CN102639562A - 对绿脓假单胞菌的血清型iats o1的脂多糖类(lps)具有特异性的人单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对绿脓假单胞菌的血清型IATS O1具有特异性的人单克隆抗体以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤。另外，本发明涉及包含至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。

Description

对绿脓假单胞菌的血清型IATS O1的脂多糖类(LPS)具有特异性的人单克隆抗体
技术领域
本发明涉及对绿脓假单胞菌的血清型IATS O1具有特异性的人单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤、编码该抗体的核酸以及用该抗体转染的宿主细胞。此外，本发明涉及产生所述单克隆抗体的方法。另外，本发明涉及包含至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。
背景技术
绿脓假单胞菌是一种发现于淡水和土壤中的普遍存在的革兰氏阴性环境细菌。其是一种经典的机会致病菌，正常情况下对免疫活性宿主不具有威胁，免疫活性宿主通过调理抗体和吞噬作用将其清除。然而，囊性纤维变性患者和无免疫应答个体(包括烧伤患者、ICU中的插管患者、癌症和AIDS患者，以及经历器官移植的患者)尤其处于感染医院感染的高风险。连同甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素耐药长球菌(vancomycin-resistant enterococci，VRE)，绿脓假单胞菌为多达34％的全部医院感染负责，所述医院感染已经从1975年的7.2/1000患者日(patient days)增至1995年的9.8/1000患者日。血流感染和肺炎属于最常观察到的医院感染形式。
已经尝试了开发一种八价轭合物疫苗，其由与绿脓假单胞菌的解毒毒素A偶联的绿脓假单胞菌的8个最相关的LPS血清型组成，以在囊性纤维变性患者中预防慢性绿脓假单胞菌感染。早期的临床结果是有前景的，显示诱导了对绿脓假单胞菌的血清型具有特异性的有效抗体。然而，有效的接种仅在免疫活性患者以及在可预测情况中是可能的。因此，大部分绿脓假单胞菌受害者不能通过该八价疫苗实现自动免疫。由于大部分绿脓假单胞菌菌株具有多重耐药性这样的事实，因此对治疗绿脓假单胞菌患者的可选治疗手段存在需要。一种尝试是通过经典杂交瘤技术或噬菌体展示所有组成成分克隆建立人单克隆抗体。该两种方法以及由此建立的抗体显示严重的缺陷。
经典杂交瘤技术(″Kohler and Milstein″方法)基于通过用挑选的抗原自动免疫接种而引发所需特异性的鼠B细胞以及通过与骨髓瘤配偶融合而引发永生。之后，产生抗体的克隆的遗传信息需要通过基因工程而进行人源化，并且抗体需要在合适的表达系统中产生。同样，噬菌体展示所有组成成分克隆需要复杂的抗体基因工程并建立合适的表达系统。
已知定向于细菌LPS的鼠单克隆抗体识别除人抗体之外的表位。因此，在鼠中产生单克隆抗体之后进行人源化并不一定导致分离出具有与应用于人类中有关的特异性的抗体。
此外，IgM同种型的抗体是最有效的，原因在于与IgM连接的效应机理对于抗菌免疫性是最佳的。然而，由于该分子具有复杂的五聚体形式，迄今为止还未实现IgM抗体的重组表达。因此，通过噬菌体展示技术分离的抗体的表达局限于除IgM之外的同种型。
可选地，在产生特异于绿脓假单胞菌的LPS部分的人单克隆抗体方面具有不同的尝试。然而，其中的很多尝试缺乏效应子功能并因此不具有保护性。
因此，作为本发明基础的一个技术问题是提供对绿脓假单胞菌的特定血清型的LPS具有特异性的人单克隆抗体，其中所述抗体特别是在体内展示高度保护能力。
所述技术问题通过如下面所定义的人单克隆抗体解决。
发明内容
根据本发明，提供了命名为216-O1且对绿脓假单胞菌血清型IATSO1的LPS具有特异性的人单克隆抗体；或者能够与所述LPS结合的所述人单克隆抗体的片段或衍生物，其中该抗体的轻链的可变区包含下述中的至少一种：在CDR1区中的SEQ ID NO：1、在CDR2区中的SEQ ID NO：2和在CDR3区中的SEQ ID NO：3，并且其中该抗体的重链的可变区包含下述中的至少一种：在CDR1区中的SEQ ID NO：4、在CDR2区中的SEQ ID NO：5和在CDR3区中的SEQ ID NO：6。
根据本发明的优选实施方式，提供了对绿脓假单胞菌血清型IATSO1的LPS具有特异性的人单克隆抗体；或者能够与所述LPS结合的所述人单克隆抗体的片段或衍生物，其中该抗体的轻链的可变区包含：在CDR1区中的SEQ ID NO：1、在CDR2区中的SEQ ID NO：2和在CDR3区中的SEQ ID NO：3，并且其中该抗体的重链的可变区包含：在CDR1区中的SEQ ID NO：4、在CDR2区中的SEQ ID NO：5和在CDR3区中的SEQ ID NO：6。
本发明还提供了能够产生所述单克隆抗体的杂交瘤以及分别编码所述抗体的轻链和重链的核酸。此外，本发明提供可包含所述核酸的载体和宿主细胞。另外，提供了产生所述单克隆抗体的方法。另外，提供了包含至少一种抗体和/或至少一种核酸的药物组合物及其第二医学应用。
令人惊讶的是，已经发现按照本发明的人单克隆抗体展示出高度保护能力。具体而言，所述人单克隆抗体证实在体外具有调理吞噬作用。甚至更重要的是，按照本发明的单克隆抗体展示体内保护能力，如通过在鼠烧伤模型中保护以及治疗以免受到全身感染所测定的。
与Collins等所述的人单克隆抗体相比(Collins MS et al.，1990.FEMSIM 64：263-268)，在根据本发明的人单克隆抗体的情况下，可在低得多的剂量以及更高的保护水平下实现调理吞噬。此外，与现有技术状态所述的单克隆抗体相反，根据本发明的人单克隆抗体在患者分离物识别方面显示显著更好的结果，并且在调理吞噬实验中也显示优良结果。
