JP6236062B2 - 抗ｍｉｆ抗体とグルココルチコイドの併用療法 - Google Patents

Description

本発明は、抗MIF抗体、具体的にはそのMIF関連疾患の治療におけるグルココルチコイドと組み合わせた使用に関する。

マクロファージ遊走阻止因子(MIF)は、ツベルクリン過敏性モルモット由来の腹腔浸出細胞(マクロファージを含む)のin vitro無作為遊走を阻害する能力にもとづいて最初に単離されたサイトカイン（Bloom et al. Science 1966、153、80-2；David et al. PNAS 1966、56、72-7)である。今日、MIFは、多様な活性スペクトラムを示す先天性および後天性免疫反応の重要な上流調節因子として知られている。

ヒトMIF cDNAは1989年にクローニングされ(Weiser et al.、PNAS 1989、86、7522-6)、そのゲノムにおける位置は、クロモソーム22にマッピングされた。ヒトMIF遺伝子の産物は、114アミノ酸（N末端メチオニンの開裂後)の、みかけの分子量が約12.5 kDaのタンパク質である。MIFは、いかなる他のタンパク質とも顕著な配列相同性をもたない。該タンパク質は、同一サブユニットのトリマーとして結晶化する。各モノマーは、4本鎖βシートに対してパックする2つの逆平行αらせんを含む。該モノマーは、モノマー間の接点を形成する隣り合ったサブユニットのβシートと相互作用するさらなる2本のβ鎖を有する。3つのサブユニットは、分子の三回転軸（three-fold axis）に沿ってタンパク質の中心を突き通る溶媒アクセス可能チャンネルを形成するよう配置される(Sun et al. PNAS 1996、93、5191-5196)。

マクロファージからのMIFの分泌は、非常に低濃度のグルココルチコイドで誘導されたと報告された（Calandra et al. Nature 1995、377、68-71)。しかしながら、またMIFは、グルココルチコイドの効果を逆調節し、他のサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子TNF-αおよびインターロイキンIL-1βの分泌を刺激する(Baugh et al.、Crit Care Med 2002、30、S27-35)。MIFは、例えば、血管新生促進、増殖促進、および抗アポトーシス特性を有し、腫瘍細胞増殖を促進することも示された(Mitchell、R.A.、Cellular Signalling、2004. 16(1)：p. 13-19；Lue、H. et al.、Oncogene 2007. 26(35)：p. 5046-59)。MIFは、リンパ腫、メラノーマ、および結腸癌の増殖にも直接関連する（Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000、20:751-62)。

MIFは、多くの病状のメディエーターであり、とりわけ、限定されるものではないが炎症性腸疾患（IBD)、リウマチ性関節炎(RA)、急性、急性呼吸促迫症候群（ARDS)、喘息、糸球体腎炎、IgA腎症、心筋梗塞(MI)、敗血症、および癌を含む種々の疾患と関連する。ポリクローナルおよびモノクローナル抗MIF抗体は、組換えヒトMIFに対して生成された(Shimizu et al.、FEBS Lett. 1996；381、199-202；Kawaguchi et al、Leukoc. Biol. 1986、39、223-232、およびWeiser et al.、Cell. Immunol. 1985、90、167−78)。

抗MIF抗体は治療的使用が示唆されている。Calandra et al.、(J. Inflamm.（1995)；47、39-51)は、実験的に誘発したグラム陰性およびグラム陽性敗血性ショックから動物を保護するための抗MIF抗体の使用を報告した。抗MIF抗体は、敗血性ショックおよび他の炎症性疾患状態におけるサイトカインの生成を調節する治療手段として示唆された。

US 6,645,493は、MIFの生物活性を中和するハイブリドーマ細胞由来のモノクローナル抗MIF抗体を開示する。MIFは、動物モデルにおいて、これらマウス由来抗MIF抗体はエンドトキシン性ショックの治療に有益な効果を有することが示されるかもしれない。

US 200310235584は、MIF遺伝子がホモ接合性にノックアウトされている動物においてMIFに対する高親和性抗体を製造する方法を開示する。

グリコシル化阻害因子(GIF)はGalat et al（Eur. J. Biochem、1994、224、417-21)に記載されたタンパク質である。MIFおよびGIFは現在同一であると認識されている。Watarai et al.（PNAS 2000、97、13251-6)は、Ts細胞中のGIFの翻訳後修飾の生化学的性質を同定するための種々のGIFエピトープと結合するポリクローナル抗体を開示した。Watarai et al（上記）は、GIFはin vitroで種々の構造異性体を生じると報告した。あるタイプの異性体は、1システイン残基の化学修飾により生じる。化学修飾は、GIFタンパク質内の構造変化をもたらす。グルココルチコイド（グルココルチコステロイドと呼ばれることもある）は、ほとんどの脊椎動物に存在するグルココルチコイドレセプターと結合するステロイドホルモンの１クラスである。グルココルチコイドは、免疫活性（すなわち炎症）を低下させる免疫系のフィードバックメカニズムの一部である。医薬において、グルココルチコイドは、免疫系の過剰反応により生じる疾患を治療するために用いられ、そのような疾患の例にはアレルギー、喘息、自己免疫疾患、および敗血症がある。グルココルチコイドは、癌細胞の異常なメカニズムのいくつかとも干渉し、癌の治療にも用いられる。

グルココルチコイドレセプターと結合すると、活性化したグルココルチコイドレセプター複合体は、トランス活性化として知られるプロセスにより核中の抗炎症性タンパク質の発現を上方調節し、遺伝子誘導に対する作用を減弱させることにより（NF-κB、AP1、jun-jun-ホモダイマーなどを介する)サイトゾル中の炎症促進タンパク質の発現を抑制する。原則として、グルココルチコイドは、コルチコステロイドのサブグループとして定義される。さらに、グルココルチコイド活性(SEGRA、選択的グルココルチコイドレセプターアゴニスト) を有する新規クラスの化合物が知られている。これら化合物は、完全にアゴニスト的なグルココルチコイド作用のいくつかのみを有し、遺伝子誘導（NF-κB、AP1、jun-jun-ホモダイマーなどを介する）に対するトランス作用、トランス抑制、および間接的作用の全スペクトルをもたらすことはできない。選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(SERM’s＝タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン)との類似性により、これら化合物は選択的グルココルチコイドレセプターモジュレーター（SERM’s)とも呼ばれる。SEGRA’s/SEGRM’sの例には、マプラコラート(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348が含まれる。

天然グルココルチコイドの重要な例には、生命に必須であり、種々の重要な心臓血管、代謝、免疫学的、および恒常性機能を調節または支持するコルチゾール(またはヒドロコルチゾン)がある。種々の合成グルココルチコイドも利用可能である。

該グルココルチコイドは、3つの主要分野、すなわち、免疫学的、代謝的、および胎児発生分野で作用する。免疫分野において、該グルココルチコイドは、抗炎症性タンパク質の発現を上方調節し、炎症促進タンパク質の発現を下方調節する。代謝作用は以下のようにまとめることができる。
・特に肝臓における糖新生の刺激。この経路は、非ヘキソース基質、例えばアミノ酸からのグルコース、およびトリグリセリド分解からのグリセロールの合成をもたらし、特に肉食動物およびある種の草食動物に重要である。糖新生に関与する酵素の発現の増強は、おそらくグルココルチコイドの最もよく知られた代謝機能である。
・肝外組織由来のアミノ酸の可動化。これは糖新生の基質として働く。
・筋肉および脂肪組織におけるグルコース摂取の阻害。脂肪分解により放出される脂肪酸は、筋肉などの組織のエネルギー産生に用いられ、放出されたグリセロールは、糖新生の別の基質を提供する。

胎児発生において、グルココルチコイドは、肺の成熟、および子宮外肺機能に必要な界面活性剤の産生を促進する。グルココルチコイドは、さらに正常な脳の発達にとって主要な基質である。コルチゾールよりはるかに強力な種々の合成グルココルチコイドが治療的使用のために作製されている。それらは薬物動態（吸収、半減期、分布容量、クリアランス）および薬力学が異なる。

グルココルチコイド有効性、効果の持続性、および重複するミネラルコルチコイド有効性が異なる。コルチゾール(ヒドロコルチゾン)は、グルココルチコイド有効性の比較標準である。著しい量（ある場合には最大50％）が腸から吸収されないので、経口有効性は非経口有効性より低いかもしれない。

例には、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、コルチゾン/コルチゾール、フルオロコルトロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、パラメタゾンが含まれる。

さらに、グルココルチコイドの作用といくらか（すべてではない）だけ似ている化合物があり、この化合物は、SEGRAs（選択的グルココルチコイドレセプターアゴニスト)と呼ばれる。SEGRA’s/SEGRM’sの例には、マプラコラート(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A,RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348が含まれる。

主として局所適用（例えば、スプレー−肺、坐剤−結腸、クリーム−皮膚)のためのステロイド)：ヒドロコルチゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルチカゾン、フルニソリド、モメタゾン、シクレソニド、クロベタゾン。

齧歯類においてマクロファージおよびT細胞MIF産生がグルココルチコイドにより阻害されるのではなく誘導されたことは非常に驚くべきことであった(Calandra T、Bernhagen J、Metz CN et al.、(1995) MIF as a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production. Nature 377:68-71;およびBacher M、Metz CN、Calandra T、et al.、(1996) An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T-cell activation. PNAS 93：7849-7854)。MIFは炎症促進特性を有することが知られているので、これらの結果は、最初の矛盾および調和困難のようであった。しかしながら、次いで、MIFが、実際にグルココルチコイドの抗炎症性免疫抑制事実を無効にすることがわかった。

グルココルチコイドは、種々の疾患および障害（下記参照）の治療に有用で有効であることが示されたが、該投与には、用いた薬物療法のタイプに応じて一定の副作用がありうる。最も一般的な副作用には以下のものが含まれる。
・免疫抑制
・糖新生の増加、インスリン耐性、およびグルコーストレランス不全（「ステロイド糖尿病」）による高血糖症。
・皮膚脆弱性の増加、あざができやすい。
・腸カルシウム吸収の低下による負のカルシウムバランス。
・ステロイド性骨粗鬆症；骨密度の低下（骨粗鬆症、骨壊死、高い骨折リスク、遅い骨折修復）。
・内臓および体幹脂肪沈着(中心性肥満)および食欲増進による体重増加。
・副腎機能障害（長期使用し、漸減せずに突然中止した場合)
・筋肉分解（タンパク質分解）、脆弱；筋肉量および修復の減少。
・胸脂肪体の拡張および皮膚の小血管の拡張。
・無排卵、月経期間異常。
・成長障害、思春期遅延。
・血漿アミノ酸増加、尿形成増加；負の窒素バランス。
・中枢神経系に対する興奮作用（陶酔感、精神病）。
・頭蓋圧増加による緑内障。
・白内障

