JP2016175918A - 抗ｍｉｆ抗体と化学療法剤の併用療法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗ＭＩＦ抗体と化学療法剤を用いた、癌の併用療法の提供。
【解決手段】抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子）抗体と化学療法剤としてのミトキサントロン、ドキソルビシン及び／又はシスプラチンを組み合わせた、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、及び肺癌等の癌治療薬。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗ＭＩＦ抗体、特に、癌の処置における癌治療薬、すなわち化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体の使用に関する。

背景
マクロファージ遊走阻害因子(ＭＩＦ)は、ツベルクリン過敏性モルモットの腹膜滲出細胞(マクロファージを含む)のインビトロでのランダムな遊走を阻害する能力に基づいて、最初に単離されたサイトカインである(Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2; David et al. PNAS 1966, 56, 72-7)。今日、ＭＩＦは、多面的な活性を示す自然免疫応答および後天性免疫応答の重大な上流調節因子として知られている。

ヒトＭＩＦ ｃＤＮＡは1989年にクローン化され(Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6)、そのゲノム局在は染色体22に位置付けられた。ヒトＭＩＦ遺伝子産物は、１１４アミノ酸(Ｎ−末端メチオニン切断後)および約１２.５kDaの見かけの分子量を有するタンパク質である。ＭＩＦは、他の何れのタンパク質とも有意な配列相同性を有さない。このタンパク質は、同一のサブユニットの三量体として結晶化する。各モノマーは、４本鎖βシートとまとまった２本の逆平行αヘリックスを含む。モノマーは、隣接するサブユニットのβシートと相互作用してモノマー間のインターフェースを形成する、さらに２本のβ鎖を有する。３つのサブユニットは、分子の３回軸に沿ってタンパク質の中心を通過する、溶媒が接近可能なチャネルを含むバレルを形成するよう配置される(Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196)。

極低濃度のグルココルチコイドで、マクロファージからのＭＩＦ分泌が誘発されることが報告された(Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71)。しかし、ＭＩＦはまた、グルココルチコイドの作用を対抗制御し、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αやインターロイキンＩＬ−１βなどの他のサイトカインの分泌を刺激する(Baugh et al., Crit Care Med 2002, 30, S27-35)。ＭＩＦはまた、例えば、血管新生促進性、増殖促進性および抗アポトーシス性を示し、それによって腫瘍細胞増殖を促進する(Mitchell, R.A., Cellular Signalling, 2004. 16(1): p. 13-19; Lue, H. et al., Oncogene 2007. 26(35): p. 5046-59)。また、それは、例えばリンパ腫、黒色腫および結腸癌の増殖に直接関連している(Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62)。

ＭＩＦは、多くの病状のメディエーターであり、それゆえに、とりわけ炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、関節リウマチ(ＲＡ)、急性呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、喘息、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、心筋梗塞(ＭＩ)、敗血症および癌を含むがこれらに限定されない多様な疾患に関連している。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗ＭＩＦ抗体が、組み換えヒトＭＩＦに対して開発されている(Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-202; Kawaguchi et al, Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232, and Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 167-78)。

抗ＭＩＦ抗体は、治療的使用が示唆されている。Calandraら (J. Inflamm. (1995); 47, 39-51)は、グラム陰性およびグラム陽性敗血症ショックの実験的誘発から動物を保護するために抗ＭＩＦ抗体を使用したことを報告した。抗ＭＩＦ抗体は、敗血症ショックおよび他の炎症性疾病状態におけるサイトカイン産生を調節するための治療手段として提案された。

US 6,645,493 は、ＭＩＦの生物学的活性を中和するハイブリドーマ細胞から誘導されるモノクローナル抗ＭＩＦ抗体を開示している。マウス由来抗ＭＩＦ抗体は、エンドドキシン誘発ショックの処置に有益な効果を有することが動物モデルで示された。

US 200310235584は、ＭＩＦ遺伝子をホモ接合的にノックアウトした動物中で、ＭＩＦに対する高親和性抗体を製造する方法を開示する。

グリコシル化阻害因子(ＧＩＦ)は、Galatら(Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21)によって記載されたタンパク質である。現在、ＭＩＦおよびＧＩＦは同一であると認識されている。Wataraiら(PNAS 2000, 97, 13251-6)は、Ｔｓ細胞中のＧＩＦの翻訳後修飾の生化学的性質を識別するための、異なるＧＩＦエピトープに結合するポリクローナル抗体を記載している。Wataraiら(上掲)は、ＧＩＦが、インビトロで異なる立体配座のアイソフォームを生じることを報告した。１つのタイプのアイソマーは、１個のシステイン残基の化学修飾によって生じる。化学修飾は、ＧＩＦタンパク質内の立体配座変化を起こす。

過去数十年間、ＭＩＦが関係している医学的疾患および障害の１つが、上で指摘した通り、癌である。癌は、一般的に、種々の経路によって処置され、その１つがいわゆる化学療法剤(抗癌化学療法の基礎である)の使用である。化学療法の基本的な概念は、一般的な意味で、疾患または障害(細菌、ウイルス、寄生虫および癌細胞によって引き起こされる)が、化学化合物によって有効に処置できると仮定する。化学療法の１つの具体的な適応症は、癌である。化学療法剤は、例えば、他の細胞より速く分裂する細胞を殺すことによって作用でき、そうして、一般的に非癌細胞より速く分裂する癌細胞を標的とする。大部分の化学療法剤は、細胞分裂を損なうことによって作用し、すなわち、細胞周期の１つまたは幾つかの段階に作用するため、より速く分裂する細胞を標的にできる。化学療法剤は、細胞分裂阻害剤、すなわち細胞の増殖または分裂を遅くするか、または抑止することができるものであるか；他の化学療法剤は、細胞に損傷を与えて細胞を殺すことができ、この場合にそれらを細胞傷害剤と言う。ほとんどの細胞傷害剤は、それ自体で細胞を殺すのに十分ではないが、プログラム細胞死(アポトーシス)を開始させるための刺激を生じる損傷を与える。

一般的に、化学療法剤の主要なクラスは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼおよび他の抗腫瘍剤である。最も一般的には、上記の通り、これらの薬物は、細胞分裂に影響を及ぼす。また、これらの薬物は、ＤＮＡ合成または機能に影響を及ぼし得る。他の化学療法剤は、ＤＮＡに直接干渉しない。これらは、新しいクラスの化学療法剤であり、シグナル妨害剤と呼ばれ、モノクローナル抗体およびイマチニブメシル酸塩のようなチロシンキナーゼ阻害剤を含む。

求核性官能基をアルキル化するアルキル化剤の例は、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、トロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ダカルバジン、テモゾロミド、マイトマイシンＣおよび他の多くのものである。シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンおよび他の白金含有化合物は、ＤＮＡと安定な複合体を形成する。

細胞傷害性代謝拮抗剤は、葉酸アナログ(例えばメトトレキサート／アミノプテリン、ラルチトレキセド、ペメトレキセド)、プリン(例えば６−メルカプトプリン、アザチオプリン、チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン)またはピリミジン(シタラビン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシルおよびそのプロドラッグ、デアザシチジン)である。代謝拮抗剤は、プリンおよびピリミジンヌクレオチドのデノボ合成における極めて重要な段階を妨害することによってＤＮＡ合成を阻害するか、または、代謝拮抗剤は、細胞周期のＳ期のＤＮＡに組み込まれて、ＤＮＡフォールディング、ＤＮＡ修復またはメチル化を妨害する。あるいは、幾つかの化合物はまた、ＲＮＡに組み込まれる。

植物に由来し、微小管機能を阻止することによって細胞分裂を遮断するアルカロイドおよびテルペノイドの例は、ビンカアルカロイドおよびタキサンである。特によく知られているビンカアルカロイドは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンである。ポドフィロトキシンは、植物誘導化合物のさらなる例である。タキサンの例は、ドセタキセルまたはパクリタキセルである。エストラムスチンは、チューブリンを標的とする合成化合物の例である。

ＤＮＡのトポロジーを維持する酵素の阻害剤であるトポイソメラーゼ阻害剤の例は、イリノテカンおよびトポテカンのようなカンプトテシン(camphtotecin)(トポイソメラーゼ１型阻害剤)、または、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシド(トポイソメラーゼ２型阻害剤)を含む。
最後に、抗腫瘍性挿入剤は、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどを含む。

包括的な概説は、下に示した通り、Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12^th Edition, “General Principles of Cancer Chemotherapy. Introduction”に含まれる。

