KR20160049047A - 항-mif 항체 및 화학요법제의 조합 요법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-MIF 항체, 특히 이를 암 치료에서 치료제, 즉 화학요법제와 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

항-MIF 항체 및 화학요법제의 조합 요법{COMBINATION THERAPY OF ANTI-MIF ANTIBODIES AND CHEMOTHERAPEUTICS}

본 발명은 항-MIF 항체, 특히 이를 암 치료에서 암 치료제, 즉 화학요법제와 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다.

배경

대식세포 이동 억제 인자 (MIF)는 투베르쿨린 과민성 기니 피그 (대식세포를 함유함)로부터의 복막 분비 세포의 시험관내 무작위 이동을 억제하는 이의 능력을 기초로 초기에 단리된 사이토카인이다 (문헌 [Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2]; [David et al. PNAS 1966, 56, 72-7]). 현재, MIF는 다면발현성 활성 스펙트럼을 발휘하는 선천성 및 후천성 면역 반응의 결정적인 상류 조절인자로서 공지되어 있다.

인간 MIF cDNA가 1989년에 클로닝되었고 (문헌 [Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6]), 이의 게놈 위치는 22번 염색체에 지도화되었다. 인간 MIF 유전자의 생성물은 아미노산 114개 (N-말단 메티오닌 절단 후) 및 겉보기 분자량 약 12.5 kDa의 단백질이다. MIF는 어떠한 다른 단백질에 대한 유의한 서열 상동성도 없다. 이러한 단백질은 동일한 소단위들의 삼량체로서 결정화된다. 각각의 단량체는 4-가닥 베타-시트에 대해 패킹(packing)된 2개의 역평행 알파-나선을 함유한다. 단량체는 인접한 소단위의 베타-시트와 상호작용하여 단량체들 사이의 계면을 형성하는 추가적인 2개의 베타-가닥이 있다. 3개의 소단위는 분자의 3회전 축을 따라 단백질의 중심을 통해 이어지는, 용매가 접근가능한 채널을 함유하는 배럴(barrel)을 형성하도록 배열된다 (문헌 [Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196]).

매우 낮은 농도의 글루코코르티코이드에서 대식세포로부터의 MIF 분비가 유도되었음이 보고되었다 (문헌 [Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71]). 그러나, MIF는 또한 글루코코르티코이드의 효과를 역-조절하고, 종양 괴사 인자 TNF-α 및 인터루킨 IL-1 β와 같은 기타 사이토카인의 분비를 자극한다 (문헌 [Baugh et al., Crit Care Med 2002, 30, S27-35]). MIF는 또한, 예를 들어 혈관형성-유발(pro-angiogenic), 증식-유발(pro-proliferative) 및 항-세포자멸사 성질을 나타냄으로써 종양 세포 성장을 촉진하는 것으로 또한 나타났다 (문헌 [Mitchell, R.A., Cellular Signalling, 2004. 16(1): p. 13-19]; [Lue, H. et al., Oncogene 2007. 26(35): p. 5046-59]). 이는 또한 예를 들어 림프종, 흑색종 및 결장암의 성장과 직접적으로 연관된다 (문헌 [Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62]).

MIF는 많은 병리학적 상태의 매개인자이고, 따라서 염증성 장 질환 (IBD), 류머티스성 관절염 (RA), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 천식, 사구체신염, IgA 신장병증, 심근경색 (MI), 패혈증 및 암을 특히 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 질환과 연관된다.

재조합 인간 MIF에 대해 폴리클로날 및 모노클로날 항-MIF 항체가 개발되었다 (문헌 [Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-202]; [Kawaguchi et al, Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232], 및 [Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 167-78]).

항-MIF 항체가 치료 용도에 제안되었다. 문헌 [Calandra et al., J. Inflamm. (1995); 47, 39-51]에 따르면, 항-MIF 항체가 실험적으로 유도된 그람-음성 및 그람-양성 패혈성 쇼크로부터 동물을 보호하는데 사용되었다. 항-MIF 항체는 패혈성 쇼크 및 기타 염증성 질환 상태에서 사이토카인 생산을 조정하는 요법의 수단으로서 제안되었다.

US 6,645,493에는 MIF의 생물학적 활성을 중화하는, 하이브리도마 세포로부터 유래된 모노클로날 항-MIF 항체가 개시되어 있다. 동물 모델에서, 이러한 마우스-유래 항-MIF 항체가 내독소-유도 쇼크의 치료에서 이로운 효과가 있는 것으로 나타날 수 있었다.

US 200310235584에는 MIF 유전자가 동형접합으로 녹-아웃(knock-out)된 동물에서의 MIF에 대한 고친화력 항체를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

글리코실화-억제 인자 (GIF)는 문헌 [Galat et al., Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21]에 기술된 단백질이다. MIF 및 GIF는 현재 동일한 것으로 인지된다. 문헌 [Watarai et al., PNAS 2000, 97, 13251-6]에서, Ts 세포에서의 GIF의 번역후 변형의 생화학적 성질을 확인하기 위한 여러 GIF 에피토프들에 결합하는 폴리클로날 항체들이 기술되었다. 문헌 [Watarai et al., 상기 문헌]에서, GIF가 시험관 내에서 상이한 입체형태적 아이소형(isoform)으로 발생하는 것으로 보고되었다. 한 유형의 이성질체는 단일 시스테인 잔기의 화학적 변형에 의해 발생한다. 이러한 화학적 변형은 GIF 단백질 내에서의 입체형태적 변화에 이른다.

MIF가 지난 수십 년 동안 연루되었던 의학 질환 및 장애 중 하나는 - 상기에서 지적된 바와 같이 - 암이다. 암은 일반적으로 다양한 경로를 통해 치료되고, 이들 중 하나는 소위 화학요법제 (항암 화학요법의 기초임)를 사용하는 것이다. 일반적인 의미에서 화학요법의 기초를 이루는 개념은 질환 또는 장애 (박테리아, 바이러스, 기생충 및 암 세포에 의해 야기됨)가 화학적 화합물에 의해 효과적으로 치료될 수 있다는 것에 있다. 화학요법의 한 특정 적응증은 암이다. 화학요법제는 예를 들어 다른 세포보다 더욱 신속하게 분열되는 세포를 사망시킴으로써 작용할 수 있고, 따라서 통상적으로 비-암성 세포보다 더욱 신속하게 분열되는 암 세포를 표적화할 수 있다. 대부분의 화학요법제 약물은 세포 분열을 손상시킴으로써 작동하고, 즉 세포 주기 중 한 단계 또는 여러 단계에서 작용하며, 따라서 더욱 신속하게 분열되는 세포를 표적화할 수 있다. 화학요법제는 세포정지성(cytostatic)일 수 있고, 즉 세포 성장 또는 분열을 느리게 하거나 폐지시킨다; 다른 화학요법제 약물은 세포에 손상을 일으키고 이를 사망시킬 수 있고, 이러한 경우에 이는 세포독성으로 칭해진다. 대부분의 세포독성 약물은 그 자체로는 세포를 사망시키는데 충분하지는 않지만 예정된(programmed) 세포 사망 (세포자멸사)을 개시시키는 자극을 생성시키는 손상을 가한다.

일반적으로, 화학요법제 약물의 주요 부류는 알킬화제, 항-대사산물, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제(topoisomerase) 및 기타 항-종양 작용제이다. 가장 통상적으로, 상기 언급된 바와 같이, 이러한 약물들은 세포 분열에 영향을 미치고, 이들은 DNA 합성 또는 기능에 또한 영향을 미칠 수 있다. 기타 화학요법제는 DNA를 직접적으로 방해하지 않는다. 이들은 신호 인터셉터(interceptor)로 지칭되는, 화학요법제의 보다 새로운 부류이며, 모노클로날 항체 및 타이로신 키나제(kinase) 억제제 예컨대 이매티닙 메실레이트를 포함한다.

친핵성 관능기를 알킬화하는 알킬화제의 예는 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 트로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴, 로무스틴, 다카르바진, 테모졸로미드, 미토마이신 C 및 기타 등등이다. 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴 및 기타 백금 함유 화합물은 DNA와 안정적인 복합체를 형성한다.

세포독성 항-대사산물은 엽산 유사체 (예를 들어, 메토트렉세이트/아미노프테린, 랄티트렉세드, 페메트렉세드), 퓨린 (예를 들어, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 티오구아닌, 플루다라빈, 클라드리빈) 또는 피리미딘 (시타라빈, 젬시타빈, 5-플루오로우라실 및 이의 전구약물, 데아자사이티딘)이다. 항-대사물질은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 디 노보(de novo) 합성에서의 결정적인 단계를 방해함으로써 DNA-합성을 억제하거나, 또는 세포 주기의 S기 동안 DNA 내로 혼입되고, 여기에서 DNA-폴딩(folding), DNA-복구 또는 메틸화를 방해한다. 별법적으로, 일부 화합물은 RNA 내로 또한 혼입된다.

식물로부터 유래되고 미세관 기능을 방지함으로써 세포 분열을 차단하는 알칼로이드 및 테르페노이드의 예는 빈카-알칼로이드 및 탁산이다. 특히 주지된 빈카-알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신이다. 포도필로톡신은 식물-유래 화합물의 추가적인 예이다. 탁산의 예는 도세탁셀 또는 파클리탁셀이다. 에스트라무스틴은 튜불린을 표적화하는 합성 화합물의 예이다.