合成または内因性グルココルチコイドの過剰持続により生じた臨床問題の組み合わせをクッシング症候群という。

上記効果に加えて、外因性グルココルチコイドは、視床下部副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)および下垂体副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)を抑制するので、１週間以上の高用量ステロイドの使用は患者の副腎の抑制を生じ始める。抑制持続により副腎は萎縮（物理的萎縮）し、外因性グルココルチコイドの中断後完全に機能が回復するのに数カ月かかりうる。この回復期間中、患者は疾患などのストレスの間中、副腎機能障害にかかりやすい。

大事なことは、長期にわたりグルココルチコイドを投与された患者は、グルココルチコイド抵抗性も発現しうる。該患者において、高用量のグルココルチコイドは、適切な抗炎症性反応をもたらすのに充分ではない（Barnes PJ、Adcock IM. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases. Lancet 2009 May 30；373(9678):1905-1917)。

上記副作用は、該グルココルチコイド薬の用量が増加すると著しく増大する。該薬剤の投与量が減少すると通常副作用も減少または改善する。

したがって、当該分野において、該グルココルチコイドの投与用量を減らすことができるMIF関連疾患および障害の治療法を提供することが急務である。

（発明の説明）
この目的は本発明により解決された。

具体的には、抗MIF抗体および所定のグルココルチコイドの組み合わせ（併用）療法により、より低用量のグルココルチコイドを用いるMIF関連疾患の治療を可能にし、および/または該疾患のグルココルチコイド単独治療と同用量でより高い効果を達成することができる相乗効果が認められた。

具体的には、抗oxMIF抗体および所定のグルココルチコイドの組み合わせ療法による治療は、上記および本発明の実施例に例示した相乗効果と関連することが示された。

上昇したMIFレベル（すなわち一般的にはMIFレベル）は、種々の疾患の発症、とりわけ炎症性疾患または癌の発症後に検出される。しかしながら、MIFは、健康対象でも循環しており、明確に区別するのは難しい。これに対して、oxMIFは健康対象には存在しない。oxMIFは、疾患状態において増加し、患者の試料、例えば血液、血清、および尿中に検出することができる。

MIFおよびそれに対する抗体の徹底的な研究により、抗体RAB9、RAB4およびRAB0はoxMIFと特異的に結合する(そしてredMIFと結合することができない)ことをみいだした。この結合は、抗体RAM9、RAM4およびRAM0についても認められた。

本発明者らが行った初期の実験において、酸化的手順、例えばシスチン介在酸化、GSSG(ox.グルタチオン)介在酸化、またはMIFのProclin300またはタンパク質架橋剤(例えばBMOE)がMIFの上記抗体に対する結合をもたらすことが示された。

本発明が達した驚くべき結論は以下の通りである。
・組換えMIF（ヒト、マウス、ラット、CHO、サル)の酸化還元調節（シスチン/GSSG介在の軽度の酸化）または組換えMIFのProclin300またはタンパク質架橋剤による処置は、Baxterの抗MIF抗体RAB9、RAB4およびRAB0の結合をもたらす。
・oxMIFの減少はAb結合の損失をもたらす。
・oxMIF異性体に対する特異性は、Abのin vivo生物学的効果と関連する。
・oxMIFレベルは疾患状態と関連しうる。

（ox)MIFに関するこのさらなる知見は、本発明者らのさらなる研究の基礎となった。

本発明の好ましい態様は以下の通りである。
1. グルココルチコイド受容疾患の治療に用いるためのグルココルチコイドと組み合わせた抗MIF抗体。
2. グルココルチコイド受容疾患がグルココルチコイドによる治療に反応する1項に記載のグルココルチコイドと組み合わせた抗MIF抗体。
3. 炎症、アレルギー、癌、または喘息の治療に用いるための1または2項に記載のグルココルチコイドと組み合わせた抗MIF抗体。
4. 該抗体が抗oxMIF抗体である1、2、または3項に記載のグルココルチコイドと組み合わせた抗MIF抗体。
5. 抗MIF抗体が、下記群：抗MIF抗体RAB9、RAB4、RAB0、RAM9、RAM4、および/またはRAM0から選ばれる1〜4項のいずれかに記載の組み合わせ。
6. 該グルココルチコイドが、グルココルチコイドレセプターアゴニスト、例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、トリマシノロン、デキサメタゾン、パラメタゾン、フルオルコルトロン、ブデソニド、フルチカゾン、フルニソリド、シクレソニド、モメタゾン、クロベタゾン、コルチゾンおよびヒドロコルチゾン、および抗炎症性SEGRA’s/SEGRM’s（例えば、マプラコラート(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348)からなる群から選ばれる1〜5項のいずれかに記載の組み合わせ。
7. 該抗MIF抗体が、抗体RAB9、RAB4、またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0、好ましくは抗体RAM9のいずれか１であり、該グルココルチコイドが、全身投与の場合は(メチル)プレドニゾロンおよびデキサメタゾンおよび局所投与の場合はブデソニドからなる群から選ばれ、該MIF関連疾患が、炎症、具体的には腎炎、さらにより好ましくはループス腎炎、糸球体腎炎、IgA、またはIgM腎症、全身性血管炎（例えば、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症およびHenoch-Schoenlein紫斑病)、抗GBM腎炎および/または急速進行性糸球体腎炎、(タイプI、II、III、またはIV)、例えば、ANCA（抗好中球細胞質抗体)腎炎)である1〜6項のいずれかに記載の組み合わせ。
8. 該抗MIF抗体が、抗体RAB9、RAB4、またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0、好ましくは抗体RAM9のいずれかであり、該グルココルチコイドが、全身投与の場合は(メチル)プレドニゾロンおよびデキサメタゾンおよび局所投与の場合はブデソニドからなる群から選ばれ、該MIF関連疾患がループス腎炎である、1〜6項のいずれかに記載の組み合わせ。
9. 該抗MIF抗体が、抗体RAB9、RAB4、またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0、好ましくはRAM9のいずれかであり、該グルココルチコイドが、全身投与の場合は(メチル)プレドニゾロンおよびデキサメタゾンおよび局所投与の場合はブデソニドからなる群から選ばれ、該MIF関連疾患が全身性エリテマトーデスである、1〜6項のいずれかに記載の組み合わせ。
10. 抗MIF抗体が、抗体RAB9、RAB4、またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0、好ましくはRAM9のいずれかであり、該グルココルチコイドが、全身投与の場合はデキサメタゾンおよび(メチル)プレドニゾロンおよび局所投与の場合はブデソニドからなる群から選ばれ、該MIF関連疾患が皮膚の炎症である、1〜6項のいずれかに記載の組み合わせ。
11. 該抗MIF抗体が、抗体RAB9、RAB4、またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0、好ましくは RAM9のいずれかであり、該グルココルチコイドが、全身投与の場合はデキサメタゾンおよび(メチル)プレドニゾロンおよびブデソニド、または局所投与の場合はヒドロコルチゾンからなる群から選ばれ、該MIF関連疾患がT細胞性免疫反応により生じる、1〜6項のいずれかに記載の組み合わせ。
12. 該T細胞性免疫反応が、皮膚の炎症、例えば、乾癬、または接触性過敏症である10または11項の組み合わせ療法。
13. 該グルココルチコイドがブデソニドであり、該ブデソニドが局所適用のために製剤化される、10〜12項のいずれかの組み合わせ療法。
14. 該抗MIF抗体が、抗体RAB9、RAB4、またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0、好ましくは RAM9のいずれかであり、該グルココルチコイドがブデソニドであり、該MIF関連疾患が炎症性腸疾患(IBD)であり、該IBDが潰瘍性大腸炎およびクローン病から選ばれる1〜5項のいずれかに記載の組み合わせ療法。
15. 該抗MIF抗体が、抗体RAB9、RAB4、またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0、好ましくはRAM9のいずれかであり、該グルココルチコイドが、全身投与の場合は(メチル)プレドニゾロンおよびデキサメタゾンおよび局所投与の場合はブデソニドからなる群から選ばれ、該MIF関連疾患が多発性硬化症である、1〜6項のいずれかに記載の組み合わせ。
16. 1〜15項のいずれかに記載の組み合わせおよび使用説明書を含むキット。
17. グルココルチコイド受容疾患、具体的には、炎症、アレルギー、喘息、または癌の治療に用いるための上記1〜15のいずれかに記載の組み合わせまたは16項のキット。

上記抗体を、その配列および上記それぞれ上記抗体RAB0、RAB4およびRAB9、およびそれぞれRAM0、RAM4およびRAM9の各軽鎖または重鎖を含むE.coli（TG1株)を含むプラスミドとして寄託することにより特徴づけ、裏付ける。該プラスミドをGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ)、Mascheroder Weg 1b、Braunschweig、Germanyにプダペスト条約の下で寄託することにより得られた公式番号であるDSM番号により特徴付ける。プラスミドをそれぞれE. coli株に入れて寄託した。

DSM 25110番号のプラスミドは、抗MIF抗体RAB4の軽鎖配列を含む。DSM 25112番号のプラスミドは、抗MIF抗体RAB4の重鎖(IgG4)配列を含む。

適切な宿主細胞中のプラスミドDSM 25110およびDSM 25112の同時発現は、好ましい抗MIF抗体RAB4の産生をもたらす。DSM 25111番号のプラスミドは抗MIF抗体RAB9の軽鎖配列を含む。DSM 25113番号のプラスミドは、抗MIF抗体RAB9の重鎖(IgG4)配列を含む。適切な宿主細胞におけるプラスミドDSM 25111およびDSM 25113の同時発現は、好ましい抗MIF抗体RAB9の産生をもたらす。DSM 25114番号のプラスミドは、抗MIF抗体RAB0の軽鎖配列を含む。DSM 25115番号のプラスミドは、抗MIF抗体RAB0の重鎖(IgG4)配列を含む。適切な宿主細胞中のプラスミドDSM 25114およびDSM 25115の同時発現は、好ましい抗MIF抗体RAB0の産生をもたらす。さらなるプラスミドを、それぞれ以下のごとく、RAM0、RAM4およびRAM9の軽鎖配列および重鎖配列について2012年4月12日にDSMZでブダペスト条約のもと寄託した：
RAM9（重鎖)：E.coli GA.662-01.pRAM9hc - DSM 25860.
RAM4（軽鎖)：E.coli GA.906-04.pRAM4lc - DSM 25861.
RAM9（軽鎖)：E.coli GA.661-01.pRAM9lc - DSM 25859.
RAM4（重鎖)：E.coli GA.657-02.pRAM4hc - DSM 25862.
RAM0（軽鎖)：E.coli GA.906-01.pRAM0lc - DSM 25863.
RAM0（重鎖)：E.coli GA.784-01.pRAM0hc - DSM 25864.

