KR20150008105A

KR20150008105A - 항-mif 항체와 글루코코르티코이드의 조합 요법

Info

Publication number: KR20150008105A
Application number: KR20147031758A
Authority: KR
Inventors: 란돌프 케르슈바우머; 디르크 보엘켈; 프리드리히 샤이프링거; 하르트무트 에를리히
Original assignee: 박스터 헬쓰케어 에스에이; 백스터 인터내셔널 인코포레이티드
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2015-01-21
Also published as: WO2013156472A1; IL235037A0; ZA201507929B; CN104470540A; US20210187105A1; ES2779036T3; AU2013203957B2; US20180280501A1; MX2014012534A; RU2014145694A; CA2869987A1; AU2015210447A1; JP6236062B2; EP2838559B1; EP2838559A1; US20150250873A1; CL2014002789A1; CN104470540B; NZ628454A; AU2013203957A1

Abstract

본 발명은 항-MIF 항체, 특히 글루코코르티코이드 수용적 질환을 치료하는 데 있어서 글루코코르티코이드와 조합되는 그의 용도에 관한 것이다.

Description

항-MIF 항체와 글루코코르티코이드의 조합 요법 {COMBINATION THERAPY OF ANTI-MIF ANTIBODIES AND GLUCOCORTICOIDS}

본 발명은 항-MIF 항체, 특히 MIF-관련 질환을 치료하는 데 있어서 글루코코르티코이드와 조합되는 그의 용도에 관한 것이다.

대식세포 이동 억제 인자 (MIF)는 투베르쿨린(tuberculin) 과민성 기니아 피그 (대식세포를 함유함)로부터의 복막 분비 세포의 시험관내 무작위 이동을 억제할 수 있는 그의 능력을 기초로 하여 초기에 단리된 사이토킨이다 (문헌 [Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2]; [David et al. PNAS 1966, 56, 72-7] 참조). 오늘날, MIF는 다면 발현성 활성 스펙트럼을 발휘하는 선천 및 후천 면역 반응의 중요한 상류 조절인자로서 공지되어 있다.

인간 MIF cDNA는 1989년에 클로닝되었고 (문헌 [Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6] 참조), 그의 게놈 위치는 22번 염색체에 지도화되었다. 인간 MIF 유전자의 생성물은 114개의 아미노산 (N-말단 메티오닌의 절단 후)과 약 12.5 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 단백질이다. MIF는 다른 어떠한 단백질과도 유의적인 서열 상동성을 갖고 있지 않다. 이 단백질은 동일한 소단위의 삼량체로서 결정화된다. 각 단량체는 4개-가닥의 베타-시트에 대해 패킹되는 2개의 역평행 알파-나선을 함유한다. 이러한 단량체는 인접한 소단위의 베타-시트와 상호 작용하여 단량체들 간의 계면을 형성하는 2개의 부가 베타-가닥을 갖는다. 3개의 소단위는, 분자 3회전 축을 따라 단백질의 중심을 관류하는 용매-접근 가능한 채널을 함유하는 배럴(barrel)을 형성하도록 배열된다 (문헌 [Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196] 참조).

대식세포로부터의 MIF 분비는 극히 저농도의 글루코코르티코이드에서 유도되는 것으로 보고되었다 (문헌 [Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71] 참조). 그러나, MIF는 또한, 글루코코르티코이드의 효과를 역조절하고, 기타 사이토킨, 예컨대 종양 괴사 인자 TNF-α 및 인터루킨 IL-1β의 분비를 자극한다 (문헌 [Baugh et al., Crit Care Med 2002, 30, S27-35] 참조). MIF는 또한, 예를 들어 혈관형성을 증진시키는 특성, 증식을 증진시키는 특성 및 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 특성을 나타냄으로써, 종양 세포 성장을 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Mitchell, R.A., Cellular Signalling, 2004. 16(1): p. 13-19]; [Lue, H. et al., Oncogene 2007. 26(35): p. 5046-59] 참조). 이는 또한, 예를 들어 림프종, 흑색종 및 결장암의 성장과 직접적인 연관이 있다 (문헌 [Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62] 참조).

MIF는 많은 병리학적 상태의 매개인자이므로, 특히 염증성 장 질환 (IBD), 류마티스성 관절염 (RA), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 천식, 사구체신염, IgA 신병증, 심근 경색 (MI), 패혈증 및 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 질환과 연관이 있다.

재조합 인간 MIF에 대항한 폴리클로날 및 모노클로날 항-MIF 항체가 개발되었다 (문헌 [Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-202]; [Kawaguchi et al., Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232], 및 [Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 16778] 참조).

치료적 용도를 위한 항-MIF 항체가 제안되었다. 문헌 ([Calandra et al., J. Inflamm. (1995); 47, 39-51] 참조)에는 실험적으로 유도된 그램-음성 및 그램-양성 패혈성 쇼크로부터 동물을 보호하기 위해 항-MIF 항체를 사용하였다고 보고되었다. 항-MIF 항체는 패혈성 쇼크 및 기타 염증성 질환 상태에서 사이토킨 생성을 조절하기 위한 요법의 수단으로서 제안되었다.

US 6,645,493에는 MIF의 생물학적 활성을 중화시키는, 하이브리도마 세포로부터 유래된 모노클로날 항-MIF 항체가 개시되어 있다. 동물 모델에서는, 이들 마우스-유래된 항-MIF 항체가 내독소-유도된 쇼크를 치료하는 데 있어서 유익한 효과를 나타내는 것으로 보여질 수 있다.

US 200310235584에는 MIF 유전자를 동형접합적으로 녹-아웃(knock-out)시켰던 동물에게서 MIF에 대한 고 친화성 항체를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

글리코실화-억제성 인자 (GIF)는 문헌 ([Galat et al., Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21] 참조)에 기재된 단백질이다. MIF 및 GIF는 현재, 동일한 것으로 인식되고 있다. 문헌 ([Watarai et al., PNAS 2000, 97, 13251-6] 참조)에는 Ts 세포에서 GIF의 해독 후 변형의 생화학적 성질을 확인하기 위해 상이한 GIF 에피토프와 결합하는 폴리클로날 항체가 기재되어 있다. 문헌 ([Watarai et al., 상기 참조])에는 GIF가 시험관 내에서 상이한 입체 형태적 이소형으로 존재한다고 보고되었다. 한 가지 유형의 이성체는 단일 시스테인 잔기의 화학적 변형에 의해 발생한다. 이러한 화학적 변형으로 인해, GIF 단백질 내에서 입체 형태적 변화가 유발된다.

종종 글루코코르티코스테로이드로 지칭되기도 하는 글루코코르티코이드는 거의 모든 척추 동물에 존재하는, 글루코코르티코이드 수용체와 결합하는 특정 계열의 스테로이드 호르몬이다. 글루코코르티코이드는 면역 활성 (즉, 염증)을 거절하는 면역계의 피드백 기전의 일부이다. 의약에서는, 이들이 과활동성 면역계에 의해 유발되는 질환을 치료하기 위해 사용되는데, 이러한 질환에 대한 예는 알레르기, 천식, 자가면역 질환 및 패혈증이다. 이들은 또한, 암 세포에서 일부 비정상적인 기전을 방해하므로, 암을 치료하는 데 사용되기도 한다. 글루코코르티코이드 수용체와의 결합시, 이와 같이 활성화된 글루코코르티코이드 수용체 복합체는 전사활성화로서 공지된 공정에 의해 핵에서의 소염 단백질의 발현을 상향 조절하고, 유전자 유도에 대한 작용을 약화시킴으로써 시토졸에서의 염증 유발성 단백질의 발현을 억제한다 (NF-κB, AP1, jun-jun-동종이량체 등을 통하여 이루어짐). 원칙적으로, 글루코코르티코이드는 코르티코스테로이드의 서브그룹으로서 정의된다. 또한, 글루코코르티코이드 활성을 지닌 신규 부류의 화합물 (SEGRA, 선택적 글루코코르티코이드 수용체 작동제)이 공지되어 있다. 이들 화합물은 완전한 작동성 글루코코르티코이드의 작용의 일부만을 발휘하는데, 즉 이들은 완전한 스펙트럼의 전사-활성화, 전사-억제, 및 유전자 유도에 대한 간접 작용 (NF-κB, AP1, jun-jun-동종이량체 등을 통하여 이루어짐)을 유발시키지 못한다. 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM's = 타목시펜, 랄록시펜, 토레미펜)에서 유추하여, 이들 화합물은 또한, 선택적 글루코코르티코이드 수용체 조절인자 (SEGRM's)로서 지칭된다. SEGRA's/SEGRM's의 예는 마프라코레이트(Mapracorate) (= BOL303242X = ZK245186), 화합물 A, RU24856, RU24782, RU40066, ZK 216348을 포함한다.

자연 글루코코르티코이드의 중요한 예는 생존에 필수적이고, 각종 중요한 심혈관계, 대사, 면역학적 및 생체 항상성 기능을 조절하거나 지지해주는 코르티솔 (또는 히드로코르티손)이다. 이들은 또한, 입수 가능한 몇 가지 합성 글루코코르티코이드이다.

글루코코르티코이드는 3가지 주요 분야, 즉 면역학적 분야, 대사 분야 및 태아 발달 분야에서 작용한다. 면역 분야에서는 이들이 소염 단백질의 발현을 상향 조절하고, 염증 유발성 단백질의 발현은 하향 조절한다. 대사 효과는 다음과 같이 요약될 수 있다:

· 특히 간에서 글루코스 신합성(gluconeogenesis)을 자극함: 이러한 경로로 인해, 아미노산과 같은 비-헥소스 기질로부터 글루코스가 합성되고 트리글리세리드 붕괴로부터 글리세롤이 합성되며, 상기 경로는 육식 동물 및 특정 초식 동물에게 특히 중요하다. 글루코스 신합성에 관여한 효소의 발현을 증강시키는 것이 글루코코르티코이드의 가장 잘 공지된 대사 기능인 것으로 추정된다.

· 간 외의 조직으로부터 아미노산을 동원함: 이들은 글루코스 신합성에 대한 기질로서 제공된다.

· 근육 및 지방 세포 조직에서 글루코스 흡수를 억제함: 지방 분해에 의해 방출된 지방산이 근육과 같은 조직에서 에너지 생성을 위해 사용되고, 방출된 글리세롤은 글루코스 신합성에 대한 또 다른 기질을 제공한다.

태아 발달에서는, 글루코코르티코이드가 폐의 성숙을 증진시키고, 자궁 외의 폐 기능에 필요한 계면활성제의 생성을 증진시킨다. 이들은 정상적인 뇌 발달을 위한 추가의 주요 물질이다.

각종 합성 글루코코르티코이드 (이들 중 일부는 코르티솔보다 한층 더 강력하다)가 치료적 용도를 위해 창출되었다. 이들은 약동학 (흡수, 반감기, 분포 용적, 청소율) 및 약력학에 있어서 상이하다.

글루코코르티코이드 효력, 효과 기간, 및 중복 무기질코르티코이드 효력은 다양하다. 코르티솔 (히드로코르티손)은 글루코코르티코이드 효력을 알아보기 위한 표준 비교물이다. 히드로코르티손은 코르티솔의 제약 제제에 사용된 명칭이다. 경구 효력은 비경구 효력 보다 덜할 수도 있는데, 이는 상당량 (일부 경우에는 50% 이하)이 내장으로부터 흡수되지 않을 수 있기 때문이다.

그 예는 다음과 같다:

히드로코르티손, 코르티손 아세테이트, 코르티손/코르티솔, 플루오로코르톨론, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 덱사메타손, 베타메타손, 파라메타손.

또한, 글루코코르티코이드의 모든 작용은 아니지만 일부 작용을 단지 모방하는 화합물이 있는데; 이러한 화합물은 SEGRAs (선택적 글루코코르티코이드 수용체 작동제)로서 지칭된다. SEGRA's/SEGRM's의 예는 마프라코레이트 (= BOL303242X = ZK245186), 화합물 A, RU24856, RU24782, RU40066, ZK 216348을 포함한다.

주로 국부 적용 (예를 들어, 분무-폐, 좌제-결장, 크림-피부)을 위한 스테로이드: 히드로코르티손, 베클로메타손, 부데소니드, 플루티카손, 플루니솔리드, 모메타손, 시클레소니드, 클로베타손.

대식세포 및 T-세포 MIF 생성이 설치류에서 글루코코르티코이드에 의해 억제되기보다는 오히려 유도되었다는 사실을 발견한 것은 극히 놀라운 일이었다 (문헌 [Calandra T, Bernhagen J, Metz CN et al., (1995) MIF as a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production. Nature 377:68-71]; 및 [Bacher M, Metz CN, Calandra T, et al., (1996) An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T-cell activation. PNAS 93: 7849-7854] 참조).