与现有技术状态所述的单克隆抗体相反(Harrison FJJ et al.1997.Hybridoma 16(5)：413-420；Zweerink HJ et al.1988.Infection andImmunity 56(8)：1873-1879)，根据本发明的人单克隆抗体还产生于用轭合物疫苗自动免疫的健康个体的血液。通常已知的是，针对多肽的抗体由于缺乏T-细胞帮助具有次要特性(即，具有很小效应物潜力的低亲和性)。只有通过应用轭合物疫苗，能够产生对抗多肽靶标的具有强效应物潜力的高亲和性的有价值的抗体。此外，与现有技术状态所述的单克隆抗体的产生率相比(Zweerink HJ et al.1988.Infection andImmunity 56(8)：1873-1879)，根据本发明的人单克隆抗体产生率更高。
根据本发明，所述抗体对绿脓假单胞菌血清型IATS O1的LPS具有特异性，并在低达0.1ng/ml的浓度、优选在低达0.5ng/ml的浓度显示调理吞噬活性(opsonophagocytic activity)，如利用荧光-轭合物细菌所测定。没有现有技术抗体被报告在这种低剂量下可显示调理吞噬活性。
本发明的抗体对绿脓假单胞菌血清型IATS O1的LPS具有特异性，并且在1.7与4.3ng/ml(95％置信区间)之间的浓度下，特别是在约2.7ng/ml的浓度下展示出一半最大值的调理吞噬活性。
本发明也考虑以下述亲和力与绿脓假单胞菌血清型IATS O1的LPS特异性结合的抗体：1.03 108M-1＞+/-3.41×107M-1。
按照本发明的单克隆抗体以高特异性识别临床分离物。利用该抗体识别10个感染IATS O1血清型绿脓假单胞菌的患者样品中的10个。并非受理论束缚，假定所述单克隆抗体能够识别现有技术已知的IATSO1的所有绿脓假单胞菌菌株。该性质使得该抗体对诊断和治疗特别有用。因此，根据本发明的抗体展示出不可超越的可靠性。
如本文所用的术语“人单克隆抗体”包括任何独立于获取所述单克隆抗体的来源的部分或完全人单克隆抗体。优选通过杂交瘤产生所述人单克隆抗体。通过基因工程以及特别是通过用如在权利要求中所定义的特定CDR区段置换背景抗体的CDR区而将如在权利要求中所定义的CDR区段的CDR接枝到可用的单克隆抗体上，也可以获得该单克隆抗体。
“CDR区”是用于抗体的互补决定区的术语，即，决定抗体对特定抗原的特异性的区域。在轻链和重链上的三个CDR区(CDR1至CDR3)负责抗原结合。
通过应用如在http://www.bioinf.orq.uk/abs/seqtest.html所示的 Kabat编号测定CDR。
重链内的CDR区地位置如下：
VH外显子内的CDR1区氨基酸31至35，
VH外显子内的CDR2区氨基酸50至65，
VH外显子内的CDR3区氨基酸95和随后的氨基酸。
CDR区的位置独立于抗体类别，即，IgM、IgA或IgG.
κ轻链的CDR区的位置如下：
Vχ外显子内的CDR1区氨基酸24至34，
Vχ外显子内的CDR2区氨基酸50至56，
Vχ外显子内的CDR3区氨基酸89和随后的氨基酸。
λ型轻链的CDR区的位置如下：
Vλ外显子内的CDR1区氨基酸24至34，
Vλ外显子内的CDR2区氨基酸50至56，
Vλ外显子内的CDR3区氨基酸89和随后的氨基酸。
从V碱基索引可以获得VH、Vχ和Vλ外显子的氨基酸排比。(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
术语“血清型”指任何已知的绿脓假单胞菌血清型。目前用于不同绿脓假单胞菌血清型的不同术语的词汇索引表示于说明书中的表I中。
术语“片段”指能够与LPS血清型结合的抗体的任意片段。所述片段具有至少10、优选20、更优选50个氨基酸的长度。合适的抗体片段的实例包括二价片段，例如，F(ab)2、F(ab′)2，一价片段，例如，Fab、Fab′、Fv，二价片段和一价片段的单链重组形式等。抗体片段可以是糖基化的，例如在抗体可变区含碳水化合物部分。优选所述片段包含抗体的结合区。优选该片段是Fab或F(ab′)2片段或其混合物。
术语“衍生物”包括由于至少一个氨基酸的添加、缺失和/或置换而不同的人单克隆抗体的任何突变蛋白。优选地，所述衍生物是人单克隆抗体的突变蛋白，其中所述突变蛋白携带至少一个位于如在权利要求中所示的重链和/或轻链中的任意CDR中的保守置换。更优选地，所述突变蛋白具有不超过5个、不超过4个、优选不超过3个、特别优选不超过2个保守置换。抗体的片段或衍生物与特定LPS血清型结合的能力通过如在材料和方法部分所述的直接ELISA测定：该特定LPS被固定在ELISA板的固相上。抗体片段或抗体的衍生物用已固定的LPS温育，并且通过合适的酶结合的二抗使其已结合抗体或衍生物可见。
按照本发明，术语“保守置换”指用术语相同物理化学组的氨基酸置换属于特定物理化学组的氨基酸。物理化学组如下定义：
非极性氨基酸组包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。具有不带电的极性侧链的氨基酸组包括天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸和胱氨酸。具有带正电的极性侧链的氨基酸的物理化学组包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。具有带负电的极性侧链的氨基酸的物理化学组包括天冬氨酸和谷氨酸，也称为天冬氨酸(aspartate)和谷氨酸(glutamate)。
根据本发明，如上所述提供了对绿脓假单胞菌血清型IATS O1的LPS具有特异性的抗体。
根据本发明进一步的实施方式，本发明提供了对LPS或绿脓假单胞菌LPS血清型IATS O1具有特异性的人单克隆抗体，其中该抗体的轻链的可变区SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且重链的可变区具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列；或者提供了能够与所述LPS结合的所述抗体的变体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：7至少85％同源，优选至少90％同源，更优选至少95％同源，而该抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：8至少85％同源，优选至少90％同源，更优选至少95％同源。
