CN104470540B

CN104470540B - 抗-mif抗体和糖皮质激素的联合治疗

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Publication number: CN104470540B
Application number: CN201380028648.3A
Authority: CN
Inventors: R·克西堡曼; D·弗尔克尔; F·沙伊夫林格; H·埃尔利希
Original assignee: Hundred Deep Co; Hundred Deep LLC
Current assignee: Hundred deep company; Hundred deep limited liability company
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2033-04-16
Also published as: JP6236062B2; EP2838559A1; US20180280501A1; WO2013156472A1; AU2013203957B9; AU2015210447A1; CA2869987A1; MX2014012534A; NZ628454A; AU2013203957B2; JP2015514734A; AU2013203957A1; ES2779036T3; EP2838559B1; US20210187105A1; IL235037A0; AU2015210447B2; RU2014145694A; US20150250873A1; CL2014002789A1

Abstract

本发明涉及一种抗‑MIF抗体，特别是它们联合糖皮质激素用于对糖皮质激素接受性疾病的治疗。

Description

抗-MIF抗体和糖皮质激素的联合治疗

本发明涉及一种抗-MIF抗体，特别是它们联合糖皮质激素用于MIF相关疾病的治疗。

背景技术

巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种细胞因子，起初是基于它能够抑制腹膜渗出液细胞从对结核菌素高度敏感的豚鼠(包含巨噬细胞)中体外随机迁移的能力而被分离的(Bloom et al.Science 1966,153,80-2；David et al.PNAS 1966,56,72-7)。今天，已经知道MIF作为先天性和获得性免疫反应的一个关键的上游调控子，上述免疫反应具有广谱活性。

人类MIF cDNA在1989年得到克隆(Weiser et al.,PNAS 1989,86,7522-6)，其基因定位于22号染色体。人类MIF基因产品为具有114个氨基酸的蛋白质(N端蛋氨酸裂解后)，其表观分子量大约为12.5kDa。MIF没有与其他蛋白存在显著的序列同源性。该蛋白结晶成同一亚单位的三聚体。每个单体包含两个反向平行的α螺旋，所述α螺旋包裹(packagainst)四链β片。该单体还有其他两个β链，该β链和相邻亚单位的β片相互作用以在单体之间形成界面。三个亚单位排布成一个包含亲溶剂通道的管道，该管道可以沿着分子三重轴向穿过蛋白质中心(Sun et al.PNAS 1996,93,5191-5196)。

据报道，低浓度糖皮质激素可以诱导巨噬细胞分泌MIF(Calandra et al.Nature1995,377,68-71)。然而，MIF也会反方向调节糖皮质激素的作用，并刺激其他细胞因子的分泌，例如肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1β(Baugh et al.,Crit Care Med 2002,30,S27-35)。MIF同样表现出例如展示促血管生成、促增殖和抗凋亡的性质，因此能促进肿瘤细胞的生长(Mitchell,R.A.,Cellular Signalling,2004.16(1):p.13-19；Lue,H.et al.,Oncogene 2007.26(35):p.5046-59)。此外，例如它和淋巴瘤、黑素瘤和结肠癌的生长也有直接联系(Nishihira et al.J Interferon Cytokine Res.2000,20:751-62)。

MIF是多种病理情况的中介物，因此，与多种疾病都有关联，其包括但不限于炎症性肠病(IBD)、风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、血管球性肾炎、IgA肾病、心肌梗死(MI)、败血症和癌症。

多克隆和单克隆抗-MIF抗体已经用于抵抗重组人类MIF(Shimizu et al.,FEBSLett.1996；381,199-202；Kawaguchi et al,Leukoc.Biol.1986,39,223-232,和Weiser etal.,Cell.Immunol.1985,90,16778)。已经表明抗-MIF抗体具有治疗用途。Calandra etal.,(J.Inflamm.(1995)；47,39-51)报道了使用抗-MIF抗体保护动物免于实验上诱发的革兰氏阴性和革兰氏阳性感染性休克。这表明抗-MIF抗体可作为一种治疗手段来调控感染性休克和其他炎症疾病状态中的细胞因子产生。

US 6,645,493公开了一种源自杂交瘤细胞的单克隆抗-MIF抗体，其能够中和MIF的生物学活性。在动物模型中表明这些源自鼠的抗-MIF抗体在治疗内毒素诱发的休克中具有有益效果。

US 2003 10235584公开了一种在动物中制备对MIF具有高亲和性的抗体，所述动物中的MIF基因已经被纯合(homozygously)敲除。

糖基化抑制因子(GIF)是一种蛋白质，具体描述见Galat et al.(Eur.J.Biochem,1994,224,417-21)。MIF和GIF被认为是相同的。Watarai et al.(PNAS 2000,97,13251-6)描述了一种能够结合到不同的GIF表位的多克隆抗体以识别Ts细胞中的GIF翻译后修饰的生物化学特性。Watarai et al,supra报道称GIF在体外出现在不同的构象异构体中。该异构体的一个类型通过化学修饰单个半胱氨酸残基而产生。该化学修饰导致GIF蛋白内部的构象改变。

糖皮质激素，有时也被称为糖皮质类固醇，是一类可以与糖皮质激素受体结合的甾类激素，其存在于几乎所有的脊椎动物。糖皮质激素是免疫系统反馈机制的一部分，其能够减小免疫活动，即炎症。在医学方面，它们用于治疗因免疫过度引起的疾病，其代表性疾病的例子是过敏、哮喘、自身免疫病和败血症。它们也干扰癌细胞中的一些异常机制，所以也可以用于治疗癌症。在与糖皮质激素激素受体结合之后，活化的糖皮质激素受体复合物可以通过被称为反式激活的过程上调细胞核内抗炎蛋白的表达，并通过减弱基因诱导作用(通过NF-κB、AP1、jun-jun同源二聚体等)抑制细胞溶质中促炎蛋白的表达。理论上，糖皮质激素被定义为皮质类固醇的亚组。此外，已经知道一类具有糖皮质激素活性(SEGRA、选择性糖皮质激素受体激动剂)的新型化合物。这些化合物只展现了整个兴奋糖皮质激素的部分作用，即它们不能引起广谱的反式激活、反式抑制和对基因诱导的间接作用(通过NF-κB、AP1、jun-jun同源二聚体等)。通过对选择性雌激素受体调节剂(SERM’s＝它莫西芬、雷洛昔芬、托瑞米芬)用类推的方法，这些化合物也被称为选择性糖皮质激素调节剂(SERM’s)。SEGRA’s/SEGRM’s的例子包括Mapracorate(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK216348。

天然糖皮质激素的一个重要例子是皮质醇(或氢化可的松)，其为人体所必须并且调控或支持不同的重要的心血管、新陈代谢、免疫学和稳态功能。也有若干种合成的糖皮质激素是可以利用的。

糖皮质激素在三个主要领域起作用，即免疫学领域、代谢领域和胎儿发育领域。在免疫领域，它们上调抗炎蛋白的表达并下调促炎蛋白的表达。

代谢效应总结如下所示：

·刺激糖质新生，特别是肝脏中的糖质新生。该通路导致经由非己糖底物例如氨基酸合成葡萄糖，以及经由甘油三酸酯裂解合成甘油，该通路在食肉动物和某些食草动物中特别重要。增强涉及糖质新生的酶的表达可能是糖皮质激素最有名的代谢功能。

·氨基酸从肝外组织的调动：这些氨基酸作为糖质新生的底物。

·抑制肌肉和脂肪组织对葡萄糖的吸收：脂肪酸通过脂解作用释放并被用于在例如肌肉等的组织中生产能量，并且释放的甘油为糖质新生提供另一种底物。

在胎儿发育中，糖皮质激素促进肺的成熟和表面活性剂的生成，所述表面活性剂对于子宫外肺功能是必须的。进一步地，它们对于正常脑发育是关键物质。

已经研制多种合成的糖皮质激素用于治疗，有些比皮质醇更有效。它们的药代动力学(吸收、半衰期、分布容量和清除)和药效不同。

糖皮质激素效力、疗效时间和覆盖(overlapping)盐皮质激素效力不同。皮质醇(氢化可的松)是糖皮质激素效力的标准对照。氢化可的松是皮质醇作为药物制剂的名称。由于相当一部分含量(一些案例中高至50％)可能不能由肠吸收，口服效力可能比肠胃外(不经肠道的)效力低。

例子为：

氢化可的松、醋酸可的松、可的松/考的索、氟可龙(Fluorocortolon)、泼尼松、氢化泼尼松、甲基氢化泼尼松、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、倍他米松、帕拉米松。

此外，还有一些化合物：它们仅模仿糖皮质激素的一些作用而不是全部作用；这些化合物被称为SEGRAs(选择性糖皮质激素受体激动剂)。SEGRA’s/SEGRM’s的例子包括Mapracorate(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK216348。

主要用于局部施用(例如，喷雾-肺部、栓剂-结肠、乳霜-皮肤)的类固醇：氢化可的松、倍氯米松、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、莫美他松、环索奈德、氯倍他索。

令人惊异是，在啮齿动物中发现糖皮质激素可以诱导而非抑制巨噬细胞和T细胞MIF的产生(Calandra T,Bernhagen J,Metz CN et al.,(1995)MIF as aglucocorticoid-induced modulator of cytokine production.Nature 377:68-71；和Bacher M,Metz CN,Calandra T,et al.,(1996)An essential regulatory role formacrophage migration inhibitory factor in T-cell activation.PNAS 93:7849-7854)。

