KR20120016086A

KR20120016086A - 슈도모나스 애루지노사 혈청형 ｉａｔｓ０１의 지질다당류(ｌｐｓ) 특이적 인간 단일클론 항체

Info

Publication number: KR20120016086A
Application number: KR1020117026384A
Authority: KR
Inventors: 마이클 루돌프; 홀거 코치; 스테파니 파스
Original assignee: 켄타 바이오테크 아게
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2012-02-22
Also published as: WO2010115606A1; CA2758081A1; MX2011010634A; JP2012523221A; BRPI1013427A2; EP2417157A1; US20120114657A1; IL215549A0; CN102639562A

Abstract

본 발명은 슈도모나스 애루지노사 혈청형(P. aeruginosa serotype) IATS O1에 대해 특이적인 인간 단일클론 항체, 및 상기 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 최소한 하나의 항체 또는 상기 항체를 암호화하는 최소한 하나의 핵산을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

슈도모나스 애루지노사 혈청형 ＩＡＴＳ０１의 지질다당류(ＬＰＳ) 특이적 인간 단일클론 항체{Human Monoclonal Antibody Specific for Lipopolysaccharides (LPS) of Serotype IATS O1 of Pseudomonas aeruginosa}

본 발명은 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 혈청형 IATS O1에 대한 특이적 인간 단일클론항체, 그것을 생산하는 하이브리도마(hybridoma), 그것을 암호화하는 핵산(nucleic acids), 및 그것을 형질도입한 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 항체 또는 상기 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)는 신선한 물 및 토양에서 발견되는 어디에나 존재하는 그람-음성 환경 박테리아이다. 이것은 정상적으로는 옵소닌 항체(opsonising antibodies) 및 포식작용(phagocytosis)으로 균을 제거할 수 있는, 면역성이 있는 숙주(immunocompetent host)에게는 위험이 되지 않는 전형적인 기회 감염균(opportunistic pathogen)이다. 하지만, 낭포성 섬유증 환자(cystic fibrosis patient) 및 화상 환자, ICU내 관삽입 환자, 암 및 AIDS 환자 뿐만 아니라 기관 이식을 겪은 환자를 포함한 면역손상된(immunocompromised) 개인은 특히 병원 감염과 접촉할 위험이 높다. 메테실린-내성 스타필로코커스 오레우스(methicillin-resistant S. aureus; MRSA) 및 반코마이신-내성 엔터로코시(vancomycin-resistant enterococci;VRE)와 함께, 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)는 전체 병원 감염의 34%에 해당하고, 이것은 1975년 7.2/1000 환자일(patient days)에서 1995년 9.8/1000 환자일로 증가하였다. 혈류 감염(blood-stream infection) 및 뉴모니아(pneumonia)는 가장 높은 빈도로 관찰되는 병원 감염의 형태이다.

낭포성 섬유증 환자에서 만성 슈도모나스 애루지노사의 감염 예방을 위해 슈도모나스 애루지노사의 탈독소화 독소 A와 결합된, 가장 관련있는 슈도모나스 애루지노사의 8개의 LPS 혈청형으로 구성된 8가 접합체-백신(octavalent conjugate-vaccine)을 개발하기 위한 시도가 있었다. 초기 임상 결과는 유망하였고, 슈도모나스 애루지노사의 혈청형에 대한 강력한 항체의 유도를 나타내었다. 하지만, 능동 백신 접종(active vaccination)은 오직 면역력이 있는 환자 및 예측 가능한 상황에서만 가능하였다. 따라서, 대부분의 슈도모나스 애루지노사의 희생자들은 8가 백신을 사용하여 능동적으로 면역화될 수 없다. 대부분의 슈도모나스 애루지노사 균주는 다중약물 내성이 있다는 사실 때문에, 슈도모나스 애루지노사-감염 환자들을 치료하기 위한 다른 치료 대안 수단이 필요하다. 하나의 시도는 일반적인 하이브리도마 기술(hybridoma technology) 또는 파지 디스플레이 레퍼토리 클로닝(phage display repertoire cloning)을 사용하여 인간 단일클론 항체를 만드는 것이다.

두 방법 및 그로 인해 만들어진 항체는 심각한 단점이 있다.

일반적인 하이브리도마 기술(classical hybridoma technology, "Kohler and Milstein" 접근)은 선택한 항원의 능동적 면역접종(immunization)에 의해서 및 골수성 파트너(myeloma partner)와 융합에 의해서 원하는 특이성을 갖는 쥐의 B 세포(murine B cell)을 유도하는 것에 기초한다. 그 후에, 항체-생산 클론의 유전적 정보를 유전적 조작에 의해 인간화시키고, 생산되는 상기 항체를 적절한 발현 시스템내에서 생산하도록 한다. 유사하게, 파지 디스플레이 레퍼토리 클로닝(phage display repertoire cloning)은 상기 항체의 정교한 유전적 조작 및 적절한 발현 시스템의 수립을 요구한다.

박테리아 LPS에 대하여 직접적인 쥐의 단일클론 항체는 다른 인간항체보다 에피토프를 인지하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 인간화 이전의 쥐에서 단일클론 항체의 생산은 인간에서 사용을 위해 관련 있는 특이성을 갖는 항체의 분리를 반드시 야기하지 않는다.

또한, IgM 아형(isotype)의 항체는 항박테리아 면역에 적합한 IgM과 연결된 작용기 메커니즘 때문에 가장 효과가 있다. 하지만, 지금까지 IgM 항체의 재조합 발현은 IgM 분자의 5합체 형태인 복합체 때문에 이루어질 수 없었다. 결과적으로, 파지-디스플레이 기술에 의해 분리된 항체의 발현은 IgM이 아닌 다른 아형으로 제한되어 있다.

또는, 슈도모나스 애루지노사의 LPS 모이어티(moieties)에 대한 인간 단일클론 항체를 생산하기 위한 다른 시도가 있었다. 하지만, 그들 중 다수는 작용기 기능이 결여되었고 따라서 보호적 기능이 없었다.

그에 있어서, 본 발명에 있는 한 기술적 문제는 특정 슈도모나스 애루지노사혈청형의 LPS에 대하여 특이적인 인간 단일클론 항체를 생산하는 것이고, 여기에서 상기 항체는 높은 보호적 기능, 특히 생체내(in vivo)에서 높은 보호적 기능을 나타낸다.

상기 기술적 문제는 하기에 정의되는 인간 단일클론 항체에 의해 해결되었다.

본 발명에 따라, 슈도모나스 애루지노사 혈청형 IATS O1의 LPS에 특이적인 216-O1의 인간 단일클론 항체가 제공되었고 여기에서 상기 항체 경쇄의 가변 부위는 최소한 하나의 CDR1 부위내에서 서열 번호: 1, CDR2 부위내에서 서열 번호: 2, CDR3 부위내에서 서열 번호: 3을 포함하고, 및 여기에서 상기 항체 중쇄의 가변부위는 최소한 하나의 CDR1 부위내에서 서열 번호: 4, CDR2 부위내에서 서열 번호: 5, CDR3 부위내에서 서열 번호: 6을 포함하거나; 또는 상기 LPS에 결합할 수 있는 그것의 단편 또는 유도체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 슈도모나스 애루지노사 혈청형 IATS O1의 LPS에 대하여 특이적인 인간 단일클론 항체는 제공되고 여기에서 상기 항체 경쇄의 가변 부위는 최소한 하나의 CDR1 부위 내에서 서열 번호: 1, CDR2 부위 내에서 서열 번호: 2, CDR3 부위 내에서 서열 번호: 3을 포함하고, 및 여기에서 상기 항체 중쇄의 가변부위는 최소한 하나의 CDR1 부위 내에서 서열 번호: 4, CDR2 부위 내에서 서열 번호: 5, CDR3 부위 내에서 서열 번호: 6을 포함하거나; 또는 상기 LPS에 결합할 수 있는 그것의 단편 또는 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 단일클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마(hybridoma) 및 상기 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 암호화하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 또한, 상기 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 최소한 하나의 항체 및/또는 최소한 하나의 핵산을 포함하는 약학적 조성물 및 그것의 2차 의학적 용도를 제공한다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 높은 보호적 능력을 나타내는 것을 발견하였다. 특히, 상기 인간 단일클론 항체는 시험관 내(in vitro)에서 옵소닌식세포화(opsonophagocytic)되는 것으로 증명되었다. 보다 중요하게는, 본 발명에 따른 상기 단일클론 항체는 화상 쥐 모델에서 전신 감염(systemic infection)으로부터 치료뿐만 아니라 보호되기 때문에 생체내에서 보호적 기능을 나타낸다.

