ES2779036T3 - Terapia de combinación de anticuerpos anti-MIF y glucocorticoides - Google Patents

Terapia de combinación de anticuerpos anti-MIF y glucocorticoides Download PDF

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Abstract

Anticuerpo anti-MIF en combinación con un glucocorticoide para su uso en el tratamiento de inflamación, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-oxMIF, y en el que el anticuerpo anti-MIF se selecciona del siguiente grupo: anticuerpo anti-MIF RAB9, es decir, un anticuerpo con una cadena ligera depositada como DSM 25111 y una cadena pesada depositada como DSM 25113, RAB4, es decir, un anticuerpo con una cadena ligera depositada como DSM 25110 y una cadena pesada depositada como DSM 25112 y/o RAB0, es decir, un anticuerpo con una cadena ligera depositada como DSM 25114 y una cadena pesada depositada como DSM 25115, o RAM9, es decir, un anticuerpo con una cadena ligera depositada como DSM 25859 y una cadena pesada depositada como DSM 25860, RAM4, es decir, un anticuerpo con una cadena ligera depositada como DSM 25861 y una cadena pesada depositada como DSM 25862 o RAM0, es decir, un anticuerpo con una cadena ligera depositada como DSM 25863 y una cadena pesada depositada como DSM 25864.

Description

DESCRIPCIÓN
T e ra p ia de co m b in a c ió n de a n ticu e rp o s a n ti-M IF y g lu co co rtico id e s
La p re se n te in ve n c ió n se re fie re a a n tic u e rp o s a n ti-M IF , en p a rtic u la r a su uso en co m b in a c ió n con g lu co co rtico id e s , en el tra ta m ie n to de e n fe rm e d a d e s re la c io n a d a s con M IF.
Antecedentes
El fa c to r in h ib id o r de la m ig ra c ió n de m a cró fa g o s (M IF ) es una c ito c in a a is la da in ic ia lm e n te b a sá n d o se en su ca p a c id a d de in h ib ir la m ig ra c ió n a le a to ria in vitro de cé lu la s e xu d a d a s p e rito n e a le s de co b a ya s h ip e rse n s ib le s a tu b e rcu lin a (q ue con tie n e n m a c ró fa g o s ) (B lo o m et al. S c ien ce 1966, 153, 80-2 ; D av id et al. P N A S 1966, 56, 72-7 ). H o y en día, M IF se co n o ce co m o un re g u la d o r a sc e n d e n te c rítico de la re sp u e s ta in m u n ita ria in n a ta y a d q u irid a que e je rce un e sp e c tro p le io tró p ico de activ ida de s .
El A D N c de M IF h um a no se c lonó en 1989 (W e is e r et al., P N A S 1989, 86, 7522-6 ), y su u b icac ión g e n ó m ica se m a pe ó con el c ro m o so m a 22. El p ro d u c to de l gen M IF h u m a n o es una p ro te ín a con 114 a m in o á c id o s (d e sp u é s de la e sc is ió n de la m e tio n in a N -te rm in a l) y una m a sa m o le c u la r a p a re n te de a p ro x im a d a m e n te 12,5 kDa. El M IF no tie n e una h o m o lo g ía de se cu e n c ia s ig n ifica tiva con n in g un a o tra p ro te ína . La p ro te ína c ris ta liza com o un trím e ro de s u b u n id a d e s idé n tica s . C ada m o n ó m e ro con tie n e dos h é lices a lfa a n tip a ra le la s que se e m p a q u e ta n con tra una lám ina beta de cua tro cad en as . El m o n ó m e ro tie n e dos ca d e n a s beta a d ic io n a le s que in te ra c tú an con las lám ina s beta de las s u b u n id a d e s a d y a c e n te s para fo rm a r la su p e rfic ie de co n ta c to e n tre los m o nó m eros .
Las tre s s u b u n id a d e s están d isp u e s ta s para fo rm a r un c ilin d ro que co n tie n e un ca n a l a cce s ib le al d iso lve n te que a tra v ie sa el ce n tro de la p ro te ína a lo la rgo de un e je m o le c u la r tr ip le (S un et al. P N A S 1996, 93, 5191 -5196 ).
Se in fo rm ó que la sec re c ió n de M IF de los m a c ró fa g o s se indu jo a c o n c e n tra c io n e s m uy ba jas de g lu co co rtico id e s (C a la n d ra et al. N ature 1995, 377, 68 -71 ) S in e m b a rg o , el M IF ta m b ié n co n tra rre g u la los e fe c to s de los g lu co co rtico id e s y e s tim u la la sec re c ió n de o tra s c ito c in a s ta le s com o el fa c to r de n e c ro s is tu m o ra l T N F -a y la in te rle u c in a IL-1 p (B a ug h et al., C rit C are M ed 2002 , 30, S 27 -35). T a m b ié n se d e m o s tró que el M IF, p o r e jem p lo , p re se n ta b a p ro p ie d a d e s p ro a n g io g é n ica s , p ro p ro life ra tiva s y a n tia p o p tó tica s , p ro m o v ie n d o a s í el c re c im ie n to de cé lu la s tu m o ra le s (M itch e ll, R .A ., C e llu la r S ign a llin g , 2004. 16 (1): págs. 13-19; Lue, H. et al., O n co g e n e 2007. 26 (35): págs. 5046-59 ). T a m b ié n , p o r e jem p lo , se aso c ia d ire c ta m e n te con el c re c im ie n to de lin fom a, m e la n o m a y c á n c e r de co lon (N ish ih ira et al. J In te rfe ron C y to k in e Res. 2000, 20: 751 -62).
El M IF es un m e d ia d o r de m u ch o s e s ta d o s p a to ló g ico s y, p o r tan to , e stá a so c ia d o con una v a rie d a d de e n fe rm e d a d e s , in c lu ye n d o e n tre o tras , e n fe rm e d a d in te s tin a l in fla m a to ria (E II), a rtr itis re u m a to id e (AR ), s ín d ro m e de d ificu lta d re sp ira to ria a g u d a (S D R A ), asm a , g lo m e ru lo n e fritis , n e fro p a tía p o r IgA, in fa rto de m io ca rd io (IM ), s e p tice m ia y cáncer, a u n q u e no se lim itan a las m ism as . Los a n ticu e rp o s a n ti-M IF p o lic lo n a le s y m o n o c lo n a le s se han d e sa rro lla d o con tra m If h u m a n o re co m b in a n te (S h im izu et al., F E B S Lett. 1996; 381, 199-202 ; K aw a gu ch i et al., Leukoc. B iol. 1986, 39, 223 -232 y W e is e r et al., Cell. Im m u no l 1985, 90, 16778).
Se han s u g e rid o a n ticu e rp o s a n ti-M IF para uso te ra p é u tico . C a la n d ra et al., (J. In flam m . (1995 ); 47, 39-51 ), según los in fo rm e s , u sa ron a n ticu e rp o s a n ti-M IF p ara p ro te g e r a los a n im a le s del cho qu e sé p tico p o r b ac te ria s G ra m -n e g a tiva s y G ra m -p o s itiva s in d u c id o e xp e rim e n ta lm e n te . S e su g irie ro n a n ticu e rp o s a n ti-M IF com o m e d io de te ra p ia p ara m o d u la r la p rod u cc ión de c ito c in a s en ch o q u e sé p tico y o tro s e s ta d o s p a to ló g ico s in fla m a to rio s .
El d o cu m e n to US 6.645.493 d ivu lg a a n ticu e rp o s a n ti-M IF m o n o c lo n a le s d e riva d o s de cé lu la s de h ib rid om a, que n e u tra liza n la a c tiv id a d b io ló g ica de M IF. P udo d e m o stra rse en un m o d e lo a n im a l q ue e s to s a n ticu e rp o s a n ti-M IF d e riva d o s de ra ton es tu v ie ro n un e fe c to b e n e fic io so en el tra ta m ie n to del ch o q u e in d u c id o p or e nd o tox in as .
El d o cu m e n to US 200310235584 d ivu lg a m é to d o s p ara p re p a ra r a n ticu e rp o s de a lta a fin ida d para M IF en a n im a le s en los q ue el gen M IF se ha ina c tiva do h o m o c ig ó tica m e n te .
El fa c to r de inh ib ic ió n de la g lico s ila c ió n (G IF ) es una p ro te ína d e sc rita p o r G a la t et al. (Eur. J. B iochem , 1994, 224, 417 -21 ). A h o ra se re co n o ce que M IF y G IF son idé n tico s . W a ta ra i et al. (P N A S 2000, 97, 13251 -6 ) d e sc rib ie ro n a n ticu e rp o s p o lic lo n a le s que se unen a d ife re n te s e p íto p o s de G IF p ara id e n tif ic a r la na tu ra le za b io q u ím ica de la m o d ifica c ió n p o s tra d u cc io n a l de G IF en cé lu la s Ts. W a ta ra i et al. a n te rio rm e n te , in fo rm a ro n que el G IF se p rod u ce en d ife re n te s iso fo rm a s c o n fo rm a c io n a le s in vitro. Un tip o de isó m e ro se p rod u ce p o r m o d ifica c ió n q u ím ica de un ú n ico re s idu o de c is te ín a . La m o d ifica c ió n q u ím ica co n d u ce a ca m b io s c o n fo rm a c io n a le s d en tro de la p ro te ín a G IF.
Los g lu co co rtico id e s , a ve ce s ta m b ié n d e n o m in a d o s g lu co co rtico s te ro id e s , son una c lase de h o rm o n a s e s te ro id e a s q ue se unen al re ce p to r de g lu co co rtico id e s , q ue e stá p rese n te en cas i to d o s los a n im a le s ve rte b ra d o s . Los g lu co co rtico id e s fo rm a n parte del m e ca n ism o de re tro a lim e n ta c ió n del s is te m a in m u n ita rio q ue re du ce la a ctiv ida d inm un ita ria , es dec ir, la in fla m ac ió n . En m e d ic ina , se usan p ara tra ta r e n fe rm e d a d e s q ue e s tán p ro vo ca d a s p o r un s is te m a in m u n ita rio h ip e rac tivo , p o r lo q ue son e je m p lo s de ta le s e n fe rm e d a d e s las a le rg ias , el asm a, las e n fe rm e d a d e s a u to in m u n ita r ia s y la sep tice m ia . T a m b ié n in te rfie re n con a lg u n o s de los m e ca n ism o s a n ó m a lo s en las cé lu la s can ce ro sas , p o r lo q ue ta m b ié n se usan p ara tra ta r el cáncer. A l u n irse al re ce p to r de g lu co co rtico id e s , el c o m p le jo del re ce p to r de g lu co co rtico id e s a c tiva d o re gu la la e xp re s ió n de p ro te ín a s a n tiin fla m a to r ia s en el núc leo m e d ia n te un p roce so co n o c id o com o tra n s a c tiv a c ió n y re p r im e la e xp re s ió n de p ro te ín a s p ro in fla m a to r ia s en el c ito so l al a te n u a r las a cc io n e s en la in d u cc ió n g é n ica (a tra vé s de N F-kB, A P 1 , h o m o d ím e ro s ju n -ju n , e tc.). En p rinc ip io , los g lu co co rtico id e s se d e fine n co m o un su b g ru p o de co rtico s te ro id e s . A d e m á s, se co n o ce una nueva c la se de co m p u e s to s con a c tiv id a d g lu co co rtico id e (S E G R A , a g o n is ta s se le c tivo s del re ce p to r de g lu co co rtico id e s ). E s to s co m p u e s to s e je rce n só lo a lg u n a s de las a cc io n e s de los g lu co co rtico id e s a g o n is ta s com p le to s , es dec ir, no log ran o b te n e r el e sp e c tro co m p le to de tra n sa c tiva c ió n , tra n s re p re s ió n y a cc io n e s in d ire c ta s sob re la ind u cc ión g é n ica (a tra vé s de N F -kB, A P 1, h o m o d ím e ro s ju n -ju n , etc.). P o r a n a lo g ía con los m o d u la d o re s se le c tivo s del re ce p to r de e s tró g e n o s (S E R M = ta m o x ife n o , ra lox ifen o , to re m ife n o ), e s to s co m p u e s to s ta m b ié n se d e n o m in a n m o d u la d o re s se le c tivo s del re ce p to r de g lu co co rtico id e s (S E R M ). Los e je m p lo s de S E G R A /S E G R M inc luyen m a p ra c o ra t (= B O L 303242 X = Z K 245186 ), co m p u e s to A, R U 24856 , R U 24782 , R U 40066 , Z K 216348.
Un e je m p lo im p o rta n te de g lu co co rtico id e s n a tu ra le s es el co rtiso l (o h id ro co rtiso n a ) q ue es e se n c ia l para la v id a y re gu la o a p o ya una v a r ie d a d de fu n c io n e s c a rd io va scu la re s , m e ta bó licas , in m u n o ló g ica s y h o m e o s tá tica s im p orta n te s .
T a m b ié n h ay va r io s g lu co co rtico id e s s in té tico s d isp on ib le s .
Los g lu co co rtico id e s a c tú an en tre s ca m p o s p rinc ip a le s , es dec ir, el cam p o de d e sa rro llo inm u n o ló g ico , m e ta b ó lico y fe ta l. En el cam p o inm un ita rio , re gu lan p or in c re m e n to la e xp re s ió n de p ro te ína s a n tiin fla m a to r ia s y re gu lan p o r d ism in u c ió n la e xp re s ió n de p ro te ín a s p ro in fla m a to ria s . Los e fe c to s m e ta b ó lico s pueden re su m irse de la s ig u ie n te m anera :
• E s tim u la c ió n de la g lu co n e o g é n e s is , p a rticu la rm e n te en el h ígado: e sta ru ta da co m o re su lta d o la s ín tes is de g lu co sa a p a rtir de su s tra to s no hexosa ta le s com o a m in o á c id o s y g lice ro l a p a rtir de la d e sco m p o s ic ió n de tr ig licé r id o s y es p a rticu la rm e n te im p o rta n te en c a rn ívo ro s y d e te rm in a d o s herb ívo ro s . P o te n c ia r la e xp re s ió n de e n z im a s im p lica d a s en la g lu c o n e o g é n e s is es p ro b a b le m e n te la fu n c ió n m e ta b ó lica m e jo r co n o c id a de los g lu co co rtico id e s .
• M o v iliza c ió n de a m in o á c id o s de te jid o s e x tra h e p á tico s : s irven com o su s tra to s para la g lu co n e o g é n e s is .
• Inh ib ic ión de la ca p ta c ió n de g lu co sa en te jid o m u sc u la r y a d ip oso : los á c id os g ra so s lib e ra d o s p or la lip ó lis is se usan para la p ro d u cc ió n de e n e rg ía en te jid o s com o el m ú scu lo , y el g lice ro l lib e ra d o p ro p o rc io n a o tro su s tra to para la g lu co n e o g é n e s is .
En el d e sa rro llo fe ta l, los g lu co co rtico id e s p rom ue ve n la m a d u ra c ió n del pu lm ó n y la p ro d u cc ió n del te n s io a c tiv o que es n e ce sa rio para la fu n c ió n p u lm o n a r e x tra u te rin a . S on o tras su s ta n c ia s c lave p ara el d e sa rro llo no rm a l del cereb ro .
Se ha c re a d o una v a r ie d a d de g lu co co rtico id e s s in té ticos , a lg u n o s m u ch o m á s p o ten tes q ue el cortiso l, para uso te ra p é u tico .
Se d ife re n c ia n en fa rm a c o c in é tic a (a bso rc ión , sem iv id a , v o lu m e n de d is trib u c ió n , a c la ra m ie n to ) y en fa rm a co d in á m ica . La p o te n c ia de los g lu co co rtico id e s , la d u ra c ió n del e fe c to y la su p e rp o s ic ió n de la p o te n c ia de los m in e ra lo co rtico id e s va ría n . El co rtiso l (h id ro c o rtiso n a ) es la co m p a ra c ió n co n ve n c io n a l para la po ten c ia de los g lu co co rtico id e s . La h id ro co rtiso n a es el n om b re usa do p ara las p re p a ra c io n e s fa rm a c é u tic a s de co rtiso l. La p o te n c ia ora l p uede se r m e n o r q ue la p o te n c ia p are n te ra l d ado q ue ca n tid a d e s s ig n ifica tiva s (h as ta el 50% en a lg u n o s caso s) pueden a b so rb e rse en el in tes tino .
E je m p lo s son:
H id ro co rtiso n a , a ce ta to de co rtiso na , c o rtiso n a /co rtiso l, f lu o ro co rto lo n a , p red n iso na , p re d n iso lon a , m e tilp re d n iso lo n a , tr ia m c in o lo n a , d e xa m e ta so n a , b e ta m e ta so n a , p a ra m e ta son a .
A d e m á s, hay c o m p u e s to s q ue só lo im itan a lg u n a s pero no to d a s las a cc io n e s de los g lu co co rtico id e s ; e stos co m p u e s to s se d e n o m in a n S E G R A (a g o n is ta s se le c tivo s de l re ce p to r de g lu co co rtico id e s ). Los e je m p lo s de S E G R A /S E G R M inc lu ye n m a p ra c o ra t (= B O L 303242 X = Z K 245186 ), c o m p u e s to A, R U 24856 , R U 24782 , R U 40066 , Z K 216348.
E s te ro id e s p rin c ip a lm e n te para a p lica c ió n loca l (p o r e je m p lo , p u lve riza d o r-p u lm ó n , s u p o s ito rio -co lo n , c re m a-p ie l): h id ro co rtiso n a , b e c lo m e ta so n a , b ud eson ida , flu tica so n a , flu n iso lid a , m o m e ta so n a , c ic le son ida , c lob e ta so na .
Fue m u y so rp re n d e n te e n c o n tra r q ue la p rod u cc ión de M IF de m a c ró fa g o s y cé lu la s T fue in d u c id a en lu g a r de in h ib id a p o r g lu co co rtico id e s en ro e d o re s (C a la n d ra T, B em ha ge n J, M e tz CN et al., (1995 ) M IF as a g lu co co rtico id ind u ce d m o d u la to r o f cy to k in e p rod u ctio n . Nature 377: 68-71 ; y B a ch e r M, M e tz CN, C a la n d ra T, et al., (1996 ) A n e sse n tia l re g u la ro ry ro le fo r m a c ro p h a g e m ig ra tio n in h ib ito ry fa c to r in T -ce ll a c tiva tion . P N A S 93: 7849 -7854 ).
C o m o se con oc ía q ue el M IF tie n e p ro p ie d a d e s p ro in fla m a to ria s , e s to s re su lta d o s p a re c ie ro n al p rin c ip io p a ra d ó jico s y d ifíc ile s de co n c ilia r. P os te rio rm e n te , sin em ba rg o , se d e scu b rió q ue el M IF a nu la en e fe c to los h echos in m u n o su p re so re s a n tiin fla m a to r io s de los g lu co co rtico id e s .
A u n q u e se ha d e m o s tra d o q ue los g lu co co rtico id e s son ú tiles y e x ito so s en el tra ta m ie n to de v a r ia s e n fe rm e d a d e s y tra s to rn o s d ife re n te s (vé ase a con tin u a c ió n ), la a d m in is tra c ió n puede te n e r una va rie d a d de e fe c to s secu nd a rio s , d e p e n d ie n d o del tip o de m e d ic a m e n to usado . Los e fe c to s s e cu n d a rio s m ás co m u n e s inc luyen
• In m u n o su p re s ió n
• H ip e rg lu ce m ia d e b id o al a u m e n to de la g lu co n e o g é n e s is , re s is te n c ia a la insu lina e in to le ra n c ia a la g lu co sa (“ d ia b e te s e s te ro id e a ”)
• F ra g ilid a d de la p iel a u m e n ta d a , fác il de m a g u lla r
• B a la n ce de ca lc io n e g a tivo d e b id o a la a b so rc ió n in te s tin a l de ca lc io re d u c id a
• O s te o p o ro s is in d u c id a p o r e s te ro id e s ; d en s id a d óse a re du c ida (o s te o p o ro s is , o s te o n e c ro s is , m a yo r rie sgo de fra c tu ra , re pa ra c ió n de fra c tu ra m ás len ta)
• A u m e n to de peso d e b id o al a u m e n to de la d e p o s ic ió n de g ra sa v isc e ra l y tro n ca l (o b e s id a d ce n tra l) y e s tim u la c ió n del a pe tito
• In su fic ie n c ia su p ra rre n a l (si se usa d u ra n te m u ch o tie m p o y se d e tie n e re p e n tin a m e n te s in d ism in u ir) • R u p tu ra m u sc u la r (p ro te ó lis is ), d eb ilid a d ; m a sa m u sc u la r y re p a ra c ió n re du c ida s
• E xp a n s ió n de a lm o h a d illa s de g rasa m a la r y d ila ta c ió n de p eq ue ño s v a so s sa n g u ín e o s en la piel
• A n o vu la c ió n , irre g u la rid a d de los p e rio d o s m e n s tru a le s
• In su fic ie n c ia de c re c im ie n to , re tra so p ub era l
• A m in o á c id o s p la sm á tico s a u m e n ta d o s , fo rm a c ió n de urea a u m e n ta da ; b a la nce n eg a tivo de n itróg en o • E fec to e xc ita d o r so b re el s is te m a n e rv io so cen tra l (e u fo ria , p s icos is )
• G la u co m a d e b id o a p res ió n c ra ne a l a u m e n ta d a
• C a ta ra ta s
La co m b in a c ió n de p ro b le m a s c lín ico s p ro d u c id o s p o r g lu co co rtico id e s en exce so y p ro lo ng a do s, s in té tico s o e nd óg en os , se d e n o m in a s ín d ro m e de C ush ing .