用語「予防的」または「治療的」処置は、当該分野で認識されており、患者に薬剤を投与することをいう。望まない病状（疾患または宿主動物の他の望まない状態）の臨床的兆候の前に投与すると、望まない病状の発現から宿主を保護するが、望まない兆候の後に投与すると、該処置は治療的である（すなわち、存在する望まない病状または副作用を減少、軽減、または以上することを意図する）。

本明細書で用いている抗(ox)MIF化合物は、(ox)MIFの生物活性を減弱し、阻害し、妨害し、または中和し、または減少させるあらゆる物質を表す。抗(ox)MIF化合物は、(ox)MIF活性を阻害または中和する物質、例えば抗体、特に好ましくは本明細書に記載の抗体、例えば抗体、特に好ましくは本明細書に記載の抗体、さらにより好ましくは抗体RAB9、RAB4および/またはRAB0、またはRAM9、RAM4、またはRAM0でありうる。

本発明の好ましいMIFアンタゴニストは抗MIF抗体である。さらにより好ましくは抗MIF抗体はoxMIFに対する抗体である。他の態様において、抗oxMIF抗体、例えば上記抗体またはその抗原結合部分は、100 nM以下のKD、好ましくは50 nM以下のKD、さらにより好ましくは10nM以下のKDでoxMIFと結合する。本発明は、さらに抗MIF抗体またはその抗原結合部位、および本発明のグルココルチコイド剤を含むキットに関する。キットは、該抗体およびグルココルチコイド剤に加えて、さらに治療薬、およびその使用を含みうる。キットは、治療方法における使用説明書を含むことができる。

より初期の結果は、oxMIFのみと結合し、redMIFと結合せず、さらにGCOおよび/または細胞増殖を阻害する抗MIF抗体は、動物モデルに有益な効果を誘導することを示す。
（発明の詳細な説明）

本発明をさらに開示した図に記載する。

実施例1aで行ったデキサメタゾンによる用量設定処置のスキームである。 種々の用量のデキサメタゾンを投与後第8日のタンパク尿。 種々の用量のデキサメタゾンを投与後のマクロファージ浸潤。マクロファージ(ED1陽性細胞)数/糸球体横断面を測定した。各動物の結果および各群の平均を示す。 種々の用量のデキサメタゾン後の糸球体半月。各動物について測定した糸球体半月のパーセンテージを示し、各群の平均を示す。 実施例1bのグリシン形成における抗MIF抗体RAM9に対する用量設定のスキーム。 ２用量の抗体RAM9後第8日のタンパク尿。 2用量の抗体RAM9後のマクロファージ浸潤。(ED1陽性細胞)数/糸球体横断面を測定した。各動物の結果および各群の平均を示す。 2用量の抗体RAM9後の糸球体半月の形成。各動物について測定した糸球体半月のパーセンテージを示し、各動物の平均を示す。 実施例1cにおけるデキサメタゾンおよび抗体RAM9の組み合わせによる治療スケジュールのスキーム。 抗体RAM9（用量範囲0〜120ｍｇ／ｋｇ)およびデキサメタゾン(0.025ｍｇ／ｋｇ)による組み合わせ処置後のタンパク尿の低下。2つの独立した実験の平均を示す。矢印は、抗体を適応しない種々の用量のデキサメタゾンによるたんぱく尿の減少％を示す。 抗体RAM9（用量範囲0〜120ｍｇ／ｋｇ)およびデキサメタゾン（0.025ｍｇ／ｋｇ)の組み合わせ処置後に観察されたマクロファージ浸潤の減少。2つの独立した実験の平均を示す。矢印は、抗体を適応しない種々の用量のデキサメタゾンによるマクロファージ浸潤の減少％を示す。 抗体RAM9（dose range 0-120ｍｇ／ｋｇ)およびデキサメタゾン（0.025ｍｇ／ｋｇ)による組み合わせ処置後の半月形成の減少。2つの独立した実験の平均を示す。矢印は、抗体を適応しない種々の用量のデキサメタゾンによる半月形成の減少％を示す。 DNFBに対する接触性過敏症（CHS)。ヒドロコルチゾン（−HC)を適用しないRAM9処置マウスに比べてヒドロコルチゾン（＋HC)と組み合わせて抗MIF（RAM9)で処置したマウスのチャレンジした耳におけるCHS反応の減弱。アイソタイプコントロール抗体処置マウス（ヒドロコルチゾンの局所適用有りまたはなし）を陰性コントロールとして用いた。１群あたり8匹のマウスを用い、皮膚接触皮膚炎の減少を右耳（チャレンジ）および左耳（非チャレンジ）間の耳の熱さの差を測定することにより定量した。（定義および一般的技術）

特記しない限り、本発明について用いた科学および技術用語は、当業者が一般的に理解している意味を有する。一般的に、本明細書で用いている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質および核酸化学の技術、およびそれらに関連して用いる用語は、当該分野でよく知られ、一般的に用いられるものである。本発明の方法および技術は、一般的に当該分野でよく知られ、特記しない限り本明細書全体に引用および記載されている種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載された常套的方法により実施される。例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（1989)およびAusubel et al.、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates（1992)、およびHarlowおよびLane Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（1990)参照(これらの内容は本明細書の一部を構成する)）。

「MIF」または「マクロファージ遊走阻止因子」は、免疫および炎症反応において重要なメディエーターおよびグルココルチコイドの逆調節因子として知られているタンパク質を表す。MIFは哺乳類MIF、具体的にはヒトMIF（Swiss-Prot第1受託番号：P14174)を含む。モノマー形は115アミノ酸タンパク質としてコードされるが、最初のメチオニンの開裂により114アミノ酸タンパク質として生成される。「MIF」は、「GIF」(グリコシル化阻害因子)および他の形のMIF、例えばMIFの融合タンパク質も含む。MIFのアミノ酸の番号付けは、N末端メチオニン（アミノ酸1)で出発し、C末端アラニン(アミノ酸115)で終わる。「酸化MIF」またはoxMIFは、本発明の目的において、弱い酸化試薬（例えばシステイン）でMIFを処理することにより生じるMIFの異性体として定義される。本発明により示されるように、このように処理した組換えoxMIFは、（例えば）動物に細菌をチャレンジした後にin vivoで生じる構造再配列をoxMIFと共有するMIFのアイソフォームを含む。redMIFは、本発明の目的において、減少したMIFと定義され、RAB0、RAB9および/またはRAB4と結合しないMIFである。

本発明に記載の抗oxMIF抗体は、それぞれ弱い酸化または還元により生じるoxおよびred MIFを区別することができる。抗oxMIF抗体は、oxMIFを特異的に検出するのに有用である。これら配座異性体間の区別はELISAまたは表面表面プラズモン共鳴により評価する。両技術は、当業者によく知られ、以下のごとく行うことができる。
Biacoreによる抗体の特異的結合評価

oxMIFおよびredMIFの抗体RAB9およびRAB0に対する結合動力学は、Biacore 3000 Systemを用いる表面プラズモン共鳴分析により試験する。該抗体をCM5（＝カルボキシメチル化デキストラン)チップおよび0.2％ Proclin300とプレインキュベーションした組換えMIFタンパク質上にコートし、注射した。(Proclin300は、oxMIF構造を安定化させる酸化的イソチアゾロンからなる。)ProClin300を添加しない天然HBS-EP緩衝液（＝Biacoreランニング緩衝液）中で、組換えMIFタンパク質は、RAB9、RAB0、または陰性（バックグラウンド）結合抗体として用いた基準抗体（無関係アイソタイプコントロール抗体）のいずれとも結合しなかった。

好ましい態様において、oxMIFは、抗体RAB9、RAB4および/またはRAB0、またはその抗原結合部位によって示差的に結合するMIFであり、これら抗体はoxMIFとは結合するがredMIFはこれら抗体のいずれにも結合しないことを意味する。

他の態様において、抗oxMIF抗体、例えば上記抗体またはその抗原結合部分は、100 nM以下のKD、好ましくは50 nM以下のKD、さらにより好ましくは10nM以下のKDでoxMIFと結合する。さらにより好ましい態様において、該抗体は5nM以下のKDでoxMIFと結合する。

抗体、例えば、RAB9、RAB4、またはRAB0の非結合（oxMIFまたはredMIFに対する)は、一般的に当業者に知られたように決定することができ、その例には以下の方法がある：（還元または酸化状態の）組換えMIFを用いるELISA、または（還元または酸化状態の）組換えMIFを用いる表面プラズモン共鳴（上記のよく知られたBiacoreアッセイなど）。

結合を測定する好ましい方法は、抗体の例えばrec.(ox)MIFに対する表面プラズモン共鳴であり、ここで「結合」は、100 nM以下の、好ましくは50 nM以下の、さらにより好ましくは10 nM以下のKDにより表されることを意味するが、400 nM以上のKDにより特徴付けられる。「結合」および「特異的結合」は、本明細書では上記を表すために互換性に用いる。本願の文脈において「示差的結合」は、化合物、具体的には本明細書に記載の抗体がoxMIF（例えば、上記KD値を有する)と結合するが、redMIFとは結合しないことを意味する(非結合は上記のごとく定義する)。

「抗体」は、完全抗体、または完全抗体と（特異的）結合において競合する抗原結合部分を表す。一般的には、Fundamental Immunology、Ch. 7（Paul、W.編、第2版 Raven Press、N.Y.（1989))参照(この内容は本明細書の一部を構成する)。用語抗体には、限定されるものではないが、ヒト抗体、哺乳類抗体、単離された抗体および遺伝子操作形、例えばキメラ、キャメライズド（camelized）、またはヒト化抗体が含まれる。