Collins et al. (Collins MS et al., 1990. FEMSIM 64:263-268)에 의해 기술된 인간 단일클론 항체와 비교하여, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 보다 낮은 농도에서 보다 높은 보호적 기능뿐만 아니라 옵소닌식세포작용(opsonophagocytosis)이 있다. 또한, 당업계에서 기술된 단일클론 항체와 대조적으로, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 격리 환자의 인지에서 유의적으로 보다 좋은 결과 및 옵소닌식세포작용 검사(opsonophagocytosis assays)에서 좋은 결과 모두를 나타내었다.

당업계에서 기술된 단일클론 항체(Harrison FJJ et al. 1997. Hybridoma 16(5):413-420; Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 56(8):1873-1879)와 대조적으로, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 나아가 접합체 백신(conjugate vaccine)으로 능동적으로 면역화된 건강한 개개인의 혈액으로부터 생성되었다. 일반적으로 다당류(polysaccharides)에 대한 항체는 T-세포 도움의 결여때문에 낮은 질(즉, 낮은 작용기 능력을 갖는 저-친화력)을 갖는다. 단지 접합체 백신(conjugate vaccine)을 통해 강한 작용기 기능과 함께 고친화력을 갖는, 다당류 표적에 대한 뛰어난 항체가 생산되었다. 또한, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 생산율은 당업계에 기술된 단일클론 항체의 생산율(Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 56(8):1873-1879)과 비교하여 보다 높다.

본 발명에 따라서, 상기 항체는 형광-결합 박테리아(fluorescence-conjugate bacteria)를 사용하여 결정된 것과 같이, 슈도모나스 애루지노사 혈청형 IATS O1의 LPS에 대해 특이적이고 0.1ng/ml의 낮은 농도, 바람직하게는 0.5ng/ml의 낮은 농도에서 옵소닌식세포 활성을 나타낸다. 상기 낮은 농도에서 옵소닌식세포 작용 활성을 나타낸 항체는 이전의 당업계에 보고된 적이 없다.

본 발명의 항체는 슈도모나스 애루지노사 혈청형 IATS O1의 LPS에 대해 특이적이고 1.7 및 4.3ng/ml[95% 컨피던스 간격(confidence interval)] 사이의 농도, 특히 약 2.7ng/ml의 농도에서 에서 최대 옵소닌식세포 작용 활성의 반을 나타낸다.

또한, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 혈청형 IATS O1의 LPS에 특이적으로 결합하고 하기의 결합활성(avidity)을 갖는 항체를 계획한다:

1.03x10⁸ M^-1 +/- 3.41x10⁷ M^-1.

본 발명에 따른 상기 단일클론 항체는 높은 특이성으로 임상 격리체(clinical isolates)를 인식한다. 슈도모나스 애루지노사 혈청형 IATS O1에 감염된 환자 10 샘플 중 10개 모두 이 항체를 사용하여 동정되었다. 결부된 이론없이, 단일클론 항체는 당업계에 알려진 모든 슈도모나스 애루지노사 혈청형 IATS O1를 인지할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 특성은 상기 항체가 특히 진단 및 치료에 유용함을 준다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 돋보적인 확실성을 나타낸다.

여기서 사용되는 "인간 단일클론 항체"의 용어는 단일클론 항체가 수득된 출처에 상관없이 모든 부분적 또는 전체적 인간 단일클론 항체를 포함한다. 하이브리도마에 의한 상기 인간 단일클론 항체의 생산은 바람직하다. 또한, 상기 단일클론 항체는 유전적 조작에 의해 생산될 수 있고, 보다 구체적으로는 청구항에 정의된 특이적 CDR 부분으로 배경 항체(background antibody)의 CDR 부위를 대체함으로써 청구항에 정의된 CDR 부분을 가능한 단일클론 항체로 CDR 이식에 의하여 생산될 수 있다.

"CDR 부위"는 항체의 상보성 결정 부위(complementarity determining region), 즉 특정 항원에 대하여 항체의 특이성을 결정하는 부위를 위해 사용되는 용어이다. 경쇄 및 중쇄 모두에서 세 개의 CDR 부위(CDR1 내지 CDR3)는 항원 결합을 담당한다.

상기 CDR은 http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html에 보여지는 것과 같이 케벳 번호(Kabat numbering)를 적용하여 결정된다.

중쇄 내에 CDR 부위의 위치는 하기와 같다:

V_H 엑손(exon) 내에서 CDR1 부위 아미노산 31 내지 35,

V_H 엑손(exon) 내에서 CDR2 부위 아미노산 50 내지 65,

V_H 엑손(exon) 내에서 CDR3 부위 아미노산 95 및 하기의 아미노산.

CDR 부위의 위치는 항체의 종류, 즉 IgM, IgA 또는 IgG와 무관하다.

카파 경쇄내에서 CDR 부위의 위치는 하기와 같다:

V _χ 엑손( exon ) 내에서 CDR1 부위 아미노산 24 내지 34,

V _χ 엑손( exon ) 내에서 CDR2 부위 아미노산 50 내지 56,

V _χ 엑손( exon ) 내에서 CDR3 부위 아미노산 89 및 하기의 아미노산.

람다 타입 경쇄내에서 CDR 부위의 위치는 하이과 같다:

V _λ 엑손( exon ) 내에서 CDR1 부위 아미노산 24 내지 34,

V _λ 엑손( exon ) 내에서 CDR2 부위 아미노산 50 내지 56,

V _λ 엑손( exon ) 내에서 CDR3 부위 아미노산 89 및 하기의 아미노산.

V _H , V _χ , 및 V _λ 엑손의 아미노산 배열( alignment )은 V 염기( base )로부터 수득될 수 있다(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).

"혈청형(serotype)" 용어는 모든 알려진 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 혈청형을 의미한다. 상이한 슈도모나스 애루지노사 혈청형을 위해 현재 사용되는 상이한 명명법의 용어 색인표는 상세한 설명에 있는 표 1에 보여진다.

"단편(fragment)"은 LPS 혈청형에 결합할 수 있는 항체의 모든 단편을 의미한다. 상기 단편은 최소한 10개, 바람직하게는 20개, 보다 바림직하게는 50개의 아미노산을 갖는다. 적절한 항체 단편의 예는 2가 단편(divalent fragment), 예를 들면 F(ab)_2, F(ab')₂, 1가 단편(momovalent fragment), 예를 들면 Fab, Fab', Fv, 상기의 단일쇄(single chain) 재조합 형태, 및 그와 같은 것을 포함한다. 항체 단편은 글리코실화될(glycosylated) 수 있고, 예를 들면 항체 가변 부위에서 카르보하이드레이트 모이어티(carbohydrate moieties)를 포함한다. 항체의 결합부위로 구성되는 단편이 바람직하다. 단편은 Fab 또는 F(ab')₂ 단편 또는 그것의 혼합물인 것이 바람직하다.

"유도체"라는 용어는 최소한 한 개의 아미노산 첨가, 결실, 및/또는 치환에 의해 상이해진 인간 단일클론 항체의 모든 변형단백질(mutein)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 유도체는 인간 단일클론 항체의 변형단백질이고 여기에서 변형단백질은 청구항에서 정의된 중쇄 및/또는 경쇄에 있는 어떤 CDR에서 최소한 하나의 보존적 치환을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 변형단백질은 5개 이하, 4개 이하, 바람직하게는 세 개 이하, 특히 바람직하게는 2개 이하의 치환을 갖는다. 상기 항체의 단편 또는 유도체의 특정 LPS 혈청형에 결합하는 능력은 재료 및 방법 부분에 기술된 직접적 ELISA에 의해 결정된다: 특정 LPS는 ELISA 플레이트의 고체면에 고정된다. 항체 단편 또는 항체의 유도체는 고정화된 LPS와 함께 배양되고, 결합된 항체 또는 그것의 유도체는 적절한 효소-결부된 2차 항체(enzyme-conjugated secondary antibody)에 의하여 가시화된다.

본 발명에 따라, "보존적 치환"이라는 용어는 특정 물리화학적군에 속하는 하나의 아미노산이 동일한 물리-화학적 군에 속하는 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 상기 물리-화학적 군은 하기와 같다:

비-극성 아미노산의 군은 하기로 구성된다: 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 트립토판(tryptophan). 전하를 띠지 않는 극성 곁사슬(side chain)을 갖는 아미노산 군은 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 티로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 및 시스틴(cystine)으로 구성된다. 양성 전하를 띤 극성 곁사슬을 갖는 아미노산의 물리-화학적 군은 리신(lysine), 아르기닌(arginine), 및 히스티딘(histidine)으로 구성된다. 음성 전하를 띤 극성 곁사슬을 갖는 물리-화학적 군은 아스팔산(aspartic acid) 및 글루타믹 산(glutamic acid)으로 구성되어 있으며, 또는 아스팔테이트(aspartate) 및 글루타메이트(glutamate)로 명명된다.