DNA의 위상을 유지시키는 효소의 억제제인 토포이소머라제 억제제의 예는 캄프토테신 예컨대 이리노테칸 및 토포테칸 (제1형 토포이소머라제 억제제) 또는 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드 (제2형 토포이소머라제 억제제)를 포함한다.

마지막으로, 항-신생물 삽입제(intercalating agent)의 예는 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신 등을 포함한다.

하기 제시된 바와 같이 문헌 [Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12^th Edition, "General Principles of Cancer Chemotherapy. Introduction"]에 포괄적인 개관이 포함된다.

여러 종양이 호르몬 요법을 받을 수 있다; 글루코코르티코이드 (예를 들어, 프레드니솔론, 덱사메타손 및 기타 등등)는 림프종 세포의 세포자멸사를 촉진한다. 따라서, 이들은 전형적인 화학요법제 체계에 포함된다. 유사하게, 여러 유형의 암이 호르몬 시술을 받을 수 있다. 이는, 예를 들어, 유방암, 난소암 및 전립선암을 포함한다. 수용체의 둔감화를 유도하고 따라서 호르몬 생산을 억제하는 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 작동제 (예를 들어, 부세렐린, 고세렐린, 류프롤리드, 히스렐린 등), 또는 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 길항제 (예를 들어, 데가렐릭스)로 고나도트로핀의 뇌하수체 방출을 억제함으로써 호르몬 제거가 달성될 수 있다. 별법적으로, 에스트로겐 및 안드로겐의 작용이 호르몬 수용체 길항제에 의해 차단될 수 있다; 에스트로겐 수용체의 부분적인 작동제로서 작용하는 화합물 (선택적 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM's)로 또한 지칭됨)은 타목시펜, 랄록시펜 및 토레미펜을 포함한다. 풀베스트란트는 순수한 에스트로겐 수용체 길항제의 예이다. 안드로겐 수용체는 플루타미드, 비칼리타미드 및 시프로테론과 같은 길항제에 의해 차단될 수 있다. 마지막으로, 호르몬 합성을 담당하는 적절한 효소를 차단함으로써 호르몬 제거가 달성될 수 있다. 에스트로겐의 경우, 이는 아미노글루테티미드, 포르메스탄, 엑세메스탄, 아나스트라졸 및 레트로졸과 같은 화합물에 의해 차단되는 아로마타제(aromatase) (CYP19)이다. 아비라테론으로 17 α-히드록실라제(hydroxylase)/C17,20 리아제(lyase) (CYP17A1) 효소를 억제함으로써 안드로겐 생산이 억제될 수 있다. 어떠한 접근법에 의해 호르몬 입력이 차단되는지와 관계없이, 영향을 받을 수 있는 암 세포의 성장이 억제되고, 이의 세포자멸사가 촉진된다.

여러 상이한 암 유형의 치료에서 화학요법제가 유용하고 성공적인 것으로 나타났지만, 화학요법제 체계는 사용된 투약 유형에 따라 광범위한 부작용이 있다. 가장 통상적인 부작용은 면역계 억제를 포함하고, 이는 잠재적으로 치사성 감염, 피로, 빈혈, 쉽게 출혈하는 경향, 위장 곤란, 예컨대 구역 및 구토, 설사 또는 변비 및 모발 손실을 초래할 수 있다. 또한, 특정 장기에 대한 손상이 일어날 수 있고, 이는 예를 들어 심장 손상, 간 손상, 신장 손상, 내이에 대한 손상, 말초 신경계에 대한 손상, 및 뇌 기능장애를 초래한다.

이러한 부작용 모두는 소정의 화학요법제 약물의 투여량이 증진되는 경우에 심각하게 증가된다. 투여되는 약물의 양을 감소시키는 것은 일반적으로 더 낮은 발생률 및/또는 경감된 부작용을 또한 초래할 것이다.

다른 경우에, 고-용량 치료가 필요한 경우에 화학요법제 약물의 효과가 강화 또는 증가될 수 있다면 유리할 것이다.

따라서, 소정의 화학요법제의 투여 용량의 감소를 허용하고/하거나 소정의 화학요법제의 효과를 강화하는 암에 대한 요법을 제공하는 것이 업계에서 여전히 절박하게 요구된다.

발명의 설명

이러한 목표가 본 발명에 의해 해소되었다.

특히, 항-MIF 항체 및 소정의 화학요법제의 조합 요법에 의해 상승작용성 효과가 검출될 수 있고, 이는 암을 화학요법제 단독으로 치료하는 것과 비교하여 암을 더 낮은 투여량의 화학요법제로 치료하는 것 및/또는 유사한 투여량으로 더 높은 효과를 달성하는 것을 허용할 것으로 나타날 수 있었다.

특히, 상기 기술되고 본 발명의 실시예에서 예시된 바와 같이, 항-oxMIF 항체 및 소정의 화학요법제의 조합 요법에 의한 치료가 상승작용성 효과와 연관되는 것으로 나타날 수 있었다.

상승된 MIF 수준, 즉 일반적인 MIF의 수준이 다양한 질환의 발병 후에, 특히 암 발병 후에 검출된다. 그러나, MIF는 건강한 대상체에서도 순환되고, 이는 명확한 구별을 어렵게 만든다. 반면에, oxMIF는 건강한 대상체에서 존재하지 않는다.

MIF 및 이에 대한 항체의 면밀한 연구 후에, 항체 RAB9, RAB4 및 RAB0, 뿐만 아니라 RAM9, RAM4 및 RAM0가 oxMIF에 특이적으로 결합한다는 것 (그리고, redMIF에 결합할 수 없다는 것)이 발견되었다.

본 발명가들에 의해 수행된 이전 실험에서, 산화 절차 예컨대 시스틴-매개 산화, GSSG (ox. 글루타티온)-매개 산화 또는 MIF를 프로클린(Proclin)300 또는 단백질 가교제 (예를 들어 BMOE)와 함께 인큐베이션하는 것이 MIF가 상기 언급된 항체에 결합하는 것을 야기한다는 것이 나타날 수 있었다.

본 발명가들이 도달한 놀라운 결과는 하기와 같다:

· 재조합 MIF (인간, 뮤린(murine), 래트, CHO, 원숭이)의 산화환원 조정 (Cys/Glu-매개 경도 산화) 또는 재조합 MIF를 프로클린300 또는 단백질 가교제로 처리하는 것이 박스터(Baxter)의 항-MIF 항체 RAB9, RAB4 및 RAB0의 결합에 이른다.

· oxMIF의 환원이 Ab 결합의 상실에 이른다.

· oxMIF-아이소형에 대한 특이성이 생물학적 Ab 효능 (특히 생체내)과 상호관련된다.

· oxMIF 수준이 질환 상태와 상호관련될 수 있다.

(ox)MIF에 관한 이러한 추가적인 지식이 본 발명가들의 추가적인 연구의 기초로서의 역할을 하였다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 하기와 같다:

1. 암 치료에서 사용하기 위한, 바람직하게는 젬시타빈, 시스플라틴 및/또는 독소루비신인 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.

2. 제1항에 있어서, 암이 췌장암, 난소암, 전립선암, 유방암, 폐암 및 결장암, 보다 바람직하게는 췌장암, 전립선암 및 난소암의 군으로부터 선택되는, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.

3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-MIF 항체가 항-MIF 항체 RAM9, RAM0 및/또는 RAM4의 군으로부터 선택되는 조합물.

4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 젬시타빈인 조합 요법.

5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM9이고, 화학요법제가 임의적으로 시스플라틴과 조합된 독소루비신이며, 암이 난소암인 조합 요법.

6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM9이고, 화학요법제가 젬시타빈이며, 암이 췌장 암종인 조합 요법.

7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM0이고, 화학요법제가 임의적으로 시스플라틴과 조합된 독소루비신이며, 암이 난소암인 조합 요법.

8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM0이고, 화학요법제가 젬시타빈이며, 암이 췌장 암종인 조합 요법.

9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM4이고, 화학요법제가 임의적으로 시스플라틴과 조합된 독소루비신이며, 암이 난소암인 조합 요법.

10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM4이고, 화학요법제가 젬시타빈이며, 암이 췌장 암종인 조합 요법.

11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM0이고, 화학요법제가 미톡산트론이며, 암이 전립선암인 조합 요법.

12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 조합물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.

13. 암 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 조합물 또는 제12항의 키트.

상기 언급된 항체는 이의 서열, 뿐만 아니라 각각의 상기 언급된 항체 RAB0, RAB4 및 RAB9 각각, 및 RAM0, RAM4 및 RAM9 각각의 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 이. 콜라이(E.coli) 내의 플라스미드로서의 기탁물을 특징으로 하고 이에 의해 지지된다.

이러한 플라스미드들은 독일 브라운슈바이크 마쉐로더 베크 1베 소재의 독일 미생물 및 세포 배양물 선집(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ)에 부다페스트 조약 하에 기탁했을 때 수득된 바와 같은 공인 번호인 이의 DSM 번호를 특징으로 한다. 이러한 플라스미드들은 각각 이. 콜라이 균주 내에서 기탁되었다.