抗体の用語「抗原結合部分」は、抗原（例えば(ox)MIF）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上の断片を表す。抗原結合部分は、組換えDNA技術、または完全抗体の酵素的または化学的開裂により生成することができる。抗原結合部位には、例えば、限定されるものではないが以下のものが含まれる：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、および相補性決定領域(CDR) 断片、一本差抗体(scFv)、キメラ抗体、抗体およびポリペプチド（すなわち、oxまたはredMIF）との特異的抗原結合をもたらすのに充分な抗体の少なくとも部分を含むポリペプチド。N末端〜C末端の成熟軽鎖および重鎖可変ドメインは、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の配置は、Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health、Bethesda、Md.（1987および1991))、Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917（1987)、またはChothia et al.、Nature 342:878-883（1989)の定義に従う。抗体またはその抗原結合部分を誘導体化するか、または別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質)と結合させることがことができる。例えば、抗体またはその抗原結合部分を、１またはそれ以上の他の分子エンティティ、例えば別の抗体（例えば二特異的抗体またはディアボディ）、検出可能な物質、細胞毒性物質、医薬物質、および/または連結分子と機能的に結合させることができる。

用語「KD」は、当業者の一般的に知識に従って、特定抗体の各抗原との平衡解離定数を表す。この平衡解離定数はアフィニティを測定する。該アフィニティは、平衡状態（結合と解離が平衡を保つ定常状態）(すなわち：oxまたはredMIFおよび抗体)で複合体がどれくらい形成されるかを決定する。
k_a＝結合速度定数[M^-1 s^-1]
k_d＝解離速度定数[s^-1]
K_D＝平衡解離定数＝kd/ka [M]

用語「ヒト抗体」は、可変および定常ドメインがヒト配列であるあらゆる抗体を表す。該用語は、ヒト遺伝子由来の配列を含むが、例えば、生じうる免疫原性を減少させ、アフィニティを増加させ、望ましくないフォールディングを生じうるシステインを排除するなどのように変化している抗体を含む。該用語は、例えばヒト細胞では典型的ではないグリコシル化をもたらすかもしれない非ヒト細胞で組換え的に製造した抗体を含む。

用語「ヒト化抗体」は、ヒト配列と非ヒト配列を含む抗体を表し；具体的には「ヒト化抗体」は、ヒト配列が付加され、および/または非ヒト配列を置換する非ヒト抗体を表す。

用語「キャメライズド（camelized）抗体」は、抗体構造または配列がラクダ由来の抗体により近似するよう変化している抗体を表す（キャメリド抗体ともいう）。キャメライズド抗体の設計および製造方法は、当業者の一般的知識の一部である。

用語「キメラ抗体」は、2またはそれ以上の異なる種由来の領域を含む抗体を表す。

用語「単離抗体」または「その単離された抗原結合部分」は、抗体供給源、例えばファージディスプレイライブラリーまたはB細胞レパートリーから選ばれ、同定された抗体またはその抗原結合部分を表す。本発明の抗(ox)MIF抗体の製造には、遺伝子操作、例えば、RNAの逆転写および/またはDNAの増幅、および発現ベクター中へのクローニングによる組換えDNAのあらゆる製造方法を含む。ある態様において、該ベクターは、さらなるDNA断片がウイルスゲノム中に結合していることがあるウイルスベクターである。ある態様において、該ベクターは導入される宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。他の態様において、該ベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞中に導入すると宿主細胞のゲノムに統合され、宿主ゲノムとともに複製されることができる。さらに、あるベクターは、作動可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。

抗(ox)MIF抗体は、とりわけ、常套的発現ベクター、例えば細菌ベクター（例えば、pBR322およびその誘導体)、または真核性ベクターにより生成することができる。該抗体をコードする配列は、宿主細胞からの複製、発現、および/または分泌を制御する制御配列とともに提供することができる。これら制御配列は、例えばプロモーター(例えば、CMV、またはSV40)およびシグナル配列を含む。発現ベクターは、選択および増幅マーカー、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（DHFR)、ヒグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ、およびチミジンキナーゼも含むことができる。用いるベクターの成分、例えば選択マーカー、レプリコン、エンハンサーは、市販品を用いるか、常套的方法により製造することができる。該ベクターは、種々の細胞培養、例えば哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、HEK293、NSO、繊維芽細胞、昆虫細胞、酵母、または細菌、例えばE.coli中で発現させるために構築することができる。例えば、発現したタンパク質の最適なグリコシル化を可能にする細胞を用いる。抗(ox)MIF抗体軽鎖遺伝子および抗(ox)MIF抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができるか、または該遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。該抗体遺伝子は、標準的方法、例えば抗体遺伝子断片およびベクターの相補性制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーションにより発現ベクター中に挿入される。

抗(ox)MIF抗体またはその抗原結合部位の製造法は、トランスフェクション、例えば、エレクトロポーレーション、またはマイクロインジェクションにより組換えDNAを真核細胞に導入するための当該分野で知られたあらゆる方法を含みうる。例えば、抗(ox)MIF抗体の組換え発現は、導入配列がゲノム中に安定して統合された細胞をもたらす適切なトランスフェクション法により、１またはそれ以上の制御配列（例えば強いプロモーター）の制御下、抗(ox)MIF抗体をコードするDNA配列を含む発現プラスミドを適切な宿主細胞株に導入することにより達成することができる。リポフェクション法は、本発明に従って用いることができるトランスフェクション法の例である。

抗(ox)MIF抗体の製造法は、例えば、連続式またはバッチ式で該形質転換細胞を培養し、例えば構成的にまたは導入で抗(ox)MIF抗体を発現させるための当該分野で知られたあらゆる方法も含むことができる。抗(ox)MIF抗体を製造するためのさらなる参考文献はWO 2009/086920に具体的に記載されている。好ましい態様において、本発明に従って製造した抗(ox)MIF抗体は、oxMIFまたはそのエピトープと結合する。本発明の特に好ましい抗体は、抗体RAB9、RAB4および/またはRAB0である。別の好ましい抗体は、RAM9、RAM4および/またはRAM0である。これら抗体の配列はWO 2009/086920に記載されている。本発明の配列表に加えて下記参照のこと。

配列番号1、RAB9の軽鎖のアミノ酸配列：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQRIM TYLNWYQQKP GKAPKLLIFV ASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTLTISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
配列番号2、RAB4の軽鎖のアミノ酸配列：
DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
配列番号3、RAB0の軽鎖のアミノ酸配列：
DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
配列番号4、RAB2の軽鎖のアミノ酸配列：
DIQMTQSPVT LSLSPGERAT LSCRASQSVR SSYLAWYQQK PGQTPRLLIY GASNRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGNSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
配列番号5、RAB9の重鎖のアミノ酸配列：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSS
IGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQ
WLYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT
CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM
ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP
PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG
SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK；
配列番号6、RAB4の重鎖のアミノ酸配列：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG
IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN
VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA
ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SLGK；
配列番号7、RAB0の重鎖のアミノ酸配列：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSG
IYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN
VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA
ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SLGK；
配列番号8、RAB2の重鎖のアミノ酸配列：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA
ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SLGK；
配列番号9、RAM0hcのアミノ酸配列：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN
YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK；
配列番号10、RAM0lcのアミノ酸配列：
DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
配列番号11、RAM9hcのアミノ酸配列：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQ WLYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK；
配列番号12、RAM9lcのアミノ酸配列：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQRIM TYLNWYQQKP GKAPKLLIFV ASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTLTISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
配列番号13、RAM4hcのアミノ酸配列：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK；
配列番号14、RAM4lcのアミノ酸配列：
DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC。

本発明の抗MIF抗体は、好ましくは単離されたモノクローナル抗体である。該抗MIF抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、またはIgD分子でありうる。他の態様において、抗MIF抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4サブクラスである。他の態様において、該抗体はサブクラスIgG1またはIgG4である。他の態様において、該抗体はサブクラスIgG4である。ある態様において、該IgG4抗体は、セリン(セリン228)がプロリンに変化する単一突然変異を有する。したがって、IgG4のFc領域のCPSCサブ配列は、IgG1のサブ配列であるCPPCになる(Angal et al. MolImmunol. 1993、30、105-108)。

さらに、抗(ox)MIF抗体の製造法は、抗体を精製するための当該分野で知られたあらゆる方法、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィを含む。ある態様において、抗(ox)MIF抗体はサイズ排除クロマトグラフィにより精製することができる。

MIFの用語「中心領域」および「C末端領域」は、ヒトMIFのそれぞれアミノ酸35〜68およびaa 86〜115、好ましくはそれぞれaa 50〜68およびaa 86〜102を含むヒトMIFの領域を表す。

本発明の特に好ましい抗体は、ヒトMIFの領域aa 50〜68または領域aa 86〜102と結合する。また、これは、以下のごとく結合する、好ましい抗体RAB0、RAB4、RAB2およびRAB9、ならびにRAM4、RAM0およびRAM9のエピトープとの結合にも反映される：
RAB4およびRAM4：aa 86〜102
RAB9およびRAM9：aa 50〜68
RAB0およびRAM0：aa 86〜102
RAB2：aa 86〜102

したがって、RAM4およびRAB4は、RAM9およびRAB9と同じ特異性を有する。RAM0およびRAB0について同じである。これはこれら抗体を用いて同じ結果が得られることを示す実施例にも反映される。

用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたは抗体断片と特異的に結合することができるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面基、例えば、露出したアミノ酸、アミノ糖、または他の炭化水素側鎖からなり、通常、特異的3次元構造特性および特異的荷電特性を有する。

用語「ベクター」は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を表す。ある態様において、ベクターはプラスミド、すなわち、さらなるDNA断片が連結しうる環状２本鎖DNAループである。

用語「宿主細胞」は、発現ベクターに導入後に組換えタンパク質を産生することができる細胞株を表す。用語「組換え細胞株」は、組換え発現ベクターが導入されている細胞株を表す。「組換え細胞株」は、特定対象の細胞株だけでなく、そのような細胞株の子孫も意味する。ある修飾が突然変異または環境的影響により次世代に生じうるので、そのような子孫は、実際に親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いる用語「組換え細胞株」の範囲に含まれる。本発明の宿主細胞タイプには、例えば、COS細胞、CHO細胞、または例えばHEK293細胞または当業者に知られているあらゆる他の宿主細胞があり、例えば細菌細胞（例えばE.coli細胞）なども含まれる。ある態様において、抗MIF抗体は、選択マーカーとしてG418が付加されたDHFR欠損CHO細胞株（例えばDXB11）中で発現する。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターをCHO宿主細胞に導入すると、該抗体は、宿主細胞中で抗体が発現するか、または宿主細胞が増殖する培養液中に抗体が分泌されるのに充分な時間、宿主細胞を培養することにより産生される。