본 발명에서, 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 혈청형 IATS O1의 LPS에 특이적인 항체는 상기 개요된 것과 같이 제공된다.

한 실시예에 따라, 본 발명은 LPS 또는 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) LPS 혈청형 IATS O1에 특이적인 인간 단일클론 항체를 제공하고 여기에서 상기 항체 경쇄의 가변 부위는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는다.; 또는 상기 LPS에 결합할 수 있는 상기 항체의 변이는 서열 번호: 7에 대해 최소한 85% 상동성, 바람직하게는 최소한 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소한 95%의 상동성을 갖고, 그리고 상기 항체 중쇄의 가변 부위의 아미노산 서열은 서열 번호: 8에 대하여 최소한 85%의 상동성, 바람직하게는 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 95%의 상동성을 갖는다.

당업자에게 알려진 "상동성(homology)"이란 용어는 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 분자 사이의 관련성 정도를 나타낸 것이고, 이것은 상기 서열 사이의 일치성에 의해 결정된다. "상동성" 비율은 차이 또는 다른 서열의 특징을 고려하여, 둘 또는 그 이상의 서열에서 상동성 부위의 비율로부터 나타내진다.

서로 관련있는 폴리펩티드의 상동성은 알려진 과정에 의해 결정될 수 있다. 규칙에 따라, 특별한 요구 사항이 고려된 알고리즘(algorithms)을 갖는 특별 컴퓨터 프로그램이 사용된다. 상동성 결정을 위한 바람직한 과정은 연구된 서열 사이에서 가장 큰 일치성이 처음으로 생산되었다. 두 서열 사이에서 상동성 결정을 위한 컴퓨터 프로그램은 GAP을 포함한 GCG 프로그램 패키지(program package) (Devereux J et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (WI); BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul S et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990))를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI(National Centre for Biotechnology Information) 및 다른 출처(BLAST Handbook, Altschul S et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al., J. Mol. 215: 403-410 (1990))로부터로부터 수득 될 수 있다. 또한 알려진 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm)은 상동성 결정을 위해 사용될 수 있다.

서열 비교를 위한 바람직한 변수(parameter)는 하기는 포함한다:

알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453

비교 매트릭스: BLOSUM62 from Henikoff & Henikoff, PNAS USA 89 (1992),

10915-10919

갭 페널티(Gap penalty): 12

갭-길이 페널티(Gap-length penalty): 2

또한, GAP 프로그램은 상기 변수들을 사용하여 적절한 용도로 사용된다. 상기 변수는 아미노산 서열 비교를 위한 표준 변수(default parameter)고, 말단에서의 상기 갭은 상동성 값을 감소시키지 않는다. 참조 서열과 비교하여 매우 적은 서열로, 100,000까지 기대치(expectancy value)를 증기시키는데 필요할 수 있고, 어떤 경우에는 낱말 길이(낱말 크기)를 2까지 감소시키는데 필요할 수 있다.

나아가 모델 알고리즘(model algorithms), 갭 오프닝 페널티(gap opening penalties), 갭 연장 페널티(gap extension penalties) 및 Program Handbook, Wisconsin Package, Version 9, September 1997에 그것들의 명명된 것을 포함하는 비교 매트릭스(comparison matrices)를 사용할 수 있다. 상기 선택은 수행되는 비교, 나아가 상기 비교가 GAP 또는 Best Fit이 선호되는 곳인 서열쌍(sequence pair) 사이, 또는 FASTA 또는 BLAST가 선호하는 곳인 하나의 서열과 큰 서열 데이터베이스사이에서 수행되었는지에 의존할 것이다.

상기 알고리즘으로 결정된 85%의 일치는 85%의 상동성으로 기술된다. 동일한 것이 더 높은 상동성으로 적용된다.

바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 상기 변형단백질은 85% 또는 그 이상, 예를 들면 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는다.

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lamda) 종류가 있다. 특히 바람직하게는, 경쇄는 카파 형태이다. 상기 경쇄는 자연적으로 재배열된 것을 포함하는 자연적으로 존재하는 쇄(chain) , 유전적으로 조작 또는 경쇄의 합성 종류 중 하나일 수 있다. IATS O1에 특이적인 본 발명에 따른 항체가 카파 종류라면, 경쇄는 배선(germ line) DPK18(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)로부터 유래된 것이 바람직하다.

또 다른 실시예에 따라, 본 발명의 인간 단일클론 항체의 중쇄는 인간의 모든 아형, 즉 IgM,. IgA, 또는 IgG를 포함한다. 바람직하게, 상기 중쇄는 IgM 종류이다. 상기 항체가 IgM 종류이면, 이것은 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) LPS에 대해 높은 결합활성(avidity)의 이로운 특징을 나타내고, 효과적으로 보체에 결합하고 따라서 박테리아를 직접 사멸시키고, 및/또는 식세포 작용을 위해 효과적으로 박테리아는 옵소닌화한다. 또한, IgM은 슈도모나스 애루지노사 엘라스타아제(P. aeruginosa elastase)에 의한 단백질용해 분해에 대해 내성이 있는 반면, IgG 또는 IgA과 같은 다른 아형은 분해될 수 있다. IgM 항체는 적는 양에서도 효과적이다. 쥐 당 1 내지 4 μg은 쥐 화상 패혈증 모델(murine burn wound sepsis model)에서 보호적 기능을 나타낸다

중쇄의 가변부위는 배선 VH3-11(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)로부터 유래되는 것이 바람직하다. 경쇄 및 중쇄는 단일-쇄 항체(single-chain antibody) (예를 들면, 2가 scFv, 이중 기능 scFv 및 이중 특이적 scFv)로서 공유 결합 또는 비-공유결합 중 하나에 의해 서로 연결될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 인간 단일클론 항체는 전체적으로 인간 아미노산 서열로 구성되어 있다.

"인간 아미노산 서열로 전적으로 구성(consists entirely of human amino acid sequence)"은 인간 단일클론 항체의 아미노산 서열이 인간 배선(human germ line)으로부터 유래했다는 것을 의미한다. 이것은 다른 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들면, 인간 아미노산으로 구성된 상기 인간 단일클론 항체는 하이브리도마(hybridoma)로부터 수득될 수 있고 여기서 B-세포는 인간 B-세포이다. 또는, 상기 인간 단일클론 항체는 청구항에 명시된 CDR 부위를 사용 가능한 인간 단일클론 항체로 CDR 이식되어 본 발명에 따른 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) LPS 혈청형에 특이적인 인간 단일클론 항체를 생산함으로써 수득될 수 있다.

인간 단일클론 항체의 전체적인 인간 아미노산 서열은 거부 반응 또는 과민성 쇼크(anaphylactic shock)와 같은 바람직하지 않은 부작용의 발생을 방지한다.

또한 바람직하게, 인간 단일클론 항체는 인간 항원 인지를 나타낸다.

"인간 항원 인지"는 본 발명의 인간 단일클론 항체에 의한 상기 항원 인지가 기본적으로 항체의 인간 유도 항원-특이적 가변 부위를 통해 매개되는 것을 의미하고, 따라서 건강한 인간 개인에 의한 항원인지와 동일하다. 특히 인간 단일클론 항체의 상기 중쇄 및 경쇄의 Fc 부위는 인간 보체 시스템과 상호작용을 보장하고 HAMA(human anti-mouse-antibodies)라고 불리는 생성의 위험을 감소시키기 위해 인간 종류이다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 인간 B-세포 또는 상기 인간 B-세포와 골수종(myeloma) 또는 이종골수종(heteromyeloma) 세포와 융합하여 얻어진 하이브리도마(hybridoma)로부터 수득이 가능하다.