DSM 25110번 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB4의 경쇄 서열을 포함한다.

DSM 25112번 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB4의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.

적절한 숙주 세포에서의 플라스미드 DSM 25110 및 DSM 25112의 공동-발현은 바람직한 항-MIF 항체 RAB4의 생산을 초래한다.

DSM 25111번 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB9의 경쇄 서열을 포함한다

DSM 25113번 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB9의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.

적절한 숙주 세포에서의 플라스미드 DSM 25111 및 DSM 25113의 공동-발현은 바람직한 항-MIF 항체 RAB9의 생산을 초래한다.

DSM 25114번 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB0의 경쇄 서열을 포함한다

DSM 25115번 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB0의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.

적절한 숙주 세포에서의 플라스미드 DSM 25114 및 DSM 25115의 공동-발현은 바람직한 항-MIF 항체 RAB0의 생산을 초래한다.

유사하게, RAM0, RAM9 및 RAM4의 경쇄 및 중쇄가 독일 브라운슈바이크 소재의 DSMZ에 2012년 4월 12일에 부다페스트 조약 하에 유사하게 기탁되었다. 하기의 명칭이 사용되었다:

RAM9 - 중쇄: 이. 콜라이 GA.662-01.pRAM9hc - DSM 25860.

RAM4 - 경쇄: 이. 콜라이 GA.906-04.pRAM4lc - DSM 25861.

RAM9 - 경쇄: 이. 콜라이 GA.661-01.pRAM9lc - DSM 25859.

RAM4 - 중쇄: 이. 콜라이 GA.657-02-pRAM4hc - DSM 25862.

RAM0 - 경쇄: 이. 콜라이 GA.906-01.pRAM0lc - DSM 25863.

RAM0 - 중쇄: 이. 콜라이 GA.784-01.pRAM0hc - DSM 25864.

"예방적" 또는 "치료적" 처치는 업계에 인식되어 있고, 대상체에게 약물을 투여하는 것을 지칭한다. 원치 않는 병태 (예를 들어, 대상체의 질환 또는 기타 원치 않는 상태)의 임상 징후 전에 투여되면, 처치가 예방적이고, 즉 이는 원치 않는 병태가 발달되는 것으로부터 대상체를 보호하는 반면, 원치 않는 병태의 징후 후에 투여되면, 처치가 치료적이다 (즉, 이는 현존하는 원치 않는 병태 또는 이로부터의 부작용을 감소시키거나, 완화하거나 또는 유지시키도록 의도된다).

본원에서 사용된 바와 같이, 항-(ox)MIF 화합물은 (ox)MIF의 생물학적 활성을 약화시키거나, 이를 억제하거나, 이에 대항하거나, 이에 반대로 작용하거나, 이를 감소시키는 임의의 작용제를 지칭한다. 항(ox)MIF 화합물은 (ox)MIF 활성을 억제하거나 중화시키는 작용제, 예를 들어, 항체, 특히 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 항체, 더욱 더 바람직하게는 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0일 수 있다. 매우 바람직한 항체는 RAM9, RAM4 및/또는 RAM0이다.

본 발명에 따른 바람직한 MIF 길항제는 항-MIF 항체이다. 더욱 더 바람직한 항-MIF 항체는 oxMIF에 대한 항체이다. 다른 실시양태에서, 항-oxMIF 항체, 예를 들어, 상기 언급된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 100 nM 미만의 K_D, 바람직하게는 50 nM 미만의 K_D, 보다 더 바람직하게는 10 nM 미만의 K_D로 oxMIF에 결합한다.

매우 바람직하게는, 항체는 5 nM 미만의 K_D로 oxMIF에 결합한다.

본 발명은 추가적으로 항-MIF 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 뿐만 아니라 본 발명에 따른 화학요법제를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 항체 및 화학요법제에 더하여 추가적인 치료제 및 이의 사용을 포함할 수 있다. 키트는 치료 방법에서의 사용 설명서를 포함할 수도 있다.

기존의 결과들은 oxMIF에만 결합하고, redMIF에는 결합하지 않으며, 추가로 GCO 및/또는 세포 증식을 억제하는 항-MIF 항체가 동물 모델에서 이로운 효과를 유도한다는 것을 나타냈다.

발명의 상세한 설명

본 발명이 동봉된 도면에서 추가로 설명된다.

도면 설명:
도 1: A2780adr 난소암 세포를 RAM0 (A) 및 RAM9 (B)와 조합된 독소루비신으로 처리했을 때의 카스파제(Caspase) 3 수준의 상승. 처리되지 않은 세포에 비해 증가된 카스파제 3 활성 백분율이 지시된다. 세포를 인간 아이소타입(isotype) 대조군 IgG (대조군 IgG), 항-MIF 항체 RAM0 또는 RAM9 단독, 대조군 IgG 및 독소루비신의 조합물 (대조군 IgG + Dox), 독소루비신 단독 (Dox), 또는 항-MIF 항체 및 독소루비신의 조합물 (RAM0 + Dox 또는 RAM9 + Dox)으로 처리하였다.
도 2: 인간 난소암 세포주 A2780을 사용하는 시스플라틴-의존적 세포 사망 검정법에서의 RAM0 및 시스플라틴의 시험관내 조합. 항체 부재 (항체 없음) 또는 인간 아이소타입 대조군 IgG 또는 항-MIF 항체 RAM0 존재 하의 시스플라틴의 EC50이 도해된다. 데이터는 9회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다.
도 3: 인간 난소암 세포주 A2780을 사용하는 마우스 이종이식편 모델에서의 RAM0 및 시스플라틴의 생체내 조합. 접종된 마우스를 인간 대조군 IgG 또는 RAM0으로 처리한 후의 종양 중량이 지시된다. 항체는 단독으로 또는 시스플라틴과 조합되어 적용되었다.
도 4: 인간 전립선암 세포주 LnCAP를 사용하는 미톡산트론-의존적 세포 사망 검정법에서의 RAM0 및 미톡산트론의 시험관내 조합. 항체 부재 (항체 없음) 또는 인간 아이소타입 대조군 IgG 또는 항-MIF 항체 RAM0 존재 하의 미톡산트론의 EC50이 도해된다. 단일 값, 뿐만 아니라 10회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차가 제시된다.

정의 및 일반적인 기술

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 지닌다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학과 관련되어 사용되는 명명법 및 이의 기술은 당업계에 주지되어 있고 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이다. 달리 지시되지 않는 한, 업계에 주지되어 있고 본 명세서 전반에 걸쳐 언급 및 논의된 다양한 일반적인 참고문헌 및 더욱 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 본 발명의 방법 및 기술이 일반적으로 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992]), 및 [Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]를 참조하고, 이들은 본원에 참조로 포함된다.

"MIF" 또는 "대식세포 이동 억제 인자"는 면역 및 염증 반응에서 결정적인 매개인로서, 그리고 글루코코르티코이드의 역조절인자로서 공지된 단백질을 지칭한다. MIF는 포유동물 MIF, 특히 단량체 형태가 아미노산 115개의 단백질로서 코딩되지만 개시 메티오닌의 절단으로 인해 아미노산 114개의 단백질로서 생산되는 인간 MIF (스위스-프롯(Swiss-Prot) 1차 승인 번호: P14174)를 포함한다. "MIF"는 "GIF" (글리코실화-억제 인자) 및 MIF의 기타 형태 예컨대 MIF의 융합 단백질을 또한 포함한다. MIF의 아미노산의 번호매김은 N-말단 메티오닌 (아미노산 1)으로 시작하고, C-말단 알라닌 (아미노산 115)으로 끝난다.

"산화형 MIF" 또는 oxMIF는 본 발명의 목적을 위해 MIF를 경도 산화 시약, 예컨대 시스틴으로 처리하는 것에 의해 발생하는 MIF의 아이소형으로서 정의된다. 본 발명가들에 의해 제시된 바와 같이, 이러한 방식으로 처리된 재조합 oxMIF는 (예를 들어) 동물에 박테리아를 시험감염(challenge)시킨 후에 생체 내에서 발생하는 oxMIF와 구조적 재배열을 공유하는 MIF의 아이소형(들)을 포함한다.

redMIF는 본 발명의 목적을 위해 환원형 MIF로서 정의되고, RAB0, RAB9 및/또는 RAB4에 결합하지 않는 MIF이다.

본 발명에 기술된 항-oxMIF 항체는 각각 경도 산화 또는 환원에 의해 생성된 oxMIF와 redMIF를 구별할 수 있다. 항-oxMIF 항체는 oxMIF를 특이적으로 검출하는데 유용하다. 이러한 이형태체(conformer)들의 구별은 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가된다. 양쪽 기술 모두 당업자에게 주지된 바와 같이, 그리고 하기에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

비아코어(Biacore)에 의한 항체의 차별적인 결합의 평가.

비아코어 3000 시스템을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 항체 RAB9 및 RAB0에 대한 oxMIF 및 redMIF의 결합 역학을 시험한다. 항체를 CM5 (= 카르복시메틸화 덱스트란) 칩 상에 코팅하고, 0.2％ 프로클린300과 함께 예비-인큐베이션된 재조합 MIF 단백질을 주입하였다. (프로클린300은 oxMIF 구조를 안정화시키는 산화성 이소티아졸론으로 이루어진다.) 프로클린300이 첨가되지 않은 천연 HBS-EP 완충제 (= 비아코어 수행 완충제)에서는, 재조합 MIF 단백질이 RAB9, RAB0, 또는 음성 (배경) 결합 대조군으로서 사용된 기준 항체 (관련이 없는 아이소타입 대조군 항체)에 결합하지 않았다.