幾つかの腫瘍は、ホルモン治療に感受性である：グルココルチコイド(例えばプレドニゾロン、デキサメタゾンなど)は、リンパ細胞のアポトーシスを促進する。従って、これらは、典型的な化学療法レジメンに含まれる。同様に、幾つかのタイプの癌は、ホルモン介入に感受性である。これらは、例えば、乳癌、卵巣癌および前立腺癌を含む。ホルモン除去は、受容体の脱感作を誘発してホルモン生産を阻害するゴナドトロピン放出ホルモン受容体アゴニスト(例えばブセレリン、ゴセレリン、リュープロリド、ヒストレリン(hisrelin)など)で、あるいは、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体アンタゴニスト(例えばデガレリクス)で、ゴナドトロピンの下垂体放出を抑制することによって達成できる。あるいは、エストロゲンおよびアンドロゲンの作用は、ホルモン受容体アンタゴニストによって遮断され得る。エストロゲン受容体で部分アゴニストとして作用する化合物(選択的エストロゲン受容体モジュレーター、ＳＥＲＭとも言う)は、タモキシフェン、ラロキシフェンおよびトレミフェンを含む。フルベストラントは、純粋なエストロゲン受容体アンタゴニストの一例である。アンドロゲン受容体は、フルタミド、ビカルタミドおよびシプロテロンなどのアンタゴニストによって遮断できる。最後に、ホルモン除去は、その合成を担う関連の酵素を遮断することによって達成できる。エストロゲンの場合、それはアロマターゼ(CYP19)であり、アミノグルテチミド、ホルメスタン、エキセメスタン、アナストロゾールおよびレトロゾールなどの化合物によって遮断される。アンドロゲン生産は、酵素１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ１７,２０−リアーゼ(CYP17A1)を、アビラテロンで阻害することによって抑制できる。どんなアプローチでホルモン流入を遮断するかにかかわらず、感受性癌細胞の増殖は抑制され、そのアポトーシスが促進される。

化学療法剤は、幾つかの異なる癌のタイプの処置に有用であり、好結果であることが示されているが、化学療法剤のレジメンは、用いられる医薬のタイプによって、様々な副作用を有する。最も一般的な副作用は、致死的な可能性がある感染症に至り得る免疫系の抑制、疲労、貧血、易出血性傾向、嘔気・嘔吐、下痢または便秘のような胃腸障害、および脱毛を含む。さらに、特定の臓器に対する損傷を起こし得て、その結果、心臓損傷、肝臓損傷、腎臓損傷、内耳に対する損傷、末梢神経系に対する損傷および脳機能障害を起こし得る。

これらの副作用は全て、その化学療法剤の投与量を増加させれば、深刻に増大する。薬物の投与量の減少はまた、通常副作用の発生率を低下させ、かつ／または副作用を緩和する。
他の場合において、高用量処置が必要な場合に、化学療法剤の効果が増強または増大することは有益である。
従って、当技術分野で、ある化学療法剤の投与量を減少させることを可能とするおよび／またはある化学療法剤の効果を増強する癌治療の提供が急務のままである。

本発明の説明
この目的は、本発明によって解決される。
特に、抗ＭＩＦ抗体と、ある化学療法剤の併用療法によって、化学療法剤の低投与量での癌の処置が可能となり、かつ／または当該化学療法剤単独でのこの癌の処置と比較して、同様の投与量で、高い効果を達成することが可能となる相乗効果が検出されることが示された。
特に、抗酸化型ＭＩＦ抗体と、ある化学療法剤の併用療法による処置は、上に記戴したおよび本発明の実施例で例示した相乗効果に関連していることが示された。

様々な疾患の発症後に、とりわけ癌の発症後に、ＭＩＦレベル、すなわち全体的ＭＩＦレベルの上昇が、検出される。しかし、健常対象でもＭＩＦは循環しており、そのことが明確な区別を難しくしている。酸化型ＭＩＦは、対照的に、健常対象では存在しない。

ＭＩＦおよびそれに対する抗体の詳細な研究により、抗体RAB9、RAB4およびRAB0、ならびにRAM9、RAM4およびRAM0は、酸化型ＭＩＦに特異的に結合する(そして還元型ＭＩＦに結合できない)ことが判明した。

本発明者らによって行われた先の実験において、酸化的操作、例えばシスチン媒介酸化、ＧＳＳＧ(酸化型グルタチオン)媒介酸化、または、ＭＩＦのProclin300またはタンパク質クロスリンカー(例えばＢＭＯＥ)とのインキュベーションが、ＭＩＦの上記抗体への結合をもたらすことが示された。

本発明者らが到達した驚くべき結論は、次の通りである。
・ 組み換えＭＩＦ(ヒト、マウス、ラット、ＣＨＯ、サル)の酸化還元調節(Ｃｙｓ／Ｇｌｕが媒介する穏やかな酸化)、または、組み換えＭＩＦのProclin300 またはタンパク質クロスリンカーでの処理が、Baxterの抗ＭＩＦ抗体 RAB9、RAB4 および RAB0の結合をもたらす。
・ 酸化型ＭＩＦの還元が、Ａｂ結合喪失をもたらす。
・ 酸化型アイソフォームに対する特異性は、生物学的Ａｂ有効性(特にインビボの)と相関する。
・ 酸化型ＭＩＦレベルは疾病状態と相関し得る。
この(酸化型)ＭＩＦに関するさらなる知識は、本発明者らのさらなる研究の基礎として貢献した。

従って、本発明の好ましい態様は、次の通りである。
１. 癌の処置に使用するための、好ましくはゲムシタビン、シスプラチンおよび／またはドキソルビシンである化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体；
２. 膵癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、および結腸癌、より好ましくは膵癌、前立腺癌および卵巣癌の群から選択される、癌の処置に使用するための、項１に記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体；
３. 抗ＭＩＦ抗体が、抗ＭＩＦ抗体 RAM9、RAM0および／またはRAM4の群から選択される、項１または２に記載の併用；
４. 化学療法剤がゲムシタビンである、項１〜３の何れかに記載の併用療法；
５. 抗ＭＩＦ抗体がRAM9であり、化学療法剤が所望によりシスプラチンと組み合わせたドキソルビシンであり、癌が卵巣癌である、項１〜４の何れかに記載の併用療法；
６. 抗ＭＩＦ抗体がRAM9であり、化学療法剤がゲムシタビンであり、癌が膵癌である、項１〜４の何れかに記載の併用療法；
７. 抗ＭＩＦ抗体がRAM0であり、化学療法剤が所望によりシスプラチンと組み合わせたドキソルビシンであり、癌が卵巣癌である、項１〜４の何れかに記載の併用療法；
８. 抗ＭＩＦ抗体がRAM0であり、化学療法剤がゲムシタビンであり、癌が膵癌である、項１〜４の何れかに記載の併用療法；
９. 抗ＭＩＦ抗体がRAM4であり、化学療法剤が所望によりシスプラチンと組み合わせたドキソルビシンであり、癌が卵巣癌である、項１〜４の何れかに記載の併用療法；
１０. 抗ＭＩＦ抗体がRAM4であり、化学療法剤がゲムシタビンであり、癌が膵癌である、項１〜４の何れかに記載の併用療法；
１１. 抗ＭＩＦ抗体がRAM0であり、化学療法剤がミトキサントロンであり、癌が前立腺癌である、項１〜４の何れかに記載の併用療法；
１２. 項１〜１１の何れかに定義された併用および使用説明書を含むキット；
１３. 癌の処置に使用するための、項１〜１１の何れかに定義された併用、または項１２に記載のキット。

上記抗体は、その配列によりならびに上記抗体RAB0、RAB4およびRAB9それぞれの軽鎖または重鎖の何れかならびにRAM0、RAM4およびRAM9それぞれを含むE. coli中のプラスミドとしての寄託によって特徴づけされ、かつ支持される。

プラスミドは、ブダペスト条約に基づき、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (ＤＳＭＺ), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Germanyに寄託して得られた公式番号であるＤＳＭ番号によって特徴付けられる。プラスミドは、それぞれE. coli株中で寄託した。

DSM 25110の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 RAB4の軽鎖配列を含む。
DSM 25112の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 RAB4の重鎖(IgG4)配列を含む。
適当な宿主細胞中でのプラスミド DSM 25110 および DSM 25112の共発現により、好ましい抗ＭＩＦ抗体 RAB4が生産される。