인간 B-세포는 건강한 개인 또는 환자를 면역접종하고 이어서 알려진 방법으로 인간 B-세포가 얻어질 수 있는 혈액시료(sample)를 제거함으로써 수득될 수 있다(Current Protocols in Immunology. Chapter 7.1. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Published by Wiley & sons, Eds: JC Coligan et al). 인간 B-세포는 골수종 또는 이종골수종 세포에 융합되어 Kohler 및 Milstein 접근법에 따라 알려진 기술로 하이브리도마를 생산한다. 적절한 골수종 세포는 P3X63Ag8.653(ATCC CRL-1580) 또는 SP2/0(ATCC CRL-1646)와 같은 P3X63의 유도체이다. 적절한 이종골수종 세포(heteromyeloma cells)는 예를 들면 F3B6(ATCC HB-8785)이다. 상기 결과의 하이브리도마는 알려진 과정에 따라 선택될 수 있다. 상기 하이브리도마는 적저한 배양액에서 배양되고 생산된 항체는 상층액으로부터 수거될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인간 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 암호화하는 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 배선으로부터 유래되거나 또는 B-세포에서 존재하는 재조합으로부터 자연적으로 존재하는 핵산일 수 있고, 또는 상기 핵산은 합성된 것일 수 있다. 또한, 합성된 핵산은분해로부터 핵산의 내성을 증가시키기 위하여 포스포티오에스테르(phosphothioester)를 포함한 변형된 뉴클레오시드 사이내 결합(internucleoside bonds)을 갖는 핵산을 포함한다. 상기 핵산은 유전적으로 조작되거나 또는 뉴클레오티드 합성에 의해 완전히 합성될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 인간 단일클론 항체의 경쇄를 암호화하는 최소한 하나의 핵산 및/또는 본 발명의 인간 단일클론 항체의 중쇄를 암호화하는 최소한 하나의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 핵산은 동일한 벡터에 존재할 수 있고 또는 양면성 벡터(binary vector)의 형태에 존재할 수 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 상기 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 핵산의 발현을 촉진시키기 위해서 작동가능하게 상기 핵산과 연결된 프로모터를 포함한다. 또한, 바람직하게, 상기 벡터는 복제 원점 및 숙주 세포에서 유지를 포함한다. 또한, 상기 벡터는 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 핵산의 5'에 위치한 신호 서열(signal sequence)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 신호 서열은 배지로 암호화된 쇄(chain)의 분비를 촉진시킬 수 있다.

바람직하게, 상기 벡터는 아데노바이러스(adenoviruses), 백시니아 바이러스(vaccinia viruses), 바큘로바이러스(baculoviruse), SV 40 바이러스, 레트로바이러스(retroviruse), 식물 바이러스(plant viruse) 또는 람다 유도체(lambda derivatives) 또는 M13과 같은 박테리오파지로부터 유래될 수 있다. 특히 바람직한 벡터는 Persic et al. (Persic et al. 1997. Gene. 187(1): 9-18)에 의해서 기술된 면역 글로불린(immunoglobulin)의 진핵세포에서의 통합된 발현 벡터 시스템과 같은 인간 Ig 중쇄 및 인간 경쇄의 불변 부위(constant regions)를 포함한 벡터이다.

또한, 상기 벡터는 상기 인간 단일클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 N-말단에서 His-태그와 융합된 생산물을 생산하는 구조물의 발현을 야기하는 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 His-태그(tag)를 포함할 수 있고, 이것은 킬레이트 형성(chelate formation)에 의해 니켈컬럼(nickel column)에서 상기 단백질을 분리하는 것을 촉진시킨다.

또한, 본 발명은 상기 벡터 및/또는 상기 벡터의 발현에 적절한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 당업계에서, 많은 원핵 및 진핵세포의 발현 시스템은 알려져 있고 여기에서 이스트(yeast), 식물 세포 및 진핵 숙주 세포는 HEK293-세포, PerC6-세포, CHO-세포, COS-세포 또는 HELA-세포 및 그것의 유도체와 같은 포유류 세포와 같은 숙주세포가 바람직하다. 특히, 인간 생산 세포주가 바람직하다. 형질도입된 숙주 세포가 생산된 항체를 배양액으로 분비하는 것이 바람직하다. 만약 세포내 발현이 이루어졌으면, 그 후 재생(renaturation)이표준 방법, 예를 들면 Benetti PH et al., Protein Expr Purif Aug;13:283-290, (1998)와 같은 방법에 따라서 수행된다.

또한, 본 발명은 인간 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서는 상기 인간 단일클론 항체가 상기-기술된 하이브리도마를 배양함으로써 생산된다. 상기 생산된 단일클론 항체는 상층액으로 분비되고 그것은 보편적인 크로마토그래피 기술을 적용함으로써 정제될 수 있다.

또한, 상기 인간 단일클론 항체는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 상기 암호화된 항체 쇄(chain)의 재조합 발현에 적절한 조건하에서 배양함으로써 생산된다. 바람직하게, 상기 숙주세포는 경쇄를 암호화하는 최소한 하나의 핵산 및 중쇄를 암호화하는 최소한 하나의 핵산을 포함하고, 이 숙주 세포는 인간 B-세포에 의해 생산되는 인간 단일클론 항체의 3차 구조와 동일한 3-차 구조가 생성되는 인간 단일클론 항체를 조립할 수 있다. 만약 상기 경쇄가 중쇄와 분리되어 생산된다면, 그 후 두가지 쇄(chain)은 정제될 수 있고 그 후 근본적으로 인간 B-세포에 의해 생산되는 인간 단일클론 항체의 3-차 구조를 갖는 인간 단일클론 항체를 생산하기 위해 조립될 수 있다.

또한, 인간 단일클론 항체는 암호화된 경쇄 및./또는 중쇄의 재조합 발현에 의해 수득될 수 있고 여기에서 상기 핵산은 알려진 방법으로 인간 단일클론 항체를 암호화하는 핵산을 분리하고 청구항에서 정의된 CDR을 암호화하는 핵산 서열을 분리된 핵산으로 이식함으로써 생산할 수 있다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 변형된다. 상기 변형은 예를 들면 다이사이클로헥실카르보다이이미드(dicyclohexylcarbodiimide)를 사용하여 교차-결합(cross-linking)에 의해 모노머 형태(monomeric form)의 다이-(di), 올리고-(oligo-), 또는 중합(polymerization)을 포함한다. 따라서 생산된 다이-(di), 올리고-(oligo-), 또는 중합체(polymer)는 겔 여과에 의해 서로 분리될 수 있다. 또한 변형은 예를 들면, 각각 ε아미노-리신 잔기의 변형, 또는 아미노 및 카르복실-말단 변형과 같은 곁가지(side chain) 변형을 포함한다. 또한, 변형은 예를 들면, 상기 단백질의 글리코실레이션(glycosylation) 및/또는 부분적 또는 완전한 디클리코실레이션(deglycosylation), 및 이황화결합 형성(disufide bond formation)과 같은 번역 후 변형(post-translational modifications)을 포함한다. 또한, 상기 항체는 효소, 형광 또는 방사능 표지와 같은 표지와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명은 최소한 하나의 인간 단일클론 항체 및/또는 상기 인간 단일클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 최소한 하나의 핵산을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또한 상기 약학적 조성물은 당업계에 알려진 약학적으로 허용가능한 성분pharmaceutically acceptable ingredients)을 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 약학적 조성물은 주로 면역손상된 환자 및/또는 호흡기 기능이 손상된 환자에서 보여지는 혈류 감염(blood-stream infection), 뉴모니아(pneumonia), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 상처 감염(wound infections) 및 관절의 침습적 감염(invasive infections of joints)을 포함하는 국부 감염(local infections)에서 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)에 의해 발생한 질병의 치료에 적용된다. 또한, 상기 약학적 조성물은 병원에서 획득된 (hospital-acquired; nosocomial) 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 것이지만 이것으로 제한되지 않는다. 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 감염의 주된 희생자는 낭포성 섬유증 환자(cystic fibrosis patients), 화상 희생자(burn victims), 관삽입 환자(intubated patients), 수술 및/또는 의학적 강한 보호 유닛에 있는 환자(patients in surgical and/or medical intensive care units), 암 및 AIDS 환자, 면역 손상 환자(immunocompromised patients), 면역 억제 환자(immunosuppressed patients), 당뇨 환자뿐(diabetic patients) 아니라 정맥내 약물 남용자(intravenous drug abusers)이기 때문에, 상기 약학적 조성물은 상기 언급된 환자의 군에서 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)에 의해 유발된 질병의 예방 및/치료를 위한 특정 의도를 갖는다.

또한, 상기 약학적 조성물은 항생제 약물, 바람직하게는 상기 새로운 단일클론 항체와 결합되어 구성될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 0.1-30mg / 몸무게 kg의 농도 범위에서 상기 새로운 단일클론 항체를 포함한다. 상기 약학적 조성물은 정맥내(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피부내(intra-dermal), 피하(subcutaneous), 복강내(intra-peritoneal), 국부(topical), 비내 투여(intra-nasal administration) 또는 흡입 스프레이(inhalation spray)와 같은 알려진 방법으로 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 최소한 하나의 본 발명 인간 단일클론 항체 및 나아가 진단 테스트를 위한 선택적으로 적절한 성분을 포함하는, 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 감염의 진단을 위한 테스트 키트를 제공한다. 상기 진단 테스트를 수행하기 위한 적절한 성분은 당업계에 잘 알려져 있다. 특히 적잘한 성분의 유용한 예는 280 - 320mOsm / l의 범위 내에서 삼투질 농도(osmolality) 및 pH 6 - 8의 범위 내에서 pH 값을 갖는 버퍼 용액, 킬레이팅제(chelating agents)를 포함한 버퍼 용액, 약 0.02M 내지 약 2.0M 범위의 버퍼 조성물의 총 양이온 농도를 갖는 1가 또는 2가 양이온을 포함하는 버퍼 용액, 또는 0.O1% 내지 20% 농도의 동물 또는 인간 유래 혈청을 포함하는 버퍼 용액과 같은 버퍼 용액이다.