바람직한 실시양태에서, oxMIF는 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0 또는 이의 항원-결합 단편이 차별적으로 결합하는 MIF이고, 이는 이러한 항체들이 oxMIF에 결합하는 한편, 이러한 항체들 중 어느 것도 redMIF에는 결합하지 않는다는 것을 의미한다.

다른 실시양태에서, 항-oxMIF 항체, 예를 들어, 상기 언급된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 100 nM 미만의 K_D, 바람직하게는 50 nM 미만의 K_D, 보다 더 바람직하게는 10 nM 미만의 K_D로 oxMIF에 결합한다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 항체는 5 nM 미만의 K_D로 oxMIF에 결합한다.

상기 및 하기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 항체들은 특이성이 동일하다. 따라서, 이들은 본 발명가들에 의해 수행된 바와 같은 실험들에서 유사한 결과를 나타낸다.

항체, 예를 들어 RAB9, RAB4 또는 RAB0 또는 RAM9, RAM4 또는 RAM0의 (oxMIF 또는 redMIF에 대한) (비-)결합을 당업자에게 일반적으로 공지된 바와 같이 결정할 수 있고, 이의 예는 하기의 방법들 중 어느 하나이다: 환원 또는 산화 상태의 재조합 MIF로의 ELISA, 또는 환원 또는 산화 상태의 재조합 MIF를 사용하는 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 하기 기술된, 주지된 비아코어 검정법.

결합 결정을 위한 바람직한 방법은 예를 들어 재조합 (ox)MIF에 대한 항체의 표면 플라즈몬 공명이고, 이때 "결합"은 100 nM 미만, 바람직하게는 50 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 10 nM 미만의 K_D로 표현되는 것을 의미하는 반면, redMIF에 대한 "비-결합"은 400 nM 초과의 K_D를 특징으로 한다. "결합" 및 "특이적 결합"은 상기를 나타내도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 출원의 문맥에서의 "차별적 결합"은 화합물, 특히 본원에 기술된 바와 같은 항체가 (예를 들어, 상기 언급된 K_D 값으로) oxMIF에 결합하는 한편 redMIF에는 결합하지 않는다 (비-결합도 상기와 같이 정의됨)는 것을 의미한다.

"항체"는 무손상 항체, 또는 (특이적) 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁하는항원-결합 부분을 지칭한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] (참조로 포함됨)를 참조한다. 항체라는 용어는 인간 항체, 포유동물 항체, 단리된 항체, 및 유전자 조작 형태 예컨대 키메라, 낙타류/낙타화 또는 인간화 항체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원 (예를 들어, (ox)MIF)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소에 의한 절단 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 항원-결합 부분은 - 이에 한정되지는 않지만 - 예를 들어 하기의 것들을 포함한다: Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일쇄 항체 (scFv), 키메라 항체, 폴리펩티드, 즉, ox 또는 redMIF에 대한 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 항체의 부분을 적어도 함유하는 항체 및 폴리펩티드. N-말단에서 C-말단으로, 성숙형 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽 모두는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 영역을 포함한다. 아미노산들을 각각의 도메인에 할당하는 것은 문헌 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], [Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)], 또는 [Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 유도체화될 수 있거나 또는 또 다른 기능성 분자 (예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하나 이상의 다른 분자 엔티티(entity), 예컨대 또 다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 또는 디아바디(diabody)), 검출가능한 작용제, 세포독성제, 약제, 및/또는 연결 분자에 기능적으로 연결될 수 있다.

"K_D"라는 용어는 본원에서, 당업자의 일반 지식에 따르면, 특정 항체와 개별적인 항원의 평형 해리 상수를 지칭한다. 이러한 평형 해리 상수는 친화도를 측정한다. 친화도는 평형시 (결합과 해리가 균형을 이루는 정상 상태) 얼마나 많은 복합체가 형성되는지를 결정한다 (이러한 경우 ox 또는 redMIF 및 항체).

ka= 결합 속도 상수 [M-1 s-1]

kd = 해리 속도 상수 [s-1]

KD = 평형 해리 상수 = kd/ka [M]

"인간 항체"라는 용어는 가변 및 불변 도메인이 인간 서열인 임의의 항체를 지칭한다. 이러한 용어는 서열이 인간 유전자로부터 유래되었지만, 예를 들어 가능한 면역원성의 감소, 친화도 증가, 바람직하지 않은 폴딩을 야기할 수 있는 시스테인의 제거 등을 위해, 변화된 항체를 포함한다. 이러한 용어는 비-인간 세포에서 재조합으로 생산된 이같은 항체를 포함하고, 이는, 예를 들어, 인간 세포에 전형적이지 않은 글리코실화를 부여할 수 있다.

"인간화 항체"라는 용어는 인간 서열을 포함하고 비-인간 서열을 또한 함유하는 항체를 지칭한다; 특히, "인간화 항체"는 인간 서열이 비-인간 서열에 부가되고/되거나 비-인간 서열을 대체한 비-인간 항체를 지칭한다.

"낙타화 항체"라는 용어는 항체 구조 또는 서열이 낙타로부터의 항체를 더욱 밀접하게 닮도록 변화된 항체를 지칭하고, 낙타류 항체로 또한 명시된다. 낙타화 항체의 디자인 및 생산 방법은 당업자의 일반 지식의 일부이다.

"키메라 항체"라는 용어는 2개 이상의 상이한 종으로부터의 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.

"단리된 항체" 또는 "이의 단리된 항원-결합 부분"이라는 용어는 항체 공급원 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리 또는 B-세포 레퍼토리로부터 확인 및 선별된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭한다.

본 발명에 따른 항-(ox)MIF 항체의 생산은 유전자 조작에 의한 재조합 DNA 생성을 위한 임의의 방법, 예를 들어, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭 및 발현 벡터 내로의 클로닝에 의한 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 이때 추가적인 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서의 자가 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원이 있는 박테리아 벡터 및 포유동물 에피솜 벡터). 다른 실시양태에서, 벡터 (예를 들어, 포유동물 비-에피솜 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 자신이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "발현 벡터")로 지칭된다.

항-(ox)MIF 항체는 특히 통상적인 발현 벡터, 예컨대 박테리아 벡터 (예를 들어, pBR322 및 이의 유도체), 또는 진핵생물 벡터에 의해 생산될 수 있다. 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포로부터의 복제, 발현 및/또는 분비를 조절하는 조절 서열과 함께 제공될 수 있다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 프로모터 (예를 들어, CMV 또는 SV40) 및 신호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 선별 및 증폭 마커, 예컨대 디히드로폴레이트 리덕타제(reductase) 유전자 (DHFR), 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 및 티미딘-키나제를 또한 포함할 수 있다. 사용된 벡터의 성분, 예컨대 선별 마커, 레플리콘, 인핸서는 상업적으로 수득될 수 있거나, 또는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 다양한 세포 배양물, 예를 들어, 포유동물 세포 예컨대 CHO, COS, HEK293, NSO, 섬유아세포, 곤충 세포, 효모 또는 박테리아 예컨대 이. 콜라이에서의 발현을 위해 벡터가 구축될 수 있다. 일부 경우에, 발현된 단백질의 최적의 글리코실화를 허용하는 세포가 사용된다.

항-(ox)MIF 항체 경쇄 유전자(들) 및 항-(ox)MIF 항체 중쇄 유전자(들)가 별도의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 이러한 유전자들이 동일한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 표준 방법, 예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우의 평활 말단 결찰에 의해 항체 유전자가 발현 벡터 내로 삽입된다.

항-(ox)MIF 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산은 형질감염에 의해 진핵생물 세포 내로 재조합 DNA를 도입하는 것에 대해 업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 전기천공 또는 미세주입을 통한 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도입된 서열이 게놈 내로 안정적으로 통합되는 것을 초래하는 적합한 형질감염 방법에 의해, 하나 이상의 조절 서열 예컨대 강력한 프로모터의 제어 하의 항-(ox)MIF 항체 코딩 DNA 서열을 함유하는 발현 플라스미드를 적절한 숙주 세포주 내로 도입하는 것에 의해 항-(ox)MIF 항체의 재조합 발현이 달성될 수 있다. 리포펙션(lipofection) 방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형질감염 방법의 예이다.

항-(ox)MIF 항체의 생산은 상기 형질전환된 세포의 배양 (예를 들어 연속 또는 배치(batch) 방식), 및 항-(ox)MIF 항체의 발현 (예를 들어, 구성적 발현 또는 유도 시의 발현)을 위한 업계에 공지된 임의의 방법을 또한 포함할 수 있다. 항-(ox)MIF 항체의 생산에 대한 추가적인 참고를 위해 WO 2009/086920을 특히 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생산된 바와 같은 항-(ox)MIF 항체는 oxMIF 또는 이의 에피토프에 결합한다. 특히 바람직한 본 발명에 따른 항체는 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0, 뿐만 아니라 RAM9, RAM4 및/또는 RAM0이다.

