT-抗-IsaA F10scFv抗体在100ppm的浓度为止是无细胞毒性的物质。

[表2]

<实施例7>细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv的金黄色葡萄球菌抗菌力测试

1.TAT-抗-IsaA F10 scFv的抑制神经酰胺酶效果的确认

对TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产神经酰胺酶(Ceramidase)的效果进行了了解。

在TSB固体培养基涂抹0.1ml的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株后进行了干燥。将TAT-抗-IsaA F10 scFv稀释至10ppm和100ppm并在直径为8mm的纸盘(paperdisc)各滴定50ul后，置于固体培养基上，然后在37℃下培养了24小时。观察在纸盘周边产生的菌生长阻滞区并测量大小，其结果，由于TAT-抗-IsaA F10 scFv阻碍了金黄色葡萄球菌的生长，因此确认了抑制神经酰胺酶的活性的可能性(表3)。

[表3]

样本名称	菌生长阻滞环的大小
		PBS	0mm
青霉素	15mm
		TAT-抗-IsaA F10scFv 10ppm	4mm
TAT-抗-IsaA F10scFv 100ppm	8mm

2.TAT-抗-IsaA F10 scFv的抑制金黄色葡萄球菌生长效果的确认

对TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的成长的效果进行了了解。

将菌株接种到胰蛋白酶大豆肉汤培养基(TSB：Tryptic soy broth)，培养至OD达到0.1后，用TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体进行了处理。在37℃下培养24小时之后，在600nm处测量吸光度，从而考察了金黄色葡萄球菌的生长能力。作为阴性对照组使用了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。确认到TAT-抗-IsaA F10 scFv阻碍金黄色葡萄球菌的生长(图2)。

<实施例8>细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv的抑制炎症性细胞因子表达效果

为了了解关于TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体是否抑制主要在特应性皮肤炎皮肤发现的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表达，将人类皮肤细胞在6-孔(well)板以每孔(well)1×10⁵个进行分株后，保持37℃，在包含5％二氧化碳的培养器中进行了培养。24小时后，在无血清(serum-free)RPMI培养液中将TAT-抗-IsaA F10 scFv10ppm并分株了1×10⁴个金黄色葡萄球菌。培养后，针对细胞利用TRIzol提取了总RNA。向造粒(Pellet)放入经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的纯化水30μL并使其溶解，然后在260nm处定量。利用1μg的总RNA和TOPscript RT干混物(dry mix)执行了实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。实时(Real Time)PCR中使用的MMP-1和GAPDH在Macrogen进行了合成并使用，碱基序列示于下表4中。利用TOPreal^TM Qpcr 2XPreMIX实施了实时(Real Time)PCR。如图3所示，TAT-抗-IsaA F10 scFv抑制了因金黄色葡萄球菌增加的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，并呈现出了与作为对照组处理青霉素的效果相似的效果。

[表4]

<实施例9>细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv的抑制抗特应性效果

为了了解关于TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体是否抑制在特应性皮肤炎患者的血清中增加的最上位细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP：thymic stromallymphopoietin)和趋化因子腺活化调节趋化因子(TARC：thymus andactivationregulated chemokine/CCL17)mRNA的表达，将人类皮肤细胞在6-孔(well)板以每孔(well)1×10⁵个进行分株后，保持37℃，在包含5％二氧化碳的培养器中进行了培养。24小时后，在无血清(serum-free)RPMI培养液中将TAT-抗-IsaA F10 scFv10ppm并分株了1×10⁴个金黄色葡萄球菌。培养后，针对细胞利用TRIzol提取了总RNA。向造粒(Pellet)放入经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的纯化水30μL并使其溶解，然后在260nm处定量。利用1μg的总RNA和TOPscript RT干混物(dry mix)执行了实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。实时(RealTime)PCR中使用的TSLP、TARC以及GAPDH在Macrogen进行了合成并使用，碱基序列示于下表5中。利用TOPreal^TM Qpcr2X PreMIX实施了实时(Real Time)PCR。如图4所示，TAT-抗-IsaAF10 scFv抑制了因金黄色葡萄球菌增加的最上位细胞因子TSLP和趋化因子TARC，并呈现出了与作为对照组处理青霉素的效果相似的效果。

[表5]

<实施例10>细胞渗透性抗-IsaA F10 scFv的皮肤细胞治愈促进效果

为了了解TAT-抗-IsaA F10 scFv抗体的皮肤细胞治愈促进，将人类皮肤细胞在6-孔(well)板以每孔(well)1×10⁵个进行分株后，保持37℃，在包含5％二氧化碳的培养器中进行了培养。24小时后，在无血清(serum-free)RPMI培养液中，将TAT-抗-IsaA F10 scFv处理为50ppm，并在1小时之后，利用1,000p尖端(tip)产生了划痕伤口(scratch wound)。在培养48小时后，划痕边缘(scratch margin)部位的细胞生长，从而利用显微镜测量了伤口闭合(wound closure)程度和伤口面积(wound area)(图5)。如图5所示，观察到了TAT-抗-IsaA F10 scFv的伤口治愈效果。

以上，详细记述了本发明的特定的部分，对于本发明所属技术领域的具备普通知识的技术人员来说，这些具体记述仅为优选实现例，本发明的范围并不限于此的这一点是显而易见的。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物定义。

<110> 哈坞生物科技株式会社

<120> 抗-IsaA F10抗体的预防和改善特应性皮肤炎的用途

<130> OP-2021-0029PCT/CN

<150> KR 10-2021-0066882

<151> 2021-05-25

<150> KR 10-2021-0076076

<151> 2021-06-11

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链CDR1

<400> 1

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asn Val Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链CDR2

<400> 2

Ala Asn Ser Gln

1

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链CDR3

<400> 3

Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链CDR1

<400> 4

Gly Tyr Ala Met Gly

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链CDR2

<400> 5

Val Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链CDR3

<400> 6

Lys Val Arg Arg Val Phe Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TAT肽

<400> 7

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAT肽

<400> 8

tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgc 33

Claims

1.一种用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物，其作为有效成分而包含抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，包括：

轻链可变区，包括利用由序列编码1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列编码2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列编码3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及

重链可变区，包括利用由序列编码4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列编码5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列编码6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

2.一种用于预防或改善特应性皮肤炎的化妆品组合物，其作为有效成分而包含由序列编码7表示的TAT肽进一步结合于抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的融合抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-IsaAF10抗体或其抗原结合片段包括：

3.一种用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物，其作为有效成分而包含抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，包括：

4.一种用于预防或改善特应性皮肤炎的保健食品组合物，其作为有效成分而包含由序列编码7表示的TAT肽进一步结合于抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的融合抗-IsaAF10抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段包括：

5.一种用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物，其作为有效成分包含抗-IsaAF10抗体或其抗原结合片段，其中，包括：

6.一种用于预防或治疗特应性皮肤炎的药物组合物，其作为有效成分而包含由序列编码7表示的TAT肽进一步结合于抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段的融合抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-IsaA F10抗体或其抗原结合片段包括：