A d e m á s de los e fe c to s e n u m e ra d o s a n te rio rm e n te , el uso de e s te ro id e s a d os is a lta s d u ra n te m á s de una se m a n a co m ie n za a p ro d u c ir la sup re s ió n de las g lá n d u la s su p ra rre n a le s del p ac ie n te ya q ue los g lu co co rtico id e s e xó ge no s su p rim e n la h o rm o n a lib e ra d o ra de co rtic o tro p in a h ip o ta lá m ica (C R H ) y la h o rm o n a a d re n o c o rtic o tró p ic a h ip o fisa ria (A C T H ). C on la su p re s ió n p ro lo ng a da , las g lá n d u la s su p ra rre n a le s se a tro fia n (se e ncog en fís ic a m e n te ) y pueden ta rd a r m e se s en re c u p e ra r la fu n c ió n co m p le ta d e sp u é s de la in te rru p c ió n del g lu co co rtico id e exógeno .
D u ra n te e ste tie m p o de re cu p e ra c ió n , el p ac ie n te es v u ln e ra b le a in su fic ie n c ia su p ra rre n a l en m o m e n to s de estrés, ta l co m o una e n fe rm ed ad .
P o r ú ltim o , pero no m e no s im p orta n te , los p ac ie n te s q ue re c ib ie ro n g lu co co rtico id e s d u ra n te p e río d o s p ro lo n g a d o s ta m b ié n pueden d e s a rro lla r re s is te n c ia a los g lu co co rtico id e s . En e s to s p ac ien tes , inc lu so las d os is a lta s de g lu co co rtico id e s no son su fic ie n te s para p ro vo ca r una re spu es ta a n tiin fla m a to r ia a d e cu a d a (B a rn e s PJ, A d c o c k IM. G lu co rtico id re s is ta n ce in in fla m m a to ry d isease . L a n ce t 2009 30 de m ayo ; 373 (9678 ): 1905-1917 ).
Los e fe c to s s e cu n d a rio s e n u m e ra d o s a n te r io rm e n te a um e n ta n g ra ve m e n te si se a u m e n ta la d o s ifica c ió n del fá rm a co g lu c o c o rtico id e a d m in is tra d o . D ism in u ir la can tid a d del fá rm a co a d m in is tra d o g e n e ra lm e n te ta m b ié n d ará com o re su lta d o e fe c to s se cu n d a rio s m ás ba jos o a liv iados.
P o r tan to , s igu e e x is tie n d o una n eces id ad u rg e n te en la té c n ica de p ro p o rc io n a r una te ra p ia para e n fe rm e d a d e s y tra s to rn o s re la c io n a d o s con M IF q ue p e rm ita la re d u cc ió n de la d os is de a d m in is tra c ió n de un g lu co co rtico id e dado.
Descripción de la invención
E ste o b je to se ha re su e lto m e d ia n te la p re se n te invenc ión .
En p articu la r, pudo d e m o s tra rse que m e d ia n te una te ra p ia de co m b in a c ió n de a n ticu e rp o s a n ti-M IF y un g lu co co rtico id e dado, pod ía d e te c ta rse un e fe c to s in é rg ico q ue p e rm itir ía el tra ta m ie n to de e n fe rm e d a d e s re la c io n a d a s con M IF con una d o s ifica c ió n m á s ba ja del g lu co co rtico id e y /o lo g ra r un m a yo r e fe c to con una d o s ifica c ió n s im ila r en co m p a ra c ió n con el tra ta m ie n to de e sta e n fe rm e d a d con el g lu co co rtico id e solo .
En p a rticu la r, p udo d e m o s tra rse q ue un tra ta m ie n to m e d ia n te una te ra p ia de co m b in a c ió n de a n ticu e rp o s a n ti-o xM IF y un g lu co co rtico id e d ad o e stá a so c ia d o con un e fe c to s iné rg ico , ta l com o se d e sc rib ió a n te r io rm e n te y se e je m p lifica en los e je m p lo s de la p re se n te inve nc ión .
Los n ive les e le va d o s de M IF, es dec ir, los n ive les de M IF en g en e ra l, se d e te c ta n d e sp u é s de l in ic io de d ive rsa s e n fe rm e d a d e s , en tre o tros , d e sp u é s de l in ic io de e n fe rm e d a d e s in fla m a to ria s o cán ce r. S in e m ba rg o , el M IF c ircu la ta m b ié n en su je to s sanos, lo que d ificu lta una c la ra d ife re n c ia c ió n . oxM IF , p o r el con tra rio , no está p rese n te en su je to s sanos . o xM IF a u m e n ta en e s ta d o s p a to ló g ico s y es d e te c ta b le en m u e s tra s de p a c ie n te s com o, p o r e jem p lo , san gre , sue ro y o rina .
Se ha d e scu b ie rto d e sp u é s de una in ve s tig a c ió n e xh a u s tiva de M IF y sus a n ticu e rp o s que los a n ticu e rp o s R AB9, R A B 4 y R A B 0 se unen e sp e c ífica m e n te a o xM IF (y son in ca p a ce s de u n irse a redM iF ). E s ta un ión ta m b ié n se o b se rva para los a n ticu e rp o s R A M 9, R A M 4 y R AM 0.
En e xp e rim e n to s a n te r io re s lle va d o s a cab o p o r los in ve n to re s , p udo d e m o s tra rse q ue los p ro ce d im ie n to s o x id a tivo s com o la o x id a c ió n m e d ia d a p o r c is tin a , la o x id a c ió n m e d ia d a p o r G S S G (ox. g lu ta tió n ) o la in cu b a c ió n de M IF con P ro c lin 300 o los a ge n tes re ticu la n te s de p ro te ína s (p o r e jem p lo , B M O E ) p ro vo ca n la un ión de M IF a los a n ticu e rp o s m e n c io n a d o s a n te rio rm e n te .
Las so rp re n d e n te s co n c lu s io n e s a lca n za d a s p o r los p re se n te s inve n to re s son:
• La m o du lac ión re do x (o x ida c ió n leve m e d ia d a p o r c is tin a /G S S G ) de M IF re co m b in a n te (h um an o , m urino , ra ta, C H O , m o n o )) o el tra ta m ie n to de M IF re co m b in a n te con P ro c lin 300 o a ge n tes re ticu la n te s de p ro te ína s co n d u ce a la un ión de los a n ticu e rp o s a n ti-M IF R A B 9, R A B 4 y R A B 0 de B ax te r
• La re du cc ió n de o xM IF c o n d u ce a la p é rd ida de un ión a A c
• La e sp e c ific id a d de las iso fo rm a s de o xM IF se c o rre la c io n a con la e fica c ia b io ló g ica del A c in vivo.
• Los n ive les de o xM IF p ueden c o rre la c io n a rse con un e s ta do p a to lóg ico .
E ste c o n o c im ie n to a d ic io n a l con re sp e c to al (o x )M IF s irv ió de base para e s tu d io s p o s te rio re s de los p rese n te s inve n to re s.
A lg u n a s re a liza c io n e s p re fe rid a s de la p re se n te inve nc ión son:
1. Un a n ticu e rp o a n ti-M IF en co m b in a c ió n con un g lu co co rtico id e para su uso en el tra ta m ie n to de una e n fe rm e d a d re ce p tiva a los g lu co co rtico id e s .
2. El a n ticu e rp o a n ti-M IF en co m b in a c ió n con un g lu c o c o rtico id e seg ún el p un to 1, en el q ue la e n fe rm e d a d re cep tiva a los g lu c o c o rtico id e s re spo nd e al tra ta m ie n to con un g lu co co rtico id e .
3. El a n ticu e rp o a n ti-M IF en co m b in a c ió n con un g lu co co rtico id e seg ún los pun to s 1 ó 2, para uso en el tra ta m ie n to de in fla m ac ió n , a le rg ia , c á n c e r o asm a.
4. El a n ticu e rp o a n ti-M IF en co m b in a c ió n con un g lu co co rtico id e seg ún los p u n to s 1, 2 ó 3, en el que el a n ticu e rp o es un a n ticu e rp o an ti-o xM IF .
5. La co m b in a c ió n seg ún uno cu a lq u ie ra de los p u n to s 1-4, en la que el a n ticu e rp o a n ti-M IF se se le cc io n a del s ig u ie n te g rupo : a n ticu e rp o a n ti-M IF Ra B9, R A B 4, R A B 0, R A M 9, R A m 4 y /o R AM 0.
6. La co m b in a c ió n seg ún cu a lq u ie ra de los p u n to s 1 a 5, en la que el g lu co co rtico id e se s e le cc io n a de l g rup o que co n s is te en a g o n is ta s de l re c e p to r de g lu co co rtico id e s , p o r e je m p lo , m e tilp re d n iso lo n a , p re d n iso lo n a , tr im a c in o lo n a , d e xa m e ta so n a , p a ra m e ta so n a , f lu o rco rto lo n a , bud eson ida , flu tica so n a , f lu n iso lid a , c ic le son ida , m o m eta so na , c lo b e ta so n a , co rtiso n a e h id ro co rtiso n a , y S E G R A /S E G R M a n tiin fla m a to r io s (p o r e je m p lo , m a p ra c o ra t (= B O L 303242 X = Z K 245186 ), c o m p u e s to A, R U 24856 , R U 24782 , R U 4 G 066 , Z K 216348).
7. La co m b in a c ió n según cu a lq u ie ra de los pun to s 1 a 6, en la que el a n ticu e rp o a n ti-M IF es uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s R AB9, R A B 4 o R A B 0 o R A M 9, R A M 4 o R AM 0, p re fe rib le m e n te el a n ticu e rp o R A M 9, el g lu co co rtico id e se s e le cc io n a de l g rup o de (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta so n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e so n id a en el ca so de a d m in is tra c ió n loca l y la e n fe rm e d a d re la c io n a d a con M IF es in fla m a c ió n , en p a rtic u la r ne fritis , inc luso m ás p re fe rid a nefritis lúp ica , g o m e ru lo n e fritis , n e fro pa tía p o r IgA o IgM, v a scu lit is s is té m ica s (p o r e jem p lo , p o lia rte r itis nodosa , g ra n u lo m a to s is de W e g e n e r y p ú rpu ra de S ch o e n le in H en och), n e fritis a n ti-G B M y/o g lo m e ru lo n e fr it is rá p id a m e n te p ro g re s iva (tip o I, II, III o IV), com o , p o r e je m p lo , n e fritis p o r A N C A (a n ticu e rp o s c ito p la s m á tic o s a n ti-n e u tró filo s ).
8. La co m b in a c ió n según cu a lq u ie ra de los pun to s 1 a 6, en la que el a n ticu e rp o a n ti-M IF es uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s R AB9, R A B 4 o R A B 0, o R AM 9, R A M 4 o R A M 0 p re fe rib le m e n te el a n ticu e rp o R A M 9, el g lu co co rtico id e se s e le cc io n a de l g rup o de (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta so n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e so n id a en el caso de a d m in is tra c ió n loca l y la e n fe rm e d a d re la c io n a d a con M IF es n e fritis lúp ica.
9. La co m b in a c ió n según cu a lq u ie ra de los pun to s 1 a 6, en la q ue el a n ticu e rp o a n ti-M IF es uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s R A B 9, R A B 4 o R A B 0, o R A M 9, R A M 4 o R A M 0, p re fe rib le m e n te r A m 9, el g lu c o c o rtico id e se s e le cc io n a del g rup o de (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta so n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e so n id a en el ca so de a d m in is tra c ió n loca l y la e n fe rm e d a d re la c io n a d a con M IF es lupus e rite m a to so s is té m ico .
10. La te ra p ia de co m b in a c ió n seg ún cu a lq u ie ra de los p un tos 1 a 6, en la que el a n ticu e rp o a n ti-M IF es uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s R A B 9, Ra B4 o R AB0, o R A M 9, R A M 4 o Ra M 0, p re fe rib le m e n te R A M 9, el g lu co co rtico id e se se le cc io n a del g rup o de d e xa m e ta so n a y (m e til)p re d n iso lo n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e so n id a en el caso de a d m in is tra c ió n loca l y la e n fe rm e d a d re la c io n a d a con M IF es in fla m a c ió n cu tá ne a .
11. La te ra p ia de co m b in a c ió n seg ún cu a lq u ie ra de los p un tos 1 a 6, en la que el a n ticu e rp o a n ti-M IF es uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s R A B 9, Ra B4 o R AB0, o R A M 9, R A M 4 o Ra M 0, p re fe rib le m e n te R A M 9, el g lu co co rtico id e se se le cc io n a del g rup o de d e xa m e ta so n a y (m e til)p re d n iso lo n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e so n id a o h id ro co rtiso n a en el caso de a d m in is tra c ió n loca l y la e n fe rm e d a d re la c io n a d a con M IF e stá p ro vo ca d a p o r una re sp u e s ta in m u n ita ria m e d ia d a p o r cé lu la s T.
12. La te ra p ia de co m b in a c ió n seg ún los p un to s 10 u 11, en la q ue la re sp u e s ta in m u n ita ria m e d ia d a p o r cé lu la s T es in fla m a c ió n cu tá ne a , p o r e je m p lo , p so ria s is o h ip e rse n s ib ilid a d de con tac to .
13. La te ra p ia de c o m b in a c ió n seg ún uno c u a lq u ie ra de los p u n to s 10-12 , en la q ue el g lu c o c o rtico id e es b u d e so n id a y en la q ue la b u d e so n id a se fo rm u la para a p lica c ió n tóp ica .
14. La te ra p ia de co m b in a c ió n ta l co m o se re iv in d ica en cu a lq u ie ra de los p u n to s 1 a 5, en la q u e el a n ticu e rp o a n ti-M IF es uno cu a lq u ie ra de los a n tic u e rp o s R A B 9, R A B 4 o Ra B 0, o R A M 9, R A M 4 o R A M 0, p re fe rib le m e n te r A m 9, el g lu c o c o rtico id e es b u d e so n id a y la e n fe rm e d a d re la c io n a d a con M IF es e n fe rm e d a d in te s tin a l in fla m a to ria (E II), en la q ue la EII se se le cc io n a de co litis u lce ro sa y e n fe rm e d a d de C rohn .
15. La te ra p ia de c o m b in a c ió n ta l co m o se d e fin e en cu a lq u ie ra de los p u n to s 1 a 6, en la q ue el a n ticu e rp o a n ti-M IF es uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s R AB9, R A B 4 o r A b 0, o R A M 9, R A M 4 o R AM 0, p re fe rib le m e n te R A M 9, el g lu co co rtico id e se se le cc io n a del g rup o de (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta so n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y la b u d e so n id a en el caso de a d m in is tra c ió n loca l y la e n fe rm e d a d re la c io n a d a con M IF es e sc le ro s is m ú ltip le .
16. Un k it que co m p re n d e la co m b in a c ió n ta l com o se d e fine en cu a lq u ie ra de los p un tos 1 a 15 an te rio res , e in s tru cc io n e s de uso.
17. U na c o m b in a c ió n ta l co m o se d e fin e en cu a lq u ie ra de los p u n to s 1 a 15 a n te r io re s , o el k it de l p un to 16, p a ra su uso en el tra ta m ie n to de una e n fe rm e d a d re ce p tiva a los g lu co co rtico id e s , en p a rticu la r in fla m a c ió n , a le rg ia , asm a o cáncer.
Los a n ticu e rp o s m e n c io n a d o s a n te rio rm e n te se ca ra c te r iza n y re spa lda n ta n to p o r sus s e cu e n c ia s com o p o r d e p ó s ito s co m o p lá sm id o s en E. coli (ce pa T G 1), q ue co m p re n d e o b ien la ca d e n a lige ra o b ien la ca d e n a p e sa d a de cad a uno de los a n ticu e rp o s m e n c io n a d o s a n te r io rm e n te R A B 0, R A B 4 y R A B 9, re sp e c tiva m e n te y R A M 0, R A M 4 y R A M 9, re sp e c tiva m e n te .
Los p lá sm ido s se ca ra c te riza n p o r su n ú m e ro DSM , que es el núm e ro o fic ia l o b te n id o tra s el d ep ó s ito en v irtud del T ra ta d o de B u d a p e s t en la C o le cc ió n A le m a n a de M ic ro o rg a n is m o s y C u ltivo s C e lu la re s (D S M Z ), M a sc h e ro d e r W e g 1b, B ra u n sch w e ig , A le m a n ia . Los p lá sm id o s se d e p o s ita ro n en cep as de E. coli, re sp e c tiva m e n te .
El p lá sm id o con el n ú m e ro D SM 25110 co m p re n d e la se cu e n c ia de ca d e n a lige ra de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R AB4. El p lá sm id o con el n úm e ro D SM 25112 co m p re n d e la se cu e n c ia de ca d e n a p esad a (Ig G 4 ) de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R AB4.
La co e xp re s ió n de los p lá sm id o s D SM 25110 y D SM 25112 en una cé lu la hué sp ed a d e cu a d a da com o re su lta d o la p ro d u cc ió n de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R A B 4 p re fe rido .
El p lá sm id o con el n ú m e ro D SM 25111 co m p re n d e la se cu e n c ia de ca d e n a lige ra de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R AB9. El p lá sm id o con el n úm e ro D SM 25113 co m p re n d e la se cu e n c ia de ca d e n a p esad a (Ig G 4 ) de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R AB9.
La co e xp re s ió n de los p lá sm id o s D SM 25111 y D SM 25113 en una cé lu la hué sp ed a d e cu a d a da com o re su lta d o la p ro d u cc ió n de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R A B 9 p re fe rido .
El p lá sm id o con el n ú m e ro D SM 25114 co m p re n d e la se cu e n c ia de ca d e n a lige ra de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R AB0. El p lá sm id o con el n úm e ro D SM 25115 co m p re n d e la se cu e n c ia de ca d e n a p esad a (Ig G 4 ) de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R AB0.
La co e xp re s ió n de los p lá sm id o s D SM 25114 y D SM 25115 en una cé lu la hué sp ed a d e cu a d a da com o re su lta d o la p ro d u cc ió n de l a n ticu e rp o a n ti-M IF R A B 0 p re fe rido .
Se d e p o s ita ro n p lá sm id o s a d ic io n a le s según el T ra ta d o de B u d a p e s t el 12 de a bril de 2012 en la D S M Z para las s e cu e n c ia s de ca d e n a lige ra y p e sad a de R A M 0, R A M 4 y R A M 9, re sp e c tiva m e n te , de la s ig u ie n te m anera :
R A M 9 (ca d e n a p esad a): E. coli G A .662 -01.p R A M 9 h c - D S M 25860.
R A M 4 (ca d e n a lige ra ): E. coli G A .906 -04.p R A M 4 lc - D S M 25861.
R A M 9 (ca d e n a lige ra ): E. coli G A .661 -01.p R A M 9 lc - D S M 25859.
R A M 4 (ca d e n a p esad a ): E. coli G A .657 -02.p R A M 4 h c - D S M 25862.
R A M 0 (ca d e n a lige ra ): E. coli G A .906 -01.p R A M 0 lc - D S M 25863.
R A M 0 (ca d e n a p esad a): E. coli G A .784 -01.p R A M 0 h c - D S M 25864.
El té rm in o tra ta m ie n to “ p ro filá c tic o ” o “te ra p é u tic o ” está re co n o c id o en la té c n ica y se re fie re a la a d m in is tra c ió n de un fá rm a co a un pac ien te . Si se a d m in is tra an tes de la m a n ife s ta c ió n c lín ica del e s ta do no d e se a d o (p o r e jem p lo , e n fe rm e d a d u o tro e s ta d o no d e s e a d o de l a n im a l h ué sp ed ), e n to n ce s el tra ta m ie n to es p ro filá c tico , es dec ir, p ro te ge al h ué sp ed con tra el d e sa rro llo de l e s ta do no d eseado , m ie n tra s que si se a d m in is tra d e sp u é s de la m a n ife s ta c ió n de la e n fe rm e d a d del e s ta d o no d esea do , el tra ta m ie n to es te ra p é u tico (es dec ir, e stá d e s tin a d o a d ism in u ir, m e jo ra r o m a n te n e r el e s ta d o no d e se a d o e x is te n te o los e fe c to s s e cu n d a rio s del m ism o).