이러한 항체들의 서열은 부분적으로 WO 2009/086920에 또한 개시되어 있다; 추가적으로, 본 출원의 서열 목록 및 하기를 참조한다:

서열 1 - RAB9의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 2 - RAB4의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 3 - RAB0의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 4 - RAB2의 경쇄의 아미노산 서열:

서열 5 - RAB9의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 6 - RAB4의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 7 - RAB0의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 8 - RAB2의 중쇄의 아미노산 서열:

서열 9 - RAM0hc의 아미노산 서열:

서열 10 - RAM0lc의 아미노산 서열:

서열 11 - RAM9hc의 아미노산 서열:

서열 12 - RAM9lc의 아미노산 서열:

서열 13 - RAM4hc의 아미노산 서열:

서열 14 - RAM4lc의 아미노산 서열:

본 발명의 항-MIF 항체는 바람직하게는 단리된 모노클로날 항체이다. 항-MIF 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-MIF 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스이다. 다른 실시양태에서, 항체는 IgG1 또는 IgG4 서브클래스이다. 다른 실시양태에서, 항체는 IgG4 서브클래스이다. 일부 실시양태에서, IgG4 항체는 세린 (카밧(Kabat) 번호매김 시스템에 따른 세린228)을 프롤린으로 변화시키는 단일 돌연변이가 있다. 따라서, IgG4의 Fc 영역 내의 CPSC 하위-서열이 IgG1에서의 하위-서열인 CPPC가 된다 (문헌 [Angal et al. Mol Immunol. 1993, 30, 105-108]).

추가적으로, 항-(ox)MIF 항체의 생산은 항체 정제를 위한 업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화 크로마토그래피를 통한 방법을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 항-(ox)MIF 항체가 정제될 수 있다.

MIF의 "중심 영역" 및 "C-말단 영역"이라는 용어는 각각 인간 MIF의 아미노산 35-68 및 아미노산 86-115, 바람직하게 각각 아미노산 50-68 및 아미노산 86 내지 102를 포함하는 인간 MIF의 영역을 지칭한다.

특히 바람직한 본 발명의 항체는 인간 MIF의 아미노산 50-68 영역 또는 아미노산 86-102 영역에 결합한다. 이는 하기와 같이 결합하는 RAB0, RAB4 RAB2 및 RAB9, 뿐만 아니라 RAM4, RAM9 및 RAM0와 같은 바람직한 본 발명의 항체에 의해 또한 반영된다:

RAB4 및 RAM4: 아미노산 86-102

RAB9 및 RAM9: 아미노산 50-68

RAB0 및 RAM0: 아미노산 86-102

RAB2: 아미노산 86 - 102

"에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 항체 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 노출된 아미노산, 아미노 당 또는 기타 탄수화물 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 집단으로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 지닌다.

"벡터"라는 용어는 자신이 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 추가적인 DNA 절편이 내부에 결찰될 수 있는 플라스미드, 즉, 원형 이중 가닥 DNA 루프(loop)이다.

"숙주 세포"라는 용어는 발현 벡터를 도입한 후에 재조합 단백질을 생산할 수 있는 세포주를 지칭한다. "재조합 세포주"라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포주를 지칭한다. "재조합 세포주"는 특정한 대상체 세포주뿐만 아니라 이같은 세포주의 자손을 또한 의미한다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 특정 변형이 후속 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이같은 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용된 바와 같은 "재조합 세포주"라는 용어의 범주 내에 포함된다.

본 발명에 따른 숙주 세포 유형은 예를 들어 COS 세포, CHO 세포, 예를 들어, HEK293 세포, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 숙주 세포이고, 따라서 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포를 또한 포함한다. 한 실시양태에서, DHFR-결핍 CHO 세포주, 예를 들어, DXB11에서 G418을 선별 마커로 첨가하여 항-MIF 항체가 발현된다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 CHO 숙주 세포 내로 도입되면, 숙주 세포에서의 항체 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체 분비를 허용하는데 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다.

표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항-(ox)MIF 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

본 발명이 제공하는 바와 같은 조합 요법의 제2 활성 성분은 화학요법제이다.

일반적인 의미의 화학요법제는 박테리아, 바이러스 또는 기생충 감염으로부터 발생하거나 정상 세포의 형질전환 (암)에 기인하는 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있는 화합물이다. 화학요법의 한 특정한 적응증은 암이다. 화학요법제는 예를 들어 다른 세포보다 더욱 신속하게 분열되는 세포를 사망시킴으로써 작용할 수 있고, 따라서 통상적으로 비-암성 세포보다 더욱 신속하게 분열되는 암 세포를 표적화할 수 있다. 대부분의 화학요법제는 세포 주기의 여러 단계 중 하나에서 세포 분열을 손상시킴으로써 작용한다. 따라서, 이는 더욱 신속하게 분열되는 세포를 표적화할 수 있다. 화학요법제는 세포정지성일 수 있고, 즉 세포 성장 또는 분열을 느리게 하거나 폐지킨다; 다른 화학요법제는 세포 손상 및 사망을 야기할 수 있고, 이러한 경우에 이는 세포독성으로 칭해진다. 대부분의 세포독성 약물은 그 자체로는 세포를 사망시키는데 충분하지는 않지만 예정된 세포 사망 (세포자멸사)을 개시시키는 자극을 생성시키는 손상을 가한다.

일반적으로, 화학요법제 약물의 주요 부류는 알킬화제, 항-대사산물, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 및 기타 항-종양 작용제이다. 가장 통상적으로, 상기 언급된 바와 같이, 이러한 약물들은 세포 주기의 한 단계 또는 여러 단계에 영향을 미치고, 이들은 DNA 합성 또는 DNA 통합성에 또한 영향을 미칠 수 있다. 기타 화학요법제는 DNA를 직접적으로 방해하지 않는다. 이들은 화학요법제의 보다 새로운 부류이며, 모노클로날 항체 및 타이로신 키나제 억제제 예컨대 이매티닙 메실레이트를 포함할 수 있다. 기타 예는 화학요법 호르몬 및 호르몬 길항제, 예를 들어 글루코코르티코스테로이드이다.

친핵성 관능기를 알킬화하는 알킬화제의 예는 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 트로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴, 로무스틴, 다카르바진, 테모졸로미드, 미토마이신 C 및 기타 등등이다. 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴 및 기타 백금 함유 화합물은 DNA와 안정적인 복합체를 형성한다.

세포독성 항-대사산물은 엽산 유사체 (예를 들어, 메토트렉세이트/아미노프테린, 랄티트렉세드, 페메트렉세드), 퓨린 유사체 (예를 들어, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 티오구아닌, 플루다라빈, 클라드리빈) 또는 피리미딘 유사체 (시타라빈, 젬시타빈, 5-플루오로우라실 및 이의 전구약물, 데아자사이티딘)이다. 항-대사물질은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 디 노보 합성에서의 결정적인 단계를 방해함으로써 DNA-합성을 억제하거나, 또는 세포 주기의 S기 동안 DNA 내로 혼입되고, 여기에서 DNA-폴딩, DNA-복구 또는 메틸화를 방해한다. 별법적으로, 일부 화합물은 RNA 내로 또한 혼입된다.

식물로부터 유래되고 미세관 기능을 방지함으로써 세포 분열을 차단하는 알칼로이드 및 테르페노이드의 예는 빈카-알칼로이드 및 탁산이다. 특히 주지된 빈카-알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신이다. 포도필로톡신은 식물-유래 화합물의 추가적인 예이다. 탁산의 예는 도세탁셀 또는 파클리탁셀이다. 또 다른 에는 알부민-결합 파클리탁셀인 아브락산이다. 에스트라무스틴은 튜불린을 표적화하는 합성 화합물의 예이다.

DNA의 위상을 유지시키는 효소의 억제제인 토포이소머라제 억제제의 예는 캄프토테신 예컨대 이리노테칸 및 토포테칸 (제1형 토포이소머라제 억제제) 또는 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드 (제2형 토포이소머라제 억제제)를 포함한다.

마지막으로, 항-신생물 삽입제의 예는 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신 등을 포함한다.

문헌 [Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12^th Edition, "General Principles of Cancer Chemotherapy"]에 포괄적인 개관이 포함된다.