因为已知MIF具有促炎作用，这些结果起初看来是相互矛盾并难以调解的。然而随后发现MIF甚至撤销了糖皮质激素的抗炎免疫抑制作用。

虽然已经表明糖皮质激素对于治疗一些不同疾病和紊乱(如下所示)是有用的而且成功的，但是取决于用药类型，施用时可能导致一系列的副作用。大多数副作用包括如下所示：

·免疫抑制

·糖质新生的提高导致的高血糖症；胰岛素耐受性；和受损的葡萄糖耐受性(“类固醇糖尿病”)

·皮肤脆性增加；易挫伤

·因肠钙吸收降低导致的钙负平衡

·类固醇诱导的骨质疏松症；降低骨密度(骨质疏松症、骨坏死、高骨裂风险、骨裂愈合放缓)

·内脏和躯干脂肪沉积引起的体重增加(内向性肥胖)和食欲刺激

·肾上腺功能不全(使用较长时间后突然停止，而不是逐渐减少用量)

·肌肉分解(蛋白质水解)、虚弱；肌肉质量和修复功能下降

·颧骨脂肪垫扩张和皮肤中的小血管扩张

·停止排卵、月经周期不规律

·生长障碍、青春期延迟

·血浆氨基酸升高、尿素形成增加；氮负平衡

·中枢神经系统的兴奋作用(欣快、精神错乱)

·颅压升高引起的青光眼

·白内障

因长久使用、过度使用合成的或内源性糖皮质激素引起的临床问题的组合被称之为库兴氏综合征(Cushing's syndrome)。

除了上面列出的作用，由于外源性糖皮质激素抑制下丘脑的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和垂体的促肾上腺皮质激素(ACTH)，高剂量的类固醇用药超过一周后开始抑制病人肾上腺功能。随着抑制的延长，在停止外源性糖皮质激素给药后，肾上腺萎缩(生理收缩)需要数月才能完全恢复功能。

在恢复期间，该病人在受到压力时例如生病时，容易出现肾上腺功能不全。

最后(但并非最不重要)，随着时间的延长，接受糖皮质激素的病人也会形成糖皮质激素耐受。在这些病人中，即使使用高剂量的糖皮质激素也不足以引发足够的抗炎反应(Barnes PJ,Adcock IM.Glucocorticoid resistance in inflammatorydiseases.Lancet 2009May 30；373(9678):1905-1917)。

如果所述糖皮质激素药物的给药剂量增加，上述副作用还会更加严重。降低给药剂量通常也会降低或减轻副作用。因此，本领域迫切需要提供一种对MIF相关疾病和紊乱的治疗，该治疗可以减少给定糖皮质激素的给药剂量。

发明内容

通过本发明已经解决了该目标。

特别地，结果显示抗-MIF抗体和给定糖皮质激素联合治疗，可以检测到协同效应，其使得可以采用较低剂量的糖皮质激素治疗MIF相关疾病，和/或与单独使用糖皮质激素治疗该疾病相比，相似剂量可以取得更强的效应。

特别地，如上所述以及本发明实施例所列举的，抗-oxMIF抗体和给定糖皮质激素的联合治疗与协同效应是相关的。很多疾病尤其是在炎性疾病或癌症开始之后，就可以检测到评估的(evaluated)MIF水平，即MIF一般水平。然而，健康个体也存在MIF循环，这使得难以清楚地区分。相反地，oxMIF不存在于健康个体中。oxMIF在疾病状态下增加，并在病人样品例如血液、血清和尿液中可以检测的到。

在深入研究MIF和其抗体后发现，抗体RAB9、RAB4和RAB0能够和oxMIF特异性结合(而不能和redMIF结合)。抗体RAM9、RAM4和RAM0也可以观察到这种结合。

在发明人的早期试验中，可以看到氧化过程例如胱氨酸介导的氧化、GSSG(ox.谷胱甘肽)介导的氧化或MIF与Proclin300或蛋白质交联剂(例如BMOE)温育后可以使得MIF与上述抗体结合。

本发明人取得了下述令人惊异的结论：

·重组MIF(人类、小鼠、大鼠、CHO和猴子)的氧化还原调制(胱氨酸/GSSG介导的轻度氧化)或用Proclin300或蛋白质交联剂处理重组MIF可以导致重组MIF与Baxter抗-MIF抗体RAB9、RAB4和RAB0结合。

·oxMIF的还原导致抗体(Ab)结合的丧失。

·oxMIF亚型在体内与生物学Ab的效力相关的特异性。

·oxMIF水平和疾病状态相关。

关于(ox)MIF的其他知识可以用作本申请发明人进一步研究的基础。

本发明优选的实施例为：

1.抗-MIF抗体联合糖皮质激素用于糖皮质激素接受性疾病的治疗。

2.如项目1所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，其中所述糖皮质激素接受性疾病对采用糖皮质激素的治疗有反应。

3.如项目1或2所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，用于炎症、过敏、癌症或哮喘的治疗。

4.如项目1、2或3所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，其中所述抗体是抗-oxMIF抗体。

5.如项目1至4任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗-MIF抗体RAB9、RAB4、RAB0、RAM9、RAM4和/或RAM0。

6.如项目1至5任一项中所述的联合，其中，所述糖皮质激素选自由糖皮质激素受体激动剂构成的组，例如甲基氢化泼尼松、氢化泼尼松、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、帕拉米松、氟可龙(Fluorocortolone)、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、环索奈德、莫美他松、氯倍他松、可的松和氢化可的松，和抗炎SEGRA’s/SEGRM’s(例如，Mapracorate(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348)。

7.如项目1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4或RAB0或RAM9、RAM4或RAM0中的任意一种，优选抗体RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相关疾病是炎症，尤其是肾炎、更优选狼疮肾炎、肾小球性肾炎、IgA或IgM肾病、系统性血管炎(例如结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、紫癜)、抗-GBM肾炎和/或急进性肾小球肾炎(类型I、II、III或IV)，例如ANCA(抗中性粒细胞胞质抗体)肾炎)。

8.如项目1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4或RAB0，或RAM9、RAM4或RAM0中的任意一种，优选抗体RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关疾病是狼疮肾炎。

9.如项目1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0中的任意一种，优选RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关疾病是全身性红斑狼疮。

10.如项目1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0中的任意一种，优选RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关疾病是皮肤炎症。

11.如项目1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0中的任意一种，优选RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关疾病是T细胞介导的免疫反应。

12.如项目10或11所述的联合治疗，其中，所述T细胞介导的免疫反应是皮肤炎症，例如银屑病或接触性超敏反应。

13.如项目10至12任一项所述的联合治疗，其中，所述糖皮质激素是布地奈德，并且布地奈德配制为局部施用。

14.如项目1至5任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0中的任意一种，优选RAM9，所述糖皮质激素是布地奈德，所述MIF相关疾病是炎症性肠病(IBD)，其中所述IBD选自溃疡性结肠炎和克罗恩病。

15.如项目1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0中的任意一种，优选RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关疾病是多发性硬化。

16.一种试剂盒，其包含如上述项目1至15任一项中所述的联合以及使用说明。

17.如上述项目1至15任一项中所述的联合，或如项目16所述的试剂盒用于糖皮质激素接受性疾病的治疗，特别是用于炎症、过敏、哮喘或癌症的治疗。

上述抗体通过它们的序列以及保存在大肠杆菌(E.coli)(TG1菌株)中的质粒中进行表征和支持，所述质粒分别包含上述抗体RAB0、RAB4和RAB9，以及RAM0、RAM4和RAM9的各自轻链或重链中的一种。

上述质粒用它们的DSM编号表征，DSM是根据布达佩斯条约在德国的微生物保藏和细胞培养(DSMZ)(位于德国，布伦瑞克，Mascheroder Weg 1b)保存时得到的官方号码。这些质粒分别保存在大肠杆菌(E.coli)菌株中。

编号为DSM25110的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的轻链序列。

编号为DSM25112的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的重链(IgG4)序列。

质粒DSM25110和DSM25112在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF抗体RAB4的生成。

编号为DSM25111的质粒包含抗-MIF抗体RAB9的轻链序列。

编号为DSM25113的质粒包含抗-MIF抗体RAB9的重链(IgG4)序列。

质粒DSM25111和DSM25113在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF抗体RAB9的生成。

编号为DSM25114的质粒包含抗-MIF抗体RAB0的轻链序列。

编号为DSM25115的质粒包含抗-MIF抗体RAB0的重链(IgG4)序列。

质粒DSM25114和DSM25115在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF抗体RAB0的生成。

同样地，分别包含RAM0、RAM9和RAM4的轻链和重链序列的其他质粒已经根据布达佩斯条约于2012年4月12日保存在DSMZ(德国，布伦瑞克)。使用以下命名：

RAM9–重链:E.coli GA.662-01.pRAM9hc–DSM 25860。

RAM4–轻链:E.coli GA.906-04.pRAM4lc–DSM 25861。

RAM9–轻链:E.coli GA.661-01.pRAM9lc–DSM 25859。

RAM4–重链:E.coli GA.657-02.pRAM4hc–DSM 25862。

RAM0–轻链:E.coli GA.906-01.pRAM0lc–DSM 25863。

RAM0–重链:E.coli GA.784-01.pRAM0hc–DSM 25864。

术语“预防性”或“治疗性”治疗在本领域是熟知的，其是指对病人进行给药。如果是在有不希望的状态的临床表现(例如，个体的疾病或其他不希望的状态)之前给药，那么该治疗就是预防性的，即它保护个体免于形成不希望的状态，而如果是在不希望的状态表现之后给药，那么该治疗就是治疗性的(即其是为了从中减小、减轻或维持现存的不希望的状态或其副作用)。