T a l com o se usa en el p rese n te d o cu m e n to , un co m p u e s to a n ti-(o x )M IF se re fie re a c u a lq u ie r a ge n te que a tenúa, inh ibe , se o pone , co n tra rre s ta o d ism in u ye la a c tiv id a d b io ló g ica de (o x )M IF . Un co m p u e s to a n ti(o x )M IF p ue de se r un a ge n te que inh ibe o n eu tra liza la a c tiv id a d de (o x )M IF , p o r e je m p lo , un a n ticue rp o , p a rticu la rm e n te p re fe rido , los a n ticu e rp o s ta l com o se d e sc rib e n en el p rese n te d o cu m e n to , inc lu so m ás p re fe rid o s los a n ticu e rp o s R A B 9, R A B 4 y /o R A B 0 o R A M 9, R A M 4 o R A M 0.
El a n ta g o n is ta de M IF p re fe rid o según la p rese n te inve n c ió n es un a n ticu e rp o a n ti-M IF . Inc lu so m ás p re fe rid o , el a n ticu e rp o a n ti-M IF es un a n ticu e rp o con tra oxM IF . En o tras re a liza c io n e s , los a n ticu e rp o s a n ti-o xM IF , p o r e jem p lo , los a n ticu e rp o s m e n c io n a d o s a n te r io rm e n te o una porc ión de un ión a a n tíg e n o de los m ism o s se unen a o xM IF con una K d de m e n o s de 100 nM , p re fe rib le m e n te una K d de m e no s de 50 nM , in c lu so m ás p re fe rid o con una K d de m e n o s de 10 nM.
La inve n c ió n se re fie re a d e m á s a k its q ue co m p re n d e n un a n ticu e rp o a n ti-M IF o una p o rc ió n de un ión a a n tíg e n o del m ism o , a s í com o un a ge n te g lu c o c o rtico id e según la inve nc ión . Un k it puede in c lu ir a d e m á s de l a n ticu e rp o y el a ge n te g lu co co rtico id e , a g e n te s te ra p é u tico s a d ic io n a le s y usos de los m ism os . Un k it ta m b ié n puede in c lu ir in s tru cc io n e s de uso en un m é to do te ra p é u tico .
Los re su lta d o s a n te r io re s han d e m o s tra d o q ue un a n ticu e rp o a n ti-M IF q ue só lo se une a o xM IF y no se une a re dM IF e inh ibe a d e m á s G C O y /o la p ro life ra c ió n c e lu la r ind u ce un e fe c to b e n e fic io so en un m o de lo an im a l.
Descripción detallada de la invención
La inve n c ió n se d e sc rib e a d ic io n a lm e n te en las fig u ra s ad jun tas .
Descripción de las figuras:
F ig u ra 1: d ia g ra m a e sq u e m á tico de l tra ta m ie n to de b úsqu ed a de d o s is con d e xa m e ta so n a ta l com o se llevó a cabo en el e je m p lo 1a.
F ig u ra 2: p ro te in u ria el d ía 8 d e sp u é s de la a d m in is tra c ió n de va r ia s d os is d ife re n te s de d e xa m e ta so n a .
F ig u ra 3: in filtra c ió n de m a c ró fa g o s d e sp u é s de la a d m in is tra c ió n de v a r ia s d o s is de d e xa m e ta so n a . Se d e te rm in ó el n ú m e ro de m a c ró fa g o s (cé lu la s p os itiva s para E D 1) p o r se cc ión tra n s v e rsa l g lo m e ru la r. Se m u e s tra el re su lta d o para cad a a n im a l, a sí com o la m e d ia para cad a grupo .
F ig ura 4: se m ilu n a s g lo m e ru la re s d e sp u é s de v a r ia s dos is de d e xa m e ta so n a . Se ind ica el p o rce n ta je de se m ilu n a s g lo m e ru la re s d e te rm in a d o p ara cad a a n im a l y se m u es tra la m e d ia para cad a grupo .
F ig u ra 5: d ia g ra m a e sq u e m á tico del h a lla zg o de d os is para el a n ticu e rp o a n ti-M IF R A M 9 en una fo rm u la c ió n de g lic in a seg ún el e je m p lo 1b.
F ig u ra 6: p ro te in u ria el d ía 8 d e sp u é s de d os d os is de a n ticu e rp o R A M 9.
F ig u ra 7: in filtra c ión de m a c ró fa g o s d e sp u é s de dos dos is de a n ticu e rp o R A M 9. S e d e te rm in ó el n ú m e ro de m a cró fa g o s (cé lu la s p os itiva s para E D 1) p o r se cc ión tra n s v e rsa l g lo m e ru la r. S e m u e s tra el re su lta d o para cada a n im a l, a s í com o la m e d ia p ara cad a grupo.
F ig ura 8: fo rm a c ió n de se m ilu n a s g lo m e ru la re s d e sp u é s de dos d os is de a n ticu e rp o R AM 9. S e ind ica el p o rce n ta je de se m ilu n a s g lo m e ru la re s d e te rm in a d o para cada a n im a l y se m u e s tra la m e d ia para cad a grupo .
F ig u ra 9: d ia g ra m a e sq u e m á tico del p rog ra m a de tra ta m ie n to p ara una co m b in a c ió n de d e xa m e ta so n a y a n ticue rp o R A M 9 según el e je m p lo 1c.
F ig u ra 10: re du cc ió n de p ro te in u ria d e sp u é s de l tra ta m ie n to co m b in a d o con a n ticu e rp o R A M 9 (in te rva lo de d os is 0­ 120 m g /kg ) y d e xa m e ta so n a (0 ,025 m g /kg ). Se re p re se n ta la m e d ia de dos e xp e rim e n to s in d e p e n d ie n te s . Las fle ch a s m u es tra n el % de re du cc ió n de p ro te in u ria p o r d ife re n te s d os is de d e xa m e ta so n a sin la a p lica c ió n de a n ticue rp os .
F ig u ra 11: re du cc ió n o b se rva d a de la in filtra c ió n de m a c ró fa g o s d e sp u é s de l tra ta m ie n to co m b in a d o con a n ticu e rp o R A M 9 (in te rva lo de d os is 0 -120 m g /kg ) y d e x a m e ta so n a (0 ,025 m g /kg ). S e re p re se n ta la m e d ia de d os e xp e rim e n to s in d e p e n d ie n te s . Las fle ch a s m u es tra n el % de re du cc ió n de la in filtra c ión de m a cró fa g o s p o r d ife re n te s dos is de d e xa m e ta s o n a sin la a p lica c ió n de a n ticue rp os .
F ig ura 12: re du cc ió n de la fo rm a c ió n de se m ilu n a s d e sp u é s del tra ta m ie n to co m b in a d o con a n ticu e rp o R A M 9 (in te rva lo de dos is 0 -120 m g /kg ) y d e xa m e ta s o n a (0 ,025 m g /kg ). S e re p re se n ta la m e d ia de dos e xp e rim e n to s in d e p e n d ie n te s . Las fle ch a s m u e s tra n el % de re du cc ió n de la fo rm a c ió n de se m ilu n a s p o r las d ife re n te s d os is de d e xa m e ta s o n a sin la a p lica c ió n de a n ticue rp os .
F ig u ra 13: respuesta de hipersensibilidad de contacto (CHS) a DNFB. R ea cc ió n de C H S a te n u a d a en la o re ja e xp u e s ta de ra ton es tra ta d o s con a n ti-M IF (R A M 9 ) en co m b in a c ió n con h id ro co rtiso n a (+ H C ) en co m p a ra c ió n con ra ton es tra ta d o s con R A M 9 sin a p lica c ió n de h id ro co rtiso n a (-H C ). Se usa ron ra ton es tra ta d o s con a n ticu e rp o de co n tro l de iso tip o (con o sin a p lica c ió n tó p ic a de h id ro co rtiso n a ) co m o co n tro l n ega tivo . Se usa ron o ch o ra to n e s p o r g ru p o y se cu a n tif icó la d e rm a tit is de co n ta c to de la o re ja re d u c id a m id ie n d o la d ife re n c ia de l g ro s o r de la o re ja e n tre la o re ja d e re ch a (e xp u e s ta ) y la izq u ie rd a (no exp ue s ta ).
Definiciones y técnicas generales
A m e n o s q ue se d e fin a lo co n tra r io en el p re se n te d o cu m e n to , los té rm in o s c ie n tíf ic o s y té c n ico s u sa do s en re lac ió n con la p rese n te inve nc ión te n d rá n los s ig n ifica d o s que co m ú n m e n te e n tien de n los e xp e rto s en la té cn ica . En gen e ra l, las n o m e n c la tu ra s u sa da s en re lac ió n con, y las té c n ica s de, cu ltivo de cé lu la s y te jid o s , b io lo g ía m o lecu la r, in m u n o lo g ía , m ic ro b io lo g ía , g en é tica y q u ím ica de p ro te ín a s y á c id o s n u c le ico s d e sc rita s en el p rese n te d o cu m e n to son a q u e lla s b ien co n o c id a s y co m ú n m e n te u sa d a s en la té cn ica . Los m é to d o s y té c n ica s de la p rese n te inve nc ión se re a liza n g e n e ra lm e n te seg ún m é to d o s c o n ve n c io n a le s b ien co n o c id o s en la té cn ica y ta l com o se d e sc rib e en d ive rsa s re fe re n c ia s g e n e ra le s y m ás e sp e c ífica s que se c itan y co m e n ta n a lo la rgo de la p rese n te m e m o ria d e sc rip tiva a m e no s que se ind iq ue lo con tra rio . V éa n se , p o r e je m p lo , S a m b ro o k et al., M o le c u la r C lon ing : A L a b o ra to ry M anua l, 2 a ed., C o ld S pring H a rb o r L a b o ra to ry P ress, C o ld S pring H arbor, N ue va Y o rk (1989 ) y A u su b e l et al., C u rre n t P ro to co ls in M o le c u la r B io logy , G re e n e P u b lish in g A s so c ia te s (1992 ) y H a rlo w and L ane A n tib o d ie s : A L a b o ra to ry M anua l, C o ld S pring H a rb o r L a b o ra to ry P ress, C old S pring H arbo r, N .Y . (1990 ), que se inco rp o ra n en el p re se n te d o cu m e n to com o re fe ren c ia .
“ M IF ” o “ fa c to r in h ib id o r de la m ig ra c ió n de m a c ró fa g o s ” se re fie re a la p ro te ína , que se co n o ce com o m e d ia d o r c rítico en la re sp u e s ta in m u n ita ria e in fla m a to ria , y com o c o n tra rre g u la d o r de g lu co co rtico id e s . El M IF inc lu ye M IF de m a m ífe ro , e sp e c ífica m e n te M IF h um a no (n ú m e ro de re g is tro p rim a rio S w iss -P ro t: P 14174 ), en el que la fo rm a m o n o m é rica se co d ifica com o una p ro te ína de 115 a m in o á c id o s pero se p rod u ce com o una p ro te ína de 114 a m in o á c id o s d eb ido a la e sc is ión de la m e tio n in a in ic ia l. “ M IF ” ta m b ié n inc lu ye “G IF ” (fa c to r de inh ib ic ió n de la g lic o s ila c ió n ) y o tras fo rm a s de M IF, ta le s co m o p ro te ín a s de fus ió n de M IF.
La n u m e ra c ió n de los a m in o á c id o s de M IF co m ie n za con la m e tio n in a N -te rm in a l (a m in o á c id o 1) y te rm in a con la a la n in a C -te rm in a l (a m in o á c id o 115).
“ M IF o x id a d o ” u o xM IF se d e fin e para los p ro p ó s ito s de la in ve n c ió n com o una iso fo rm a de M IF que se p rod u ce p o r tra ta m ie n to de M IF con re a c tivo s o x id a n te s suaves , ta le s com o la c is tina . T a l com o se ha d e m o s tra d o p o r la p rese n te inve nc ión , el o xM IF re co m b in a n te que se ha tra ta d o de esta m a n e ra co m p re n d e iso fo rm a (s ) de M IF que c o m p a rte (n ) re o rd e n a m ie n to s e s tru c tu ra le s con o xM IF que (p o r e je m p lo ) se p rod u ce in vivo d e sp u é s de la e xp o s ic ió n de a n im a le s a bacte rias .
P ara los p ro p ó s ito s de e s ta in ve n c ió n , re d M IF se d e fin e co m o M IF re d u c id o y es M IF q ue no se une a RABO, R A B 9 y /o R AB4.
Los a n ticu e rp o s a n ti-o xM IF d e sc rito s en esta inve nc ión son ca p a ce s de d is c rim in a r e n tre o xM IF y redM IF , que se g en e ran p o r o x id ac ión o re du cc ió n leve, re sp e c tiva m e n te . Los a n ticu e rp o s a n ti-o xM IF son ú tiles para d e te c ta r e sp e c ífica m e n te oxM IF . La d is c rim in a c ió n e n tre e stos c o n fo rm a d o re s se e va lúa m e d ia n te E L IS A o re so n a n c ia de p la sm ó n su p e rfic ia l. A m b a s té c n ica s pueden re a liza rse ta l co m o co n oce b ien un e xp e rto en la té c n ica y ta l com o se d e sc rib e a con tin u a c ió n .
E va lu a c ió n de la un ión d ife re n c ia l de los a n ticu e rp o s p o r B iacore .
La c in é tic a de u n ión de o xM IF y re dM IF al a n tic u e rp o R A B 9 y RABO se e xa m in a m e d ia n te a n á lis is de re so n a n c ia de p la sm ón su p e rfic ia l u sa nd o un s is te m a B iaco re 3000. Los a n ticu e rp o s se re cu b rie ro n en un ch ip C M 5 (= d ex tran o ca rb o x im e tila d o ) y se in ye c tó p ro te ín a M IF re co m b in a n te , p re v ia m e n te in cu b a d a con P ro c lin 300 al 0 ,2% . (P ro c lin 300 co n s is te en iso tia z o lo n a s o x id a tiva s q ue e s ta b iliza n la e s tru c tu ra de oxM IF ). En el ta m p ó n H B S -E P n a tivo (= ta m p ó n de tra n s fe re n c ia B ia co re ) sin la a d ic ió n de P ro C lin 300 , n in g u n a de las p ro te ín a s M IF re co m b in a n te s se u n ió a R A B 9, R A B 0 o al a n ticu e rp o de re fe re n c ia (a n ticu e rp o de con tro l de iso tipo irre le va n te ) usa do com o con tro l de un ión n e g a tivo (de fon do ).
En una re a liza c ió n p re fe rid a , o xM IF es M IF q ue e stá u n ido d ife re n c ia lm e n te p o r el a n ticu e rp o R AB9, R A B 4 y /o R A B 0 o un fra g m e n to de un ión a a n tíg e n o del m ism o, lo q ue s ig n ifica q ue e s to s a n ticu e rp o s se unen a o xM IF m ie n tra s que re dM IF no e stá u n ido p o r n in g un o de e s to s a n ticue rp os .
En o tras re a liza c io n e s , los a n ticu e rp o s a n ti-o xM IF , p o r e je m p lo , los a n ticu e rp o s m e n c io n a d o s a n te r io rm e n te o una p o rc ió n de u n ión a a n tíg e n o de los m ism o s se unen a o xM IF con u na K d de m e n o s de 100 nM , p re fe rib le m e n te una K d de m e no s de 50 nM, inc lu so m ás p re fe rid o con una K d de m e no s de 10 nM. En una re a liza c ió n aún m ás p re fe rid a , los a n ticu e rp o s se unen a o xM IF con una K d de m e no s de 5 nM.
La (n o ) un ión de un a n ticu e rp o , p o r e je m p lo , R AB9, R A B 4 o R A B 0 (p a ra o xM IF o re d M IF ) p uede d e te rm in a rse com o co n o ce g e n e ra lm e n te un e xp e rto en la té cn ica , s ien do e je m p lo s uno cu a lq u ie ra de los s ig u ie n te s m é to do s : E L IS A con M IF re co m b in a n te en su e s ta do re d u c id o u o x id ad o , o re so n a n c ia de p la sm ón su p e rfic ia l u sa nd o M IF re co m b in a n te en su e s ta d o re d u c id o u o x id ad o , com o el co n o c id o e n sa yo B iaco re , d e sc rito a n te rio rm e n te .
Un m é to d o p re fe rid o para la d e te rm in a c ió n de la un ión es la re so n a n c ia de p la sm ón su p e rfic ia l de un a n ticu e rp o a, p o r e je m p lo , re c .(o x )M IF tra s lo cua l “ u n ió n ” p re te nd e re p re se n ta rse con una K d de m e n o s de 100 nM p re fe rib le m e n te m e no s de 50 nM, in c lu so m á s p re fe rib le m e n te m e n o s de 10 nM m ie n tra s q ue la no un ión a re dM IF se ca ra c te r iza p o r una K D de m ás de 400 nM. “ U n ió n ” y “ un ión e sp e c ífica ” se usan in d is tin ta m e n te en el p rese n te d o cu m e n to para d e n o ta r lo an te rio r. “ U n ión d ife re n c ia l” en el co n te x to de e sta so lic itu d s ig n ifica que un com p ue s to , en p a rtic u la r los a n ticu e rp o s ta l co m o se d esc ribe n en el p re se n te d o cu m e n to , se unen a o xM IF (p o r e je m p lo , con los v a lo re s de K d m e n c io n a d o s a n te r io rm e n te ) m ie n tra s q ue no se unen a re d M IF (d e fin ié n d o se la no un ión de n ue vo ta l com o a n te rio rm e n te ).
Un “ a n tic u e rp o ” se re fie re a un a n ticu e rp o in ta c to o una p orc ión de un ión a a n tíg e n o que co m p ite con el a n ticue rp o in ta c to p o r la un ión (e sp e c ífica ). V éa se en genera l, F u n d a m e n ta l Im m u no log y, cap. 7 (P au l, W ., ed., 2 a ed. R aven P ress, N .Y . (1989 )) ( in c o rp o ra d o com o re fe ren c ia ). El té rm in o a n ticu e rp o inc lu ye a n ticu e rp o s h um anos , a n ticu e rp o s de m a m ífe ro s , a n ticu e rp o s a is la d o s y fo rm a s g e n é tica m e n te m o d ifica d a s ta le s co m o a n ticu e rp o s q u im é ricos , c a m e liza d o s o h u m a n iza d o s , a u n q u e no se lim ita a los m ism os.
El té rm in o “ p orc ión de un ión a a n tíg e n o ” de un a n ticu e rp o se re fie re a uno o m á s fra g m e n to s de un a n ticu e rp o que re tien en la cap ac id ad de u n irse e sp e c ífica m e n te a un a n tíge no (p o r e je m p lo , (o x )M IF ). Las p o rc io n e s de un ión a a n tíg e n o pueden p ro d u c irse m e d ia n te té c n ica s de A D N re co m b in a n te o m e d ia n te e sc is ió n e n z im á tica o q u ím ic a de a n ticu e rp o s in tac tos . Las p o rc io ne s de un ión a a n tíg e n o inc lu ye n , p o r e je m p lo , a un qu e no se lim itan a, lo s igu ien te : fra g m e n to s Fab, Fab ', F (ab ')2 , F v y de la re g ió n d e te rm in a n te de co m p le m e n ta rie d a d (C D R ), a n tic u e rp o s de ca d e n a se n c illa (scF v), a n ticu e rp o s q u im é rico s , a n ticu e rp o s y p o lip é p tid o s que con tien en al m e no s una p orc ión de un a n ticu e rp o que es su fic ie n te para c o n fe rir un ión de a n tíg e n o e sp e c ífica al po lip ép tid o , es dec ir, o xM IF o redM IF . D esde el e x tre m o N -te rm in a l hasta el e x tre m o C -te rm ina l, ta n to los d o m in io s v a r ia b le s m a d u ro s de ca d e n a lige ra co m o los de ca d e n a p esad a co m p re n d e n las re g io ne s FR1, C D R 1, FR2, C D R 2, FR3, C D R 3 y FR4. La a s ig na c ió n de a m in o á c id o s a cad a d o m in io e stá según las d e fin ic io n e s de K aba t, S e q u e n ce s o f P ro te in s o f Im m u n o lo g ica l In te re s t (In s titu to s N a c io n a le s de S a lud , B e th esd a , M a ry la n d (1987 y 1991)), C h o th ia et al. J. M ol. B iol. 196: 901 -917 (1987 ) o C h o th ia et al., N a tu re 342: 878 -883 (1989 ). Un a n ticu e rp o o porc ió n de un ión a a n tíg e n o del m ism o puede d e riva tiza rse o u n irse a o tra m o lé cu la fu n c io n a l (p o r e je m p lo , o tro pép tid o o p ro te ína ). P o r e je m p lo , un a n ticu e rp o o una porc ión de un ión a a n tíg e n o de l m ism o puede u n irse fu n c io n a lm e n te a una o m á s e n tid a d e s m o le cu la re s , ta le s com o o tro a n ticu e rp o (p o r e je m p lo , un a n ticu e rp o b ie sp e c ífico o un d ia cue rp o ), un a ge n te d e te c ta b le , un a ge n te c ito tóx ico , un a g e n te fa rm a cé u tico , y /o una m o lé cu la de unión.