상기 테스트 키트는 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 감염의 특이적 의존 진단에 적절하다. 테스트는 액체 또는 멤브레인-결합 형태에서 보편적인 ELISA 테스트에 기초할 수 있다. 상기 탐지는 당업계에 알려진 직접적 또는 간접적일 수 있고 여기에서 상기 항체는 선택적으로 효소, 형광 또는 방사능 표지와 결합된다.

하기 예시들은 본 발명을 예시하는 것이고 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 또한 실시예는 당업자가 상세한 설명을 연구하고 통상적인 일반적 지식을 가질 때, 당업자에게 명확할 것이다

도 1은 216 - O1 중쇄 가변부위의 DNA 및 아미노산 서열과 관련이 있다. 216 - O1의 CDR1 부위는 위치 31 내지 35이고, 216 - O1의 CDR2 부위는 위치 50 내지 66이며, 216 - O1의 CDR3 부위는 위치 99 내지 104이다.
도 2는 216 - O1 카파 경쇄 가변부위(kappa light chain variable region)의 DNA 및 아미노산과 관련이 있다. 216 - O1의 CDR1 부위는 위치 24 내지 39이고, 216 - O1의 CDR2 부위는 위치 55 내지 61이며, 216 - O1의 CDR3 부위는 위치 94 내지 1O1이다.
도 3은 단일클론 항체 216-O1에 의한 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 균주로부터 분리한 LPS의 인지 패턴에 관한 것이다. 216 - O1의 결합은 ELISA에 의해 결정되었다.
도 4의 a는 단일클론 항체 216 - O1에 의한 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 참조 균주(혈청형 O1 - 07)의 인지에 관한 것이다. 도 4의 b는 단일클론 항체 216 - O1 및 다른 두가지 알려진 항체(MAb C1 및 MAb C2)에 의한 임상적 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 분리체(isolate)의 인지 패턴에 관한 것이다. 상기 항체의 결합은 전체 세포 ELISA(항체의 원천으로서, 실시예: 전체 세포 ELISA를 참조)에 의해 결정되었다.
도 5는 단일클론 항체 216 - O1 및 다른 두가지 알려진 항체(MAb C1 및 MAb C2)의 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 혈청형 IATS O1에 대한 옵소닌식세포작용 활성(opsonophagocytotic activity)에 관한 것이다.
도 6은 쥐에서 단일클론 항체 216 - O1의 약동력학(pharmocodynamics)에 관한 것이다. 216 - O1의 생체내(in vivo) 보호 능력은 쥐 화상 패혈증 모델에서 평가되었다. 상이한 농도의 216 - O1를 NMRI 쥐로 정맥내(i.v) 주입한다. 생존율은 주입 후 96시간까지 보였고(도 6의 a), 주입 3일 후 3 실험의 요약을 보였다(도 6의 b).

재료 및 방법

하기의 재료 및 방법은 실시예에서 사용되었다:

LPS -특이성 결정 및 IgM 의 정량

세포 배양 상층액에서 항체를 스크리닝하고 분석하기 위하여, ELISA를 (Cryz, S.J. et al., 1987. J. Clin. Invest. 80(1):51-56)에 기재된 것에 약간의 변형을 가하여 수행되었다. 간략하게, 슈도모나스 애루지노사 LPS(P. aeruginosa lipopolysaccharide) (집에서 생산된) 보관 용액을 36mM 트리에틸아민(triethylamine) 또는 H₂O에 2mg/ml의 농도로 준비되었다. 코팅하기 위하여, 상기 용액을 PBS에 10μg/ml로 희석하였다. 이 용액을 동일한 부피의 10μg/ml 메틸화된 인간 혈청 알부민(human serum albumin; HSA; 하기와 같이 집에서 생산되었다: 동결건조된 HSA 2g을 200ml의 완전 메탄올에 용해시켰다. 37% HCl의 1.68ml을 첨가한 후, 상기 용액을 어두운 곳에서 가끔 흔들어주며 최소한 3일 동안 상온에 저장하였다. 그 침전물을 10분 동안 원심분리(4500rpm, GS1 rotor)하여 모으고, 용제에 있는 펠렛(pellet)을 현탁(suspending)하여 완전 메탄올로 두 번, 무수 에테르(anhydrous ether)로 두 번 씻어준다. 상기 침전물을 2시간 동안 건조기에서 건조시키고 상기 건조된 펠렛을 H₂O에 현탁시켜, 분주(aliquot)하여 -20℃에 보관하였다. NUNC^？ ELISA 플레이트를 100μl/웰(well) LPS-HSA 용액으로 상온에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 0.05% Tween20 (#93773; Fluka Chemie AG, Switzerland)를 포함한 PBS pH 7.4의 300ml(PBS-T) (집에서 제조)로 세 번 씻어준 후, 세포 배양 상층액을 PBS에 1:2로 희석하고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 플레이트를 PBS-T로 세 번 씻어준 후에, 결합된 항체를 PBS-T에 1:2000-1:4000로 희석한 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 염소 항-인간 IgM 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgM antibody, # 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD)로 탐지하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 상온에서 반응시켰고, PBS-T로 세 번 씻어주었다. 항체-결합을 100μl/웰 OPD 기질 용액(0.4 mg/ml Orthophenyldiamine in 0.1M sodium-citrate buffer containing 0.O12% (v/v) H₂O₂)을 첨가하여 가시화하였다. 1M HCl을 50μl/웰로 첨가하여 색 반응을 2-3분 후에 정지시켰다. 광학적 밀도는 ELISA 리더(reader)로 490nm에서 소프트 맥스 프로 ^？ 소프트웨어(Softmax Pro^？software)를 사용하여 측정하였다.

세포 배양 상층액에서 IgM를 정량하기 위해, ELISA 플레이트를 1μg/ml의 결합하지 않은 PBS에 있는 염소 항-인간 IgM 항체를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 상기 플레이트를 PBS-T로 세 번 씻어주고, 세포 상층액 및 스탠다드(standard)를 2배 비율 희석으로 배양하였다. 스탠다드에 따라, 정제된 인간 항체를 0.5μg/ml의 농도부터 시작하여 사용하였다. 모든 희석은 PBS-T에서 수행되었다. 상기 플레이트를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 PBS-T로 세 번 씻어준 후, 결합된 항체를 PBS-T에 1:2000-1:4000로 희석한 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 염소 항-인간 IgM 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgM antibody, # 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD)로 탐지하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 상온에서 반응시켰고, PBS-T로 세 번 씻어주었다. 항체-결합을 100μl/웰 OPD 기질 용액을 첨가하여 가시화하였다. 1M HCl을 50μl/웰로 첨가하여 색 반응을 1분 후에 정지시켰다. 광학적 밀도는 ELISA 리더(reader)로 490nm에서 소프트 맥스 프로^？ 소프트웨어(Softmax Pro^？software)를 사용하여 측정하였다.

결합활성( avidity )의 결정

유리 LPS(free LPS)를 항체에 첨가하는 것이 어떻게 코팅된 LPS와의 결합에 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 결합활성(avidity)을 억제 검사법(inhibition assay)을 사용하여 결정하였다. 상기 결합활성은 오직 코팅된 LPS에 대해 항체 신호의 50% 억제를 나타내는 유리 LPS 농도(mol/L에서)의 상호보완가(reciprocal value)이다. 이것은 Reed-Munch 방법(Reed L.J. and Muench H., Am J of Hygiene (27), 493-497 (1938))을 사용하여 산출되었다.

플레이트를 상기(LPS 특이성 결정) 기술한 것과 같이 LPS로 코팅하였다. 0.05% Tween20 (#93773; Fluka Chemie AG, Switzerland)를 첨가한 PBS pH 7.4(PBS-T) (집에서 제조)의 300ml로 상기 플레이트를 씻어준 후, 항체를 첨가한다. 참조와 같이, PBS에 있는 항체의 희석줄(dilution row)을 사용하였다. 또한, 상이한 농도의 유리 LPS(H₂O에 있는)를 216-O1의 일정한 농도를 사용한 두 번째 희석줄에 첨가하였다. 상기 플레이트를 상온에서 2시간 동안 반응시키고 그 후 PBS-T로 세 번 씻어주었다. 플레이트-결합 항체를 PBS-T에 각각 1:2000-1:4000로 희석한 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 염소 항-인간 IgM 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgM antibody, # 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD)로 탐지하였다. 상기 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양하였고, PBS-T를 사용하여 세 번 씻어주었다. 항체-결합을 100μl/웰 OPD 기질 용액(0.4 mg/ml Orthophenyldiamine in 0.1M sodium-citrate buffer containing 0.O12% (v/v) H₂O₂)을 첨가하여 가시화하였다. 1M HCl을 50μl/웰로 첨가하여 색 반응을 2-3분 후에 정지시켰다. 광학적 밀도는 ELISA 리더(reader)로 490nm에서 소프트 맥스 프로^？ 소프트웨어(Softmax Pro^？software)를 사용하여 측정하였다.