本领域技术人员已知的术语“同源性”指明了两个或更多个多肽分子之间的亲缘性程度，这是通过序列之间的一致性确定的。百分比“同源性”基于两个或更多个序列中的同源区的百分比，并考虑了缺口或其他序列特征。
彼此相关的多肽的同源性可以通过已知方法测定。通常，使用算法考虑了特殊要求的特殊计算机程序。测定同源性的优选程序首先在所研究的序列之间产生最大一致性。测定两个序列之间的同源性的计算机程序包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux J et al.，Nucleic Acids Research 12(12)：387(1984)；Genetics Computer GroupUniversity of Wiscon-sin，Madison(Wl)；BLASTP，BLASTN and FASTA(Altschul S et al.，J.Molec.Biol.215：403-410(1990))。BLAST X程序可得自National Centre for Biotechnology Information(NCBI)以及得自其他来源(BLAST Handbook，Altschul S et al.，NCB NLM NIH BethesdaMD 20894；Altschul S et al.，J.MoI.215：403-410(1990))。也可以使用熟知的Smith-Waterman算法来测定同源性。
用于序列比较的优选参数包括下述：
算法：Needleman and Wunsch，J.MoI.Biol.48(1970)，443-453比较矩阵：BLOSUM62from Henikoff&Henikoff，PNAS USA 89(1992)，10915-10919
空隙罚分(Gap penalty)：12
空隙长度罚分(Gap-length penalty)：2
GAP程序也适合用于上述参数。上述参数是氨基酸序列比较的标准参数(缺省参数)，其中末端的缺口不会减小同源性值。在与参考序列相比非常小的序列的情况下，此外，使期望值增加至多达100,000并且在一些情况下将字长(字码尺寸)降低至2可能是必要的。
可以使用另外的模型算法、空隙开口罚分(gap opening penalties)、空隙延伸罚分(gap extension penalties)和比较矩阵，包括在ProgramHandbook，Wisconsin Package，Version 9，September 1997中列举的那些。选择取决于要执行的比较，并且还取决于比较是在优选GAP或Best Fit的序列对之间还是在优选FASTA或BLAST的一个序列与大序列数据库之间进行。
利用上述算法测定的85％的一致性被描述为85％同源性。这也适用较高程度的同源性。
在优选的实施方式中，根据本发明的突变蛋白具有85％或更大的同源性，例如，大于90％或95％。
还优选根据本发明的人单克隆抗体的轻链属于κ或λ类型。特别优选的是，所述轻链属于κ类型。该轻链可以是天然存在的链(包括天然重排的)、遗传修饰的或合成类型的轻链。如果对IATS O1特异的根据本发明的抗体属于κ类型，则优选该轻链可得自种系DPK18(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。
根据进一步优选的实施方式，本发明的人单克隆抗体的重链选自所有人类同种型，即IgM、IgA或gG。优选地，所述重链属于IgM型。如果抗体属于IgM型，则其展示出对绿脓假单胞菌LPS具有高亲和力的有利性质，有效结合补体，并因此介导直接杀死细菌和/或有效地调理细菌吞噬。此外，IgM可抵抗由绿脓假单胞菌弹性蛋白酶引起的蛋白水解降解，然而，其他同种型如IgG或IgA可被降解。低量的IgM抗体是有效的。在鼠烧伤创面脓毒症模型中1至4μg/鼠具有保护力。
优选可变重链得自种系VH3-11(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。轻链和重链可作为单链抗体(例如，二价scFv，双功能scFv和双特异性scFv)共价键接或可以彼此非共价键接。
根据本发明的优选实施方式，所述人单克隆抗体完全由人氨基酸序列组成。
“完全由人氨基酸序列组成”指所述人单克隆抗体的氨基酸序列得自人种系。这可以以不同方式获得。例如，由人氨基酸序列组成的人单克隆抗体可从杂交瘤获得，其中B-细胞是人类B-细胞。可选地，所述人单克隆抗体可通过将如在权利要求中所示的CDR区CDR接枝到可用的人单克隆抗体从而产生根据本发明的对绿脓假单胞菌LPS血清型具有特异性的人单克隆抗体来获得。
所述人单克隆抗体的完全的人氨基酸序列防止不想要的不良作用诸如排斥反应或过敏性休克发生。
进一步优选地，所述人单克隆抗体显示了人抗原识别。“人抗原识别”指通过本发明的人单克隆抗体进行的抗原识别基本通过抗原的人衍生的抗原特异性可变区介导，因此其与通过健康人类抗体进行的抗原识别相同。具体而言，同样要求所述人单克隆抗体的重链和轻链的Fc部分属于人类型，以便确保与人类补体系统的相互作用，并降低产生所谓的HAMA(人抗-鼠-抗体)的风险。
根据进一步优选的实施方式，本发明个人单克隆抗体可得自人类B-细胞或得自通过使所述人类B-细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞(heteromyeloma cell)融合而得到的杂交瘤。
通过对健康个体或患者免疫接种并随后从血样中移走可以获得人类B-细胞，该人类B-细胞可以以已知的方式从血样中分离(CurrentProtocols in Immunology.Chapter 7.1.Isolation of whole mononuclearcells from peripheral blood and cord blood.Published by Wiley&sons，Eds：JC Coligan et al.)。根据经典的Kohler&Milstein方法按照已知的技术，可以将人类B-细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤融合而产生杂交瘤。合适的骨髓瘤细胞是P3X63诸如P3X63Ag8.653(ATCC CRL-1580)或SP2/0(ATCC CRL-1646)的衍生物。合适的异源杂交瘤为例如F3B6(ATCC HB-8785)。可以根据已知的程序选择所得到的杂交瘤。使杂交瘤在合适的培养基中培养，并从上清液回收所产生的抗体。