抗(ox)MIF抗体は、標準的タンパク質精製方法を用いて培養液から回収することができる。

本発明により提供される組み合わせ療法の第2活性成分はグルココルチコイドである。グルココルチコイド（グルココルチコステロイドともいうことがある）は、ほとんどすべての脊椎動物に存在するグルココルチコイドレセプター(グルココルチコイドレセプターα)と結合するステロイドホルモンのクラスである。グルココルチコイドは、免疫活性（すなわち炎症）を低下させる免疫系のフィードバックメカニズムの一部である。医薬において、グルココルチコイドは、過剰な免疫系により生じる疾患を治療するのに用いられ、そのような疾患の例にはアレルギー、喘息、自己免疫疾患、および敗血症がある。グルココルチコイドは、癌細胞の異常なメカニズムのいくつかとも干渉し、癌を治療するのにも用いられる。グルココルチコイドレセプターに結合すると、活性化したグルココルチコイドレセプター複合体は、トランス活性化として知られるプロセスにより核中の抗炎症性タンパク質の発現を上方調節し、サイトゾル中の炎症性タンパク質の発現を抑制する。原則として、グルココルチコイドは、コルチコステロイドのサブグループとして定義される。さらに、グルココルチコイド活性を有する新しいクラスの化合物(SEGRA、選択的グルココルチコイドレセプターアゴニスト)が知られている。

該化合物は、完全アゴニストグルココルチコイドの作用のいくつかしか持たず、遺伝子誘導(NF-κB、AP1、jun-junホモダイマーなどを介する)における全範囲のトランス活性化トランス抑制、および間接作用を生じさせることはできない。選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（SERM＝タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン)と同様に、これら化合物も選択的グルココルチコイドレセプターモジュレーター(SEGRM)という。SEGRA/SEGRMの例には、マプラコラート(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348が含まれる。すべてのこれら化合物は、文献に記載され、当業者に良く知られている。具体的には、総説のDe Bosscher et al、2010、Curr Opin Pharmacol 10：497-504参照。RU 24856、RU 40066およびRU 24782は、例えば、Ｖａｙｓｓｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ、1997、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ 11:1245-1255に記載されている。これらは以下の各化学式を有する：

ZK245186は、Proksch et al、2011、Drug Metab Dispos 39:1181-1187およびSchaecke et al.、2009、Br J Pharmacol、158(4):1088-103に記載されており、下記式を有する：(R)-1,1,1-トリフルオロ-4-(5-フルオロ-2,3-ジヒドロbベンゾフラン-7-イル)-4-メチル-2-{[(2-メチル-5-キノリル)アミノ]メチル}ペンタン-2-オール。ZK 216348は、Schaecke et al.、2004、PNAS USA 101:227-232に記載されており、下記化学式を有する：

化合物Aは、Rauner et al、2011、Endocrinology 152:103-112、およびDe Bosscher K、Vanden Berghe W、Beck IM、Van Molle W、Hennuyer N、Hapgood J、Libert C、Staels B、Louw A、Haegeman G、2005、A fully dissociated compound of plant origin for inflammatory gene repression. Proc Natl Acad Sci USA 102:15827-15832に記載されており、下記式を有する：2-(4-アセトキシフェニル)-2-クロロ-N-メチル-エチルアンモニウムクロリド。

グルココルチコイドの重要な例に、生命に必須であり、種々の重要な循環器、代謝、免疫、および恒常性機能を調節または支持するコルチゾール(またはヒドロコルチゾン)がある。種々の合成グルココルチコイドも利用可能である。

該グルココルチコイドは、3つの主要分野、すなわち、免疫、代謝、および胎児発育の分野で作用する。免疫の分野において、グルココルチコイドは、抗炎症性タンパク質の発現を上方調節し、炎症性タンパク質の発現を下方調節する。代謝作用は下記のごとく要約することができる：
・特に肝臓における糖新生の刺激：この経路は、非ヘキソース基質（例えばアミノ酸）からのグルコースの、およびトリグリセリド分解からグリセロールの合成をもたらし、肉食動物およびある草食動物において特に重要である。糖新生に関与する酵素の発現の増強は、おそらくグルココルチコイドの最もよく知られた代謝機能である。
・肝臓外組織からのアミノ酸の移行：これらは糖新生の基質として働く。
・筋肉および脂肪組織におけるグルコース取り込み阻害：脂肪分解により放出された脂肪酸は、筋肉などの組織におけるエネルギーの生成に用いられ、放出されたグリセロールは、糖新生の別の基質を提供する。

胎児発育において、グルココルチコイドは、肺の成熟、および子宮外肺機能に必要な界面活性剤の生成を促進する。グルココルチコイドは、さらに正常脳発育の極めて重要な物質である。コルチゾールよりはるかに強力な種々の合成グルココルチコイドが治療に用いるために生み出されている。それらは薬物動態（吸収率、半減期、分布容量、クリアランス）および薬力学的に異なる。

本発明の文脈において、「グルココルチコイド」は、グルココルチコイドレセプターαに作用するすべてのグルココルチコイドを意味する。具体的には、これは「古典的」グルココルチコイドレセプターアゴニストおよび上記SEGRAを含む。好ましい態様において、すべてのそれらグルココルチコイドは、NF-κB経路および/またはAP-1経路を介して作用するものを含む。さらに好ましい態様において、本発明のグルココルチコイドはすべて（「古典的」）グルココルチコイドである。

理論的には、将来いつか、例えば、トランス活性化またはトランス抑制を介してのみ作用し、NF-κB経路を介して作用しないグルココルチコイドがあるかもしれない（なさそうだが）。好ましい態様において、これら化合物は本発明に含まれない。

NF-κBは、活性化B細胞の核因子κ軽鎖エンハンサーである。NF-κBは、実質的にすべての細胞種および組織に存在する特異的転写因子である。該DNAの特定の制御領域と結合することにより、NF-κBは、抗アポトーシス遺伝子、カスパーゼファミリーの遺伝子、具体的にはシクロオキシゲナーゼ-2（Cox-2)、IL-6およびTNF-αなどの標的遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる。

グルココルチコイド有効性、効果の持続時間、および重複するミネラルコルチコイド有効性は変化する。コルチゾール(ヒドロコルチゾン)は、グルココルチコイド有効性の標準比較物である。ヒドロコルチゾンはコルチゾールの医薬製剤に用いる名前である。著しい量（ある場合には最大50％）が腸から吸収されないかもしれないので、経口有効性は非経口有効性より低いかもしれない。

本発明の好ましいグルココルチコイドの例には以下のものがある：
ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、コルチゾン/コルチゾール、フルオロコルトロン、プレドニゾン、プレドニゾロン,メチルプレドニゾロン(特に全身投与用)、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、パラメタゾン、ブデソニド（特に局所投与用)、SEGRAs（選択的グルココルチコイドレセプターアゴニスト)。

さらに、グルココルチコイドと作用がいくらかだけ（すべてではない）似ている化合物があり、該化合物はSEGRAs（選択的グルココルチコイドレセプターアゴニスト)という。SEGRA’s/SEGRM’sの例には、マプラコラート(＝BOL303242X＝ZK245186)、化合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348が含まれる。SEGRAsは、典型的にはNFκ-B経路を介してその効果を発揮する。

主として局所適用のためのステロイド（例えば、スプレー：肺、坐剤：結腸、クリーム：皮膚）：ヒドロコルチゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルチカゾン、フルニソリド、モメタゾン、シクレソニド、クロベタゾン、最も好ましくはブデソニド。

さらに好ましい態様において、該グルココルチコイドは以下からなる群から選ばれる：ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ブデソニド、フルドロコルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロンおよび/またはメチルプレドニゾロン。以下のものが特に好ましい：(メチル)プレドニゾロン、ヒドロコルチゾンおよびデキサメタゾン。全身投与用の(メチル)プレドニゾロンがさらにより好ましい。ヒドロコルチゾンが、本発明の態様において局所適用に好ましい。さらに好ましい態様において、ブデソニドが局所投与に好ましい。グルココルチコイドの塩、エステル、および/または異性体は、すべて本発明の範囲内に含まれるものとし、用語「グルココルチコイド」に該当すると理解すべきである。それらはすべてよく知られているか、よく知られた方法により製造することができる。

齧歯類においてマクロファージおよびT細胞のMIF産生がグルココルチコイドにより阻害されるのではなく誘導されるという知見は非常に驚くべきことであった(Calandra T、Bernhagen J、Metz CN et al.,(1995) MIF as a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production. Nature 377:68-71；およびBacher M、Metz CN、Calandra T、et al.,（1996) An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T-cell activation. PNAS 93：7849-7854)。

MIFは炎症性特性を有することが知られていたので、これらの結果は最初の矛盾、調整困難である。しかしながら、次いで、MIFが実際にグルココルチコイドの抗炎症性免疫抑制事実を覆すことがわかった。

当業者に知られているあらゆる特定のグルココルチコイドを本発明の文脈において用いることができ、これらは先に例示したグルココルチコイドでありうる。さらに、グルココルチコイドの合成も当該分野でよく知られている。

グルココルチコイドは、種々の疾患の緩和および治療に有効であることが示された。しかしながら、ほとんどのグルココルチコイドは、例えば上記のある範囲の副作用と関連があり、ある場合には治療を止めなければならないほどに極度である。いずれにせよ、該副作用は、患者の身体的および精神的健康にさらなる負担を与え、可能なかぎり避けるべきである。

本発明では、グルココルチコイドと抗MIF抗体を組み合わせることにより、グルココルチコイドのみを活性成分として投与する場合に比べて所定の治療に必要なグルココルチコイドの量を減らすことができる。本発明が可能とするさらなる可能性は、グルココルチコイドの単独投与に比べてグルココルチコイドの用量を維持し、患者においてはるかに高い治療反応を得ることである。

驚くべきことに、本発明者らは、グルココルチコイドと抗MIF抗体の組み合わせにより得られる効果が同じ治療反応を維持したままでグルココルチコイドの明確な用量の減少を可能にすることを示した。

治療反応は、当業者が容易に測定することができ、所定の病状を減弱もしくは改善し、または軽減することを表す。これを測定するアッセイは、よく知られており、例えばある疾患を有する対象の生存の確率および長さの決定および同じ該疾患を有する他の対象の生存の確率および長さの決定、または同一患者における経時的な症状の変化の測定でありうる。