此处，抗-(ox)MIF化合物是指能够减弱、抑制、对抗、抵消或降低(ox)MIF生物学活性的任意试剂。抗-(ox)MIF的化合物可为能够抑制或中和(ox)MIF活性的试剂，例如抗体、特别优选此处所述的抗体，更优选抗体RAB9、RAB4和/或RAB0或RAM9、RAM4或RAM0。

根据本发明，优选的MIF拮抗剂是抗-MIF抗体。更优选的抗-MIF抗体是针对oxMIF的抗体。在其他实施例中，所述抗-oxMIF抗体，例如上述抗体或结合oxMIF的抗原结合部分，其K_D小于100nM，优选K_D小于50nM，更优选K_D小于10nM。

本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含抗-MIF抗体或其抗原结合部分以及本发明所述的糖皮质激素。除了抗体和糖皮质激素，试剂盒还进一步包含治疗剂及其用途。试剂盒也可包含在治疗方法中的使用说明。

早期结果表明，在动物模型中，抗-MIF抗体只能结合oxMIF而不能结合redMIF，并能够抑制GCO和/或细胞增殖，从而带来有益效果。

发明详述

本发明内容通过所附附图进行进一步描述。

附图说明

图1：实施例1a中进行的地塞米松的剂量探索治疗示意图。

图2：几个不同剂量的地塞米松给药后第8天的蛋白尿。

图3：几个不同剂量的地塞米松给药后的巨噬细胞浸润。测定每个肾小球横截面的巨噬细胞(ED1阳性细胞)的数量。显示每只动物的结果以及每组动物的平均值。

图4：几个不同剂量的地塞米松给药后的肾小球新月体。显示测得的每只动物中肾小球新月体的百分比和每组动物中肾小球新月体比例的平均值。

图5：根据实施例1b所述的甘氨酸配方中的抗-MIF抗体RAM9的剂量探索示意图。

图6：两种剂量的抗体RAM9给药后第8天的蛋白尿。

图7：两种剂量的抗体RAM9给药后的巨噬细胞浸润。测定每个肾小球横截面的巨噬细胞(ED1阳性细胞)的数量。显示每只动物的结果以及每组动物的平均值。

图8：两种剂量的抗体RAM9给药后的肾小球新月体的形成。显示测得的每只动物中肾小球新月体的百分比和每组动物中肾小球新月体比例的平均值。

图9：根据实施例1c所述的地塞米松联合抗体RAM9的治疗日程示意图。

图10：抗体RAM9(剂量范围：0-120mg/kg)联合地塞米松(0.025mg/kg)治疗后蛋白尿的降低。提供了两组独立实验的平均值。箭头表示使用不同剂量的地塞米松而不使用抗体时蛋白尿降低的百分比。

图11：抗体RAM9(剂量范围：0-120mg/kg)联合地塞米松(0.025mg/kg)治疗后观察到的巨噬细胞浸润的降低。提供了两组独立实验的平均值。箭头表示使用不同剂量地塞米松而不使用抗体时巨噬细胞浸润降低的百分比。

图12：抗体RAM9(剂量范围：0-120mg/kg)联合地塞米松(0.025mg/kg)治疗后新月体形成的下降。提供了两组独立实验的平均值。箭头表示使用不同剂量地塞米松而不使用抗体时新月体形成降低的百分比。

图13：针对DNFB的接触性超敏反应(CHS)。与单独使用RAM9而没有使用氢化可的松(-HC)治疗小鼠相比，抗-MIF(RAM9)联合氢化可的松(+HC)治疗小鼠的被刺激的耳朵后CHS反应减弱。使用同型对照抗体治疗小鼠(不施用/局部施用氢化可的松)作为阴性对照。每组使用八只小鼠，通过测量右耳(被刺激的)和左耳(未被刺激的)的耳朵厚度的差值而将耳朵接触性皮炎的降低进行量化。

定义和基本技术

除非此处另有定义，本发明所使用科学和技术术语的含义为本领域普通技术人员通常所理解的含义。一般而言，与此处所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因和蛋白质以及核苷酸化学相关的所用术语和技术是本领域众所周知的且通用的。除非特别指出，本发明的方法和技术一般按照本领域已知的传统方法和本说明书中所引用和讨论的各种综述和更特定的文献中所描述的方法进行。见例如，Sambrook等，分子克隆：实验手册第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)和Ausubel等，当代分子生物学操作手册，格林出版联合社(1992)以及Harlow和Lane抗体:实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1990)，通过引用其被包括在此处。

“MIF”或“巨噬细胞移动抑制因子”是指一种蛋白质，已知其在免疫反应和炎症反应中是一种关键的调节子，并且其是糖皮质激素的抗调控子。MIF包括哺乳动物MIF，特别是人MIF(Swiss-Prot原始登记号：P14174)，其中单体形式编码为含115个氨基酸的蛋白质，但由于在起始蛋氨酸处裂解，最终形成含114个氨基酸的蛋白质。“MIF”也包括“GIF”(糖基化抑制因子)和其他形式的MIF，例如MIF的融合蛋白。MIF的氨基酸编号起始于N端的蛋氨酸(氨基酸1号)，结束于C端的丙氨酸(氨基酸115号)。

根据本发明的目的，“氧化的MIF”或oxMIF定义为MIF的异构体，其通过采用温和氧化剂例如胱氨酸处理MIF得到。如之前本申请所示，用该方式处理的重组oxMIF包括MIF的异构体，该异构体和oxMIF共享结构的重排，oxMIF(例如)在动物感染细菌之后在体内产生。

根据本发明的目的，redMIF被定义为还原的MIF，其为不和RAB0、RAB9和/或RAB4结合的MIF。

本发明所述的抗-oxMIF抗体能够区分oxMIF和redMIF，所述oxMIF和redMIF分别通过温和氧化或还原得到。抗-oxMIF抗体对于特异性地检测oxMIF是有用的。这些构象异构体之间的区别可通过ELISA或表面等离子体共振进行评估。这两种技术的操作对于本领域技术人员是已知的，并可以采用下述方法进行操作。

用Biacore评估抗体的差异结合

使用Biacore 3000系统，通过表面等离子体共振分析检测oxMIF和redMIF与抗体RAB9和RAB0的结合动力学。所述抗体涂覆于CM5(＝甲基葡聚糖)芯片，并且注射与0.2％的Proclin300预先温育的重组MIF蛋白。(Proclin300由稳定oxMIF结构的氧化异噻唑酮构成)。在不添加Proclin300的天然HBS-EP缓冲液(＝Biacore电泳缓冲液)中，不能与RAB9、RAB0或相关抗体(不相关的同型对照抗体)的重组MIF蛋白用作阴性(背景)结合对照。

在一个优选的实施例中，oxMIF是与抗体RAB9、RAB4和/或RAB0或者是其抗原-结合片段差异性结合的MIF，意味着这些抗体能与oxMIF结合，而redMIF不与这些抗体中的任何一个结合。

在其他实施例中，抗-oxMIF抗体，例如，上述抗体或其结合oxMIF的抗原结合部分的K_D值低于100nM，优选K_D值低于50nM，更优选K_D值低于10nM。在一个特别优选的实施例中，结合oxMIF的抗体的K_D值低于5nM。

抗体例如RAB9、RAB4或RAB0能否结合(例如oxMIF或redMIF)可以根据本领域技术人员已知的方法确定，举例而言可以是下述方法中的任何一个：使用还原态或氧化态的重组MIF的ELISA，或使用还原态或氧化态的重组MIF的表面等离子体共振，例如上述已知的Biacore实验。

用于确定抗体与例如rec.(ox)MIF结合的一个优选的方法是表面等离子体共振，其中“结合”意味着K_D值低于100nM，优选低于50nM，甚至更优选低于10nM，其中未结合redMIF表征为K_D值高于400nM。“结合”和“特异性结合”在本文可交换使用，定义如上所述。“差异性结合”在本申请上下文中是指一种化合物，特别是本文所述的抗体，其能够结合oxMIF(例如，其K_D值如上所述)，而不能结合redMIF(如上所述未结合)。

“抗体”是指完整的抗体或能够与用于(特异性)结合的完整抗体相竞争的抗原结合部分。一般参见免疫基础，第7章(Paul,W.,ed.,第2章.Raven Press,纽约(1989))(通过引用包含在本文)。术语抗体包括但不限于人类抗体、哺乳动物抗体、分离的抗体和基因工程形式的抗体例如嵌合体、骆驼化或人源化抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体的一个或一个以上保留特异性结合抗原(例如(ox)MIF)能力的片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术制备，也可以通过酶或化学裂解完整抗体而制备。抗原结合部分包括但不限于例如下述：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和互补性决定区域(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、抗体和包含至少抗体的一部分的多肽，其中，所述抗体足以使得特异性抗原结合到多肽，即ox或redMIF。从N端到C端，成熟轻链和重链的可变区包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区域。每个区域中氨基酸的排列与下述文献的定义保持一致：Kabat，Sequences of Protein of immunological interest《具有免疫性兴趣的蛋白序列》(国家卫生研究院，贝塞斯达，Md.(1987和1991))；Chothia etal.J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，或Chothia et al.,Nature 342:878-883(1989)。抗体或其抗原结合部分可以衍生或连接到另一个功能分子(例如另外一种肽或蛋白质)。例如，能够功能性地连接到一个或一个以上其他分子实体的抗体或其抗原结合部分，例如另一种抗体(例如双特异性抗体或双链抗体(diabody))、可检测试剂、细胞毒性试剂、药物试剂、和/或连接分子。