MIF는 염증 유발성을 지닌 것으로 공지되었기 때문에, 이들 결과는 처음에는, 역설적이고 해결하기 어려운 것 같았다. 그러나 그 후에, MIF는 실제로, 글루코코르티코이드의 소염 면역억제성보다 우위에 있다는 사실이 밝혀졌다.

글루코코르티코이드가 몇 가지 상이한 질환 및 장애 (하기 참조)의 치료에 유용하고 성공적인 것으로 나타나긴 하였지만, 이를 투여하는 것은 사용된 의약의 유형에 따라서, 특정 범위의 부작용을 가져올 수 있다. 가장 흔한 부작용은 다음을 포함한다:

· 면역억제

· 증가된 글루코스 신합성, 인슐린 내성 및 내당능 장애로 인한 고혈당증 ("스테로이드 당뇨병")

· 증가된 피부 연약성, 멍이 잘듬

· 감소된 장 칼슘 흡수로 인한 부정적인 칼슘 균형

· 스테로이드-유도된 골다공증; 감소된 골 밀도 (골다공증, 골괴사, 높아진 골절 위험, 느린 골절 회복)

· 증가된 내장 및 몸통 지방 축적 (복부 비만) 및 식욕 자극으로 인한 체중 증가

· 부신 기능부전증 (장기간 사용하였다가 점차적으로 줄이지 않고 갑자기 중단하였을 경우에 발생함)

· 근육 파손 (단백질 분해), 약화; 감소된 근육 질량 및 회복

· 뺨 지방체의 팽창 및 피부의 미소 혈관의 확장

· 무배란, 생리 주기의 불규칙함

· 성장 장애, 사춘기 지연

· 증가된 혈장 아미노산, 증가된 우레아 형성; 부정적인 질소 균형

· 중추 신경계에 대한 흥분 효과 (행복감, 정신병)

· 증가된 두개골 압력으로 인한 녹내장

· 백내장.

합성이든 아니면 내인성이든지 간에, 과량의 장기적인 글루코코르티코이드에 의해 야기된 임상 문제의 조합이 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome)으로 명명된다.

상기 열거된 효과 이외에도, 고 용량 스테로이드를 1주 초과하여 사용하게 되면 환자의 부신이 억제되기 시작하는데, 이는 외인성 글루코코르티코이드가 시상 하부의 부신피질 자극 호르몬-방출 호르몬 (CRH)과 뇌하수체 부신피질 자극 호르몬 (ACTH)을 억제하기 때문이다. 장기간 억제하는 경우, 부신이 위축되고 (물리적으로 수축된다), 외인성 글루코코르티코이드의 중단 후에 완전한 기능을 회복하는 데 수 개월이 소요될 수 있다.

이러한 회복 기간 동안, 환자는 질병과 같은 스트레스의 시간 동안 부신 기능 부전증에 취약할 수 있다.

마지막이긴 하지만 역시 중요하게도, 오랜 기간에 걸쳐 글루코코르티코이드를 투여한 환자에게서 글루코코르티코이드 내성이 발생할 수도 있다. 이들 환자에게는, 심지어 고 용량의 글루코코르티코이드도 적절한 소염 반응을 유발시키기에 충분하지 않다 (문헌 [Barnes PJ, Adcock IM. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases. Lancet 2009 May 30; 373(9678):1905-1917] 참조).

상기 열거된 부작용은 소정의 글루코코르티코이드 약물의 투여량을 늘리는 경우에 심하게 증가된다. 투여된 약물의 양을 감소시키면, 통상적으로 보다 낮거나 완화된 부작용이 야기될 것이다.

따라서, 당해 분야에서는, 소정의 글루코코르티코이드의 투여 용량을 감소시킬 수 있는, MIF-관련 질환 및 장애에 대한 요법을 제공하는 것이 여전히 긴급하게 요망된다.

발명의 설명

상기 목적은 본 발명에 의해 해결되었다.

특히, 항-MIF 항체와 소정의 글루코코르티코이드의 조합 요법에 의해, 보다 저 투여량의 글루코코르티코이드를 이용하여 MIF-관련 질환을 치료할 수 있게 해주고/해주거나 글루코코르티코이드 단독을 이용하여 상기 질환을 치료하는 것과 비교해서 유사한 투여량으로 보다 높은 효과를 달성할 수 있게 해주는 상승적 효과를 탐지할 수 있는 것으로 나타났다.

특히, 항-oxMIF 항체와 소정의 글루코코르티코이드의 조합 요법에 의한 치료는 상기 언급된 바와 같고 본 발명의 실시예에 예시된 바와 같은 상승적 효과와 연관이 있는 것으로 나타났다.

각종 질환의 발병 후에, 특히 염증성 질환 또는 암의 발병 후에 상승된 MIF 수준 (즉, 일반적으로 MIF의 수준)이 탐지된다. 그러나, MIF는 건강한 대상체에게서도 순환되므로, 이를 명확히 구별하는 것은 어렵다. 이와는 달리, oxMIF는 건강한 대상체에게 존재하지 않는다. oxMIF는 질병 상태에서는 증가되고, 예를 들어 혈액, 혈청 및 뇨와 같은 환자의 샘플에서 탐지 가능하다.

MIF 및 그에 대한 항체를 철저히 조사한 후에, 항체 RAB9, RAB4 및 RAB0가 oxMIF와 특이적으로 결합하는 것으로 (그리고, 이들 항체는 redMIF와 결합할 수 없는 것으로) 밝혀졌다. 이러한 결합은 또한, 항체 RAM9, RAM4 및 RAM0에 대해서도 관찰된다.

본 발명자들에 의해 수행된 초기 연구에서는, 산화적 과정, 예컨대 시스틴-매개된 산화, GSSG (ox.글루타치온)-매개된 산화, 또는 MIF와 프로클린300(Procline300) 또는 단백질 가교결합제 (예를 들어, BMOE)의 항온 배양이 MIF를 상기 언급된 항체들과 결합하게 해주는 것으로 나타났다.

본 발명자들에 의해 도달된 놀라운 결론은 다음과 같다:

· 재조합 MIF (인간, 뮤린, 래트, CHO, 원숭이)를 산화 환원 조절 (시스틴/GSSG-매개된 경도 산화)하거나, 또는 재조합 MIF를 프로클린300 또는 단백질 가교결합제로 처리하면, 백스터(Baxter)의 항-MIF 항체 RAB9, RAB4 및 RAB0의 결합이 야기된다.

· oxMIF를 환원시키면, Ab 결합성이 상실된다.

· oxMIF-이소형에 대한 특이성은 생체 내에서의 생물학적 Ab 효능과 상관이 있다.

· oxMIF 수준은 질환 상태와 상관이 있을 수 있다.

(ox)MIF에 관한 상기 부가의 지식은 본 발명자들의 추가 연구를 위한 기본으로서 제공되었다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 다음과 같다:

1. 글루코코르티코이드-수용적 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.

2. 글루코코르티코이드 수용적 질환이 글루코코르티코이드로의 치료에 대해 반응하는, 항목 1에 따르는 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.

3. 염증, 알레르기, 암 또는 천식을 치료하는 데 사용하기 위한, 항목 1 또는 2에 따르는 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.

4. 항체가 항-oxMIF 항체인, 항목 1, 2 또는 3에 따르는 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.

5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 다음 군으로부터 선택되는 조합물: 항-MIF 항체 RAB9, RAB4, RAB0, RAM9, RAM4 및/또는 RAM0.

6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 글루코코르티코이드가 글루코코르티코이드 수용체 작동제, 예를 들어 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 덱사메타손, 파라메타손, 플루오르코르톨론, 부데소니드, 플루티카손, 플루니솔리드, 시클레소니드, 모메타손, 클로베타손, 코르티손 및 히드로코르티손, 및 소염 SEGRA's/SEGRM's (예를 들어, 마프라코레이트 (= BOL303242X = ZK245186), 화합물 A, RU24856, RU24782, RU40066, ZK 216348)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조합물.

7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, RAB4 또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0 중 어느 하나, 바람직하게 항체 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 염증, 특히 신염, 보다 더 바람직하게 루푸스 신염, 사구체신염, IgA 또는 IgM 신병증, 전신성 혈관염 [예를 들어, 결절성 다발성 동맥염, 베게너(Wegener) 육아종증 및 헤노흐-쇤라인(Henoch-Schoenlein) 자반증], 항-GBM 신염 및/또는 급속히 진행성인 사구체신염 (유형 I, II, III 또는 IV), 예를 들어 ANCA (항-호중구 세포질 항체) 신염인 조합물.

8. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, RAB4 또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0 중 어느 하나, 바람직하게 항체 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 루푸스 신염인 조합물.

9. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, RAB4 또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0 중 어느 하나, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 전신성 홍반성 루푸스인 조합물.

10. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, RAB4 또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0 중 어느 하나, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 덱사메타손 및 (메틸)프레드니솔론의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 피부 염증인 조합 요법.

11. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, RAB4 또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0 중 어느 하나, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 덱사메타손 및 (메틸)프레드니솔론의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드 또는 히드로코르티손이며, MIF-관련 질환이 T-세포 매개된 면역 반응에 의해 유발되는 조합 요법.

12. 항목 10 또는 11에 있어서, T-세포 매개된 면역 반응이 피부 염증, 예를 들어 건선 또는 접촉성 과민증인 조합 요법.

13. 항목 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 글루코코르티코이드가 부데소니드이고, 이러한 부데소니드가 국소 적용용으로 제제화되는 조합 요법.

14. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, RAB4 또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0 중 어느 하나, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 염증성 장 질환 (IBD)이며, IBD가 궤양성 결장염 및 크론병(Crohn Disease)으로부터 선택되는 조합 요법.

15. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, RAB4 또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0 중 어느 하나, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 다발성 경화증인 조합 요법.

16. 상기 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 따르는 조합물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.

17. 글루코코르티코이드 수용적 질환, 특히 염증, 알레르기, 천식 또는 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 상기 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 따르는 조합물, 또는 항목 16의 키트.

상기 언급된 항체는 그들의 서열에 의해서뿐만 아니라 각각의 상기 언급된 항체 RAB0, RAB4 및 RAB9 각각, 및 RAM0, RAM4 및 RAM9 각각의 경쇄 또는 중쇄를 포함하는, 이. 콜라이 (E. coli) (균주 TG1)내의 플라스미드로서의 기탁물에 의해 명확히 규명되고 뒷받침된다.

상기 플라스미드는 부다페스트 조약 하에 저먼 컬렉션 오브 마이크로오가니즘 앤드 셀 컬쳐 [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ); 독일 브라운슈바이크 마쉐로더 베크 1베]에 기탁시 수득된 바와 같은 공식 번호인 그들의 DSM 번호로써 명확히 규명된다. 이들 플라스미드는 각각 이. 콜라이 균주로 기탁되었다.

DSM 25110 번호를 갖는 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB4의 경쇄 서열을 포함한다.

DSM 25112 번호를 갖는 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB4의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.

플라스미드 DSM 25110 및 DSM 25112를 적합한 숙주 세포에서 공동-발현시키면, 바람직한 항-MIF 항체 RAB4가 생성된다.

DSM 25111 번호를 갖는 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB9의 경쇄 서열을 포함한다.

DSM 25113 번호를 갖는 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB9의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.

플라스미드 DSM 25111 및 DSM 25113을 적합한 숙주 세포에서 공동-발현시키면, 바람직한 항-MIF 항체 RAB9가 생성된다.

DSM 25114 번호를 갖는 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB0의 경쇄 서열을 포함한다.

DSM 25115 번호를 갖는 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB0의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.

플라스미드 DSM 25114 및 DSM 25115를 적합한 숙주 세포에서 공동-발현시키면, 바람직한 항-MIF 항체 RAB0이 생성된다.

RAM0, RAM4 및 RAM9 각각의 경쇄 및 중쇄 서열에 대한 부가 플라스미드를 2012년 4월 12일자로 부다페스트 조약에 따라서 DSMZ에 다음과 같이 기탁하였다:

RAM9 (중쇄): 이. 콜라이 GA.662-01.pRAM9hc - DSM 25860.

RAM4 (경쇄): 이. 콜라이 GA.906-04.pRAM4lc - DSM 25861.

RAM9 (경쇄): 이. 콜라이 GA.661-01.pRAM9lc - DSM 25859.

RAM4 (중쇄): 이. 콜라이 GA.657-02.pRAM4hc - DSM 25862.