El té rm in o “ K d” se re fie re en el p re se n te d o cu m e n to , según el co n o c im ie n to g e n e ra l de un e xp e rto en la té cn ica , a la co n s ta n te de d iso c ia c ión de e q u ilib rio de un a n ticu e rp o p a rticu la r con el a n tíg e n o re spe ctivo . E s ta co n s ta n te de d iso c ia c ió n de e q u ilib rio m id e la a fin ida d . La a fin ida d d e te rm in a cuá n to co m p le jo se fo rm a en el e q u ilib rio (e s ta do e s ta c io n a rio en el q ue la a so c ia c ió n e q u ilib ra la d iso c ia c ió n ) (en el p rese n te d o cu m e n to : o xM IF o re dM IF y a n ticue rp o ).
Ka = co n s ta n te de ta sa de a so c ia c ió n [M _1 s_1]
Kd = co n s ta n te de ta sa de d iso c ia c ió n [s_1]
K d = co n s ta n te de d iso c ia c ió n de e q u ilib rio = Kd/ka [M ]
El té rm in o “a n tic u e rp o h u m a n o ” se re fie re a c u a lq u ie r a n ticu e rp o en el que los d o m in io s v a r ia b le s y co n s ta n te s son s e cu e n c ia s h um a na s . El té rm in o a b a rca a n tic u e rp o s con se cu e n c ia s d e riva d a s de g e n e s h um a no s , pero q ue se han cam b ia d o , p o r e je m p lo , para d is m in u ir la p os ib le in m u n o g e n ic id a d , a u m e n ta r la a fin ida d , e lim in a r las c is te ín a s que pueden p ro v o ca r p le g a m ie n to no d esea do , e tc. El té rm in o a b a rca ta le s a n tic u e rp o s p ro d u c id o s de fo rm a re co m b in a n te en cé lu la s no hum a na s , que pueden , p o r e jem p lo , im p a rtir g lico s ila c ió n no típ ica de cé lu la s h um anas .
El té rm in o “ a n ticu e rp o h u m a n iz a d o ” se re fie re a a n ticu e rp o s q ue co m p re n d e n se cu e n c ia s h um a na s y que con tien en ta m b ié n s e cu e n c ia s no h um a na s ; en p a rticu la r, un “ a n ticu e rp o h u m a n iz a d o ” se re fie re a un a n ticu e rp o no h um a no en el q ue se han a ñ a d id o s e cu e n c ia s h u m a n a s y /o s e cu e n c ia s h um a n a s re e m p la za n las s e cu e n c ia s no hum a na s .
El té rm in o “ a n ticu e rp o c a m e liz a d o ” se re fie re a a n ticu e rp o s en los q ue la e s tru c tu ra o se cu e n c ia s de a n ticu e rp o s se ha ca m b ia d o para p a re ce rse m á s a los a n ticu e rp o s de los cam e llos , ta m b ié n d e n o m in a d o s a n ticu e rp o s cam é lido s . Los m é to d o s para el d ise ño y la p rod u cc ión de a n ticu e rp o s c a m e liza d o s fo rm a n parte de l co n o c im ie n to g en e ra l de un e xp e rto en la técn ica .
El té rm in o “ a n ticu e rp o q u im é ric o ” se re fie re a un a n ticu e rp o que co m p re n d e re g io n e s de dos o m ás e sp ec ie s d ife re n te s .
El té rm in o “ a n ticu e rp o a is la d o ” o “ porc ión de un ión a a n tíg e n o a is la da de l m is m o ” se re fie re a un a n ticu e rp o o una p o rc ió n de un ión a a n tíg e n o d e l m ism o q ue se ha id e n tif ic a d o y s e le cc io n a d o de una fu e n te de a n tic u e rp o s ta l co m o una b ib lio te ca de p re se n ta c ió n de fa g o s o un re p e rto rio de cé lu la s B.
La p ro d u cc ió n de los a n ticu e rp o s a n ti-(o x )M IF seg ún la p re se n te in ve n c ió n inc lu ye c u a lq u ie r m é to d o para la g e n e ra c ió n de A D N re co m b in a n te m e d ia n te in g e n ie ría g en é tica , p o r e je m p lo , m e d ia n te tra n sc rip c ió n in ve rsa de A R N y /o a m p lif ica c ió n de A D N y c lo n a c ió n en v e c to re s de e xp re s ió n . En a lg u n a s re a liza c io n e s , el v e c to r es un v e c to r v ira l, en el que pueden lig a rse se g m e n to s de A D N a d ic io n a le s en el g e n o m a v ira l. En a lg u n a s re a liza c io n e s , el v e c to r es cap az de re p lica c ió n a u tó n o m a en una cé lu la hué sp ed en la que se in tro d u ce (p o r e je m p lo , ve c to re s b a c te ria n o s que tie n e n un o rigen b a c te ria n o de re p lica c ió n y ve c to re s e p iso m a le s de m a m ífe ro ). En o tras re a liza c io n e s , el v e c to r (p o r e jem p lo , v e c to re s de m a m ífe ro s no e p iso m a le s ) puede in te g ra rse en el g e n o m a de una cé lu la hué sp ed tra s la in tro d u cc ió n en la cé lu la h ué sp ed y, p o r tan to , re p lica rse ju n to con el g e n o m a de l huésped . A d e m á s , d e te rm in a d o s v e c to re s son ca p a ce s de d ir ig ir la e xp re s ió n de g enes a los que e stán un idos o p e ra tiv a m e n te . D ich os v e c to re s se d e n o m in a n en el p re se n te d o cu m e n to “v e c to re s de e xp re s ió n re c o m b in a n te s ” (o s im p le m e n te , “ve c to re s de e xp re s ió n ”).
P ueden p ro d u c irse a n tic u e rp o s a n ti-(o x )M IF , e n tre o tros , p o r m e d io de ve c to re s de e xp re s ió n co n ve n c io n a le s , ta le s co m o ve c to re s b a c te ria n o s (p o r e je m p lo , p B R 322 y su s d e riva d o s ) o ve c to re s e u ca rio ta s . E sas se cu e n c ia s que co d ifica n para el a n ticu e rp o p ueden p ro p o rc io n a rse con se cu e n c ia s re g u la d o ra s que re gu lan la rep lica c ió n , e xp re s ió n y /o se c re c ió n de la cé lu la hué sp ed .
E stas se cu e n c ia s re g u la d o ra s co m p re n d e n , p o r e je m p lo , p ro m o to re s (p o r e je m p lo , C M V o S V 40 ) y se cu e n c ia s seña l. Los ve c to re s de e xp re s ió n ta m b ié n p ueden c o m p re n d e r m a rca d o re s de se le cc ió n y a m p lifica c ió n , ta le s com o el gen de d ih id ro fo la to re d u c ta sa (D H F R ), h ig ro m ic in a B fo s fo tra n s fe ra s a y t im id in a c ina sa . Los co m p o n e n te s de los ve c to re s usa do s , ta le s co m o m a rca d o re s de se le cc ió n , re p lico n e s , p o te n c ia d o re s , p ueden o b te n e rse c o m e rc ia lm e n te o p re p a ra rse m e d ia n te m é to d o s co n v e n c io n a le s . Los v e c to re s p ue de n co n s tru irse para la e xp re s ió n en d ive rso s cu ltivo s ce lu la re s , p o r e je m p lo , en cé lu la s de m a m ífe ro ta le s com o C H O , C O S , H E K 293, N SO , fib ro b la s to s , cé lu la s de inse cto s , le va d u ra s o b a c te ria s ta le s com o E. coli. En a lg u n o s caso s, se usan cé lu la s que p e rm ite n una g lico s ila c ió n ó p tim a de la p ro te ína e xp re sa d a .
E l/los g e n (e s) de la ca d e n a lige ra del a n ticu e rp o a n ti-(o x )M IF y e l/lo s g e n (e s) de la ca d e n a p esad a del a n ticu e rp o a n ti-(o x )M IF p ueden in se rta rse en ve c to re s d ife re n c ia d o s o los gen es se inse rtan en el m ism o v e c to r de exp re s ió n . Los gen es de a n tic u e rp o s se inse rtan en el v e c to r de e xp re s ió n m e d ia n te m é to d o s c o n ve n c io n a le s , p o r e je m p lo , lig a m ie n to de s itio s de re s tr icc ió n co m p le m e n ta rio s en el fra g m e n to y v e c to r de l gen de l a n ticu e rp o , o lig a m ie n to de e x tre m o rom o si no hay s itio s de re s tr icc ió n p rese n te s .
La p ro d u cc ió n de a n tic u e rp o s a n ti-(o x )M IF o fra g m e n to s de un ión a a n tíg e n o de los m ism o s puede in c lu ir c u a lq u ie r m é to d o co n o c id o en la té cn ica para la in tro d u cc ió n de A D N re co m b in a n te en cé lu la s e u ca rio ta s m e d ia n te tra n s fe cc ió n , p o r e je m p lo , p o r m e d io de e le c tro p o ra c ió n o m ic ro in ye cc ió n . P o r e je m p lo , la e xp re s ió n re co m b in a n te de l a n ticu e rp o a n ti-(o x )M IF puede lo g ra rse m e d ia n te la in tro d u cc ió n de un p lá sm id o de e xp re s ió n que con tie n e la se c u e n c ia de A D N q ue co d ifica para el a n ticu e rp o a n ti-(o x )M IF ba jo el co n tro l de una o m ás se c u e n c ia s re gu la d o ra s , ta l co m o un p ro m o to r fu e rte , en una línea ce lu la r h u é sp e d a d e cu a d a , m e d ia n te un m é to d o de tra n s fe cc ió n a p ro p ia d o que da co m o re su lta d o cé lu la s q ue tien en las se cu e n c ia s in tro d u c id a s in te g ra d a s de m a n e ra e s ta b le en el g enom a. El m é to d o de lip o fe cc ió n es un e je m p lo de un m é to d o de tra n s fe cc ió n , que p uede u sa rse seg ún la p rese n te inve nc ión .
La p ro d u cc ió n de a n tic u e rp o s a n ti-(o x )M IF ta m b ié n puede in c lu ir c u a lq u ie r m é to d o co n o c id o en la té cn ica para el cu ltivo de d ich a s cé lu la s tra n s fo rm a d a s , p o r e je m p lo , de m a n e ra con tin u a o d isco n tin u a , y la e xp re s ió n de l a n ticu e rp o a n ti-(o x )M IF , p o r e je m p lo , co n s titu tiva o p o r ind u cc ión . Se re fie re en p a rt ic u la r al d o cu m e n to W O 2009 /086920 para re fe re n c ia a d ic io n a l p a ra la p ro d u cc ión de a n ticu e rp o s a n ti-(o x )M IF . En una re a liza c ió n p re fe rida , los a n tic u e rp o s a n ti-(o x )M IF p ro d u c id o s seg ún la p re se n te in ve n c ió n se unen a o xM IF o a un e p íto p o de l m ism o . Los a n tic u e rp o s p a rtic u la rm e n te p re fe rid o s seg ún la p re se n te in ve n c ió n son los a n tic u e rp o s R A B 9, R A B 4 y /o R A B 0. Los a n tic u e rp o s a lte rn a tivo s p re fe rid o s son R A M 9, r A m 4 y /o R A M 0.
Las se cu e n c ia s de e s to s a n ticu e rp o s se d ivu lga n en el d o cu m e n to W O 2009 /086920 ; vé a se a d e m á s la lis ta de s e cu e n c ia s de la p re se n te so lic itu d y lo s igu ien te :
S E Q ID NO : 1 para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la ca d e n a lige ra de R A B 9:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCRSSGRIM TYLNWYQQKP GKAPKLUFV ASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTITISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPITF6G GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY
PREÁKVGWKV DNALGSGNSQ ESVTEGDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC,
S E Q ID NO : 2 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la ca d e n a lige ra de R A B 4:
DIGMTGSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYGGK PGQAPRLLIY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLIISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVGWKV DNALGSGNSQ ESVTEGDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC,
S E Q ID NO : 3 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la ca d e n a lige ra de R A B 0:
DSQfVtTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQGK PGQAPRLUY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLT1SRLQ PEDFAVYYCG GYGRSLTFGG GTKVESKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSG ESVTEGDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC,
E Q ID NO : 4 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la ca d e n a lige ra de R A B 2:
DIQMTQSPVT LSLSPGERAT LSCRASQSVR SSYLAWYQQK PGQTPRLLIY GASNRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCG GYGNSLTFGG GTKVE!KRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSG ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGECf
E Q ID NO: 5 para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la ca d e n a p esa d a de R AB9:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFSIYSMNWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGTTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLY LGMNSLRAED TAVYYCAGSG WLYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPIA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSGEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK,
E Q ID NO: 6 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la cad en a p esa d a de R A B 4:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LGMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSWTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSMTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLG6PSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRW SVLTVLHGDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGGP REPQVYTLPP SQEEMTKNGV SLTCIVK6FY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSD6S FFLYSRLTVD KSRWGEGNVF SCSVMHEALH NHYTGKSLSL
SLGK,
E Q ID NO : 7 para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la ca d e n a p esad a de RABO:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMPWVRGA PGKGLEWVSG IYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LGMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSWTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRW SVLTVLHGDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGGP REPQVYTLPP SQEEMTKNGV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWGEGNVF SCSVMHEALH NHYTGKSLSL SLGK,
E Q ID NO : 8 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la ca d e n a p esa d a de R A B 2: EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVW GQ6 TTVW SSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALG CIVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLGSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSGEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KT1SKAKGQP
REPQVYTLPP SGEEMTKNGV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGGPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTGKSLSL SLGK,
E Q ID NO: 9 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de RAM Ohc:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGM DVW GG6 TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCIVKDYF PEPVW SW NS GALTSGVHTF PÁVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMiSRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLW LH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK,
E Q ID NO: 10 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de RAMOIc:
DIQMTQSPGT LSLSPGERÁT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLUY GTSSRATGiP DRFSGSASGT DFTLTiSRLQ PEDFAVYYCQ QYG RSITFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC,
E Q ID NO: 11 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de R A M 9hc:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQ WLY6MDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVWSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCW VDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK,
E Q ID NO: 12 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de R A M 9lc :
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQRiM TYLNWYQQKP GKAPKLLIFV ASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTLTISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPLTFGG GTKVEIKRW AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC,
E Q ID NO: 13 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de R A M 4h c:
EVQLLESGGG LVGPG6SLRL SCAASGFTFSIYAMDWVRGA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ÁDSVKGRFTI
SRDNSKNTLY IQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGGG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGYHTF PAVLQSSGLY SLSSWWPS SSLGTGTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH GDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKT1SKAK GGPREPGVYT LPPSREEMTK
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK,
S E Q ID NO : 14 para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de R A M 4lc :
DIGMTGSPGT LSLSPGERAT LSCRASGGVS SSSIAWYOQK PGGAPRLUY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG 6TKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEGLKSGTA SWCLLNNFY
PREAKVGWKV DNALQSGNSQ ESVTEGDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK WACEVTHGG LSSPVTKSFN RGEC.
El a n ticu e rp o a n ti-M IF de la inve nc ión es p re fe rib le m e n te un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l a is la do . El a n ticu e rp o a n ti-M IF puede s e r una m o lé cu la IgG , IgM , IgE, IgA o IgD . En o tras re a liza c io ne s , el a n ticu e rp o a n ti-M IF es una su b c la se IgG 1, IgG 2, IgG 3 o IgG 4. En o tra s re a liza c io n e s , e l a n ticu e rp o es la s u b c la se IgG1 o IgG 4. En o tra s re a liza c io n e s , el a n ticu e rp o es la su b c la se IgG 4. En a lg u n a s re a liza c io n e s , el a n tic u e rp o IgG 4 tie n e una ú n ica m u ta c ió n que cam b ia la se rin a (se rin a 228 ) a p ro lin a . En co n se cu e n c ia , la s u b se cu e n c ia C P S C en la re g ió n Fc de IgG 4 se co n v ie rte en C P P C , que es una s u b se cu e n c ia en IgG1 (A n ga l et al. M ol Im m u no l. 1993, 30, 105-108).
A d e m á s , la p ro d u cc ió n de a n ticu e rp o s a n ti-(o x )M IF puede in c lu ir c u a lq u ie r m é to do co n o c id o en la té cn ica para la p u rifica c ió n de un a n ticu e rp o , p o r e je m p lo , m e d ia n te c ro m a to g ra fía de in te rca m b io a n ió n ico o c ro m a to g ra fía de a fin id a d . En una re a liza c ió n , e l a n ticu e rp o a n ti-(o x )M IF p ue de p u rifica rse p o r c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n m o lecu la r. Los té rm in o s “ reg ión c e n tra l” y “ re g ió n C -te rm in a l” de M IF se re fie ren a la re g ió n de M IF h u m a n o que co m p re n d e los a m in o á c id o s 35 -68 y aa 86 -115 , re sp e c tiva m e n te , p re fe rib le m e n te aa 50 -68 y aa 86 a 102 de M IF hum ano , re sp e c tiva m e n te .
Los a n tic u e rp o s p a rtic u la rm e n te p re fe rid o s de la p re se n te in ve n c ió n se unen o b ien a la re g ió n de aa 50 -68 o b ien a la reg ión de aa 86 -102 de M IF h u m a n o . E sto ta m b ié n se re fle ja en la un ión de l e p íto p o de los a n tic u e rp o s p re fe rid o s R A B 0, R A B 4 R A B 2 y R A B 9, a s í co m o R A M 4, R A M 0 y R A M 9 q ue se unen de la s ig u ie n te m anera :
R A B 4 y R A M 4: aa 86 -102
R A B 9 y R A M 9: aa 50 -68
R A B 0 y R A M 0: aa 86 -102
R A B 2: aa 86 -102
P o r tan to , R A M 4 y R A B 4 tie n e n la m ism a e sp e c ific id a d que R A M 9 y R A B 9. Lo m ism o es c ie rto para R A M 0 y R A B 0. E sto ta m b ié n se re fle ja en los e je m p lo s lle va d o s a cab o que m u e s tra n que se o b te n d rá n re su lta d o s s im ila re s con e s to s a n ticu e rp o s .
El té rm in o “ e p íto p o ” inc luye c u a lq u ie r d e te rm in a n te de p ro te ín a ca p a z de u n irse e sp e c ífica m e n te a una in m u n o g lo b u lin a o un fra g m e n to de a n ticu e rp o . Los d e te rm in a n te s e p itó p ico s co n s is te n h a b itu a lm e n te en a g ru p a c io n e s de m o lé cu la s de su p e rfic ie q u ím ic a m e n te a c tiva s co m o ta le s a m in o á c id o s e xp u e s to s , a m ino a zú ca re s u o tras ca d e n a s la te ra le s de h id ra to s de ca rb o n o y h a b itu a lm e n te tienen ca ra c te rís tica s e s tru c tu ra le s tr id im e n s io n a le s e sp e c ífica s , a s í co m o c a ra c te rís tica s de ca rga e sp e c ífica s .
El té rm in o “v e c to r” se re fie re a una m o lé cu la de á c id o n u c le ico c a p a z de tra n s p o rta r o tro á c id o n u c le ico al que se ha un ido . En a lg u na s re a liza c io n e s , el v e c to r es un p lá sm ido , es dec ir, un buc le c irc u la r de A D N b ica te n a rio en el que p ue de n liga rse s e g m e n to s de A D N a d ic io n a le s .
El té rm in o “cé lu la h u é sp e d ” se re fie re a una línea ce lu la r, que es ca p a z de p ro d u c ir una p ro te ín a re co m b in a n te d e sp u é s de in tro d u c ir un v e c to r de e xp re s ió n . El té rm in o “ línea c e lu la r re co m b in a n te ” se re fie re a una línea ce lu la r en la que se ha in tro d u c id o un v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te . D ebe e n te n d e rse que “ líne a c e lu la r re c o m b in a n te ” s ig n ifica no só lo la línea ce lu la r p a rtic u la r s ino ta m b ié n la p ro g e n ie de d icha línea ce lu la r. D eb ido a que pueden p ro d u c irse d e te rm in a d a s m o d ifica c io n e s en las g e n e ra c io n e s s ig u ie n te s d eb ido a m u ta c io n e s o in flu e n c ia s a m b ie n ta le s , d ich a p ro g e n ie p ue de , de hecho , no s e r id é n tica a la cé lu la m a dre , p e ro aun a s í se in c lu ye n d e n tro del a lca n ce de l té rm in o “ línea c e lu la r re co m b in a n te ” ta l co m o se usa en el p re se n te d o cu m e n to .