DSM 25111の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 RAB9の軽鎖配列を含む。
DSM 25113の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 RAB9の重鎖(IgG4)配列を含む。
適当な宿主細胞中でのプラスミド DSM 25111 および DSM 25113の共発現により、好ましい抗ＭＩＦ抗体 RAB9が生産される。

DSM 25114の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 RAB0の軽鎖配列を含む。
DSM 25115の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 RAB0の重鎖(IgG4)配列を含む。
適当な宿主細胞中でのプラスミド DSM 25114 および DSM 25115の共発現により、好ましい抗ＭＩＦ抗体RAB0が生産される。

同様に、RAM0、RAM9およびRAM4の軽鎖および重鎖を、ブダペスト条約に基づき、2012年4月12日に、ＤＳＭＺ(Braunschweig, Germany)に寄託した。下記の記号を用いた：
RAM9 - 重鎖: E. coli GA.662-01.pRAM9hc - DSM 25860.
RAM4 - 軽鎖: E. coli GA.906-04.pRAM4lc - DSM 25861.
RAM9 - 軽鎖: E. coli GA.661-01.pRAM9lc - DSM 25859.
RAM4 - 重鎖: E. coli GA.657-02-pRAM4hc - DSM 25862.
RAM0 - 軽鎖: E. coli GA.906-01.pRAM0lc - DSM 25863.
RAM0 - 重鎖: E. coli GA.784-01.pRAM0hc - DSM 25864.

用語“予防的”または“治療的”処置は、当技術分野で認識されているものであり、対象への薬物の投与をいう。望ましくない状態(例えば対象の疾患または他の望ましくない状態)の臨床的顕在化の前に投与するならば、処置は、予防的であり、すなわち、望ましくない状態の発症から対象を守る。一方、望ましくない状態の顕在化後の投与ならば、処置は、治療的である(すなわち、現存する望ましくない状態またはその副作用を軽減する、改善するまたは維持することを意図する)。

本明細書で用いられるとき、抗(酸化型)ＭＩＦ化合物は、(酸化型)ＭＩＦの生物学的活性を減弱する、阻害する、対抗する、相殺するまたは減少させるあらゆる薬物を言う。抗(酸化型)ＭＩＦ化合物は、(酸化型)ＭＩＦ活性を阻害するかまたは中和する薬物であってよく、例えば抗体であり、特に好ましいのは本明細書に記載された抗体であり、さらにより好ましいのは、抗体 RAB9、RAB4 および／または RAB0である。非常に好ましい抗体は、RAM9、RAM4 および／または RAM0である。

本発明による好ましいＭＩＦアンタゴニストは、抗ＭＩＦ抗体である。さらにより好ましい抗ＭＩＦ抗体は、酸化型ＭＩＦに対する抗体である。他の態様において、抗酸化型ＭＩＦ抗体、例えば上記の抗体またはその抗原結合部分は、１００ｎＭ未満のＫ_Ｄ、好ましくは５０ｎＭ未満のＫ_Ｄ、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満のＫ_Ｄで酸化型ＭＩＦに結合する。非常に好ましくは、抗体は、５ｎＭ未満のＫ_Ｄで酸化型ＭＩＦに結合する。

本発明は、さらに、抗ＭＩＦ抗体またはその抗原結合部分、ならびに、本発明による化学療法剤を含む、キットに関する。キットは、抗体および化学療法剤に加えて、さらなる治療薬およびその使用を含んでよい。また、キットは、治療方法における使用説明書を含み得る。

先の結果より、酸化型ＭＩＦにのみ結合して還元型ＭＩＦに結合せず、さらにＧＣＯおよび／または細胞増殖を阻害する抗ＭＩＦ抗体が、動物モデルで有益な効果を誘発することが示された。

本発明の詳細な説明
本発明は、さらに、添付の図面に記載される。

図１：A2780adr卵巣癌細胞をRAM0 (Ａ) および RAM9 (Ｂ)と組み合わせたドキソルビシンで処置したときのカスパーゼ３レベルの上昇。非処置細胞に対するカスパーゼ３活性の上昇パーセンテージを示す。細胞をヒトアイソタイプコントロールＩｇＧ(コントロールＩｇＧ)、抗ＭＩＦ抗体 RAM0 または RAM9のみ、コントロールＩｇＧとドキソルビシンの組み合わせ(コントロールＩｇＧ＋Dox)、ドキソルビシンのみ(Dox)または抗ＭＩＦ抗体とドキソルビシンの組み合わせ(RAM0＋DoxまたはRAM9＋Dox)で処置した。 図２：ヒト卵巣癌細胞株A2780を用いたシスプラチン依存性細胞死アッセイにおけるインビトロでのRAM0とシスプラチンの組み合わせ。抗体非存在下(抗体なし)またはヒトアイソタイプコントロールＩｇＧまたは抗ＭＩＦ抗体 RAM0存在下でのシスプラチンのＥＣ_５０を示す。データは、９個の独立した実験の平均値±標準偏差である。 図３：ヒト卵巣癌細胞株A2780を用いたマウスの異種移植片モデルにおけるインビボでのRAM0とシスプラチンの組み合わせ。移植したマウスをヒトコントロールＩｇＧまたはRAM0で処置した後の腫瘍重量を示す。抗体は、単独でまたはシスプラチンと組み合わせて適用された。 図４：ヒト前立腺癌細胞株LnCAPを用いたミトキサントロン依存性細胞死アッセイにおけるインビトロでのRAM0とミトキサントロンの組み合わせ。抗体の非存在下(抗体なし)またはヒトアイソタイプコントロールＩｇＧまたは抗ＭＩＦ抗体 RAM0の存在下でのミトキサントロンのＥＣ_５０を示す。１個の値および１０個の独立した実験の平均値±標準偏差を示す。

定義および一般的な方法
本明細書で別途定義しない限り、本発明に関して用いられる科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。一般的に、本明細書で記載された細胞、組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学に関連して用いられる命名法および技術は、当技術分野で周知のものであって、一般的に用いられているものである。本発明の方法および技法は、特記しない限り、一般的に、当技術分野で周知の慣用の方法に従って、本明細書全体で引用され、かつ説明された様々な一般的および具体的引用文献に記載された通りに行われる。例えば Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)(これらは、引用することによって本明細書に組み込まれる)を参照のこと。

“ＭＩＦ”または“マクロファージ遊走阻害因子”は、免疫および炎症応答に重要なメディエーターとして、およびグルココルチコイドの対抗制御因子として知られるタンパク質をいう。ＭＩＦは、哺乳動物ＭＩＦ、特にヒトＭＩＦ (Swiss-Prot primary accession number: P14174)を含み、単量体型は、１１５アミノ酸タンパク質としてコードされるが、最初のメチオニンの切断により、１１４アミノ酸として生産される。また、“ＭＩＦ”は、“ＧＩＦ”(グリコシル化阻害因子)および他の型のＭＩＦ、例えばＭＩＦの融合タンパク質を含む。ＭＩＦのアミノ酸のナンバリングは、Ｎ末端メチオニン(アミノ酸1)から始まり、Ｃ末端アラニン(アミノ酸115)で終わる。

“酸化されたＭＩＦ”または酸化型ＭＩＦは、本発明の目的のために、ＭＩＦを穏やかな酸化剤、例えばシスチンで処理することによって生じるＭＩＦのアイソフォームとして定義される。本発明者らによって示される通り、この方法で処理された組み換え酸化型ＭＩＦは、(例えば)動物を細菌に暴露した後にインビボで生じる酸化型ＭＩＦと構造的再配列を共有するＭＩＦのアイソフォームを含む。

還元型ＭＩＦは、本発明の目的のために、還元されたＭＩＦと定義され、RAB0、RAB9 および／または RAB4 に結合しないＭＩＦである。

本発明で記載された抗酸化型ＭＩＦ抗体は、それぞれ穏やかな酸化または還元によって生じる酸化型ＭＩＦと還元型ＭＩＦを区別することができる。抗酸化型ＭＩＦ抗体は、特異的に酸化型ＭＩＦを検出するのに有用である。これらのコンホーマーの区別は、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴によって評価される。両方の方法は、当業者に周知の通りに、および下に記載した通りに行うことができる。