此外，本发明提供分别编码本发明的人单克隆抗体的重链和轻链的核酸。所述核酸可以是天然存在的合适，或者衍生自种系或者衍生自在B-细胞中发生的重排，可选地，所述核酸可以是合成的。合成的核酸还包括具有修饰的核苷酸间键(包括磷硫二酯键(phosphothioester))的核酸，以增加核酸对降解的抵抗力。所述核酸可以进行基因工程改造或者提供核苷酸合成完成合成产生。
本发明还提供包含至少一个编码本发明的人单克隆抗体的轻链的核酸和/或至少一个编码本发明的人单克隆抗体的重链的核酸的载体。所述核酸可以在同一载体中存在或者可以以二元载体(binary vectors)的形式存在。所述载体优选包括可操作连接于该合适的启动子，以便于编码轻链和/或重链的核酸的表达。优选地，所述载体还包括用于在宿主细胞中复制并维持的起点。载体还可以包含编码位于核酸的5′、编码轻链或重链的信号序列的核苷酸序列。所述信号序列可以促进编码链分泌进入培养基中。
优选地，所述载体得自腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、SV40病毒、逆转录病毒、植物病毒或噬菌体诸如λ衍生物或M13。特别优选的载体是含有人Ig重链和人轻链的恒定区的载体，诸如Persic等所述的用于免疫球蛋白的真核表达的整合型载体(Persic et al.1997.Gene.187(1)：9-18)。
所述载体可还包含His-tag编码核苷酸序列，导致构建物表达，用于产生在所述人单克隆抗体的轻链和/或重链的N-端具有His-tag的融合产物，其便于在镍柱上通过螯合物形成进行的蛋白质的纯化。
此外，本发明提供包含载体和/或适合该载体表达的合适的宿主细胞。在现有技术中，很多原核和真核生物表达系统是已知的，其中优选真核宿主细胞诸如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞，和哺乳动物细胞，诸如HEK293-细胞、PerC6-细胞、CHO-细胞、COS-细胞或HELA-细胞以及它们的衍生物。特别优选的是人类产生细胞系。优选被转染的宿主细胞将所产生的抗体分泌进入培养基中。如果实现了胞内表达，则按照标准方法诸如例如Benetti PH et al.，Protein Expr Purif Aug；13：283-290，(1998)进行复性。
本发明还提供了用于产生人单克隆抗体的方法。在一个实施方式中，所述人单克隆抗体是通过培养上述杂交瘤而产生的。所产生的抵抗力抗体被分泌进入上清液中并且可以通过应用常规色谱技术从该上清液中提纯。
可选地，所述人单克隆抗体通过包含根据本发明的载体的宿主细胞并在适于所编码抗体链的重组表达的条件下培养该宿主细胞来产生。优选地，所述宿主细胞包含至少一种编码轻链的核酸和至少一种编码重链的核酸，并且能够装配所述人单克隆抗体，以便产生3-维结构，其等价于由人类B-细胞产生的人单克隆抗体3-维结构。如果轻链单独于重链产生，则两种链都可被纯化并随后装配，以产生人单克隆抗体，其基本具有如通过人类B-细胞所产生的人单克隆抗体的3-维结构。
所述人单克隆抗体还可以通过所编码的轻链和/或重链的重组表达来获得，其中核酸通过下述产生：以已知的方式分离编码人单克隆抗体的核酸并将编码如在权利要求中所定义的CDR的核酸序列接枝到所分离的核酸上。
根据进一步优选的实施方式，根据本发明的人单克隆抗体被修饰。该修饰包括单体形式的二聚、低聚或聚合，例如利用二环已基碳二亚胺通过交联。提供凝胶过滤可以使如此产生的二聚物、低聚物或聚合物彼此分离。其他的修饰包括侧链修饰，例如，修饰[ε]-氨基赖氨酸残基，或者分别对氨基端和羧基端的修饰。其他的修饰包括翻译后修饰，例如，蛋白质的糖基化和/或部分或完全去糖基化，以及二硫键形成。抗体还可以与标记结合，诸如，酶、荧光或放射性标记。
本发明还提供药物组合物，其包含至少一种人单克隆抗体和/或至少一种编码该人单克隆抗体的轻链和/或重链的核酸。
所述药物组合物还可包括本领域已知的药学上可接受的成分。
优选地，所述药物组合物用以治疗在感染中由绿脓假单胞菌引起的疾病，所述感染诸如血流感染、肺炎、慢性支气管炎、局部感染，包括关节的创伤感染和侵入性感染，主要存在于无免疫应答的患者和/或存在于患有缺乏免疫力的呼吸功能的患者中。所述药物组合物还意图用于预防和/或治疗医院内获得性(医院)感染，但不限于此。因为绿脓假单胞菌感染的主要受害者是囊性纤维变性患者、烧伤受害者、插管患者、在手术室和/或内科重症监护室中的患者、癌症和AIDS患者、无免疫应答的患者、免疫抑制患者、糖尿病患者以及静脉药物滥用者，因此所述药物组合物特别意图用于在所述患者组中预防和/或治疗由绿脓假单胞菌引起的疾病。
所述药物组合物还包含抗生素药物，优选与新单克隆抗体偶联的抗生素药物。
所述药物组合物包含浓度范围为0.1-30mg/kg体重的新型单克隆抗体。
所述药物组合物可以以任何已知的方式施用，诸如静脉、肌内、皮内、皮下、腹膜内、局部、鼻内施用或作为吸入喷雾剂。
本发明还提供用于诊断绿脓假单胞菌感染的试剂盒，其包含至少一种本发明的人单克隆抗体以及任选包含用于实施诊断试验的其他合适的成分。用于实施诊断试验的其他合适的成分在本领域是熟知的。合适的成分的特别有用的实例是缓冲液，诸如重量摩尔渗透压浓度在280-320mOsm/l范围内以及pH值在pH6-8范围内的缓冲液、含螯合剂的缓冲液、含一价或二价阳离子并且缓冲液组合物的总阳离子浓度在约0.02M至约2.0M范围内的缓冲液，或者含有浓度在0.01％与20％之间的动物或人来源血清的缓冲液。
所述试剂盒适于绿脓假单胞菌感染的特定的可靠的诊断。试验测定可基于液体或膜结合形式的常规ELISA试验。检测可以是直接或间接的，如本领域已知的，其中所述抗体任选与酶、荧光或放射性标记结合。