El tipo de cé lu la h ué sp ed seg ún la p rese n te in ve n c ió n es, p o r e je m p lo , una cé lu la C O S , una cé lu la C H O o, p o r e je m p lo , una cé lu la H E K 293, o c u a lq u ie r o tra cé lu la hué sp ed co n o c id a p o r un e xp e rto en la té cn ica , p o r lo que ta m b ié n inc lu ye , p o r e je m p lo , cé lu la s b a c te ria n as , com o p o r e je m p lo cé lu la s de E. coli. En una re a liza c ió n , el a n tic u e rp o a n ti-M IF se e xp re sa en una líne a de cé lu la s C H O d e fic ie n te en D H F R , p o r e je m p lo , D X B 11, y con la a d ic ión de G 418 co m o m a rc a d o r de se le cc ió n . C u a n d o los ve c to re s de e xp re s ió n re co m b in a n te s que cod ifica n para g en es de a n ticu e rp o s se in trod uce n en cé lu la s h u é sp e d C H O , los a n ticu e rp o s se p rod u ce n cu ltiva n d o las cé lu las h u é sp e d d u ra n te un p e río d o de tiem p o su fic ie n te para p e rm itir la e xp re s ió n del a n ticu e rp o en las cé lu la s h u é sp ed o la se c re c ió n del a n ticu e rp o en el m e d io de cu ltivo en que se h acen c re c e r las cé lu la s hué sp ed .
Los a n ticu e rp o s a n ti-(o x )M IF pueden re cu p e ra rse del m e d io de cu ltivo usa nd o m é to d o s c o n ve n c io n a le s de p u rifica c ió n de p ro te ína s.
El se g u n d o p rinc ip io ac tivo de la te ra p ia de co m b in a c ió n p ro p o rc io n a d a p o r la p rese n te in ve n c ió n es un g lu co co rtico id e . Los g lu co co rtico id e s , a ve ce s ta m b ié n d e n o m in a d o s g lu co co rtico s te ro id e s , son una c lase de h o rm o n a s e s te ro id e a s que se unen al re c e p to r de g lu c o c o rtico id e s (re c e p to r de g lu co co rtico id e s a ), que está p re se n te en cas i to d o s los a n im a le s ve rte b ra d o s .
Los g lu co co rtico id e s fo rm a n parte del m e ca n ism o de re tro a lim e n ta c ió n del s is te m a in m u n ita rio que reduce la a c tiv id a d inm u n ita ria , es d ec ir, la in fla m a c ió n . En m e d ic in a , se usan para tra ta r e n fe rm e d a d e s que e s tá n p ro vo ca d a s p o r un s is te m a in m u n ita rio h ip e rac tivo , p o r lo que son e je m p lo s de ta le s e n fe rm e d a d e s las a le rg ias , el asm a , las e n fe rm e d a d e s a u to in m u n ita r ia s y la se p tice m ia . T a m b ié n in te rfie re n con a lg u n o s de los m e ca n ism o s a n ó m a lo s en las cé lu la s ca n ce ro sa s , p o r lo que ta m b ié n se usan p a ra t ra ta r e l cán ce r. A l u n irse al re c e p to r de g lu c o c o rtico id e s , el co m p le jo del re c e p to r de g lu co co rtico id e s a c tiva d o regu la la e xp re s ió n de p ro te ín a s a n tiin fla m a to r ia s en el núc leo m e d ia n te un p ro ce so con o c id o com o tra n sa c tiva c ió n y re p r im e la e xp re s ió n de p ro te ín a s p ro in fla m a to r ia s en el c ito so l. En p rinc ip io , los g lu c o c o rtico id e s se d e fine n co m o un su b g ru p o de c o rtico e s te ro id e s . A d e m á s , se co n o ce una n ue va c lase de co m p u e s to s con a c tiv id a d g lu co co rtico id e (S E G R A , a g o n is ta s se le c tivo s del re c e p to r de g lu co co rtico id e s ).
E s to s c o m p u e s to s e je rce n só lo a lg u n a s de las a cc io n e s de los g lu co co rtico id e s a g o n is ta s com p le to s , es dec ir, no log ra n o b te n e r el e sp e c tro co m p le to de tra n sa c tiva c ió n , tra n s re p re s ió n y a cc io n e s in d ire c ta s sob re la ind u cc ión g é n ica (a tra vé s de N F -kB, A P 1, h o m o d ím e ro s ju n -ju n , e tc .). P o r a n a lo g ía con m o d u la d o re s se le c tivo s del re c e p to r de e s tró g e n o s (S E R M = ta m o x ife n o , ra lo x ife n o , to re m ife n o ), e s to s c o m p u e s to s ta m b ié n se d e n o m in a n m o d u la d o re s se le c tivo s del re c e p to r de g lu co co rtico id e s (S E G R M ). Los e je m p lo s de S E G R A /S E G R M inc lu ye n m a p ra co ra t (= B O L 303242 X = Z K 245186 ), co m p u e s to A , R U 24856 , R U 24782 , R U 40066 , Z K 216348. T o do s e s to s co m p u e s to s se han d e sc rito en la té c n ica y ya los c o n o ce b ien el e xp e rto en la té cn ica . V é a se en p a rt ic u la r e l a rtícu lo de re v is ión De B o s s c h e r et al, 2010 , C u rr O p in P h a rm a co l 10: 497 -504 p ara una v is ió n g e n e ra l. Los d o c u m e n to s RU 24856 , RU 40066 y RU 24782 se d e sc rib e n , p o r e je m p lo , en V a yss ie re et al, 1997, M ol E n d o crin o l 11: 1245 -1255. E stas son las fó rm u la s q u ím ica s re sp e c tiva s :
Figure imgf000015_0001
Z K 245186 se d e sc rib e en P roksch et al, 2011, D rug M e tab D isp os 39: 1181 -1187 y en S ch a cke et al., 2009 , B r J P h a rm a co l, 158 (4): 1088 -103. T ie n e la s ig u ie n te fó rm u la : (R )-1,1,1 -tr if lu o ro -4 -(5 -flu o ro -2 ,3 -d ih id ro b e n z o fu ra n -7 - il) -4 m e til-2 -{[(2 -m e til-5 -q u in o lil)a m in o ]m e til}p e n ta n -2 -o l. Z K 216348 se co n oce de S ch a cke et al., 2004, P N A S U S A 101: 227 -232. T ie n e la s ig u ie n te fó rm u la qu ím ica :
Figure imgf000016_0001
El c o m p u e s to A se d ivu lg a en R a u n e r et al, 2011, E n d o c rin o lo g y 152: 103 -112 a s í com o en De B o s s c h e r K, V a n d e n B e rg h e W , B e ck IM, V an M o lle W , H e n n u ye r N, H a p g o o d J, L ib e rt C, S tae ls B, L ou w A, H ae ge m an G, 2005, A fu lly d is so c ia te d co m p o u n d o f p la n t o rig in fo r in fla m m a to ry gene re p ress ion . P ro c N atl A ca d Sci U S A 102: 15827 -15832. El co m p u e s to A tie n e la fó rm u la c lo ru ro de 2 -(4 -a c e to x ife n il)-2 -c lo ro -N -m e til-e tila m o n io .
Un e je m p lo im p o rta n te de un g lu c o c o rtico id e es el co rtiso l (o h id ro co rtiso n a ), q ue es e se n c ia l p a ra la v id a y re g u la o a p o ya una v a r ie d a d de fu n c io n e s ca rd io va scu la re s , m e ta b ó lica s , in m u n o ló g ica s y h o m e o s tá tica s im p orta n te s . T a m b ié n h ay va r io s g lu co co rtico id e s s in té tico s d isp on ib le s .
Los g lu c o c o rtico id e s a c tú a n en tre s c a m p o s p rin c ip a le s , es dec ir, el ca m p o de d e sa rro llo in m u n o ló g ico , m e ta b ó lico y fe ta l. En el cam p o inm un ita rio , re gu lan p or in c re m e n to la e xp re s ió n de p ro te ína s a n tiin fla m a to r ia s y re gu lan p o r d ism in u c ió n la e xp re s ió n de p ro te ín a s p ro in fla m a to ria s . Los e fe c to s m e ta b ó lico s pueden re su m irse de la s ig u ie n te m anera :
• E s tim u la c ió n de la g lu co n e o g é n e s is , p a rticu la rm e n te en el h ígado : esta ru ta da co m o re su lta d o la s ín tes is de g lu co sa a p a rtir de su s tra to s no h e xo sa ta le s co m o a m in o á c id o s y g lice ro l a p a rtir de la d e sc o m p o s ic ió n de tr ig licé r id o s y es p a rticu la rm e n te im p o rta n te en c a rn ívo ro s y d e te rm in a d o s h e rb ívo ro s . P o te n c ia r la e xp re s ió n de e n z im a s im p lica d a s en la g lu c o n e o g é n e s is es p ro b a b le m e n te la fu n c ió n m e ta b ó lica m e jo r co n o c id a de los g lu co co rtico id e s .
• M o v iliza c ió n de a m in o á c id o s de te jid o s e x tra h e p á tico s : s irven com o su s tra to s para la g lu co n e o g é n e s is .
• Inh ib ic ión de la cap ta c ió n de g lu cosa en te jid o m u sc u la r y a d ip oso : los ác id os g raso s lib e ra d o s p or la lipó lis is se usan p ara la p ro d u cc ió n de e n e rg ía en te jid o s com o el m ú scu lo , y el g lice ro l lib e ra d o p ro p o rc io n a o tro su s tra to para la g lu co n e o g é n e s is .
En el d e sa rro llo fe ta l, los g lu c o c o rtico id e s p ro m u e ve n la m a d u ra c ió n de l p u lm ó n y la p ro d u cc ió n de l te n s io a c tiv o que es n e ce sa rio para la fu n c ió n p u lm o n a r e x tra u te rin a . S on o tra s s u s ta n c ia s c lave para el d e sa rro llo n o rm a l del ce reb ro . Se ha c re a d o una v a r ie d a d de g lu co co rtico id e s s in té tico s , a lg u n o s m u ch o m ás p o ten tes que el co rtiso l, para uso te ra p é u tico .
Se d ife re n c ia n en fa rm a c o c in é tic a ( fa c to r de a bso rc ió n , sem iv id a , vo lu m e n de d is trib uc ió n , a c la ra m ie n to ) y en fa rm a co d in á m ica .
En el co n te x to de la p rese n te inve nc ión , “ g lu c o c o rtico id e s ” s ig n ifica rá to d o s los g lu co co rtico id e s que a c túan en el re c e p to r a lfa de g lu c o c o rtico id e s . En p a rticu la r, e sto a b a rca los a g o n is ta s de re c e p to r de g lu c o c o rtico id e s “c lá s ic o s ” , a s í co m o los S E G R A d e sc rito s a n te rio rm e n te . En una re a liza c ió n p re fe rid a , se a b a rca n to d o s eso s g lu co co rtico id e s q ue a c tú a n a tra v é s de la ru ta N F -kB y /o la ru ta A P -1. En una re a liza c ió n p re fe rid a a d ic io n a l, los g lu c o c o rtico id e s de la inve n c ió n son to d o s g lu co co rtico id e s (“c lá s ic o s ” ).
T e ó rica m e n te , en a lgún m o m e n to en el fu tu ro puede haber, a u n q u e sea poco p robab le , g lu co co rtico id e s que só lo a c túen , p o r e je m p lo , p o r m e d io de tra n s a c tiv a c ió n o tra n s re p re s ió n , pero no a c tú e n p or m e d io de la ru ta N F -kB. En una re a liza c ió n p re fe rid a , e s to s co m p u e s to s no e s ta ría n a b a rca d o s p o r la p re se n te invenc ión .
N F -kB es el fa c to r n u c le a r p o te n c ia d o r de las ca d e n a s lige ra s kap pa de las cé lu la s B a c tivad as . Es un fa c to r de tra n s c rip c ió n esp ec ífico , que e x is te en p rá c tica m e n te to d o s los tip o s de cé lu las y te jid o s . A l un irse a re g io ne s re g u la d o ra s p a rticu la re s de l A D N , puede in flu ir en la tra n sc rip c ió n de g en es d ia n a , com o los g en es a n tia p o p tó tico s , la fa m ilia de g e n e s de la ca sp a sa y, en p articu la r, la c ic lo o x ig e n a s a -2 (C o x-2 ), IL-6 y T N F -a lfa .
La p o te n c ia de los g lu co co rtico id e s , la d u ra c ión de l e fe c to y la su p e rp o s ic ió n de la p o ten c ia de los m in e ra lo co rtico id e s va ría n . El co rtiso l (h id ro c o rtiso n a ) es la co m p a ra c ió n co n ve n c io n a l para la po ten c ia de los g lu co co rtico id e s . La h id ro co rtiso n a es el n om b re usa do para las p re p a ra c io n e s fa rm a cé u tica s de co rtiso l. La p o te n c ia o ra l p u e d e s e r m e n o r q ue la p o te n c ia p a re n te ra l ya q ue ca n tid a d e s s ig n ific a tiv a s (h a s ta el 50 % en a lg u n o s ca so s) p ueden no a b so rb e rse en el in testino .
E je m p lo s de g lu co co rtico id e s p re fe rid o s de la p re se n te inve n c ió n son:
h id ro co rtiso n a , a ce ta to de co rtiso n a , c o rtiso n a /co rtiso l, f lu o ro co rto lo n a , p red n iso na , p re d n iso lo n a , m e tilp re d n iso lo n a (p a rticu la rm e n te para a d m in is tra c ió n s is té m ica ), tr ia m c in o lo n a , d e xa m e ta so n a , b e ta m e ta so n a , p a ra m e ta so n a , b u d e so n id a (p a rticu la rm e n te p ara a d m in is tra c ió n loca l), S E G R A (a g o n is ta s se le c tivo s de l re ce p to re s de g lu co co rtico id e s ).
A d e m á s , hay c o m p u e s to s que só lo im itan a lg u n a s pero no to d a s las a cc io n e s de los g lu co co rtico id e s ; estos co m p u e s to s se d e n o m in a n S E G R A (a g o n is ta s se le c tivo s de l re ce p to r de g lu co co rtico id e s ). Los e je m p lo s de S E G R A /S E G R M inc lu ye n m a p ra c o ra t (= B O L 303242 X = Z K 245186 ), co m p u e s to A, R U 24856 , R U 24782 , R U 40066 , Z K 216348. Los S E G R A n o rm a lm e n te e je rce n sus e fe c to s p o r m e d io de la ru ta N Fk-B.
E s te ro id e s p rin c ip a lm e n te para a p licac ión loca l (p o r e je m p lo , p u lve riza d o r-p u lm ó n , s u p o s ito rio -co lo n , c re m a-p ie l): h id ro co rtiso n a , b e c lo m e ta so n a , bud eson ida , f lu tica so n a , flun iso lida , m o m e ta so n a , c ic le so n id a , c lo b e ta so n a , m ás p re fe rib le m e n te b ud eson ida .
En una re a liza c ió n p re fe rid a a d ic ion a l, el g lu co co rtico id e se se le cc io n a del g rup o que co n s is te en h id ro co rtiso na , a ce ta to de co rtiso na , b ud eson ida , flu d ro co rtiso n a , d e xa m e ta so n a , p re d n iso lo n a y /o m e tilp re d n iso lo n a .
Se p re fie re n p a rticu la rm e n te (m e til)p re d n iso lo n a , h id ro co rtiso n a y d e xa m e ta so n a , inc lu so m ás p re fe rib le m e n te (m e til)p re d n iso lo n a para a d m in is tra c ió n s is té m ica . La h id ro co rtiso n a puede p re fe rirse para una a p licac ión tó p ica en una re a liza c ió n de la inve nc ión . En una re a liza c ió n p re fe rid a a d ic io n a l, se p re fie re la b u d e so n id a para a d m in is tra c ió n loca l.
Las sa les, los é s te res y /o los isó m e ro s de los g lu co co rtico id e s e stán co m p re n d id o s en el a lca nce de la p rese n te in ve n c ió n y se e n te n d e rá n co m p re n d id o s d en tro de l té rm in o “ g lu c o c o rtico id e s ” . T o d o s se con oce n b ien o pueden p re p a ra rse m e d ia n te m é to d o s b ien con oc id os .
Fue m u y so rp re n d e n te e n c o n tra r que la p rod u cc ión de M IF de m a c ró fa g o s y cé lu la s T fue in d u c id a en lu g a r de inh ib id a p o r g lu co co rtico id e s en ro e d o re s (C a la n d ra T, B e rnh ag e n J, M e tz CN et al., (1995 ) M IF as a g lu co co rtico id -ind u ce d m o d u la to r o f cy to k in e p rod u ctio n . N a tu re 377: 68 -71 ; y B a ch e r M, M e tz CN, C a la n d ra T, et al., (1996 ) A n e sse n tia l re g u la to ry ro le fo r m a c ro p h a g e m ig ra tio n in h ib ito ry fa c to r in T -ce ll a ctiva tion . P N A S 93: 7849 -7854 ).
C o m o se co n o c ía q ue el M IF tie n e p ro p ie d a d e s p ro in fla m a to ria s , e s to s re su lta d o s p a re c ie ro n al p rin c ip io p a ra d ó jico s y d ifíc ile s de co n c ilia r. P o s te rio rm e n te , sin e m ba rg o , se d e scu b rió que el M IF a nu la en e fe c to los hechos in m u n o su p re so re s a n tiin fla m a to r io s de los g lu co co rtico id e s .
C u a lq u ie r g lu co co rtico id e d ad o co n o c id o por un e xp e rto en la té c n ica puede u sa rse en el co n te x to de la p rese n te inve nc ión ; e stos pueden se r los g lu co co rtico id e s a m o do de e je m p lo m e n c io n a d o s a n te rio rm e n te . A d e m á s, la s ín te s is de un g lu co co rtico id e se co n o ce de n ue vo b ien en la técn ica .
Se ha d e m o s tra d o que los g lu co co rtico id e s tien en é x ito en el a liv io y el tra ta m ie n to de va r ia s e n fe rm e d a d e s . Sin e m b a rg o , la m a yo ría de los g lu co co rtico id e s e stán a so c ia d o s con una v a r ie d a d de e fe c to s secu n d a rio s , ta l com o , por e je m p lo , se d e sc rib ió a n te rio rm e n te , que en a lg u n o s c a so s son e x tre m o s , en la m e d id a en que el tra ta m ie n to d ebe d ero g a rse . En c u a lq u ie r caso , los e fe c to s s e cu n d a rio s su p o n e n una ca rg a a d ic io n a l p a ra la sa lu d fís ica y m e n ta l de un p ac ie n te y, p o r tan to , d eben e v ita rse en la m e d id a de lo pos ib le .
C on la p rese n te inve nc ión , al c o m b in a r un g lu co co rtico id e con un a n ticu e rp o a n ti-M IF , a ho ra es p os ib le re d u c ir la ca n tid a d del g lu co co rtico id e , que es n e ce sa ria p ara un tra ta m ie n to d ad o en c o m p a ra c ió n con una s itu a c ió n en la que el g lu co co rtico id e se a d m in is tra com o ú n ico p rin c ip io activo . U na pos ib ilid ad a d ic io n a l h ab ilita d a p o r la p rese n te in ve n c ió n es m a n te n e r la d o s is de l g lu co co rtico id e en co m p a ra c ió n con el g lu co co rtico id e a d m in is tra d o so lo y te n e r una re sp u e s ta al tra ta m ie n to m u ch o m a yo r en el pac ien te .
Los p rese n te s in ve n to re s d e m o stra ro n de m a n e ra bas tan te so rp re n d e n te que el e fe c to o b te n id o al c o m b in a r un g lu c o c o rtico id e con un a n tic u e rp o a n ti-M IF p e rm itió u na c la ra re d u cc ió n de la d os is de g lu c o c o rtico id e , m ie n tra s que to d a v ía se pod ía m a n te n e r la m ism a re sp u e s ta al tra ta m ie n to .
Un e xp e rto en la té c n ica p ue de d e te rm in a r fá c ilm e n te una re sp u e s ta a l tra ta m ie n to y se re fie re a d is m in u ir o m e jo ra r o a liv ia r un e s ta do dado. Los e n sa yo s para d e te rm in a r e sto se con o ce n b ien y pueden ser, p o r e je m p lo , la d e te rm in a c ió n de la p ro b a b ilid a d o la d u ra c ión de la s u p e rv ive n c ia de un su je to que tien e una e n fe rm e d a d con la p ro b a b ilid a d o la d u ra c ión de la su p e rv ive n c ia en o tros su je to s que tie n e n la m ism a e n fe rm e d a d o m e d ia n te la d e te rm in a c ió n de l ca m b io de s ín to m a s d e n tro de uno y el m ism o p ac ie n te d u ra n te un p e río d o de tiem p o.