Biacoreによる抗体の示差的結合の評価
酸化型ＭＩＦおよび還元型ＭＩＦの抗体RAB9およびRAB0への結合速度論は、Biacore 3000 Systemを用いた表面プラズモン共鳴によって調べられる。抗体をＣＭ５(＝カルボキシメチル化デキストラン)チップ上にコートし、０.２％ Proclin300と共にプレインキュベートした組み換えＭＩＦタンパク質を注入した(Proclin300は、酸化イソチアゾロンからなり、酸化型ＭＩＦ構造を安定化する)。ProClin300を添加しない未変性ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液(＝Biacoreランニング緩衝液)中では、組み換えＭＩＦタンパク質は、RAB9、RAB0またはネガティブ(バックグランド)結合コントロールとして用いられる参照抗体(無意味なアイソタイプコントロール抗体)に一切結合しなかった。

好ましい態様において、酸化型ＭＩＦは、抗体RAB9、RAB4および／またはRAB0、またはその抗原結合フラグメントに示差的に結合するＭＩＦであり、すなわち、これらの抗体は酸化型ＭＩＦと結合するが、これらの抗体の何れも還元型ＭＩＦと結合しないことを意味する。

他の態様において、抗酸化型ＭＩＦ抗体、例えば上記の抗体またはその抗原結合部分は、１００ｎＭ未満のＫ_Ｄで、好ましくは５０ｎＭ未満のＫ_Ｄで、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満のＫ_Ｄで酸化型ＭＩＦに結合する。特に好ましくは、本発明の抗体は、５ｎＭ未満のＫ_Ｄで酸化型ＭＩＦに結合する。

上および下で定義した本発明の抗体は、同様の特異性を有する。従って、それらは、本発明者らによって行われた実験で同様の結果を示す。

抗体、例えばRAB9、RAB4またはRAB0、または、RAM9、RAM4またはRAM0の(酸化型ＭＩＦまたは還元型ＭＩＦへの)(非)結合は、一般的に当業者に知られている通りに決定でき、その例は、下記の方法の何れか１つである：還元状態または酸化状態の組み換えＭＩＦでのＥＬＩＳＡ、または、上で記載した周知のBiacoreアッセイのような還元状態または酸化状態の組み換えＭＩＦを用いた表面プラズモン共鳴。

好ましい結合決定方法は、例えば還元型(酸化型)ＭＩＦに対する、抗体の表面プラズモン共鳴であり、ここで、“結合”は、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満のＫ_Ｄを表すことを意味し、一方、還元型ＭＩＦへの非結合は、４００ｎＭより大きいＫ_Ｄによって特徴付けられる。“結合”および“特異的結合”は、本明細書で、上を表すために互換的に用いられる。“示差的結合”は、本明細書の内容において、化合物が、特に本明細書に記載の抗体が、酸化型ＭＩＦに(例えば上記のＫ_Ｄ値で)結合する一方、それらが、還元型ＭＩＦに結合しない(非結合も上で定義している)ことを意味する。

“抗体”は、完全な抗体か、または、(特異的)結合について完全な抗体と競合する抗原結合部分を言う。一般的には、Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (引用により組み込まれる)を参照のこと。用語抗体は、ヒトの抗体、哺乳動物の抗体、単離した抗体および遺伝子工学的な形態、例えばキメラ、ラクダ科／ラクダ化またはヒト化抗体を含み、これらに限定されない。

用語抗体の“抗原結合部分”は、抗原(例えば(酸化型)ＭＩＦ)に特異的に結合する能力を保持する１種以上の抗体フラグメントを言う。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ法によって、または、完全な抗体の酵素切断または化学的切断によって製造され得る。抗原結合部分は、例えば、下記のものを含むが、これらに限定されない：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、および相補性決定領域(ＣＤＲ)フラグメント、一重鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、ポリペプチド、すなわち酸化型または還元型ＭＩＦに対して特異的な抗原結合をするのに十分な抗体の少なくとも一部を含む抗体およびポリペプチド。Ｎ末端からＣ末端までの成熟軽鎖および重鎖の可変ドメインは、領域 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 および FR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)、または、Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。抗体またはその抗原結合部分は、他の機能性分子(例えば他のペプチドまたはタンパク質)に誘導できるかまたは結合できる。例えば、抗体またはその抗原結合部分は、１つ以上の他の分子部分、例えば他の抗体(例えば二重特異性抗体または二特異性抗体)、検出可能な物質、細胞傷害剤、薬物および／または結合分子と機能的に結合できる。

用語“Ｋ_Ｄ”は、本明細書で、当業者の一般的な知識に従って、特定の抗体とその抗原との平衡解離定数を言う。この平衡解離定数は、親和性を測るものである。親和性は、平衡状態(結合が解離と平衡を保っている定常状態)(ここでは酸化型または還元型ＭＩＦと抗体)で、どれほど多くの複合体が形成されているかで決定する。
ｋ_ａ＝結合速度定数[Ｍ^−１ｓ^−１]
ｋ_ｄ＝解離速度定数[ｓ^−１]
Ｋ_Ｄ＝解離平衡定数＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ[Ｍ]

用語“ヒト抗体”は、可変および定常ドメインがヒトの配列である何らかの抗体を言う。本用語は、ヒトの遺伝子から誘導されるが、例えば可能性のある免疫原性を減少させる、親和性を増大させる、望ましくないフォールディングを起こすかもしれないシステインを除くなどの変更をした配列を有する抗体を包含する。本用語は、例えばヒト細胞に典型的でないグリコシル化を授けるはずである、非ヒト細胞で組み換えにより産生したような抗体を包含する。

用語“ヒト化抗体”は、ヒト配列を含み、かつ非ヒト配列も含む抗体を言う。特に、“ヒト化抗体”は、ヒト配列を非ヒト配列に付加しているおよび／またはヒト配列が非ヒト配列に置き換えられている非ヒト抗体を言う。

用語“ラクダ化抗体”は、抗体構造または配列が、ラクダ由来の抗体により酷似するように変更された抗体をいい、ラクダ科抗体とも命名される。ラクダ化抗体の設計および生産は、当業者に一般的な知識の一部である。

用語“キメラ抗体”は、２種以上の異なる種由来の領域を含む抗体を言う。
用語“単離された抗体”または“その単離された抗原結合部分”は、抗体ソース、例えばファージディスプレイライブラリーまたはＢ細胞レパートリーから同定され、選択された、抗体またはその抗原結合部分を言う。

本発明による抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の生産は、遺伝子工学によって、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅および発現ベクターへのクローニングによって、組み換えＤＮＡを作製するあらゆる方法を含む。幾つかの態様において、ベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスのゲノムにライゲートし得る、ウイルスベクターである。幾つかの態様において、ベクターは、導入される宿主細胞中で自己複製できる(例えば細菌由来の複製を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター)。他の態様において、ベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主のゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、動作可能に結合した遺伝子の発現の指示ができる。このようなベクターは、本明細書で“組み換え発現ベクター”(または単に“発現ベクター”)と言う。

抗(酸化型)ＭＩＦ抗体は、とりわけ、慣用の発現ベクター、例えば細菌ベクター(例えばpBR322およびその誘導体)、または、真核生物ベクターによって作製できる。抗体をコードするこれらの配列は、宿主細胞からの複製、発現および／または分泌を制御する制御配列と共に提供され得る。これらの制御配列は、例えばプロモーター(例えばCMVまたはSV40)およびシグナル配列を含む。また、発現ベクターは、選択マーカーおよび増幅マーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(ＤＨＦＲ)、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびチミジンキナーゼも含み得る。用いるベクターの構成要素、例えば選択マーカー、レプリコン、エンハンサーは、商業的に得られるか、または、慣用の方法によって作製できる。ベクターは、様々な細胞培養物、例えば哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、線維芽細胞、昆虫細胞、酵母または細菌、例えばE. coliにおける発現のために構築され得る。幾つかの例において、発現されたタンパク質の最適なグリコシル化を可能とする細胞を用いる。

抗(酸化型)ＭＩＦ抗体軽鎖遺伝子および抗(酸化型)ＭＩＦ抗体重鎖遺伝子は、別のベクターに挿入され得るか、または、これらの遺伝子は、同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法、例えば抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーションによって、または、制限部位が存在しないならば平滑末端ライゲーションによって発現ベクターに挿入される。

抗(酸化型)ＭＩＦ抗体またはその抗原結合フラグメントの作製は、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによるトランスフェクションによって組み換えＤＮＡを真核生物細胞に導入するための当技術分野で既知のあらゆる方法を含む。例えば、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の組み換え発現は、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、１種以上の制御配列、例えば強力なプロモーターの制御下で、適切なトランスフェクション法によって、適当な宿主細胞株に導入することによって達成でき、その結果、ゲノムに安定に組み込まれた導入配列を有する細胞が得られる。リポフェクション法は、本発明に従って用いられ得るトランスフェクション法の一例である。