서열 분석

하이브리도마 세포의 RNA를 Qiagen의 RNeasy-키트를 사용하여 분리하였다. cDNA를 역전사효소(Superscript II, Invitrogen and Primescript, Takara Bio Inc.)를 사용하여 합성하였다. 인간 재조합된 IgG 및 IgM 가변 도메인 코딩 부위의 증폭을 위하여 고안된, 인간 IgG 및 Ig M 라이브러리 프라이머 세트(#F2000, Progen)를 사용하여, 중쇄 및 경쇄의 서브그룹을 결정하였다. 선도 서열(leader sequence)에 있는 특이적 정방향 프라이머를 디자인하고 PCR 및 시퀀싱(sequencing)에 의한 가변 부위를 증폭하기 위한 불변 프라이머(constant primer)와 함께 사용하였다. 뿐만 아니라, 시퀀싱을 위하여, 가변 부위에 있는 정방향 프라이머를 상기 서열을 확인하기 위하여 디자인하였다. 시퀀싱을 microsynth AG(Balgach, Switzerland)에서 수행하였다. PCR 및 시퀀싱을 위하여, 하기의 프라이머를 사용하였다(표 3): 역방향 불변 IgM(IgM con): 5'-AAG GGT TGG GGC GGA TGC ACT-3'; 역방향 불변 카파(Kappa rev): 5'-GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AG-3'. 중쇄(heavy chain) VH3에 대한 정방향 프라이머로서: 5'-ATG GAG TTT GGG CTG AGC TG-3' 및 경쇄 선도 1(light chain leader 1): 5'-CAA TGA GGC TCC CTG CTC AG-3'가 사용되었다.

뿐만 아니라, 시퀀싱을 위하여, 하기 정방향 프라이머를 디자인하여 중쇄 HC CDR2-3: 5'-AGT CTG AGA GCC GAG GAC AC-3' 및 경쇄 LC CDR2-3: 5'-ACA GAT TCA GCG GCA GTG G-3'를 사용하였다.

CDRs은 http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html를 통해 카바트 번호를 적용하여 결정하였다.

서열을 V-Base DNAPLOT 소프트웨어를 사용하여 기존의 배선 서열(germline sequence)와 비교하였다(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).

슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)의 IATS 혈청형(serotype) 백신 균주

IATS 혈청혈(serotype)	구체화(specification)
O1	PA53 (IT4)
03	6510 (Habs3)
04	6511 (Habs4)
05	Fisher 7 (IT7)
06	PA220 (IT1)
O10	Fisher 5 (IT5)
O11	Fisher 2 (IT2)
O16	E576 (IT3)

슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 혈청형 IATS O1의 임상적 분리체(clinical isolates)

분리체(isolate)	기원(origin)
PEG12	임상적 분리체 바젤(Clinical Isolate Basel)
PEG37	임상적 분리체 바젤(Clinical Isolate Basel)
487/T421	집 내 균주 모음(In house strain collection)
615/T341	집 내 균주 모음(In house strain collection)
PEG3	임상적 분리체 바젤(Clinical Isolate Basel)
PEG7	임상적 분리체 바젤(Clinical Isolate Basel)
PEG9	임상적 분리체 바젤(Clinical Isolate Basel)
2309.07	임상적 분리체 베른(Clinical Isolate Bern)
2309.24	임상적 분리체 베른(Clinical Isolate Bern)
2310.20	임상적 분리체 베른(Clinical Isolate Bern)
PEG4 (IATS O1)	임상적 분리체 바젤(Clinical Isolate Basel)

상기 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 분리체는 환자의 요(urine) 또는 호흡기도(respiratory tract) 다양한 근원으로부터 수득되었다.

전체 세포 ELISA( Whole cell ELISA )

슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 참조 균주 O1-O17 및 상이한 임상적 분리체로부터의 박테리아(표 2 참조)를 이 검사법에서 사용하였다. 각 혈청형 O1-O17의 한 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 균주는 참조 균주(reference strain) (ATCC - American Type Culture Collection)로서 검사되었다: 참조 균주 O1 (ATCC 33348), 참조 균주 O2 (ATCC 33356), 참조 균주 O3 (ATCC 33350), 참조 균주 O4 (ATCC 33351), 참조 균주 O5 (ATCC 33352), 참조 균주 O6 (ATCC 33354), 참조 균주 O7 (ATCC 33353), 참조 균주 O8 (ATCC 33355), 참조 균주 O9 (ATCC 33356), 참조 균주 O10 (ATCC 33357), 참조 균주 O11 (ATCC 33358), 참조 균주 O12 (ATCC 33359), 참조 균주 O13 (ATCC 33360), 참조 균주 O14 (ATCC 33361), 참조 균주 O15 (ATCC 33362), 참조 균주 O16 (ATCC 33363) 및 참조 균주 O17 (ATCC 33364).

박테리아를 37℃의 BHI(Brain Heart Infusion) 배지에서 광학 농도(optical density)가 550nm에서 1이 될 때까지 배양하였고, 37% 포르말린(formalin)으로 하룻밤동안 37℃에서 고정시켰다(포르말린의 최종 농도: 0.5%). 상기 고정된 박테리아를 PBS에서 1:50으로 희석하고 ELISA 플레이트에 하룻밤 동안 상온에서 고정시켰다. 0.5%의 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)를 포함한 120ml의 PBS를 사용하여 37℃에서 30분 동안 상기 플레이트를 블럭킹(blocking)하고, 단일클론 항체 216-O1를 포함한 하이브리도마 상층액의 100ml을 상기 고정된 박테리아와 함께 37℃에서 90분 동안 배양하였다. 또는, 상기 분리체를 배지 단독에서 또는 대조군 항체(데이터는 보여지지 않음)과 함께 배양하였다. 상기 플레이트를 PBS-T(PBS, 0.5% Tween-20)로 세 번 씻어준 후, 결합된 항체를 PBS-T에 각각 1:2000-1:4000로 희석된 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 염소 항-인간 IgM 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgM antibody, # 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD)로 탐지하였다. 상기 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양하였고, PBS-T를 사용하여 세 번 씻어주었다. 항체-결합을 100μl/웰 OPD 기질 용액(0.4 mg/ml Orthophenyldiamine in 0.1M sodium-citrate buffer containing 0.O12% (v/v) H₂O₂)을 첨가하여 가시화하였다. 1M HCl을 50μl/웰로 첨가하여 색 반응을 2-3분 후에 정지시켰다. 광학적 밀도는 ELISA 리더(reader)로 490nm에서 소프트 맥스 프로^？ 소프트웨어(Softmax Pro^？software)를 사용하여 측정하였다.

실험을 비교하기 위하여, US 4,834,975(Siadak)에 기술된, 첨가적 항-슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) LPS 혈청형 IATS O1 항체 분비 세포주 9D10 및 C5D5를 ATCC로부터 주문하였고, 생산된 항체는 각각 MAb C1 (9D10) 및 MAb C2 (C5D5)이며, 216-O1과 비교하였다.

옵소닌식세포작용 검사법( opsonophagocytosis assay )