下述实施例阐述了本发明但不意图限制本发明的范围。当本领域技术人员研究本说明书并具有公知常识时，其他的实施方式对于他们而言是显而易见的。
附图简述
图1涉及216-O1重链可变区的DNA和氨基酸序列。216-O1的CDR1区位于31至35位，216-O1的CDR2区位于50至66位，216-O1的CDR3区位于99至104位。
图2涉及216-O1κ轻链可变区的DNA和氨基酸序列。216-O1的CDR1区位于24至39位，216-O1的CDR2区位于55至61位，216-O1的CDR3区位于94至101位。
图3涉及通过单克隆抗体216-O1进行的绿脓假单胞菌菌株的LPS的识别图案。216-O1的结合通过ELISA测定。
图4a涉及通过单克隆抗体216-O1进行的绿脓假单胞菌参照菌株(血清型01-017)的识别。图4b涉及通过单克隆抗体216-O1和两种其他已知抗体(MAb C1和MAb C2)进行的临床绿脓假单胞菌分离物的识别图案。抗体的结合通过全细胞ELISA(关于抗体来源，见19页，实施例：全细胞ELISA)测定。
图5涉及定向对抗绿脓假单胞菌血清型IATS O1的单克隆抗体216-O1和两种其他已知抗体(MAb C1和MAb C2)的调理吞噬活性。
图6涉及单克隆抗体216-O1在小鼠中的药物动力学。在鼠烧伤创面脓毒症模型中评价216-O1的体内保护能力。将剂量的216-O1静脉施用给NMRI小鼠。攻击后的存活率显示可达96h(图6A)，并且显示了攻击后三天中3个实验的概况(图6B)。
材料和方法
下述材料和方法用在实施例中：
LPS-特异性的测定和IgM的量化
为筛选和分析细胞培养上清液中的抗体，如别处所述在具有一些变化的情况下进行ELISA(Cryz，S.J.et al.，1987.J.Clin.Invest.80(1)：51-56)。简言之，在36mM三乙胺或在H2O中以2mg/ml的浓度制备绿脓假单胞菌脂多糖(LPS)(室内产生)储备溶液。为进行涂布，将溶液在PBS中稀释至10μg/ml。使该溶液与等体积的10μg/ml甲基化人血清白蛋白(HAS；如下在室内产生：将2g冻干的HAS溶解在200ml无水甲醇中)混合。添加1.68ml 37％HCI之后，将溶液在室温下在黑暗中贮存至少3天，伴随偶尔摇动。通过10min离心(4500rpm，GS1转子)收集沉淀，并且通过将粒状沉淀悬浮在溶解中用无水甲醇洗两次以及用无水醚洗两次。将沉淀在干燥器中干燥2小时，并将干燥的粒状沉淀悬浮在H2O中，并以等分试样贮存在-20℃下。将
Figure BDA0000118069500000131
ELISA板用100μl/孔LPS-HAS溶液在室温下涂覆过夜。在用300μl含0.05％Tween 20(#93773；Fluka Chemie AG，Switzerland)的PBS pH7.4(室内产生)(PBS-T)洗板三次之后，将细胞培养上清液在PBS中稀释1∶2，并在室温下温育2小时。用PBS-T洗板三次之后，用在PBS-T中稀释1∶2000-1∶4000的辣根过氧化物酶结合的羊抗-人IgM抗体(#074-1003；KPL；Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.Gaithersburg，MD)检测结合抗体。将所述板在室温温育1小时，并用PBS-T洗三次。通过添加100μl/孔OPD基质溶液(0.4mg/ml正苯基二胺，在含0.012％(v/v)H2O2的0.1M柠檬酸钠缓冲液中)，使抗体结合可见。通过添加50μl/孔1MHCl 2-3分钟之后，呈色反应停止。利用Softmax
Figure BDA0000118069500000132
软件在ELISA读数器上在490nm读取光密度。
为量化细胞培养上清液中的IgM，用在PBS中的1μg/ml未结合饿羊抗-人IgM抗体在4℃涂覆ELISA板过夜。用PBS-T洗板三次，并在2倍稀释中温育细胞上清液和标准。作为标准，使用浓度0.5μg/ml始于的纯化人抗体。所有稀释均在PBS-T中进行。将板在室温下温育2小时。用PBS-T洗板三次之后，用在PBS-T中稀释1∶2000-1∶4000的辣根过氧化物酶结合的羊抗-人IgM抗体(KPL)检测结合抗体。将所述板在室温温育1小时，并用PBS-T洗三次。通过添加100μl/孔OPD基质溶液，使抗体结合可见。通过添加50μl/孔1M HCl约1分钟之后，呈色反应停止。利用Softmax
Figure BDA0000118069500000133
软件在ELISA读数器上在490nm读取光密度。
亲和力测定
利用抑制试验测定亲和力，其中研究了向抗体中加入游离LPS如何影响其与已涂覆LPS的结合。亲和力是将50％的抗体信号抑制仅赋予已涂覆LPS的游离LPS(以mol/L计)的浓度的倒数值。这可利用Reed-Munch方法(Reed L.J.and Muench H.，Am J of Hygiene(27)，493-497(1938))计算。
如上所述用LPS涂覆板(测定LPS特异性)。在用300μl含0.05％Tween 20(#93773；Fluka Chemie AG，Switzerland)的PBS pH7.4(室内产生)(PBS-T)洗板三次之后，加入抗体。作为参考，使用在PBS中的一系列稀释抗体。另外，利用恒定浓度的216-O1，在第二稀释中加入不同浓度的游离LPS(在H2O中)。将板在室温下温育2小时，随后用PBS-T洗三次。用在PBS-T中分别稀释1∶2000或1∶4000的辣根过氧化物酶结合的羊抗-人IgM抗体(#074-1003；KPL；Kirkegaard&PerryLaboratories，Inc.Gaithersburg，MD或#62-7500Zymed，Invitro-gen，Carlsbad)检测板结合抗体。将板在室温下温育1小时，并用PBS-T洗三次。通过添加100μl/孔OPD基质溶液(0.4mg/ml邻-苯二胺，在含0.012％(v/v)H2O2的0.1M柠檬酸钠缓冲液中)，使抗体结合可见。通过添加50μl/孔1M HCl 2-3分钟之后，呈色反应停止。利用Softmax