適切なアッセイは、例えば赤血球沈降アッセイであり、さらなるアッセイには本明細書の実施例に記載のものがある。本発明の好ましいグルココルチコイドは、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、デキサメタゾン、ブデソニド、プレドニゾロンおよび/またはメチルプレドニゾロンである。メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンおよびブデソニドおよびデキサメタゾンが特に好ましい。全身投与には(メチル)プレドニゾロンおよびデキサメタゾン、局所投与にはブデソニドがさらにより好ましい。

以下の組み合わせが特に好ましい：
−RAM9とデキサメタゾンの組み合わせ、
−RAM9とブデソニドの組み合わせ、
−RAM9とヒドロコルチゾンの組み合わせ、
−RAM9とプレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンの組み合わせ、
−RAM0とデキサメタゾンの組み合わせ、
−RAM4とデキサメタゾンの組み合わせ、
−RAM0とブデソニドの組み合わせ、
−RAM4とブデソニドの組み合わせ、
−RAM0とプレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンの組み合わせ、
−RAM4とプレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンの組み合わせ、
−RAM4とヒドロコルチゾンの組み合わせ、
−RAM0とヒドロコルチゾン。

特に好ましい態様において、ヒドロコルチゾンおよびブデソニドを局所（topical/local）適用に用いる。

本発明の文脈において、特定の病状の治療のために知られているすべての適切なグルココルチコイドが含まれることを明確に指摘する。すなわち、最も好ましい態様において、本発明のグルココルチコイドは、所定の疾患のためのそれぞれ代表的処置であるグルココルチコイドである。

上記の好ましい組み合わせは、好ましくは以下に記載のグルココルチコイド受容疾患の治療に使用される。

本発明の組み合わせ療法は、グルココルチコイド受容疾患を治療するために特に適している。

本発明の文脈において「グルココルチコイド受容疾患」は、グルココルチコイド療法に反応する疾患と定義される。グルココルチコイド療法に反応することが知られている疾患を以下に挙げる。

本発明の組み合わせ療法を考慮する当業者は、グルココルチコイドを用いる治療を考えている病状に直面するとすぐに該療法を考慮するだろう。

炎症性疾患およびある種の癌のタイプはいずれもグルココルチコイド受容疾患であることがよく知られている。両タイプの疾患について標準的グルココルチコイド療法が存在する。本発明の目的は、抗MIF療法と標準的グルココルチコイド療法を組み合わせることである。場合により、副作用により必要があれば標準的グルココルチコイドの用量を減らすことも可能である。

好ましい態様において、該グルココルチコイド受容疾患は、赤血球沈降アッセイにおける沈降値の顕著な改善がみられる疾患である。顕著な改善とは、当業者が顕著とみなす改善である。

本発明の組み合わせ療法で治療することができる特に好ましい疾患は炎症性疾患であり、さらにより好ましくは該炎症性疾患は適応免疫系を介して（すなわち、BおよびT細胞を介して）作用する疾患であろう。

さらに好ましくは、該グルココルチコイド受容疾患は、アレルギー性疾患、さらにより好ましくは自己免疫疾患であろう。

すべてのこれら疾患は、グルココルチコイド療法に反応することが知られている。

本発明の文脈において特に好ましい疾患には以下のものがある：
−腎炎、具体的には 糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎（タイプI、II、III、またはIV)、全身性血管炎（例えば、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、Henoch-Schoenlein紫斑病、急性増殖性糸球体腎炎)
−ループス腎炎、ANCA腎炎、抗GBM腎炎(例えばグッドパスチャー病)、IgA腎症、IgM腎症
−エリテマトーデス
−T細胞性免疫反応、例えば、皮膚の炎症、例えば乾癬または接触性過敏症
−IBD、例えば潰瘍性大腸炎およびMorbusCrohn
−多発性硬化症
−リウマチ性関節炎
−ぶどう膜炎
−2型糖尿病
−気管支喘息
−接触性皮膚炎
−乾癬
−アトピー性皮膚炎
−膵炎
−天疱瘡
−シェーグレン病
−ベーチェット病
−Horton病
−強皮症
−多発筋炎。

下記のようなグルココルチコイド受容疾患に対する相乗効果がみられた。選択したモデルは、メカニズム的に上記すべての疾患と同じである抗原抗体反応について効果が示されているので特に適している。

本願により予想される可能な剤形は、錠剤、カプセル剤、サシェー剤、または丸薬である。顆粒剤は、好ましい剤形として用いるか、カプセルもしくはサシェーに充填するか、さらに錠剤または丸薬に圧縮することができる。

本願に含まれるさらなる剤形には以下のものがある：飲料もしくはシロップ剤、エリキシル剤、チンキ剤、サスペンジョン剤、溶液剤、ヒドロゲル、フィルム、ローゼンジー剤、チューインガム、口腔内崩壊錠、洗口剤、歯磨き粉、リップクリーム、薬用シャンプー、ナノ粒子サスペンジョン剤および微粒子錠剤、ならびにエアロゾル、吸入剤、ネブライザー、燻煙もしくはフリーベース粉末型、および局所適用用剤形、例えばクリーム、ゲル、塗布剤、またはバーム、ローション、軟膏、点耳薬、点眼薬、および皮膚パッチ。

さらに、肛門もしくは膣で用いることができる坐剤が含まれる。

本発明の好ましい剤形は、経口剤形、例えば顆粒剤、コートした顆粒剤、錠剤、腸溶錠剤、ペレット剤、坐剤、およびエマルジョン剤である。顆粒剤および錠剤がさらにより好ましい。他の好ましい剤形は、非経口または局所剤形である。抗MIF抗体の特に好ましい投与経路は、皮下または静脈内適用である。グルココルチコイドの好ましい投与経路は経口適用（例えば、顆粒剤、液剤、サシェー剤、または錠剤）である。グルココルチコイドのさらに好ましい適用形は局所適用であり、局所適用には、皮膚に対する適用、および/またはスプレー、例えば鼻腔用スプレーもしくは吸入剤が含まれうる。グルココルチコイドのさらに好ましい投与経路は静脈内適用である。

抗炎症剤として市販されている種々のグルココルチコイドは、しばしば局所用製剤（例えば鼻炎用鼻腔用スプレーもしくは喘息用吸入剤）である。これら製剤は、標的領域のみに作用し、副作用や潜在的相互作用を減らすという利点がある。典型的な化合物は、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルチカゾン、フルニソリド、クロベタゾン、モメタゾンおよびシクレソニドである。喘息用のグルココルチコイドは、定用量の吸入剤または乾燥粉末として投与される。すなわち、そのような製剤も本発明の好ましい態様である。該投与はすべての知られた経路で行うことができる。

用語「組み合わせ」または「組み合わせ療法」は本明細書では互換性に用いる。該用語は、抗MIF抗体をグルココルチコイドと共にまたは連続的に（逆もある）投与する投与計画を表す。該投与計画は、典型的にはグルココルチコイドを１日１回、抗MIF抗体を2週間に１回であろう。好ましい投与計画は、上記のように、グルココルチコイドと一緒にまたは連続して抗MIF抗体を投与することができる。この文脈において「一緒に」は、抗MIF抗体投与とグルココルチコイド投与の間が10分間以内であることを意味する。「連続的に」は、抗MIF抗体投与とグルココルチコイド投与の間が10分間以上であることを意味する。該時間は、10分間以上、30分間以上、1時間以上、3時間以上、6時間以上、または12時間以上でありうる。

抗MIF抗体およびステロイドは、基本的に両化合物が同じ時間に（ある期間）体内に存在することが保証されるように投与される。抗MIF抗体の半減期は典型的には2〜4週間、ステロイドの半減期は6〜24時間である。

したがって、上記組み合わせ療法は、各当業者は該グルココルチコイドおよび該抗体それぞれのよく知られた半減期を考慮して連続的投与計画も明確に含む。抗体の半減期は一般的に2〜4週間であることから、該抗体の投与は2週間毎、3週間毎、または1月間毎に1回だけかもしれない。本発明の組み合わせ療法においてそのような抗体とともに投与するグルココルチコイドは、典型的態様において半減期が6〜24時間であり、したがって、該グルココルチコイドの投与は、5時間毎、6時間毎に１回、1日3回、1日2回、または典型的態様において1日1回である。
表１．デキサメタゾン用量−ラット/マウス/ヒトでの比較

当業者によく知られているステロイドの「5の法則」を用いて、種々のグルココルチコイド間の投与スケジュールを以下のごとく計算することができる：1mg デキサメタゾンは約5mgプレドニゾロンに等しく、約25mgコルチゾンに等しい。

上記「高用量」は、典型的には、急性疾患を可能な限り有効に処置する必要がある場合に投与される。高用量は、典型的には、長期間の投与スケジュールでは投与されない。

しかしながら、本発明におけるグルココルチコイドの用量および抗体と組み合わせた用量は、処置する特定の疾患および罹患対象の詳細に従って個別的に医師が決定する必要があろう。

本発明を限定するものではないが、例として、腎炎の治療には典型的には以下の2つの選択肢がある：
1) 500mgメチルプレドニゾロン/日、3日間(高用量)；次いでプレドニゾロン最大30mg/日(低用量)を経口投与、または
2) プレドニゾロン最大60mg/日(中用量)を経口投与、次いで徐々に減量する（最大6カ月間かけることができる）。

また、本発明は、当業者が、当業者の知識、例えば各治療指針（例えばNIH指針）に基づいてグルココルチコイドおよび抗MIF抗体両方の所要量を決定することに関する。特に好ましい態様において、活性成分は、制御放出（例えば遅延放出）で送達すべき成分であろう。すなわち、そのような活性成分を含む本発明の経口投与剤形はコーティングされて提供されるかもしれない。したがって、好ましい態様において、本発明は、コーティングされた顆粒剤、具体的には制御的に放出される活性成分を含む顆粒剤（該顆粒剤はコーティングされている）に関する。

より好ましくは、このコーティングは、薬理学的に許容されるコーティングであり、特に好ましくは腸溶コーティング、持続放出コーティング、または遅延放出コーティングであり、すべてのそのようなコーティングは、当業者によく知られている。