하기는 알킬화제의 예이다:

메클로르에타민

시클로포스파미드 이포스파미드

멜팔란

클로람부실

프로카르바진 (N-메틸히드라진, MIH)

부술판

카무스틴 (BCNU)

스트렙토조신

(스트렙토조토신)

벤다무스틴

다카르바진 (DTIC; 디메틸트리아제놀 미다졸 카르복스아미드)

테모졸로미드

시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴

항-대사물질의 예는 하기와 같다:

메토트렉세이트 (아메토프테린)

페메트렉세드

플루오로우라실 (5-플루오로우라실; 5-FU), 카페시타빈

시타라빈 (사이토신 아라비노시드)

젬시타빈

5-아자-사이티딘

데옥시-5-아자-사이티딘

메르캅토퓨린 (6-메르캅토퓨린; 6-MP)

펜토스타틴 (2'-데옥시코포르마이신)

플루다라빈

클로파라빈

넬라라빈

천연 제품은 하기로부터 선택될 수 있다:

빈블라스틴

비노렐빈

빈크리스틴

파클리탁셀, 도세탁셀

에토포시드

테니포시드

토포테칸

이리노테칸

닥티노마이신

(악티노마이신 D)

다우노루비신

(다우노마이신, 루비도마이신)

독소루비신

욘델리스

미톡산트론

블레오마이신

미토마이신 C

L-아스파라기나제(asparaginase)

호르몬 및 길항제의 예는 하기와 같다:

미토탄 (o.p'DDD)

프레드니손

히드록시프로게스테론 카프로에이트,

메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트

디에틸스틸베스트롤, 에티닐 에스트라디올

타목시펜, 토레미펜

아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄

테스토스테론 프로피오네이트, 플루옥시메스테론

플루타미드, 카소덱스

류프롤리드

추가적인 작용제의 예는 하기와 같다:

히드록시우레아

트레티노인, 3산화비소

히스톤 데아세틸라제(deacetylase) 억제제 (보리노스탯)

이매티닙

다사티닙, 닐로티닙

제피티닙, 에를로티닙

소라페닙

수니티닙

라파티닙

보르테조밉

인터페론-알파,

인터루킨-2

탈리도미드

레날리도미드

템시롤리무스,

에베롤리무스

화학요법제는 암의 경감 및 치료에서 성공적인 것으로 나타났다. 그러나, 대부분의 화학요법제는 일부 경우에는 치료가 중단되어야 할 정도로 극심한 광범위한 부작용과 연관된다. 어떠한 경우에도, 부작용은 환자의 신체 및 정신 건강에 추가적인 부담을 지우고, 따라서 가능한 한 이를 피해야 한다.

본 발명으로, 화학요법제를 항-MIF 항체와 조합함으로써, 화학요법제가 단독 활성 성분으로서 제공되는 상황과 비교하여 소정의 치료에 필요한 화학요법제의 양을 감소시키는 것이 이제 가능하다. 본 발명에 의해 가능해진 추가적인 가능성은 단독으로 제공된 화학요법제와 비교하여 화학요법제의 용량을 유지하면서 환자에서 훨씬 더 높은 치료 반응이 있는 것이다.

환자에서의 이러한 치료 반응 증가는, 예를 들어 화학요법제의 부작용이 더 높은 용량으로의 연속적인 치료를 허용하지 않는 경우에, 항-MIF 항체와 더 낮은 용량의 화학요법제의 조합으로 화학요법제 단독과 같은 치료 반응을 달성하는 가능성을 또한 가리킨다.

화학요법제를 항-MIF 항체와 조합함으로써 수득된 효과가 항-MIF 항체 또는 화학요법제 단독보다 훨씬 더 높은 치료 반응을 나타냈다는 것은 본 발명가들에 의해 꽤 뜻밖이었다.

치료 반응은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 소정의 병태를 감소시키거나 호전시키거나 또는 경감시키는 것을 지칭한다. 이같은 치료 반응을 결정하는 방법은 주지되어 있고, 예를 들어 질환에 걸렸고 MIF 길항제 및 화학요법제의 조합으로 치료된 대상체의 생존 가능성 또는 기간을, 동일한 질환에 걸렸고 어느 한쪽 작용제 단독으로 치료된 다른 대상체에서의 생존 가능성 또는 기간을 이용해 결정하거나, 또는 일정 기간에 걸쳐 1명의 동일한 환자에서의 증상 변화를 결정하는 것에 의할 수 있다. 당업자에게 주지된 예는 카플란-마이어-플롯(Kaplan-Meier-Plot)이다.

기타 방법/검정법이 주지되어 있고, 예를 들어 일반 교과서, 예컨대 문헌 [The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12^th Edition, "General Principles of Cancer Chemotherapy. Introduction"]으로부터 유래될 수 있다. 이러한 참고문헌은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다; 추가적인 방법/검정법은 본 발명의 실시예에 기술된 것들이다.

본 발명에 따른 바람직한 화학요법제는 독소루비신 및 젬시타빈이다. 독소루비신은 바람직한 실시양태에서 시스플라틴과 조합되어 사용될 수 있다.

예를 들어 아브락산이 또한 바람직하다.

특히 바람직한 조합은 하기와 같다:

- 항-MIF 항체와 함께 독소루비신 (바람직하게는 시스플라틴과 조합됨)으로 난소암을 치료하는 것, 또는

- 바람직하게는 항-MIF 항체와 함께 젬시타빈 및/또는 아브락산으로 췌장 암종을 치료하는 것.

상기 조합의 바람직한 실시양태에서, 항-MIF 항체는 RAB9, RAB4 및 RAB0의 군으로부터 선택된다.

본 발명의 문맥에서의 "암"은 세포 또는 일군의 세포가 제어되지 않은 성장, 침습 (침입 및 인접 조직의 파괴)을 나타내고 때로는 전이를 나타내는 모든 장애 또는 질환을 포함한다.

게다가, 바람직한 실시양태에서, 암은 MIF와 관련될 수 있다. MIF-관련 암은 예를 들어 림프종, 육종, 전립선암 및 결장암, 방광암, 췌장암, 난소암, 흑색종, 간세포 암종, 난소암, 유방암 및 췌장암, 뿐만 아니라 자궁내막증이다.

본 출원에 의해 구상되는 가능한 투약 형태는 정제, 캡슐, 사쉐(sachet) 또는 알약이다. 과립은 그대로 바람직한 투약 형태로서 사용될 수 있거나, 캡슐 또는 사쉐 내로 충전될 수 있거나, 또는 정제 또는 알약으로 추가로 압축될 수 있다.

본 출원에 의해 또한 포함되는 추가적인 투약 형태는 드링크 또는 시럽, 엘릭서(elixir), 팅크제(tincture), 현탁액, 용액, 히드로겔, 필름, 로젠지(lozenge), 츄잉검, 경구 붕해성 정제, 구강 세정제, 치약, 입술용 밤(balm), 약용 샴푸, 나노스피어 현탁액 및 마이크로스피어 정제, 뿐만 아니라 에어로졸, 흡입제, 네뷸라이저(nebuliser), 스모킹(smoking) 또는 프리베이스(freebase) 분말 형태 및 국소 도포용 투약 형태 예컨대 크림, 겔, 도찰제 또는 밤, 로션, 연고, 점이제, 점안제 및 피부 패치(patch)이다.

좌약이 또한 포함되고, 이는 예를 들어 직장 또는 질에서 사용될 수 있다. 모든 이러한 투약 형태들은 당업자에게 주지되어 있다.

본 발명에 따른 바람직한 투약 형태는 경구 형태 예컨대 과립, 코팅 과립, 정제, 장용정, 펠릿, 좌약 및 에멀션이다. 과립 및 정제가 더욱 더 바람직하다. 기타 바람직한 투약 형태는 비경구 또는 국소 투여 형태이다. 항-MIF 항체에 대한 특히 바람직한 투여 경로는 피하 또는 정맥내 적용이다. 화학요법제에 대한 바람직한 투여 경로는 경구 적용 (예를 들어, 과립, 액체, 사쉐 또는 정제)이다. 화학요법제에 대한 추가적인 바람직한 적용 형태는 국소 적용이고, 이때 국소 적용은 피부에 적용하는 것 및/또는 분무, 예컨대 코에 분무하는 것 또는 흡입제를 포함할 수 있다. 화학요법제에 대한 추가적인 바람직한 투여 경로는 정맥내 적용 또는 피하 주사를 통한 적용 (저속 방출 제형을 포함함)이다.

그러나 투여는 원칙적으로 모든 공지된 경로에 의한 것일 수 있다.

"조합" 또는 "조합 요법"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이는 항-MIF 항체가 화학요법제와 함께 또는 화학요법제에 이어서 또는 이와 반대로 투여되는 투약 체계를 지칭한다. 이러한 투약 체계는 전형적으로 화학요법제에 대해서는 매일, 항-MIF 항체에 대해서는 2주마다일 것이다. 바람직한 투약 체계는 하기와 같다:

상기 설명된 바와 같이, 항-MIF 항체를 화학요법제(들)와 함께 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 이러한 문맥에서의 "~와 함께"는 항-MIF 항체 투여와 화학요법제 투여 사이에 10분 이하가 경과하였음을 의미한다. "순차적으로"는 항-MIF 항체 투여와 화학요법제 투여 사이에 10분 초과가 경과하였음을 의미한다. 그렇다면 기간은 10분 초과, 30분 초과, 1시간 초과, 3시간 초과, 6시간 초과 또는 12시간 초과일 수 있다.

항-MIF 항체 및 화학요법제는 주로 양쪽 화합물이 반드시 동일한 기간 동안 (특정 시기 동안) 신체 내에 존재하는 방식으로 투약된다. 항-MIF 항체는 반감기가 전형적으로 2-4주이고, 화학요법제는 반감기가 2-48시간이다.

따라서, 상기 조합 요법은 당업자가 각각의 해당 화학요법제 약물 및 해당 항체의 주지된 반감기를 고려하는 순차적인 투약 체계를 또한 명백하게 포함한다. 항체는 일반적으로 반감기가 2-4주라는 사실을 고려하여, 해당 항체의 투여는 2주마다, 3주마다 또는 1개월에 1번뿐일 수 있다. 이같은 항체와 함께 본 발명의 조합 요법에서 투여될 화학요법제 약물은 전형적인 실시양태에서 반감기가 2-48시간이다; 따라서, 전형적인 실시양태에서 화학요법제의 투여는 5시간마다, 6시간마다, 하루에 3번, 하루에 2번, 하루에 1번, 일주일에 1번, 또는 3주에 1번 주기일 수 있다.