Figure BDA0000118069500000141
软件在ELISA读数器上在490nm读取光密度。
序列分析
通过使用来自Qiagen的RNeasy-Kit分离杂交瘤细胞的RNA。利用反转录酶(Superscript II，Invitrogen and Primescript，Takara Bio Inc.)合成cDNA。利用设计用于扩增人重排IgG和IgM可变域编码区的人IgG和IgM文库引物组(#F2000，Progen)，测定重链和轻链的亚组。设计在引导序列中的特异性正向引物并与恒定引物结合使用，用于通过PCR扩增可变区并测序。关于测序，另外设计在可变区中的正向引物，以验证所述序列。在Microsynth AG(Balgach，Switzerland)上进行测序。
对于PCR和测序，使用下述引物(表III)：反向恒定IgM(IgM con)：5′-AAG GGT TGG GGC GGA TGC ACT-3′；反向恒定κ(κrev)：5′-GAAGAC AGA TGG TGC AGC CAC AG-3′。作为重链的正向引物，使用了VH3：5′-ATG GAG TTT GGG CTG AGC TG-3′，以及作为轻链的正向引物，使用了前导序列1：5′-CAA TGA GGC TCC CTG CTC AG-3′。
关于测序，另外设计了下述正向引物，并且对于重链使用HCCDR2-3：5′-AGT CTG AGA GCC GAG GAC AC-3′，而对于轻链则使用LC CDR2-3：5′-ACA GAT TCA GCG GCA GTG G-3′。
通过http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html，应用Kabat编号，测定CDR。
利用V-Base DNAPLOT软件(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)使序列与现有的种系序列进行比较。
表I
绿脓假单胞菌接种菌株的IATSS血清型
Figure BDA0000118069500000151
表II
绿脓假单胞菌血清型IATS O1的临床分离物
Figure BDA0000118069500000161
这些绿脓假单胞菌分离物从患者的诸如尿或呼吸道的各种来源获得。
全细胞ELISA
在该实验中使用了绿脓假单胞菌参照菌株O1-O17和来自不同临床分离物的细菌(见表II)。对每种血清型O1-017的一种绿脓假单胞菌菌株进行测试吗，作为参照菌株(ATCC-美国标准菌库)：参照菌株01(ATCC 33348)、参照菌株02(ATCC 33356)、参照菌株03(ATCC33350)、参照菌株04(ATCC 33351)、参照菌株05(ATCC 33352)、参照菌株06(ATCC 33354)、参照菌株O7(ATCC 33353)、参照菌株O8(ATCC 33355)、参照菌株O9(ATCC 33356)、参照菌株010(ATCC33357)、参照菌株011(ATCC 33358)、参照菌株012(ATCC 33359)、参照菌株013(ATCC 33360)、参照菌株O14(ATCC 33361)、参照菌株O15(ATCC 33362)、参照菌株016(ATCC 33363)和参照菌株017(ATCC 33364)。
使细菌在脑心浸液(BHI)培养基中于37℃生长至，550nm下的光密度为1，并用37％福尔马林(福尔马林的终浓度：0.5％)在37℃过夜固定。将该固定的细菌在PBS中稀释1∶50，并使100μl在ELISA上室温下过夜固定。将板用120μl含0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在37℃封闭30分钟后，将含单克隆抗体216-O1的100μl杂交瘤上清液用已固定的细菌在37℃温育90分钟。可选地，将分离物用单独的培养基或对照抗体温育(数据未显示)。用PBS-T(PBS，0.5％Tween-20)洗板3次后，用在PBS-T中稀释1∶2000-1∶4000的辣根过氧化物酶结合的羊抗-人IgM抗体(#074-1003；KPL；Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.Gaithersburg，MD)检测板结合抗体。将板在37℃温育1小时，并用PBS-T洗三次。通过添加100μl/孔OPD基质溶液(0.4mg/ml邻-苯二胺，在含0.012％(v/v)H2O2的0.1M柠檬酸钠缓冲液中)，检测抗体结合。通过添加50μl/孔1M HCl 2-3分钟之后，呈色反应停止。利用Softmax
Figure BDA0000118069500000171
软件在ELISA读数器上在490nm读取光密度。
关于比较实验，如在US4,834,975(Siadak)中所述，从ATCC预定额外的抗-绿脓假单胞菌LPS血清型IATS O1分泌细胞系9D10和C5D5，产生抗体(分别为MAb C1(9D10)和MAb C2(C5D5))，并与216-O1进行比较。
调理吞噬测定
为测定生物活性，测试单克隆抗体216-O1的调理吞噬活性。基于该目的，使血清型IATS O1的绿脓假单胞菌(菌株PA53)在TSBG(含1％(w/v)葡萄糖的30g/l Tryptic Soy Broth)培养基中过夜生长。用20ml0.1M pH8.0的碳酸氢盐缓冲液洗涤该细菌两次之后，将该细菌的沉淀再悬浮于5ml 0.1M pH8.0的碳酸氢盐缓冲液。加入50μl的5-(和-6)-羧基荧光素，琥珀酰亚胺酯(5(6)-FAM SE)；Molecular Probes，Eugene，OR；10mg/ml，在二甲亚砜中)，并在37℃温育1小时。通过加入100μl37％甲醛并在37℃温育过夜，固定细菌。为去除未结合染料，将细菌用20ml冷的无菌PBS洗6次，以5ml再悬浮，并在PBS中稀释至OD550nm＝1。将标记抗体以等分试样贮存在-80℃，直到使用。为进行测试，将等分试样的细菌在HBSS-BSA(含0.1％BSA的Hanks平衡盐溶液)中稀释1∶50。使70μl细菌与30μl分别含单克隆抗体216-O1或非特异性单克隆对照抗体的杂交瘤细胞培养上清液的不同稀释混合(未显示数据)。