根据本领域技术人员的通常知识，术语“K_D”此处是指特定抗体相对于各自抗原的平衡解离常数。该平衡解离常数可以测量亲和力。亲和力决定了在平衡态(结合和解离保持平衡的稳定状态)形成了多少复合物(此处：ox或redMIF和抗体)。

ka＝结合速度常数[M^-1 s^-1]

kd＝解离速度常数[s^-1]

K_D＝平衡解离常数＝kd/ka[M]

术语“人类抗体”是指可变区和恒定区是人类序列的任何抗体。该术语包括带有源自人类基因但却被改变过的序列的抗体，所述改变例如为降低可能的免疫原性、增加亲和力、去除可能引起不良折叠的半胱氨酸等。该术语包含了在非人类细胞重组制备的抗体，其能够如给予人类细胞非典型的糖基化。

术语“人源化抗体”是指包含人类序列并包含非人类序列的抗体；特别地，“人源化抗体”是指非人类抗体，其中添加了人类序列和/或人类序列替换非人类序列。

术语“骆驼化抗体”是指一种抗体，其中所述抗体结构或序列已经发生改变，其和源自骆驼的抗体更加相似，也被命名为骆驼抗体。设计和制备骆驼化抗体的方法是本领域技术人员所熟知的基本知识的一部分。

术语“嵌合抗体”是指包含来自两种或两种以上不同物种的区域的抗体。

术语“分离的抗体”或“其分离的抗原结合部分”是指从抗体源例如噬菌体展示库或B细胞谱中被识别和挑选的一种抗体或其抗原结合部分。

根据本发明所述的抗-(ox)MIF抗体的制备包含采用基因工程生成重组DNA的任何方法，例如通过反向转录RNA和/或扩增DNA和将其克隆到表达载体。在一些实施例中，所述载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可连接到病毒基因组。在一些实施例中，所述载体能够在被引入的宿主细胞中自我复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)。在其他实施例中，所述载体(例如非-游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时可以整合到宿主细胞的基因组中，从而可以和宿主基因组一起复制。此外，特定的载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体此处被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。

抗-(ox)MIF抗体尤其可以通过传统表达载体制备，例如细菌载体(例如pBR322和它的衍生物)或真核载体。编码抗体的那些序列能与调控复制、表达和/或从宿主细胞分泌的调控序列一起被提供。这些调控序列包括例如启动子(例如CMV或SV40)和信号序列。表达载体也包含选择和扩增标志物，例如二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶和胸苷激酶。所用载体的成分例如选择标记物、复制子、增强子可以通过商购获得或通过传统方法制备。该载体可以被构建以在不同细胞培养基中表达，例如哺乳动物细胞例如CHO、COS、HEK293、NSO、纤维组织母细胞、昆虫细胞、酵母或细菌例如大肠杆菌(E.coli)。在一些例子中，所用的细胞可以获得表达蛋白的最佳糖基化。

所述抗-(ox)MIF抗体的轻链基因和抗-(ox)MIF抗体的重链基因可以插入到不同的载体或插入到同一个表达载体中。所述抗体基因通过标准方法插入到表达载体中，例如通过抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接、或如果没有限制性位点则通过平末端连接。

抗-(ox)MIF或其抗原结合片段的制备包括本领域已知的通过转染将重组DNA导入到真核细胞的任何方法，例如通过电穿孔或微注射。例如，可以通过下述方法实现抗-(ox)MIF抗体的重组表达：将包含编码抗-(ox)MIF抗体的DNA序列的表达质粒通过适当的转染方法转入适当的宿主细胞株，所述序列受一种或多种调控序列例如强启动子的控制，从而得到所转入的序列已经稳定整合到基因组的细胞。该脂质转染方法只是根据本发明可能使用到的方法的一个举例。

抗-(ox)MIF抗体的制备也可包含本领域已知的用于培养所述转化细胞的任何方法，例如连续或分批培养，以及抗-(ox)MIF抗体的表达，例如组成性或诱导性表达。特别是进一步参考在WO 2009/086920中提及的抗-(ox)MIF抗体的制备。在一个优选的实施例中，根据本发明制备的抗-(ox)MIF抗体可以结合oxMIF或其表位。根据本发明，特别优选的抗体是抗体RAB9、RAB4和/或RAB0。或者优选的抗体是RAM9、RAM4和/或RAM0。

这些抗体的序列已在WO 2009/086920中被公开，本申请的其他序列如下所示：

RAB9轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:1：

RAB4轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:2：

RAB0轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:3：

RAB2轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:4：

RAB9重链的氨基酸序列SEQ ID NO:5：

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGTTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQ WLYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK；

RAB4重链的氨基酸序列SEQ ID NO:6：

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK；

RAB0重链的氨基酸序列SEQ ID NO:7：

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTKYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK；

RAB2重链的氨基酸序列SEQ ID NO:8：

VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLGK；

RAM0hc的氨基酸序列SEQ ID NO:9：

ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS

GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN

RAM0lc的氨基酸序列SEQ ID NO: 10：

RAM9hc的氨基酸序列SEQ ID NO: 11：

SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK；

RAM9lc的氨基酸序列SEQ ID NO: 12：

RAM4hc的氨基酸序列SEQ ID NO:13：

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK

RAM4lc的氨基酸序列SEQ ID NO:14：

本发明的抗-MIF抗体优选分离的单克隆抗体。该抗-MIF抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在其他实施例中，该抗-MIF抗体是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类。在其他实施例中，该抗体是IgG1或IgG4亚类。在其他实施例中，该抗体是IgG4亚类。在一些实施例中，该IgG4抗体带有一个单独突变，其将丝氨酸(丝氨酸228)改变成脯氨酸。相应地，IgG4的Fc区域中的子序列CPSC变为CPPC，CPPC是IgG1的子序列(Angal et al.Mollmmunol.1993,30,105-108)。

此外，抗-(ox)MIF抗体的制备可包含本领域已知的用于纯化抗体的任何方法，例如通过阴离子交换色谱或亲和色谱。在一个实施例中，抗-(ox)MIF抗体可以通过体积排阻色谱纯化。

术语MIF的“中心区域”和“C端区域”分别是指包含人类MIF氨基酸第35-68位和氨基酸第86-115位的区域，优选分别包含人类MIF氨基酸第50-68位和氨基酸第86-102位的区域。本发明的特别优选的抗体能够结合人类MIF氨基酸第50-68位或第86-102位的区域。这同样被能与优选的下述抗体结合的表位所反应，例如RAB0、RAB4、RAB2和RAB9，以及RAM4、RAM0和RAM9，它们的结合如下所示：

RAB4和RAM4：aa 86-102

RAB9和RAM9：aa 50-68

RAB0和RAM0：aa 86-102

RAB2：aa 86-102

因此，RAM4和RAB4，如同RAM9和RAB9具有相同的特异性。RAM0和RAB0也是如此。这同样在实施例中也可以得到反应，在这些实施例体现出使用这些抗体可以得到类似的结果。

术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或抗体片段的任何蛋白决定簇。抗原决定簇一般由化学性质活跃的表面分子基团例如暴露的氨基酸、氨基糖或其他碳水化合物侧链构成，一般具有特异的三维结构特点以及特异的电荷特征。

术语“载体”是指一种核苷酸分子，其能够将其他的核苷酸运输至与其被连接处。在一些实施例中，所述载体是质粒，即连接有额外DNA片段的圆形双链DNA环。

术语“宿主细胞”是指一种细胞系，其在引入表达载体后可以制备重组蛋白。术语“重组细胞系”是指已经引入重组表达载体的细胞系。应该理解的是，“重组细胞系”不仅指特定个体细胞系，也指该细胞系的后代。由于突变或者环境影响，后代可能发生特定修饰，其后代虽然事实上可能和母细胞不一致，但是仍然属于此处所述的术语“重组细胞系”的范围之内。

根据本发明的宿主细胞类型是例如COS细胞、CHO细胞或例如HEK293细胞或其他本领域技术人员已知的任何宿主细胞，也包括例如细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)细胞。在一个实施例中，该抗-MIF抗体在DHFR-缺乏的CHO细胞系例如DXB11中表达，其中添加G418作为选择标志物。当编码抗体基因的重组表达载体被引入到CHO宿主细胞时，通过培养宿主细胞至足够的时间使得抗体在宿主细胞表达或者抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中，从而制备抗体。

抗-(ox)MIF抗体可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收。

本发明提供的联合治疗的第二个活性成分是糖皮质激素。

糖皮质激素，有时也被称为糖皮质类固醇，是一类可以与糖皮质激素受体(糖皮质激素受体α)结合的甾类激素，其几乎存在于所有的脊椎动物。糖皮质激素是免疫系统反馈机制的一部分，其能够减小免疫活动，即减少炎症。在医学方面，它们用于治疗因免疫过度引起的疾病，其代表性疾病的例子是过敏、哮喘、自身免疫病和败血症。它们也干扰癌细胞中的一些异常机制，所以可以用于治疗癌症。在与糖皮质激素激素受体结合之后，活化的糖皮质激素受体复合物可以通过被称为反式激活的过程上调细胞核内抗炎蛋白的表达，并抑制细胞溶质中促炎蛋白的表达。理论上，糖皮质激素被定义为皮质类固醇的亚组。此外，已经知道一类具有糖皮质激素活性(SEGRA，选择性糖皮质激素受体激动剂)的新型化合物。