炎症性サイトカインMIF（マクロファージ遊走阻止因子)に対するn vivo保護抗MIF mAbのサブセット(例えば、RAB9、RAB4、RAB0、RAM9、RAM4、RAM0)は、還元状態で非修飾MIFと結合しない。これに対して、これらmAbは、酸化還元依存性MIFアイソフォームに対して選択性が高いことが示された。

特に好ましい抗体は抗体RAB9である。

別の特に好ましい抗体は抗体RAB4である。

さらに別の特に好ましい抗体は抗体RAB0である。

特に好ましい抗体は抗体RAM9である。

別の特に好ましい抗体は抗体RAM4である。

さらに別の特に好ましい抗体は抗体RAM0である。

本発明が示すように、本明細書で提唱する組み合わせ療法は、両成分の非常に驚くべき相乗効果をもたらすのに好都合である。グルココルチコイドで処置することにより生じる多くの副作用を考慮すると、本発明は治療中の患者の状況を改善するであろう代替処置を提供するのに大いに適している。同時に、副作用の減少は、特に慢性疾患においてきわめて重要な患者のコンプライアンスも改善する。最終的に、本発明は、医師が高用量のグルココルチコイドで得られる結果をさらに増加させるのを可能にし、特定の病的状態および特定の環境下で速やかに命を救うことができる。

本発明を以下に実施例で説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
（参考例）
A) 抗体スクリーニングのためのGCOアッセイ

THP1浮遊培養を遠心分離し、次いで、細胞を10⁶細胞/mlの細胞密度で再浮遊させる。この培養を96ウェルマイクロプレートのウェルに移し(90μl/ウェル)および潜在的抗MIF抗体を最終濃度75μg/mlで加える。各抗体をトリプリケートで試験する。37℃でo/nインキュベーション後、デキサメタゾンを濃度2nMで加え、37℃で1時間インキュベーションした後LPSを加える(最終濃度3ng/ml)。37℃でさらに6時間インキュベーションした後に上清を採取し、IL-6濃度を市販のELISAで測定する。トリプリケートの結果を平均し、IL-6分泌のパーセンテージをコントロール抗体と比較して決定する。75％以下のIL-6分泌をもたらす抗体を陽性とする。
B) IC ₅₀ 値を決定するためのアッセイ

実験手順は、増加する量の抗体を用いる(典型的には1〜125nM)以外はスクリーニングアッセイに記載した通りに実施する。得られた用量反応曲線は、陰性コントロール抗体と比較した阻害％で表す。この曲線を用いて、抗体の最大阻害効果(％Inh max)および該最大阻害効果の50％を示す抗体濃度(IC₅₀)を計算する。
C) 細胞増殖の阻害

血清は静止NIH/3T3におけるMIFの分泌を刺激し、次いでMIFは細胞増殖を刺激する。したがって、内因性MIFを阻害する抗体は、静止NIH/3T3細胞の増殖を減少させる。増殖の減少は、³H-チミジンの取り込みにより測定する。

1000 NIH/3T3細胞/ウェルを、10％血清含有培地中、37℃で週末の間、96ウェルプレート中でインキュベーションする。次に、細胞を37℃で一夜0.5％血清含有培地中でインキュベーションして飢餓させる。0.5％培地を除去し、10％血清、75μg/ml抗体および5μCi/mlの³H-チミジンを含む新鮮培地に交換した。CO₂インキュベーター中、37℃で16時間インキュベーションした後、細胞を150μl/ウェルの冷PBSで2回洗浄する。マルチチャンネルピペットを用いて150μl/ウェルの5％（w/v) TCA溶液を加え、4℃で30分間インキュベーションする。プレートを150μl PBSで洗浄する。75μl/ウェルの0.5％ SDS含有0.5M NaOH溶液を加え、混合し、室温で保存する。試料を5 mlのUltima Gold（Packard)および75μlの試料溶液を混合してβカウンターで測定する。各測定をトリプリケートで行い、値をt検定によりコントロールの値と比較する。増殖が有意に減少した(P＜0.05)抗体を陽性とみなす。
D) 結合試験：抗MIF抗体のエピトープ決定

各ペプチドをカップリング緩衝液で希釈してペプチド濃度を典型的には1μg/mlとしてマイクロプレート(NUNC Immobilizer（登録商標）Amino Plate F96 Clear)に加え、4℃（100μl/ウェル)で一夜インキュベーションする。コントロールとして組換え完全長MIFおよびPBSを用いる。プレートを200μl PBSTで3回洗浄し、次いで抗体(PBS中2〜4μg/ml)を加え(100μl/ウェル)、室温で2時間、静かに振盪させながらインキュベーションする。プレートを200μl PBSTで3回洗浄し、検出用抗体(例えば、Fc特異的抗ヒトIgG/HRP標識、Sigma)を加える(100μl/ウェル)。室温で1時間、静かに振盪させながらインキュベーションした後、プレートを200μl PBSTで3回洗浄する。各ウェルを、100μl TMB（3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン)溶液(T-0440、Sigma)で暗所にて30分間インキュベーションする。染色反応を、100μl/ウェルの1.8 M H2SO4溶液を加えて止める。試料を450nmで測定する。
E) Biacoreによる抗MIF抗体のFab断片のアフィニティ測定

典型的には、40 RU単位のヒト組換えMIFをCM5（＝カルボキシメチル化デキストラン)マトリックス(Biacore)を含むセンサーチップに固定化する。Fab断片をHBS-EPで希釈し典型的には6〜100nMの濃度範囲で注射する。各サイクル後、チップを50 mM NaOH＋1 M NaClで再生する。1:1 Langmuirモデルに従ってアフィニティを計算する。

序論：
グルココルチコイド薬を用いる疾患の治療は、しばしば重度の副作用または用量増加の必要性により妨げられる。本発明において、本発明者らは、グルココルチコイド化合物(例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、またはプレドニゾロン)の有効性を抗oxMIF抗体との組み合わせにより増加させることができることを記載する。そのような組み合わせは、各単独療法に比べてそのような疾患の改善された療法をもたらし、患者の平均余命を有意に延長する可能性がある。

具体的には、本発明により以下のことが達成される。
−低用量のグルココルチコイドで以前の高用量と同じ効果を達成し、副作用を減らすことができる。
−同じグルココルチコイド用量でより高い効果が得られる。
−高グルココルチコイド用量を必要であれば投与することができ、治療効果が増強される。
腎炎
実施例１：半月体形成性糸球体腎炎の動物モデル

このモデルは、本発明の効果を示すことが予測できると当該分野で認識されている。該モデルは、「MIF関連疾患」の上記定義に含めることができる疾患の全範囲にわたり該組み合わせ療法の効果を示すのに適しており、特に、このモデルは以下の疾患に適している：ループス腎炎、抗GBM腎炎、ANCA腎炎、IgA腎症。デキサメタゾンは、ヒトの治療において各グルココルチコイドを予測させると当該分野で認識されている。例えば、ヒトのループス腎炎を治療するための好ましいグルココルチコイドはメチルプレドニゾロンであろう。

抗MIFモノクローナル抗体(mAb)およびそのデキサメタゾンとの組み合わせの効果を、Wistar Kyoto（WKY)ラットの免疫性腎毒性腎炎(NTN)において試験する。このモデルは、マクロファージ浸潤、フィブリン沈着、および組織破壊12を伴う疾患を急激に発症するNTNを、0.1 ml ウサギ抗ラット糸球体基底膜血清(第0日)の単回静脈内注射により雄WKYラットに誘導する。mAbおよびデキサメタゾンを下記の時点および用量で腹腔内注射する。24時間尿試料を、タンパク尿を定量するために、糸球体腎炎誘導前および腎炎誘導後の種々の時間間隔で代謝ケージを用いて収集する。腎組織切片を、次に免疫組織学により分析するために凍結する。腎損傷の形態をヘマトキシリン/エオジン(H&E)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色した腎組織切片で評価する。マクロファージを免疫パーオキシダーゼ技術およびモノクローナルマウス抗体ED1（Serotec、UC)を用いて検出する。該動物モデルは詳細に記載された(Tam FWK、Smith J、Morel D、Karkar AM、Thompson EM、Cook HT、Pusey CD：Development of scarring and renal failure in a rat model of crescentic glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant 14:1658-1666、1999)。
抗MIF抗体の投与

ヒト療法用の抗MIF抗体の用量範囲：0.2〜25ｍｇ／ｋｇ

ヒト療法用の好ましい用量範囲：1〜10ｍｇ／ｋｇ

抗MIF抗体の、in vitroアッセイ(化学運動性アッセイ)およびアフィニティ測定に基づくヒトMIFの阻害はマウスまたはラットMIFより10倍以上強い。したがって、ラットにおける腎炎実験の用量範囲2〜120ｍｇ／ｋｇ(実験1c)は、ヒトでの0.2〜12ｍｇ／ｋｇに相当する。MIFアンタゴニストとステロイドとの組み合わせによる治療効果の増強を、半月体形成性糸球体腎炎のラットモデルで証明する。種々の濃度のデキサメタゾンを予備実験に用い、準最適ステロイド用量をみいだす(実施例1a；該実験のスキームを図１に示し、結果を図2〜４に示す)。第2予備実験において、MIFアンタゴニスト（抗MIF抗体RAM9)の効果を確認する(実施例1b)。最後に、準最適用量のデキサメタゾンを該抗体と組み合わせ(実施例1c)、この組み合わせは疾患パラメーターの顕著な改善された減少をもたらす。この組み合わせ療法でみられた有益な効果は、10倍以上高いステロイドの用量で達成される効果に相当する。
実施例1a

要約(図1も参照のこと)
・WKYラットに糸球体腎炎を誘導後4日に処置を行う。
・腎損傷の重症度を、一夜（第7日〜第8日）尿回収後および第8日に動物を処分後に評価する(図1参照)。
・0.25ｍｇ／ｋｇ デキサメタゾンの単回腹腔内注射は、タンパク尿を約50％（図2)、糸球体マクロファージ浸潤を約53％(図3)および半月体数を約25％（図5)減少させる。
→0.025ｍｇ／ｋｇを準最適デキサメタゾン濃度として決定する。
→0.025ｍｇ／ｋｇは、抗体RAM9の潜在的効果を試験するために適すると考えられる。
実施例1b