また、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の製造は、例えば連続的またはバッチ式方法での、形質転換した細胞の培養について当業者に既知のあらゆる方法、および、例えば構成的または導入による抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の発現を含む。抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の生産についてのさらなる参考として、特に、WO 2009/086920を指定する。好ましい態様において、本発明によって生産された抗(酸化型)ＭＩＦ抗体は、酸化型ＭＩＦまたはそのエピトープに結合する。本発明によると、特に好ましい抗体は、抗体 RAB9、RAB4および／またはRAB0、ならびにRAM9、RAM4および／またはRAM0である。

これらの抗体の配列は、一部WO 2009/086920に開示されている。さらに、本出願の配列表および次に示すものを参照のこと。
配列番号１：RAB9の軽鎖のアミノ酸配列

配列番号２：RAB4の軽鎖のアミノ酸配列

配列番号３：RAB0の軽鎖のアミノ酸配列

配列番号４：RAB2の軽鎖のアミノ酸配列

配列番号５：RAB9の重鎖のアミノ酸配列

配列番号６：RAB4の重鎖のアミノ酸配列

配列番号７：RAB0の重鎖のアミノ酸配列

配列番号８：RAB2の重鎖のアミノ酸配列

配列番号９：RAM0hcのアミノ酸配列

配列番号１０：RAM0lcのアミノ酸配列

配列番号１１：RAM9hcのアミノ酸配列

配列番号１２：RAM9lcのアミノ酸配列

配列番号１３：RAM4hcのアミノ酸配列

配列番号１４：RAM4lcのアミノ酸配列

本発明の抗ＭＩＦ抗体は、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体である。抗ＭＩＦ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ分子であり得る。他の態様において、抗ＭＩＦ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスである。他の態様において、抗体は、サブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ４の何れかである。他の態様において、抗体は、サブクラスＩｇＧ４である。幾つかの態様において、ＩｇＧ４抗体は、セリン(セリン228, Kabatナンバリングスキームによる)をプロリンに変更した単一突然変異を有する。従って、ＩｇＧ４のFc領域におけるCPSC部分配列は、ＩｇＧ１の部分配列であるCPPCとなる(Angal et al. Mol Immunol. 1993, 30, 105-108)。

さらに、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の生産は、当技術分野に既知の何らかの抗体精製方法、例えばアニオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによる精製方法を含み得る。一つの態様において、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養物上清から精製できる。

用語ＭＩＦの“中心領域”および“Ｃ末端領域”は、それぞれアミノ酸35〜68およびaa 86〜115を含むヒトＭＩＦの領域、好ましくは、それぞれaa 50〜68およびaa 86〜102のヒトＭＩＦを言う。

本発明の特に好ましい抗体は、aa 50〜68領域またはaa 86〜102領域のヒトＭＩＦの何れかに結合する。また、これは、次の通りに結合するRAB0、RAB4、RAB2およびRAB9、ならびにRAM4、RAM9およびRAM0などの本発明の好ましい抗体にも反映される：
RAB4 および RAM4：aa 86〜102
RAB9 および RAM9：aa 50〜68
RAB0 および RAM0：aa 86〜102
RAB2：aa 86〜102

用語“エピトープ”は、免疫グロブリンまたは抗体フラグメントに特異的に結合できる何らかのタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、通常、分子の化学的に活性な表面の基からなり、例えば、露出したアミノ酸、アミノ糖または他の炭水化物側鎖であって、通常、特異的な３次元構造特性および特異的変電荷特性を有する。

用語“ベクター”は、それが結合している他の核酸を輸送できる核酸分子をいう。幾つかの態様において、ベクターは、プラスミドであり、すなわち、さらなるＤＮＡセグメントをライゲートし得る円形の二重鎖ＤＮＡループである。

用語“宿主細胞”は、発現ベクター導入後に組み換えタンパク質を生産できる細胞株を言う。用語“組み換え細胞株”は、組み換え発現ベクターが導入されている細胞株を言う。“組み換え細胞株”は、特定の対象の細胞株のみならず、当該細胞株の子孫も意味すると理解されるべきである。突然変異または環境的影響の何れかのために後の世代に特定の修飾が生じ得ることから、このような後代は、実際は親細胞と同一ではないが、それでも本明細書で用いられる用語“組み換え細胞株”の範囲内に含まれる。

本発明による宿主細胞のタイプは、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、または、例えばＨＥＫ２９３細胞、または当業者に既知の他の何れかの宿主細胞であり、それ故、例えばE. coli細胞のような細菌の細胞を含む。一つの態様において、抗ＭＩＦ抗体は、G418を選択マーカーとして加えたＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株、例えばDXB11中で発現される。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターがＣＨＯ宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞中で抗体が発現するのに十分な時間または宿主細胞を増殖させた培養培地に抗体を分泌するのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって、抗体を生産する。

抗(酸化型)ＭＩＦ抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収できる。

本発明によって提供される併用療法剤の第２活性成分は、化学療法剤である。
化学療法剤は、一般的な意味で、細菌、ウイルス、寄生虫の感染によって生じるか、または正常な細胞の形質転換(癌)による疾患または障害の処置に使用できる化合物である。化学療法剤の１つの具体的な適応症は、癌である。化学療法剤は、例えば、他の細胞より速く分裂する細胞を殺すことによって作用でき、そうして、一般的に非癌細胞より速く分裂する癌細胞を標的とする。大部分の化学療法剤は、細胞周期の幾つかの段階の１つで細胞分裂を損なうことによって作用する。従って、より速く分裂する細胞を標的にできる。化学療法剤は、細胞分裂阻害剤、すなわち細胞の増殖または分裂を遅くするか、または抑止することができるものであるか；他の化学療法剤は、細胞に損傷を与えて細胞を殺すことができ、この場合にそれらを細胞傷害剤と言う。大部分の細胞傷害剤は、それ自体で細胞を殺すのに十分ではないが、プログラム細胞死(アポトーシス)を開始させるための刺激を生じる損傷を与える。

一般的に、化学療法剤の主要なクラスは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤および他の抗腫瘍剤である。最も一般的には、上記の通り、これらの薬物は、細胞周期の１つまたは幾つかの段階に影響を及ぼす；また、これらの薬物は、ＤＮＡ合成またはＤＮＡ完全性に影響を及ぼし得る。他の化学療法剤は、ＤＮＡに直接干渉しない。これらは、新しいクラスの化学療法剤であり、モノクローナル抗体およびイマチニブメシル酸塩のようなチロシンキナーゼ阻害剤を含む。他の例は、化学療法ホルモン剤およびホルモンアンタゴニストであり、例えばグルココルチコステロイドである。

求核性官能基をアルキル化するアルキル化剤の例は、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、トロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ダカルバジン、テモゾロミド、マイトマイシンＣおよび他の多くのものである。シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンおよび他の白金含有化合物は、ＤＮＡと安定な複合体を形成する。

細胞傷害性代謝拮抗剤は、葉酸アナログ(例えばメトトレキサート／アミノプテリン、ラルチトレキセド、ペメトレキセド)、プリンアナログ(例えば６−メルカプトプリン、アザチオプリン、チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン)、またはピリミジンアナログ(シタラビン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシルおよびそのプロドラッグ、デアザシチジン)である。代謝拮抗剤は、プリンおよびピリミジンヌクレオチドのデノボ合成における極めて重要な段階を妨害することによってＤＮＡ合成を阻害するか、または、代謝拮抗剤が細胞周期のＳ期のＤＮＡに組み込まれて、ＤＮＡフォールディング、ＤＮＡ修復またはメチル化を妨害する。あるいは、幾つかの化合物はまた、ＲＮＡに組み込まれる。

植物から誘導され、微小管機能を阻止することによって細胞分裂を遮断するアルカロイドおよびテルペノイドの例は、ビンカアルカロイドおよびタキサンである。特によく知られているビンカアルカロイドは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンである。ポドフィロトキシンは、植物誘導化合物のさらなる例である。タキサンの例は、ドセタキセルまたはパクリタキセルである。他の例は、アブラキサン、アルブミン結合パクリタキセルである。エストラムスチンは、チューブリンを標的とする合成化合物の例である。