这些化合物只展现了完全兴奋糖皮质激素的部分作用，即它们不能引起广谱的反式激活、反式抑制和对基因诱导的间接作用(通过NF-κB、AP1、jun-jun同源二聚体等)。通过对选择性雌激素受体调节剂(SERM′s＝它莫西芬、雷洛昔芬、托瑞米芬)用类推的方法，这些化合物也被称为选择性糖皮质激素受体调节剂(SERM′s)。SEGRA′s/SEGRM′s的例子包括Mapracorate(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK216348。

所有这些化合物已经在本领域中被公开，其对于本领域技术人员而言是已知的。特别参考综述文献De Bosscher et al,2010,Curr Opin Pharmacol 10:497-504。如文献Vayssière et al,1997,Mol Endocrinol 11:1245-1255公开了RU 24856、RU 40066和RU24782。它们的化学结构式分别如下所示：

Proksch et al,2011,Drug Metab Dispos 39:1181-1187和et al.,2009,Br J Pharmacol,158(4):1088-103公开了ZK245186。其化学式为：(R)-1,1,1-三氟-4-(5-氟-2,3-苯并二氢呋喃-7-基)-4-甲基-2-{[(2-甲基-5-喹啉基)氨基]甲基}-2-戊醇。根据et al.,2004,PNAS USA 101:227-232可知ZK 216348，其具备下述化学结构式：

Rauner et al,2011,Endocrinology 152:103-112和De Bosscher K,VandenBerghe W,Beck IM,Van Molle W,Hennuyer N,Hapgood J,Libert C,Staels B,Louw A,Haegeman G,2005公开了化合物A，其为用于抑制炎性基因的从植物中完全分离的化合物。Proc Natl Acad Sci USA 102:15827–15832。化合物A的化学式为：2-(4-乙酸苯酚酯)-2-氯-N-甲基-盐酸乙胺。

糖皮质激素的一个重要例子是皮质醇(或氢化可的松)，其为人体所必须并且调控或支持多种重要的心血管、新陈代谢、免疫学和稳态功能。也有若干种合成的糖皮质激素是可以利用的。

糖皮质激素在三个主要领域起作用，即免疫学领域、代谢领域和胎儿发育领域。在免疫领域，它们上调抗炎蛋白的表达并下调促炎蛋白的表达。代谢效应总结如下所示：

已经研制了多种合成的糖皮质激素用于治疗，有些比皮质醇更有效。它们的药代动力学(吸收因数、半衰期、分布容量和清除)和药效不同。在本发明中，“糖皮质激素”是指能够以糖皮质激素受体α起作用的所有糖皮质激素。特别地，其包含“经典的”糖皮质激素受体激动剂和上述SEGRAs。在一个优选的实施方式中，包含通过NF-κB通路和/或AP-1通路起作用的所有糖皮质激素。在一个进一步优选的实施例中，本发明的糖皮质激素为所有(“经典的”)糖皮质激素。

虽然不太可能，理论上讲在未来的某个时间点，糖皮质激素仅通过如反式激活或反式抑制起作用，而不通过NF-κB通路起作用。在一个优选的实施例中，本发明不包含这些化合物。

NF-κB是活性B细胞的核因子κ轻链增强子。它是一种特异性转录因子，几乎存在于所有类型的细胞和组织。通过结合到DNA的特定调控区域，它可以影响靶基因的转录，所述靶基因为例如抗凋亡基因、半胱天冬酶家族基因，特别是环氧酶-2(Cox-2)、IL6和TNF-α。糖皮质激素的效力、作用时间和覆盖(overlapping)盐皮质激素是不同的。皮质醇(氢化可的松)是糖皮质激素效力的标准对照。氢化可的松是皮质醇用作药物制剂的名称。由于相当一部分含量(一些案例中高至50％)可能不能由肠吸收，口服效力可能比肠胃外(不经肠道的)效力低。

本发明优选的糖皮质激素的例子为：

氢化可的松、醋酸可的松、可的松/考的索、氟可龙(Fluorocortolon)、强的松、氢化泼尼松、甲基氢化泼尼松(特别用于全身给药)、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、倍他米松、帕拉米松、布地奈德(特别用于局部给药)、SEGRAs(选择性糖皮质激素受体激动剂)。

此外，还有一些化合物，它们只能模拟糖皮质激素的部分功能而非全部功能；这些化合物被称为SEGRAs(选择性糖皮质激素受体激动剂)。SEGRA’s/SEGRM’s的例子包括Mapracorate(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066和ZK216348。SEGRAs一般通过NF-κB通路起作用。

主要用于局部施用的类固醇(例如喷雾-肺部、栓剂-结肠、乳霜-皮肤)：氢化可的松、倍氯米松、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、莫美他松、环索奈德、氯倍他索，最优选布地奈德。

在一个进一步优选的实施例中，所述糖皮质激素选自由氢化可的松、醋酸可的松、布地奈德、氟氢可的松、地塞米松、氢化泼尼松和/或甲基氢化泼尼松构成的组。特别优选的是(甲基)氢化泼尼松、氢化可的松和地塞米松，更优选用于全身给药的(甲基)氢化泼尼松。在本发明的一个实施例中，优选氢化可的松用于局部给药。在一个进一步优选的实施例中，优选布地奈德用于局部给药。

糖皮质激素的盐类、脂类和/或同分异构物都在本发明的保护范围之内，应该理解它们都在“糖皮质激素”的概念范围之内。它们都是已知的或可以通过已知的方法制备。

令人惊异是，在啮齿类动物中发现糖皮质激素可以诱导而非抑制巨噬细胞和T细胞MIF的产生(Calandra T,Bernhagen J,Metz CN et al.,(1995)MIF as aglucocorticoid-induced modulator of cytokine production.Nature 377:68-71；和Bacher M,Metz CN,Calandra T,et al.,(1996)An essential regulatory role formacrophage migration inhibitory factor in T-cell activation.PNAS 93:7849-7854)。

由于已知MIF具有促炎作用，这些结果起初看来是相互矛盾并难以调解的。然而随后发现MIF甚至撤销了糖皮质激素的抗炎免疫抑制作用。

本领域技术人员已知的任意给定糖皮质激素都可以用于本发明，包括上述代表性糖皮质激素。进一步地，本领域已知如何合成糖皮质激素。

已经表明，糖皮质激素在一些疾病的减轻或治疗方面都是成功的。然而，大多数糖皮质激素都和一系列副作用有关，例如如上所述，在个别例子中达到了抵消治疗(作用)的程度。在任意例子中，所述副作用对病人的生理和精神健康都产生了进一步的负担，因此，这应该尽可能的避免。

与糖皮质激素作为单一活性成分给药的情况相比，在本发明中糖皮质激素通过联合抗-MIF抗体能降低糖皮质激素的剂量，该联合在特定治疗中是必要的。本发明的另一个可能是，与单独给药糖皮质激素相比，同样剂量的糖皮质激素在病人体内产生更强的治疗反应。

本发明的发明人惊异地发现糖皮质激素联合抗-MIF抗体产生的效应可以允许清晰的糖皮质激素剂量下降，并能维持同样的治疗反应。

本领域技术人员可以很容易地测定治疗反应，所述治疗反应是指对给定病情的减少或改善或减轻。测定治疗反应的实验是已知的，例如测定患病个体存活的可能性或存活时间，或者是患有相同疾病的其他个体的存活可能性或存活时间，可以通过测定一个或相同病人随着时间症状的变化。

例如一个适当的实验是红细胞沉降实验，其他实验可以是本申请实施例中所述的实验。根据本发明，优选的糖皮质激素是醋酸可的松、氢化可的松、氟氢可的松、地塞米松、布地奈德、氢化泼尼松、和/或甲基氢化泼尼松。特别优选的是甲基氢化泼尼松、氢化可的松、布地奈德和地塞米松。更特别优选的是：全身给药的(甲基)氢化泼尼松和地塞米松；局部给药的布地奈德。

特别优选的组合是：

RAM9联合地塞米松

RAM9联合布地奈德

RAM9联合氢化可的松

RAM9联合氢化泼尼松或甲基氢化泼尼松

RAM0联合地塞米松

RAM4联合地塞米松

RAM0联合布地奈德

RAM4联合布地奈德

RAM0联合氢化泼尼松或甲基氢化泼尼松

RAM4联合氢化泼尼松或甲基氢化泼尼松

RAM4联合氢化可的松

RAM0联合氢化可的松。

在一个特别优选的实施例中，氢化可的松和布地奈德用于局部施用。

已经明确地指出，在本发明包含已知的可用于治疗特定疾病状态的所有适合的糖皮质激素。因此，在最优选的实施例中，本发明所述的糖皮质激素是用于治疗给定疾病的各自黄金标准糖皮质激素。

优选使用上述优选的组合用于下文所述的糖皮质激素接受性疾病。

本发明所述的联合治疗特别适合治疗糖皮质激素接受性疾病。

在本申请中的“糖皮质激素接受性疾病”是指对糖皮质激素治疗有反应的疾病。已知对糖皮质激素治疗有反应的疾病如下所示。一旦遇到他或她考虑采用糖皮质激素治疗的疾病状态，本领域技术人员会想到本发明所述的联合治疗。

已知炎症疾病和特定的癌症类型是糖皮质激素接受性疾病。这两种疾病都存在标准的糖皮质激素治疗。本发明的目的之一是联合抗-MIF治疗与这些标准的糖皮质激素治疗。在一些情况下，如果因为副作用有必要，可以降低标准的糖皮质激素剂量。