要約(図4も参照のこと)
・WKYラットに糸球体腎炎を誘導後4および6日に処置を行う。
・腎損傷の重症度を、一夜（第7日〜第8日）尿回収後および第8日に動物を処分後に評価する(図5参照)。
・抗体RAM9の腹腔内注射は以下のものを減少させる：
−アルブミン尿(図6および図10)：60ｍｇ／ｋｇ：約22％、120ｍｇ／ｋｇ：約25％。
−マクロファージ浸潤(図7および図11)：60ｍｇ／ｋｇ：約26％、120ｍｇ／ｋｇ：約38％。
−半月体数(図8および図12)：60ｍｇ／ｋｇ：約10％、120ｍｇ／ｋｇ：約12％。
・さらに、尿中MIF、TNFα、およびIl-1βは減少する。
実施例1c

要約(図9参照)
・WKYラットに糸球体腎炎を誘導後4日（デキサメタゾン＋抗体）および6日（抗体のみ）に処置を行う。
・腎損傷の重症度を、一夜（第7日〜第8日）尿回収後および第8日に動物を処分後に評価する(図9参照)。
・抗体RAM9およびデキサメタゾンの組み合わせは強い相乗効果を示す（図10〜12参照）。
−デキサメタゾンの効果は、明らかに＞10倍強まる。

記載した動物モデルは、MIFアンタゴニストおよびステロイドの組み合わせ療法の有益な効果を裏付ける。ステロイド治療は広範囲の治療的適用を有するが、広範な制限がある（高用量での副作用、ステロイド抵抗性など）。ステロイドとMIF抗体の組み合わせ療法は、炎症性疾患、感染性疾患、または癌などの患者における広く新しい治療機会を開く可能性がある。
実施例2

下記モデルは、全身性エリテマトーデスおよびループス腎炎の実験モデルとして当該分野で認識されているNZB/NZW F1マウスを用いる。これらマウスの治療は、ループス腎炎および全身性エリテマトーデスの治療を予測可能であると認識される。MIFアンタゴニストとステロイドの組み合わせによる治療効果の増強を、ループス腎炎のマウスモデルで証明する。種々の濃度のデキサメタゾンを予備実験に用いて準最適ステロイド用量をみいだす(実験2a)。最後に、準最適用量のデキサメタゾンを該抗体と組み合わせ(実施例2b)、この組み合わせは疾患パラメーターの顕著な改善された減少をもたらす。この実験では成熟ハイブリッドマウスを用いる、このマウスは、ヒトの全身性エリテマトーデス（SLE)に良く似た免疫疾患を発現する。雌マウスでは該疾患は約32〜38週齢までに持続的タンパク尿および核酸に対する循環抗体を伴って現れる。
実施例2a
「NZB/NZW F1ハイブリッドマウスにおけるデキサメタゾンの用量決定」

この目的は、ステロイド療法と抗MIF抗体のさらなる相乗性を研究するためのデキサメタゾンの準最適用量を決定することである。

NZB/NZW F1マウスにおける該疾患の確立をタンパク尿を測定することによりモニターし、確認する。マウスがタンパク尿を示したら、動物を種々の用量のデキサメタゾンまたはビークルでi.p.処置する。実験終了時に動物を屠殺し、記録するパラメーターはタンパク尿、糸球体マクロファージ数、および腎組織像である。
グループ1：ビークル
グループ2：デキサメタゾン 0.5ｍｇ／ｋｇ
グループ3：デキサメタゾン 1.0ｍｇ／ｋｇ
グループ4：デキサメタゾン 2.0ｍｇ／ｋｇ
グループ5：組織像コントロール
実施例2b
「NZB/NZW F1ハイブリッドマウスにおける抗MIF RAM9抗体と準最適デキサメタゾン用量の相乗作用」

この実験では、薬剤候補のRAM9抗体と準最適用量のデキサメタゾンの相乗作用を検討する。NZB/NZW F1マウスにおける該疾患の確立をタンパク尿を測定することによりモニターし、確認する。マウスがタンパク尿を示したら、動物をステロイドと抗体で処置する。実験終了時に動物を屠殺し、記録するパラメーターはタンパク尿、糸球体マクロファージ数、および腎組織像である。
「動物グループ」
グループ1：組織像コントロール
グループ2：コントロール抗体BAX C3
グループ3：抗MIF RAM9
グループ4：デキサメタゾン＋コントロール抗体BAX C3
グループ5：デキサメタゾン＋抗MIF RAM9
表2：実験2のまとめ

T細胞性疾患
実施例3a

用いた動物モデルは、DNFB（2,4-ジニトロフルオロベンゾール)に対する遅延型過敏症(DTH)反応の誘導に向けられる。C57Bl/6マウスを、腹部にDNFBを局所適用して感作する。マウスの耳にDNFB溶液を塗布してマウスをチャレンジする。炎症性反応の重症度を、チャレンジ後24時間で耳の厚さをノギスで計って判定する。同時に動物を屠殺して耳を切除し、続く組織学的分析用に保存する。

この動物モデルは、T細胞性免疫反応に関連する疾患、例えば皮膚の炎症（乾癬など）を予測させると当該分野で認識されている。

処置スケジュールは以下の通りである：
T=0d：動物を感作する。
T=5d：抗炎症療法で処置し、マウスをチャレンジする。
T=6d：耳の腫脹を定量し、動物を塗擦し、耳をさらなる組織分析用に回収する。

本実験を上記モデルを用いて実施し、デキサメタゾン用量の決定(実施例1および2の記載と同様に)を行い、RAM9抗体およびヒドロコルチゾンの組み合わせ効果を測定する（局所適用）。

すべての実験は該組み合わせの相乗効果を示す。
実施例3b〜d：接触性過敏症
材料および方法

2,4-ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)に対する接触性過敏症(CHS)反応を、記載した先のモデルを修飾したものを用いて測定した（Ludwig、et al.、2010、Am J Pathol 176、1339-1345参照)。C57BL/6マウスを、75μlのDNFB（Sigma、St. Louis、MO)溶液(アセトン/オリーブ油4/1中0.5％)で剃毛したマウスの背部皮膚を処置して感作した。第5日にマウスを、ヒドロコルチゾン（チャレンジした耳)またはビークル(チャレンジしていない耳)の局所適用、および抗MIF抗体RAM9またはアイソタイプコントロール抗体の静脈内注射で処置した。30分後該マウスの右耳に20μlの0.3％ DNFBをチャレンジし、局所炎症反応を生じさせる。ビークル(アセトン/オリーブ)油をコントロールとして左耳に適用した。右耳および左耳の差を特定してDNFBに対する腫脹反応をチャレンジ後24時間でマイクロメーター(Mitutoyo Co.、Tokyo、Japan)を用いて測定した。1群あたりマウス8匹を用いた。
結果

実施例3b：ヒドロコルチゾンの用量決定

第1実験において、抗体を適用することなく、異なる3用量のヒドロコルチゾン(DACベースクリーム軟膏中0.3％、1％および3％)を適用した。ヒドロコルチゾンを含まないビークルを陰性コントロールとして用いた。1％ヒドロコルチゾンは、耳厚を測定して決定した接触性皮膚炎モデルにおける準最適抗炎症効果をもたらす濃度であることがわかった。

実施例3c：抗MIF抗体RAM9の用量決定

第2実験において、20ｍｇ／ｋｇの抗MIF抗体RAM9を、ヒドロコルチゾンを用いることなく適用し、アイソタイプコントロール抗体を陰性コントロールに用いた。該実験の主な測定項目である耳の腫脹は、抗MIF処置マウスにおいてアイソタイプコントロール抗体または生理食塩水で処置したマウスに比べて有意に減少した。20ｍｇ／ｋｇは有効性の高い用量であったので、10ｍｇ／ｋｇ RAM9を次に実験の準最適用量として用いた。

実施例3d：RAM9（i.v.)およびヒドロコルチゾン(局所)の組み合わせ適用

最後に、マウスを、10ｍｇ／ｋｇアイソタイプコントロール抗体またはRAM9を単独もしくはヒドロコルチゾン(DACベースクリーム中1％)と組み合わせて処置した。結果を図13に示す。アイソタイプコントロール抗体処置マウスは約100μmの耳の腫脹を示した。準最適用量のヒドロコルチゾンとアイソタイプコントロール抗体を組み合わせた局所適用は耳の腫脹を減少させなかった。10ｍｇ／ｋｇ RAM9の単独療法もアイソタイプコントロール抗体と同様の結果をもたらした。しかしながら、耳の厚さはRAM9およびヒドロコルチゾン療法を投与したグループで顕著に減少し、両薬剤には耳の腫脹を最小限にする相乗作用があると結論づけることができる。
結論

まとめると、これらの実験は、接触性皮膚炎のマウスモデルにおける準最適用量のRAM9およびヒドロコルチゾンの治療的相乗作用の証拠を示す。

Claims (13)

1. グルココルチコイド受容疾患の治療に使用するためのグルココルチコイドと抗マクロファージ遊走阻止因子（MIF）抗体とを含む組み合わせ医薬であって、該抗MIF抗体が、配列番号11で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖との組み合わせからなる抗体であり、該グルココルチコイドが、デキサメタゾンまたはヒドロコルチゾンである、組み合わせ医薬。
2. 該グルココルチコイド受容疾患がグルココルチコイドによる治療に反応する請求項1記載の組み合わせ医薬。
3. 炎症、アレルギー、癌、または喘息の治療に使用するための請求項1または2記載の組み合わせ医薬。
4. 該抗体が抗酸化MIF（oxMIF）抗体である、請求項1、2、または3記載の組み合わせ医薬。
5. 該グルココルチコイド受容疾患が、ループス腎炎、糸球体腎炎、IgAまたはIgM腎症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、Henoch-Schoenlein紫斑病、抗GBM腎炎、急速進行性糸球体腎炎（タイプI、II、III、またはIV)、または抗好中球細胞質抗体（ANCA）腎炎である、請求項1〜4のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
6. 該グルココルチコイド受容疾患がループス腎炎である請求項1〜4のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
7. 該グルココルチコイド受容疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項1〜4のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
8. 該グルココルチコイド受容疾患が皮膚の炎症である、請求項1〜4のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
9. 該グルココルチコイド受容疾患がT細胞性免疫反応により生じる、請求項1〜4のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
10. T細胞性免疫反応が、乾癬または接触性過敏症である請求項9記載の組み合わせ医薬。
11. 該グルココルチコイド受容疾患が炎症性腸疾患(IBD)であり、IBDが潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群から選ばれる請求項1〜4のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
12. 該グルココルチコイド受容疾患が多発性硬化症である、請求項1〜4のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
13. 請求項1〜12のいずれかに記載の組み合わせ医薬、および使用説明書を含むキット。

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