ＤＮＡのトポロジーを維持する酵素の阻害剤であるトポイソメラーゼ阻害剤の例は、イリノテカンおよびトポテカンのようなカンプトテシン(トポイソメラーゼ１型阻害剤)、または、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシド(トポイソメラーゼ２型阻害剤)を含む。
最後に、抗腫瘍挿入剤は、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどを含む。
包括的な概説は、Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12^th Edition, “General Principles of Cancer Chemotherapy”に含まれる。

以下は、アルキル化剤についての例である：
メクロレタミン
シクロホスファミド、イホスファミド
メルファラン
クロラムブシル
プロカルバジン(Ｎ−メチルヒドラジン, ＭＩＨ)
ブスルファン
カルムスチン(ＢＣＮＵ)
ストレプトゾシン
(ストレプトゾトシン)
ベンダムスチン
ダカルバジン(ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド)
テモゾロミド
シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン。

代謝拮抗剤は、以下によって例示される：
メトトレキサート(アメトプテリン)
ペメトレキセド
フルオロウラシル(５−フルオロウラシル；５−ＦＵ)、カペシタビン
シタラビン(シトシン アラビノシド)
ゲムシタビン
５−アザ−シチジン
デオキシ−５−アザ−シチジン
メルカプトプリン(６−メルカプトプリン；６−ＭＰ)
ペントスタチン(２'−デオキシコホルマイシン)
フルダラビン
クロファラビン
ネララビン。

一方、天然産物は、以下から選択できる：
ビンブラスチン
ビノレルビン
ビンクリスチン
パクリタキセル、ドセタキセル
エトポシド
テニポシド
トポテカン
イリノテカン
ダクチノマイシン
(アクチノマイシンＤ)
ダウノルビシン
(ダウノマイシン、ルビドマイシン)
ドキソルビシン
ヨンデリス
ミトキサントロン
ブレオマイシン
マイトマイシンＣ
Ｌ−アスパラギナーゼ。

ホルモン剤およびアンタゴニストについての例は、以下のものである：
ミトタン(o.p'-DDD)
プレドニゾン
カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン
酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール
ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール
タモキシフェン、トレミフェン
アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン
プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン
フルタミド、カソデックス
リュープロリド。

一方、さらなる薬物についての例は、以下のものである：
ヒドロキシウレア
トレチノイン、三酸化ヒ素
ヒストンデアセチラーゼ阻害薬(ボリノスタット)
イマチニブ
ダサチニブ、ニロチニブ
ゲフィチニブ、エルロチニブ
ソラフェニブ
スニチニブ
ラパチニブ
ボルテゾミブ
インターフェロン−α
インターロイキン−２
サリドマイド
レナリドミド
テムシロリムス
エベロリムス。

化学療法剤は、癌の改善および処置に好結果であることが示されている。しかし、大部分の化学療法剤が、ある場合処置を止めなければならない程度まで極度である、一定範囲の副作用を伴う。いずれの場合でも、副作用は、患者の身体および精神の健康にさらなる負担となるために、できるかぎり避けるべきである。

本発明では、化学療法剤を抗ＭＩＦ抗体と組み合わせることによって、いまや、化学療法剤を単一の活性成分として与える状況と比べて、ある処置に必要な化学療法剤の量を減らすことが可能となった。さらに、本発明により可能と成るさらなる可能性は、化学療法剤単独で与える状況と比べて、化学療法剤の投与量を維持し、同時に患者の処置応答を高めることである。

患者の処置応答の向上はまた、例えば化学療法剤の副作用のために高用量での連続的な処置が許容されない場合などに、低用量の化学療法剤と抗ＭＩＦ抗体の組み合わせで、化学療法剤単独と同様の処置応答を達成する可能性を示す。

かなり驚くべきことに、本発明者らによって、化学療法剤の抗ＭＩＦ抗体との組み合わで得られる効果が、抗ＭＩＦ抗体単独または化学療法剤単独のどちらよりもかなり高い処置応答を示すことが示された。

処置応答は、当業者によって容易に決定でき、ある状態をなくすまたは改善するまたは緩和することをいう。当該処置応答を決定する方法は周知であり、例えば、ＭＩＦアンタゴニストまたは化学療法剤の何れか単独で処置された同じ疾患を有する他の患者の生存可能性または寿命と共に、ＭＩＦアンタゴニストおよび化学療法剤の組み合わせで処置された疾患を有する患者の生存可能性または寿命を決定することであるか、あるいは、１人の同一の患者で、一定時間に亘る症状の変化を決定することである。当業者に周知の例は、カプラン・マイヤー・プロットである。

他の方法／アッセイは周知であり、The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12^th Edition, “General Principles of Cancer Chemotherapy. Introduction”のような一般的な教科書から導かれ得る。この参考文献は、引用によって、その全体が組み込まれる；さらなる方法／アッセイは、本願実施例で記載されたものである。

本発明による好ましい化学療法剤は、ドキソルビシンおよびゲムシタビンである。ドキソルビシンは、好ましい態様において、シスプラチンとの組み合わせで用いられ得る。
また、例えば、アブラキサンが好ましい。

特に好ましい組み合わせは、
・抗ＭＩＦ抗体と共に、好ましくはシスプラチンと組み合わせたドキソルビシンによる卵巣癌の処置；または、
・好ましくは抗ＭＩＦ抗体と共に、ゲムシタビンおよび／またはアブラキサンによる膵癌の処置
である。

上記組み合わせの好ましい態様において、抗ＭＩＦ抗体は、RAB9、RAB4およびRAB0の群から選択される。

本明細書の内容において、“癌”は、細胞または細胞群が、非制御増殖、浸潤(隣接組織の侵入および破壊)、および時には転移を示す全ての障害または疾患を包含する。
さらに、好ましい態様において、癌は、ＭＩＦに関連するものであり得る。ＭＩＦ関連癌は、例えば、リンパ腫、肉腫、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巣癌、黒色腫、肝細胞癌、卵巣癌、乳癌および膵癌ならびに子宮内膜症である。

本発明の適用に可能な投与形は、錠剤、カプセル剤、サシェ剤または丸薬である。顆粒剤は、そのまま好ましい投与形として用いられ得るか、カプセルまたはサシェに充填され得るか、あるいは、錠剤または丸薬に圧縮され得る。

本発明の適用に含まれるさらなる投与形は、飲料またはシロップ剤、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、溶液、ヒドロゲル、フィルム、ロゼンジ剤、チューイングガム、口腔内崩壊錠、洗口液、練り歯磨き、リップバーム、薬用シャンプー、ナノスフィア懸濁液およびミクロスフィア錠剤、ならびに、エアロゾル、吸入器、ネブライザー、喫煙用または吸引用(freebase)粉末形態、および、局所適用投与形、例えばクリーム剤、ゲル剤、リニメント剤またはバルム、ローション、軟膏、点耳剤、点眼剤および皮膚用パッチである。

さらに、例えば直腸または膣に用いられ得る坐薬を包含する。全てのこれらの投与形は、当業者に周知である。

本発明に従う好ましい投与形は、顆粒剤、コーティングした顆粒剤、錠剤、腸溶性コーティングした錠剤、ペレット、坐薬およびエマルジョンのような経口投与形である。さらにより好ましくは、顆粒剤および錠剤である。他の好ましい投与形は、非経腸または局所投与形である。抗ＭＩＦ抗体のための特に好ましい投与経路は、皮下適用または静脈内適用である。化学療法剤のための好ましい投与経路は、経口適用(例えば顆粒剤、液体、サシェ剤または錠剤)である。化学療法剤のためのさらに好ましい適用は、局所適用であり、局所適用は、皮膚への適用、および／または鼻用スプレーまたは吸入器のようなスプレーを包含し得る。化学療法剤のためのさらに好ましい投与経路は、静脈内適用または皮下注入による適用(遅延放出製剤を含む)である。
しかし、投与は、原則として全ての既知の経路によりできる。

用語“組み合わせ”または“併用療法”は、本明細書中で、相互交換可能に用いられる。当該用語は、抗ＭＩＦ抗体を、化学療法剤と同時に、または、順次にまたはその逆で、投与する投与レジメンをいう。投与レジメンは、典型的に、化学療法剤について毎日、抗ＭＩＦ抗体について２週間毎である。

好ましい投与レジメンは、次の通りである：上に説明した通り、抗ＭＩＦ抗体を、化学療法剤と同時にまたは順次投与できる。本明細書の内容において、“同時に”は、抗ＭＩＦ抗体の投与と化学療法剤の投与の間が長くても１０分しか経過しないことを意味する。“順次”は、抗ＭＩＦ抗体の投与と化学療法剤の投与の間が１０分より長く経過することを意味する。その時間は、１０分より長くても、３０分より長くても、１時間より長くても、３時間より長くても、６時間より長くても、または、１２時間より長くてもよい。