그러나, 본 발명에 따라 화학요법제를 투약하는 것, 뿐만 아니라 항체와 조합하여 투약하는 것은 치료될 특정 장애 및 괴로워하는 대상체의 특성에 따라 사례별 기준으로 의사에 의해 결정될 필요가 있을 것이다. 당업자는 소정의 화학요법제에 대한 각각의 지침에 정통하다.

치유적 화학요법에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 원하는 용량 강도를 달성하기 위해 가장 높은 허용 용량을 적용하기를 바랄 것이다. 독성이 있는 경우에만 용량이 감소된다 (즉, 호중구 계수 < 4000 (그러나 >2500) = 절반 용량 투여; 시스플라틴 또는 시클로포스파미드 참조). 대부분의 화학요법제는 g (㎎)/체표면적 ㎡을 기초로 투여된다. 마우스, 래트 및 인간 사이의 내성 및 효능 차이는 체표면적을 기초로 하여 용량을 정하는 것에 의해 전형적으로 설명된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 활성 성분은 제어 방출, 예를 들어 지연 방출로 전달되어야 하는 성분일 것이다. 즉, 이같은 활성 성분을 포함하는 본 발명의 경구 투여가능한 투약 형태에 코팅이 제공될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 코팅이 있는 과립, 특히 제어 방식으로 방출되어야 하는 활성 성분을 포함하고, 이에 의해 코팅이 있는 과립에 관한 것이다.

보다 바람직하게는, 이러한 코팅은 약리학상 허용되는 코팅이고, 장용 코팅, 장기 방출 코팅 또는 지연 방출 코팅이 특히 바람직하다; 모든 이같은 코팅은 당업자에게 주지되어 있다.

염증유발성 사이토카인 MIF (대식세포 이동 억제 인자)에 대해 유도되는 생체내 보호 항-MIF mAb (예를 들어 RAB9, RAB4, RAB0)의 부분집합은 환원 상태의 미변형 MIF에 결합하지 않는다. 반면에, 이러한 mAb들은 산화환원 의존적 MIF 아이소형에 대해 고도로 선택적인 것으로 나타났다.

특히 바람직한 항체는 항체 RAB9이다.

또 다른 특히 바람직한 항체는 항체 RAB4이다.

또 다른 특히 바람직한 항체는 항체 RAB0이다.

매우 바람직한 항체는 항체 RAM9이다.

본 발명에 의해 제시된 바와 같이, 본원에서 제안된 조합 요법은 양쪽 성분의 상승작용성 효과를 초래한다는 점에서 유리하다.

본 발명이 하기에서 예를 들어 기술될 것이고, 이에 의해 실시예는 결코 본 발명을 한정하는 것으로서 간주되지 않아야 한다.

참고 예

A) 항체 스크리닝을 위한 GCO-검정법:

THP1 현탁 배양물을 원심분리하고, 세포를 신선한 전체 배지에 10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 재현탁시킨다. 이러한 배양물을 96웰 마이크로플레이트의 웰로 옮기고 (90 ㎕/웰), 잠재적인 항-MIF 항체를 75 ㎍/㎖의 최종 농도를 제공하도록 첨가한다. 각각의 항체를 3회 되풀이하여 테스트한다. 37℃에서의 철야 인큐베이션 후, 덱사메타손을 2 nM의 농도를 제공하도록 첨가하고, 37℃에서의 1시간 인큐베이션 후, LPS를 첨가한다 (3 ng/㎖ 최종 농도). 37℃에서 추가로 6시간 동안 인큐베이션한 후, 상청액을 수거하고, 시판되는 ELISA에서 IL-6 농도를 결정한다. 3회 되풀이한 결과를 평균화하고, 대조군 항체와 비교하여 IL-6 분비 백분율을 결정한다. 75％ 미만의 IL-6 분비를 초래하는 항체가 양성으로서 평가된다.

B) IC ₅₀ 값을 결정하기 위한 검정법

증가되는 양의 항체 (전형적으로 1 - 125 nM)가 사용된다는 것을 제외하고는 스크리닝 검정법에 대해 시술된 바와 같이 실험 절차를 수행한다. 생성된 용량 반응 곡선은 음성 대조군 항체에 비교된 억제 ％로서 표현된다. 이러한 곡선이 항체의 최대 억제 효과 (최대 억제 ％) 및 최대 억제 효과의 50％를 나타내는 항체 농도 (IC₅₀)의 계산에 사용된다.

C) 세포 증식의 억제

혈청은 휴지 중인 NIH/3T3에서 MIF의 분비를 자극하고, 차례로 MIF는 세포 증식을 자극한다. 따라서, 이러한 내인성 MIF를 억제하는 항체는 휴지 중인NIH/3T3 세포의 증식을 감소시킨다. ³H-티미딘의 혼입에 의해 증식 감소가 결정된다.

웰 당 1000개의 NIH/3T3 세포를 10％ 혈청을 함유하는 배지에서 주말에 걸쳐 37℃에서 96웰 플레이트에서 인큐베이션한다. 그 후, 0.5％ 혈청을 함유하는 배지에서의 인큐베이션에 의해 철야로 37℃에서 세포를 굶주리게 하였다. 0.5％ 배지를 제거하고, 10％ 혈청, 75 ㎍/㎖ 항체 및 5 μCi/㎖의 3H-티미딘을 함유하는 신선한 배지로 교체한다. 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 16시간 인큐베이션한 후, 세포를 웰 당 150 ㎕의 저온 PBS로 2회 세정한다. 다중 채널 피펫을 사용하여, 웰 당 150 ㎕의 5％ (w/v) TCA 용액을 첨가하고, 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 150 ㎕의 PBS로 세정한다. 웰 당 75 ㎕의 0.5M NaOH 용액 + 0.5％ SDS를 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 보관한다. 5 ㎖의 울티마 골드(Ultima Gold) (패커드(Packard)) 및 75 ㎕ 샘플 용액을 혼합함으로써 β-계수기에서 샘플을 측정한다. 각각의 결정을 3회 되풀이하여 수행하고, 값을 t-테스트에 의해 대조군 항체의 값과 비교한다. 유의하게 증식을 감소시킨 항체 (P<0.05)가 양성으로서 평가된다.

D) 결합 연구: 항-MIF 항체의 에피토프 결정

각각의 펩티드를 전형적으로 1 ㎍/㎖의 펩티드 농도를 제공하도록 커플링 완충제에서 희석하고, 마이크로플레이트 (눈크 이모빌라이저™ 아미노 플레이트 F96 클리어(NUNC Immobilizer™ Amino Plate F96 Clear))에 첨가하고, 철야로 4℃에서 인큐베이션한다 (100 ㎕/웰). 대조군으로서, 재조합 전장 MIF 및 PBS가 사용된다. 플레이트를 200 ㎕ PBST로 3회 세정하고, 항체 (PBS 내의 2-4 ㎍/㎖)를 첨가하고 (100 ㎕/웰), 부드럽게 진탕하면서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 플레이트를 200 ㎕ PBST로 3회 세정하고, 검출 항체 (예를 들어 Fc 특이적 항-인간 IgG/HRP 표지됨, 시그마(Sigma))를 첨가한다 (100 ㎕/웰). 부드럽게 진탕하면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 200 ㎕ PBST로 3회 세정한다. 각각의 웰을 100 ㎕ TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액 (T-0440, 시그마)과 함께 30분 동안 암실에서 인큐베이션한다. 웰 당 100 ㎕의 1.8 M H₂SO₄-용액을 첨가함으로써 염색 반응을 정지시킨다. 450 nm에서 샘플을 측정한다.

E) 비아코어에 의한 항-MIF 항체의 Fab 단편의 친화도 결정

전형적으로, 40 RU 유닛의 인간 재조합 MIF를 CM5 (= 카르복시메틸화 덱스트란) 매트릭스 (비아코어)가 있는 센서 칩 상에 고정시킨다. HBS-EP에 희석된 전형적으로 6 - 100 nM의 농도 범위로 Fab 단편을 주입한다. 각각의 사이클 후, 50 mM NaOH + 1 M NaCl로 칩이 재생된다. 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 따라 친화도를 계산한다.

실시예

서론:

종종 심각한 부작용 또는 투여량 증가 요구가 화학요법제 약물을 사용하는 암 및 과증식성 장애의 치료법을 방해한다. 또한, 다수의 종양이 화학요법제 시술에 대해 저항성인 것으로 입증되었다. 본 발명에서, 화학요법제 화합물 (예를 들어, 젬시타빈, 독소루비신, 또는 시스플라틴)의 유효성이 MIF 길항제 (예를 들어 항-oxMIF 항체)와의 조합에 의해 증가될 수 있다는 것이 기술된다. 이같은 조합은 각각의 단독요법과 비교하여 암 및 과증식성 장애의 개선된 치료법을 초래할 잠재력 및 환자의 기대 수명을 유의하게 연장할 잠재력이 있다.