在一个优选的实施例中，所述糖皮质激素接受性疾病是在红细胞沉淀实验中可以观察到沉淀值的显著提高的疾病。显著提高是指本领域技术人员认为其提高是显著。

能够采用本发明所述的联合治疗来治疗的特别优选的疾病是：

炎症疾病、更优选通过适应性免疫系统(即通过B细胞和T细胞)起作用的炎症疾病。

更优选的是，所述糖皮质激素接受性疾病是变应性疾病，更优选自身免疫性疾病。

已知所有这些疾病是对糖皮质激素治疗有反应的疾病。

本发明特别优选的疾病是：

-肾炎、特别是肾小球性肾炎、急进性肾小球肾炎(I、II、III或IV型)、系统性血管炎(例如结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、紫癜、急性增殖性肾小球肾炎)

-狼疮性肾炎、ANCA肾炎、抗-GBM肾炎(例如Goodpasture综合征)、IgA肾病、IgM肾病

-红斑狼疮

-T细胞介导的免疫反应，例如皮肤炎症、例如银屑病或接触性超敏反应

-IBD，例如溃疡性结肠炎和MorbusCrohn病

-多发性硬化症

-风湿性关节炎

-眼色素层炎

-2型糖尿病

-支气管性气喘

-接触性皮炎

-银屑病

-过敏性皮肤炎

-胰腺炎

-天疱疮

-干燥综合征(病)

-白塞病

-Horton’s综合征

-硬皮病

-多肌炎。

在下述例子中已经表明了糖皮质激素接受性疾病的协同效应。所选的模型是特别适合的，因为其展现的抗原-抗体反应的效应对于上述所有疾病理论上都是一样的。

本申请可能的剂型设想成片剂、胶囊、袋剂或丸剂。颗粒剂作为优选的剂型，可以装入胶囊或袋或者可以进一步压缩成片剂或丸剂。

本发明还包括的剂型是饮品或糖浆、酏剂(elixirs)、药酒、悬浮液、溶液、水凝胶、膜剂、锭剂、口香糖、口腔崩解片、漱口水、牙膏、润唇膏、含药洗发水、纳米球悬浮液和微球体片剂和气溶胶、吸入剂、喷雾、烟或加热用粉末形式和局部应用的剂型例如霜、凝胶、搽剂或软膏、洗剂、药膏、滴耳液、滴眼液和皮肤贴布。

进一步包含栓剂，其可被用于例如直肠给药或阴道给药。所有这些剂型对于本领域技术人员都是已知的。

根据本发明，优选的剂型是口服药例如颗粒剂、包膜颗粒、片剂、肠溶衣片、药丸、栓剂和乳剂。更优选的是颗粒剂和片剂。其他优选的剂型是肠胃外或局部用药剂型。抗MIF抗体特别优选的给药途径是皮下或静脉给药。糖皮质激素优选的给药途径是口服给药(例如颗粒剂、液体、袋剂或片剂)。糖皮质激素进一步优选的给药方式是局部用药，其中所述局部用药包含涂覆到皮肤和/或喷雾，例如鼻腔喷雾或吸入剂。糖皮质激素进一步优选的给药方式是静脉注射。

市场上作为抗炎药的一些糖皮质激素经常呈局部施用配方，例如针对鼻炎的鼻用喷雾或针对哮喘的吸入剂。这些制剂的优点在于仅影响目标区域，因而可以降低副作用或潜在的相互作用。代表性化合物为倍氯米松、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、氯倍他松、莫美他松和环索奈德。针对哮喘，糖皮质激素通过剂量器或干粉吸入器以吸入剂方式给药。因此，这种剂型也是本发明优选的实施例。

可以通过已知的方式给药。

术语“联合”或“联合治疗”在此处交换使用。它们是指一种给药方案，其中抗-MIF抗体和糖皮质激素同时或先后给药或顺序相反。所述给药方案一般为糖皮质激素每日给药，而抗-MIF抗体每两周给药。优选的给药方案为：

如上所述，抗-MIF抗体可以和糖皮质激素同时或先后给药。“同时”在上下文中是指给药抗-MIF抗体和给药糖皮质激素的时间间隔不超过10分钟。“先后”是指给药抗-MIF抗体和给药糖皮质激素的时间间隔在10分钟以上。因此，时间间隔可以是10分钟以上、30分钟以上、1小时以上、3小时以上、6小时以上或12小时以上。

抗-MIF抗体和类固醇的剂型是主要以能够确保两种化合物在体内存在的时间相同(特定时间段)的剂型。抗-MIF抗体的半衰期一般为2-4周，类固醇的半衰期为6-24小时。

因此，上述联合治疗明确地包含了连续给药方案，其中在该方案中本领域技术人员会分别考虑糖皮质激素和抗体已知的半衰期问题。鉴于抗体的半衰期一般为2-4周，考虑所用抗体的给药时间仅为每2周一次、每3周一次或一个月一次。在一个典型实施例中，本发明所述的联合抗体给药的糖皮质激素的半衰期是6-24小时；因此，糖皮质激素的给药时间在代表性实施例中是每隔5小时一次、每隔6小时一次、一天三次、一天两次、一天一次。

表1：地塞米松剂量-比较大鼠/小鼠/人

类固醇领域的技术人员熟知的“rule of five”可以用于计算不同糖皮质激素的给药方案，方法如下：1mg地塞米松相当于大约5mg氢化泼尼松，反过来相当于大约25mg可的松。

一般在需要尽可能有效地治疗的急性紊乱情况下，才会使用上述“高剂量”。一般不用于更持久的给药方案。

然而，根据本发明的糖皮质激素以及联合抗体的剂量，将由执业医师基于每个案例根据需要治疗的具体紊乱和患者具体情况决定。

下面提供一个例子，其不应被理解为对本发明的限制，针对肾炎的治疗一般有两个选择：

1)每天给药500mg甲基氢化泼尼松，持续三天(高剂量)；随后口服氢化泼尼松，其最高剂量为30mg/天(低剂量)，或者

2)口服氢化泼尼松，其最高剂量为60mg/天(中等剂量)，然后随着时间降低(可以口服最高6个月)。

此外，本发明针对于以下的本领域技术人员：其能够基于他或她的知识，例如基于各自的治疗指南，例如NIH指南来确定糖皮质激素和抗-MIF抗体的必要剂量。

在特别优选的实施例中，所述活性成分是需要控制给药速度的成分，例如缓释。也就是说，本发明口服给药的剂型包含的活性成分需要连同包衣一起提供。因此，在优选的实施例中，本发明是指带有包衣的颗粒，特别地，是指包含应当以可控方式释放的活性成分的颗粒，其中这些颗粒带有包衣。更优选地，该包衣是药学上可接受的包衣，特别优选的是肠溶衣、延长释药包衣或延缓释药包衣；所有这些包衣对于本领域技术人员都是已知的。

体内保护性抗-MIF mAbs的一个子类(例如RAB9、RAB4、RAB0、RAM9、RAM4、RAM0)，是指不和未修饰的还原态的MIF结合的促炎细胞因子MIF(巨噬细胞移动抑制因子)。相比之下，这些mAbs表现出对氧化还原依赖型MIF同型的高度选择性。

一个特别优选的抗体是抗体RAB9。

另一个特别优选的抗体是抗体RAB4。

另一个特别优选的抗体是抗体RAB0。

一个特别优选的抗体是抗体RAM9。

另一个特别优选的抗体是抗体RAM4。

另一个特别优选的抗体是抗体RAM0。

如本发明所示，此处所述的联合治疗的优点在于，它导致两种成分出现令人惊异的协同效应。考虑到使用糖皮质激素治疗导致的众多副作用，本发明高度适合提供一种替代治疗，其在治疗后可以改善病人的情况。与此同时，副作用的降低也可以提高病人的顺从性，这对于慢性疾病是特别重要的。

最后，进一步地，本发明允许执业医生增加通过使用高剂量糖皮质激素获得的效果，这在特定情况下和在特定疾病状态中是可以立即救命的。

本发明随后通过下述实施例的方式进一步描述，其中所述实施例不应该被理解为是对本发明的限制。

参考实施例

A)用于抗体筛选的GCO实验

THP1悬浮培养基离心，细胞用新鲜的完全培养基重悬至细胞密度为每毫升含10⁶个细胞。该培养物转移到96微孔板中(90μl/孔)，添加潜在的抗-MIF抗体至终浓度为75μg/ml。一式三份测试每个抗体。在37℃开始孵育之后，添加地塞米松至浓度为2nM，在37℃孵育一小时之后，添加LPS(终浓度为3ng/ml)。在37℃进一步孵育六小时之后，收集上清液，使用商购的ELISA测定IL-6浓度。三组的所有结果取平均值，测定相比对照抗体IL-6分泌的百分比。导致IL-6分泌率低于75％的抗体被认为是阳性。

B)测定IC ₅₀ 值的实验

除了增加所用抗体量(一般为1-125nM)以外，其他依照筛选实验中所述的方法进行本实验。相比于阴性对照抗体，得到的剂量反应曲线表示为％抑制。该曲线用于计算抗体的最大抑制效应(％Inh max)和具有50％最大抑制效应(IC₅₀)的抗体浓度。

C)细胞增殖抑制

血清可以刺激静止的NIH/3T3分泌MIF，并且MIF反过来可以刺激细胞增殖。因此，抑制内源性MIF的抗体会降低静止的NIH/3T3细胞的增殖。增殖的降低可以通过添加³H-胸苷测定。