Un e nsayo a de cu ad o es, p o r e jem p lo , el e nsayo de s e d im e n ta c ió n g lo b u la r; e nsayo s a d ic io n a le s son a qu e llo s ta l com o se d esc rib e n en los p re se n te s e je m p lo s . G lu co co rtico id e s p re fe rid o s seg ún la p rese n te in ve n c ió n son a ce ta to de co rtiso na , h id ro co rtiso n a , flu d ro co rtiso n a , d e xa m e ta so n a , b ud eson ida , p re d n iso lo n a y /o m e tilp re d n iso lo n a .
P a rticu la rm e n te p re fe rid os son m e tilp re d n iso lo n a , h id ro co rtiso n a y b u d e so n id a y d e xa m e ta so n a . Inc lu so m ás p re fe rid o s son (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta so n a para a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e so n id a para a d m in is tra c ió n tóp ica .
Las co m b in a c io n e s p a rticu la rm e n te p re fe rid a s son
• R A M 9 en co m b in a c ió n con d e xa m e ta so n a ,
• R A M 9 en co m b in a c ió n con bud eson ida ,
• R A M 9 en co m b in a c ió n con h id ro co rtiso na ,
• R A M 9 en co m b in a c ió n con p re d n iso lo n a o m e tilp re d n iso lo n a ,
• R A M 0 en co m b in a c ió n con d e xa m e ta so n a ,
• R A M 4 en co m b in a c ió n con d e xa m e ta so n a ,
• R A M 0 en co m b in a c ió n con bud eson ida ,
• R A M 4 en co m b in a c ió n con bud eson ida ,
• R A M 0 en co m b in a c ió n con p re d n iso lo n a o m e tilp re d n iso lo n a ,
• R A M 4 en co m b in a c ió n con p re d n iso lo n a o m e tilp re d n iso lo n a ,
• R A M 4 en co m b in a c ió n con h id ro co rtiso na ,
• R A M 0 en co m b in a c ió n con h id ro co rtiso na .
En una re a liza c ió n p re fe rid a p articu la r, se usa h id ro co rtiso n a y b u d e so n id a para a p lica c ió n tó p ica /lo ca l.
Se se ñ a la e xp líc ita m e n te que, en el con te x to de la p rese n te inve nc ión , se a b a rca cada g lu co co rtico id e a de cu ad o que se co n o ce para el tra ta m ie n to de un e s ta do p a to ló g ico p a rticu la r. P o r tan to , en la re a liza c ió n m ás p re fe rid a , el g lu co co rtico id e de la inve nc ión es un g lu co co rtico id e que es el tra ta m ie n to de re fe re n c ia re sp e c tivo para una e n fe rm e d a d dada.
Las c o m b in a c io n e s p re fe rid a s a n te r io re s se usan p re fe rib le m e n te p ara el tra ta m ie n to de una e n fe rm e d a d re ce p tiva a g lu co co rtico id e s ta l com o se d e fine a co n tin u a c ió n en el p re se n te d ocum e n to .
La p re se n te te ra p ia de co m b in a c ió n es p a rticu la rm e n te a d e cu a d a p ara el tra ta m ie n to de una e n fe rm e d a d re ce p tiva a g lu co co rtico id e s . La “ e n fe rm e d a d re ce p tiva a los g lu c o c o rtico id e s ” en el p rese n te co n te x to se d e fine co m o una e n fe rm e d a d que re sp o n d e a la te ra p ia con g lu co co rtico id e s . Las e n fe rm e d a d e s que se sabe que re spo nd en a la te ra p ia con g lu c o c o rtico id e s se e n u m e ra n a co n tin u a c ió n . Un e xp e rto en la té c n ica q ue co n s id e re la p re se n te te ra p ia de co m b in a c ió n co n s id e ra ría esa te ra p ia ta n p ron to com o se e n fre n ta ra a un e s ta do p a to ló g ico para el cua l hab ría c o n s id e ra d o un tra ta m ie n to con un g lu co co rtico id e .
Se sab e q ue ta n to las e n fe rm e d a d e s in fla m a to ria s com o d e te rm in a d o s tip o s de c á n c e r son e n fe rm e d a d e s re cep tiva s a los g lu co co rtico id e s .
P ara a m bo s tip o s de e n fe rm e d a d e s e x is ten te ra p ia s de re fe re n c ia con g lu co co rtico id e s . El p ro p ó s ito de la p re se n te in ve n c ió n es c o m b in a r la te ra p ia a n ti-M IF con e stas te ra p ia s de re fe re n c ia con g lu co co rtico id e s . En a lg u n o s casos, ta m b ié n es p os ib le re d u c ir la d o s ifica c ió n de re fe re n c ia de g lu co co rtico id e s , si es n ece sa rio d eb ido a los e fe c to s secu n d a rio s .
En una re a liza c ió n p re fe rid a , la e n fe rm e d a d re ce p tiva a los g lu co co rtico id e s es una e n fe rm e d a d en la que se o b se rva una m e jo ra s ig n ifica tiva de los va lo re s de s e d im e n ta c ió n en el e n sa yo de se d im e n ta c ió n g lo b u la r. U na m e jo ra s ig n ifica tiva es una m e jo ra co n s id e ra d a s ig n ifica tiva p o r un e xp e rto en la técn ica .
Las e n fe rm e d a d e s p a rticu la rm e n te p re fe rid a s que p od rían tra ta rs e con la p rese n te te ra p ia de co m b in a c ió n serían , p o r tan to : e n fe rm e d a d e s in fla m a to ria s , inc lu so m á s p re fe rid as , las e n fe rm e d a d e s in fla m a to ria s se ría n a qu e lla s e n fe rm e d a d e s q ue a c tú an a tra vé s de l s is te m a in m u n ita rio a d a p ta tivo (es dec ir, a tra vé s de cé lu la s B y T).
Inc lu so m ás p re fe rida , la e n fe rm e d a d re ce p tiva a los g lu co co rtico id e s se ría una e n fe rm e d a d a lé rg ica , inc lu so m ás p re fe rid a un tra s to rn o a u to in m u n ita rio .
Se sa b e q ue to d a s e s ta s e n fe rm e d a d e s re spo nd en a la te ra p ia con g lu co co rtico id e s .
E n fe rm e d a d e s p a rticu la rm e n te p re fe rid a s en el co n te x to de la p re se n te inve nc ión son:
• ne fritis , en p a rtic u la r g lo m e ru lo n e fr it is , g lo m e ru lo n e fr it is rá p id a m e n te p ro g re s iva (tip o I, II, III o IV), va sc u lit is s is té m ica s (p o r e je m p lo , p o lia rte ritis nodosa, g ra n u lo m a to s is de W e g e n e r, p ú rpu ra de S ch o e n le in H enoch, g lo m e ru lo n e fr it is p ro life ra tiva a g u d a )
• n e fritis lúp ica , n e fritis p o r A N C A , n e fritis a n ti-G B M (p o r e je m p lo , e n fe rm e d a d de G o o d p a s tu re ), n e fro pa tía p o r IgA, n e fro p a tía p o r IgM,
• lup u s e rite m a to so
• re sp u e s ta s in m u n ita ria s m e d ia d a s p o r cé lu la s T, p o r e je m p lo , in fla m a c ió n cu tá ne a , com o p so ria s is o h ip e rse n s ib ilid a d de con tac to .
• EII, com o co litis u lce ro sa y M o rb u sC ro h n
• e sc le ro s is m ú ltip le
• a rtritis re u m a to id e
• u ve ítis
• d ia b e te s m e llitu s tip o 2
• a sm a b ronqu ia l
• d e rm a tit is de co n ta c to
• p so ria s is
• d e rm a tit is a tó p ica
• p a n cre a titis
• p é n fig o
• e n fe rm e d a d de S jog re n
• e n fe rm e d a d de B eh ce t
• e n fe rm e d a d de H orton
• e sc le ro d e rm ia
• p o lim io s itis
El e fe c to s in é rg ico se ha d e m o s tra d o para las e n fe rm e d a d e s re ce p tiva s a los g lu co co rtico id e s en los e je m p lo s a co n tin u a c ió n . Los m o de los se le cc io n a d o s son p a rticu la rm e n te a d e cu a d o s ya que el e fe c to se m u e s tra para una re acc ión a n tíg e n o -a n ticu e rp o que sería m e cá n ica m e n te igua l para to d a s las e n fe rm e d a d e s e n u m e ra d a s a n te rio rm e n te .
Las p o s ib le s fo rm a s de d o s ifica c ió n p re v is ta s p o r la p re se n te so lic itud son co m p rim id o s , cáp su la s , so b re s o p íldo ras . Los g rá n u lo s p ue de n u sa rse com o ta l com o fo rm a de d o s ifica c ió n p re fe rid a , p ue de n re lle n a rse en cá p su la s o sob re s o p ue de n c o m p rim irse a d ic io n a lm e n te para d a r co m p rim id o s o p íldo ras .
O tras fo rm a s de d o s ifica c ió n que ta m b ié n se inc luyen en la p rese n te so lic itud son beb ida s o ja ra b e s , e lix ires, t in tu ra s , su sp e n s io n e s , d iso lu c io n e s , h id ro ge le s , p e lícu la s , p as tilla s , ch ic les , co m p rim id o s b uco d isp e rsa b le s , e n ju a g u e s b uca les , p as ta de d ien tes , b á lsa m o s lab ia les , ch a m p ú s m e d icad os , s u sp e n s io n e s de n a n o e s fe ra s y co m p rim id o s de m ic ro e s fe ra s , a s í com o p u lve riza do re s , in h a la d o re s , n eb u liza d o re s , fo rm a s para fu m a r o en po lvo de base lib re y fo rm a s de d o s ifica c ió n para a p licac ión tó p ica com o c re m as, ge les, lin im e n to s o bá lsam o s, loc iones, p om a da s , g o ta s para los o ídos, g o tas para los o jos y p a rch e s para la piel.
A d e m á s se a b a rca n su p o s ito r io s que pueden usa rse , p o r e je m p lo , p o r v ía re c ta l o va g in a l. T o d a s e stas fo rm a s de d o s ifica c ió n las co n o ce b ien un e xp e rto en la técn ica .
F o rm a s de d o s ifica c ió n p re fe rid as según la p rese n te inve nc ión son fo rm a s o ra les com o g rán u lo s , g rá n u lo s re cub ie rto s , co m p rim id o s , co m p rim id o s con re cu b rim ie n to e n té rico , g rá n u lo s , s u p o s ito r io s y e m u ls ion es . Inc lu so m ás p re fe rid o s son los g rá n u lo s y co m p rim id o s . O tra s fo rm a s de d o s ifica c ió n p re fe rid a s son fo rm a s de d o s ifica c ió n p a re n te ra l o tóp ica . U na v ía de a d m in is tra c ió n p re fe rid a p a rtic u la r para el a n ticu e rp o a n ti-M IF es una a p licac ión su b cu tá n e a o in traven o sa . U na v ía de a d m in is tra c ió n p re fe rid a para el g lu co co rtico id e es la a p lica c ió n o ra l (p o r e je m p lo , un g rán u lo , líqu ido , sob re o co m p rim id o ). U na fo rm a de a p lica c ió n p re fe rid a a d ic io n a l para el g lu co co rtico id e es la a p lica c ió n tó p ica , en la que una a p lica c ió n tó p ica puede a b a rc a r una a p lica c ió n a la p ie l y /o un p u lve riza d o r, com o un p u lv e r iza d o r nasa l o inh a lad o r. U na v ía de a d m in is tra c ió n p re fe rid a a d ic io n a l para un g lu co co rtico id e es una a p lica c ió n in traven o sa .
V a rio s g lu co co rtico id e s que se co m e rc ia liza n com o a n tiin fla m a to r io s son a m e nu do fo rm u la c io n e s tó p ica s , ta le s com o p u lve riza d o re s n asa le s para la rin itis o in h a la d o re s para el asm a. E stas p re p a ra c io n e s tien en la ve n ta ja de a fe c ta r so lo al á rea o b je tivo , re d u c ie n d o a s í los e fe c to s se cu n d a rio s o p os ib le s in te ra cc io n e s . Los com p u e s to s típ ic o s son b e c lo m e ta so n a , bud eson ida , flu tica so n a , f lu n iso lid a , c lo b e ta so n a , m o m e ta so n a y c ic le son ida . Para el a sm a , los g lu c o c o rtico id e s se a d m in is tra n com o m e d ica m e n to s in h a la to r io s con un in h a la d o r d o s ific a d o r o de po lvo seco. P o r tan to , ta le s fo rm u la c io n e s ta m b ié n son re a liza c io n e s p re fe rid a s de la p re se n te inve nc ión .
La a d m in is tra c ió n p ue de s e r m e d ia n te to d a s las v ía s con oc id as .
Los té rm in o s “ c o m b in a c ió n ” o “te ra p ia de c o m b in a c ió n ” se usan de m a n e ra in te rca m b ia b le en el p rese n te d o cu m e n to . Se re fie ren a un ré g im en de d o s ifica c ió n en el que el a n ticu e rp o a n ti-M IF se a d m in is tra ju n to con el g lu co co rtico id e o v ice ve rsa . El ré g im en de d o s ifica c ió n se ría n o rm a lm e n te d ia rio para los g lu co co rtico id e s y cada 2 se m a n a s para el a n ticu e rp o an ti-M IF . Los re g ím e n e s de d o s ifica c ió n p re fe rid os son:
T a l com o se e xp licó a n te rio rm e n te , es p os ib le a d m in is tra r el a n ticu e rp o a n ti-M IF ju n to con el g lu co co rtico id e o de m a n e ra secu en c ia l. “J u n to c o n ” en e s te co n te x to s ig n ifica q ue no h ay m ás de 10 m in u to s e n tre la a d m in is tra c ió n de l a n ticu e rp o a n ti-M IF y la a d m in is tra c ió n del g lu co co rtico id e . “ De m a ne ra s e c u e n c ia l” s ig n ifica q ue han p a sa d o m á s de 10 m in u tos entre la a d m in is tra c ió n del a n ticu e rp o a n ti-M IF y la a d m in is tra c ió n del g lu co co rtico id e . El p e ríodo de tie m p o p uede s e r de m ás de 10 m in u tos , m ás de 30 m in u tos , m ás de 1 hora , m ás de 3 horas , m ás de 6 h o ra s o m ás de 12 horas.
El a n ticu e rp o a n ti-M IF y el e s te ro id e se d os ifica n p rin c ip a lm e n te para g a ra n tiz a r que a m bo s co m p u e s to s estén p rese n te s en el cu e rp o d u ra n te el m ism o p e ríodo de tie m p o (d u ra n te un p erío do de tie m p o d e te rm in a d o ). Un a n ticu e rp o a n ti-M IF tie n e una se m iv id a de n o rm a lm e n te 2 - 4 sem a na s , los e s te ro id e s una se m iv id a de 6 -24 horas,
P o r tan to , la te ra p ia de co m b in a c ió n a n te r io r ta m b ié n a b a rca e xp líc ita m e n te un ré g im en de d o s ifica c ió n se cu e n c ia l en el que el e xp e rto tien e en cu e n ta la se m iv id a b ien co n o c id a de l g lu co co rtico id e re spe ctivo en cue s tió n y el a n ticu e rp o en cue s tió n . En v is ta del hecho de que los a n ticu e rp o s tie n e n g e n e ra lm e n te una se m iv id a de 2 - 4 sem a na s , la a d m in is tra c ió n de l a n ticu e rp o en cue s tió n pod ría se r só lo cada 2 sem a na s , ca d a 3 se m a n a s o una vez al m es. El g lu c o c o rtico id e q ue va a a d m in is tra rs e en la te ra p ia de co m b in a c ió n de la in ve n c ió n con un a n ticu e rp o de este t ip o tiene, en una re a liza c ió n típ ica , una se m iv id a de 6 - 24 h; p o r tan to , la a d m in is tra c ió n de l g lu co co rtico id e pod ría se r cad a 5 horas, cad a 6 horas, tre s v e c e s al d ía , d os v e c e s al d ía o una v e z al d ía en una re a liza c ió n típ ica .
T a b la 1: d o s ifica c ió n de d e xa m e ta so n a - co m p a ra c ió n ra ta /ra tó n /h u m a n o
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“ La re g la de los c in c o ” , q ue la co n o ce b ien un e xp e rto en la té c n ica de los e s te ro id e s , p ue de u sa rse p ara c a lc u la r los p ro g ra m a s de d o s ifica c ió n e n tre d ife re n te s g lu co co rtico id e s , ta l co m o sigue: 1 mg de d e xa m e ta s o n a e q u iva le a a p ro x im a d a m e n te 5 mg de p re d n iso lo n a , que a su ve z e q u iva le a a p ro x im a d a m e n te 25 m g de co rtisona .
La “ dos is a lta ” m e n c io n a d a a n te r io rm e n te se a d m in is tra ría n o rm a lm e n te en un caso en el que un tra s to rn o a gudo d eba tra ta rs e de la m a n e ra m ás e ficaz pos ib le . N o rm a lm e n te no se a d m in is tra para un p ro g ra m a de d o s ifica c ió n m ás d u ra d e ro de m a yo r d u rac ión .
S in e m ba rg o , la d o s ifica c ió n de g lu co co rtico id e s , a sí com o la d o s ifica c ió n co m b in a d a con a n ticue rp os , según la p rese n te inve nc ión , d eb e rá d e te rm in a rse p o r el m é d ico caso p o r caso seg ún el tra s to rn o e sp e c ífico a tra ta rs e y los d e ta lle s de l su je to a fe c ta do .
S ó lo co m o e je m p lo , que de n in g u n a m a ne ra debe in te rp re ta rse com o lim ita tivo de la p rese n te inve nc ión , n o rm a lm e n te h ab ría d os o p c io n e s p ara el tra ta m ie n to de la nefritis :
1) 500 mg de m e tilp re d n iso lo n a /d ía d u ra n te 3 d ías (d os is a lta ); se g u id o de p re d n iso lo n a a d m in is tra d a p o r v ía ora l m áx. 30 m g /d ía (d os is ba ja), o
2 ) p re d n iso lo n a a d m in is tra d a p o r v ía oral, m áx. 60 m g /d ía (d os is m ed ia ), que luego se reduce con el tie m p o (que puede ta rd a r h as ta 6 m eses).
De nuevo , la inve nc ión está d ir ig id a al e xp e rto en la té cn ica que d e te rm in a rá la d o s ifica c ió n n ecesa ria ta n to de g lu co co rtico id e s com o de a n ticu e rp o s a n ti-M IF b a sá n d o se en su co n o c im ie n to , p o r e je m p lo , según las pau ta s de tra ta m ie n to re spe ctivas , p o r e je m p lo , las p a u ta s de los N IH.
En una re a liza c ió n p a rtic u la rm e n te p re fe rid a , el p rin c ip io a c tivo se ría un p rin c ip io q ue d e b e ría a d m in is tra rs e con una lib e ra c ió n con tro la d a , p o r e je m p lo , una lib e ra c ió n re ta rda da . Es dec ir, las fo rm a s de d o s ifica c ió n que pueden a d m in is tra rse p o r v ía o ra l de la p re se n te inve n c ió n q ue co m p re n d e n un p rin c ip io a c tivo de e ste tipo , p od rían d o ta rse de un re cu b rim ie n to . P o r tan to , en una re a liza c ió n p re fe rid a , la p rese n te inve n c ió n se re fie re a g rá n u lo s con re cu b rim ie n to s y, en p a rticu la r, a g rá n u lo s que co m p re n d e n p rin c ip io s a c tivo s que se libe ra rá n de m a ne ra con tro la d a , p o r lo q ue e s to s g rá n u lo s tie n e n un re cub rim ie n to .
M ás p re fe rid o , este re cu b rim ie n to es un re cu b rim ie n to fa rm a c o ló g ica m e n te a ce p ta b le y p a rticu la rm e n te p re fe rid o es un re cu b rim ie n to e n té rico , un re cu b rim ie n to de lib e ra c ió n p ro lo n g a d a o un re cu b rim ie n to de lib e ra c ió n re ta rda da ; to d o s e s to s re cu b rim ie n to s los co n o ce b ien un e xp e rto en la técn ica .