개론

삽입제와 조합된 항-MIF

(항-MIF 항체와 독소루비신의 조합에 의해 예시됨)

실시예 1: 독소루비신 및 항-MIF 항체의 조합 적용에 의한 독소루비신-저항성 인간 난소암 세포에서의 세포자멸사 유도:

시험관내 검정법에서, 독소루비신 저항성 A2780adr 난소암 세포를 항-MIF 항체 RAM9 또는 RAM0 단독으로 또는 이와 독소루비신을 조합하여 처리하였다. 72시간 처리 후에 카스파제 3 활성의 검출에 의해 세포자멸사 유도를 평가하였다. 처리되지 않은 세포 또는 항체 단독으로 처리된 세포는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 세포 또는 미처리 세포와 비교하여 어떠한 강화된 카스파제 3 활성도 나타내지 않았다. 독소루비신은 유의하지만 미미한 강화된 카스파제 3 활성을 유도하였다. 항-MIF 항체 및 독소루비신의 조합은 카스파제 3 활성, 따라서 세포자멸사 유도를 더욱 강화하였다. 결과는 이전의 독소루비신 저항성 세포주가 MIF 중화 항체와의 조합 적용에 의해 이러한 화학요법 약물에 대해 민감성이게 된다는 것을 나타낸다. 독소루비신과 RAM0 (도 1a) 또는 RAM9 (도 1b)의 조합이 유사한 결과를 제공하였다. 이러한 결과들은 항-MIF가 항-대사물질과 조합될 때 생체 내에서 관찰된 상승작용적으로 증가된 카스파제 활성을 입증한다.

알킬화제와 조합된 항-MIF

(항-MIF 항체와 시스플라틴의 조합에 의해 예시됨)

실시예 2: 항-MIF 항체가 시험관 내에서 시스플라틴의 작용에 대해 A2780 난소암 세포를 민감화시킨다:

시스플라틴 및 항-MIF 항체의 상승작용성 효과가 시스플라틴-의존적 세포 사망 검정법에서 실연되었다. A2780 세포를 50 nM RAM0 또는 인간 아이소타입 대조군 항체의 부재 또는 존재 하에 증가되는 농도의 시스플라틴과 함께 인큐베이션하였다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 아큐타제(Accutase)™로 탈착시키고, 칼세인-AM으로 표지하고, 칼세인 형광 수준을 유동 세포측정법으로 결정하였다. 어떠한 약물 또는 항체도 없을 때의 평균 형광 강도를 1로 설정하여 검정법들 사이의 변동에 대해 표준화하였다. 평균 형광 강도를 시스플라틴 농도에 대해 블롯팅(blotted)하였고, 시스플라틴의 절반 최대 활성 농도 (EC50-값)를 계산하였다. 시스플라틴이 RAM0과 조합되었을 때 EC50-값이 유의하게 감소되었다 (p<0.01) (도 2). 단독요법으로서의 항-MIF 항체 (시스플라틴 부재)는 아이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포 사망에 대한 효과가 없었다 (데이터는 제시되지 않음).

실시예 3: 항-MIF 항체가 생체 내에서 시스플라틴의 작용에 대해 A2780 난소암 세포를 민감화시킨다:

상기 요약된 데이터는 세포 배양에서 RAM0이 난소암 세포를 시스플라틴에 의한 세포 사망에 대해 더욱 감수성이게 하였다는 것을 요약하였다. 이러한 효과는, 특히 생체 내에서 또한 관찰될 수 있다면, 매우 적절하다. 이를 A2780 이종이식편이 접종된 암컷 Mf1 누드 마우스에서 탐구하였다 (도 3). 마우스 (n= 군 당 10마리)에 매트리겔에 재현탁된 1×10⁶개의 A2780 세포를 접종하였다. RAM0 (15 ㎎/㎏) 또는 인간 아이소타입 대조군 항체 (15 ㎎/㎏)를 이종이식편을 접종하고 나서 1일 후에 시작하여 2일마다 주사하였다. 이종이식편 접종 후 제2일에 시작하여 일주일에 1번 시스플라틴을 투여하였다. 시스플라틴은 단독요법으로서 종양 성장에 대한 어떠한 효과도 없었다. RAM0은 미미하지만 유의한 효과가 있었다. 그러나, RAM0은 시스플라틴 처리에 대해 종양을 민감화시켰고, 시스플라틴 및 RAM0의 조합은 유의하게 감소된 종양 성장을 나타냈다 (p=0.04).

삽입제/천연 작용제와 조합된 항-MIF

(항-MIF 항체와 미톡산트론의 조합에 의해 예시됨)

실시예 4: 항-MIF 항체 RAM0에 의해 미톡산트론의 세포독성 작용에 대해 LnCAP 전립선암 세포가 민감화된다:

미톡산트론 및 항-MIF 항체의 상승작용성 효과가 미톡산트론-의존적 세포 사망 검정법에서 실연되었다. LnCAP 세포를 100 nM RAM0 또는 인간 아이소타입 대조군 항체의 부재 또는 존재 하에 증가되는 농도의 미톡산트론과 함께 인큐베이션하였다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 아큐타제™로 탈착시키고, 칼세인-AM으로 표지하고, 칼세인 형광 수준을 유동 세포측정법으로 결정하였다. 어떠한 약물 또는 항체도 없을 때의 평균 형광 강도를 1로 설정하여 검정법들 사이의 변동에 대해 표준화하였다. 평균 형광 강도를 미톡산트론 농도에 대해 플롯팅하였고, 미톡산트론의 절반 최대 활성 농도 (EC₅₀-값)를 계산하였다. 10개의 독립적인 EC₅₀ 값을 각각의 미톡산트론/항체 조합 (n=10)에 대해 결정하였고, 결과가 도 4에서 도해된다. 미톡산트론 단독에 대한 평균 EC₅₀-값은 1.6 nM인 것으로 결정되었다. 미톡산트론 및 대조군 항체의 조합은 동일한 평균 EC₅₀을 제공하였다. 그러나, 미톡산트론이 RAM0과 조합되었을 때 평균 EC₅₀이 0.97 nM로 유의하게 감소되었다. 단독요법으로서의 항-MIF 항체 (미톡산트론 부재)는 아이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포 사망에 대한 효과가 없었다 (데이터는 제시되지 않음).

결론

MIF 항체를 표준 진료 화학요법제 약물과 조합하는 것의 강력한 강화된 효능이 상기의 여러 실험에서 제시되었다. 시험관내 검정법에서, 독소루비신-저항성 세포주가 카스파제 활성의 증가에 의해 실연되는 바와 같이 항-MIF 항체와의 공동-인큐베이션에 의해 독소루비신-민감성이게 되었다. 또한, 항-MIF 항체 시스플라틴 저항성 암 세포가 생체 내 모델에서 시스플라틴 민감성이게 되었다. 게다가, 시험관내 검정법에서, 미톡산트론 및 항-MIF 항체의 조합에 대해 평균 EC₅₀의 유의한 감소를 볼 수 있었다. 이는 화학요법제 약물과 MIF-억제제의 상승작용성 효과를 최초로 기술한 것이다. 따라서, 화학요법제 및 MIF 항체를 사용하는 조합 요법이 화학요법제 시술의 현재의 한계를 극복할 수 있고, 과증식성 장애가 있는 환자에서의 치료 결과를 개선시킬 수 있다.

DSMZ DSM25859 20120412 DSMZ DSM25860 20120412 DSMZ DSM25861 20120412 DSMZ DSM25862 20120412 DSMZ DSM25863 20120412 DSMZ DSM25864 20120412 DSMZ DSM25115 20110831 DSMZ DSM25110 20110831 DSMZ DSM25111 20110831 DSMZ DSM25112 20110831 DSMZ DSM25113 20110831 DSMZ DSM25114 20110831

SEQUENCE LISTING <110> Baxter Healthcare S.A. Baxter International Inc. <120> COMBINATION THERAPY OF ANTI-MIF ANTIBODIES AND CHEMOTHERAPEUTICS <130> 163 259 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of RAB9 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Met Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Val Ala Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Trp Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser 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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys 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Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (10)

1. 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
2. 제1항에 있어서, 암이 췌장암, 난소암, 전립선암, 유방암, 폐암 및 결장암, 보다 바람직하게는 췌장암, 전립선암 및 난소암의 군으로부터 선택되는, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-MIF 항체가 항-MIF 항체 RAM9, RAM0 및/또는 RAM4의 군으로부터 선택되는, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 미톡산트론, 독소루비신 및/또는 시스플라틴으로부터 선택되는, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM9이고, 화학요법제가 임의적으로 시스플라틴과 조합된 독소루비신이며, 암이 난소암인, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM0이고, 화학요법제가 임의적으로 시스플라틴과 조합된 독소루비신이며, 암이 난소암인, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM4이고, 화학요법제가 임의적으로 시스플라틴과 조합된 독소루비신이며, 암이 난소암인, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-MIF 항체가 RAM0이고, 화학요법제가 미톡산트론이며, 암이 전립선암인, 암 치료에서 사용하기 위한 화학요법제와 조합된 항-MIF 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 화학요법제와 조합된 항체, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
10. 암 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 화학요법제와 조합된 항체 또는 제9항의 키트.

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