RAM0 (경쇄): 이. 콜라이 GA.906-01.pRAM0lc - DSM 25863.

RAM0 (중쇄): 이. 콜라이 GA.784-01.pRAM0hc - DSM 25864.

용어 "예방적" 또는 "치료적" 처치는 당해 분야에 인식되어 있고, 특정 약물을 환자에게 투여하는 것을 지칭한다. 원치 않는 병태 (예를 들어, 숙주 동물의 질환 또는 기타 원치 않는 상태)의 임상 징후 이전에 투여하는 경우, 상기 처치는 예방적인데, 즉 원치 않는 병태가 발생하는 것으로부터 숙주를 보호해주는 반면, 원치 않는 병태의 징후 후에 투여하는 경우, 이러한 처치는 치료적이다 (즉, 기존의 원치 않는 병태 또는 그로부터의 부작용을 감소, 완화 또는 유지시키고자 한다).

본원에 사용된 바와 같은 항-(ox)MIF 화합물은 (ox)MIF의 생물학적 활성을 약화시키거나, 억제하거나, 대항하거나, 상쇄시키거나 또는 감소시키는 어느 작용제를 지칭한다. 항-(ox)MIF 화합물은 (ox)MIF 활성을 억제하거나 중화시키는 작용제, 예를 들어 항체, 특히 바람직하게 본원에 기재된 바와 같은 항체, 보다 더 바람직하게 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0일 수 있다.

본 발명에 따르는 바람직한 MIF 길항제는 항-MIF 항체이다. 보다 더 바람직하게, 항-MIF 항체는 oxMIF에 대한 항체이다. 기타 실시양태에서, 항-oxMIF 항체, 예를 들어 상기 언급된 항체 또는 그의 항원 결합성 부분은 100 nM 미만의 K_D, 바람직하게 50 nM 미만의 K_D, 보다 더 바람직하게 10 nM 미만의 K_D로 oxMIF와 결합한다.

본 발명은 추가로, 항-MIF 항체 또는 그의 항원 결합성 부분뿐만 아니라 본 발명에 따르는 글루코코르티코이드제를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 상기 항체와 글루코코르티코이드제 이외에도, 추가의 치료제 및 그의 용도를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 치료적 방법에 있어서의 사용 설명서를 포함할 수 있다.

초기 결과는 oxMIF와만 결합하고 redMIF와는 결합하지 않으며, GCO 및/또는 세포 증식을 추가로 억제하는 항-MIF 항체가 동물 모델에서 유익한 효과를 유도시킨다고 제시하였다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 첨부된 바와 같은 도면에 추가로 기재되어 있다.

도 1: 실시예 1a에서 수행된 바와 같이 덱사메타손을 이용한 용량-찾기 처리의 도식적 다이아그램.
도 2: 몇 가지 상이한 용량의 덱사메타손의 투여 후 8일째의 단백뇨.
도 3: 몇 가지 용량의 덱사메타손의 투여 후 대식세포 침윤. 사구체 단면적당 대식세포 (ED1 양성 세포)의 수를 결정하였다. 각 동물에 대한 결과뿐만 아니라 각 군에 대한 평균이 제시된다.
도 4: 몇 가지 용량의 덱사메타손의 투여 후 사구체 반월체. 각 동물에 대해 결정된 사구체 반월체의 비율이 표시되고, 각 군에 대한 평균이 제시된다.
도 5: 실시예 1b에 따르는 글리신 제제에서 항-MIF 항체 RAM9에 대한 용량 찾기의 도식적 다이아그램.
도 6: 2가지 용량의 항체 RAM9의 투여 후 8일째의 단백뇨.
도 7: 2가지 용량의 항체 RAM9의 투여 후 대식세포 침윤. 사구체 단면적당 대식세포 (ED1 양성 세포)의 수를 결정하였다. 각 동물에 대한 결과뿐만 아니라 각 군에 대한 평균이 제시된다.
도 8: 2가지 용량의 항체 RAM9의 투여 후 사구체 반월체 형성. 각 동물에 대해 결정된 사구체 반월체의 비율이 표시되고, 각 군에 대한 평균이 제시된다.
도 9: 실시예 1c에 따르는 덱사메타손과 항체 RAM9의 조합에 대한 치료 스케줄의 도식적 다이아그램.
도 10: 항체 RAM9 (용량 범위 0 내지 120 mg/kg)와 덱사메타손 (0.025 mg/kg)을 이용한 조합 치료 후 단백뇨의 감소. 2가지 독립적인 실험의 평균을 도시한다. 화살표는 항체를 적용하지 않고서 상이한 용량의 덱사메타손에 의한 단백뇨의 감소 %를 나타낸다.
도 11: 항체 RAM9 (용량 범위 0 내지 120 mg/kg)와 덱사메타손 (0.025 mg/kg)을 이용한 조합 치료 후 관찰된 대식세포 침윤의 감소. 2가지 독립적인 실험의 평균을 도시한다. 화살표는 항체를 적용하지 않고서 상이한 용량의 덱사메타손에 의한 대식세포 침윤의 감소 %를 나타낸다.
도 12: 항체 RAM9 (용량 범위 0 내지 120 mg/kg)와 덱사메타손 (0.025 mg/kg)을 이용한 조합 치료 후 반월체 형성의 감소. 2가지 독립적인 실험의 평균을 도시한다. 화살표는 항체를 적용하지 않고서 상이한 용량의 덱사메타손에 의한 반월체 형성의 감소 %를 나타낸다.
도 13: DNFB 에 대한 접촉성 과민증 ( CHS ) 반응. 히드로코르티손을 적용하지 않고서 (-HC) RAM9로 처리된 마우스와 비교해서, 히드로코르티손과 조합해서 (+HC) 항-MIF (RAM9)로 처리된 마우스의 시험감염된 귀에 대한 약화된 CHS 반응. 이소형 대조군 항체 처리된 마우스 (히드로코르티손의 국부 적용을 수반하거나 수반하지 않음)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 군당 8마리 마우스를 사용하였고, 우측 귀 (시험감염됨)와 좌측 귀 (시험감염되지 않음) 간의 귀 두께 차이를 측정함으로써, 감소된 귀 접촉성 피부염을 정량화하였다.

정의 및 일반적 기술

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 연계해서 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학과 관련되어 사용되는 명명법 및 이의 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 흔히 사용되는 것이다. 달리 표시되지 않는 한 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로, 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서 수행하고, 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 각종 일반적 및 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행한다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] 참조).

"MIF" 또는 "대식세포 이동 억제 인자"는 면역 및 염증 반응에 있어서 중요한 매개인자로서 공지되고 글루코코르티코이드의 역조절인자로서 공지되는 단백질을 지칭한다. MIF는 포유류 MIF, 구체적으로 인간 MIF [스위스-프로트(Swiss-Prot) 일차 승인 번호: P14174)]를 포함하는데, 여기서 단량체 형태는 115개 아미노산 단백질로서 암호화되지만, 개시 메티오닌의 절단으로 인해 114개 아미노산 단백질로서 생성된다. "MIF"는 또한, "GIF" (글리코실화-억제성 인자) 및 기타 형태의 MIF, 예컨대 MIF의 융합 단백질을 포함한다. MIF의 아미노산의 넘버링은 N-말단 메티오닌 (아미노산 1)으로 시작하고, C-말단 알라닌 (아미노산 115)으로 종결된다.

"산화된 MIF" 또는 oxMIF는 본 발명의 목적상 경도 산화성 시약, 예컨대 시스틴으로 MIF를 처리함으로써 발생하는 MIF의 이소형으로서 정의된다. 본 발명에 의해 제시된 바와 같이, 이러한 방식으로 처리한 재조합 oxMIF는, (예를 들어) 동물을 세균으로 시험감염(challenge)시킨 후 생체 내에서 발생하는 oxMIF와 구조적 재배열을 공유하는 MIF의 이소형(들)을 포함한다.

redMIF는 본 발명의 목적상 환원된 MIF로서 정의되고, RAB0, RAB9 및/또는 RAB4와 결합하지 않는 MIF이다.

본 발명에 기재된 항-oxMIF 항체는 경도 산화 또는 환원에 의해 각각 생성되는 ox MIF와 red MIF 간을 식별할 수 있다. 항-oxMIF 항체는 oxMIF를 특이적으로 탐지하는 데 유용하다. 이들 이형태체 간의 식별은 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명에 의해 평가한다. 양 기술은 당업자에게 널리 공지된 바와 같고 다음에 기재되는 바와 같이 수행할 수 있다.

비아코어(Biacore)에 의해 항체의 차등 결합을 평가함

항체 RAB9 및 RAB0에 대한 oxMIF 및 redMIF의 결합 역학은 비아코어 3000 시스템을 이용하여 표면 플라스몬 공명 분석함으로써 조사한다. 상기 항체를 CM5 (= 카르복시메틸화 덱스트란) 칩 상에 코팅하고, 0.2% 프로클린300과 함께 예비-항온 배양한 재조합 MIF 단백질을 주사하였다. (프로클린300은 oxMIF 구조를 안정화시키는 산화성 이소티아졸론으로 이루어진다). 프로클린300을 첨가하지 않은 천연 HBS-EP 완충제 (= 비아코어 수행 완충제)에서는, 어떠한 재조합 MIF 단백질도 RAB9, RAB0, 또는 음성 (배경) 결합 대조군으로서 사용된 기준 항체 (무관한 이소형 대조군 항체)와 전혀 결합하지 않았다.

바람직한 실시양태에서, oxMIF는 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0, 또는 그의 항원 결합성 단편에 의해 차등적으로 결합되는 MIF인데, 이는 이들 항체가 oxMIF와는 결합하는 반면, redMIF는 이들 항체 중 어느 하나에 의해서도 결합되지 않는다는 것을 의미한다.

기타 실시양태에서, 항-oxMIF 항체, 예를 들어 상기 언급된 항체 또는 그의 항원 결합성 부분은 100 nM 미만의 K_D, 바람직하게 50 nM 미만의 K_D, 보다 더 바람직하게 10 nM 미만의 K_D로 oxMIF와 결합한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 5 nM 미만의 K_D로 oxMIF와 결합한다.

(oxMIF 또는 redMIF에 대한) 항체, 예를 들어 RAB9, RAB4 또는 RAB0의 (비-)결합도는 당업자에게 일반적으로 공지된 바와 같이 결정할 수 있고, 그 예는 다음 방법 중 어느 하나이다: 그의 환원된 또는 산화된 상태의 재조합 MIF를 이용한 ELISA, 또는 그의 환원된 또는 산화된 상태의 재조합 MIF를 이용한 표면 플라스몬 공명, 예컨대 상기 언급된 널리 공지된 비아코어 검정.

결합도를 결정하는 데 바람직한 방법은, 예를 들어 재조합 (ox)MIF에 대한 항체의 표면 플라스몬 공명인데, 이때 "결합도"는 100 nM 미만의 K_D, 바람직하게 50 nM 미만의 K_D, 보다 더 바람직하게 10 nM 미만의 K_D로써 나타내는 것을 의미하는 반면, redMIF에 대한 비-결합도는 400 nM 초과의 K_D를 특징으로 한다. "결합도" 및 "특이적 결합도"는 상기를 의미하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 출원의 맥락에서 "차등 결합도"는 화합물, 특히 본원에 기재된 바와 같은 항체가 oxMIF와 결합하지만 (예를 들어, 상기 언급된 K_D 값을 수반한다), 이들 항체가 redMIF와는 결합하지 않는다는 (비-결합도는 다시 상기와 같이 정의된다) 것을 의미한다.

"항체"는 온전한 항체이거나, 또는 (특이적) 결합을 놓고 온전한 항체와 경쟁하는 항원 결합성 부분을 지칭한다. 일반적으로, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] 참조. 용어 항체는 인간 항체, 포유류 항체, 단리된 항체 및 유전적으로 조작된 형태, 예컨대 키메라, 카멜화 또는 인간화 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

용어 항체의 "항원 결합성 부분"은 항원 (예를 들어, (ox)MIF)과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항원 결합성 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합성 부분은, 예를 들어 다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다: Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 키메라 항체, 폴리펩티드, 즉 ox 또는 redMIF에 대한 특이적 항원 결합성을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부분을 함유하는 항체 및 폴리펩티드. N-말단에서부터 C-말단까지, 성숙한 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다는 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각 도메인에 배정하는 것은 다음 문헌의 정의에 따른다 (문헌 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], [Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)], 또는 [Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)] 참조). 항체 또는 그의 항원 결합성 부분은 유도체화하거나 또는 또 다른 기능적 분자 (예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합성 부분은 하나 이상의 기타 분자상 실체, 예컨대 또 다른 항체 (예를 들어, 이중-특이적 항체 또는 디아보디), 탐지 가능한 작용제, 세포독성제, 제약제, 및/또는 연결성 분자와 기능적으로 연결될 수 있다.