생물학적 활성을 결정하기 위하여, 상기 단일클론 항체 216-O1의 옵소닌식세포 활성을 검사하였다. 상기 목적을 위하여, 혈청형 IATS O1의 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 박테리아(균주 PA53)를 TSBG ( 1% (w/v) 글루코오즈를 포함한 30g/l Tryptic Soy Broth) 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 0.1M 바이-카르보네이트 버퍼(Bi-Carbonate buffer), pH 8.0의 20ml로 상기 박테리아를 두 번 씻어준 후, 박테리아 펠렛(pellet)을 0.1M 바이-카르보네이트 버퍼(Bi-Carbonate buffer), pH 8.0의 5ml로 현탁하였다. 5-(및-6)-카르복실플루오르신, 숙시니미딜 에스테르[5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester; 5(6)-FAM SE; Molecular Probes, Eugene, 또는; 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide)에서 10 mg/ml] 의 50μl를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 박테리아를 37% 포르말데히드(formaldehyde)의 100 μl를 첨가하고 하룻밤 동안 37℃에서 배양함으로써 고정시켰다. 결합하지 않은 염색제(dye)를 제거하기 위하여, 박테리아를 살균된 차가운 PBS 20ml로 6번 씻어주고 PBS 5ml에 다시 현탁하여 OD_550nm = 1이 되도록 PBS에 희석하였다. 상기 표지된 박테리아를 분주하여 -80℃에 사용할때까지 저장하였다. 상기 검사법을 위하여, 상기 박테리아의 분주를 HBSS-BSA (0.1% BSA를 포함한 Hanks balanced salt solution)에 1:50으로 희석하였다. 상기 박테리아 70μl를 단일클론 항체 216-O1, 또는 비특이적 단일클론 대조군 항체를 각각 포함한 하이브리도마 세포 배양 상층액의 상이한 희석물 30μl과 함께 혼합하였다(데이터는 보여지지 않음). 또한, 새끼 토끼 혈청(baby rabbit serum, Charles River Laboratories, Germany)의 20μl를 보체의 출처로서 첨가하거나 또는 열로 비활성화된(1시간, 56℃) 보체를 대조군으로서 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양 후에, 분화된 HL-60 세포[전골수구성 세포주(promyelocytic cell line)는 4일 동안 20% (v/v) 소태아혈청(fetal calf serum) 및 100mM 다이-메틸-포르마마이드(di-methyl-formamide)가 첨가된 IMDM(Iscoves Modified Dulbecco's Medium; Sigma)에 배양함으로써 과립구 세포로 분화된다]의 60μl를 옵소닌화된 박테리아에 첨가하여 최종농도가 1.3 x 10⁶ 세포/ml이 되도록 하였다. 쉐이커(shaker)에서 37℃, 90분 동안 배양한 후에, 세포 세척 버퍼[0.02%(v/v) 아자이드(azide)를 포함하는 PBS; Becton Dickenson]의 2ml 및 트립판 블루 용액(trypane blue solution (#T8154, Sigma)의 100μl를 1분 동안 첨가하여 반응을 정지시켰다. 5분 동안 350 x g에서 원심분리한 후, 상기 세포 펠렛을 세포 세척 버퍼의 약 200μl에 다시 현탁하고 세포 유동 분석(flow cytometry)을 사용하여 분석하였다. 양성 옵소닌식세포작용 활성(Positive opsonphagocytotic activity)은 배경 염색(background staining)과 비교하여 HL-60 세포의 녹색 형광을 분석함으로써 결정하였다. 배경 염색은 플루오르신-결합 박테리아를 보체의 존재하에 HL-60 세포와 배양함으로써 결정되었다.

슈도모나스 애루지노사 ( P. aeruginosa ) 감염 쥐의 생체내( in vivo ) 보호

쥐 화상 모델( Murine burn wound model )

216-O1의 생체내 보호 능력을 쥐 화상 패혈증 모델에서 결정하였다. 0.1 내지 1.5 mg/kg의 단일클론 항체 216-O1을 약 0.1ml의 부피내에서 정맥내로 상기 모델 유발 2시간 전에 NMRI-쥐(18-20g; Charles River Laboratories)로 투여하였다. 대조군으로서, 비특이적 대조군(ctr) 항체 1.5 mg/kg가 투여되었다. 상기 모델을 유발하기 위하여, 10마리의 암컷 쥐의 군을 케타민(Ketamine, Narketan; Vetoquinola G)/잘진(Xalzine, Xylasol; Dr. E. Graeub AF)를 66mg/kg 케타민 및 13.2mg/kg 자일라진(Xylazine)으로 사용하여 마취하였다. 화상 직전에, 쥐를 5% 이솔푸란(isolfurane)내에서 2-3분 동안 유지하였다. 상기 쥐의 등 2㎠ 부위에 10초 에탄올 화상을 입힌다. 0.5ml PBS에 현탁된 상기 주입 미생물(슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) IATS O1; PA53,표1 참조)을 2.5-5 x 10⁷cfu/쥐로 즉시 피하로 화상 부위에 주입한다. 상기 동물에 0.3 mg/kg 템게식(Temgesic, 진통제)를 피하로 하루에 두 번 투여하고 생존율을 상기 모델 유발 96시간 후까지 매일 세 번씩 모니터하였다.

실시예

실시예 1: 216-O1의 DNA 및 아미노산 서열

상기 항체 특이성은 DNA- 및 아미노산-서열에 의해 각각 결정되었다. 중쇄 및 경쇄의 가변 단편(variable fragment)의 DNA 서열이 결정되었다. 간략하게, 하이브리도마 세포의 총 RNA는 분리되었고 상보적 cDNA로 역전사되었다. 선도서열 내 정방향 프라이머와 함께 Cκ 및Cμ-특이적 프라이머를 사용하여, IgM 및 카파 가변 부위 및 불변 부위의 일부를 PCR에 의해 증폭하였다. 그 후 상기 PCR 단편은 아가로오즈 겔(agarose gel)로부터의 절단에 의해 추출되어, 도 3에 기술된 프라이머와 함께 시퀀싱(sequencing)을 위해 주형(template)으로 사용되었다.

IgM 중쇄 및 216-O1의 카파 경쇄의 가변 부위(variable region)의 PCR-증폭 및 시퀀싱을 위해 사용되는 프라이머

프라이머	HC/LC	서열, 서열 번호 11 내지16	적용
IgM 불변부위(IgM con)	HC	5'-AAG GGT TGG GGC GGA TGC ACT	PCR, 시퀀싱(sequencing)
VH3	HC	5'-ATG GAG TTT GGG CTG AGC TG	PCR, 시퀀싱(sequencing)
중쇄(HC) CDR2-3	HC	5'-AGT CTG AGA GCC GAG GAC AC	시퀀싱(sequencing)
카파 역방향(Kappa rev)	LC	5'-GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AG	PCR, 시퀀싱(sequencing)
선도 1(Leader 1)	LC	5'-CAA TGA GGC TCC CTG CTC AG	PCR, 시퀀싱(sequencing)
경쇄(LC) CDR2-3	LC	5'-ACA GAT TCA GCG GCA GTG G	시퀀싱(sequencing)

이어서, 상기 가변 부위의 서열은 Vbase Index (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)와 비교하였다. 배선 서열(germline sequence)와의 비교는 상기 경쇄가 DPK18와 가장 높은 유사성을 갖고 중쇄는 VH3-11 배선 서열과 가장 높은 유사성을 갖는 것을 보였다. IgM 중쇄 및 216-O1의 카파 경쇄의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 도 1 및 2에 기술되어 있다.

실시예 2: 단일클론 항체 216- O1 에 의한 슈도모나스 애루지노사( P. aeruginosa )로 부터의 분리된 LPS 및 슈도모나스 애루지노사 ( P. aeruginosa ) 혈청혈 IATS O1 의 임상적 분리체의 인지

216-O1은 건강한 지원자에게 8가 O-PS-독소 A 백신을 접종하여 생성되었다. 상기 백신은 IATS O1 균주 PA53의 LPS를 포함한다. 상기 LPS 특이성을 결정하기 위하여, 216-O1을 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)로부터 분리된 LPS(표 1)의 패널에서 검사되었다(도 3). 216-O1이 특이적으로 IARS O1 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)를 인지하는지 조사하기 위하여, 17 참조 균주에서 검사되었다(도 4의 a).

뿐만 아니라, 그 후 혈청형 IATS O1의 상이한 임상적 분리체(도 4의 b)를 216-O1 및 다른 항-슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) LPS IATS O1 항체(MAb C1 및 MAb C2)와 결합하는지 알아보기 위하여 전체 세포 ELISA에 의해 검사되었다. 모든 분리체의 혈청형은 상업적으로 이용가능한 혈청형 응집 키트(serotype agglutination kit)를 사용하여 결정되었고 PCR에 의해 확인되었다.

216-O1은 특이적으로 상기 IATS O1 혈청형의 분리된 LPS와 반응하였지만, 검사된 다른 어떤 혈청형과도 반응하지 않았다. 또한, 결합은 오직 IATS O1 참조 균주에서만 관찰되었고 IATS O1-O17 참조 균주에서는 관찰되지 않았다. 이러한 분리체의 진실성은 각각의 혈청형에 대한 다른 어떤 단일클론 항체를 양성 대조군으로서 사용하여 확인되었다(데이터는 보여지지 않음). 216-O1의 임상적 분리체의 인지를 알려진 두 개의 항체(MAb C1 및 MAb C2)와 비교할 때, 216-O1 및 MAb C1는 모든 10개의 검사된 임상적 분리체에 결합한 것을 보이는 반면, MAb C2는 10개의 검사된 분리체 중 오직 6개에 결합하는 것을 보였다.