抗ＭＩＦ抗体および化学療法剤は、原則として、両方の化合物が体内で同じ時間周期の間(特定の期間について)存在することを確実にする方法で投与される。抗ＭＩＦ抗体は典型的に２〜４週間の半減期を、化学療法剤は２〜４８時間の半減期を有する。

従って、上記併用治療はまた、明らかに、対象の各化学療法剤および対象の抗体の周知の半減期を考慮した連続投与レジメンを包含する。抗体が一般的に２〜４週の半減期を有する事実を考慮して、対象の抗体の投与は、２週毎、３週毎または月１回であり得る。本発明の当該抗体との併用療法で投与する化学療法剤は、典型的な態様において、２〜４８時間の半減期を有する。そのため、化学療法剤の投与は、典型的な態様において、５時間毎、６時間毎、１日３回、１日２回、１日１回、週１回または３週に１回であり得る。

しかし、化学療法剤の投与量および本発明に従う抗体との併用投与量は、処置される具体的な障害および罹患した対象の特徴に従って、医師により個別的に決定される必要がある。当業者は、示された化学療法剤におけるそれぞれのガイドラインを知っている。

根治的化学療法における一般的な理解として、望む用量強度を達成するために最も高い耐性用量を適用することを願うであろう。投与量は、毒性があるときのみ減らす(すなわち好中球数＜４０００(しかし＞２５００)＝投与量の半分を投与, シスプラチンまたはシクロホスファミドを参照のこと)。大部分の化学療法剤は、(m)g/m²体表面に基づいて投与される。マウス、ラットおよびヒトの間の耐容性および有効性の違いは、典型的に、投与量を体表面を基準とさせることにより説明される。

特に好ましい態様において、活性成分は、制御放出、例えば遅延放出で送達されるべきである成分である。すなわち、このような活性成分を含む本発明の経口投与可能な投与形には、コーティングが施されてよい。従って、好ましい態様において、本発明は、コーティングを有する顆粒剤に関し、特に、顆粒がコーティングを有することによって、制御された方法で放出される活性成分を含む顆粒剤に関する。

より好ましくは、このコーティングは、薬理学的に許容されるコーティングであり、特に好ましくは、腸溶性コーティング、長時間放出コーティング、または遅延放出コーティングである。全てのこのようなコーティングは、当業者に周知である。

炎症促進性サイトカインＭＩＦ(マクロファージ遊走阻害因子)に対して指向性であるインビボ保護抗ＭＩＦ mAbs (例えばRAB9、RAB4、RAB0)のサブセットは、還元状態の非修飾ＭＩＦに結合しない。これとは対照的に、これらのmAbsは、レドックス依存性ＭＩＦアイソフォームに高い選択性を示した。

特に好ましい抗体は、抗体RAB9である。
他の特に好ましい抗体は、抗体RAB4である。
また、他の特に好ましい抗体は、抗体RAB0である。
非常に好ましい抗体は、抗体RAM9である。

本発明によって示された通り、本明細書で提案された併用療法剤は、両方の成分の相乗効果をもたらす点で有利である。
本発明は、次の実施例によって記載される。当該実施例は、決して本発明を限定すると考えるべきではない。

参照例
Ａ) 抗体スクリーニングのためのＧＣＯアッセイ
ＴＨＰ１懸濁培養物を遠心分離し、細胞を、新しい完全培地中で、細胞密度１０^６細胞/mlで再度懸濁する。この培養物を９６ウェルマイクロプレート(９０μl/ウェル)のウェルに移し、潜在的な抗ＭＩＦ抗体を、最終濃度７５μg/mlとなるよう加える。各抗体について３組試験する。３７℃で一夜インキュベーションした後、デキサメタゾンを濃度２ｎＭとなるよう加え、３７℃で１時間インキュベーションした後、ＬＰＳを加える(最終濃度３ng/ml)。さらに３７℃で６時間インキュベーションした後、上清を集め、ＩＬ−６濃度を市販のＥＬＩＳＡで決定する。３組の結果を平均化し、コントロール抗体と比較したＩＬ−６分泌のパーセンテージを決定する。ＩＬ−６分泌が７５％未満であった抗体をポジティブと評価する。

Ｂ) ＩＣ _５０ 値を決定するためのアッセイ
実験手順は、増加する量の抗体(典型的に１〜１２５ｎＭ)を用いる以外、スクリーニングアッセイについて記載した通りに行う。得られた用量応答曲線は、ネガティブコントロール抗体と比較して％阻害として表される。この曲線を、抗体の最大阻害効果(%Inh max)および最大阻害効果の５０％を示す抗体濃度(ＩＣ_５０)の計算に用いる。

Ｃ) 細胞増殖の阻害
血清が静止状態のNIH/3T3でＭＩＦの分泌を刺激し、次いでＭＩＦが細胞増殖を刺激する。従って、この内因性ＭＩＦを阻害する抗体は、静止状態のNIH/3T3細胞の増殖を減少させる。増殖の減少を、^３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定する。
ウェル当たり１０００個のNIH/3T3細胞を、９６ウェルプレート中、週末の間、３７℃で、１０％ 血清を含む培地中でインキュベートする。次いで、０.５％ 血清を含む培地中でインキュベーションすることによって、細胞を３７℃で一夜飢餓状態にする。０.５％ 培地を除き、１０％ 血清、７５μg/ml 抗体および５μCi/ml ^３Ｈ−チミジンを含む新しい培地に置き換える。ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で１６時間インキュベーションした後、細胞をウェル当たり１５０μｌの冷ＰＢＳで２回洗浄する。マルチチャンネルピペットを用いて、ウェル当たり１５０μｌの５％(w/v) ＴＣＡ溶液を加え、４℃で３０分間インキュベートする。プレートを１５０μｌのＰＢＳで洗浄する。ウェル当たり７５μｌの０.５％ ＳＤＳを含む０.５Ｍ ＮａＯＨ溶液を加え、混合し、室温で保存する。β−カウンター中で、５mlのUltima Gold (Packard)および７５μｌのサンプル溶液を混合することによって、サンプルを測定する。各測定を３組行い、値をｔ−検定によってコントロール抗体の値と比較する。増殖を有意に減少させる(Ｐ＜０.０５)抗体をポジティブと評価する。

Ｄ) 結合試験：抗ＭＩＦ抗体のエピトープ決定
各ペプチドをカップリング緩衝液で希釈して、典型的に１μg/mlのペプチド濃度とし、マイクロプレート(NUNC ImmobilizerTM Amino Plate F96 Clear)に加え、４℃で一夜インキュベートする(１００μｌ／ウェル)。コントロールとして組み換え全長ＭＩＦおよびＰＢＳを用いる。プレートを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、抗体(ＰＢＳ中２〜４μg/ml)を加え(１００μｌ／ウェル)、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートする。プレートを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体(例えばFc特異的抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ標識, Sigma)を加える(１００μｌ／ウェル)。穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベーションした後、プレートを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。各ウェルを、１００μｌのＴＭＢ(３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン)の溶液(T-0440, Sigma)と共に、暗所で３０分間インキュベートする。ウェル当たり１００μｌの１.８Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液を加えることによって、染色反応を停止させる。サンプルを４５０nmで測定する。

Ｅ) Biacoreによる抗ＭＩＦ抗体のFabフラグメントの親和性決定
典型的に、４０ＲＵユニットのヒト組み換えＭＩＦを、ＣＭ５(＝カルボキシメチル化デキストラン)マトリックスを有するセンサーチップ(Biacore)上に固定化する。Fabフラグメントを、ＨＢＳ−ＥＰで希釈された典型的に６〜１００ｎＭの濃度範囲で注入する。各サイクル後、チップを５０ｍＭ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌで再生する。１：１ラングミュアモデルに従って親和性を計算する。

序論：
化学療法剤を用いた癌および過剰増殖性障害の治療は、しばしば、重度の副作用または投与量の必須の増加によって阻まれる。さらに、多くの腫瘍が、化学療法介入に耐性であることが判明している。本発明において、我々は、化学療法化合物(例えばゲムシタビン、ドキソルビシンまたはシスプラチン)の効果が、ＭＩＦアンタゴニスト(例えば抗酸化型ＭＩＦ抗体)との組み合わせによって向上できることを記載する。当該組み合わせは、それぞれの単剤治療と比較して、癌および過剰増殖性障害の改善された治療をもたらし、患者の余命を著しく延長する可能性を有する。