용어 "K_D"는 본원에서 당업자의 일반적 지식에 따라서, 각각의 항원과의 특별한 항체의 평형 해리 상수를 지칭한다. 이러한 평형 해리 상수는 친화도를 측정한다. 친화도는 평형시 (결합과 해리가 균형을 이루는 정지 상태) 얼마나 많은 복합체가 형성되는 지를 결정한다 (본원에서는, ox 또는 redMIF 및 항체).

k_a = 결합 속도 상수 [M^-1 s^-1]

k_d = 해리 속도 상수 [s^-1]

K_D = 평형 해리 상수 = kd/ka [M]

용어 "인간 항체"는 가변 및 불변 도메인이 인간 서열인 어느 항체를 지칭한다. 상기 용어는 인간 유전자로부터 유래된 서열을 수반하긴 하지만, 예를 들어 가능한 면역원성을 감소시키거나, 친화도를 증가시키거나, 바람직하지 못한 폴딩을 유발시킬 수도 있는 시스테인을 제거하기 위해 변화시킨 바 있는 항체를 포괄한다. 상기 용어는, 예를 들어 인간 세포의 전형적이지 않은 글리코실화를 부여할 수도 있는, 비-인간 세포에서 재조합적으로 생성된 상기 항체를 포괄한다.

용어 "인간화 항체"는 인간 서열을 포함하고 또한, 비-인간 서열을 함유하는 항체를 지칭하는데, 특히 "인간화 항체"는 인간 서열을 부가하였고/하였거나 인간 서열이 비-인간 서열을 대체한 비-인간 항체를 지칭한다.

용어 "카멜화(camelized) 항체"는 카멜리드 항체로 명시되기도 하는, 카멜로부터의 항체와 보다 근접하게 유사하도록 항체 구조 또는 서열을 변화시킨 항체를 지칭한다. 카멜화 항체를 설계 및 생성하는 방법은 당업자의 일반적인 지식 중 일부이다.

용어 "키메라 항체"는 2가지 이상의 상이한 종으로부터의 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.

용어 "단리된 항체" 또는 "그의 단리된 항원 결합성 부분"은 파지 디스플레이 라이브러리 또는 B-세포 레퍼토리와 같은 항체 공급원으로부터 확인되고 선별된 항체 또는 그의 항원 결합성 부분을 지칭한다.

본 발명에 따르는 항-(ox)MIF 항체의 생성은, 예를 들어 RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통하여 유전자 조작하고, 발현 벡터 내로 클로닝시킴으로써 재조합 DNA를 생성시키는 어떠한 방법도 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스성 벡터인데, 여기서는 부가의 DNA 절편을 바이러스성 게놈 내로 연결시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 이것이 도입되는 숙주 세포에서 자기 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균성 복제 기원을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜성 포유류 벡터). 기타 실시양태에서, 벡터 (예를 들어, 비-에피솜성 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 이러한 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "발현 벡터")로서 지칭된다.

항-(ox)MIF 항체는 특히, 통상적인 발현 벡터, 예컨대 세균성 벡터 (예를 들어, pBR322 및 그의 유도체), 또는 진핵성 벡터를 통하여 생성될 수 있다. 상기 항체를 암호화하는 서열에는 숙주 세포로부터의 복제, 발현 및/또는 분비를 조절해주는 조절성 서열이 제공될 수 있다. 이들 조절성 서열은, 예를 들어 프로모터 (예를 들어, CMV 또는 SV40) 및 신호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 또한, 선별 및 증폭 마커, 예컨대 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 (DHFR), 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 및 티미딘-키나제를 포함할 수 있다. 사용된 벡터의 성분, 예컨대 선별 마커, 레플리콘, 증강인자는 상업적으로 수득할 수 있거나 또는 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 벡터는 각종 세포 배양물, 예를 들어 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK293, NSO, 섬유아세포, 곤충 세포, 효모 또는 세균, 예컨대 이. 콜라이에서 발현하도록 구축될 수 있다. 일부 경우에는, 발현된 단백질의 최적의 글리코실화를 허용해 주는 세포를 사용한다.

항-(ox)MIF 항체 경쇄 유전자(들) 및 항-(ox)MIF 항체 중쇄 유전자(들)를 별개의 벡터 내로 삽입할 수 있거나 또는 상기 유전자를 동일한 발현 벡터 내로 삽입한다. 이러한 항체 유전자는 표준 방법, 예를 들어 상보성 제한 부위를 항체 유전자 단편 및 벡터 상에 연결시키거나, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우에는, 평활 말단 연결시킴으로써 발현 벡터 내로 삽입한다.

항-(ox)MIF 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 생성은 형질감염에 의해, 예를 들어 전기천공 또는 미세주사를 통하여 재조합 DNA를 진핵 세포 내로 도입하기 위해 당해 분야에 공지된 어떠한 방법도 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-(ox)MIF 항체의 재조합 발현은 하나 이상의 조절성 서열, 예컨대 강력한 프로모터의 제어 하에 항-(ox)MIF 항체 암호화 DNA 서열을 함유하는 발현 플라스미드를 적당한 형질감염 방법에 의해 적합한 숙주 세포주 내로 도입하여, 게놈 내로 안정적으로 통합된 도입된 서열을 갖는 세포가 생성되도록 함으로써 달성할 수 있다. 리포펙션(lipofection) 방법은 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 형질감염 방법의 한 예이다.

항-(ox)MIF 항체의 생성은 또한, 상기 형질전환된 세포를, 예를 들어 연속식 또는 배치식으로 배양하기 위해 당해 분야에 공지되고, 예를 들어 구성적 또는 유도시 항-(ox)MIF 항체의 발현을 위해 당해 분야에 공지된 어떠한 방법도 포함할 수 있다. 이는 항-(ox)MIF 항체의 생성을 위한 추가 참조를 위해 특히 WO 2009/086920에 언급되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라서 생성된 바와 같은 항-(ox)MIF 항체는 oxMIF 또는 그의 에피토프와 결합한다. 본 발명에 따르는 특히 바람직한 항체는 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0이다. 또 다른 바람직한 항체는 RAM9, RAM4 및/또는 RAM0이다.

이들 항체의 서열은 WO 2009/086920에 개시되어 있는데; 또한, 본 출원의 서열 목록 및 다음을 참조할 수 있다:

서열 1: RAB9의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 2: RAB4의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 3: RAB0의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 4: RAB2의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 5: RAB9의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 6: RAB4의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 7: RAB0의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 8: RAB2의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 9: RAM0hc의 아미노산 서열:

서열 10: RAM0lc의 아미노산 서열:

서열 11: RAM9hc의 아미노산 서열:

서열 12: RAM9lc의 아미노산 서열:

서열 13: RAM4hc의 아미노산 서열:

서열 14: RAM4lc의 아미노산 서열:

본 발명의 항-MIF 항체는 바람직하게, 단리된 모노클로날 항체이다. 이러한 항-MIF 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있다. 기타 실시양태에서, 항-MIF 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아부류이다. 기타 실시양태에서, 항체는 아부류 IgG1 또는 IgG4이다. 기타 실시양태에서, 항체는 아부류 IgG4이다. 일부 실시양태에서, IgG4 항체는 세린 (세린 228)을 프롤린으로 변화시키는 단일 돌연변이를 갖는다. 따라서, IgG4의 Fc 영역 중의 CPSC 부-서열은 CPPC가 되는데, 이는 IgG1에서의 부-서열이다 (문헌 [Angal et al. MolImmunol. 1993, 30, 105-108] 참조).

부가적으로, 항-(ox)MIF 항체의 생성은, 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화 크로마토그래피를 통하여 항체를 정제하기 위해 당해 분야에 공지된 어떠한 방법도 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항-(ox)MIF 항체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

용어 MIF의 "중심 영역" 및 "C-말단 영역"은 각각 인간 MIF의 아미노산 35-68 및 aa 86-115, 바람직하게 각각 aa 50-68 및 aa 86 내지 102를 포함하는 인간 MIF의 영역을 지칭한다.

본 발명의 특히 바람직한 항체는 인간 MIF의 영역 aa 50-68 또는 영역 aa 86-102와 결합한다. 이는 또한, 다음과 같이 결합하는 바람직한 항체 RAB0, RAB4, RAB2 및 RAB9 뿐만 아니라 RAM4, RAM0 및 RAM9의 에피토프 결합성에 의해 반영된다:

RAB4 및 RAM4: aa 86-102

RAB9 및 RAM9: aa 50-68

RAB0 및 RAM0: aa 86-102

RAB2: aa 86-102.

따라서, RAM4 및 RAB4는 RAM9 및 RAB9와 동일한 특이성을 갖는다. 이는 RAM0 및 RAB0에 대해서도 마찬가지로 적용된다. 이는 또한, 이들 항체를 이용하여 유사한 결과가 수득될 것이라는 것을 나타내는, 수행된 실시예에 의해 반영된다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체 단편과 특이적으로 결합할 수 있는 어떠한 단백질 결정기도 포함한다. 에피토프 결정기는 통상적으로, 노출된 아미노산, 아미노 당, 또는 기타 탄수화물 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 집단으로 이루어지고, 통상적으로 특이적인 3차원적 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다.

용어 "벡터"는 그와 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 즉 부가의 DNA 절편이 연결될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프이다.

용어 "숙주 세포"는 발현 벡터를 도입한 후 재조합 단백질을 생성할 수 있는 세포주를 지칭한다. 용어 "재조합 세포주"는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포주를 지칭한다. "재조합 세포주"가 특별한 대상체 세포주 뿐만 아니라 이러한 세포주의 자손도 의미한다는 것을 인지해야 한다. 돌연변이 또는 환경상 영향으로 인해 특정의 변형이 다음 세대에 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실상, 부모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 세포주"의 범위 내에 여전히 포함된다.

본 발명에 따르는 숙주 세포 유형은, 예를 들어 COS 세포, CHO 세포, 또는 예를 들어, HEK293 세포, 또는 당업자에게 공지된 기타 모든 숙주 세포이므로, 예를 들어 이. 콜라이 세포와 같은 세균성 세포를 또한 포함한다. 한 실시양태에서, 항-MIF 항체는 DHFR-결핍성 CHO 세포주, 예를 들어 DXB11에서, 선별 마커로서 G418의 부가 하에 발현된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 CHO 숙주 세포 내로 도입하는 경우, 상기 항체는 이 항체를 숙주 세포에서 발현시킬 수 있거나 또는 항체를 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비시킬 수 있기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다.

항-(ox)MIF 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

본 발명에 의해 제공된 바와 같은 조합 요법의 제2 활성 성분은 글루코코르티코이드이다.

종종 글루코코르티코스테로이드로 지칭되기도 하는 글루코코르티코이드는 거의 모든 척추 동물에 존재하는, 글루코코르티코이드 수용체 (글루코코르티코이드 수용체 α)와 결합하는 특정 부류의 스테로이드 호르몬이다. 글루코코르티코이드는 면역 활성 (즉, 염증)을 거절하는 면역계의 피드백 기전의 일부이다. 의약에서는, 이들이 과활동성 면역계에 의해 유발되는 질환을 치료하기 위해 사용되는데, 이러한 질환에 대한 예는 알레르기, 천식, 자가면역 질환 및 패혈증이다. 이들은 또한, 암 세포에서 일부 비정상적인 기전을 방해하므로, 암을 치료하는 데 사용되기도 한다. 글루코코르티코이드 수용체와의 결합시, 이와 같이 활성화된 글루코코르티코이드 수용체 복합체는 전사활성화로서 공지된 공정에 의해 핵에서의 소염 단백질의 발현을 상향 조절하고, 시토졸에서의 염증 유발성 단백질의 발현을 억제한다. 원칙적으로, 글루코코르티코이드는 코르티코스테로이드의 서브그룹으로서 정의된다. 또한, 글루코코르티코이드 활성을 지닌 신규 부류의 화합물 (SEGRA, 선택적 글루코코르티코이드 수용체 작동제)이 공지되어 있다.