실시예 3: 216- O1 의 시험관내 ( In vitro ) 활성 : 옵소닌식세포 활성( opsonophagocytic activity )

216-O1의 시험관내 생물학적 활성은 유동 세포계수기-기초 옵소닌식세포작용 검사법(flow cytometry-based opsonophagocytosis assay)을 사용하여 조사되었다. 형광-표지된 (5(6)-FAM SE)-결합 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 혈청형 IATS O1를 보체 출처로서 정상 토끼 혈청의 존재하에 단계적으로(serially) 희석한 216-O1와 배양하였다. 옵소닌화된 박테리아는 분화된 HL-60 세포[전골수구성 세포주(promyelocytic cell line), ATCC: CCL-240; 4일 동안 0.1M 다이-메틸-포르마마이드(di-methyl-formamide)를 첨가함으로써 대식세포(phagocyte)로 분화]와 배양되었다. 옵소닌식세포작용은 FACS에 의해 분석되었다. 양성 옵소닌식세포 활성은 (5(6)-FAM SE)-결합된 박테리아의 배경 염색을 활성 보체의 부재하에(열에 의해 비활성화된 혈청)에 있는 HL-60 세포와 비교하여 HL-60 세포의 녹색 형광을 분석함으로써 결정되었다. 2번의 독립적인 실험 결과의 평균(mean)을 도 5에 나타내었다.

216-O1는 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) IATS O1 혈청형의 매개 식세포작용을 농도의존적으로 매개하였다(채워진 원). FITC-양성HL-60 세포의 최대 퍼센트의 반을 야기하는 농도로 정의된 216-O1의 옵소닌식세포 활성(OA₅₀)은 약 2.7ng/ml이었다. 그러한 낮은 농도에서의 활성은 216-O1의 높은 작용기 잠재력을 의미한다. 216-O1의 옵소닌 식세포 작용을 매개하는 능력을 MAb C1(사각형) 및 MAb C2(삼각형)와 비교할 때, MAb C2(3.8 ng/ml)에 대하여 상대적 옵소닌식세포 활성은 탐지되었다. MAb C1는 보다 매우 효과가 없는 것으로 나타났다(50.9ng/ml).

결과적으로, 216-O1 항체가 환자 분리체의 인지에거 유의적으로 보다 좋은 특성 뿐만 아니라 옵소닌식세포 활성에서 좋은 결과를 보인다.

실시예 4: 단일클론 항체 216- O1 의 생체내( In vivo ) 보호적 능력

216-O1의 생체내 보호적 능력은 쥐 화상 패혈증 모델(murine burn wound sepsis model)에서 조사되었다. NMRI쥐에 216-O1의 상이한 농도를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 2시간 후에, 2 x 2cm 화상을 가하고 화상 부위하에 2.5x10⁵ - 5x10⁵ CFU 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 균주 PA53 (O1)을 피하내(s.c.)로 주입하였다. 전체 실험기간동안 쥐에 진통제를 주입하였다. 생존율은 매일 세 번씩 모니터되었다. 생존율을 상기 모델 유도 후 96시간까지 보이는 한 실험 및 세 번의 독립적 실험의 상기 모델 유도 3일 후 생존율을 보였다(도 6의 B).

농도 ≥0.1mg/ 체중 kg은 전신적 슈도모나스 접종(systemic Pseudomonas challenge)으로부터 60-100%의 보호를 가져온다. 또 다른 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 혈청형에 대한 대조군 항체는 보호적 작용을 나타내지 않는다. 투여 농도의 감소는 낮은 생존률을 야기한다. 슈도모나스(Pseudomonas)에 감염되지 않는 화상 쥐(mice with burn wound)는 100%-생존율을 가지므로, 죽음은 슈도모나스(Pseudomonas) 감염의 직접적 결과이다. 상기 결과는 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 감염에 대한 216-O1의 생체내 효과(in vivo efficacy)를 증명한다.

<110> Kenta Biotech AG <120> Human Monoclonal Antibody 216-01, Specific for Lipopolysaccarides (LPS) of Serotype IATS01 of Pseudomonas aeruginosa <130> PCT60352HV200pau <150> 09/005245.7 <151> 2009-04-09 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR1 light chain <400> 1 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR2 light chain <400> 2 Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 light chain <400> 3 Met Gln Gly Thr Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR1 heavy chain <400> 4 Gly Phe Trp Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR2 heavy chain <400> 5 Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Leu Lys Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 heavy chain <400> 6 Ser Ala Trp Cys Thr Tyr 1 5 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> variable region light chain <400> 7 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> variable region heavy chain <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Leu Lys Asn Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Cys Ser Ser Ala Trp Cys Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> variable region light chain <400> 9 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccgagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac actccctttc 300 actttcggcc ctgggaccaa agtggatatc aaa 333 <210> 10 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> variable region heavy chain <400> 10 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacatttagt gggttttgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggagag ggctggagtg ggtggccaac ataaaagaag atggaagtct gaaaaactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgaaaa ctcactgttt 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgctg tagttccgcc 300 tggtgcacct actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-primer <400> 11 aagggttggg gcggatgcac t 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-primer <400> 12 gaagacagat ggtgcagcca cag 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-primer <400> 13 atggagtttg ggctgagctg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-primer <400> 14 caatgaggct ccctgctcag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing-primer <400> 15 agtctgagag ccgaggacac 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing-primer <400> 16 acagattcag cggcagtgg 19

Claims

항체 경쇄(light chain)의 가변부위(variable region)는 CDR1 부위에서 서열 번호: 1, CDR2 부위에서 서열 번호: 2, 및 CDR3 부위에서 서열 번호: 3을 포함하고, 항체 중쇄(heavy chain)의 가변부위는 CDR1 부위에서 서열 번호: 4, CDR2 부위에서 서열 번호: 5, 및 CDR3 부위에서 서열 번호: 6을 포함하는, 슈도모나스 애루지노사 지질다당류(LPS) 혈청형 IATS O1(P. aeruginosa LPS serotype IATS O1)의 LPS에 대해 특이적인 인간 단일클론 항체(human monoclonal antibody), 또는 상기 LPS에 결합할 수 있는 그의 단편 또는 유도체.
항체 경쇄의 가변부위는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖고 및 중쇄의 가변부위는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 제 1항의 인간 단일클론 항체; 또는 상기 항체 경쇄의 가변부위의 아미노산 서열이 서열 번호: 7과 최소한 85%의 상동성을 갖고 및 상기 항체 중쇄의 가변부위의 아미노산 서열이 서열 번호: 8과 최소한 87%의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 LPS에 결합할 수 있는 상기 항체의 변이(variant).
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항체 경쇄는 카파 타입(kappa type)인 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항체의 경쇄는 람다 타입(lamda type)인 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄는 IgM, IgA 또는 IgG 형태, 바람직하게는 IgM 타입인 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 5항에 있어서, 항체의 중쇄는 IgM 타입인 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전체적으로 인간 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항원 인지를 나타내는 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체는 상기 중쇄 및/또는 경쇄에 있는 어떠한 CDR 부위에 최소한 하나의 보존적 치환(conservative substitution)을 갖는 인간 단일클론 항체의 변형단백질(mutein)인 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 N-말단에서, 내부에서, 및/또는 C-말단에서 변형되는 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
제 10항에 있어서, 변형은 올리고머화(oligomerization), 및 약물 및/또는 표지(label) 결합체 중 최소한 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체.
인간 B 세포 또는 상기 인간 B 세포를 골수종(myeloma) 또는 이종골수종(heteromyeloma) 세포와 융합함으로써 수득한 하이브리도마(hybridoma)로부터 수득될 수 있는 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 9항 또는 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.
제 1항 내지 제 9항 또는 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산.
제 1항 내지 제 9항 또는 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산.
최소한 하나의 제 14항의 경쇄를 암호화하는 핵산 및/또는 최소한 하나의 제 15항의 중쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
제 16항에 있어서, 벡터는 그 발현을 촉진시키기 위해 핵산과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 14항의 벡터 및/또는 제 14항 또는 제 15항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
항체의 분비를 허용하는 조건하에서 제 13항의 하이브리도마를 배양하거나 또는 인간 단일클론 항체의 발현에 적절한 조건하에서 제 18항의 숙주 세포를 배양하고 및 상기 배양 상층액으로부터 상기 항체를 선택적으로 정제하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 9항 또는 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체를 생산하는 방법.
최소한 하나의 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체 및/또는 최소한 하나의 제 13항 또는 제 14항의 핵산 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 성분을 포함하는 약학적 조성물.
인간 환자에서 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 감염을 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도의 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체 및/또는 제 13항 또는 제 14항의 핵산.
인간 환자에서 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 감염을 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체 및/또는 제 13항 또는 제 14항의 핵산의 용도.
제 21항 또는 22항에 있어서, 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 감염은 병원-획득 감염(hospital-acquired infection)인 것을 특징으로 하는 용도.
최소한 하나의 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 인간 단일클론 항체 및/또는 제 13항 또는 제 14항의 핵산, 및 나아가 진단 검사를 수행하기 위해 선택적으로 적절한 성분을 포함하는 시료 내 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 진단용 검사 키트.