Un su b co n ju n to de A cM a n ti-M IF p ro te c to re s in vivo (p o r e je m p lo , R AB9, R AB4, R A B 0, R AM 9, R A M 4, R A M 0), que se d irige n con tra el M IF de c ito c in a s p ro in fla m a to r ia s (fa c to r in h ib id o r de la m ig ra c ió n de m a c ró fa g o s ) no se unen al M IF no m o d ifica d o en su e s ta do re duc ido . P o r el con tra rio , se d e m o stró que e stos A cM son a lta m e n te se le c tivo s para una iso fo rm a de M IF d e p e n d ie n te de redox.
Un a n ticu e rp o p a rticu la rm e n te p re fe rid o es el a n ticu e rp o R AB9.
O tro a n ticu e rp o p a rticu la rm e n te p re fe rid o es el a n ticu e rp o R AB4.
A ú n o tro a n ticu e rp o p a rticu la rm e n te p re fe rid o es el a n ticu e rp o R AB0.
Un a n ticu e rp o p a rticu la rm e n te p re fe rid o es el a n ticu e rp o R A M 9.
O tro a n ticu e rp o p a rticu la rm e n te p re fe rid o es el a n ticu e rp o R A M 4.
A ú n o tro a n ticu e rp o p a rticu la rm e n te p re fe rid o es el a n ticu e rp o R A M 0.
T a l com o se m u es tra en la p rese n te inve nc ión , la te ra p ia de co m b in a c ió n p rop u es ta en el p rese n te d o cu m e n to es v e n ta jo sa p o rque da com o re su lta d o el so rp re n d e n te e fe c to s in é rg ico de a m b o s co m p o n e n te s . En v is ta de los e n o rm e s e fe c to s se cu n d a rio s e n co n tra d o s p or el tra ta m ie n to con g lu co co rtico id e s , la p rese n te inve n c ió n es m uy a d e cu a d a para p ro p o rc io n a r un tra ta m ie n to a lte rn a tivo que m e jo ra rá la s itu a c ió n del p ac ien te bajo tra ta m ie n to . S im u ltá n e a m e n te , la re d u cc ió n de los e fe c to s s e cu n d a rio s ta m b ié n m e jo ra rá el c u m p lim ie n to de l p ac ien te , lo cua l es de g ran im p o rta n c ia en p a rticu la r en las e n fe rm e d a d e s c ró n icas . F in a lm e n te , la p re se n te inve n c ió n p e rm ite al m é d ico a u m e n ta r los re su lta d o s o b te n id o s con a lta s d os is de g lu c o c o rtico id e s aún m ás, lo q ue p ue de s a lv a r in m e d ia ta m e n te la v id a en e s ta d o s p a to ló g ico s p a rticu la re s y en c ircu n s ta n c ia s p articu la re s .
La p re se n te in ve n c ió n se d e sc rib irá a co n tin u a c ió n a m o do de e je m p lo s , p o r lo q u e los e je m p lo s no se co n s id e ra rá n lim ita tivo s de la p re se n te invenc ión .
E je m p lo s de re fe re n c ia
A ) E n sa yo de G C O para la d e te cc ió n de a n ticue rp os :
Se ce n tr ifu g a un cu ltivo en su sp e n s ió n de TH P1 y las cé lu la s se re su sp e n d e n en m e d io co m p le to nue vo a una d en s id a d c e lu la r de 106 cé lu las p o r ml. Este cu ltivo se tra n s fie re a los p oc illos de una m ic ro p la ca de 96 p oc illos (90 |il/p o c illo ) y se a ñade un p os ib le a n ticu e rp o a n ti-M IF para d a r una co n ce n tra c ió n fin a l de 75 |ig /m l. C ada a n ticu e rp o se som e te a p rue b a p o r tr ip lica d o . D espu és de la incu ba c ió n d u ra n te la noche a 37°C, se a ña de d e xa m e ta s o n a para d a r una co n ce n tra c ió n de 2 nM y d e sp u é s de una hora de incu ba c ió n a 37°C se a ña de LPS (co n c e n tra c ió n fin a l de 3 ng /m l). D e sp u é s de o tra s se is h o ra s de in cu b a c ió n a 37°C, se re cog e el s o b re n a d a n te y se d e te rm in a n las c o n c e n tra c io n e s de lL -6 en un E L IS A d isp o n ib le c o m e rc ia lm e n te . Los re su lta d o s de los tr ip lica d o s se p ro m e d ia n y el p o rce n ta je de se c re c ió n de IL -6 se d e te rm in a en co m p a ra c ió n con los a n ticu e rp o s de con tro l. Los a n ticu e rp o s q ue dan co m o re su lta d o una sec re c ió n de IL-6 de m e no s del 75 % se e va lúa n co m o pos itivos.
B) E n sa yo para la d e te rm in a c ió n de va lo re s de C k n
El p ro ce d im ie n to e xp e rim e n ta l se lleva a ca b o ta l com o se d e sc rib e para el e n sa yo de d e te cc ió n con la e xce p c ió n de que se usan ca n tid a d e s c re c ie n te s de a n ticu e rp o s (n o rm a lm e n te de 1 a 125 nM ). La cu rva de re spu es ta a la dos is re su lta n te se e xp re sa co m o % de inh ib ic ió n en co m p a ra c ió n con un a n ticu e rp o de con tro l n eg a tivo . Esta cu rva se usa para c a lc u la r el e fec to in h ib id o r m á x im o del a n ticu e rp o (% inh. m á x .) y la co n ce n tra c ió n de a n ticu e rp o que m u e s tra el 50 % del e fe c to in h ib id o r m á x im o (C I50).
C ) Inh ib ic ión de la p ro life ra c ió n ce lu la r
El sue ro e s tim u la la se c re c ió n de M IF en N IH /3 T 3 la te n te s y M IF a su ve z e s tim u la la p ro life ra c ió n ce lu la r. Los a n ticu e rp o s que inh iben este M IF e nd ó g e n o , p o r tan to , d ism in u ye n la p ro life ra c ió n de cé lu la s N IH /3 T 3 la ten tes. La re d u cc ió n de la p ro life ra c ió n se d e te rm in a m e d ia n te la in co rp o ra c ió n de 3H -tim id in a .
Se incu ba n 1000 cé lu las N IH /3 T 3 p o r poc illo en una p laca de 96 p oc illos d u ra n te el fin de se m a n a a 37°C en m e d io que c o n te n ía su e ro al 10% . Se m a ta ro n de h a m b re cé lu la s d u ra n te la noche a 37°C p o r in cu b a c ió n en m e d io que co n te n ía sue ro al 0 ,5% . Se re tira el m e d io al 0 ,5 % y se re e m p la za p o r m e d io n uevo que con tie n e su e ro al 10%, a n ticu e rp o 75 |ig /m l y 3H -tim id in a 5 | i C i/m l. D e s p u é s de 16 h o ra s de in cu b a c ió n en una in cu b a d o ra de C O 2 a 37°C, las cé lu la s se lavan dos v e ce s con 150 |il de P B S frío p o r poc illo . U sa n d o una p ip e ta m u ltica na l, se a ña de n 150 |il de una d iso lu c ió n de T C A al 5% (p /v ) p o r p oc illo y se incu ba n d u ra n te 30 m in u to s a 4°C. Las p la cas se lavan con 150 |il de P BS . P o r poc illo , se a ña de n 75 |il de una d iso luc ión de N aO H 0 ,5 M con S D S al 0 ,5% , se m e zc la n y se a lm a ce n a n a te m p e ra tu ra am b ie n te . Se m iden las m u e s tra s en un c o n ta d o r p m e zc la n d o 5 m l de U ltim a G old (P a cka rd ) y 75 |il de d iso lu c ió n de m u es tra . C ad a d e te rm in a c ió n se re a liza p o r tr ip lica d o y los v a lo re s se com p a ra n con los va lo re s de l a n ticu e rp o de co n tro l m e d ia n te una p rue b a de la t. Los a n ticu e rp o s que re du cen s ig n ifica tiva m e n te la p ro life ra c ió n (P < 0 ,05 ) se e va lú a n co m o pos itivos.
D) E s tu d io s de un ión: d e te rm in a c ió n de l e p íto p o de a n ticu e rp o s a n ti-M IF
C a d a p é p tid o se d iluye en ta m p ó n de a co p la m ie n to para d a r una co n ce n tra c ió n de p ép tido de n o rm a lm e n te 1 |ig /m l a ñ a d id o a las m ic ro p la ca s (N U N C Im m o b ilize r™ A m in o P la te F96 C le a r) y se incu ba d u ra n te la noche a 4°C (100 |il/p o c illo ). C om o co n tro le s se usan M IF y PBS re co m b in a n te s de lon g itu d com p le ta . La p laca se lava 3 ve ce s con 200 |il de P B S T y se a ña de n a n ticu e rp o s (2 -4 |ig /m l en P B S ) (100 |il/p o c illo ) y se incu ba n d u ra n te 2 hora s a te m p e ra tu ra a m b ie n te con ag itac ió n suave. La p laca se lava 3 ve ce s con 200 |il de P B S T y se a ña de a n ticu e rp o de d e te cc ió n (p o r e je m p lo , a n ticu e rp o a n ti-Ig G h um a na m a rca d o con H R P e sp e c ífico de Fc, S ig m a ) (100 ^ l/p o c illo ) . D e sp u é s de in c u b a r d u ra n te 1 hora a te m p e ra tu ra a m b ie n te con a g ita c ió n sua ve , la p la ca se lava 3 v e c e s con 200 |il de P B S T. C ada poc illo se incu ba con 100 |il de d iso lu c ió n de T M B (3 ,3 ',5 ,5 '- te tra m e tilb e n c id in a ) (T -0440 , S ig m a ) d u ra n te 30 m in u to s en la o scu rid a d . La re acc ión de tin c ió n se d e tien e a ñ a d ie n d o 100 |il de d iso lu c ió n de H 2S O 4 1,8 M p o r pozo. Las m u e s tra s se m iden a 450 nm.
E) D e te rm in a c ió n de a fin id a d de fra g m e n to s Fab de a n ticu e rp o s a n ti-M IF m e d ia n te B iaco re
N orm a lm e n te , se inm ov iliza n 40 u n id a d e s RU de M IF re co m b in a n te h um a no en un ch ip s e n s o r con una m a triz de C M 5 (= d e x tra n o ca rb o x im e tila d o ) (B ia co re ). S e inyectan fra g m e n to s Fab a un in te rva lo de co n ce n tra c ió n n o rm a lm e n te de 6 a 100 nM d ilu ido en H B S -E P . D e spu és de cad a c iclo , el ch ip se re g e n e ra con N aO H 50 m M N aC l 1 M. Las a fin id a d e s se ca lcu la n según el m o d e lo de L a n g m u ir 1:1.
Ejemplos
In tro d ucc ió n :
La te ra p ia de e n fe rm e d a d e s que usa fá rm a c o s g lu co co rtico id e s a m e n u d o se ve o b s ta cu liza d a p o r e fe c to s s e cu n d a rio s g ra ve s o un a u m e n to re q u e rid o de la d o s ifica c ió n . En e sta inve nc ión , se d e sc rib e que la e fe c tiv id a d de los c o m p u e s to s de g lu co co rtico id e s (p o r e jem p lo , d e xa m e ta so n a , h id ro co rtiso n a o p re d n is o lo n a ) puede a u m e n ta rse m e d ia n te la co m b in a c ió n con un a n ticu e rp o a n ti-o xM IF . U na co m b in a c ió n de e ste tip o tie n e el p o te n c ia l de d a r com o re su lta d o una te ra p ia m e jo rad a de ta le s tra s to rn o s en co m p a ra c ió n con la m o n o te ra p ia re sp e c tiva e inc lu so p ro lo n g a r s ig n ifica tiva m e n te la e sp e ra n za de v id a de los p ac ien tes .
En p a rticu la r, con la p re se n te inve n c ió n se log ra lo s igu ien te :
• p ue de n a d m in is tra rs e d os is m ás b a jas de g lu c o c o rtico id e s p ara lo g ra r e l m ism o e fe c to con una d os ifica c ió n a n te r io rm e n te m ás a lta , lo q ue da com o re su lta d o m e n o s e fe c to s se cu n d a rio s
• se e n co n tra rá una m a yo r e fica c ia con una d o s ifica c ió n idé n tica de g lu co co rtico id e s
• pueden a d m in is tra rse d o s ifica c io n e s a lta s de g lu co co rtico id e s si se d esea y te n d rá n un e fe c to te ra p é u tico po ten c iad o .
N E F R IT IS
E jem p lo 1: m o de lo a n im a l para g lo m e ru lo n e fr it is con sem ilu na s :
E s te m o d e lo se re co n o ce en la té c n ica co m o p re d e c ib le p ara m o s tra r los e fe c to s de la inve n c ió n . Es a d e cu a d o para m o s tra r los e fe c to s de la te ra p ia de co m b in a c ió n en to d a la gam a de e n fe rm e d a d e s que pueden in c lu irse bajo la d e fin ic ió n a n te r io r de “ e n fe rm e d a d e s re la c io n a d a s con M IF ” en p a rticu la r, este m o d e lo es a d e cu a d o para las s ig u ie n te s e n fe rm e d a d e s : n e fritis lúp ica , n e fritis an ti-G B M , n e fritis p o r A N C A , n e fro pa tía p o r IgA. La d e xa m e ta so n a se re co n o ce en la té c n ica co m o p red ic tiva de un g lu co co rtico id e re spe ctivo en el tra ta m ie n to de un hum ano . P o r e je m p lo , un g lu co co rtico id e p re fe rid o para el tra ta m ie n to de la ne fritis lúp ica en un h um a no sería la m e tilp re d n iso lo n a .
El e fe c to de l a n ticu e rp o m o n o c lo n a l a n ti-M IF (A cM ) y su co m b in a c ió n con d e x a m e ta so n a se e xa m in a en la ne fritis n e fro tó x ica m e d ia d a p o r inm un ida d (N T N ) en ra tas W is ta r K yo to (W K Y ). Este m o de lo tie n e un in ic io rá p ido de la e n fe rm e d a d con in filtra c ió n de m a cró fa g o s , d e p o s ic ió n de fib r in a y d e s tru c c ió n de te jid o 12. Se ind u ce N TN en ra tas W K Y m a ch o m e d ia n te inye cc ió n in tra ve n o sa ú n ica de 0,1 ml de sue ro de co n e jo a n ti-m e m b ra n a b asa l g lo m e ru la r de ra ta (d ía 0). El A cM y la d e xa m e ta so n a se inye cta n p o r v ía in tra p e rito n e a l en los pun to s de tie m p o y las d o s ifica c io n e s que se d esc ribe n a con tin u a c ió n . S e recogen m u e s tra s de o rina de 24 horas u sa nd o ja u la s m e ta b ó lic a s a n te s de la in d u cc ió n de la g lo m e ru lo n e fr it is y en d ive rso s in te rva lo s de tie m p o d e s p u é s de la ind u cc ió n de n e fritis para la c u a n tif ica c ió n de la p ro te inu ria . Se con g e la n s e cc io n e s de te jid o s re n a le s para su p o s te rio r a ná lis is m e d ia n te in m u n o h is to lo g ía . La m o rfo lo g ía de la les ión rena l se e va lúa en se cc io n e s de te jid o rena l te ñ id o con h e m a to x ilin a /e o s in a (H & E ) y á c id o p e ryó d ico de S ch iff. El m a cró fa g o se d e tec ta m e d ia n te la té c n ica de in m u n o p e ro x id a sa y u sa nd o el a n ticu e rp o m o n o c lo n a l de ra tón ED1 (S e ro te c , UC). El m o d e lo a n im a l se d e sc rib ió en d e ta lle (T a m FW K, S m ith J, M ore l D, K a rk a r AM , T h o m p so n EM , C o o k HT, P use y CD: D e ve lo p m e n t o f sca rring and rena l fa ilu re in a ra t m ode l o f c re sce n tic g lo m e ru lo n e p h ritis . N ep h ro l D ia l T ra n sp la n t 14: 1658-1666 , 1999).
D o s ifica c ió n de a n ticu e rp o s a n ti-M IF
In te rva lo de d os is de a n ticu e rp o a n ti-M IF para te ra p ia hum ana :
0 ,2 - 25 m g/kg
In te rva lo de d os is p re fe rid o para te ra p ia hum a na : 1 -10 m g /kg
Los a n ticu e rp o s a n ti-M IF son 10 ve ce s m á s p o te n te s en la inh ib ic ió n de M IF h u m a n o que M IF de ra tón o ra ta b a sá n d o se en e n sa yo s in vitro (e n sa yo de q u im io c in e s is ) y m e d ic io n e s de a fin ida d . P o r tan to , el in te rva lo de d os is de l e xp e rim e n to de n e fritis (e xp e rim e n to 1c) de 2 -120 m g /kg en la ra ta co rre sp o n d e a 0 , 2 - 12 m g /kg en el á m b ito hum ano .
El e fe c to te ra p é u tico p o te n c ia d o m e d ia n te la co m b in a c ió n de un a n ta g o n is ta de M IF con e s te ro id e s se d e m u e s tra en un m o d e lo de ra ta para la g lo m e ru lo n e fr it is con sem ilu na s . Se usan d ife re n te s co n ce n tra c io n e s de d e x a m e ta so n a en un e xp e rim e n to p re lim in a r para e n co n tra r una dos is de e s te ro id e s su b ó p tim a (e je m p lo 1a; en la fig u ra 1 se re p re se n ta un d ia g ra m a e sq u e m á tico de l e xp e rim e n to ; los re su lta d o s se m u e s tra n en las fig u ra s 2 -4). En un se g u n d o e xp e rim e n to p re lim in a r, se co n firm a la e fe c tiv id a d de un a n ta g o n is ta de M IF (a n ticu e rp o a n ti-M IF R A M 9) (e je m p lo 1b). F in a lm e n te , se co m b in a una dos is su b ó p tim a de d e xa m e ta so n a con d icho a n ticu e rp o (e je m p lo 1c) y e sta co m b in a c ió n da co m o re su lta d o una re d u cc ió n n o ta b le m e n te m e jo ra d a de los p a rá m e tro s de la e n fe rm e d a d . El e fe c to b e n e fic io so o b se rva d o en e sta te ra p ia de co m b in a c ió n co rre sp o n d e al e fe c to que se log ra con una dos is de e s te ro id e s m ás de 10 v e ce s m ayor.
E jem p lo 1a:
R esu m e n (vé a se ta m b ié n la fig u ra 1)
• El tra ta m ie n to se a d m in is tra 4 d ía s d e sp u é s de la in d u cc ió n de g lo m e ru lo n e fr it is en ra tas W K Y
• la g ra ve d a d de la les ió n re na l se e va lú a d e sp u é s de la re co g id a de o rin a d u ra n te la n o ch e (d ía 7 a d ía 8) y d e sp u é s de l sa c rific io se le c tivo de los a n im a le s el d ía 8 (vé a se la fig u ra 1)
• la inye cc ió n in tra p e rito n e a l ún ica de d e x a m e ta so n a 0 ,25 m g /kg reduce la p ro te inu ria en a p ro x im a d a m e n te un 50 % (fig u ra 2), la in filtra c ión de m a c ró fa g o s g lo m e ru la re s en a p ro x im a d a m e n te un 53% (fig u ra 3) y los re cu e n to s de se m ilu n a s en a p ro x im a d a m e n te un 25 % (fig u ra 5).
^ 0 ,025 m g /kg se d e te rm in a co m o co n ce n tra c ió n su b ó p tim a de d e x a m e ta so n a
^ 0 ,025 m g /kg se co n s id e ra a p ro p ia d o para e s tu d ia r un p os ib le e fe c to de l a n ticu e rp o R A M 9
E jem p lo 1b:
R esu m e n (vé a se ta m b ié n la fig u ra 4)
• El tra ta m ie n to se a d m in is tra 4 y 6 d ía s d e sp u é s de la ind u cc ión de g lo m e ru lo n e fr it is en ra tas W K Y
• la g ra ve d a d de la les ió n re na l se e va lú a d e sp u é s de la re co g id a de o rina d u ra n te la n oche (d ía 7 a d ía 8) y d e sp u é s de l sa c rific io se le c tivo de los a n im a le s el d ía 8 (fig u ra 5)
• la inye cc ió n in tra p e rito n e a l de l a n ticu e rp o R A M 9 reduce
- a lb u m in u ria (fig u ra 6 y fig u ra 10): 60 m g/kg : aprox . el 22% , 120 m g/kg : aprox . el 25%
- in filtra c ión de m a c ró fa g o s (fig u ra 7 y fig u ra 11): 60 m g/kg : a p ro x im a d a m e n te el 26% , 120 m g/kg :
a p ro x im a d a m e n te el 38%
- R e cu e n to s de s e m ilu n a s (fig u ra 8 y fig u ra 12): 60 m g /kg : a p ro x im a d a m e n te el 10% , 120 m g/kg :
a p ro x im a d a m e n te el 12%
• a de m ás, M IF, T N F a e II-1 p se re du cen en la orina.