이들 화합물은 완전한 작동성 글루코코르티코이드의 작용의 일부만을 발휘하는데, 즉 이들은 완전한 스펙트럼의 전사-활성화, 전사-억제, 및 유전자 유도에 대한 간접 작용 (NF-κB, AP1, jun-jun-동종이량체 등을 통하여 이루어짐)을 유발시키지 못한다. 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM's = 타목시펜, 랄록시펜, 토레미펜)에서 유추하여, 이들 화합물은 또한, 선택적 글루코코르티코이드 수용체 조절인자 (SEGRM's)로서 지칭된다. SEGRA's/SEGRM's의 예는 마프라코레이트 (= BOL303242X = ZK245186), 화합물 A, RU24856, RU24782, RU40066, ZK 216348을 포함한다. 이들 화합물 모두는 당해 분야에 보고되었고, 지금까지 당업자에게 널리 공지되어 있다 (특별한 고찰 문헌 [De Bosscher et al., 2010, Curr Opin Pharmacol 10: 497-504] 참조). RU 24856, RU 40066 및 RU 24782는, 예를 들어 문헌 ([Vayssiere et al., 1997, Mol Endocrinol 11:1245-1255] 참조)에 기재되어 있다. 이들은 각각 다음 화학식을 갖는다:

ZK245186은 문헌 ([Proksch et al., 2011, Drug Metab Dispos 39:1181-1187] 및 [Schaecke et al., 2009, Br J Pharmacol, 158(4):1088-103] 참조)에 개시되어 있다. 이는 다음 식을 갖는다: (R)-1,1,1-트리플루오로-4-(5-플루오로-2,3-디히드로벤조푸란-7-일)-4-메틸-2-{[(2-메틸-5-퀴놀릴)아미노]메틸}펜탄-2-올. ZK 216348은 문헌 ([Schaecke et al., 2004, PNAS USA 101:227-232] 참조)으로부터 공지되어 있다. 이는 다음 화학식을 갖는다:

화합물 A는 문헌 ([Rauner et al., 2011, Endocrinology 152:103-112] 참조) 뿐만 아니라 문헌 ([De Bosscher K, Vanden Berghe W, Beck IM, Van Molle W, Hennuyer N, Hapgood J, Libert C, Staels B, Louw A, Haegeman G, 2005, A fully dissociated compound of plant origin for inflammatory gene repression. Proc Natl Acad Sci USA 102:15827-15832] 참조)에 개시되어 있다. 화합물 A는 식 2-(4-아세톡시페닐)-2-클로로-N-메틸-에틸암모늄 클로라이드를 갖는다.

글루코코르티코이드의 중요한 예는 생존에 필수적이고, 각종 중요한 심혈관계, 대사, 면역학적 및 생체 항상성 기능을 조절하거나 지지해주는 코르티솔 (또는 히드로코르티손)이다. 이들은 또한, 입수 가능한 몇 가지 합성 글루코코르티코이드이다.

글루코코르티코이드는 3가지 주요 분야, 즉 면역학적 분야, 대사 분야 및 태아 발달 분야에서 작용한다. 면역 분야에서는 이들이 소염 단백질의 발현을 상향 조절하고, 염증 유발성 단백질의 발현을 하향 조절한다. 대사 효과는 다음과 같이 요약될 수 있다:

· 특히 간에서 글루코스 신합성을 자극함: 이러한 경로로 인해, 아미노산과 같은 비-헥소스 기질로부터 글루코스가 합성되고 트리글리세리드 붕괴로부터 글리세롤이 합성되며, 상기 경로는 육식 동물 및 특정 초식 동물에게 특히 중요하다. 글루코스 신합성에 관여한 효소의 발현을 증강시키는 것이 글루코코르티코이드의 가장 잘 공지된 대사 기능인 것으로 추정된다.

각종 합성 글루코코르티코이드 (이들 중 일부는 코르티솔 보다 한층 더 강력하다)가 치료적 용도를 위해 창출되었다. 이들은 약동학 (흡수 인자, 반감기, 분포 용적, 청소율) 및 약력학에 있어서 상이하다.

본 발명의 맥락에서, "글루코코르티코이드"는 글루코코르티코이드 수용체 알파에서 작용하는 모든 글루코코르티코이드를 의미할 것이다. 특히, 이는 "전통적인" 글루코코르티코이드 수용체 작동제 뿐만 아니라 상기 언급된 SEGRAs를 포괄한다. 바람직한 실시양태에서, NF-κB 경로 및/또는 AP-1 경로를 통하여 작용하는 모든 글루코코르티코이드가 포괄된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 글루코코르티코이드는 모두 ("전통적인") 글루코코르티코이드이다.

이론상, 나중에 어떤 시점에서, 예를 들어 전사활성화 또는 전사억제를 통해서만 작용하지만, NF-κB 경로를 통해서는 작용하지 않는 글루코코르티코이드가 거의 발생하지 않긴 하지만, 존재할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 이들 화합물은 본 발명에 의해 포괄되지 않을 것이다.

NF-κB는 활성화된 B-세포의 핵 인자 카파 경쇄 증강인자이다. 이는 실제적으로 모든 세포 유형 및 조직에 존재하는 특이적 전사 인자이다. DNA의 특별한 조절성 영역과 결합함으로써, 이는 항-아폽토시스 유전자, 카스파제-계열의 유전자, 및 특히 시클로옥시게나제-2 (Cox-2), IL-6 및 TNF-알파와 같은, 표적 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있다.

글루코코르티코이드 효력, 효과 기간, 및 중복 무기질코르티코이드 효력은 다양하다. 코르티솔 (히드로코르티손)은 글루코코르티코이드 효력을 알아보기 위한 표준 비교물이다. 히드로코르티손은 코르티솔의 제약 제제에 사용된 명칭이다. 경구 효력은 비경구 효력보다 덜할 수도 있는데, 이는 상당량 (일부 경우에는 50% 이하)이 내장으로부터 흡수되지 않을 수 있기 때문이다.

본 발명의 바람직한 글루코코르티코이드의 예는 다음과 같다:

히드로코르티손, 코르티손 아세테이트, 코르티손/코르티솔, 플루오로코르톨론,

프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 (특히 전신 투여용), 트리암시놀론,

덱사메타손, 베타메타손, 파라메타손, 부데소니드 (특히 국부 투여용), SEGRAs (선택적 글루코코르티코이드 수용체 작동제).

또한, 글루코코르티코이드의 모든 작용은 아니지만 일부 작용을 단지 모방하는 화합물이 있는데; 이러한 화합물은 SEGRAs (선택적 글루코코르티코이드 수용체 작동제)로서 지칭된다. SEGRA's/SEGRM's의 예는 마프라코레이트 (= BOL303242X = ZK245186), 화합물 A, RU24856, RU24782, RU40066, ZK 216348을 포함한다. SEGRAs는 전형적으로, NF-κB 경로를 통하여 그들의 효과를 발휘한다.

주로 국부 적용 (예를 들어, 분무-폐, 좌제-결장, 크림-피부)을 위한 스테로이드: 히드로코르티손, 베클로메타손, 부데소니드, 플루티카손, 플루니솔리드, 모메타손, 시클레소니드, 클로베타손, 가장 바람직하게 부데소니드.

추가의 바람직한 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 히드로코르티손, 코르티손 아세테이트, 부데소니드, 플루드로코르티손, 덱사메타손, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 것은 (메틸)프레드니솔론, 히드로코르티손 및 덱사메타손이고, 보다 더 바람직한 것은 전신 투여용 (메틸)프레드니솔론이다. 본 발명의 한 실시양태에서 국부 투여용으로 히드로코르티손이 바람직할 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 부데소니드가 국부 투여용으로 바람직하다.

글루코코르티코이드의 염, 에스테르 및/또는 이성체는 모두 본 발명의 범위 내에 포괄되는 것으로 의미되고, 용어 "글루코코르티코이드"에 해당하는 것으로 인지되어야 한다. 이들은 모두 널리 공지되어 있거나 또는 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.

당업자에 의해 공지된 소정의 어떠한 글루코코르티코이드도 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는데; 이들은 상기 언급된 예시적 글루코코르티코이드일 수 있다. 추가로, 글루코코르티코이드의 합성 역시 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

글루코코르티코이드는 몇 가지 질환의 완화 및 치료에 성공적인 것으로 나타났다. 그러나, 대부분의 글루코코르티코이드는, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 특정 범위의 부작용과 연관이 있는데, 이러한 부작용은 일부 경우에는, 치료를 폐기해야 할 정도로 극심하다. 어떠한 경우에도, 상기 부작용은 환자의 신체적 및 정신적 건강에 추가의 부담을 주므로, 가능한 한 피해야 한다.

본 발명을 이용하여, 글루코코르티코이드를 항-MIF 항체와 조합함으로써, 글루코코르티코이드가 유일한 활성 성분으로서 제공되는 상황과 비교해서 소정의 치료에 필요한 글루코코르티코이드의 양을 감소시키는 것이 지금 가능하다. 본 발명에 의해 가능해진 추가의 가능성은 단독으로 제공된 글루코코르티코이드와 비교해서 글루코코르티코이드의 용량을 유지하는 것이고, 환자에게서 훨씬 더 높은 치료 반응을 갖는 것이다.

글루코코르티코이드를 항-MIF 항체와 조합함으로써 수득된 효과로 인해, 여전히 동일한 치료 반응을 유지할 수 있으면서도 글루코코르티코이드의 명백한 용량 감소가 허용되었다는 사실이 다소 놀랍게도 본 발명자들에 의해 제시되었다.

치료 반응은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 이는 소정의 병태를 감소시키거나 호전시키거나 또는 완화시키는 것을 지칭한다. 이를 결정하기 위한 검정은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 특정 질환을 갖는 대상체의 생존 가능성 또는 생존 기간을, 동일한 질환을 갖는 다른 대상체에서의 생존 가능성 또는 생존 기간을 이용해 결정하거나, 또는 특정 기간에 걸쳐 다름 아닌 바로 동일한 환자 내에서 증상의 변화를 결정하는 것일 수 있다.

적합한 검정은, 예를 들어 적혈구 침강 검정인데; 부가의 검정은 본 실시예에 기재된 것이다. 본 발명에 따르는 바람직한 글루코코르티코이드는 코르티손-아세테이트, 히드로코르티손, 플루드로코르티손, 덱사메타손, 부데소니드, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론이다. 특히 바람직한 것은 메틸프레드니솔론, 히드로코르티손, 부데소니드 및 덱사메타손이다. 보다 더 바람직한 것은 전신 투여용 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손, 및 국소 투여용 부데소니드이다.

특히 바람직한 조합은 다음과 같다:

- 덱사메타손과 조합되는 RAM9,

- 부데소니드와 조합되는 RAM9,

- 히드로코르티손과 조합되는 RAM9,

- 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론과 조합되는 RAM9,

- 덱사메타손과 조합되는 RAM0,

- 덱사메타손과 조합되는 RAM4,

- 부데소니드와 조합되는 RAM0,

- 부데소니드와 조합되는 RAM4,

- 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론과 조합되는 RAM0,

- 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론과 조합되는 RAM4,

- 히드로코르티손과 조합되는 RAM4,

- 히드로코르티손과 조합되는 RAM0.

특히 바람직한 실시양태에서, 히드로코르티손 및 부데소니드는 국소/국부 적용을 위해 사용된다.

본 발명의 맥락에서, 특별한 질환 상태를 치료하는 것으로 공지되는 적합한 모든 글루코코르티코이드가 포괄되는 것으로 명백하게 지적된다. 따라서, 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 글루코코르티코이드는 소정의 질환에 대한 각각의 금 표준 치료인 글루코코르티코이드이다.

상기 바람직한 조합은 다음에 정의되는 바와 같은 글루코코르티코이드 수용적 질환을 치료하는 데 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조합 요법은 글루코코르티코이드 수용적 질환을 치료하는 데 특히 적합하다.

본 발명의 맥락에서 "글루코코르티코이드 수용적 질환"은 글루코코르티코이드 요법에 반응하는 질환으로서 정의된다. 글루코코르티코이드 요법에 반응하는 것으로 공지되어 있는 질환은 다음에 열거되는 바와 같다. 본 조합 요법을 고려하여 당업자는 자신이 글루코코르티코이드를 이용한 치료를 고려했었을 질환 상태에 직면하자마자 그 요법을 고려할 것이다.

염증성 질환뿐만 아니라 특정의 암 유형 둘 다가 글루코코르티코이드-수용적 질환인 것으로 널리 공지되어 있다. 양 질환 유형에 대한 표준 글루코코르티코이드 요법이 존재한다. 항-MIF 요법을 이들 표준 글루코코르티코이드 요법과 조합하는 것이 본 발명의 목적이다. 일부 경우에는, 필요한 경우 부작용으로 인해, 표준 글루코코르티코이드 투여량을 감소시키는 것도 가능하다.