在包含10％血清的培养基的96孔板中，每孔含1000个NIH/3T3细胞在37℃培养整个周末。然后，细胞再含有0.5％血清的培养基中在37℃饥饿培养过夜。去除0.5％的培养基，用新鲜的包含10％血清、75μg/ml抗体和5μCi/ml的3H-胸苷培养基替换。在CO₂培养箱中37℃下培养16小时之后，每孔中的细胞用150μl的冷PBS冲洗2次。使用多通道吸管在每孔中添加150μl 5％(w/v)TCA溶液，然后在4℃下孵育30分钟。用150μl PBS冲洗平板。每孔添加75μl的0.5M NaOH溶液和0.5％SDS，混合后，室温下储存。通过将5ml Ultima Gold(Packard)和75μl样品溶液混合后，在β-计数器测量样品。每个测量都是一式三份，其值通过t-检验和对照抗体相比较。能够显著降低增殖的抗体(P<0.05)被认为是阳性的。

D)结合研究：抗-MIF抗体的表位决定簇

用偶联缓冲液(coupling buffer)稀释每种肽后，得到一般为1μg/ml浓度的肽，并添加到微板中(NUNC Immobilizer^TM Amino Plate F96Clear)，然后在4℃下孵育过夜(100μl/孔)。使用重组的全长MIF和PBS作为对照。平板用200μl PBST冲洗三次，添加抗体(PBS中2-4μg/ml)(100μl/孔)，在室温下孵育2小时并轻轻摇晃。平板用200μl PBST冲洗三次，并添加检测抗体(例如标记的Fc特异性抗-人类IgG/HRP，Sigma)(100μl/孔)。在室温下孵育并轻轻摇晃1小时后，所述平板用200μl PBST冲洗三次。每孔用100μl TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液(T-0440，Sigma)在暗处孵育30分钟。通过每孔添加100μl1.8M H₂SO₄终止染色反应。在450nm下测量样品。

E)通过Biacore测定抗-MIF抗体的Fab片段的亲和性

典型地，将40RU单位的人类重组MIF和CM5(＝甲基葡聚糖)基质(Biacore)固定在感应芯片上。注射Fab片段，并且稀释于HBS-EP中的Fab片段注射的浓度范围一般为6-100nM。每次循环之后，该芯片都用50mM NaOH+1M NaCl重新生成。根据1:1Langmuir模型计算亲和性。

具体实施方式

引言：

使用糖皮质激素药物治疗疾病经常因严重的副作用或必要的剂量增加而受阻。在本发明中，我们描述了糖皮质激素化合物的效力(例如地塞米松、氢化可的松或氢化泼尼松)可以通过联合抗-oxMIF抗体而增加。相比于各自的单独治疗，该组合能够潜在地改善对这种紊乱的治疗并甚至显著地延长病人的预期寿命。

特别地，本发明取得了下述结果：

-给药低剂量的糖皮质激素可以取得与之前高剂量的糖皮质激素相同的效果，并且副作用更低

-相同的糖皮质激素剂量可以得到更高的疗效

-如果需要，可以给予高剂量的糖皮质激素从而得到增强的治疗效应。

肾炎

实施例1：新月体性肾小球肾炎的动物模型

在本领域认为该模型预见能够显示本发明的效果。该模型适合显示联合治疗对包含在上述“MIF相关的疾病”定义范围之内的全部疾病的治疗效果。特别地，该模型对下述疾病是适合的：狼疮性肾炎、抗-GBM肾炎、ANCA肾炎、IgA肾病。本领域认为地塞米松预测可以在人类治疗中用作糖皮质激素。例如，治疗人类狼疮性肾炎优选的糖皮质激素是甲基氢化泼尼松。

抗-MIF单克隆抗体(mAb)和它联合地塞米松的效果在Wistar Kyoto(WKY)大鼠的免疫介导的肾毒性肾炎中检测。该模型快速发病并伴有巨噬细胞浸润、纤维素沉积和组织损坏12。在雄性WKY大鼠中通过单一静脉注射(第0天)0.1ml兔子抗-鼠肾小球基底膜血清诱发NTN。在下述时间点腹腔注射下述剂量的mAb和地塞米松。在诱导肾小球性肾炎之前以及诱导用于量化蛋白尿的肾炎后不同的时间间隔内，采用代谢笼收集24小时尿样。冷冻肾组织切片用于随后的免疫组织学的分析。通过苏木精/曙红(H&E)和过碘酸-希夫(氏)(PAS)染色肾组织切片来评估肾损伤的形态学。通过免疫过氧化物酶技术和单克隆小鼠抗体ED1(Serotec，UC)检测巨噬细胞。该动物模型的具体描述见下述文献(Tam FWK,Smith J,MorelD,Karkar AM,Thompson EM,Cook HT,Pusey CD:Development of scarring and renalfailure in a rat model of crescentic glomerulonephritis.Nephrol DialTransplant 14:1658-1666,1999)。

抗-MIF抗体的剂量

用于人体治疗的抗-MIF抗体的剂量范围是：0.2-25mg/kg

用于人体治疗优选的剂量范围是：1-10mg/kg

基于体外实验(化学运动性实验)和亲和性测量发现，所述抗-MIF抗体抑制人类MIF的效力比抑制小鼠或大鼠MIF的效力高10倍以上。因此，肾炎实验(实施例1c)的剂量范围分别设定为大鼠：2-120mg/kg，人类：0.2-12mg/kg。

在患有新月体性肾小球肾炎的大鼠模型中证明了MIF拮抗剂联合类固醇可以增强治疗效应。在初期实验中使用不同浓度的地塞米松以找到次最优类固醇剂量(实施例1a；实验示意图如图1所示；结果如图2-4所示)。在第二个初期实验中，证实了MIF拮抗剂(抗-MIF抗体RAM9)的效力(实施例1b)。最后，次优剂量的地塞米松联合所述抗体(实施例1c)，该联合导致疾病参数的降低得到显著改善。该联合治疗取得的有益效果相当于10倍以上类固醇剂量所取得的效果。

实施例1a:

总结(见图1)

·WKY大鼠被诱导肾小球性肾炎4天后提供治疗

·收集过夜尿液(第7天至第8天)之后和在第8天选择性宰杀(culling)动物之后评估肾损伤的严重程度(见图1)

·单次腹膜内注射0.25mg/kg的地塞米松可以降低大约50％的蛋白尿(图2)、大约53％的肾小球巨噬细胞浸润(图3)和大约25％的新月体数量(图5)。

→确定0.025mg/kg为次最优地塞米松浓度

→确定0.025mg/kg适于用于研究抗体RAM9的潜在效果

实施例1b:

总结(见图4)

·WKY大鼠被诱导肾小球性肾炎4天和6天后提供治疗

·收集过夜尿液(第7天至第8天)之后和在第8天选择性宰杀(culling)动物之后评估肾损伤的严重程度(见图5)

·腹膜内注射抗体RAM9可以降低：

－蛋白尿(图6和图10)：60mg/kg：大约22％，120mg/kg：大约25％

－巨噬细胞浸润(图7和图11)：60mg/kg：大约26％，120mg/kg：大约38％

－新月体数量(图8和图12)：60mg/kg：大约10％，120mg/kg：大约12％

·进一步地，尿液中的MIF，TNF和IL-1β降低。

实施例1c:

总结(见图9)

·WKY大鼠被诱导肾小球性肾炎4天后(地塞米松+抗体)和6天后(单独抗体)提供治疗

·收集过夜尿液(第7天至第8天)之后和在第8天选择性宰杀(culling)动物之后评估肾损伤的严重程度(见图9)

·抗体RAM9联合地塞米松表现出强大的协同效应，见图10-12：

-地塞米松的效应很明显地增加了10倍以上

所述动物模型例证了MIF拮抗剂和类固醇联合治疗的有益效应。类固醇治疗有广泛的治疗应用范围，但同时也有普遍的局限性(高剂量导致的副作用、类固醇抵抗性等)。类固醇和MIF抗体的联合治疗有潜力为患有下述疾病的病人打开更宽广的新的治疗机会，例如炎症疾病、传染病或癌症。

实施例2

下述模型使用本领域已知的NZB/NAWF1小鼠，其用作全身性红斑狼疮和狼疮性肾炎的实验模型。这些小鼠的治疗被认为可以预测狼疮性肾炎和全身性红斑狼疮的治疗。

在患有狼疮性肾炎的小鼠模型中证明了MIF拮抗剂联合类固醇可以增强治疗效应。在初期实验中使用不同浓度的地塞米松以找到次最优类固醇剂量(实施例2a)。最后，次优剂量的地塞米松联合所述抗体(实施例2b)，该联合导致疾病参数的降低得到显著改善。

这些实验使用成年NZB/NAW F1杂交小鼠。这些小鼠发展出类似人类全身性红斑狼疮(SLE)的免疫紊乱症状。雌性小鼠会在带有持续性尿蛋白和针对核酸的循环抗体的32-38周龄时显现出该疾病。

实施例2a:

“地塞米松在NZB/NZW F1小鼠中的剂量研究”

本实验的目标是为了确定地塞米松的次最优剂量以促进类固醇治疗联合抗MIF抗体的协同研究。

NZB/NZW F1小鼠中疾病的确立是通过测量蛋白尿监控和确认的。当小鼠表现出蛋白尿时，腹腔注射不同剂量的地塞米松或赋形剂来处理动物。在实验最后，动物被处死并得到下述参数：蛋白尿、肾小球巨噬细胞数量和肾组织学。