概要

挿入剤と組み合わせた抗ＭＩＦ(ドキソルビシンと抗ＭＩＦ抗体の組み合わせによって例示される)
実施例１：ドキソルビシンおよび抗ＭＩＦ抗体の組み合わせ適用によるドキソルビシン抵抗性ヒト卵巣癌細胞におけるアポトーシスの誘発
インビトロアッセイにおいて、ドキソルビシン耐性A2780adr卵巣癌細胞を、抗ＭＩＦ抗体 RAM9 または RAM0の何れかのみ、または、それとドキソルビシンとの組み合わせで処置した。処置の７２時間後に、カスパーゼ３活性の検出によって、アポトーシスの誘発を評価した。非処置細胞または抗体のみで処置した細胞は、アイソタイプコントロール抗体処置細胞または非処置細胞と比較して、カスパーゼ３活性の上昇を全く示さなかった。ドキソルビシンは、有意ではあるが、少ないカスパーゼ３活性の上昇を誘発した。抗ＭＩＦ抗体およびドキソルビシンの組み合わせは、さらにカスパーゼ３活性を上昇させ、その結果としてアポトーシスの誘発を増進した。この結果は、以前はドキソルビシン耐性であった細胞株が、ＭＩＦ中和抗体との組み合わせ適用によって、この化学療法剤に感受性となったことを示す。RAM0 (図１Ａ)またはRAM9 (図１Ｂ)とドキソルビシンの組み合わせは、同等の結果を生じた。これらの結果から、抗ＭＩＦを代謝拮抗剤と組み合わせたとき、インビボで観察されるカスパーゼ活性の相乗的な上昇が確認された。

アルキル化剤と組み合わせた抗ＭＩＦ(シスプラチンと抗ＭＩＦ抗体の組み合わせによって例示される)
実施例２：抗ＭＩＦ抗体がインビトロでA2780卵巣癌細胞をシスプラチンの作用に感受性とする
シスプラチンと抗ＭＩＦ抗体の相乗効果を、シスプラチン依存性細胞死アッセイで証明した。A2780細胞を、シスプラチンの濃度を増加させながら、５０ｎＭのRAM0またはヒトアイソタイプコントロール抗体の非存在下または存在下でインキュベートした。４８時間インキュベーションした後、細胞をAccutase(商標)で剥離し、カルセイン−ＡＭで標識し、カルセイン蛍光レベルをフローサイトメトリーによって決定した。薬物も抗体も存在しない場合の平均蛍光強度を１に設定して、アッセイ間の変化量を標準化した。平均蛍光強度をシスプラチン濃度に対してプロットし、シスプラチンの最大半量活性濃度(ＥＣ_５０値)を計算した。シスプラチンをRAM0と組み合わせたとき、ＥＣ_５０値が著しく減少した(ｐ＜０.０１)(図２)。単剤治療としての抗ＭＩＦ抗体(シスプラチン非存在下)は、アイソタイプコントロール抗体と比較して、細胞死に全く効果を有さなかった(データ示さず)。

実施例３：抗ＭＩＦ抗体はインビボでA2780卵巣癌細胞をシスプラチンの作用に感受性とする
上に要約したデータは、細胞培養物中で、RAM0は、卵巣癌細胞を、シスプラチンによる細胞死に、より感受性とすることを示した。インビボでも観察できるならば、この効果は高い関連性がある。これを、A2780異種移植片を接種したメスのＭｆ１ヌードマウスで調べた(図３)。マウス(ｎ＝１０／群)に、マトリゲルに再懸濁した１×１０^６個のA2780細胞を接種した。RAM0 (１５mg/kg)またはヒトアイソタイプコントロール抗体(１５mg/kg)を、異種移植片の接種後１日目から開始して、隔日注射した。シスプラチンを、異種移植片接種後２日目から開始して、週１回投与した。シスプラチンは、単剤治療として腫瘍増殖に全く効果を有さなかった。RAM0は、小さく有意でない効果を有した。しかし、RAM0は、腫瘍をシスプラチン処置に感受性とし、シスプラチンおよびRAM0の組み合わせは、著しい腫瘍増殖の減少を示した(ｐ＝０.０４)。

挿入剤／天然薬物と組み合わせた抗ＭＩＦ(ミトキサントロンと抗ＭＩＦ抗体の組み合わせによって例示される)
実施例４：LnCAP前立腺癌細胞は、抗ＭＩＦ抗体 RAM0によってミトキサントロンの細胞傷害作用に感受性となる
ミトキサントロンおよび抗ＭＩＦ抗体の相乗効果を、ミトキサントロン依存性細胞死アッセイで証明した。LnCAP細胞を、ミトキサントロンの濃度を増加させながら、１００ｎＭのRAM0またはヒトアイソタイプコントロール抗体の非存在下または存在下でインキュベートした。４８時間インキュベーションした後、細胞をAccutase(商標)で剥離し、カルセイン−ＡＭで標識し、カルセイン蛍光レベルをフローサイトメトリーによって決定した。薬物も抗体も存在しない場合の平均蛍光強度を１に設定して、アッセイ間の変化量を標準化した。平均蛍光強度をミトキサントロン濃度に対してプロットし、ミトキサントロンの最大半量活性濃度(ＥＣ_５０値)を計算した。１０個の独立したＥＣ_５０値をミトキサントロン／抗体の各々の組み合わせについて決定し(ｎ＝１０)、結果を図４に記載する。ミトキサントロンのみについての平均ＥＣ_５０値を１.６ｎＭと決定した。ミトキサントロンとコントロール抗体の組み合わせでは、同じ平均ＥＣ_５０を得た。しかし、ミトキサントロンをRAM0と組み合わせたとき、平均ＥＣ_５０は０.９７ｎＭまで著しく減少した。単剤治療としての抗ＭＩＦ抗体(ミトキサントロン非存在下)は、アイソタイプコントロール抗体と比較して、細胞死に全く効果を有さなかった(データ示さず)。

結論
ＭＩＦ抗体と標準治療である化学療法剤との組み合わせの強力な効果上昇が上記の様々な実験で示されている。インビトロアッセイにおいて、カスパーゼ活性の上昇によって証明された通り、抗ＭＩＦ抗体と共にインキュベーションすることによってドキソルビシン耐性細胞株をドキソルビシン感受性とした。さらに、抗ＭＩＦ抗体は、インビボモデルで、シスプラチン耐性癌細胞をシスプラチン感受性とした。さらに、インビトロアッセイで、ミトキサントロンおよび抗ＭＩＦ抗体の組み合わせで平均ＥＣ_５０の有意な減少が示された。これは、化学療法剤とＭＩＦ阻害剤との相乗効果の初めての記載である。従って、化学療法剤およびＭＩＦ抗体を用いた併用療法は、化学療法介入の現在の限界を克服でき、過剰増殖性障害を有する患者において、治療結果を改善できる。

Claims (10)

1. 癌の処置に使用するための、化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
2. 膵癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、肺癌および結腸癌、好ましくは膵癌、前立腺癌および卵巣癌からなる群から選択される癌の処置に使用するための、請求項１に記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
3. 抗ＭＩＦ抗体が、抗ＭＩＦ抗体 RAM9、RAM0および／またはRAM4からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
4. 化学療法剤が、ミトキサントロン、ドキソルビシンおよび／またはシスプラチンから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
5. 抗ＭＩＦ抗体がRAM9であり、化学療法剤がシスプラチンと組み合わせてもよいドキソルビシンであり、癌が卵巣癌である、請求項１〜４のいずれかに記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
6. 抗ＭＩＦ抗体がRAM0であり、化学療法剤がシスプラチンと組み合わせてもよいドキソルビシンであり、癌が卵巣癌である、請求項１〜４のいずれかに記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
7. 抗ＭＩＦ抗体がRAM4であり、化学療法剤がシスプラチンと組み合わせてもよいドキソルビシンであり、癌が卵巣癌である、請求項１〜４のいずれかに記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
8. 抗ＭＩＦ抗体がRAM0であり、化学療法剤がミトキサントロンであり、癌が前立腺癌である、請求項１〜４のいずれかに記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体、および使用説明書を含むキット。
10. 癌の処置に使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の化学療法剤と組み合わせた抗ＭＩＦ抗体、または請求項９に記載のキット。

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