바람직한 실시양태에서, 글루코코르티코이드 수용적 질환은 적혈구 침강 검정에서 침강 값의 유의적인 개선이 관찰되는 질환이다. 유의적인 개선은 당업자에 의해 유의적인 것으로 간주되는 바와 같은 개선이다.

따라서, 본 조합 요법으로 치료될 수 있는 특히 바람직한 질환은 다음과 같을 것이다:

염증성 질환, 보다 더 바람직하게, 이러한 염증성 질환은 적응 면역계를 통하여 (즉, B- 및 T-세포를 통하여) 작용하는 질환일 것이다.

보다 더 바람직하게, 글루코코르티코이드 수용적 질환은 알레르기성 질환, 보다 더 바람직하게는 자가면역 장애일 것이다.

이들 질환 모두는 글루코코르티코이드 요법에 반응하는 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 맥락에서 특히 바람직한 질환은 다음과 같다:

- 신염, 특히 사구체신염, 급속히 진행성인 사구체신염 (유형 I, II, III 또는 IV), 전신성 혈관염 (예를 들어, 결절성 다발성 동맥염, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 급성 증식성 사구체신염),

- 루푸스 신염, ANCA 신염, 항-GBM 신염 [예를 들어, 구드패스츄어병(Goodpasture disease)], IgA 신병증, IgM 신병증,

- 홍반성 루푸스,

- T-세포 매개된 면역 반응, 예를 들어 피부 염증, 예컨대 건선 또는 접촉성 과민증,

- IBD, 예컨대 궤양성 결장염 및 모르부스크론(MorbusCrohn),

- 다발성 경화증,

- 류마티스성 관절염,

- 포도막염,

- 유형 2 당뇨병,

- 기관지 천식,

- 접촉성 피부염,

- 건선,

- 아토피성 피부염,

- 췌장염,

- 천포창,

- 쇼그렌병(Sjoegren's disease),

- 베체트병(Behcet disease),

- 호르톤병(Horton's disease),

- 피부 경화증,

- 다발성 근염.

다음 실시예에서는 글루코코르티코이드 수용적 질환에 대한 상승적 효과가 제시되었다. 이러한 효과는 상기 열거된 모든 질환에 대해 기계론적으로 동일할 것인 항원-항체 반응에 대해 제시되기 때문에, 선택된 모델이 특히 적합하다.

본 출원에 의해 예상되는 가능한 투여 형태는 정제, 캅셀제, 향낭 또는 환제이다. 과립제는 그대로 바람직한 투여 형태로서 사용될 수 있거나, 이를 캅셀제 또는 향낭 내로 충진시킬 수 있거나, 또는 추가로 압착시켜 정제 또는 환제로 만들 수 있다.

본 출원에 의해 또한 포괄되는 추가의 투여 형태는 드링크 또는 시럽, 엘릭시르, 팅크제, 현탁제, 용제, 히드로젤, 필름, 로젠지, 츄잉 검, 경구 붕해성 정제, 구강 세척제, 치약, 립 밤, 약용 샴푸, 나노구 현탁제 및 미소구 정제 뿐만 아니라 에어로솔, 흡입제, 분무기, 흡연 또는 유리염기 분말 형태, 및 국소 적용을 위한 투여 형태, 예컨대 크림, 젤, 바르는 약 또는 밤, 로션, 연고, 점이제, 점안제 및 피부 패치이다.

예를 들어, 직장내 또는 질내에 사용될 수 있는 좌제가 추가로 포괄된다. 이들 투여 형태 모두는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명에 따르는 바람직한 투여 형태는 경구 형태, 예컨대 과립제, 코팅된 과립제, 정제, 장용정, 펠릿, 좌제 및 에멀션이다. 보다 더 바람직한 것은 과립제 및 정제이다. 기타 바람직한 투여 형태는 비경구 또는 국소 투여 형태이다. 항 MIF 항체에 대한 특히 바람직한 투여 경로는 피하 또는 정맥내 적용이다. 글루코코르티코이드에 대한 바람직한 투여 경로는 경구 적용이다 (예를 들어, 과립제, 액상제, 향낭 또는 정제). 글루코코르티코이드에 대한 추가의 바람직한 적용 형태는 국소 적용인데, 국소 적용은 피부에 대한 적용 및/또는 분무, 예컨대 비내 분무 또는 흡입기를 포괄할 수 있다. 글루코코르티코이드에 대한 추가의 바람직한 투여 경로는 정맥내 적용이다.

소염제로서 판매되고 있는 몇 가지 글루코코르티코이드는 종종 국소 제제, 예컨대 비염의 경우에는 비내 분무제 또는 천식의 경우에는 흡입기이다. 이들 제제는 표적화된 부위에만 영향을 미침으로써, 부작용 또는 잠재적 상호작용을 감소시키는 이점이 있다. 전형적인 화합물은 베클로메타손, 부데소니드, 플루티카손, 플루니솔리드, 클로베타손, 모메타손 및 시클레소니드이다. 천식의 경우에는, 글루코코르티코이드를 정량 흡입제 또는 건조 분말 흡입기로서 투여한다. 따라서, 이러한 제제가 또한, 본 발명의 바람직한 실시양태이다.

투여는 공지된 모든 경로에 의할 수 있다.

용어 "조합" 또는 "조합 요법"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 항-MIF 항체를 글루코코르티코이드와 함께 또는 이에 순차적으로 투여하거나, 또는 그 반대의 경우인 투여 방식을 지칭한다. 이러한 투여 방식은 전형적으로, 글루코코르티코이드에 대해서는 매일 투여하고, 항-MIF 항체에 대해서는 2주마다 투여할 것이다. 바람직한 투여 방식은 다음과 같다:

상기 설명된 바와 같이, 항-MIF 항체를 글루코코르티코이드와 함께 또는 순차적으로 투여하는 것이 가능하다. 이러한 맥락에서 "함께"는 항-MIF 항체의 투여와 글루코코르티코이드의 투여 사이의 시간이 10분 이내인 것을 의미한다. "순차적으로"는 항-MIF 항체의 투여와 글루코코르티코이드의 투여 사이의 시간이 10분을 초과하는 것을 의미한다. 이때, 이러한 시간은 10분 초과, 30분 초과, 1시간 초과, 3시간 초과, 6시간 초과 또는 12시간 초과일 수 있다.

항-MIF 항체와 스테로이드는 주로, 양 화합물이 반드시 동일한 시간 동안 (특정 시간 범위에 대해) 체내에 존재하는 방식으로 투여된다. 항-MIF 항체는 전형적으로 2 내지 4주의 반감기를 갖고, 스테로이드는 6 내지 24시간의 반감기를 갖는다.

따라서, 상기 조합 요법은 또한, 당업자가 해당 각각의 글루코코르티코이드와 해당 항체의 널리 공지된 반감기를 고려한 순차적 투여 방식을 명백하게 포괄한다. 상기 항체가 일반적으로 2 내지 4주의 반감기를 갖는다는 사실에 비추어 볼때, 해당 항체의 투여는 단지 2주마다, 3주마다 또는 1개월에 1회일 수 있다. 본 발명의 조합 요법에서 상기 항체와 함께 투여될 글루코코르티코이드는 전형적인 실시양태에서, 6 내지 24 h의 반감기를 가지므로; 글루코코르티코이드의 투여는 전형적인 실시양태에서, 5시간마다, 6시간마다, 1일 3회, 1일 2회, 또는 1일 1회일 수 있다.

스테로이드 분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있는 "5의 규칙"을 이용하여, 다음과 같이 상이한 글루코코르티코이드들 간의 투여 스케줄을 계산할 수 있다: 1 mg 덱사메타손은 대략 5 mg 프레드니솔론과 동일하고, 이는 결국 대략 25 mg 코르티손과 동일하다.

상기 언급된 "고 용량"은 전형적으로, 급성 장애를 가능한 한 효과적으로 치료해야 할 필요가 있는 경우에 제공될 것이다. 이는 전형적으로, 보다 장기간의 투여 스케줄에는 제공되지 않는다.

그러나, 본 발명에 따라서, 글루코코르티코이드를 투여하는 것뿐만 아니라 이를 항체와 조합 투여하는 것은 치료하고자 하는 특이적 장애 및 병에 걸린 대상체의 내역에 따라서 개개의 증례에 따라 의사에 의해 결정될 필요가 있을 것이다.

다음은 단지 예로서 제시되며, 이로써 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하는데, 전형적으로 신염을 치료하기 위한 2가지 선택 사항이 있다:

1) 3일 동안 1일 500 mg 메틸프레드니솔론 (고 용량)을 투여한 다음; 1일 최대 30 mg의 프레드니솔론 (저 용량)을 경구 투여하거나, 또는

2) 1일 최대 60 mg의 프레드니솔론 (중간 용량)을 경구 투여한 다음, 시간이 경과함에 따라 그 양을 감소시킨다 (6개월 이하가 소요될 수 있다).

다시 언급하면, 본 발명은 자신의 지식에 기초하여, 예를 들어 각각의 치료 지침, 예를 들어 NIH 지침에 기초하여 글루코코르티코이드와 항-MIF 항체 둘 다의 필요한 투여량을 결정할 당업자에 관한 것이다.

특히 바람직한 실시양태에서, 활성 성분은 제어 방출식, 예를 들어 지연 방출식으로 전달되어야 하는 성분일 것이다. 즉, 이러한 활성 성분을 포함하는 본 발명의 경구 투여 가능한 투여 형태에 코팅이 제공될 수도 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서 본 발명은 코팅을 수반한 과립제, 및 특히 제어 방식으로 방출되어야 할 활성 성분을 포함하는 과립제 (이로써 이들 과립제는 코팅을 갖는다)에 관한 것이다.

보다 바람직하게, 이러한 코팅은 제약상 허용되는 코팅이고, 특히 바람직하게 장용 코팅, 장기간 방출 코팅 또는 지연 방출 코팅이며; 이러한 코팅 모두는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

염증 유발성 사이토킨 MIF (대식세포 이동 억제 인자)에 대항하여 유도되는, 생체내 보호성 항-MIF mAb (예를 들어, RAB9, RAB4, RAB0, RAM9, RAM4, RAM0)의 서브세트는 그의 환원된 상태의 변형되지 않은 MIF와 결합하지 않는다. 이와는 달리, 이들 mAb는 산화 환원 반응 의존성 MIF 이소형에 대해 고도로 선택적인 것으로 나타났다.

특히 바람직한 항체는 항체 RAB9이다.

또 다른 특히 바람직한 항체는 항체 RAB4이다.

또한 또 다른 특히 바람직한 항체는 항체 RAB0이다.

특히 바람직한 항체는 항체 RAM9이다.

또 다른 특히 바람직한 항체는 항체 RAM4이다.

또한 또 다른 특히 바람직한 항체는 항체 RAM0이다.

본 발명에 의해 제시된 바와 같이, 본원에서 제안된 조합 요법은, 이로 인해 양 성분의 극히 놀라운 상승적 효과가 발생한다는 점에서 유리하다. 글루코코르티코이드를 이용한 치료에 의해 발생한 엄청난 부작용을 감안하면, 본 발명은 치료 중인 환자의 상황을 개선시켜 줄 대체 치료를 제공하는 데 매우 적합하다. 동시에, 부작용 감소는 또한, 특히 만성 질환에 있어 상당히 중요한 환자 순응도를 개선시킬 것이다. 최종적으로, 본 발명을 이용하여 의사는 특별한 질환 상태 및 특별한 상황 하에서 즉시 인명을 구조할 수 있는, 더욱 고 용량의 글루코코르티코이드를 이용하여 수득되는 바와 같이 결과를 향상시킬 수 있다.

본 발명은 다음 실시예를 통하여 추가로 기재될 것이지만, 이러한 실시예가 본 발명을 제한하는 수단으로써 간주되지 말아야 한다.

참조 실시예

A) 항체 스크리닝을 위한 GCO -검정:

THP1 현탁 배양물을 원심분리시키고, 세포를 신선한 완전 배지에 재현탁시켜 10⁶개 세포/ml의 세포 밀도가 되도록 하였다. 이 배양물을 96-웰 미세판의 웰에 옮기고 (90 ㎕/웰), 잠재적 항-MIF 항체를 가하여 75 ㎍/ml의 최종 농도를 수득하였다. 각 항체를 세 번 되풀이 하여 시험하였다. 37℃ 하에 밤새 항온 배양한 후, 덱사메타손을 가하여 2 nM의 농도를 수득하고, 37℃ 하에 1시간 동안 항온 배양한 후, LPS를 가하였다 (3 ng/ml 최종 농도). 37℃ 하에 6시간 더 항온 배양한 후, 상등액을 수거하고, IL-6 농도를 시판용 ELISA에서 결정하였다. 세 번 되풀이한 결과를 평균내고, 대조군 항체와 비교해서 IL-6 분비 비율(%)을 결정하였다. 75% 미만으로 IL-6을 분비시키는 항체를 양성으로서 평가하였다.