组1：赋形剂

组2：地塞米松0.5mg/kg

组3：地塞米松1.0mg/kg

组4：地塞米松2.0mg/kg

组5：组织学对照

实施例2b:

“抗MIF抗体RAM9与次优剂量的地塞米松在NZB/NZW F1杂交小鼠中的协同效应”

在本实验中研究了候选药物RAM9抗体和次优剂量的地塞米松之间的协同效应。

NZB/NZW F1小鼠中疾病的确立是通过测量蛋白尿监控和确认的。当小鼠表现出蛋白尿时，用类固醇和抗体治疗动物。在实验最后，动物被处死并得到下述参数：蛋白尿、肾小球巨噬细胞数量和肾组织学。

“动物组”

组1：组织学对照

组2：对照抗体BAX C3

组3：抗MIF RAM9

组4：地塞米松+对照抗体BAX C3

组5：地塞米松+抗MIF RAM9

表2：实验2的综述

实验2	抗体	类固醇
			狼疮性肾炎	-	地塞米松剂量滴定
狼疮性肾炎	RAM9	地塞米松

T-细胞介导的疾病

实施例3a

所用动物模型用于诱导对DNFB(2,4-二硝基氟苯)的迟发型过敏(DTH)：C57Bl/6小鼠通过在腹部局部施用DNFB而致敏。通过将DNFB溶液涂抹到小鼠耳朵上来刺激小鼠。炎症反应的炎症程度通过在被刺激24小时之后用卡尺测量耳朵的厚度来判断。与此同时，处死动物，并将切下的耳朵保存以用于随后的组织学分析。

该动物模型在本领域被认为可以用于预见T细胞介导的免疫反应相关的疾病，例如皮肤炎症，例如银屑病。

处理时间表如下所示：

T＝0天：敏感小鼠

T＝5天：给药抗炎治疗并刺激小鼠

T＝6天：量化耳朵肿胀、杀死小鼠、收集耳朵用于组织学分析

该实验通过上述模型实施已完成地塞米松剂量滴定(类似实施例1和2所述)，并确定RAM9抗体联合氢化可的松(局部实施)的效应。

所有实验显示联合的协同效应。

实施例3b-d：接触性超敏反应

材料与方法

接触性超敏反应(CHS)对2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应使用修饰后的下述早期模型测定(见Ludwig,et al.,2010,Am J Pathol 176,1339-1345)。C57BL/6小鼠通过用75μlDNFB溶液(Sigma，圣路易斯，密苏里州)(0.5％溶于丙酮/橄榄油，4/1)处理小鼠剃毛后的背部皮肤而致敏。在第5天，小鼠通过局部施用氢化可的松(对被刺激的耳朵)或赋形剂(对未被刺激的耳朵)并静脉注射抗MIF抗体RAM9或同型对照抗体进行处理。30分钟之后，用20μl0.3％DNFB刺激小鼠的右耳以引发局部炎症反应。该赋形剂(丙酮/橄榄)油施用在左耳作为对照。作为右耳和左耳的区别，被刺激24小时之后使用千分尺(Mitutoyo Co.,Tokyo,Japan)测量对DNFB的肿胀反应。每组使用8只小鼠。

结果

实施例3b：氢化可的松的剂量滴定

在第一个实验中，施用三种不同剂量的氢化可的松(0.3％、1％和3％的DAC基础乳膏)，而没有施用抗体。不含氢化可的松的赋形剂作为阴性对照。发现浓度为1％的氢化可的松是可以在患有接触性皮炎的模型中产生次优抗炎效应的浓度，其通过测量耳朵厚度确定。

实施例3c：抗-MIF抗体RAM9的剂量滴定

在第二个实验中，施用20mg/kg的抗-MIF抗体RAM9而没有施用氢化可的松，同型对照抗体用作阴性对照。相比于用同型对照抗体或盐水治疗小鼠，耳朵肿胀作为这些实验的主要指标在用抗-MIF治疗的小鼠中显著降低。20mg/kg作为高度有效的剂量，10mg/kg的RAM9作为次优剂量在后续实验中使用。

实施例3d：RAM9(静脉注射)和氢化可的松(局部)的联合施用

最后，小鼠用10mg/kg的同型对照抗体或RAM9，或联合氢化可的松(1％的DAC基础乳膏)进行治疗。结果见图13。同型对照抗体处理后的小鼠表现出耳朵肿胀了大约100μm。局部施用次优剂量的氢化可的松联合同型对照抗体不能降低耳朵肿胀。10mg/kg的RAM9作为单药治疗与同型对照抗体的结果类似。然而，在同时接受RAM9和氢化可的松的小组中，耳朵的厚度显著降低，这表明该两种药物在缩小耳朵肿胀方面具有协同效应。

结论

总之，这些实验为次优剂量的RAM9和氢化可的松在小鼠模型中对于接触性皮炎具有治疗性协同作用提供了证据。

仅用于受理局

仅用于国际局

Claims

1.抗-oxMIF抗体联合糖皮质激素在制备用于治疗糖皮质激素接受性疾病的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述糖皮质激素接受性疾病对采用糖皮质激素的治疗有反应。

3.如权利要求1或2所述的应用，用于炎症、过敏、癌症或哮喘的治疗。

4.如权利要求1所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体选自于下组：抗-oxMIF抗体RAB9、RAB4和/或RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0，进一步地，所述抗体RAB9的重链氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，所述抗体RAB9的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述抗体RAB4的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述抗体RAB4的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述抗体RAB0的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述抗体RAB0的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述抗体RAM9的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述抗体RAM9的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

所述抗体RAM4的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述抗体RAM4的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

所述抗体RAM0的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体RAM0的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

5.如权利要求1所述的应用，其中，所述糖皮质激素选自于由糖皮质激素受体激动剂和抗炎SEGRA’s/SEGRM’s构成的组。

6.如权利要求1所述的应用，其中，所述糖皮质激素受体激动剂选自于由甲基氢化泼尼松、氢化泼尼松、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、帕拉米松、氟可龙、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、环索奈德、莫美他松、氯倍他松、可的松和氢化可的松构成的组。

7.如权利要求5所述的应用，其中所述抗炎SEGRA’s/SEGRM’s选自(R)-1,1,1-三氟-4-(5-氟-2,3-苯并二氢呋喃-7-基)-4-甲基-2-{[(2-甲基-5-喹啉基)氨基]甲基}-2-戊醇、2-(4-乙酸苯酚酯)-2-氯-N-甲基-盐酸乙胺、RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348。

8.如权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体选自下组：抗体RAB9、抗体RAB4和抗体RAB0，或RAM9、RAM4或RAM0，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述糖皮质激素接受性疾病是炎症。

9.如权利要求8所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAM9。

10.如权利要求8所述的应用，其中，所述糖皮质激素接受性疾病是肾炎。

11.如权利要求8所述的应用，其中，所述糖皮质激素接受性疾病是狼疮肾炎、肾小球性肾炎、IgA或IgM肾病、系统性血管炎、抗-GBM肾炎和/或急进性肾小球肾炎。

12.如权利要求11所述的应用，其中，所述系统性血管炎是结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、紫癜。

13.如权利要求11所述的应用，其中，所述急进性肾小球肾炎是类型I、II、III或IV。

14.如权利要求10所述的应用，其中，所述肾炎是ANCA肾炎。

15.如权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAB9、抗体RAB4和抗体RAB0，或RAM9、RAM4或RAM0，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述糖皮质激素接受性疾病是狼疮肾炎。

16.如权利要求15所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAM9。

17.如权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体选自下组：抗体RAB9、抗体RAB4和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述糖皮质激素接受性疾病是全身性红斑狼疮。

18.如权利要求17所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAM9。

19.如权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体选自下组：抗体RAB9、抗体RAB4和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述糖皮质激素接受性疾病是皮肤炎症。

20.如权利要求19所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAM9。

21.如权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体选自下组：抗体RAB9、抗体RAB4和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述糖皮质激素接受性疾病是T细胞介导的免疫反应。

22.如权利要求21所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAM9。

23.如权利要求21所述的应用，其中，所述T细胞介导的免疫反应是皮肤炎症。

24.如权利要求21所述的应用，其中，所述T细胞介导的免疫反应是银屑病或接触性超敏反应。

25.如权利要求19所述的应用，其中，所述糖皮质激素是布地奈德，并且布地奈德配制为局部施用。

26.如权利要求21所述的应用，其中，所述糖皮质激素是布地奈德，并且布地奈德配制为局部施用。

27.如权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体选自下组：抗体RAB9、抗体RAB4和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0，所述糖皮质激素是布地奈德，所述糖皮质激素接受性疾病是炎症性肠病(IBD)，其中，所述IBD选自溃疡性结肠炎和克罗恩病。

28.如权利要求27所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAM9。

29.如权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体选自下组：抗体RAB9、抗体RAB4和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0，所述糖皮质激素选自下组：全身给药时为(甲基)氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述糖皮质激素接受性疾病是多发性硬化。

30.如权利要求29所述的应用，其中，所述抗-oxMIF抗体是抗体RAM9。

31.一种试剂盒，其包含如权利要求1至30中任一项所述的抗-oxMIF抗体联合糖皮质激素，以及使用说明。

32.如权利要求31所述的试剂盒，用于糖皮质激素接受性疾病的治疗。

33.如权利要求31所述的试剂盒，用于炎症、过敏、哮喘或癌症的治疗。