E jem p lo 1c:
R esu m e n (vé a se la fig u ra 9 )
• El tra ta m ie n to se a d m in is tra 4 d ías (d e xa m e ta so n a a n ticu e rp o ) y 6 d ías (a n ticu e rp o so lo ) d e sp u é s de la in d u cc ió n de g lo m e ru lo n e fr it is en ra tas W K Y
• la g ra ve d a d de la les ió n re na l se e va lú a d e sp u é s de la re co g id a de o rina d u ra n te la n oche (d ía 7 a d ía 8) y d e sp u é s del sa c rific io se le c tivo de los a n im a le s el d ía 8 (fig u ra 9)
• la co m b in a c ió n de l a n ticu e rp o R A M 9 y la d e xa m e ta s o n a m u e s tra fu e rte s e fe c to s s iné rg ico s , vé a n s e las fig u ra s 10-12:
- a pa re n te m e n te , el e fe c to de la d e x a m e ta so n a se p o te n c ia > 10 ve ce s
El m o de lo a n im a l d e sc rito e je m p lifica el e fec to b e n e fic io so de una te ra p ia de co m b in a c ió n de a n ta g o n is ta s y e s te ro id e s de l M IF. El tra ta m ie n to con e s te ro id e s tie n e una a m p lia g a m a de a p lic a c io n e s te ra p é u tica s , p e ro m u e s tra lim ita c io n e s g e n e ra liza d a s (e fe c to s se cu n d a rio s a d os is a ltas , re s is te n c ia a los e s te ro id e s , e tc.). U na te ra p ia de c o m b in a c ió n de e s te ro id e s y a n ticu e rp o s de M IF tie n e el p o te n c ia l de a b r ir una nue va o p o rtu n id a d de tra ta m ie n to g e n e ra l en p a c ie n te s con, p o r e jem p lo , e n fe rm e d a d e s in fla m a to ria s , e n fe rm e d a d e s in fe cc io sa s o cáncer.
E je m p lo 2
El s ig u ie n te m o d e lo usa ra to n e s N Z B /N Z W F1 q ue se re con oce n en la té c n ica com o un m o d e lo e xp e rim e n ta l para el lupus e rite m a to so s is té m ico y la n e fritis lúp ica . S e re co n o ce q ue el tra ta m ie n to de e s to s ra ton es es p re d e c ib le para el tra ta m ie n to de la n e fritis lúp ica y el lupus e rite m a to so s is té m ico .
El e fe c to te ra p é u tico p o te n c ia d o m e d ia n te la co m b in a c ió n de un a n ta g o n is ta de M IF con e s te ro id e s se d e m u e s tra en un m o d e lo de ra tón para n e fritis lúp ica . Se usan d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s de d e xa m e ta s o n a en un e xp e rim e n to p re lim in a r p ara e n co n tra r una dos is de e s te ro id e s su b ó p tim a (e xp e rim e n to 2a). F in a lm e n te , una d os is s u b ó p tim a de d e xa m e ta s o n a se co m b in a con d ich o a n ticu e rp o (e xp e rim e n to 2 b ) y e sta co m b in a c ió n da com o re su lta d o una re d u cc ió n n o ta b le m e n te m e jo ra d a de los p a rá m e tro s de la e n fe rm ed ad .
P ara e stos e xp e rim e n to s se usan ra ton es h íb rid o s N Z B /N Z W F1 a du ltos . E s tos ra ton es d e sa rro lla n un tra s to rn o in m u n o ló g ico que se a se m e ja m u ch o al lupus e rite m a to so s is té m ico (L E S ) en el hom bre . En ra ton es hem bra , la e n fe rm e d a d se m a n ifie s ta en a p ro x im a d a m e n te 32 -38 se m a n a s de edad con p ro te in u ria p ers is ten te y a n ticu e rp o s c ircu la n te s con tra á c id o s n uc le icos .
E jem p lo 2a:
“ H a lla zg o de d os is de d e x a m e ta so n a en ra ton es h íb rid os N Z B /N Z W F 1 ”
El o b je tivo es d e te rm in a r una dos is su b ó p tim a de d e xa m e ta s o n a para e s tu d io s de s in e rg ia a d ic io n a le s e n tre la te ra p ia con e s te ro id e s y a n ticu e rp o s a n ti-M IF .
El e s ta b le c im ie n to de la e n fe rm e d a d en los ra ton es N Z B /N Z W F1 se co n tro la y co n firm a m id ie n d o p ro te inu ria . C u a n d o los ra ton es m u es tra n p ro te inu ria , los a n im a le s se tra ta n i.p. con d ife re n te s d os is de d e xa m e ta s o n a o v e h ícu lo . A l fin a l de l e xp e rim e n to , los a n im a le s se sac rifica n y los p a rá m e tro s de lec tu ra son p ro te inu ria , n ú m e ro de m a cró fa g o s g lo m e ru la re s e h is to lo g ía renal.
G ru p o 1: V e h ícu lo
G ru p o 2: d e x a m e ta so n a 0 ,5 m g /kg
G ru p o 3: d e x a m e ta so n a 1,0 m g/kg
G ru p o 4: d e x a m e ta so n a 2 ,0 m g/kg
G ru p o 5: con tro l h is to ló g ico
E jem p lo 2b:
“ S in e rg ia e n tre el a n ticu e rp o a n ti-M IF R A M 9 y la dos is su b ó p tim a de d e xa m e ta so n a en ra ton es h íb rid os N Z B /N Z W F 1 ”
C on este e xp e rim e n to se in ve s tig a el e fe c to s in é rg ico e n tre el a n ticu e rp o R A M 9 ca n d id a to a fá rm a co y una dos is s u b ó p tim a de d e xa m e ta so n a . El e s ta b le c im ie n to de la e n fe rm e d a d en los ra ton es N Z B /N Z W F1 se m o n ito r iza y co n firm a m id ie n d o p ro te inu ria . C u a n d o los ra ton es m u es tra n p ro te inu ria , los a n im a le s se tra ta n con e s te ro id e s y a n ticu e rp o . A l fina l de l e xp e rim e n to , los a n im a le s se sac rifica n y los p a rá m e tro s de lec tu ra son p ro te inu ria , núm e ro de m a c ró fa g o s g lo m e ru la re s e h is to lo g ía renal.
“ G ru p o s de a n im a le s ”
G ru p o 1: con tro l h is to ló g ico
G ru p o 2: a n ticu e rp o de co n tro l B A X C3
G ru p o 3: a n ti-M IF R A M 9
G ru p o 4: d e x a m e ta so n a a n ticu e rp o de con tro l B A X C3
G ru p o 5: d e x a m e ta so n a a n ti-M IF R A M 9
T a b la 2: re su m e n de l e xp e rim e n to 2
Figure imgf000025_0001
N efritis lúp ica
Figure imgf000026_0001
E n fe rm e d a d e s m e d ia d a s p o r cé lu la s T
E je m p lo 3a
El m o de lo a n im a l u sado se re fie re a una ind u cc ión de re sp u e s ta s de h ip e rse n s ib ilid a d de tip o re ta rd a d o (D T H ) a D N F B (2 ,4 -d in itro flu o rb e n zo l) : los ra ton es C 57 B I/6 se se n s ib iliza n m e d ia n te la a p lica c ió n tó p ica de D N F B en el a bd om e n . Los ra ton es se exp on en al p in ta r las o re ja s de l ra tón con d iso luc ión de D N FB . La g ra ve d a d de las re sp u e s ta s in fla m a to ria s se ju z g a m e d ia n te m e d ic io n e s de ca lib re de l g ro s o r de la o re ja a las 24 hora s d e sp u é s de la e xp o s ic ió n . A l m ism o tie m p o , se sa c rifica n los a n im a le s y se co rta n las o re ja s y se co n se rva n p ara a ná lis is h is to ló g ico s pos te rio re s .
E ste m o de lo a n im a l se re co n o ce en la té cn ica com o p red ic tivo de e n fe rm e d a d e s re la c io n a d a s con re sp u e s ta s in m u n ita ria s m e d ia d a s p o r cé lu la s T, p o r e je m p lo , in fla m a c ió n cu tá ne a , com o pso rias is .
El p ro g ra m a de tra ta m ie n to es ta l com o sigue:
T = 0d: s e n s ib iliz a r ra ton es
T = 5d: a d m in is tra r te ra p ia a n tiin fla m a to r ia y e xp o n e r ra tones.
T = 6d: c u a n tif ica r la h in ch a zó n de las o re jas , sa c rif ic a r ra tones, re c o g e r o re ja s p ara a n á lis is h is to ló g ico s a d ic io n a le s Los e xp e rim e n to s se llevan a cabo con el m o de lo d escrito a n te r io rm e n te para re a liz a r una va lo ra c ió n de la d os is de d e xa m e ta s o n a (de m a n e ra s im ila r a la e xp lica d a en los e je m p lo s 1 y 2 ) y para d e te rm in a r los e fe c to s de una co m b in a c ió n de a n ticu e rp o R A M 9 e h id ro co rtiso n a (a p lica c ió n tem á tica ).
T o d o s los e xp e rim e n to s m u es tra n un e fe c to s in é rg ico de la com b in a c ió n .
E je m p lo 3b-d : h ip e rse n s ib ilid a d de con ta c to
M a te ria l y m é to d o s
Se d e te rm in ó la re sp u e s ta de h ip e rse n s ib ilid a d de con ta c to (C H S ) a 2 ,4 -d in itro flu o ro b e n c e n o (D N F B ) u sa n d o una m o d ifica c ió n de un m o d e lo a n te r io r d e sc rito (vé ase L ud w ig , et al., 2010, A m J P a th o l 176, 1339 -1345 ). Los ra ton es C 57 B L /6 se s e n s ib iliza ro n tra ta n d o la p ie l de la e sp a ld a de l ra tón ra su rad a con 75 |il de d iso lu c ió n de D N F B (S igm a , St. Lou is , M O ) (e l 0 ,5 % en a ce to n a /a c e ite de o liva , 4 /1 ). En el d ía 5, los ra to n e s se tra ta ro n con a p lica c ió n tó p ic a de h id ro co rtiso n a (en o re ja s e xp u e s ta s ) o v e h ícu lo (en o re ja s no e xp u e s ta s ) e in ye cc ió n in tra v e n o sa de a n ticu e rp o a n ti-M IF R A M 9 o a n tic u e rp o de co n tro l de iso tipo . 30 m in u to s d esp u é s , las o re ja s d e re c h a s de los ra to n e s se e xp u s ie ro n con 20 |il de D N F B al 0 ,3 % para p ro vo ca r una re sp u e s ta in fla m a to ria loca l. E l a ce ite de l ve h ícu lo (a c e to n a /a c e ite de o liva ) se a p licó a las o re ja s izq u ie rd a s co m o con tro l. La re spu es ta de h in ch a zó n a D N FB , e sp e c ifica d a co m o la d ife re n c ia e n tre las o re ja s d e re ch a e izqu ie rda , se m id ió 24 h d e sp u é s de la p rue b a u sa n d o un m ic ró m e tro (M itu to yo Co., T o k io , Jap ón ). S e u sa ron 8 ra ton es p o r g rupo .
R e su lta d o s
E jem p lo 3b: v a lo ra c ió n de la d os is de h id ro co rtiso n a
En un p rim e r e xp e rim e n to , se a p lica ro n tre s d os is d ife re n te s de h id ro co rtiso n a (a l 0 ,3% , al 1% y al 3% en p o m a d a de c re m a base d A c ) sin a p lica c ió n de a n ticu e rp o . El v e h ícu lo s in h id ro co rtiso n a s irv ió com o con tro l n eg a tivo . Se e n co n tró que la h id ro co rtiso n a al 1% es una co n ce n tra c ió n que p ro d u ce e fe c to s a n tiin fla m a to r io s su b ó p tim o s en el m o de lo de d e rm a titis de con tac to , ta l com o se d e te rm in a m id ie n d o el g ro s o r de la oreja .
E jem p lo 3c: v a lo ra c ió n de la d os is de a n ticu e rp o a n ti-M IF R AM 9:
En un se g u n d o e xp e rim e n to , se a p licó a n ticu e rp o a n ti-M IF R A M 9 20 m g /kg sin h id ro co rtiso n a y se usó un a n ticu e rp o de co n tro l de iso tip o co m o co n tro l neg a tivo . La h in ch a zó n de la o re ja , la m e d id a p rin c ip a l en e s to s e xp e rim e n to s , se re du jo s ig n ifica tiva m e n te en ra ton es tra ta d o s con a n ticu e rp o a n ti-M IF en co m p a ra c ió n con los ra ton es tra ta d o s con un a n ticu e rp o de co n tro l de iso tipo o so lu c ió n sa lin a . C o m o 20 m g /kg era una dos is a lta m e n te e ficaz, se usó R A M 9 10 m g /kg com o d os is su b ó p tim a para el e xp e rim e n to poste rio r.
E jem p lo 3d: a p lica c ió n c o m b in a d a de R A M 9 (i.v .) e h id ro co rtiso n a (tó p ica )
F in a lm e n te , los ra ton es se tra ta ro n con a n ticu e rp o de con tro l de iso tipo 10 m g /kg o R A M 9 so lo o en co m b in a c ió n con

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i . A n tic u e rp o a n ti-M IF en co m b in a c ió n con un g lu co co rtico id e p ara su uso en el tra ta m ie n to de in fla m ac ió n , en el q ue el a n ticu e rp o es un a n ticu e rp o a n ti-o xM IF , y en el q ue el a n ticu e rp o a n ti-M IF se s e le cc io n a del s ig u ie n te g rupo : a n ticu e rp o a n ti-M IF R A B 9, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25111 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a com o D S M 25113 , R A B 4, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a com o D S M 25110 y una ca d en a p e sad a d e p o s ita d a co m o D SM 25112 y /o RAB0, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25114 y una ca d e n a p esada d e p o s ita d a com o D S M 25115 , o R A M 9, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25859 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a co m o D SM 25860 , R A M 4, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a co m o D SM 25861 y una ca d e n a p esada d e p o s ita d a com o D SM 25862 o RAM 0, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25863 y una ca d e n a p esada d e p o s ita d a com o D S M 25864.
  2. 2. C o m b in a c ió n para su uso según la re iv in d ica c ió n 1, en la q ue el g lu co co rtico id e se s e le cc io n a del g rup o que c o n s is te en m e tilp re d n iso lo n a , p re d n iso lon a , tr im a c in o lo n a , d e xa m e ta so n a , p a ra m e ta so n a , f lu o rco rto lo n a , b ud en os ida , flu tica so n a , f lu n iso lid a , c ic le son ida , m o m e ta so n a , c lo b e ta so n a , c o rtiso n a e h id ro co rtiso n a , y S E G R A /S E G R M a n tiin fla m a to rio s .
  3. 3. C o m b in a c ió n para su uso seg ún cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 2, en la q ue el a n ticu e rp o a n ti-M IF se s e le cc io n a del g rup o de a n ticu e rp o R AB9, es dec ir, un a n ticu e rp o con una cad en a lige ra d e p o s ita d a co m o D SM 25111 y una cad en a p esad a d e p o s ita d a com o D SM 25113 , a n ticu e rp o R AB4, es dec ir, un a n ticu e rp o con una cad en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25110 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a com o D SM 25112 y a n ticu e rp o R AB0, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25114 y una cad en a p e sad a d e p o s ita d a com o D SM 25115 , o R A M 9, es decir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a co m o D SM 25859 y una ca d e n a p esada d e p o s ita d a co m o D SM 25860 , R AM 4, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25861 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a co m o D SM 25862 o R AM 0, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25863 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a co m o D S M 25864 , p re fe rib le m e n te a n ticu e rp o R A M 9, el g lu co co rtico id e se s e le cc io n a del g rup o de (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta so n a en el ca so de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e n o s id a en el caso de a d m in is tra c ió n loca l y la in fla m a c ió n se se le cc io n a del g rup o de nefritis , in fla m a c ió n cu tá ne a , e n fe rm e d a d in te s tin a l in fla m a to ria (E II) y e sc le ro s is m ú ltip le .
  4. 4. C o m b in a c ió n p ara su uso según la re iv in d ica c ió n 3, en la q ue la n e fritis se s e le cc io n a de n e fritis lúp ica, g lo m e ru lo n e fritis , n e fro p a tía p o r IgA o IgM, n e fritis a n ti-G B M con va sc u lit is s is té m ica y g lo m e ru lo n e fr it is rá p id a m e n te p rog res iva .
  5. 5. C o m b in a c ió n para su uso según la re iv in d ica c ió n 4, en la q ue la v a s c u lit is s is té m ica se s e le cc io n a de p o lia rte r itis nodosa, g ra n u lo m a to s is de W e g e n e ry p ú rp u ra de S ch o e n le in H enoch.
  6. 6. C o m b in a c ió n para su uso según la re iv in d ica c ió n 4, en la que la g lo m e ru lo n e fr it is se se le cc io n a de tip o I, tip o II, tip o III o tip o IV, y n e fritis p o r A N C A (a n ticu e rp o s c ito p la s m á tic o s a n ti-n e u tró filo s ).
  7. 7. C o m b in a c ió n para su uso según la re iv in d ica c ió n 4, en la que el a n ticu e rp o a n ti-M IF es R AM 9, es dec ir, un a n ticu e rp o con una cad en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25859 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a com o D SM 25860 , el g lu co co rtico id e se se le cc io n a del g rup o de (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta s o n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e n o s id a en el caso de a d m in is tra c ió n loca l y la n e fritis es n e fritis lúp ica.
  8. 8. C o m b in a c ió n para su uso según la re iv in d ica c ió n 4, en la que el a n ticu e rp o a n ti-M IF es R AM 9, es dec ir, un a n ticu e rp o con una cad en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25859 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a com o D SM 25860 , el g lu co co rtico id e se se le cc io n a del g rup o de (m e til)p re d n iso lo n a y d e xa m e ta s o n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e n o s id a en el caso de a d m in is tra c ió n loca l y la n e fritis es lupus e rite m a to so s is té m ico .
  9. 9. C o m b in a c ió n para su uso seg ún cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, en la q ue el a n ticu e rp o a n ti-M IF se s e le cc io n a del g rup o de a n ticu e rp o R AB9, es dec ir, un a n ticu e rp o con una cad en a lige ra d e p o s ita d a co m o D SM 25111 y una cad en a p esad a d e p o s ita d a com o D SM 25113 , a n ticu e rp o R AB4, es dec ir, un a n ticu e rp o con una cad en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25110 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a com o D SM 25112 y a n ticu e rp o R AB0, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25114 y una cad en a p e sad a d e p o s ita d a com o D SM 25115 , o R A M 9, es decir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a co m o D SM 25859 y una ca d e n a p esada d e p o s ita d a co m o D SM 25860 , R AM 4, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d en a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25861 y una ca d e n a p esad a d e p o s ita d a co m o D SM 25862 o R AM 0, es dec ir, un a n ticu e rp o con una ca d e n a lige ra d e p o s ita d a com o D SM 25863 y una cad en a p esad a d e p o s ita d a com o D SM 25864 , p re fe rib le m e n te R A M 9, el g lu co co rtico id e se se le cc io n a del g ru p o de d e xa m e ta s o n a y (m e til)p re d n iso lo n a en el caso de a d m in is tra c ió n s is té m ica y b u d e n o s id a o h id ro co rtiso n a en el ca so de a d m in is tra c ió n loca l y la in fla m a c ió n e stá p ro vo ca d a p o r una re spu es ta in m u n ita ria m e d ia d a p o r cé lu la s T.
  10. 10. C o m b in a c ió n para su uso seg ún la re iv in d ica c ió n 9, en la que la re sp u e s ta in m u n ita ria m e d ia d a p o r cé lu las T es in fla m a c ió n cu tánea .
  11. 11. C o m b in a c ió n para su uso según la re iv in d ica c ió n 10, en la q ue la in fla m a c ió n cu tá n e a es p so ria s is o h ip e rse n s ib ilid a d de con tac to .
  12. 12. C o m b in a c ió n para su uso seg ún una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-11, en la q ue el g lu co co rtico id e es b u d e n o s id a y en la q ue la b u d e n o s id a se fo rm u la p ara a p lica c ió n tóp ica .
  13. 13. C o m b in a c ió n para su uso según la re iv in d ica c ió n 3, en la q ue la EII se se le cc io n a de co litis u lce ro sa y e n fe rm e d a d de C rohn .
  14. 14. K it q ue co m p re n d e un a n ticu e rp o a n ti-M IF en co m b in a c ió n con un g lu co co rtico id e , a m bo s seg ún la re iv in d ica c ió n 1, e in s tru cc io n e s de uso.
  15. 15. K it según la re iv in d ica c ió n 14, p a ra su uso en el tra ta m ie n to de in fla m ac ió n .
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