B) IC ₅₀ 값을 결정하기 위한 검정

실험 과정은 증가량의 항체를 사용하는 것을 (전형적으로 1 내지 125 nM) 제외하고는 상기 스크리닝 검정에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 이로써 생성된 용량 반응 곡선은 음성 대조군 항체와 비교해서 억제 %로서 표현하였다. 이 곡선은 항체의 최대 억제 효과 (최대 억제 %) 및 최대 억제 효과의 50%를 나타내는 항체 농도 (IC₅₀)를 계산하기 위해 사용하였다.

C) 세포 증식의 억제

혈청은 휴지기 NIH/3T3에서 MIF의 분비를 자극하므로, MIF는 결국 세포 증식을 자극한다. 따라서, 이러한 내인성 MIF를 억제하는 항체는 휴지기 NIH/3T3 세포의 증식을 감소시킨다. 증식 감소는 ³H-티미딘을 혼입시킴으로써 결정하였다.

웰당 1000개의 NIH/3T3 세포를, 10% 혈청을 함유하는 배지에서 37℃ 하에 주말 동안 96 웰 판에서 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 0.5% 혈청을 함유하는 배지에서 항온 배양함으로써 37℃ 하에 밤새 굶주리게 하였다. 이러한 0.5% 배지를 제거하고, 10% 혈청, 75 ㎍/ml 항체 및 5 μCi/ml의 ³H-티미딘을 함유하는 신선한 배지로 대체시켰다. 37℃ 하의 CO₂ 항온 배양기에서 16시간 동안 항온 배양한 후, 세포를 웰당 150 ㎕의 찬 PBS로 2회 세척하였다. 다-채널 피펫을 이용하여 웰당 150 ㎕의 5% (w/v) TCA 용액을 가하고, 4℃ 하에 30분 동안 항온 배양하였다. 판을 150 ㎕ PBS로 세척하였다. 웰당, 0.5% SDS를 수반하는 75 ㎕의 0.5 M NaOH 용액을 가하고, 혼합한 다음, 실온 하에 저장하였다. 5 ml의 울티마 골드(Ultima Gold) [패카드(Packard)]와 75 ㎕ 샘플 용액을 혼합함으로써, 샘플을 β-계수기로 측정하였다. 각 결정을 세 번 되풀이 하여 수행하였고, 그 값을 t-시험에 의해 대조군 항체의 값과 비교하였다. 증식을 유의적으로 감소시키는 (P<0.05) 항체를 양성으로서 평가하였다.

D) 결합 연구: 항- MIF 항체의 에피토프 결정

각 펩티드를 커플링 완충액에서 희석시켜 전형적으로 1 ㎍/ml의 펩티드 농도를 수득하고, 이를 미세판 [NUNC 임모빌라이저™ (Immobilizer™) 아미노 플레이트 F96 클리어]에 부가하며, 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다 (100 ㎕/웰). 대조군으로서 재조합 전장 MIF 및 PBS를 사용하였다. 상기 판을 200 ㎕ PBST로 3회 세척하고, 항체 (PBS 중의 2 내지 4 ㎍/ml)를 가하며 (100 ㎕/웰), 이를 온화하게 진탕시키면서 실온 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 판을 200 ㎕ PBST로 3회 세척하고, 탐지 항체 [예를 들어, Fc 특이적 항-인간 IgG/HRP 표지됨; 시그마(Sigma)]를 가하였다 (100 ㎕/웰). 온화하게 진탕시키면서 실온 하에 1시간 동안 항온 배양한 후, 판을 200 ㎕ PBST로 3회 세척하였다. 각 웰을 암실에서 30분 동안 100 ㎕ TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액 (T-0440, 시그마)과 함께 항온 배양하였다. 웰당 100 ㎕의 1.8 M H₂SO₄-용액을 가함으로써 염색 반응을 중지시켰다. 샘플을 450 nm 하에 측정하였다.

E) 비아코어에 의한 항- MIF 항체의 Fab 단편의 친화도 결정

전형적으로, 40 RU 단위의 인간 재조합 MIF를, CM5 (= 카르복시메틸화 덱스트란) 매트릭스 (비아코어)를 수반한 센서 칩 상에 고정화시켰다. Fab 단편을 HBS-EP에 희석된 전형적으로 6 내지 100 nM의 농도 범위로 주사하였다. 각 주기 후, 상기 칩을 50 mM NaOH + 1 M NaCl로 재생시켰다. 1:1 랑뮈르(Langmuir) 모델에 따라서 친화도를 계산하였다.

실시예

도입:

글루코코르티코이드 약물을 이용한 질환의 요법은 종종, 심각한 부작용 또는 필요한 투여량의 증가에 의해 방해를 받는다. 본 발명에서 본 발명자들은 글루코코르티코이드 화합물 (예를 들어, 덱사메타손, 히드로코르티손 또는 프레드니솔론)의 유효성이 항-oxMIF 항체와 조합함으로써 증가될 수 있다고 설명하고 있다. 이러한 조합은 각각의 단독 요법에 비해 상기 장애의 치료를 개선시켜 주고, 심지어 환자의 수명을 상당히 연장시켜 줄 가능성이 있다.

특히, 본 발명을 이용하여 다음 결과를 달성한다:

- 더 적은 부작용을 초래하면서, 종전의 고 용량을 이용한 경우와 동일한 효과를 달성하기 위해 보다 저 용량의 글루코코르티코이드가 제공될 수 있다.

- 동일한 글루코코르티코이드 투여량에서도 보다 높은 효능을 접하게 될 것이다.

- 필요에 따라 고 투여량의 글루코코르티코이드가 제공될 수 있는데, 증강된 치료 효과를 가질 것이다.

신염

실시예 1: 반월형 사구체신염에 대한 동물 모델:

본 모델은 본 발명의 효과를 나타내는 것으로 예측 가능한 것으로서 당해 분야에 인식되고 있다. 이 모델은 상기 "MIF 관련 질환"의 정의에 포함시킬 수 있는 질환의 전체 범위에 걸쳐 본 발명의 조합 요법의 효과를 제시하는 데 적합하고, 특히 상기 모델은 다음 질환에 적합하다: 루푸스 신염, 항-GBM 신염, ANCA 신염, IgA 신병증. 덱사메타손은 인간의 치료에서 각각의 글루코코르티코이드에 대한 예측으로서 당해 분야에 인식되고 있다. 예를 들어, 인간에게서 루푸스 신염을 치료하는 데 바람직한 글루코코르티코이드는 메틸프레드니솔론일 것이다.

항-MIF 모노클로날 항체 (mAb)의 효과 및 그와 덱사메타손과의 조합 효과를 위스타르 교토 [Wistar Kyoto (WKY)] 래트의 면역 매개된 신독성 신염 (NTN)에서 조사하였다. 이 모델은 대식세포 침윤, 섬유소 침착 및 조직 파괴 12를 수반하면서 질환이 급속하게 발병된다. NTN은 0.1 ml의 토끼 항-래트 사구체 기저 막 혈청을 단일 정맥내 주사함으로써 숫컷 WKY 래트에서 유도시킨다 (0일). mAb 및 덱사메타손을 다음에 기재된 시점 및 투여량으로 복강내 주사하였다. 사구체신염의 유도 전에 대사 우리를 이용하여 24시간 뇨 샘플을 수집하고, 단백뇨를 정량화하기 위하여 신염 유도 후 각종 시간 간격으로 뇨 샘플을 수집하였다. 면역조직학에 의해 후속 분석하기 위하여 신장 조직 박편을 냉동시켰다. 해마톡실린/에오신 (H&E) 및 과요오드산-쉬프 [periodic acid-Schiff (PAS)] 염색된 신장 조직 박편에서 신장 손상의 형태학을 평가하였다. 모노클로날 마우스 항체 ED1 [세로텍(Serotec), UC]을 이용하고 면역퍼옥시다제 기술에 의해 대식세포를 탐지하였다. 이러한 동물 모델은 다음 문헌에 상세히 기재되어 있다 (문헌 [Tam FWK, Smith J, Morel D, Karkar AM, Thompson EM, Cook HT, Pusey CD: Development of scarring and renal failure in a rat model of crescentic glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant 14:1658-1666, 1999] 참조).

항- MIF 항체의 투여

인간 요법의 경우 항-MIF 항체의 용량 범위:

0.2 내지 25 mg/kg.

인간 요법의 경우 바람직한 용량 범위: 1 내지 10 mg/kg.

항-MIF 항체는 시험관내 검정 (화학운동성 검정) 및 친화도 측정을 기초로 하여 마우스 또는 래트 MIF보다 인간 MIF를 억제하는 데 있어서 10배 더 강력하다. 따라서, 래트에서 2 내지 120 mg/kg의 신염 실험 (실험 1c)의 용량 범위는 인간 환경에서의 0.2 내지 12 mg/kg에 상응한다.

MIF 길항제를 스테로이드와 조합함으로써 증강된 치료 효과는 반월형 사구체신염에 대한 래트 모델에서 입증되었다. 상이한 농도의 덱사메타손을 예비 실험에 사용하여 최적 이하의 스테로이드 용량을 찾아내었다 (실시예 1a; 본 실험의 도식적 디아그램이 도 1에 도시되어 있고; 그 결과는 도 2 내지 4에 제시되어 있다). 제2 예비 실험에서는, MIF 길항제 (항-MIF 항체 RAM9)의 유효성을 확증하였다 (실시예 1b). 최종적으로, 덱사메타손의 최적 이하 용량을 상기 항체와 조합하였는데 (실시예 1c), 이러한 조합으로 인해 질환 파라미터가 현저하게 개선되어 감소되었다. 이러한 조합 요법에서 관찰된 유익한 효과는 10배 초과의 더 많은 스테로이드 용량에 의해 달성되는 효과에 상응한다.

실시예 1a:

요약 (도 1 참조)

· WKY 래트에서 사구체신염의 유도 후 4일째에 치료를 수행하였다.

· 밤새 (7일에서 8일째) 뇨를 수집한 후 및 8일째에 상기 동물을 도태시킨 후에 신장 손상의 중증도를 평가하였다 (도 1 참조).

· 0.25 mg/kg 덱사메타손을 단일 복강내 주사하면 단백뇨가 대략 50% 정도 감소되고 (도 2), 사구체 대식세포 침윤이 대략 53% 정도 감소되며 (도 3), 반월체 계수치가 대략 25% 정도 감소된다 (도 5).

→ 0.025 mg/kg이 최적 이하 덱사메타손 농도로서 결정된다.

→ 0.025 mg/kg이 항체 RAM9의 잠재적 효과를 연구하는 데 적당한 것으로서 간주된다.

실시예 1b:

요약 (도 4 참조)

· WKY 래트에서 사구체신염의 유도 후 4일 및 6일째에 치료를 수행하였다.

· 밤새 (7일에서 8일째) 뇨를 수집한 후 및 8일째에 상기 동물을 도태시킨 후에 신장 손상의 중증도를 평가하였다 (도 5 참조).

· 항체 RAM9를 복강내 주사하면

- 단백뇨증 (도 6 및 도 10): 60 mg/kg: 대략 22% 감소, 120 mg/kg: 대략 25% 감소,

- 대식세포 침윤 (도 7 및 도 11): 60 mg/kg: 대략 26% 감소, 120 mg/kg: 대략 38% 감소,

- 반월체 계수치 (도 8 및 도 12): 60 mg/kg: 대략 10% 감소, 120 mg/kg: 대략 12% 감소한다.

· 더욱이, MIF, TNFα, 및 Il-1β가 뇨에서 감소된다.

실시예 1c:

요약 (도 9 참조)

· WKY 래트에서 사구체신염의 유도 후 4일째 (덱사메타손 + 항체) 및 6일째 (항체 단독)에 치료를 수행하였다.

· 밤새 (7일에서 8일째) 뇨를 수집한 후 및 8일째에 상기 동물을 도태시킨 후에 신장 손상의 중증도를 평가하였다 (도 9 참조).

· 항체 RAM9와 덱사메타손을 조합하면 강력한 상승적 효과가 나타났다 (도 10 내지 12 참조).

- 덱사메타손의 효과는 외견상 >10배 정도 증강되었다.