另外，添加20μl幼兔血清(Charles River Laboratories，Germany)，作为补体或热灭活补体来源(1h 56℃)，作为对照。在37℃温育30分钟后，将60μl已分化的HL-60细胞(通过使细胞在补充有20％(v/v)胎牛血清和100mM二甲基甲酰胺的Iscoves Modified Dulbecco′sMedium(IMDM；Sigma)温育4天，早幼粒细胞细胞系HL-60被分化成粒细胞)加入调理过的细菌中，以获得的1.3x 106细胞/ml的终浓度。在37℃在摇动器上温育90分钟后，加入2ml细胞洗涤缓冲液(含PBS的0.02％(v/v)叠氮化物；Becton Dickenson)和100μl锥虫蓝溶液(#T8154，Sigma)1分钟，用于猝灭。在350x g下离心5分钟后，将细胞沉淀再悬浮于约200μl细胞洗涤缓冲液中并通过流式细胞术分析。通过分析HL-60细胞的绿色荧光，与背景染色比较，测定正调理吞噬活性(Positive opsonphagocytotic activity)。通过在含HL-60细胞的补体的存在下温育荧光素结合的细菌，测定背景染色。
绿脓假单胞菌感染鼠的体内保护
鼠烧伤创面模型
在鼠烧伤创面脓毒症模型中测定216-O1的体内保护能力。在攻击前2小时，NMRI-小鼠(18-20g；Charles River Laboratories)静脉接受体积约0.1ml的0.1至1.5mg/kg单克隆抗体216-O1。作为对照，注射1.5mg/kg非特异性对照(ctr)抗体。关于攻击，用氯胺酮(Narketan；Vetoquinola G)/甲苯噻嗪(Xylasol；Dr.E.Graeub AF)麻醉10只雌性小使小鼠在5％异氟烷中保持2-3min。使小鼠在背部2em2区域上经历10秒钟乙醇灼烧。将悬浮在0.5ml PBS中的2.5-5x107cfu/小鼠的攻击生物(绿脓假单胞菌IATS O1；PA53，见表1)立刻皮下注射到烧伤区域中。用0.3mg/kg Temgesic(止痛剂)皮下处理所述动物，一天两次，每天三次监控存活率，直到攻击后96小时。
实施例
实施例1：216-O1的DNA和氨基酸序列
分别通过DNA序列和氨基酸序列测定抗体特异性。测定重链和轻链的可变片段的DNA序列。简言之，分离出杂交瘤细胞的全部RNA，并反转录成完全cDNA。利用Cκ和Cμ-特异性引物并结合前导序列中的正向引物，通过PCR扩增IgM和κ可变区和部分恒定区。然后通过从琼脂糖凝胶中切出，清除PCR片段，并使其用作模板，用于与表III中所述的引物一起测序。
表III
用于216-O1的IgM重链和κ轻链的
可变区的PCR-扩增和测序的引物
  引物   HC/LC   SEQ ID No 11至16   应用
  IgM con   HC   5′-AAG GGT TGG GGC GGA TGC ACT   PCR，测序
  VH3   HC   5′-ATG GAG TTT GGG CTG AGC TG   PCR，测序
  HC CDR2-3   HC   5<′>AGT CTGAGA GCC GAG GAC AC   测序
  Kappa rev   LC   5<′>GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AG   PCR，测序
  Leader 1   LC   5<′>CAA TGA GGC TCC CTG CTC AG   PCR，测序
  LC CDR2-3   LC   5<′>ACA GAT TCA GCG GCA GTG G   测序
随后使可变区的序列与Vbase Index(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)进行比较。与种系序列的比较显示轻链与DPK18种系序列具有最高相似度，而重链与VH3-11种系序列具有最高相似度。216-O1的可变区IgM重链和κ轻链的DNA序列和氨基酸序列描述在图1和2中。
实施例2：通过单克隆抗体216-O1识别从绿脓假单胞菌分离的LPS和绿脓假单胞菌血清型IATS O1的临床分离物
通过用八价O-PS-毒素A疫苗使健康志愿者免疫，产生216-O1。该疫苗含IATS O1菌株PA53的LPS。为测定LPS特异性，在一系列从绿脓假单胞菌分离的LPS(表1)上测试216-O1(图3)。为了研究216-O1是否特异性识别IATS O1绿脓假单胞菌，使其在17个参照菌株上进行测试(图4a)。
另外，通过全细胞ELISA测试血清型IATS O1的不同临床分离物(图4b)与216-O1和其他抗-绿脓假单胞菌LPS IATS O1抗体(MAb C1和MAb C2)的结合。利用商业可得的血清型凝集试剂盒测定所有分离物的血清型并通过PCR证实。216-O1与IATS O1血清型的分离LPS特异性反应，但未与任何其他受测血清型特异性反应。此外，仅观察到与IATS O1参照菌株结合，但不与IATS O2-O17参照菌株结合。利用一些对抗各血清型的其他单克隆抗体作为阳性对照，确保这些分离物的完整性(未显示数据)。比较216-O1与两种已知抗体(MAb C1和MAB C2)对临床分离物的识别，216-O1和MAb C1显示与所测试的所有10种分离物结合，而对于MAb C2，仅检测到其与10种受测分离物中的6种结合。
实施例3：216-O1的体外活性：调理吞噬活性
利用基于流式细胞术的调理吞噬实验评价216-O1的体外生物活性。在作为补体来源的正常兔血清存在下，血清型IATS O1的荧光-标记((5(6)-FAM SE)-结合绿脓假单胞菌用连续稀释的216-O1温育。已调理的细菌用分化的HL-60细胞(早幼粒细胞系，ATCC：CCL-240；通过添加0.1M二甲基甲酰胺4天实现向吞噬细胞的分化)温育。通过FACS分析调理吞噬。在不存在活性补体(热灭活血清)的情况下，通过分析HL-60细胞的绿色荧光，并与含HL-60细胞的(5(6)-FAM SE)-结合细菌的背景染色进行比较，测定阳性调理吞噬活性。2个独立实验的平均结果示于图5中。
216-O1以剂量依赖型方式介导IATS O1血清型的绿脓假单胞菌的吞噬(填充环)。216-O1的调理吞噬活性(OA50)定义为产生半最大百分比FITC-阳性HL-60细胞的浓度，其为约2.7ng/ml。此种低剂量下的活性表明216-O1具有高效应物潜力。比较216-O1与MAb C1(正方形)和MAb C2(三角形)介导调理吞噬的能力，关于MAb C2检测到相当的调理吞噬活性(3.8ng/ml)，MAb C1证实是较无效的(50.9ng/ml)。
因此，216-O1抗体在识别患者分离物方面显示了显著更好的特性，以及在调理吞噬活性方面显示优良结果。
实施例4：单克隆抗体216-O1的体内保护能力
在鼠烧伤创面脓毒症模型中评价216-O1的体外保护能力。将不同剂量的216-O1静脉施用给NMRI小鼠。2小时后，施加2x2cm烧伤创面，并在该烧伤皮肤区域皮下注射2.5x105-5x105CFU绿脓假单胞菌菌株PA53(01)。小鼠在整个实验期间接受镇痛药。每日三次监控存活率。一个实验显示存活率可达攻击后96h(图6A)，而且显示了三个独立实验在攻击后三天的存活率(图6B)。
剂量≥0.1mg/kg体重对全身性假单胞菌属攻击提供60-100％防护。针对另一种绿脓假单胞菌血清型的对照抗体未提供保护。施用减小的剂量导致较低存活率。死亡是假单胞菌感染的直接原因，因为具有烧伤创面但无假单胞菌感染的小鼠具有100％-存活率。这些数据证实了216-O1对抗绿脓假单胞菌感染的体内效力。

Claims (24)

1.对绿脓假单胞菌LPS血清型IATS O1的脂多糖(LPS)具有特异性的人单克隆抗体或者能够与所述LPS结合的所述人单克隆抗体的片段或衍生物，其中所述抗体的轻链的可变区包含：在CDR1区中的SEQ ID NO：1、在CDR2区中的SEQ ID NO：2和在CDR3区中的SEQ IDNO：3，并且其中所述抗体的重链的可变区包含：在CDR1区中的SEQID NO：4、在CDR2区中的SEQ ID NO：5和在CDR3区中的SEQ IDNO：6。
2.如权利要求1所述的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链的可变区具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且所述重链的可变区具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列；或者能够与所述LPS结合的所述抗体的变体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：7至少85％同源，而且所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：8至少85％同源。
3.如权利要求1或2所述的人单克隆抗体，其中所述轻链属于κ类型。
4.如权利要求1或2所述的人单克隆抗体，其中所述重链属于λ类型。
5.如权利要求1至4任一项所述的人单克隆抗体，其中所述重链属于IgM、IgA或IgG类型，优选属于IgM类型。
6.如权利要求5所述的人单克隆抗体，其中所述重链属于IgM类型。
7.如权利要求1至6任一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体完全由人氨基酸序列组成。
8.如权利要求1至7任一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体展示出人抗原识别。
9.如权利要求1至8任一项所述的人单克隆抗体，其中所述衍生物是携带至少一个位于所述重链和/或所述轻链中的任意CDR区中的保守置换的人单克隆抗体的突变蛋白。
10.如权利要求1至9任一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体进行了N-端修饰、内部修饰和/或C-端修饰。
11.如权利要求10所述的人单克隆抗体，其中所述修饰选自低聚以及与药物和/或标记结合中的至少一种。
12.如权利要求1至9任一项所述的人单克隆抗体得自人B细胞或者得自通过使所述人B细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞融合而获得的杂交瘤。
13.一种杂交瘤，其能够产生如权利要求1至9或12任一项所述的人单克隆抗体。
14.一种核酸，其编码如权利要求1至9或12任一项所述的人单克隆抗体的轻链。
15.一种核酸，其编码如权利要求1至9或12任一项所述的人单克隆抗体的重链。
16.一种载体，其包含至少一种如权利要求14所述的编码所述轻链的核酸和/或至少一种如权利要求15所述的编码所述重链的核酸。
17.根据权利要求16所述的载体，其中所述载体还包含与所述核酸可操作连接以促进所述核酸表达的启动子。
18.一种宿主细胞，其包含如权利要求14所述的载体和/或如权利要求14或15所述的核酸。
19.一种用于产生如权利要求1至9或12任一项所述的人单克隆抗体的方法，包括在允许抗体分泌的条件下培养如权利要求13所述的杂交瘤，或者在适合所述人单克隆抗体表达的条件下培养如权利要求18所述的宿主细胞，并且任选从培养上清液纯化所述抗体。
20.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1至12所述的人单克隆抗体和/或至少一种如权利要求13或14所述的核酸，并且任选包含药学上可接受的载体或成分。
21.如权利要求1至12任一项所述的人单克隆抗体和/或如权利要求13或14所述的核酸，用于在人类患者中预防和/或治疗绿脓假单胞菌感染。
22.如权利要求1至12任一项所述的人单克隆抗体和/或如权利要求13或14所述的核酸用于制备在人类患者中预防和/或治疗绿脓假单胞菌感染的药物组合物的应用。
23.根据权利要求21或22的应用，其中所述绿脓假单胞菌感染是医院内获得性感染。
24.用于诊断样品中的绿脓假单胞菌的试剂盒，其包含至少一种如权利要求1至12任一项所述的人单克隆抗体和/或如权利要求13或14所述的核酸，以及任选还包含用于实施诊断测试的合适成分。
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