상기 언급된 동물 모델은 MIF 길항제와 스테로이드의 조합 요법의 유익한 효과를 예시해준다. 스테로이드 치료는 광범위한 치료적 적용을 나타내지만, 만연된 한계를 보이기도 한다 (고 투여량에서의 부작용, 스테로이드 내성 등). 스테로이드와 MIF 항체의 조합 요법은, 예를 들어 염증성 질환, 감염성 질환 또는 암 환자에게서 광범위한 새로운 치료 기회를 열 수 있는 잠재력을 지니고 있다.

실시예 2

다음 모델은 전신성 홍반성 루푸스 및 루푸스 신염에 대한 실험 모델로서 당해 분야에 인식되고 있는 NZB/NZW F1 마우스를 이용한다. 이들 마우스의 치료는 루푸스 신염 및 전신성 홍반성 루푸스의 치료에 대해 예측 가능한 것으로서 인식된다.

MIF 길항제를 스테로이드와 조합함으로써 증강된 치료 효과는 루푸스 신염에 대한 마우스 모델에서 입증되었다. 상이한 농도의 덱사메타손을 예비 실험에 사용하여 최적 이하의 스테로이드 용량을 찾아내었다 (실험 2a). 최종적으로, 덱사메타손의 최적 이하 용량을 상기 항체와 조합하였는데 (실험 2b), 이러한 조합으로 인해 질환 파라미터가 현저하게 개선되어 감소되었다.

이들 실험을 위해, 다 자란 NZB/NZW F1 하이브리드 마우스를 사용하였다. 이들 마우스에게서 인간의 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)와 거의 유사한 면역학적 장애가 발생하였다. 암컷 마우스에서는 약 32주 내지 38주 때에 지속적인 단백뇨와 핵산에 대항한 순환성 항체를 수반하면서 상기 질환이 발현되었다.

실시예 2a:

"NZB/NZW F1 하이브리드 마우스에서 덱사메타손의 용량 찾기"

본 목표는 스테로이드 요법과 항-MIF 항체 간의 추가의 상승작용 연구를 위해 덱사메타손의 최적 이하 용량을 결정하는 것이다.

NZB/NZW F1 마우스에서 상기 질환의 정립을 모니터링하고, 단백뇨를 측정함으로써 확증하였다. 마우스가 단백뇨를 나타내면, 동물을 상이한 용량의 덱사메타손 또는 비히클로 복강내 처리하였다. 실험이 끝날 무렵, 동물을 희생시키고, 판독 파라미터는 단백뇨, 사구체 대식세포의 수 및 신장 조직학이다.

군 1: 비히클

군 2: 덱사메타손 0.5 mg/kg

군 3: 덱사메타손 1.0 mg/kg

군 4: 덱사메타손 2.0 mg/kg

군 5: 조직학 대조군.

실시예 2b:

"NZB/NZW F1 하이브리드 마우스에서 항-MIF RAM9 항체와 최적 이하 용량의 덱사메타손 간의 상승 작용"

본 실험을 이용하여, 약물 후보 RAM9 항체와 최적 이하 용량의 덱사메타손 간의 상승적 효과를 연구 조사하였다. NZB/NZW F1 마우스에서 상기 질환의 정립을 모니터링하고, 단백뇨를 측정함으로써 확증하였다. 마우스가 단백뇨를 나타내면, 동물을 스테로이드 및 항체로 처리하였다. 실험이 끝날 무렵, 동물을 희생시키고, 판독 파라미터는 단백뇨, 사구체 대식세포의 수 및 신장 조직학이다.

"동물의 군"

군 1: 조직학 비히클

군 2: 대조군 항체 BAX C3

군 3: 항 MIF RAM9

군 4: 덱사메타손 + 대조군 항체 BAX C3

군 5: 덱사메타손 + 항 MIF RAM9.

T-세포 매개된 질환

실시예 3a

사용된 동물 모델은 DNFB (2,4-디니트로플루오르벤졸)에 대한 지연형 과민증 (DTH) 반응의 유도에 관한 것이다: DNFB를 복부 위에 국소 적용함으로써 C57Bl/6 마우스를 감작시켰다. DNFB 용액을 마우스 귀 상으로 페인팅함으로써 마우스를 시험감염시켰다. 시험감염시킨 지 24 h 후에 캘리퍼로 귀 두께를 측정함으로써 염증성 반응의 중증도를 판단하였다. 이와 동시에, 동물을 희생시키고, 귀를 컷 오프하며, 후속 조직학적 분석을 위해 보존시켰다.

이러한 동물 모델은 T-세포 매개된 면역 반응, 예를 들어 건선과 같은 피부 염증과 관계된 질환에 대한 예측으로서 당해 분야에 인식되어 있다.

치료 스케줄은 다음과 같다:

T=0d: 마우스를 감작시킨다.

T=5d: 소염 요법을 투여하고, 마우스를 시험감염시킨다.

T=6d: 귀-부종을 정량화하고, 마우스를 희생시키며, 추가의 조직학적 분석을 위해 귀를 수집한다.

본 실험을 상기 언급된 모델로 수행하여 덱사메타손 용량을 적정하고 (실시예 1 및 2에 설명된 바와 유사하게 수행함), RAM9 항체와 히드로코르티손의 조합 (국소 적용) 효과를 결정하였다.

모든 실험은 상기 조합의 상승적 효과를 나타내었다.

실시예 3b-d: 접촉성 과민증

물질 및 방법

언급된 초기 모델의 변형을 이용하여, 2,4-디니트로플루오로벤젠 (DNFB)에 대한 접촉성 과민증 (CHS) 반응을 결정하였다 (문헌 [Ludwig, et al., 2010, Am J Pathol 176, 1339-1345] 참조). 면도한 마우스 등 피부를 75 ㎕의 DNFB (시그마; 미국 미주리주 세인트 루이스) 용액 (아세톤/올리브유 중의 0.5%, 4/1)으로 처리함으로써 C57BL/6 마우스를 감작시켰다. 5일째에, 마우스에게 히드로코르티손을 국소 적용하거나 (시험감염된 귀에 적용함) 또는 비히클을 국소 적용하고 (시험감염되지 않은 귀에 적용함), 항-MIF 항체 RAM9 또는 이소형 대조군 항체를 정맥내 주사하였다. 30분 후에, 마우스의 우측 귀를 20 ㎕ 0.3% DNFB로 시험감염시켜 국부 염증성 반응을 유발시켰다. 비히클 (아세톤/올리브유)을 대조군으로서 좌측 귀에 적용하였다. 우측 귀와 좌측 귀 간의 차이로서 명시된, DNFB에 대한 부종 반응은 마이크로미터 [미투토요 캄파니 (Mitutoyo Co.; 일본 도쿄)]를 이용하여 시험감염 후 24 h에 측정하였다. 군당 8마리 마우스를 사용하였다.

결과

실시예 3b: 히드로코르티손의 용량 적정

첫 번째 실험에서는, 3가지 상이한 용량의 히드로코르티손 (DAC 기재 크림 연고 중의 0.3%, 1% 및 3%)을 항체의 적용 없이 적용하였다. 히드로코르티손을 수반하지 않은 비히클이 음성 대조군으로서 제공되었다. 1% 히드로코르티손이, 귀 두께를 측정함으로써 결정된 바와 같이 접촉성 피부염 모델에서 최적 이하 소염 효과를 산출하는 농도인 것으로 밝혀졌다.

실시예 3c: 항- MIF 항체 RAM9 의 용량 적정:

두 번째 실험에서는, 20 mg/kg 항-MIF 항체 RAM9를 히드로코르티손 없이 적용하였고, 이소형 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이들 실험에서 주요 측정 기준인 귀 부종은 이소형 대조군 항체 또는 식염수로 처리된 마우스와 비교해서 항-MIF-처리된 마우스에서 상당히 감소되었다. 20 mg/kg이 고도로 유효한 용량이었기 때문에, 후속 실험을 위한 최적 이하 용량으로서 10 mg/kg RAM9를 사용하였다.

실시예 3d: RAM9 ( 정맥내 )와 히드로코르티손 (국소)의 조합 적용

최종적으로, 마우스를 10 mg/kg 이소형 대조군 항체 또는 RAM9 단독, 또는 히드로코르티손 (DAC 기재 크림 중의 1%)과 조합해서 처리하였다. 그 결과가 도 13에 도시되었다. 이소형 대조군 항체 처리된 마우스는 대략 100 ㎛의 귀 부종을 나타내었다. 최적 이하 용량의 히드로코르티손을 이소형 대조군 항체와 조합해서 국소 적용하면, 귀 부종이 감소되지 않았다. 단독 요법으로서 10 mg/kg RAM9 또한, 이소형 대조군 항체와 유사한 결과를 제공하였다. 그러나, 귀의 두께는 RAM9와 히드로코르티손 둘 다를 투여한 군에게서 현저하게 감소되었고, 귀 부종을 최소화하는 데 있어서 양 약물이 상승적 효과를 나타낸다고 결론지을 수 있다.

결론

요약하면, 이들 실험은 접촉성 피부염에 대한 마우스 모델에서 최적 이하 용량의 RAM9와 히드로코르티손의 치료적 상승 작용에 대한 증거를 제시한다.

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SEQUENCE LISTING <110> Baxter Healthcare S.A. Baxter International Inc. <120> COMBINATION THERAPY OF ANTI-MIF ANTIBODIES AND GLUCOCORTICOIDS <130> 163 258 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of RAB9 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Met Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Val Ala Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Trp Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val 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Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAM4hc <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Pro Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Asn Val Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 14 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAM4lc <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

글루코코르티코이드-수용적 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드 수용적 질환이 글루코코르티코이드로의 치료에 대해 반응하는, 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 염증, 알레르기, 암 또는 천식을 치료하는 데 사용하기 위한, 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-oxMIF 항체인, 글루코코르티코이드와 조합되는 항-MIF 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 다음 군으로부터 선택되는 조합물: 항-MIF 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드가 글루코코르티코이드 수용체 작동제, 예를 들어 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 덱사메타손, 파라메타손, 플루오르코르톨론, 부데소니드, 플루티카손, 플루니솔리드, 시클레소니드, 모메타손, 클로베타손, 코르티손 및 히드로코르티손, 및 소염 SEGRA's/SEGRM's (예를 들어, 마프라코레이트 (= BOL303242X = ZK245186), 화합물 A, RU24856, RU24782, RU40066, ZK 216348)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, 항체 RAB0 및 항체 RAB0의 군으로부터 선택되거나, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0, 바람직하게 항체 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 염증, 특히 신염, 보다 더 바람직하게 루푸스 신염, 사구체신염, IgA 또는 IgM 신병증, 전신성 혈관염 (예를 들어, 결절성 다발성 동맥염, 베게너 육아종증 및 헤노흐-쇤라인 자반증), 항-GBM 신염 및/또는 급속히 진행성인 사구체신염 (유형 I, II, III 또는 IV), 예를 들어 ANCA (항-호중구 세포질 항체) 신염인 조합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, 항체 RAB0 및 항체 RAB0의 군으로부터 선택되거나, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0, 바람직하게 항체 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 루푸스 신염인 조합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, 항체 RAB0 및 항체 RAB0의 군으로부터 선택되거나, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 전신성 홍반성 루푸스인 조합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, 항체 RAB0 및 항체 RAB0의 군으로부터 선택되거나, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 덱사메타손 및 (메틸)프레드니솔론의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 피부 염증인 조합 요법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, 항체 RAB0 및 항체 RAB0의 군으로부터 선택되거나, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 덱사메타손 및 (메틸)프레드니솔론의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드 또는 히드로코르티손이며, MIF-관련 질환이 T-세포 매개된 면역 반응에 의해 유발되는 조합 요법.
제10항 또는 제11항에 있어서, T-세포 매개된 면역 반응이 피부 염증, 예를 들어 건선 또는 접촉성 과민증인 조합 요법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드가 부데소니드이고, 이러한 부데소니드가 국소 적용용으로 제제화되는 조합 요법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, 항체 RAB0 및 항체 RAB0의 군으로부터 선택되거나, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 염증성 장 질환 (IBD)이며, IBD가 궤양성 결장염 및 크론병으로부터 선택되는 조합 요법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 항체 RAB9, 항체 RAB0 및 항체 RAB0의 군으로부터 선택되거나, 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0, 바람직하게 RAM9이고, 글루코코르티코이드가 전신 투여의 경우에는 (메틸)프레드니솔론 및 덱사메타손의 군으로부터 선택되고, 국부 투여의 경우에는 부데소니드이며, MIF-관련 질환이 다발성 경화증인 조합 요법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따르는 조합물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
글루코코르티코이드 수용적 질환, 특히 염증, 알레르기, 천식 또는 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따르는 조합물, 또는 제16항의 키트.